JP2003509340A - 変性疾患、神経疾患、自己免疫疾患に付随する病的状態を検出、予防又は治療するための、ポリペプチドの使用 - Google Patents
変性疾患、神経疾患、自己免疫疾患に付随する病的状態を検出、予防又は治療するための、ポリペプチドの使用Info
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Abstract
Description
る病的状態を検出、予防又は治療することを目的とする診断、予後診断、予防又
は治療用組成物を得るための、少なくとも1つのポリペプチドの使用に関する。
的及び/又は臨床的障害に結びついた病気のことである。アルツハイマー病、筋
萎縮性側索硬化症、パーキンソン病は、神経変性疾患の中に分類される。自己免
疫疾患というのは、単数又は複数の自己抗原に対する免疫系の反応過多のことで
ある。多発性硬化症(SEP)、リウマチ性多発関節炎(PR)及び紅斑性狼瘡
は、自己免疫疾患の中に分類される。
、その病理解剖学的特徴が、脳の白質及び脊髄の中のきわめて限定された脱髄ゾ
ーンの形成から成る、人間の中枢神経系の慢性疾患である。
髄の原因であるグリア細胞の損傷に付随する軸索周辺髄鞘の分解を呈する。小グ
リア細胞(中枢神経系の在住組織マクロファージ)ならびにおそらくは潜入した
血液単球に由来するマクロファージが関与する炎症性マクロファージ活性化は、
この脱髄プロセスに結びつけられ、髄鞘化された葉層の破壊に寄与する。脱髄さ
れたゾーンの中心では、グリア細胞の相対的枯渇が再度認められ、一方、周辺で
は星状膠細胞の増殖が進行し、脱髄された斑に侵入して繊維質の又はグリア細胞
様の斑を生成することができる。これらの強膜構造が、疾患に与えられた名称の
起源となっている。
ぼ系統的に結びつくという点にある。
な変質が観察される。BHEの維持における決定的要素の1つは、星状膠細胞の
足と呼ばれる星状膠細胞の細胞質拡張部分が下接して存在することから成る。お
そらく、星状膠細胞の足は、BHEを具体化する毛細管内皮障壁の凝集力を確保
する気密な接合構造の形成を誘発するか又はその維持を可能にすると思われる。
ところが、さまざまな病理モデルが、BHEの変質及び星状膠細胞の足の枯渇を
報告している。
るリンパ球の集注により、付随する炎症性応答を増幅するのに寄与する。免疫細
胞に結びつけられる炎症の寄与は、SEPにおいて重要であり、病変プロセスに
参加する。
的になっている。細菌及び/又はウイルスを原因とする仮説も立てられた。一方
、特許出願WO95/21859号の中で記述されているように、H.Perr
on et al.は、脱髄斑の典型的な形成及び星状膠細胞グリオースにたど
りつく病因論的プロセスの単数又は複数のエフェクタ作用物質を探究するに至っ
た。この研究の枠内では、彼らは、SEP患者の脳脊髄液(LCR)中に、ヒト
又は動物の星状膠細胞又は乏突起膠細胞に対する毒性活性を示す少なくとも1つ
の因子が存在することを立証した。この毒性活性は、中間フィラメント網の細胞
形態学的組織崩壊及び/又は、前記フィラメントのタンパク質の分解及び/又は
グリア細胞のアポトーシスによる細胞死滅により特徴づけられる。彼らは、特許
出願WO95/21859号に記述されているように、生きた細胞の臭化メチル
テトラゾリウム(MTT)での定量的比色秤量により、SEP患者のLCR及び
血清の標本中のこの毒性活性のin vitro検出と多発性硬化症の間の有意
な相関関係を実証した。一方、C.Malcus-Vocanson et a
l.は、この毒性因子の活性検出のためには尿がきわめて有利な生体流体である
ことを示し、アポトーシスによって死滅した付着性グリア細胞を検出及び/又は
数量化するためのフローサイトメトリを用いた方法を開発した。この方法に関す
るすべての情報は、その内容が参考として内含されている特許出願WO98/1
1439の中で記述されている。
試験が実施された。各分画のタンパク質含有量は、SDS‐PAGEゲル12%
上で分離され、銀によるゲルの着色後に観察された。観察されたタンパク質のう
ち、約21kDの見かけの分子量に中心をおくタンパク質分画がin vitr
oで検出された毒性活性にわずかだけ結びついていることがわかり、約17kD
の見かけの分子量に中心をおく分画はこの毒性活性に大半が結びついていること
がわかった。
脳の切片の死後組織学的観察により、注入から3カ月後に、星状膠細胞個体群の
アポトーシス及び脱髄斑の形成を観察することができた。全ての情報は、その内
容が参考として内含されている特許出願WO97/33466号の中に含まれて
いる。これらの観察事実は、生検後SEP罹患患者の脳の切片について観察でき
た事実に合致している(Benjelloun et al.Cell.Mol
.Biol.,1998、44(4)、579-583)。
グリア細胞に対するこの毒性活性に結びつけられたタンパク質を同定し分析した
。
、少なくとも5つの異なるタンパク質系統群に対応するそれぞれ8、14、18
及び20kDの異なる見かけの分子量をもつ4つの有利なバンドの存在を明らか
にした。これらの系統群のタンパク質は次に、質量分析及び/又は配列決定及び
データバンク内での相同性研究によって分析された(NCB1http:/ww
.ncbi.nlm.nih.gov,Basic Blast Search
,Protein Blasp,タンパク質配列は、数値データベース内にFA
STA書式で入力され、使用されるアルゴリズムはMatrix BLOSUM
62であり、「Identities」と呼ばれる同一性は、百分率で示された
同一アミノ酸の数に対応し、陽性「Positives」は、百分率で与えられ
たソフトウェアの上述のパラメータに従った生物学的等価を示すアミノ酸に対応
する)。これらのタンパク質は、ペルルカン、レチノール結合血漿タンパク質前
駆体、ガングリオシドGM2、カルグラヌリン及びサポシンBの賦活物質前駆体
のタンパク質系統群に属する。より厳密に言うと、タンパク質は(i)20kD
のバンドについて、アミノ酸3464に始まりアミノ酸3707で終わり(Mu
rduch AD et al.J.Biol Chem,1992年4月25
日;267(12);8544-47)、配列識別子中で配列番号2と番号づけ
された(全タンパク質ペルルカンは配列番号1と番号づけされている)ペルルカ
ンのC末端フラグメントであり、(ii)20kDのバンドについては、その配
列が配列番号4として示されているレチノール結合血漿タンパク質前駆体(Mo
naco HL et al.,Science,1995、268(5213
);1039‐1041)であり、(iii)18kDのバンドについては、配
列番号8で同定されているガングリオシドGM2の賦活物質の前駆体(Furs
t W et al.,Euro J Biochem, 1990年9月24
日;193(3):709‐14)であり、(iv)14kDのバンドについて
は、配列番号17で同定されたカルグラヌリンB(Lagasse, E et
al.,Mol Cell Biol,1988,Jun;8(6);240
2‐10)であり、(v)8kDのバンドについては、配列番号24に表わされ
ているサポシンB(Kleinschmidt T et al.,Biol
Chem Hoppe Seyler,1988、Dec;369(12);1
361‐5)である。なお、彼らは同様に、前記基準配列に対する変異配列の存
在、特に18kDのバンドについて、配列番号9のガングリオシドGM2賦活物
質前駆体の変異配列の存在も明らかにした。これらの変異タンパク質配列は、前
記タンパク質についてコードする遺伝子レベルでの突然変異産物であるか又は、
スプライシング現象の結果である。ここで例えば、カルプロラクチンがカルグラ
ヌリンBの一変異体であることに留意されたい。
コードを考慮に入れて、DNAヌクレオチド配列配列番号69によりコードされ
る。レチノール結合血漿タンパク質の前駆体タンパク質(配列番号4)は例えば
、遺伝子コードを考慮に入れてDNAヌクレオチド配列配列番号70によりコー
ドされる。GM2の賦活物質であるタンパク質(配列番号8)は、例えば、遺伝
子コードを考慮に入れてDNAヌクレオチド配列配列番号31によってコードさ
れる。GM2の賦活物質である突然変異を受けたポリペプチドに由来するペプチ
ドFSWDNCFEGK DPAVIR及びYSLPKSEFAV PDLEL
Pは、遺伝子コードを考慮に入れてそれぞれDNAヌクレオチド配列配列番号6
6及び67によってコードされる。カルグラヌリンBタンパク質(配列番号17
)は、例えば、遺伝子コードを考慮に入れてDNAヌクレオチド配列配列番号4
2によってコードされる。サポシンBタンパク質(配列番号24)は例えば、遺
伝子コードを考慮に入れてDNAヌクレオチド配列配列番号52によってコード
される。
示差的多重スプライシング及び/又は異なる読取り枠の結果をもたらされるタン
パク質全体のことを意味する。DNA遺伝子は、交代スプライシング現象で転写
され、こうして、タンパク質の異なる一次配列が翻訳されることになる。これら
のタンパク質は全て、同じタンパク質系統群に属する。同様に「タンパク質系統
群」という語には、その系統群の基準タンパク質配列と少なくとも70%、好ま
しくは少なくとも80%そして有利には少なくとも98%の同一性を示すタンパ
ク質も内含されている。
介入するスプライシングのことである。
配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7という配列のタンパク質又は
そのフラグメント及び異なる読取り枠に沿って対応する遺伝子によりコードされ
るタンパク質を少なくとも含んで成るタンパク質系統群のことである。
配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列
番号14、配列番号15、配列番号16という配列のタンパク質又はそのフラグ
メント、及び異なる読取り枠に沿って対応する遺伝子によりコードされ遺伝子の
示差的多重スプライシング及び/又は異なる読取り枠の結果としてもたらされる
タンパク質を少なくとも含んで成るタンパク質系統群のことである。
番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番
号23という配列のタンパク質又はそのフラグメント、及び異なる読取り枠に沿
って対応する遺伝子によりコードされ遺伝子の示差的多重スプライシング及び/
又は異なる読取り枠の結果としてもたらされるタンパク質を少なくとも含んで成
るタンパク質系統群のことである。タンパク質 MRP14(配列番号17)及
びMRP8(配列番号18)は、同じ遺伝子によりコードされながら、異なるタ
ンパク質配列を有し、同じタンパク質系統群に属する。
5、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29という配列のタ
ンパク質又はそのフラグメント、及び異なる読取り枠に沿って対応する遺伝子に
よりコードされ遺伝子の示差的多重スプライシング及び/又は異なる読取り枠の
結果としてもたらされるタンパク質を少なくとも含んで成るタンパク質系統群の
ことである。
転写され、示差的多重スプラインシングの結果もたらされるcDNA及び/又は
RNA核酸配列全体のことである。DNA遺伝子は、示差的スプライシング現象
で転写され、異なる配列の異なる核酸(cDNA、RNA)の合成を導く。これ
らのcDNA及びmRNA配列は全て、同じ核酸系統群に属するものとみなされ
る。
ドする核酸系統群というのは、配列番号30という配列の核酸又はフラグメント
を少なくとも含んで成る核酸系統群のことである。
統群というのは、遺伝子の示差的多重スプラインシグ及び/又は異なる読取り枠
の結果もたらされる配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34
、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、
配列番号40、配列番号41という配列の核酸又はフラグメントを少なくとも含
んで成る核酸系統群のことである。
うのは、遺伝子の示差的多重スプラインシング及び/又は異なる読取り枠の結果
もたらされる配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列
番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番
号51、配列番号52という配列の核酸又はフラグメントを少なくとも含んで成
る核酸系統群のことである。
は、遺伝子の示差的多重スプラインシング及び/又は異なる読取り枠の結果もた
らされる配列番号53、配列番号54、配列番号55という配列の核酸又はフラ
グメントを少なくとも含んで成る核酸系統群のことである。
エキソン接合のメカニズムのことであり、「示差的スプライシング」というのは
、異なる伝令RNAの形成をもたらし異なる複数のタンパク質の合成を発生させ
うる一次写しの複数のスプライシングスキーマの存在を意味する(Kaplan
及びDelpech,Biologie Moliculaire et Me
decine,1993年、第2版、Medecine et Science
s,Flammarion,p73-77)。この現象については科学文献中に
充分記述されている。例としては、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖についてコー
ドする遺伝子のモデル、ディストロフィン遺伝子モデル、アルファアミラーゼ遺
伝子モデル、ミエリン遺伝子などを挙げることができる。
メントについてコードする領域(エキソン)及びタンパク質等価物をもたないそ
の他の領域を含むことがわかっている。これは、遺伝子がまず第1に特異的ヌク
レオチド部位(スプラインシング部位)のレベルでスプライシング酵素によりそ
の後切断される「一次」RNAへと転写されるという事実に起因している。これ
らの酵素は次に、タンパク質についてコードする領域を接合し、かくして、その
イントロン領域が除去された「二次」RNAを再構築する。なお、細胞表現型(
ひいては組織又は分化)に応じてこれらの酵素は全て発現されるわけではなく、
従って同じRNAが、同じ個体の複数の細胞の中で異なる形でスプライシングさ
れ得、かくして配列の差異を伴うタンパク質が生成されることになる。しかしな
がらこれらの現象は、完全にコードするものの(エキソン)異なるタンパク質産
物間の示差的スプライシング現象可能な異なるスプライシングに従って、同じヌ
クレオチド領域から異なる複数のタンパク質を生成することになる複数のヌクレ
オチド領域に対しても適用可能である。
数の読取り枠をもち得ることも知られている。かくして、複数の読取り段階にお
ける複数の翻訳開始コドンの存在及び/又は、DNA上の異なる読取り段階にお
いて存在する配列を接合する一次RNAのスプライシングによって、同一のDN
A領域が、ペプチド配列の観点からみて互いに無関係のタンパク質産物を生成す
ることが可能となる。
は、一定の与えられたDNA領域内でスプライシング部位を作り出すか又は削除
し、かくしてこの領域により通常産生される単数又は複数のタンパク質産物の配
列及び構造を修正することができる。
て有利な遺伝子領域を決定するものとして同定されたDNAセグメントに対応す
る同じヌクレオチド配列が、さまざまな読取り枠内で示差的及び代替的スキーマ
に従ってスプライシングされた全てのRNA系統群、ひいては当然のことながら
、1つの読取り枠さらには3つの潜在的枠に従った「モザイク」配列及び遺伝子
多形現象に場合によって結びつけられる突然変異をもつタンパク質及びポリペプ
チドの系統群全てを定義するのに必要かつ充分な情報を含むことを可能にするこ
とができる。
ド領域によって代表され得る。実際、異なる複数のタンパク質が同じ配列のセグ
メントによってコードされる:例えば、外被糖タンパク質及び調節タンパク質T
AT、REV、NEF、VIF。
は異なるサブユニット(ヘテロダイマー、ヘテロマルチマー)の組合せの結果と
してもたらされうるということも知られている。かくして、同じDNA領域によ
ってコードされた異なるタンパク質産物が互いに組合わさって複合マルチマータ
ンパク質単位を構成することもできる。この現象は先行する現象に追加されて、
1つのタンパク質が1つのペプチドフラグメントにより同定された時点でこの複
合タンパク質を構成するその他全ての要素及びそれらをコードするスプライシン
グされたDNA及びRNAセグメントならびにタンパク質産物系統群の全ての成
員及びそれらの集合体を論理的に同定することが可能である。もう1つの例は、
タンパク質系統群MRP14又はカルグラヌリンB、MRP8、カルプロテクチ
ン、プソリアシンなどについてコードするヒトDNA領域によっても提供される
。
出、予後診断、予防又は治療することを目的とする診断、予後診断、予防又は治
療用組成物を得るための、1つのタンパク質の少なくとも1つのフラグメントを
含んで成る少なくとも1つのポリペプチドの使用において、前記タンパク質は、
未変性状態でのそのペプチド配列が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配
列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号10、
配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配
列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列
番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番
号26、配列番号27、配列番号28及び配列番号29、及び前述のペプチド配
列のいずれか1つと少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%そして有利
には少なくとも98%の同一性を呈するペプチド配列、及び、ペルルカン、レチ
ノール結合血漿タンパク質前駆体、ガングリオシドGM2、カルグラヌリンB及
びサポシンBの賦活物質前駆体の中から選ばれた同じタンパク質系統群に属する
ペプチド配列又はそのフラグメントに対応しているタンパク質の中から選択され
ている使用を目的とする。特定の実施形態においては、前述の少なくとも2つの
ポリペプチドが、変性疾患及び/又は自己免疫疾患に付随する病的状態を検出、
予後診断、予防又は治療することを目的とする診断、予後診断、予防又は治療用
組成物を得るために組合わせた形で使用される。
出、予後診断、予防又は治療することを目的とする診断、予後診断、予防又は治
療用組成物を得るための、1つのタンパク質の少なくとも1つのフラグメントを
含んで成る少なくとも1つのポリペプチドの使用において、前記タンパク質は、
未変性状態でのそのペプチド配列が、配列番号2、配列番号4、配列番号8、配
列番号17及び配列番号24、及び上述のペプチド配列のいずれか1つと少なく
とも70%、好ましくは少なくとも80%そして有利には少なくとも98%の同
一性を呈するペプチド配列に対応しているタンパク質の中から選択されている使
用にも関する。有利には、上述の定義を満たす5つのポリペプチドが組合わせて
使用される。
配列番号8、配列番号17及び配列番号24のいずれか1項の中から選択された
1つの配列を含むか又は、これにより構成されている。
うちの1つの少なくとも1つのフラグメントの使用において、該ペプチドが配列
番号58-65の配列のうちの少なくとも1つの全部又は一部を含みモノクロー
ナル抗体の産生のために使用される、使用にも関する。
、予後診断、予防又は治療することを目的とする診断、予後診断、予防又は治療
用組成物を得るための、タンパク質の少なくとも1つのヌクレオチドフラグメン
トの使用において、ここで前記ヌクレオチドフラグメントは、1つのタンパク質
の少なくとも1つのフラグメントについてコードするフラグメントの中から選択
されており、前記タンパク質は、未変性状態でのそのペプチド配列が、配列番号
1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号
7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、
配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配
列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列
番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28及び配列
番号29、上述のペプチド配列のいずれか1つと少なくとも70%、好ましくは
少なくとも80%そして有利には少なくとも98%の同一性を呈するペプチド配
列、及び前記フラグメントの相補的フラグメント、及びペルルカン、レチノール
結合血漿タンパク質前駆体、ガングリオシドGM2、カルグラヌリンB及びサポ
シンBの賦活物質前駆体の中から選ばれた同じタンパク質系統群に属するペプチ
ド配列又はそのフラグメントに対応しているタンパク質の中から選択されている
使用をもその目的としている。当業者であれば、その一般的知識内に入ることか
ら、ペプチド配列及び遺伝子コードからヌクレオチドフラグメントの核酸配列を
決定するこができる。
1-8及び配列番号10-29のうちのいずれか1つの中及びペルルカン、レモノ
ール結合血漿タンパク質前駆体、ガングリオシドGM2、カルグラヌリンB及び
サポシンBの賦活物質前駆体の中から選択された同一タンパク質系統群に属する
ペプチド配列又はそのフラグメントの中から選択された配列から成るタンパク質
についてコードする。
疾患に付随する病的状態を検出、予後診断、予防又は治療することを目的とする
診断、予後診断、予防又は治療用組成物を得るための、少なくとも1つのヌクレ
オチドフラグメントの使用において、前記フラグメントが、配列番号30、配列
番号31、配列番号33、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番
号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号
41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号4
6及び配列番号47、配列番号48、配列番号49及び配列番号50、配列番号
51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号5
6、配列番号57、配列番号67、配列番号66、配列番号69、配列番号70
及び配列番号71のうちのいずれか1つ及びその相補的配列から選ばれた核酸配
列のフラグメントである使用にある。
する病的状態を検出、予後診断、予防又は治療することを目的とする診断、予後
診断、予防又は治療用組成物を得るための上述の通りのポリペプチド又はヌクレ
オチドフラグメントの特異的リガンドの使用にも関する。
酵素活性基質又は前記ポリペプチドを補因子とする酵素といったようなポリペプ
チドに会合する可能性のあるあらゆる分子のことである。ポリクローナル及びモ
ノクローナル抗体の産生は、当業者の一般的知識の一部を成すものである。モノ
クローナル抗体の産生については、Kohler G及びMilstein C
.(1975);予め規定された特異性をもつ抗体を分泌する融合された細胞の
連続培養、Nature256:495-497及びGalfre G et
al.(1977)Nature,266;522-550、そして、ポリクロ
ーナル抗体の産生についてはRoda A.,Bolelli G.F:胆汁酸
に対する高力価抗体の産生、Journal of Steroid Bioc
hemistry,第13巻、p449-454(1980)を参考として挙げ
ることができる。
メントといったようなヌクレオチドフラグメント、相補的ポリヌクレオチド、抗
核酸抗体に会合する可能性のあるあらゆる分子のことでもある。ヌクレオチドフ
ラグメント又はポリヌクレオチドの産生は、当業者の一般的知識の一部を成す。
特に、制限酵素の使用及び自動合成装置例えばApplied Biosyst
em社から市販されている合成装置上での化学合成を挙げることができる。なお
、抗核酸抗体産生のための技術も知られている。一例としては、Philipp
e Cros et al.,Nucleic Acides Researc
,1994,Vol.22,N°15,2951‐2957;Anderson
,W.F.et al.(1988)Bioessays,8(2),69‐7
4;Lee,J.S. et al.(1984)FEBS Lett.,16
8,303‐306;Malfoy,B.et al.(1982)Bioch
emistry,21(22),5463‐5467;Stollar,B.D
.et al.,J.J.(eds)Methods in Enzymolo
gy,Academic Press,pp.70‐85;Traincard
,F.et al.(1989)J.Immunol.Meth.,123,8
3‐91及びTraincard,F.et al.(1989)Mol.Ce
ll.Probes,3,27‐38)を挙げることができる。
れる少なくとも1つのタンパク質を検出するための方法において、少なくとも1
つのポリペプチドの少なくとも1つの特異的リガンドと生体標本を接触させ、こ
こで前記ポリペプチドが1つのタンパク質の少なくとも1つのフラグメントを含
んで成り、該タンパク質は、未変性状態でのそのペプチド配列が配列番号1、配
列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配
列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番
号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号
19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号2
4、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28及び配列番号2
9、及びペプチド配列配列番号1-配列番号8及び配列番号10-配列番号29の
いずれか1つと少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%そして有利には
少なくとも98%の同一性を呈するペプチド配列、及び、ペルルカン、レチノー
ル結合血漿タンパク質前駆体、ガングリオシドGM2、カルグラヌリンB及びサ
ポシンBの賦活物質前駆体の中から選ばれた同じタンパク質系統群に属するペプ
チド配列又はそのフラグメントに対応しているタンパク質の中から選択されてお
り、かつその後、前記ポリペプチド及び前記リガンドの間の複合体の形成を検出
する方法を目的とする。前記リガンドは、有利には、モノクローナル抗体、ポリ
クローナル抗体、レセプタ、酵素活性基質又は前記ポリペプチドを補因子とする
酵素である。
けられる少なくとも1つのリガンドを検出するための方法において、1つのタン
パク質の少なくとも1つのフラグメントを含む少なくとも1つのポリペプチドと
生体標本を接触させ、該タンパク質は、未変性状態でのそのペプチド配列が配列
番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列
番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号1
3、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18
、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、
配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28及び
配列番号29、及びペプチド配列配列番号1-配列番号8及び配列番号10-配列
番号29のいずれか1つと少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%そし
て有利には少なくとも98%の同一性を呈するペプチド配列、及び、ペルルカン
、レチノール結合血漿タンパク質前駆体、ガングリオシドGM2、カルグラヌリ
ンB及びサポシンBの賦活物質前駆体の中から選ばれた同じタンパク質系統群に
属するペプチド配列又はそのフラグメントに対応しているタンパク質の中から選
択されていること、及びその後、前記ポリペプチド及び前記リガンドの間の複合
体の形成を検出することを特徴とする方法に関する。リガンドは、上述の条件を
満たすあらゆる分子である。
-8及び配列番号10-29のいずれか1つの中から選ばれた配列及びペルルカン
、レチノール結合血漿タンパク質前駆体、ガングリオシドGM2、カルグラヌリ
ンB及びサポシンBの賦活物質前駆体の中から選ばれたタンパク質の同一系統群
に属するペプチド配列又はそのフラグメントを含むか又はこれにより構成されて
いる。
の少なくとも1つのフラグメントを含んで成り、前記フラグメントが配列番号8
という基準配列との関係において少なくとも1つ特に少なくとも2つの突然変異
を含んで成る、新規ポリペプチドにも関する。該ポリペプチドは有利には、配列
番号68のアミノ酸配列FSWDNCFEGKDPAVIR及び配列番号72の
アミノ酸配列YSLPKSEFAVPDLELPを含んで成るポリペプチドの中
から選択される。
のポリペプチドは、単独で又は前述のような少なくとも1つのポリペプチドと混
合した形で、変性疾患及び/又は自己免疫疾患に付随する病的状態を検出、予後
診断、予防又は治療することを目的とする診断、予後診断、予防又は治療用組成
物を得るために使用される。
ク質断片についてコード化しているヌクレオチド断片を得ることであり、前記の
タンパク質の前記の断片が少なくとも一つの突、特に、基準列配列番号8に対す
る2つの突然変異を示す。前記のヌクレオチド断片は、特に、配列番号9につい
てコード化している断片を含むか、あるいは、断片で構成される。上記で定義し
たような唯一、あるいは、少なくとも一つのヌクレオチド断片と混合した、変性
疾患、及び/あるいは、自己免疫性疾患に関連した病理学的状態を検知、予防、
あるいは、治療するための診断、予測、予防、あるいは、治療成分を得るために
、この断片を使用する。
るいは、それで構成される少なくとも一つのポリペプチド、あるいは、このポリ
ペプチドを含むポリペプチド混合物、及び上記で記述したような少なくとも一つ
のポリペプチドと接触させ、次に、もちろん、リガンドによって前記の条件に対
応する分子が解るのであるが、対応するポリペプチド、あるいは、複数のポリペ
プチドとリガンド、あるいは、複数のリガンドとの間の複合体、あるいは、複数
の複合体の構成を検知する生物学的サンプルで、変性疾患、及び/あるいは、自
己免疫性疾患に関連した少なくとも一つのリガンドを検知するための手順を対象
とする。
前記のポリペプチドの断片を検知するための手順に関するものであって、それに
従って生物学的サンプルを前記のポリペプチドの少なくとも一つの特定のリガン
ドと接触させ、次に、前記のポリペプチドと前記のリガンドとの間の複合体の構
成を検知する生物学的サンプルで、この断片は基準列配列番号8と関連して少な
くとも一つの突然変異、好ましくは、2つの突然変異を含む。リガンドの定義は
、前述で定義したものに対応している。とりわけ、受容体のモノクロナル抗体、
ポリクロナル抗体、酵素活性基質、あるいは、前記のポリペプチドが補助因子で
ある酵素が問題となることがある。
前述で定義したような別の少なくとも一つのポリペプチドの少なくとも一つの特
定のリガンドと接触させ、次に、リガンドによって前記の条件に対応する分子が
解るのであるが、前記の複数のポリペプチドと前記の複数のポリペプチドの特定
の前記のリガンドとの間の複合体の構成を検知することができる。
てコード化しているヌクレオチド断片と、場合によっては、前述で定義したよう
な少なくとも一つのヌクレオチド断片、及び前記の断片の補完的断片と関連して
、変性疾患、及び/あるいは、自己免疫性疾患に関連した病理学的状態を検知、
予防、あるいは、治療するための診断、予測、予防、あるいは、治療成分を得る
ためのその使用である。
体、あるいは、一部、特に、ほぼ5-15のアミノ酸、より正確には、ほぼ5-1
0アミノ酸及び6-15アミノ酸を含むポリペプチド断片が知られている。ヌク
レオチド列についてはADN及びARN列が含まれるが、ヌクレオチド断片につ
いては、ヌクレオチド列の全体、あるいは、一部が知られている。
単位に関連した断片や、自然の、あるいは、人工的な方法、すなわち、差動多重
接続、あるいは、選択合成によって得られた複数の同族、あるいは、異種下位単
位を含む複雑な分子の断片が知られている。
るいは、自己免疫性疾患に関連した病理学的状態を示す患者の生体液のサンプル
を採取し、場合によっては、前記の生体液のサンプルの精製後に、物質の分光測
定によって、生体液から得られた物質のプロファイルを分析し、基準物質プロフ
ァイルと比較する、上記で定義したような少なくとも一つのポリペプチドを検知
するための手順に関するものである。
ポリペプチドの使用、及び自己免疫性、及び/あるいは神経学的、及び/あるい
は、変性疾患、特に、プラーク硬化症を予防、及び/あるいは、治療するための
その薬品の使用に関するものである。
なくとも一つのポリペプチドの使用であり、その自然状態のペプチド列が配列番
号1,配列番号2,配列番号3,配列番号4,配列番号5,配列番号6,配列番
号7,配列番号8,配列番号10,配列番号11,配列番号12,配列番号13
,配列番号14,配列番号15,配列番号16,配列番号17,配列番号18,
配列番号19,配列番号20,配列番号21,配列番号22,配列番号23,配
列番号24,配列番号25,配列番号26,配列番号27,配列番号28,及び
配列番号29に対応するタンパク質の中から前記のタンパク質が選択されており
、そのペプチド列がペプチド列配列番号1-29のいずれか一つと少なくとも7
0%の同一性を、好ましくは、少なくとも80%の同一性を、有利には、少なく
とも98%の同一性を示し、そのペプチド列、あるいは、前記の列の断片がパー
ルカン、レチノール結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドGM2の活性
化体の前駆体、calgranulineカルグラニュリンB、及びサポジンB
の中から選択された同じタンパク質のグループに属する;
、自己免疫性疾患を治療するための薬学的成分を作成するために生物学的物質を
定義するために、少なくとも一つのタンパク質の断片を含む少なくとも一つのポ
リペプチドの使用であり、その自然状態のペプチド列が配列番号1,配列番号2
,配列番号3,配列番号4,配列番号5,配列番号6,配列番号7,配列番号8
,配列番号10,配列番号11,配列番号12,配列番号13,配列番号14,
配列番号15,配列番号16,配列番号17,配列番号18,配列番号19,配
列番号20,配列番号21,配列番号22,配列番号23,配列番号24,配列
番号25,配列番号26,配列番号27,配列番号28,及び配列番号29に対
応するタンパク質の中から前記のタンパク質が選択されており、そのペプチド列
がペプチド列配列番号1-29のいずれか一つと少なくとも70%の同一性を、
好ましくは、少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一
性を示し、そのペプチド列、あるいは、前記の列の断片がパールカン、レチノー
ル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドGM2の活性化体の前駆体、カ
ルグラニュリン、及びサポジンの中から選択された同じタンパク質のグループに
属する;
9,17,14の中からポリペプチドを選択する;‐
した病理学的状態に関して治療薬の効果を試験するための少なくとも一つのヌク
レオチド断片の使用であり、それに従って、前記のヌクレオチド断片は少なくと
も一つのタンパク質の断片についてコード化している断片の中から選択され、そ
の自然状態のペプチド列が配列番号1,配列番号2,配列番号3,配列番号4,
配列番号5,配列番号6,配列番号7,配列番号8,配列番号10,配列番号1
1,配列番号12,配列番号13,配列番号14,配列番号15,配列番号16
,配列番号17,配列番号18,配列番号19,配列番号20,配列番号21,
配列番号22,配列番号23,配列番号24,配列番号25,配列番号26,配
列番号27,配列番号28,及び配列番号29,に対応するタンパク質の中から
前記のタンパク質が選択されており、そのペプチド列がペプチド列配列番号1-
29のいずれか一つと少なくとも70%の同一性を、好ましくは、少なくとも8
0%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示し、前記の断片の補
完的断片、及びペプチド列、あるいは、前記の列の断片についてコード化してい
る断片が、パールカン、レチノール結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシ
ドGM2の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンBの中から選
択された同じタンパク質のグループに属する。
連した病理学的状態についての治療薬の効果、組み換えタンパク質、及び/ある
いは、前述のパラグラフで定義したようなヌクレオチド断片のすべて、あるいは
、一部についてコード化されたタンパク質を試験するための使用;
、自己免疫性疾患を治療するための薬学的成分を作成するための少なくとも一つ
のヌクレオチド断片の使用であり、それに従って、前記のヌクレオチド断片が、
少なくとも一つのタンパク質の断片についてコード化している断片の中から選択
され、その自然状態のペプチド列が配列番号1,配列番号2,配列番号3,配列
番号4,配列番号5,配列番号6,配列番号7,配列番号8,配列番号10,配
列番号11,配列番号12,配列番号13,配列番号14,配列番号15,配列
番号16,配列番号17,配列番号18,配列番号19,配列番号20,配列番
号21,配列番号22,配列番号23,配列番号24,配列番号25,配列番号
26,配列番号27,配列番号28,及び配列番号29に対応するタンパク質の
中から前記のタンパク質が選択されており、そのペプチド列がペプチド列配列番
号1-29のいずれか一つと少なくとも70%の同一性を、好ましくは、少なく
とも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示し、前記の断
片の補完的断片、及びペプチド列、あるいは、前記の列の断片についてコード化
している断片が、パールカン、レチノール結合血漿タンパク質の前駆体、ガング
リオシドGM2の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンBの中
から選択された同じタンパク質のグループに属する;
、自己免疫性疾患を治療するための薬学的成分、組み換えタンパク質、及び/あ
るいは、前述のパラグラフで定義したようなヌクレオチド断片のすべて、あるい
は、一部についてコード化されたタンパク質を作成するための使用。
ド化している。
のいずれか一つから選択した列で構成され、ペプチド列は、ペプチド列配列番号
1-29のいずれかと、好ましくはすべて80%の同一性を、有利には少なくと
も98%の同一性を示し、ペプチド列、あるいは、前記の列の断片が、パールカ
ン、レチノール結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドGM2の活性化体
の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンBの中から選択された同じタンパ
ク質のグループに属する。ポリペプチドは、好ましくは配列番号2,4,8,9
,17,24の中から選択する。
した病理学的状態に関する治療薬の効果を試験するための少なくとも一つのヌク
レオチド断片の使用であり、それに従って、前記の断片が、配列番号30,配列
番号31,配列番号32,配列番号33,配列番号34,配列番号35,配列番
号36,配列番号37,配列番号38,配列番号39,配列番号40,配列番号
41,配列番号42,配列番号43,配列番号44,配列番号45,配列番号4
6,配列番号47,配列番号48,配列番号49,配列番号50,配列番号51
,配列番号52,配列番号53,配列番号54,配列番号55,配列番号56,
及び配列番号57,配列番号66,配列番号67,配列番号69,配列番号70
,配列番号71,及びその補完的列のいずれか一つから選択された核列の断片で
ある。
、自己免疫性疾患を治療するための薬学的成分を作成するための少なくとも一つ
のヌクレオチド断片の使用であり、それに従って、前記の断片が、配列番号30
,配列番号31,配列番号32,配列番号33,配列番号34,配列番号35,
配列番号36,配列番号37,配列番号38,配列番号39,配列番号40,配
列番号41,配列番号42,配列番号43,配列番号44,配列番号45,配列
番号46,配列番号47,配列番号48,配列番号49,配列番号50,配列番
号51,配列番号52,配列番号53,配列番号54,配列番号55,配列番号
56,及び配列番号57,配列番号66,配列番号67,配列番号69,配列番
号70,配列番号71,及びその補完的列のいずれか一つから選択された核列の
断片である。
、及び/あるいは、治療するための薬学的成分を作成するためのリコリンの使用
。
得られる臨床的及び生物学的利益が知られている。こうした利益は、とりわけ臨
床的、生物学的徴候の削減、及び磁気共鳴画像診断、脳脊髄液中のオリゴクロー
ン帯分析、誘発電位分析、及び生物試験glioグリオ毒性検知試験といった医
師による臨床的分析、及び/あるいは、生物学的分析後の疾患の病理学的効果に
現れ、その原理は、前掲の特許請求項WO98/11439に記述されている。
こうした臨床的徴候の削減、及び病理学的効果は、患者のための利益を発生させ
なければならない(Schwartz及びLazar、1995、医学的及び生
物学的統計の原理、eds Flammarion;LAzar及びSchwa
rtz、1995、医学的及び生物学的統計要素、eds Flammario
n)。むしろ研究すべき疾患は、プラーク硬化症である。
すべての成分が知られている。こうした治療薬は、(i)定性的、及び/あるい
は、定量的方法で生物学的活動、及び/あるいは、本発明で識別した当該のタン
パク質の機能、好ましくは、グリオ毒性活動に影響を与える、(ii)そのタン
パク質の発現を変化、及び/あるいは、抑制する、及び/あるいは、(iii)
細胞内、及び/あるいは、細胞外区画内のタンパク質濃度を減少させ、及び/あ
るいは、そのタンパク質の一つの非病因形を病因形、例えば、突然変異した形と
代える、及び/あるいは、少なくともそのリガンドへの固定を変化させる能力が
あり;前記のリガンドは、前述の基準に対応する分子である。文献に広範に記述
された従来の取り組み方に従って異なる治療薬が作成される。本発明で識別され
た当該のタンパク質から定義された治療薬の異なるグループを下記で説明する。
その作用、あるいは、疾病予防効果、及び/あるいは、治療効果は、試験管内、
及び/あるいは、生体内で評価される。
れた生物試験手順に従って、試験管内でグリオ毒性作用について、好ましくは、
活性状態の健康な個人及びプラーク硬化症に冒された患者の尿のサンプルを試験
する。被試験尿のサンプルに効果を試験しようとしている治療薬を添加するか、
あるいは、添加しないことによって、平行して実験を行う。生体内試験を行う前
に、試験薬剤の各濃度について、ほぼ37℃、あるいは、周囲温度でのサンプル
を用いた培養の異なる時間の経過後に、この薬剤の異なる濃度で試験を行う。
理サンプル、あるいは、精製済みサンプルについて、グリオ毒性作用を決定する
。プラーク硬化症のための疾病予防薬、及び/あるいは、治療薬は、患者の生体
液内、特に尿中のグリオ毒性作用を削減、あるいは、抑制することができる薬剤
である。上限を固定した非検査薬剤を使用しない場合の患者SEPの生体液中に
検知されたグリオ毒性作用について、また、下限を決定する健康な個人の尿中に
検知されたグリオ毒性作用について、こうした削減、あるいは、抑制を評価する
(Schawartz及びLazar、1995、医学的及び生物学的統計原理
、eds Flammarion;LAzar及びSchwartz、1995
、医学的及び生物学的統計要素、eds Flammarion)。同じ試験に
組み合わせて、幾つかの薬剤の治療効果を評価することができる。
あるいは、少なくとも本発明のポリペプチド、及び/あるいは、少なくとも本発
明のポリペプチドに対応する少なくとも遺伝子組み換えによって得られたタンパ
ク質、及び/あるいは、そのアミノ酸列が本発明の少なくとも一つのポリペプチ
ドの列に対応する少なくとも一つの合成ポリペプチドを注入する。確定された異
なる濃度で、上述で引用した特許請求WO97/33466に記述された手順に
従って、マウスやラットといった哺乳類動物、好ましくは、Lewisラットに
注入を行う。真皮内、静脈内、胸郭内、大脳内、筋肉内経路や、その他の経路で
、未処理、あるいは、異なる濃度の精製済みの尿の分溜、あるいは、少なくとも
上記で定義したようなポリペプチド、及び/あるいは、タンパク質を一連の動物
に注入する。平行して陰性検査も行う。次に、評価しようとする疾病予防薬、及
び/あるいは、治療薬を異なる濃度で、異なる投与経路で、哺乳類動物、好まし
くは、マウス、あるいは、ラットに注射する。各投与間の異なる時間間隔で、単
一用量、あるいは、繰り返し用量で注射を行う。投与後数週間までの数時間、好
ましくは、血液、血清、脳脊髄液、尿の生物学サンプルを採取する。このサンプ
ルに対して、次のようなことを行う:
当該のポリペプチド、及び/あるいは、タンパク質の作用の測定:Li及び他、
1983、Am J Hum Genet35:629‐634;Li他、19
88 JBiol Chem 263:6588‐6591;Li他、1981
J Biol Chem 256:6234‐6240;Li他、1976
J Biol Chem 251:1158;Kase他,1996,Febs
Letters33¥93;74‐76;Kishimoto他、1992,J
Lipid Res 33: 1255‐1267;O’brien他、19
91 Faseb J 5:301‐308; Murthy他、1993 J
Immunol 151:6291‐6301;Murao他、1990細胞
成長差 1:447‐454、及び/あるいは、
一つに、あるいは、その断片に固着することができる抗体、あるいは、抗体の断
片を使用することによるELISA(酵素結合免疫吸着剤効力検定)、及び/あ
るいは、Western Blotによる、単独、あるいは、組み合わせた当該
のポリペプチド、及び/あるいは、タンパク質の用量、及び/あるいは、
、タンパク質、あるいは、その断片の特定の抗体の用量、あるいは、当該のポリ
ペプチド、及び/あるいは、タンパク質、あるいは、その断片に固着することが
できる少なくとも一つのリガンドの用量、及び/あるいは、
6にScheibenbogen他が記述した前記のELISPOT技術に従っ
て、細胞毒性Tリンパ球を定量化することによって、例えば、投与された抗原の
特有な”ヘルパー”Tリンパ球細胞の試験管内活性化試験を行うことによる、当
該のポリペプチド、及びタンパク質、あるいは、その断片、及びそのポリペプチ
ド、タンパク質、及び断片に由来する免疫原性ペプチドに対して誘発された<<
ヘルパー>>細胞免疫性、及び/あるいは、細胞毒性反応の用量。明確に抗原、
ポリペプチド、当該のタンパク質、あるいは、そのタンパク質に由来する免疫原
性断片に対して患者が発生させた自然の免疫反応を探すことによって、与えられ
た患者に実施するために、あるいは、潜在的な病理学的状態を診断、及び/ある
いは、疾病予防するために、ワクチン接種の取り組み方の有効性を評価したいの
で、そうした決定は特に有利である。
タンパク質の一部を識別できるすべての分子が知られている。例えば、Elis
a、及び/あるいは、Western Blotの検査によって、試験管内でそ
れを確認することができる。
片、パールカンのC‐末端(配列番号2)、レチノル結合血漿タンパク質の前駆
体(配列番号4)、GM2の活性化体タンパク質(配列番号8)、GM2の活性
化体タンパク質の突然変異タンパク質(配列番号9)、カルグラニュリンB(配
列番号17)、サポジンB(配列番号24)、レチノル結合血漿タンパク質の前
駆体のグループに属するタンパク質、あるいは、断片(例えば、配列番号5-7
)、GM2の活性化体タンパク質のグループに属するタンパク質、あるいは、断
片(例えば、配列番号10-16)、タンパク質カルグラニュリンBのグループ
に属するタンパク質、あるいは、断片(例えば、配列番号18-23)、タンパ
ク質サポジンBのグループに属するタンパク質、あるいは、断片(例えば、配列
番号25-29)、ペプチド列配列番号1-29のいずれか一つとの少なく70%
の同一性を、好ましくは、少なくとも80%の同一性を、及び有利には、少なく
とも89%の同一性を示すペプチド列を指す。
する。グリオ毒性に関連した活性ポリペプチド、及び/あるいは、タンパク質の
特徴的効果、すなわち、グリア細胞のapoptoseアポプトーゼ、及び/あ
るいは、血液‐脳障壁の解放、及び/あるいは、demyelinizasio
n(デミエリニザション)非ミエリン化を検知、及び/あるいは、定量化するた
めに異なる研究と観察を行う。同様に、識別された本発明の当該のポリペプチド
、及び/あるいは、タンパク質の存在、あるいは、発現をその組織の中で次のよ
うに観察、及び/あるいは、定量化する:
その断片のリガンド、及び/あるいは、モノクロナル抗体、あるいは、ポリクロ
ナル抗体、あるいは、ポリペプチド、及び/あるいは、タンパク質、あるいは、
その断片に関連した前記の断片を使用することによる典型的な免疫組織学的分析
、及び/あるいは、
列から定義されたオリゴヌクレオチドを使用することによる典型的な自然環境の
下での交雑技術、及び/あるいは、
RT‐PCRによる増幅技術。 ポリペプチド、タンパク質、あるいは、その断片に固着することができる抗体
について、すべてのモノクロナル抗体、あるいは、ポリクロナル抗体、及びポリ
ペプチド、タンパク質、あるいは、その断片を識別することができる前記の抗体
のすべての断片が知られている。例えば、ELISA、及び/あるいは、Wes
tern Blotにより前記のポリペプチド、タンパク質、あるいは、その断
片を識別することができる抗体の能力を試験管内で確認する。タンパク質、サポ
ジンB、あるいは、そのタンパク質のすべての断片に固着することができる抗体
(配列番号24)は、Misasi他1998、J.NeuroChem.71
:2313、及びKlein他1994、BBRC200:1440‐1448
によって記述されているか、あるいは、従来の方法、例えば、免疫について、天
然タンパク質、組み換えタンパク質、合成ポリペプチド、あるいは、その断片か
らモノクロナル抗体、及びポリクロナル抗体を製造するために前述で出典を明示
した方法を使用することによって、製造することができる。モノクロナル抗体、
アンチサポジンBを製造するための免疫原性ペプチドは、列配列番号61及び列
配列番号62に対応するペプチドである。
質のすべての断片に固着することができる抗体は、Yuziuk他、1998J
Biol Chem273:66‐72によって説明されており、あるいは、
この種の方法を知った人物によって従来の方法を使用して製造することができる
。この抗体は、例えば、ネズミ、あるいは、ウサギに天然タンパク質、あるいは
、すべての断片、及び/あるいは、組み換えタンパク質、あるいは、すべての断
片、及び/あるいは、タンパク質のタンパク質列から定義及び合成されたペプチ
ドを注射した後に生成することができる。モノクロナル抗体、アンチGM2を製
造するために使用された免疫原性ペプチドは、配列番号58、配列番号59、及
び配列番号60と呼ばれるペプチドである。タンパク質、ガルグラニュリンB(
配列番号17)、あるいは、そのタンパク質のすべての断片に固着することがで
きる抗体は、Saintigny他,1992 J Invest Derma
tol99:639‐644、及びGoebeler他1994 J Leuk
oc Biol 55:259‐261によって記述されており、あるいは、従
来の方法を使用することによって製造することができる。モノクロナル抗体、ア
ンチガルグラニュリンBを製造するための免疫原性ペプチドは、列、配列番号6
3、配列番号64、及び配列番号65に対応するペプチドである。GM2(配列
番号9)の活性突然変異タンパク質、あるいは、そのタンパク質の断片に固着す
ることができる抗体は、上記で定義した従来の方法を使用することによって製造
することができる。
ルから得られたすべて、あるいは、部分的に分離、精製されたすべてのタンパク
質、及びそのタンパク質から得られたすべての断片が知られている。例えば、W
aring他,1998 Mol Metab63:14‐25によって記述さ
れた技術に従うことによって、サポジンB(配列番号24)に対応する天然タン
パク質が得られる;GM2(配列番号8)の活性化体タンパク質に対応する天然
タンパク質は、DeGasperi他、1989 Biochem J 260
:777‐783,Vogel他、1987 Arch Biochem Bi
ophys 259:627‐638,Mitsuyama,1983 Hok
kaido Igaku Zassi 58:502‐512;Hirabay
ashi他、1983 J Neurochem 40:168‐175,Co
nzelman他、1979 Hoppe Seylers Z Physio
l Chem 360:1837‐1849,Li他、1976 J Biol
Chem 251:1159‐1163によって記述された方法に従うことに
よって得られる。カルグラニュリンB(配列番号17)に対応する天然タンパク
質は、Hitomi他、1996 J Cel Sci 109:805‐81
5,Van den Bos他、1998 Protein Expr 13:
313‐318、及びRaftery他、1996 Biochem J 31
6:285‐293によって記述された技術に従うことによって得られる。
パク質、あるいは、その断片についてコード化しているヌクレオチド列から原核
生物細胞、あるいは、真核生物細胞の中に生成され、細胞に転写されたすべての
タンパク質、あるいは、タンパク質の断片が指摘されており、そのタンパク質、
あるいは、その断片が精製されている。一般的な方法により、原核生物、あるい
は、真核生物組織に由来するすべての細胞を本発明の枠内で使用することができ
るが、真核生物組織に由来する細胞が好ましい。実例として、細胞CHO、細胞
COS、細胞Semlikiセムリキが挙られる。本発明の目的のためには、従
来の細胞は野生型であっても、突然変異性であっても良い。例えば、Zalta
sh他1998 Bebbs letter 423:1-4及びQi他199
4 J Biol Chem 269:16746-16753に記述された技
術に従うことによって、サポジンB(配列番号24)に対応する組み換えタンパ
ク質を得ることができる。そうした組み換えタンパク質は、少なくともKase
他1996Febs lett 393:74-76に従って使用可能である。
GM2(配列番号8)の活性化体タンパク質に対応する組み換えタンパク質は、
Yuziuk他1998 J Biol Chem 273:66-77、及び
Bierfreund他1999 Neurochem res 24:295
-300に記述された技術に従うことによって、製造することができる。カルグ
ラニュリンB(配列番号17)に対応する組み換えタンパク質は、Longbo
ttom他1992 Biochim Biophys Acts 1120:
215-222、Raftery他1999 protein Expr Pu
rif 15:228-235に記述された手順に従うことによって、得ること
ができる。そうした組み換えタンパク質は、少なくともKlempt他1997
Febs Letter 408:81‐84に従って使用可能である。
コード化しているADNのヌクレオチド列、あるいは、ADNのヌクレオチド断
片については、核酸の列配列番号53、あるいは、その列の断片が知られている
。タンパク質、サポジンB(配列番号24)のすべて、あるいは、一部について
コード化しているヌクレオチド列、あるいは、断片ARNについては、遺伝コー
ドと撚り合せ現象を考慮に入れることによって、ADN列 配列番号53の前記
のすべての列が知られている。
てコード化しているADNのヌクレオチド列、あるいは、ADNのヌクレオチド
列の断片については、核酸の列配列番号31、あるいは、その列の断片が知られ
ている。GM2(配列番号8)の活性化体タンパク質のすべて、あるいは、一部
についてコード化しているARNのヌクレオチド列、あるいは、断片については
、遺伝コードと撚り合せ現象を考慮に入れることによって、ADN列 配列番号
31のすべての列が知られている。
ついてコード化しているADNのヌクレオチド列、あるいは、ADNのヌクレオ
チド断片については、核酸の列配列番号42、あるいは、その列の断片が知られ
ている。タンパク質、カルグラニュリンB(配列番号17)のすべて、あるいは
、一部についてコード化しているADNのヌクレオチド列、あるいは、断片につ
いては、遺伝コードと撚り合せ現象を考慮に入れることによって、ADN列配列
番号42の前記のすべての列が知られている。
化しているヌクレオチド列、あるいは、断片については、遺伝コードを考慮に入
れることによって、列配列番号9の前記の核酸の列が知られている。この突然変
異タンパク質B(配列番号9)のすべて、あるいは、一部についてコード化して
いるヌクレオチド列、あるいは、断片ARNについては、遺伝コードと撚り合せ
現象を考慮に入れることによって、列ADNの前記のすべての列が知られている
。
れている。この種の方法を知った人物の技術によって、このタンパク質の作用を
際立たせることができる。例えば、Li他1983,Am J Hum Gen
et 35:629‐634;Li他1988 J Biol Chem 26
3:6588‐6591,Li他1981 J Biol Chem 256:
6234‐6240及びLi他1976 J Biol Chem 251:1
159に記述された手順を使用することによって、サポジンB(配列番号24)
の作用、及びサポジンB(例えば、配列番号25-29)のグループのタンパク
質の作用を検知することができる。GM2(配列番号8)の活性化体タンパク質
の作用、及び同じグループのタンパク質(例えば、配列番号10-16)の作用
については、少なくとも、Kase他1996, Febs Letters
393:74‐76,Kishimoto他1992, j Lipid Re
s 33:1255‐1267及びO’Brien他1991 Faseb j
5:301‐308によって記述された手順を使用することによって検知され
た作用が知られている。カルグラニュリンB(配列番号17)の作用、及びカル
グラニュリンB(例えば、配列番号18-23)と同じグループのタンパク質の
作用については、少なくとも、例えば、Murthy他1993 J Immu
nol 151:6291‐6301及びNurao他1990 Cell G
rowth Differ 1:447‐454によって記述された手順を使用
することによって検知された作用が知られている。
は、技術的に実現可能である。手短に言えば、遺伝形質転換動物は、記述された
従来の方法を使用することによって生成され、それはゲノム中に組み込まれてお
り、タンパク質、あるいは、その断片について、核酸がコード化している。
を真皮内、静脈内、筋肉内、大脳内、経口、あるいは、その他の異なる経路で人
間に投与する。異なる用量を人間に投与する。最初の投与時の患者の臨床的資料
が知られている。異なる間隔で一回、あるいは、数回の投与を行うことができ、
各投与間は数日から数年にわたることができる。治療薬の投与後に決定した時間
間隔で、好ましくは、血液、血清、脳脊髄液、及び尿といった生物学的サンプル
を採取する。このサンプルから、異なる分析を行う。治療薬の最初の投与の直前
に、このサンプル採取と同じ分析も行う。同様に、分析の異なる時点で下記で説
明する補足的分析と平行して、典型的な臨床検査、及び生物学的検査(IRM、
脳脊髄液中のオリゴクローン帯、誘発電位)を行う。行った分析は、次のような
ものである:
の測定、及び/あるいは、 (ii)例えば、Li他1983,Am J Hum Genet 35:6
29‐634;Li他1988 J Biol Chem 263:6588‐
6591,Li他1981 J Biol Chem 256:6234‐62
40及びLi他1976 J Biol Chem 251:1159;Kas
e他1996, Febs Letters 393:74‐76,Kishi
moto他1992, j Lipid Res 33:1255‐1267及
びO’Brien他1991 Faseb j 5:301‐308;Murt
hy他1993 J Immunol 151:6291‐6301及びNur
ao他1990 Cell Growth Differ 1:447‐454
によって記述されたように単独、あるいは、組み合わせて、本発明において識別
された当該のタンパク質の作用の測定、及び/あるいは、 (iii)少なくともタンパク質、あるいは、その断片の一つに固着すること
ができる抗体、あるいは、抗体の断片を使用することによっる、ELISA、及
び/あるいは、Western Blotによる血液/血清、LCR、尿のサン
プル中の単独、あるいは、組み合わせた当該のタンパク質、あるいは、その断片
の用量決定、及び/あるいは、 (iv)単独、あるいは、組み合わせて天然タンパク質、あるいは、天然タン
パク質の断片、及び/あるいは、組み換えタンパク質、あるいは、その組み換え
タンパク質の断片を使用することによる、ELISA、及び/あるいは、Wes
tern Blotによる血液/血清、LCR、尿のサンプル中の当該のタンパ
ク質、あるいは、その断片の特定の抗体の用量決定。同様に、単独、あるいは、
組み合わせて識別された当該のタンパク質に固着することができるリガンドの用
量決定を行うことができる。及び/あるいは、 (v)例えば、投与された抗原(実例)の特定のリンパ球細胞Tの試験管内活
性化試験を実行することによって、当該のタンパク質、及びそのタンパク質に由
来するすべての免疫原性ペプチドに対して誘発された<<ヘルパー>>細胞免疫
、及び/あるいは、細胞毒性反応の用量決定。例えば、投与された抗原の特定の
リンパ球細胞Tの試験管内活性化試験を実行することによる(実例);例えば、
Schreibenbogen他1997 Clinical Cancer
Research 3:221‐226によって記述された前記のELISPO
T技術に従って細胞毒性リンパ球Tを定量化することによる。与えられた患者に
実施されたワクチン接種による取り組み方の効果を評価することが望まれる場合
、あるいは、単独、あるいは、組み合わせた抗原、当該のタンパク質、あるいは
、そのタンパク質に由来するすべての免疫原性断片に対して前記の患者に発生し
た自然免疫反応を際立たせることを追求することによって患者の潜在的な病理学
的状態を診断するために、そうした決定が特に有利である。 (vi)専門家に良く知られた技術に従ったヌクレオチド交雑による(Sou
thern blot, Northrn blot, ELOSA 「酵素結
合オリゴ吸着剤効力検定」(Katz JB他,Am.J.Vet.Res,1
993 Dec;54(12):2021‐6、及びFrancois Mal
let他、Journal of Clinical Microbiolog
y, June 1993,p1444‐1449 ))、及び/あるいは、当
該のタンパク質の列についてコード化している核酸の断片を使用することによる
、例えば、PCR,RT‐PCRによるADN、及び/あるいは、ARNの増幅
法による、当該のタンパク質、あるいは、そのタンパク質の断片についてコード
化しているADN、及び/あるいは、ARNの断片の検知、及び/あるいは、 (vii)組織、好ましくは、脳の生検、及びグリオ毒性分割に関連した活性
化体タンパク質の特徴的効果、すなわち、グリア細胞のapoptoseアアポ
プトーゼ、及び/あるいは、血液‐脳障壁の解放の観察、及び/あるいは、髄鞘
脱落現象の観察、及び/あるいは、 (viii)組織、あるいは、循環細胞(血液、LCR)の生検、当該のタン
パク質の存在の観察、及びリガンド、及び/あるいは、当該のタンパク質に固着
することができる抗体、あるいは、その断片を使用して、組織から採取した病歴
学的切片に関する免疫病歴学的観察、及び/あるいは、 (ix)組織、あるいは、循環細胞(血液、LCR)の生検、当該のタンパク
質の列から定義された核酸を使用することによって、当該のタンパク質について
コード化しているARN分子の自然環境の下での交雑による当該のタンパク質の
発現の観察、及び/あるいは、 (x)組織、あるいは、循環細胞(血液、LCR)の生検、当該のタンパク質
の列から定義された核酸を使用することによって、例えば、RT‐PCRといっ
た従来の技術によるARNの増幅による当該のタンパク質の発現の決定。
片、パールカンのC‐末端(配列番号2)、レチノル結合血漿タンパク質の前駆
体(配列番号4)、GM2の活性化体タンパク質(配列番号8)、GM2の活性
突然変異タンパク質(配列番号9)、カルグラニュリンB(配列番号17)、サ
ポジンB(配列番号24)、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体のグループに
属するタンパク質、あるいは、断片(例えば、配列番号5-7)、GM2の活性
突然変異タンパク質のグループに属するタンパク質、あるいは、断片(例えば、
配列番号10-16)、タンパク質、カルグラニュリンBのグループに属するタ
ンパク質、あるいは、断片(例えば、配列番号18-23)、タンパク質、サポ
ジンBのグループに属するタンパク質、あるいは、断片(例えば、配列番号25
-29)、及びペプチド列配列番号1-29のいずれかの一つとの少なくとも70
%の同一性を、好ましくは、少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくと
も98%の同一性を示すペプチド列を指す。 ‘本発明の当該のポリペプチド、及び/あるいは、タンパク質’についてコー
ド化している核酸の列ADN、あるいは、断片とは、断片、パールカンのC‐末
端についてコード化している核酸の列(配列番号2)、レチノル結合血漿タンパ
ク質の前駆体についてコード化している核酸の列(配列番号4)、GM2(配列
番号8)の活性化体タンパク質についてコード化している核酸の列(配列番号3
1)、GM2(配列番号9)の活性突然変異タンパク質についてコード化してい
る核酸の列、カルグラニュリンB(配列番号17)についてコード化している核
酸の列(配列番号53)、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体のグループに属
するタンパク質、あるいは、断片についてコード化している核酸の列ADN、及
び/あるいは、ARN(配列番号30-57)、GM2(例えば、配列番号10-
16)の活性化体タンパク質のグループに属するタンパク質、あるいは、断片、
タンパク質カルグラニュリンB(例えば、配列番号18-23)のグループに属
するタンパク質、あるいは、断片、タンパク質サポジンB(例えば、配列番号2
5-29)のグループに属するタンパク質、あるいは、断片を指す。
あるいは、その断片の中から、あるいは、前記の列(例えば、配列番号1、配列
番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-24、配列番号2
5-29)のグループに属するタンパク質に対応する列の中から選択されたタン
パク質、あるいは、タンパク質のバリエーション、及び独立して、あるいは、組
み合わせて、ペプチド列配列番号1-29のいずれか一つと、少なくとも70%
の同一性を、好ましくは、少なくとも80%の同一性を、及び有利には、少なく
とも98%の同一性を示すペプチド列は、細胞に対して、特に、グリア細胞に対
して直接的、あるいは、間接的な毒性効果を示し、それは、前掲の生物試験で明
示される。このタンパク質、あるいは、こうした複数のタンパク質が存在するこ
とによって発生した自己抗体は、自己免疫プロセスに関連している。また、治療
薬、あるいは、複数の治療薬の対象は、例えば、(i)その発現、及び/あるい
は、細胞間濃度、及び/あるいは、その循環濃度を調整する目的での天然タンパ
ク質、あるいは、複数の天然タンパク質、あるいは、そのバリエーション(ii
)、少なくともそうしたタンパク質の特定の抗体である。規定された治療薬、あ
るいは、複数の治療薬は、特定の免疫反応を発生させること、及び/あるいは、
それを和らげることによって直接、対象を除去する。
経学的疾患、好ましくは、プラーク硬化症に冒された哺乳類を治療するための薬
学的成分を作成するための生物学的資材に関するものであって、前記の成分は、
次のもので構成される:
て、あるいは、一部に対応している、少なくとも天然タンパク質、及び/あるい
は、組み換えタンパク質、あるいは、その断片、及び、パールカン、レチノル結
合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドGM2の活性化体の前駆体、カルグ
ラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列番号1、配列番号3、配列番号5
-7、配列番号10-16、配列番号18-23、配列番号25-29)の中から選
択された同じタンパク質のグループに属するペプチド列、あるいは、前記の列の
断片、及び、独立して、あるいは、組み合わせて、ペプチド列配列番号1-29
のいずれか一つと、少なくとも70%の同一性を、好ましくは、80%の同一性
を、有利には、98%の同一性を示すペプチド列、
べて、あるいは、一部に対応している、少なくとも前記のタンパク質、あるいは
、その断片の少なくとも特定のリガンド、及び、パールカン、レチノル結合血漿
タンパク質の前駆体、ガングリオシドGM2の活性化体の前駆体、カルグラニュ
リンB、及びサポジンB(例えば、配列番号1、配列番号3、配列番号5-7、
配列番号10-16、配列番号18-23、配列番号25-29)の中から選択さ
れた同じタンパク質のグループに属するペプチド列、あるいは、前記の列の断片
、及び、独立して、あるいは、組み合わせて、ペプチド列配列番号1-29のい
ずれか一つと、少なくとも70%の同一性を、好ましくは、少なくとも80%の
同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示すペプチド列、
べて、あるいは、一部に対応している少なくとも前記のタンパク質、あるいは、
その断片の特定のポリクロナル抗体、あるいは、モノクロナル抗体、及び、パー
ルカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドGM2の活性化
体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列番号1、配列
番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-23、配列番号2
5-29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属するペプチド列、
あるいは、前記の列の断片、及び、独立して、あるいは、組み合わせて、ペプチ
ド列配列番号1-29のいずれか一つと、少なくとも70%の同一性を、好まし
くは、少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示
すペプチド列、
タンパク質のグループに属するタンパク質のすべて、あるいは、一部についてコ
ード化しているADN及びARNの列(例えば、配列番号30-57)から、及
び当該の治療遺伝子の核酸列について遺伝的に変更するために対象細胞内におけ
る生体内の当該の治療遺伝子の前述の発現を保証する要素と関連してパールカン
、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、GM2の活性化体の前駆体、カルグラ
ニュリンB、及びサポジンBの中から選択された同じタンパク質のグループに属
するすべて、あるいは、一部についてコード化しているADN、及び/あるいは
、ARNの列(例えば、配列番号30-57)からその核酸列が推論される、少
なくとも一つの当該の治療遺伝子を含む少なくとも一つの核酸の列、
いは、そのタンパク質(複数)のすべての断片、あるいは、少なくとも前述のタ
ンパク質の特定の抗体を生成しない哺乳類の細胞、あるいは、 少なくとも一つの核酸列について試験管内で遺伝的に変更されている前記の哺乳
類の細胞の断片、 あるいは、同じ遺伝子、あるいは、異なる遺伝子に由来する核酸の断片に対応す
る核酸の列の断片、あるいは、核酸の列の結合、 配列番号2,4,8,9,17,及び24と記号表示されたタンパク質について
コード化しているADN及びARNの列から前記の核酸列が推論され、 ADN、及び/あるいは、ARNの列(例えば、配列番号30-57)が、パー
ルカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、GM2の活性化体の前駆体、カ
ルグラニュリンB、サポジンBの中から選択された同じタンパク質のグループに
属するタンパク質のすべて、あるいは、一部についてコード化しており、 前記の当該の治療遺伝子が当該のタンパク質、当該のタンパク質の断片、あるい
は、前記の動物の細胞の表面に出現する当該のタンパク質の特定の抗体のすべて
、あるいは、一部についてコード化している(Toes他、1997,PNAS 94:14660‐14665)。薬学的成分は、単一の対象に対してのみ方
向づけされた治療剤のみ、あるいは、幾つかの対象に対して組み合わせて方向づ
けされた薬剤を含むことができる。
片パールカンのC‐末端(配列番号2)、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体
(配列番号4)、GM2の活性化体タンパク質(配列番号8)、GM2の活性化
体の突然変異タンパク質(配列番号9)、カルグラニュリンB(配列番号17)
、サポジンB(配列番号24)、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体のグルー
プに属するタンパク質、あるいは、断片(例えば、配列番号5-7)、GM2の
活性化体タンパク質のグループに属するタンパク質、あるいは、断片(例えば、
配列番号10-16)、タンパク質カルグラニュリンBのグループに属するタン
パク質、あるいは、断片(例えば、配列番号18-23)、タンパク質サポジン
Bのグループに属するタンパク質、あるいは、断片(例えば、配列番号25-2
9)、及び、ペプチド列配列番号1-29のいずれか一つと、少なくとも70%
の同一性を、好ましくは、少なくとも80%の同一性を、有利には少なくとも9
8%の同一性を示すペプチド列を指す。
、専門家は、上記で記述した分子、及び/あるいは、前記の分子に固着すること
ができるすべての分子、及び/あるいは、前記の分子を抑制することができるす
べての分子を定義し、使用することができる。従って、本発明は、天然タンパク
質、及び/あるいは、組み換えタンパク質、及び/あるいは、合成ポリペプチド
、及びその断片、前記のタンパク質、あるいは、例えば、抗体といったその断片
(複数)に固着することができるリガンド;前記のタンパク質の発現、及び/あ
るいは、固着機能の抑制タンパク質に関するものである。
換えタンパク質(複数)、及び/あるいは、本発明で識別された当該のタンパク
質に対応する合成ポリペプチド(複数)の使用。
れた哺乳類を治療するための薬学的成分を作成するための生物学的資材に関する
ものである:
質、及び/あるいは、そのアミノ酸の列が配列番号2,4,8,9,17,及び
24と記号表示されたタンパク質の中から選択された合成ポリペプチド、及び、
パールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドGM2の活
性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列番号1、
配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-23、配列番
号25-29)の中から選択された同じタンパク質のグループにするしペプチド
列、あるいは、前記の列の断片、及び、単独、あるいは、組み合わせて、ペプチ
ド列配列番号1-29のいずれか一つと、少なくとも70%の同一性を、好まし
くは、少なくとも80%の同一性を、有利には少なくとも98%の同一性を示す
ペプチド列。
質の合成断片、例えば、対象のポリペプチドに対して免疫反応を発生させること
ができる免疫原性断片。
なくとも一つのmimotopeミモトープペプチド、及び、 パールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドGM2の活
性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列番号1、
配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-23、配列番
号25-29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属するペプチド
列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-29のいずれか
一つ、あるいは、対象のポリペプチドに対して免疫反応を発生させることができ
るミモトープの組み合わせと、少なくとも70%の同一性を、好ましくは、少な
くとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示すペプチド
列。
質(配列番号2,4,8,9,17,及び24)の転写、及び/あるいは、翻訳
を調整することができるすべてのタンパク質、あるいは、ペプチド、及び、パー
ルカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドGM2の活性化
体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列番号1、配列
番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-23、配列番号2
5-29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属するペプチド列、
あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-29のいずれか一つ
と、少なくとも70%の同一性を、好ましくは80%の同一性を、有利には98
%の同一性を示すペプチド列。独立して、あるいは、組み合わせたこうしたタン
パク質、及び/あるいは、ペプチドを投与することによって、組織内の当該のタ
ンパク質の濃度を回復することができる。
けることができ、一つは、抗原を使用するものであり(体液タイプ免疫反応)、
もう一つは、例えば、マクロファージ、細胞毒性リンパ球(CTL)、あるいは
、キラー細胞(NK)、また、<<ヘルパー>>Tリンパ球、すなわち、Tリン
パ球CD4+(細胞タイプ免疫反応)といった細胞毒性効果細胞を使用するもの
である。特に、2つのタイプの反応は、抗体が抗原を三次元形状で認識するとい
うこと、例えば、Tリンパ球は、組織適合性大型複合遺伝子(CMH)について
コード化された糖タンパク質に関連した前記の抗原の一部を認識するという点で
異なっている。すなわち、タイプIの組織適合性大型複合遺伝子は細胞の表面に
遍在的に出現し、タイプIIの組織適合性大型複合遺伝子は、抗原(APC)が
存在する場合に係わりあう細胞の表面に独自の仕方で出現する。1)第1の観点
に従って、細胞タイプの免疫反応は、CD4+タイプのT細胞(ヘルパーT細胞
)が既知の活性化現象(学術紙については、Alberolalia1997,
Annu rev Immunol15,125‐154を参照すること)に続
いて、サイトカインを生成し、次にサイトカインが前記のサイトカインを生成す
ることができるAPC細胞の増殖、抗原の特有な抗体を生成することができるB
リンパ球の細胞の判別、及び細胞毒性Tリンパ球(CTL)の刺激を誘発する、
ということが特徴である。2)細胞免疫反応の第2の観点に従って、例えば、C
D8+タイプのリンパ球(CTL)といった細胞毒性効果細胞は、a)偏在細胞
に保持された糖タンパク質に固着し、それによって生じた抗原ペプチドとの相互
作用後に活性化され、CMHIシステムに属する遺伝子によって、b)場合によ
っては、CD4+によって生成されたサイトカインによってコード化される。
列番号2,4,8,9,17,及び24)、あるいは、その断片(複数)、及び
ペプチド列、あるいは、前記のペプチド列の断片の投与に関するものであって、
そのペプチド列は、パールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガング
リオシドGM2の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例
えば、配列番号1、配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号
18-23、配列番号25-29)の中から選択された同じタンパク質のグループ
に属しており、そのペプチド列は、単独、あるいは、組み合わせて、プラーク硬
化症といった自己免疫病の予防、及び/あるいは、治療に関して、ペプチド列配
列番号1-29のいずれか一つと、少なくとも70%の同一性を、好ましくは、
少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示す。投
与されたこうしたタンパク質及びペプチドは、その毒性作用、例えば、グリオ毒
性作用を失わなければならない、あるいは、リガンドに固着する能力を失わなけ
ればならず、Tリンパ球によって仲介された免疫反応を明確に誘発することがで
き、及び/あるいは、そうしたタンパク質に向けられた抗体を使用する、という
ことを特徴とする。そうしたタンパク質は、”変更された”と言われるが、その
免疫原性は保持される。そうした変更された免疫原性分子は、従来の幾つかの処
理によって、例えば、アミノ酸の化学的、あるいは、加熱変性、切除、あるいは
、削除、挿入、あるいは、交換による突然変異によって得られる。切除の実例は
、5-30のアミノ酸に至ることのあるカルボキシル末端でのアミノ酸の切除で
ある。天然分子の合成技術、及び/あるいは、組み換え技術によって、あるいは
、化学的、あるいは、物理的処理によって、変更された分子を得ることができる
。
ク質(配列番号2,4,8,9,17,及び24)、及びパールカン、レチノル
結合血漿タンパク質の前駆体、GM2ガングリオシドの活性化体の前駆体、カル
グラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列番号1、配列番号3、配列番号
5-7、配列番号10-16、配列番号18-23、配列番号25-29)の中から
選択された同じタンパク質のグループに属するペプチド列、あるいは、前記のペ
プチド列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-29のいずれか一つ、あるいは
、その断片と、少なくとも70%の同一性を、好ましくは、少なくとも80%の
同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示すペプチド列は、自己免疫
病、好ましくは、SEPに対する予防及び治療ワクチン接種で使用される。ワク
チンには、許容可能な薬学的媒剤、及び場合によっては、補助薬、及び/あるい
は、希釈剤と組み合わせた免疫原タンパク質の有効免疫原量が含まれる。許容可
能な薬学的媒剤、補助薬、希釈剤は、専門家には良く知られている。参考のため
に、Remongton’s Pharmaceutical Science
sを引用することができる。病気の早期診断と組み合わせたワクチン成分の使用
が特に有利である。予防的及び治療的ワクチン接種用薬剤を作成する際に、免疫
原タンパク質を使用する。望ましくない副作用を誘発することなく、組織から当
該のタンパク質を除去することができる。そうしたワクチン・タンパク質、ある
いは、ペプチドの識別は、次のように行う:前述のような変更された分子の候補
(天然タンパク質、組み換えタンパク質、ペプチド)を機能試験で分析して、生
物試験と呼ばれる試験を使用して、例えば、グリオ毒性作用といったその毒性を
失ったことを確認する。その免疫原性を確認するために、(i)投与した抗原の
特有なCD8+Tリンパ球の増殖の試験管内試験(T細胞効力検定)、あるいは
、投与した抗原に特有なCD8+リンパ球の細胞毒性の試験管内試験を行い、(
ii)とりわけ、天然タンパク質に向けられた循環抗体の比率を測定する。適切
な補助薬と共に標準的手順によって人間に免疫を与えるために、この変更形態を
使用する。
懸濁液で注射をすることができる。オプションとして、調合品をエマルジョン化
することができる。抗原分子を、薬学的に許容可能で、活性成分と適合する賦形
剤と混合することができる。望ましい賦形剤の実例は、水、塩溶液、ブドウ糖、
グリセリン、エタノール、あるいは、それと同等のもの、及びその組み合わせで
ある。
を緩衝する薬剤、あるいは、水酸化アルミニウム、ムラミル・ジペプチド、ある
いは、そのバリエーションといった僅かな量の補助的物質を含めることができる
。ペプチドの場合、より大きな分子(KLH、破傷風毒素)との結合によって、
免疫原性が幾分増大する。慣習的に、皮下注射、あるいは、筋肉内注射によって
ワクチンを投与する。別の投与方法を用いた好都合な付加的な処方には、座薬、
及び経口処方がある。
0.1μg/ml-20mg/mlである。ポリヌクレオチドは、それが導入さ
れる対象細胞の同族であっても、異種であっても良い。
、不活性で当該のタンパク質(配列番号2,4,8,9,17,及び24)に対
応するその断片についてコード化している核酸分子を含むワクチンの使用に関す
るものであって、ペプチド列、あるいは、前記の列の断片は、パールカン、レチ
ノル結合血漿タンパク質の前駆体、GM2ガングリオシドの活性化体の前駆体、
カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列番号1、配列番号3、配列
番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-23、配列番号25-29)の中
から選択された同じタンパク質のグループに属しており、ペプチド列は、ペプチ
ド列配列番号1-29のいずれか一つ、あるいは、その断片と、少なくとも70
%の同一性を、好ましくは、少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくと
も98%の同一性を示す。核酸のワクチン、特に、ADNワクチンは、一般的に
許容可能な薬学的媒剤と組み合わせて筋肉内注射で投与される。
,及び24)、及びパールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、GM2
ガングリオシドの活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例
えば、配列番号1、配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号
18-23、配列番号25-29)の中から選択された同じタンパク質のグループ
に属するペプチド列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1
-29のいずれか一つ、あるいは、その断片と、少なくとも70%の同一性を、
好ましくは、少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一
性を示すペプチド列から、タンパク質の一次列のすべて、あるいは、一部に対応
するペプチド、あるいは、その断片を、ペプチド合成の従来の方法によって合成
するか、あるいは、遺伝子組み換えによって得ることができる。原核生物、ある
いは、真核生物細胞システム内に生成された当該のタンパク質に対応する組み換
えタンパク質を使用することができ、それには、様々なグループがあり、文献に
記載されている。同様に、専門家は、文献に記載された遺伝子列の知識から、遺
伝コードの縮重を考慮に入れて、それを製造することができる。本発明で識別し
たすべてのタンパク質列は、遺伝子組み換えで得ることができる。遺伝子は、適
合化されたベクターの中でクローン化される。原核生物細胞(例えば、E.co
li)、及び真核生物細胞(例えば、COS、CHO細胞、及びSimliki
細胞)を形質転換するためには、異なるベクターを使用する。原核生物、及び/
あるいは、真核生物細胞システムの中で、当該のタンパク質、あるいは、そのタ
ンパク質の断片に対応する組み換えタンパク質を作成することができる。E.c
oli細胞の場合、組み換えタンパク質は、ポリヒスチジン行列と共に生成され
る。不溶性タンパク質留分は、尿素8Mの中で可溶化される。ニッケルキレート
化樹脂(Qiagenキアゲン)上で生成物の濃縮が行われる。尿素の濃度を減
少させて、コロニーを洗浄した。尿素をなくしてイミダゾールを用いて、溶出を
行った。同様に、当該のタンパク質の完全な列を、適合させたプラスミドの中で
コロニー形成させ、次に、ワクチン・ウイルスに移して、組み換えウイルスを得
ることができる。
するための薬学的成分を作成するための生物学的資材に関するものであって、次
のようなもので構成される:
の中から選択されたタンパク質、及び/あるいは、タンパク質の断片、及び、パ
ールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、GM2ガングリオシドの活性
化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列番号1、配
列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-23、配列番号
25-29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属するペプチド列
、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-29のいずれか一
つ、あるいは、その断片と、少なくとも70%の同一性を、好ましくは、少なく
とも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示すペプチド列
に固着することができるリガンドであって、リガンドはタンパク質の作用を抑制
することができたり、できないことがある。
4の中から選択されたタンパク質、及び/あるいは、タンパク質の断片、及び、
パールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、GM2ガングリオシドの活
性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列番号1、
配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-23、配列番
号25-29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属するペプチド
列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-29のいずれか
一つ、あるいは、その断片と、少なくとも70%の同一性を、好ましくは、少な
くとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示すペプチド
列に固着することができるポリクロナル抗体、あるいは、モノクロナル抗体。こ
の抗体は、中和性であっても、なくても良い。すなわち、当該のタンパク質の作
用を抑制できても、できなくても良い。リガンドは、対象タンパク質、例えば、
そのタンパク質受容体、そのタンパク質の補助因子、タンパク質、あるいは、そ
のタンパク質の断片に固着することができるポリクロナル抗体、あるいは、モノ
クロナル抗体に固着することができるすべての分子、あるいは、分子の断片の中
から選択することができる。
抗原に対して向けられた免疫反応を監督するので、治療成分を使用できるように
するために、この抗体は非常に有用である。その機能を抑制するために中和性の
可溶性抗体を、また、免疫複合の形成によるペプチドを無くすために特定の可溶
性抗体を患者に投与する。本発明は、変性、及び/あるいは、神経学的、及び/
あるいは、自己免疫性疾患、好ましくは、プラーク硬化症の治療、及び/あるい
は、臨床追跡調査のために、特に、少なくとも本発明に記述したタンパク質を識
別することができる抗体の使用を記述している。この抗体は、ポリクロナル抗体
、及び好ましくは、モノクロナル抗体である。好ましくは、この抗体は、タンパ
ク質の活性部位を識別して、固着し、タンパク質の機能を抑制する。特に、タン
パク質に固着する抗体の能力は、例えば、ELISA、あるいは、Wester
n Blot試験といった記述した従来の技術によって、免疫原タンパク質、あ
るいは、天然免疫原ペプチド、あるいは、合成免疫原ペプチドを使用することに
よって分析されている。抗体の適定量が決定されている。タンパク質の機能を中
和する抗体の能力は、異なる方法によって、例えば、抗体の存在による免疫原タ
ンパク質、あるいは、免疫原ペプチドの作用の減少を決定することによって、好
ましくは、試験管内生物試験を使用してグリオ毒性作用の減少を決定することに
よって分析することができる。
クロナル抗体は、表面の抗原に対する抗体を生産するために使用された従来の技
術によって生成される。(i)当該の天然タンパク質、あるいは、組み換えタン
パク質を用いて、(ii)当該のタンパク質のすべての免疫原ペプチドを用いて
、(iii)当該のタンパク質、あるいは、ペプチド、及びCMGIIの分子を
発現するハツカネズミの細胞を用いて、ハツカネズミ、あるいは、ウサギに免疫
を与える。Balb/cのハツカネズミの血統が、もっとも頻繁に使用されてい
る。同様に、免疫原は、当該のタンパク質の一次列から定義されたペプチドの中
から選択されたペプチドである。例えば、次のように免疫原を作成する:ガング
リオシドGM2の前駆体の列に由来するペプチド配列番号58,59,60、サ
ポジンBの列に由来するペプチド配列番号61,62、及び、カルグラニュリン
Bに由来するペプチド配列番号63,64,65を免疫で使用するためのサポー
トとしてLymphet Keyholeリンフェットキーホール、略してペプ
チド‐KLHのヘモシアニンに結合するか、あるいは、人間の血清アルブミン、
略してペプチド‐HSAに結合する。Freundの完全補助薬(IFA)を使
用して、ペプチド‐KLH、あるいは、ペプチド‐HSAを動物に注射する。最
初のタンパク質を用いて、ELISA試験によって抗タンパク質抗体が存在する
かどうか、各ペプチドによって免疫を与えられた動物に由来するhybrido
meヒブリドームの培養血清及び浮遊物を分析する。従って、ハツカネズミの脾
臓の細胞を回収し、骨髄腫細胞と融合させる。ポリエチレングリコール(PEG
)は、最も頻繁に使用される融合剤である。最も特有で、最も敏感なな抗体を生
成するヒブリドムを選択する。作成されたヒブリドームの細胞培養によって、あ
るいは、ハツカネズミのヒブリドームの腹膜内注射後にハツカネズミの腹水から
回収することによって、試験管内でモノクロナル抗体を生成することができる。
浮遊物、あるいは、腹水による生産方法であれ、続いて、モノクロナル抗体を精
製することが重要である。使用する精製方法は、主として、ゲル・イオン交換器
による濾過か、あるいは、除去クロマトグラフィー、さらには、免疫沈殿である
。各抗体について、最良の効率が得られる方法を選択しなければならない。当該
のタンパク質に固着するために、及び/あるいは、当該のタンパク質の作用を阻
止するために最も高性能な抗体を識別するために、機能試験で抗タンパク質抗体
の十分な数を選別する。<<CDRグラフティング>>の標準的方法(サービス
の形で数多くの企業によって実現された手順)によって、選択したモノクロナル
抗体を人間に適合させる。人間に適合させたこの抗体を患者で臨床的に試験する
ことができる。臨床的パラメータによって、この抗体の効果を追跡調査すること
ができる。
生産、真核生物細胞内における遺伝子工学による生産が記述されており(EP1
20 694、あるいは、EP125 023)、本発明にも応用可能である。
患、好ましくは、プラーク硬化症に冒された哺乳類を治療するための薬学的成分
を作成するための生物学的資材に関するものであって、前記の成分は、次のもの
で構成される: (i)本発明で識別されたタンパク質(配列番号2,4,8,9,17,24)
、及び、パールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドG
M2の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列
番号1、配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-23
、配列番号25-29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属する
ペプチド列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-29の
いずれか一つ、あるいは、その断片と、少なくとも70%の同一性を、好ましく
は、少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示す
ペプチド列の中から選択された少なくとも一つのタンパク質の機能の少なくとも
一つの抑制分子、例えば、グリオ毒性作用の抑制、 (ii)例えば、転写、あるいは、翻訳を妨害するための、タンパク質配列番号
2,4,8,9,17,24、及び、パールカン、レチノル結合血漿タンパク質
の前駆体、ガングリオシドGM2の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及
びサポジンB(例えば、配列番号1、配列番号3、配列番号5-7、配列番号1
0-16、配列番号18-23、配列番号25-29)の中から選択された同じタ
ンパク質のグループに属するペプチド列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペ
プチド列配列番号1-29のいずれか一つ、あるいは、その断片と、少なくとも
70%の同一性を、好ましくは、少なくとも80%の同一性を、有利には、少な
くとも98%の同一性を示すペプチド列の中から選択された少なくとも一つのタ
ンパク質の発現の少なくとも一つの調整分子、 (iii)タンパク質配列番号2,4,8,9,17,24、及び、パールカン
、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドGM2の活性化体の前
駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列番号1、配列番号3
、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-23、配列番号25-29
)の中から選択された同じタンパク質のグループに属するペプチド列、あるいは
、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-29のいずれか一つ、あるい
は、その断片と、少なくとも70%の同一性を、好ましくは、少なくとも80%
の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示すペプチド列の中から選
択された少なくとも一つのタンパク質の代謝の少なくとも一つの調整分子、 (iv)例えば、受容器、あるいは、補助因子といった、タンパク質配列番号2
,4,8,9,17,24、及び、パールカン、レチノル結合血漿タンパク質の
前駆体、ガングリオシドGM2の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及び
サポジンB(例えば、配列番号1、配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-
16、配列番号18-23、配列番号25-29)の中から選択された同じタンパ
ク質のグループに属するペプチド列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチ
ド列配列番号1-8と配列番号10-29のいずれか一つ、あるいは、その断片と
、少なくとも70%の同一性を、好ましくは、少なくとも80%の同一性を、有
利には、少なくとも98%の同一性を示すペプチド列、ペプチド列配列番号1-
29のいずれか一つ、あるいは、その断片と、少なくとも70%の同一性を、好
ましくは、少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性
を示すペプチド列の中から選択された少なくとも一つのタンパク質の臨床の発現
、及び/あるいは、代謝の少なくとも一つの調整分子。二次的効果なしに人間の
組織のタンパク質を抑制することができると考えられる。
、合成物質の治療効率識別及び評価に関するものである:
,9,17,24、及び、パールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、
ガングリオシドGM2の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジン
B(例えば、配列番号1、配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配
列番号18-23、配列番号25-29)の中から選択された同じタンパク質のグ
ループに属するペプチド列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列
番号1-29のいずれか一つ、あるいは、その断片と、少なくとも70%の同一
性を、好ましくは、少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%
の同一性を示すペプチド列の作用を阻止、及び/あるいは、抑止することができ
る。及び/あるいは、
ように代謝を抑止することができる。及び/あるいは、
パールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドGM2の活
性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列番号1、
配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-23、配列番
号25-29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属するペプチド
列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-29のいずれか
一つ、あるいは、その断片と、少なくとも70%の同一性を、好ましくは、少な
くとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示すペプチド
列の発現を調整することができる。及び/あるいは、
,4,8,9,17,24、及びパールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前
駆体、ガングリオシドGM2の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサ
ポジンB(例えば、配列番号1、配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-1
6、配列番号18-23、配列番号25-29)の中から選択された同じタンパク
質のグループに属するペプチド列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド
列配列番号1-29のいずれか一つ、あるいは、その断片と、少なくとも70%
の同一性を、好ましくは、少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくとも
98%の同一性を示すペプチド列の機能、及び/あるいは、発現を抑止すること
ができる。こうした物質は、病気の疾病予防的及び治療的処置に使用することが
できる。本発明は、同様に、そうした物質の有効量を投与することによって、例
えば、SEPといった自己免疫病を治療、予防するための方法に関するものであ
る。こうした物質は、タンパク質、抗体、合成あるいは天然小分子、本発明で識
別されたタンパク質の誘導体、脂質、糖脂質、等であっても良い。化学コンビネ
ーション・ライブラリを使用することによって、大量に小分子を選別、識別する
ことができる。本発明は、同様に、許容可能な生理学的キャリアと組み合わせた
そうした物質を含む薬学的成分、及びそうした物質を使用することによって、S
EPといった自己免疫病の治療、あるいは、予防で使用すべき薬剤を作成するた
めの方法に関するものである。
自己免疫性疾患のための候補薬剤といった小分子量の抑制分子を識別するために
、治療した患者と治療しない患者から、治療したモデル動物と治療しないモデル
動物から、あるいは、治療したモデル動物と治療しないモデル動物の組織から採
取したサンプルを使用して、参考として特許請求に含まれた前述の試験及び手順
を使用する。本発明のこの観点には、同様に、当該のタンパク質の作用を阻止、
あるいは、抑制することができる物質を識別するための方法が含まれ、試験管内
試験、あるいは、生体内動物モデルでの物質の導入も含まれる。それが価値ある
候補薬剤であるかどうかを知るために、こうした抑制体は、有毒性及び薬物動力
学的試験でも試験される。この選別手順でタンパク質の作用、あるいは、タンパ
ク質の発現の抑制、あるいは、阻止に関して試験する物質は、タンパク質、抗体
、抗体の断片、合成、あるいは、天然小分子、当該のタンパク質からの誘導体、
等とすることができる。化学コンビネーション・ライブラリを使用することによ
って、大量に小分子を選別、識別することができる。
制体、パールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドGM
2の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列番
号1、配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-23、
配列番号25-29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属するペ
プチド列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-29のい
ずれか一つ、あるいは、その断片と、少なくとも70%の同一性を、好ましくは
、少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示すペ
プチド列、及び、前記のタンパク質の断片の抑制体。特に、プラーク硬化症の治
療のために、疾病予防的及び治療的成分にこうした抑制体を含めることができる
。例えば、リコリン、Amaryllidacae(ex:Crinum As
iaticum)から抽出されたアルカロイドは、試験管内で0.1-0.5μ
g/mlの濃度で、生体内で0.1-1mg/kg/日の濃度で使用される。例
えば、phosphodiesterases 4(PDE4)の抑制体と同じ
グループの2分子であるRolipram(商品名)及びIbudilast(
商品名)は、試験管内で1-10μM/lの濃度で、生体内で10mg/kg/
日の濃度で使用される。
ルカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドGM2の活性化
体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列番号1、配列
番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-23、配列番号2
5-29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属するペプチド列、
あるいは、前記の列の断片から、遺伝コード及びその縮重を考慮に入れることに
よって、当該のタンパク質のグループのタンパク質(例えば、配列番号32-4
1、配列番号43-52、配列番号54-57、配列番号66-67)についてコ
ード化している、当該のタンパク質、あるいは、その列に対応するヌクレオチド
列ADN及びARN(配列番号30,31,42,53)を推論することができ
る、ということが明らかである。また、本発明は、下記のような形のヌクレオチ
ド列の使用に関するものである:
ベクターに入れることができる列(遺伝子治療)
方向アミノ酸、及び/あるいは、治療遺伝子についてコード化しているアミノ酸
の使用。
患、好ましくは、プラーク硬化症に冒された哺乳類を治療するための薬学的成分
を作成するための生物学的資材に関するものであって、前記の成分は、次のもの
で構成される: (i)当該のタンパク質(配列番号2,4,8,9,17,24)、及びパール
カン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドGM2の活性化体
の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列番号1、配列番
号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-23、配列番号25-
29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属するペプチド列、ある
いは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-29のいずれか一つ、あ
るいは、その断片と、少なくとも70%の同一性を、好ましくは、少なくとも8
0%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示すペプチド列、ある
いは、その断片についてコード化している核酸の列に交雑することができる少な
くとも一つの核酸の列、 (ii)当該のタンパク質(配列番号2,4,8,9,17,24)、及びパー
ルカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドGM2の活性化
体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列番号1、配列
番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-23、配列番号2
5-29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属するペプチド列、
あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-29のいずれか一つ
、あるいは、その断片と、少なくとも70%の同一性を、好ましくは、少なくと
も80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示すペプチド列、
あるいは、その断片についてコード化している少なくとも一つの当該の治療遺伝
子を含む少なくとも一つの核酸の列、及び、生体内で前記の核酸の列について遺
伝的に変更されるよう定められた対象細胞の中で前記の遺伝子の発現を保証して
いる要素。
いは、単独、あるいは、合成、ヌクレオチド精密濃縮と呼ばれ、変更されている
か、あるいは、変更されておらず、ADNc;ゲノムADN;プラスミドADN
;メッセンジャーARNで構成されるグループの中から選択された核酸の列の断
片、あるいは、一つの領域を定義することができるADN、及び/あるいは、A
RNの断片が知られている。こうした核酸の列は、タンパク質配列番号2,4,
8,9,17,24、及び、パールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体
、ガングリオシドGM2の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジ
ンB(例えば、配列番号1、配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、
配列番号18-23、配列番号25-29)の中から選択された同じタンパク質の
グループに属するペプチド列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配
列番号1-29のいずれか一つ、あるいは、その断片と、少なくとも70%の同
一性を、好ましくは、少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98
%の同一性を示すペプチド列のアミノ酸の列から、遺伝子コードを使用すること
によって推論される。遺伝コードの縮重を理由として、本発明は、また、同等、
あるいは、同族の列も含む。限定されたこの列によって、専門家は、自身で適合
した核酸を定義することができる。
2,4,8,9,17,24)、及び、パールカン、レチノル結合血漿タンパク
質の前駆体、ガングリオシドGM2の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、
及びサポジンB(例えば、配列番号1、配列番号3、配列番号5-7、配列番号
10-16、配列番号18-23、配列番号25-29)の中から選択された同じ
タンパク質のグループに属するペプチド列、あるいは、前記の列の断片、及び、
ペプチド列配列番号1-29のいずれか一つ、あるいは、その断片と、少なくと
も70%の同一性を、好ましくは、少なくとも80%の同一性を、有利には、少
なくとも98%の同一性を示すペプチド列についてコード化している核酸の列に
交雑することができる少なくとも一つの核酸の列を含む薬学的成分を作成するた
めの生物学的資材に関するものである。
ADN、及び/あるいは、ARNの列の相補的核酸を定義し、使用することで構
成されている。この断片は、逆方向分子、あるいは、リボザイムに対応しており
、Applied Biosystem社によって販売されているような自動合
成器を用いて合成することができる。本発明は、厳格な条件のもとで、本発明の
タンパク質、あるいは、その断片(複数)についてコード化しているADN、及
び/あるいは、ARNに交雑することができるこうした核酸の使用を記述してい
る。特徴的な厳格な条件とは、研究交雑種のTm(溶解温度)下のほぼ12-2
0℃に選択された温度と塩分濃度の組み合わせに対応するものである。そうした
分子を合成して、分子サンプリングに使用される従来のマーキング方法を使用す
ることによって、マーキングすることができ、あるいは、増幅反応における誘発
剤として使用することができる。基準列に対して少なくとも90%の相同を示す
列も本発明の一部であり、同様に、基準列に対して密接に相同な少なくとも20
のヌクレオチド、及び好ましくは、30のヌクレオチドを有するその列の断片も
本発明の一部である。天然ペプチド、あるいは、そのバリエーションの比率を削
減するために、逆方向、及び/あるいは、リボザイムの取り組み方を検討するこ
とができる。そうした取り組み方は、文献に広範に記載されている。もちろん、
そうした逆方向分子は、ベクターとすることができる。同様に、逆方向について
コード化している核酸の列を含むベクターを使用することができる。
び/あるいは、神経学的疾患に冒された哺乳類を治療するための薬学的成分を作
成するための生物学的資材に関するものであり、前記の成分は、少なくとも当該
の治療遺伝子、及び前記の核酸の列について遺伝的に変更するために対象細胞内
での生体内での前記の遺伝子の発現を保証する要素を含む少なくとも核酸の列を
含む。
質、あるいは、タンパク質の断片についてコード化しているもの)により、(i
)ベクターによって導入された目標分子を使用することによって、(ii)細胞
の特定の特性を使用することによって、マクロファージ細胞のような、その中で
ペプチドが発現する細胞を選別することができる。
含むベクターの使用。
び/あるいは、神経学的疾患に冒された哺乳類を予防及び治療するための薬学的
成分を作成するための生物学的資材に関するものであり、成分は、当該の治療遺
伝子、及び前記の当該の遺伝子の発現要素を含む。遺伝子は、変異させてあって
も、なくとも良い。同様に、それは、対象細胞に組み込みができないように変更
された核酸、あるいは、スペルミンといった薬剤を用いて安定化された核酸で構
成することができる。
)、、及び、パールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシ
ドGM2の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、
配列番号1、配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-
23、配列番号25-29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属
するペプチド列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-2
9のいずれか一つ、あるいは、その断片と、少なくとも70%の同一性を、好ま
しくは、少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を
示すペプチド列、あるいは、その断片(複数)の中から選択された少なくとも一
つのタンパク質。
4)、及び、パールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシ
ドGM2の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、
配列番号1、配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-
23、配列番号25-29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属
するペプチド列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-2
9のいずれか一つ、あるいは、その断片と、少なくとも70%の同一性を、好ま
しくは、少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を
示すペプチド列の中から選択された少なくとも一つのタンパク質、あるいは、タ
ンパク質の断片に固着することができる少なくともポリクロナル抗体、あるいは
、モノクロナル抗体のすべて、あるいは、一部について。特に、前記の抗体、断
片、あるいは、抗体の誘導体が遺伝的に変更された哺乳類の対象細胞の表面に発
現し、竿防毒性効果細胞の表面に、あるいは、そうした細胞の活性化手順に係わ
るヘルパーTリンパ球の表面に存在するポリペプチドに固着できる限りでは、天
然の経膜抗体、あるいは、断片、あるいは、そうした抗体の誘導体が問題となる
。
及び、パールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドGM
2の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列番
号1、配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-23、
配列番号25-29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属するペ
プチド列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-29のい
ずれか一つ、あるいは、その断片と、少なくとも70%の同一性を、好ましくは
、少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示すペ
プチド列の中から選択された少なくとも一つのタンパク質、あるいは、その断片
の少なくとも一つの抑制分子;タンパク質配列番号2,4,8,9,17,24
、及び、パールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドG
M2の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列
番号1、配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-23
、配列番号25-29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属する
ペプチド列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-29の
いずれか一つ、あるいは、その断片と、少なくとも70%の同一性を、好ましく
は、少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示す
ペプチド列の機能、及び/あるいは、代謝、及び/あるいは、固着の抑制タンパ
ク質、
び、パールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドGM2
の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列番号
1、配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-23、配
列番号25-29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属するペプ
チド列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-29のいず
れか一つ、あるいは、その断片と、少なくとも70%の同一性を、好ましくは、
少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示すペプ
チド列の中から選択された少なくとも一つのタンパク質、あるいは、タンパク質
の断片に固着することができる少なくとも一つのリガンド、あるいは、リガンド
のすべての部分、及び/あるいは、その機能の抑制体。
(Blazar他,1997,Journal of Immunology
159:5821‐5833;Bird他,1988 Science 242
:423‐426)が知られており、誘導体については、例えば、そうした抗体
のキメラ誘導体が知られている(例えば、ハツカネズミ/人antiCD3キメ
ラ抗体、Arakawa他1996J Biochem 120:657‐66
2、あるいは、イムノトキシンsFv‐toxine、Chaudary他19
89,Nature339:394‐307を参照すること)。経膜抗体につい
ては、前記の認識と固着を可能にするために、少なくとも、特定の抗原を認識し
、それに固着することができるその機能領域が対象細胞の表面に発現する、抗体
が知られている。特に、本発明に従った抗体は、上述の機能領域を定義するアミ
ノ酸を含む融合ポリペプチド、及び対象細胞の二重膜脂質層の内部への、あるい
は、その二重層の外部表面への定着を可能にするアミノ酸の列(経膜ポリペプチ
ド)で構成される。幾つかの経膜ポリペプチドについてコード化している核酸列
は、文献に記載されている。最も有利な事例に従って、抗体の重連鎖についてコ
ード化している核酸の列は、前記の経膜ポリペプチドについてコード化している
核酸の列と融合している。
の転送後の前記の遺伝子の発現を保証するために必要な要素が指摘されている。
特に、プロモーター列、及び/あるいは、前記の細胞中の有効領域の列、及び、
特に、前記のポリペプチドの対象細胞の表面での発現を可能にするために必要な
列が問題となる。使用するプロモーターは、偏在、あるいは、組織に特有なウイ
ルス・プロモーター、あるいは、合成プロモーターであっても良い。実例として
、ウイルス・プロモーターRSV(Rous Sarcoma Virus)、
MPSV、SV40(Simian Virus)、CMV(Cytomega
lovirus)、あるいは、ワクチンウイルス、筋肉クレアチン・キナーゼに
ついて、アクチンについてコード化している遺伝子プロモーターといったプロモ
ーターが挙られる。また、与えられた細胞タイプに特有な、あるいは、規定の条
件で活性化可能なプロモーター列を選択することができる。文献には、プロモー
ター列に関する多数の情報が記載されている。
なる少なくとも2つの列、及び/あるいは、プロモーターの転写機能、あるいは
、前記の遺伝子の転写が影響を受けない限りで、隣接して、離れて同じ方向、あ
るいは、逆方向に位置する互いに同一、あるいは、異なる2つの遺伝子を含むこ
とができる。
撚り継ぎされる<<中性>>核酸列、あるいは、イントロンを導入することがで
きる。そうした列、及びその使用は、文献に記載されている(参考文献:特許請
求PCT WO 94/29471)。
転写、及び/あるいは、翻訳のために、細胞内輸送に必要な列を含むことができ
る。そうした列は、専門家には良く知られている。
み込まれないように変更されたアミノ酸、あるいは、例えば、トランスフェクシ
ョンの効率に影響を与えないスペルミンといった薬剤によって安定化されたアミ
ノ酸であっても良い。
Nの列である。すなわち、細胞への導入を容易にあらゆる化合物がないというこ
とである(核酸列の転送)。いずれにせよ、本発明の第2の実現方法に従って、
対象細胞への導入を容易にするために、また、本発明の遺伝的に変更された細胞
を得るために、この核酸の列は、<<ベクター>>の形に、特に、ウイルス・ベ
クター、例えば、アデノウイスル・ベクター、レトロウイルス・ベクター、ポッ
クスウイルスに由来するベクター、特に、ワクチンウイルス、あるいは、変更ウ
イルスAnkara(MVA)に由来するベクター、あるいは、例えば、陽イオ
ン両親媒性化合物、特に、陽イオン脂質、陽イオンあるいは中性ポリマー、特に
、プロピレン・グリコール、ポリエチレン・グリコール、グリセロール、エタノ
ール、1‐メチルL‐2ピロリドン、あるいは、その誘導体の中から選択された
実用極性化合物、及び、特に、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジエチルス
ルホキシド、ジ‐n‐プロピルスルホキシド、ジメチルスルホン、スルホラン、
ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、tetramethylure
eテトラメチルウレ、アセトニトリル、あるいは、その誘導体の中から選択され
たaprotiqueアプロティック極性化合物で構成されたグループの中から
選択された少なくとも一つの運搬分子、あるいは、物質に複合化、あるいは、結
合された少なくとも一つの前記の核酸の列で構成されたベクターといった非ウイ
ルス・ベクターとすることができる。文献には、そうしたウイルス・ベクターや
、非ウイルス・ベクターの数多くの重要な実例が記載されている。
といった一定のタイプの細胞、あるいは、特定の組織に向けられた核酸の列の転
送の案内を可能にするターゲット設定要素を含むことができる。同様に、例えば
、核、ミトコンドリア、あるいは、ペルオキシソームといった所望の一定の細胞
間区画に向けた活性物質の転送を案内することができる。とりわけ、細胞の内部
への侵入、あるいは、細胞間区画の溶解を容易にする要素が問題となる。文献に
は、そうしたターゲット設定要素が広範に記載されている。例えば、レクチン、
ペプチド、特に、ペプチドJTS‐1(特許請求、PCT WO94/4095
8を参照すること)、オリゴヌクレオチド、脂質、ホルモン、ビタミン、抗原、
抗体、膜受容器の特定のリガンド、抗リガンドと反応する敏感なリガンド、fu
sogenesヒューソゲン融合原ペプチド、核局在ペプチド、あるいは、そう
した化合物の成分のすべて、あるいは、一部が問題となる。
)、及び、パールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシド
GM2の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配
列番号1、配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-2
3、配列番号25-29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属す
るペプチド列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-29
のいずれか一つ、あるいは、その断片と、少なくとも70%の同一性を、好まし
くは、少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示
すペプチド列から定義された少なくとも一つの当該の治療遺伝子を含むベクター
の注射後の生体内での形質転換された細胞の使用。
患、好ましくは、プラーク硬化症に冒された哺乳類を治療するための薬学的成分
を作成するための生物学的資材に関するものであって、成分は、生体内で対象細
胞に導入することができ、生体内で当該の治療遺伝子を発現させることができる
下記に記述するような治療遺伝子を含む少なくとも一つのベクターを含む。本発
明の利点は、長期間、治療を受けた患者の中に発現された分子の基礎レベルを維
持できることにある。治療遺伝子についてコード化しているベクター、あるいは
、核酸を注射する。このベクター、あるいは、核酸は、対象細胞に転送され、生
体内で発現すべき細胞にトランスフェクションされなければならない。
いは、ベクターの生体内発現に関するものである。すなわち、特に、次のような
ものについてコード化している当該の治療遺伝子に対応する列である:
)の中から選択された少なくとも一つのタンパク質、及び、パールカン、レチノ
ル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドGM2の活性化体の前駆体、カ
ルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列番号1、配列番号3、配列番
号5-7、配列番号10-16、配列番号18-23、配列番号25-29)の中か
ら選択された同じタンパク質のグループに属するペプチド列、あるいは、前記の
列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-29のいずれか一つ、あるいは、その
断片と、少なくとも70%の同一性を、好ましくは、少なくとも80%の同一性
を、有利には、少なくとも98%の同一性を示すペプチド列の中から選択された
少なくとも一つのタンパク質、あるいは、その断片(複数)、
)、及び、パールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシド
GM2の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配
列番号1、配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-2
3、配列番号25-29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属す
るペプチド列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-29
のいずれか一つ、あるいは、その断片と、少なくとも70%の同一性を、好まし
くは、少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示
すペプチド列の中から選択された少なくとも一つのタンパク質に固着することが
できるポリクロナル抗体、あるいは、モノクロナル抗体の少なくともすべて、あ
るいは、一部。前記の抗体、断片、あるいは、抗体の誘導体が遺伝的に変更され
た哺乳類の対象細胞の表面で発現し、前記の抗体が、細胞毒性効果細胞、あるい
は、ヘルパーTリンパ球の表面に存在するポリペプチドに固着することができ、
そうした細胞の活性化の手順に係わる限りでは、天然の経膜抗体、あるいは、断
片、あるいは、抗体の誘導体が問題となることがある。哺乳類の血液循環中に前
記の抗体を分泌することができる細胞によって出現する抗体の断片、あるいは、
抗原についてコード化している遺伝子によって遺伝的に変更された細胞を持つ患
者が問題となることがある。
び、パールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドGM2
の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列番号
1、配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-23、配
列番号25-29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属するペプ
チド列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-29のいず
れか一つ、あるいは、その断片と、少なくとも70%の同一性を、好ましくは、
少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示すペプ
チド列の中から選択された少なくとも一つのタンパク質の抑制分子;機能、及び
/あるいは、代謝、及び/あるいは、タンパク質配列番号2,4,8,9,17
,24、及び、パールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオ
シドGM2の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば
、配列番号1、配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18
-23、配列番号25-29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属
するペプチド列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-2
9のいずれか一つ、あるいは、その断片と、少なくとも70%の同一性を、好ま
しくは、少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を
示すペプチド列の固着の抑制タンパク質、
及び、パールカン、レチノル結合血漿タンパク質の前駆体、ガングリオシドGM
2の活性化体の前駆体、カルグラニュリンB、及びサポジンB(例えば、配列番
号1、配列番号3、配列番号5-7、配列番号10-16、配列番号18-23、
配列番号25-29)の中から選択された同じタンパク質のグループに属するペ
プチド列、あるいは、前記の列の断片、及び、ペプチド列配列番号1-29のい
ずれか一つ、あるいは、その断片と、少なくとも70%の同一性を、好ましくは
、少なくとも80%の同一性を、有利には、少なくとも98%の同一性を示すペ
プチド列の中から選択された少なくとも一つのタンパク質に固着することができ
る少なくとも一つのリガンド、あるいは、リガンドのすべて、あるいは、一部、
及び/あるいは、その機能の抑制体。
ーゲットになっている分子に対する免疫反応、即ち、配列番号が2、4、8、9
、17および24である蛋白質、ならびにperlecan(パールカン)およ
びレチノールに結合している血漿蛋白質の先駆物質の間で選ばれる、ガングリオ
シッドGM[免疫グロブリン]2、カルグラニュリンBおよびサポニンB(例え
ば、配列番号が1、3、5から7、10から16、18から23および25から
29)のアクチヴェーター先駆物質の同じ蛋白質系列に属しているペプチド配列
、あるいは前述した配列のフラグメント、ならびに配列番号が1から29である
ペプチド配列のいずれかと少なくとも70%、とりわけ少なくとも80%、好ま
しくは少なくとも98%同一であるペプチド配列、ならびにその(それらの)フ
ラグメントの間で選ばれる蛋白質全てに対する、また/もしくは前述したこれら
の蛋白質、および/あるいは例えば、レセプターのような前述した蛋白質のリガ
ンドの機能、および/あるいは表示、および/あるいは代謝の抑制分子全てに対
する免疫反応をもたらすように使用することが問題になっている。このため明ら
かに、ヴェクターによって転換するターゲットになっている細胞は、リンパ細胞
タイプの細胞(CD[サイクロデキストリン]4/CD8)であるか、それとも
抗原を呈している細胞(樹枝状細胞、大食細胞等)であるかの免疫系に属してい
る細胞である。
細胞(CPA)を変えていく。大食細胞、樹枝状細胞、小膠芽細胞および星状細
胞のようなCPAは、免疫反応の初期段階で役割を演じている。これらの細胞は
最初の細胞構成要素であり、細胞内で抗原を捕らえて、これをつくりあげ、T細
胞CD4+およびCD8+に免疫原が現れると、これに関係する膜間CMHIお
よびCMHIIの細胞を示して、T細胞の活性化に加わる特異な補助蛋白質をつ
くりだしている(デブリック他、1991年、免疫学雑誌 147:2846;
レイス他、1993年、ヨーロッパ医学雑誌 178:509;コヴァチョヴィ
ッチ‐バンコフスキ他、1993年、PNAS 90:4942;コヴァチョヴ
ィッチ‐バンコフスキ他、1995年、サイエンス 267:.243;スヴェ
ンスソン他、1997年、免疫学雑誌 158:4229;ノーバリー他、19
97年、ヨーロッパ免疫学雑誌 27:280)。接種には、遺伝子をAPCの
ような細胞に転移させるターゲットにすることができる遺伝子治療のシステムを
、即ち、自らの細胞内形成および《プロセッシング》の後で、それぞれCD8+
および/あるいはCD4+細胞の表面における錯体CMHIおよび錯体CMHI
Iの分子によって、これらの細胞に現れるポリペプチドに、遺伝子コードを指定
する遺伝子を処方することが望ましい。
9、17および24である蛋白質、ならびにperlecan(パールカン)お
よびレチノールに結合している血漿蛋白質の先駆物質の間で選ばれる、ガングリ
オシッドGM2、カルグラニュリンBおよびサポニンB(例えば、配列番号が1
、3、5から7、10から16、18から23および25から29)のアクチヴ
ェーター先駆物質の同じ蛋白質系列に属しているペプチド配列、あるいは前述し
た配列のフラグメント、ならびに配列番号が1から29であるペプチド配列のい
ずれかと少なくとも70%、とりわけ少なくとも80%、好ましくは少なくとも
98%同一であるペプチド配列の間で選ばれる蛋白質、あるいはターゲットにな
っているペプチドと共に反応することができる、例えば、レセプターのようなリ
ガンドの全て、あるいはこれらの一部を示すことが選択される。従って、このよ
うな細胞は特に前述した蛋白質、あるいは前述したペプチド、および《プロセッ
サー》を、こうしたペプチドのフラグメントが抗原を呈している細胞の表面に現
れるように、食細胞の活動によって吸収しようとする。
遺伝子コードを指定する遺伝子の実例を数多く提供している。専門家はこのよう
な抗体に遺伝子コードを指定する核酸の配列を手に入れることができる。例えば
、抗体YTH 12.5(antiCD3)(ルートレッジ他、1991年、ヨ
ーロッパ免疫学雑誌 21:2717‐2725)、およびアラカワ他、199
6年、生化学雑誌 120:657‐662によるantiCD3の軽鎖および
重鎖に、遺伝子コードを指定する遺伝子を引用してみる。こうした抗体の核酸配
列は、専門家が通常使用しているベータ・ベースから容易に確認することができ
る。同様に、ATCC[アメリカ式培養コレクション]に使用することができる
ハイブリドーマから、これらの異なる抗体の軽鎖および/あるいは重鎖に、特異
なオリゴ核酸塩あるいはADNcバンクを使用する技術を用いて、RT‐PRC
[ピーシーアール法]のような拡大方法によって、遺伝子コードを指定する核酸
の配列をクローニングすることができる(マニアティス他、1982年、分子ク
ローニング、実験室マニュアル、CHS実験室、コールド・スプリング・ハーバ
ー、ニューヨーク)。従って、このようにクローニングされる配列は、ヴェクタ
ーにおける自らのクローニングに使用することができる。発明の好ましい事例に
基づくと、抗体の重鎖に遺伝子コードを指定する核酸の配列は、相同組み換えに
よって、狂犬病の糖蛋白質あるいはgp160のような膜間ポリペプチドに、遺
伝子コードを指定する核酸の配列と融合している(ポリデフキス他、1990年
、実験医学雑誌 171:875‐887)。これらの分子生物学の技術は、全
て完全に記述されている。
ある蛋白質、ならびにperlecan(パールカン)およびレチノールに結合
している血漿蛋白質の先駆物質の間で選ばれる、ガングリオシッドGM2、カル
グラニュリンBおよびサポニンB(例えば、配列番号が1、3、5から7、10
から16、18から23および25から29)のアクチヴェーター先駆物質の同
じ蛋白質系列に属している、ペプチド配列、あるいは前述した配列のフラグメン
ト、ならびに配列番号が1から29であるペプチド配列のいずれかと少なくとも
70%、とりわけ少なくとも80%、好ましくは少なくとも98%同一であるペ
プチド配列の間で選ばれる、少なくと1個の蛋白質に相応している免疫原フラグ
メントを示すことが選択される。このために、ヴェクターによって完全なポリペ
プチドか、それともリガンドおよび/あるいは特異なレセプターと共に反応する
ために選ばれる、ポリペプチドの好ましいあり方を示すことが選択できる。生体
内の脊椎細胞に入り込んでいるポリヌクレオチドよって、遺伝子コードが指定さ
れる免疫原ペプチドを、CMH分子のコンテキストで抗原を呈している細胞(A
PC)においてつくりだし、更に/あるいはこれを分泌させ、つくりあげて、更
に表すことができる。このように生体内で転移するAPCは、生体内で示される
免疫原に対して向けられる免疫反応をもたらしている。APCには抗原を捕らえ
る、異なったメカニズムがある。(a)その内の1つは、免疫グロブリンのレセ
プター(Fc)のように膜様レセプターによって、あるいは食細胞の食作用にレ
セプターが介入すると、抗原を細胞内隔室に効果的に送り込むことができる、顆
粒球、単核細胞あるいは大食細胞の表面で使用することができる補体のために、
抗原を捕らえるメカニズムである。(b)他は、液相にある細胞のパイノサイト
ーシスによってAPCに入り込むことであり、これには異なったメカニズムがあ
る。マイクロパイノサイトーシスは即ち、カルトリンで覆われているホールによ
って、小胞(0,1μm)を捕らえるメカニズムであり、マクロパイノサイトー
シスは即ち、(サイズが0,5μmから約6μmの間にある)大型の小胞を捕ら
えるメカニズムである(サルッスト他、1995年、実験医学雑誌 182:3
89‐100)。マイクロパイノサイトーシスは構成要素となって全ての細胞に
存在しているが、マクロパイノサイトーシスは、例えば大食細胞、樹枝状細胞、
星状細胞、および成長要因によって刺激を受ける上皮細胞のような細胞タイプに
限られている(ラクーシン他、細胞科学雑誌 1992年、102:867‐8
80)。こうした発明では、マクロパイノサイトーシスができる細胞によって、
前述した事象を実現できる細胞、および好ましくは細胞質で0,5μmから約6
μmの間にある高分子を捕らえることができる細胞が求められている。
ある細胞あるいはTヘルパー・リンパ細胞を、これらが自らの表面に、配列番号
が2、4、8、9、17および24である蛋白質、ならびにperlecan(
パールカン)およびレチノールに結合している血漿蛋白質の先駆物質の間で選ば
れる、ガングリオシッドGM2、カルグラニュリンBおよびサポニンB(例えば
、配列番号が1、3、5から7、10から16、18から23および25から2
9)のアクチヴェーター先駆物質の同じ蛋白質系列に属しているペプチド配列、
あるいは前述した配列のフラグメント、ならびに配列番号が1から29であるペ
プチド配列のいずれかと少なくとも70%、とりわけ少なくとも80%、好まし
くは少なくとも98%同一であるペプチド配列、ならびにこれらの細胞によって
容易には示されないが、このようなポリペプチドに遺伝子コードを指定する遺伝
子を含んでいる核酸配列の細胞に入り込むことによって、このような細胞を活性
化するプロセスを導入することができる、前述した蛋白質のリガンドに相応して
いるポリペプチドを示すように変えていく。本発明に従って同様に、配列番号が
2、4、8、9、17および24である蛋白質、ならびにperlecan(パ
ールカン)およびレチノールに結合している血漿蛋白質の先駆物質の間で選ばれ
る、ガングリオシッドGM2、カルグラニュリンBおよびサポニンB(例えば、
配列番号が1、3、5から7、10から16、18から23および25から29
)のアクチヴェーター先駆物質の同じ蛋白質系列に属しているペプチド配列、あ
るいは前述した配列のフラグメント、ならびに配列番号が1から29であるペプ
チド配列のいずれかと少なくとも70%、とりわけ少なくとも80%、好ましく
は少なくとも98%同一であるペプチド配列の間で選ばれ、治療を施す患者のタ
ーゲットになっている細胞の表面に示すことができる蛋白質に対して向けられて
いる抗体の全てあるいはその一部に、遺伝子コードを指定するこうした治療用の
遺伝子を含んでいる核酸の配列、ならびにこれらの細胞毒素の効力がある細胞、
あるいはTヘルパー・リンパ細胞によって容易には示されないポリペプチドに固
定できる、前述した抗体を選択できる。
細胞(TCL)およびキラー細胞(NK)、ならびに例えば、LAK[リンホカ
イン活性化キラー細胞]のような、これらの誘導体の特徴を示すことが求められ
ている(フェルステーク、1992年、今日の免疫学 13:244‐247;
ブリッテンド他、1996年、キャンサー 77:1226‐1243)。‘T
ヘルパー・リンパ細胞’によって、活性化した後で、免疫反応の効力がある細胞
を活性化させる要因を分泌させることができるCD4の特徴を、特に示すことが
求められている。ポリペプチドおよび特にこれらの細胞の表面に示され、こうし
た細胞を活性化するとこれに関係するレセプターは、特に錯体TCRの全てある
いはこの一部から、あるいはCD3から、錯体のCD8、CD4、CD28、L
FA‐1および4‐1BBの全てあるいはこれらの一部(メレロ他、1998年
、ヨーロッパ免疫学雑誌 28:1116‐1121)から、CD47、CD2
、CD1、CD9、CD45、CD30およびCD40から、IL[インターロ
イキン]‐7、IL‐4、IL‐2、IL‐15あるいはGM‐CSF[顆粒球
・大食細胞コロニー刺激因子]のようなサイトカイン・レセプターの全てあるい
はこれらの一部(フィンケ他、1998年、遺伝子治療 5:31‐39)から
、また例えば、NKAR、Nkp49等のようなNK細胞の錯体レセプターの全
てあるいはこの一部(カワノ他、1998年、免疫学 95:5690‐569
3;ペッシーノ他、1998年、実験医学雑誌 188:953‐960)から
、またNkp44から、ならびに例えば、Fcレセプターのような大食細胞レセ
プターの全てあるいはこれらの一部(デオ他、1997年、今日の免疫学 18
:127‐135)から成っている。
に、特に哺乳類の細胞に送り込むために開発された。これらの技術は2つのカテ
ゴリーに分類することができる。最初のカテゴリーには、顕微注射法、粒子のエ
レクトロポレーションあるいはそのボンバードのような、物理的な技術が含まれ
ている。2番目のカテゴリーは分子細胞生物学の技術を使用することに基づいて
おり、これによって遺伝子は、物質を生体内の細胞に容易に送り込む生物学ヴェ
クターあるいは化学合成ヴェクターによって転移される。今日では、更に効力が
あるヴェクターはウィルス・ヴェクターであり、特にアデノウィルスおよびレト
ロウィルスが挙げられている。これらのウィルスには、原形質膜を通過して、自
らの遺伝子物質が減成されるのを防ぎ、自らのゲノムを細胞核に送り込む、自然
のままの性質がある。これらのウィルスは広範囲に渡って研究がなされて、その
内のいくつかは既に実験的に、接種および免疫治療での人への応用に、あるいは
遺伝子の欠損を補うために用いられている。しかしながら、ウィルスによるこう
したアプローチには、特にこれらウィルス・ゲノムにおける限られたクローニン
グ能力による限界があり、つくりだされるウィルス粒子が、生体および環境にば
ら撒かれるリスク、またレトロウィルスの事例では、宿主細胞に送り込むことに
よって、人為的な突然変異の誘発が現れるリスク、更には、治療中の生体内に強
力な炎症性の免疫反応がもたらされる可能性があり、これによって、注射をする
ことができる回数が限られてくる(マッコイ他、1995年、人の遺伝子治療
6:1553‐1560;ヤン他、1996年、免疫 1:433‐422)。
これらのウィルス・ヴェクターに替わる他のシステムが存在している。例えば、
燐酸カルシウムによる共沈のような、ウィルスによらない方法の使用、ウィルス
・システムを真似ているレセプターの使用(これに関する要約には、コッテンお
よびワグナー、1993年、バイオテクノロジーの新しい考え方 4:705‐
710を参照)、あるいはポリアミド・アミンのようなポリマーの使用(ヘンス
ラーおよびソカ、1993年、生化学 4:372‐379)が挙げられている
。ウィルスによらない他の技術は、リポソームの使用に基づいており、蛋白質あ
るいは活性薬品のADNおよびARNのような生物学的高分子を送り込むための
自らの効力が、広範囲に渡って科学文献に記述されている。こうした分野で、研
究グループは細胞膜および/あるいは核酸に対して強い親和力がある陽イオン脂
質の使用を提案した。実際に核酸の分子自体は、生体内にあるいくつかの細胞の
原形質膜を通過でき(WO90/11092)、効力が特に核酸の多陰イオンの
性質に左右されることが明らかになった。1989年(フェルグナー他、ネイチ
ャー 337:387‐388)からは、陽イオン脂質が大きな陰イオン分子を
容易に送り込むために提唱されて、これによって、これらの分子の陰電荷が中和
されて、容易に細胞に入り込むようになっている。別の研究グループは、次のよ
うな陽イオン脂質を開発した。これらはDOTMA(フェルグナー他、1987
年、PNAS 84:7413‐7417)、DOGSあるいはTransfe
ctamTM(ベーア他、1989年、PNAS 86:6982‐6986)、
DMRIEおよびDORIE(フェルグナー他、メソッド 5:67‐75)、
DC‐CHOL(カオおよびファン、1991年、BBRC 179:280‐
285)、DOTAPTM(マクラクラン他、1995年、遺伝子治療 2:67
4‐622)あるいはLipofectamineTMであり、他の分子について
は、特許のWO9116024、WO9514651およびWO9740562
4に記述されている。他の研究グループは、容易に高分子、特に陽イオンの高分
子を細胞に転移する、陽イオンのポリマーを開発した。特許のWO96/026
55は樹枝状ポリマーの使用について、またWO96/02655の資料はポリ
エチレン・イミンあるいはポリプロピレン・イミンの使用について、更に、US
‐A‐5595897およびFR 2719316の資料は共役ポリリジンの使
用について記述している。
を期待しているからには、明らかに使用されるヴェクター自体が、前述したよう
に、《ターゲットになる》ことができなければならない。
can(パールカン)およびレチノールに結合している血漿蛋白質の先駆物質の
間で選ばれる、ガングリオシッドGM2、カルグラニュリンBおよびサポニンB
(例えば、配列番号が1、3、5から7、10から16、18から23および2
5から29)のアクチヴェーター先駆物質の同じ蛋白質系列に属しているペプチ
ド配列、あるいは前述した配列のフラグメント、ならびに配列番号が1から29
であるペプチド配列のいずれかと少なくとも70%、とりわけ少なくとも80%
、好ましくは少なくとも98%同一であるペプチド配列で確認される、こうした
蛋白質に対して定義される、こうした治療用の遺伝子を含んでいるヴェクターに
よって、生体の内外で転換される細胞の使用。
に斑状硬化症を予防して治療するように定められ、少なくとも1個の細胞、特に
容易には抗体をつくりださずに、哺乳類、人あるいは動物の生体に投与すること
ができて、同様に場合によっては予め培養することができる形状をしている、少
なくとも1個の細胞から成っており、前述した細胞が遺伝子的見地から、生体内
で以下のものに遺伝子コードを指定する、少なくとも1個の遺伝子を含んでいる
、少なくとも1つの核酸配列によって生体内で変えられる、薬品成分を調合する
ための生物学的物質に関するものである。
erlecan(パールカン)およびレチノールに結合している血漿蛋白質の先
駆物質の間で選ばれる、ガングリオシッドGM2、カルグラニュリンBおよびサ
ポニンB(例えば、配列番号が1、3、5から7、10から16、18から23
および25から29)のアクチヴェーター先駆物質の同じ蛋白質系列に属してい
るペプチド配列、あるいは前述した配列のフラグメント、ならびに配列番号が1
から29であるペプチド配列のいずれかと少なくとも70%、とりわけ少なくと
も80%、好ましくは少なくとも98%同一であるペプチド配列の間で選ばれる
、少なくとも1個の蛋白質、ならびに配列番号が1から29であるペプチド配列
のいずれかと少なくとも70%、とりわけ少なくとも80%、好ましくは少なく
とも98%同一であるペプチド配列、ならびに全てのフラグメント。
perlecan(パールカン)およびレチノールに結合している血漿蛋白質の
先駆物質の間で選ばれる、ガングリオシッドGM2、カルグラニュリンBおよび
サポニンB(例えば、配列番号が1、3、5から7、10から16、18から2
3および25から29)のアクチヴェーター先駆物質の同じ蛋白質系列に属して
いるペプチド配列、あるいは前述した配列のフラグメント、ならびに配列番号が
1から29であるペプチド配列のいずれかと少なくとも70%、とりわけ少なく
とも80%、好ましくは少なくとも98%同一であるペプチド配列の間で選ばれ
る、少なくとも1個の蛋白質の最初の配列から定義される、少なくとも1個のペ
プチド。
/あるいは表示の全ての抑制分子。
perlecan(パールカン)およびレチノールに結合している血漿蛋白質の
先駆物質の間で選ばれる、ガングリオシッドGM2、カルグラニュリンBおよび
サポニンB(例えば、配列番号が1、3、5から7、10から16、18から2
3および25から29)のアクチヴェーター先駆物質の同じ蛋白質系列に属して
いるペプチド配列、あるいは前述した配列のフラグメント、ならびに配列番号が
1から29であるペプチド配列のいずれかと少なくとも70%、とりわけ少なく
とも80%、好ましくは少なくとも98%同一であるペプチド配列の間で選ばれ
る蛋白質の最初の配列から生まれて、少なくとも1個のCMHI糖蛋白質に固定
することができる、少なくとも1個のペプチド。
erlecan(パールカン)およびレチノールに結合している血漿蛋白質の先
駆物質の間で選ばれる、ガングリオシッドGM2、カルグラニュリンBおよびサ
ポニンB(例えば、配列番号が1、3、5から7、10から16、18から23
および25から29)のアクチヴェーター先駆物質の同じ蛋白質系列に属してい
るペプチド配列、あるいは前述した配列のフラグメント、ならびに配列番号が1
から29であるペプチド配列のいずれかと少なくとも70%、とりわけ少なくと
も80%、好ましくは少なくとも98%同一であるペプチド配列の間で選ばれる
、少なくとも1個の蛋白質に固定することができる、少なくとも全抗体および全
部の抗体。
も治療を施す哺乳類とは異なる哺乳類に由来している。後者の事例では、前述し
た、ターゲットになっている細胞は、治療を施す哺乳類と互いに一致している処
置を受けることに注意をしたほうがよい。《哺乳類》によって、人としての哺乳
類が理解される。これらの細胞は細胞系列でつくられており、リンパ細胞、単核
細胞、星状細胞および寡突起神経膠細胞のような、CMHII+あるいはCHM
II+誘導体である。
り込み、少なくとも1個の核酸配列が少なくとも1個のこうした治療用の遺伝子
を含み、成分によって前述した細胞で前述した遺伝子が確実に示されて、前述し
たこのような治療用の遺伝子が、前述したように、生体内で分子あるいは分子の
フラグメントに、遺伝子コードを指定する核酸配列を含んでいることを特徴とす
る、変えられた細胞、および前述したような細胞をつくりだす方法に関するもの
である。特に発明は原核生物の細胞、酵母の細胞および動物の細胞、特に少なく
とも1個のヌクレオチド配列、および/あるいは前述したようなヴェクターによ
って転換される哺乳類の細胞に関するものである。
胞、星状細胞、Tリンパ細胞CD4+、Tリンパ細胞CD8+等)が、ターゲッ
トになっているポリペプチドの精製と接触するようにおかれており、こうしたポ
リペプチドがCHMIおよび/あるいはCHMIIの分子に結合している細胞の
表面の内部に移動して、そこでつくりあげられ、表されるので、ペプチドに対す
る特異な免疫反応をもたらすようになる。続いて《活性化》細胞が患者に投与さ
れて、そこでは活性化細胞が抗原の特異な免疫反応をもたらそうとする(免疫反
応の自然な方法が使用されるが、抗原を呈している細胞が現れるようにコントロ
ールされる)。
星状細胞等)が生体内で変えられて、抗原を転換される細胞で示し、抗原がCH
MIおよび/あるいはCHMIIの分子に結合して、細胞の表面に現れようとし
、患者に送り込まれて、そこでは免疫反応が完全にターゲットになるように変え
られる細胞が投与される。
が顕著であるエピトープとは逆に、あるいは大きな変化がある抗原に対して向け
られている、限られた免疫反応になっている。同様に、抗原がCMHシステムの
糖蛋白質によって、細胞の表面に正しく現れないと、治療中の患者でこうした抗
蛋白質の免疫性がうまく発揮されることはない。こうした問題を切り抜けるため
に、何人かの著者は接種によるこうしたプロセスの枠内で、特にT細胞毒素リン
パ細胞によって認めることができるペプチドの割合に相応している抗原の最小フ
ラグメントを選択して、これらを細胞内で示し、CHMIの分子に結合させて、
細胞の表面に表し、治療中の患者に、完全にターゲットになっている免疫反応を
導くことを提案した(トース他、1997年、PNAS 94:14660‐1
4665)。特に、ワクチン・ウィルスに入り込んでいるミニ遺伝子から示され
ている、(アミノ酸が3個から約13個である)非常に小さなサイズのエピトー
プが、細胞タイプの免疫を導くことができるのが明らかになった。更に、いくつ
かのミニ遺伝子は、同じヴェクターから結合してかたちで示されることがあるの
も明らかになった(こうした構造は、《string of beads[小球
列]》と呼ばれている)。こうした構造は、主に同時作用CTL[細胞障害性T
リンパ球]タイプの免疫反応を示している(ウィットン他、1993年、ウィル
ス学雑誌67:348‐352)。
5個である)非常に短いサイズの抗原ペプチドが、免疫反応が最後に向けられる
、更に複雑なポリペプチドの減成によってつくりだされる進行過程で確認される
、細胞内のプロセスに基づいている(検討には、グルトトロプ他、1996年、
今日の免疫学 17:429‐435)。続いてこれらの短いペプチドは、CM
H1あるいはCMHIIの分子に結合して、蛋白質錯体を形成し、これが細胞の
表面に送られて、前述したペプチドをそれぞれ循環T細胞毒素リンパ細胞あるい
は循環Tヘルパー・リンパ細胞に表している。更に、抗原ペプチドに対するCM
H1あるいはCMHIIの分子の特異性は、CMH1あるいはCMHIIの分子
(例えば、CHMIに対してHLA[組織適合抗原]‐A、HLA‐B等)、お
よび著しい対立遺伝子(例えば、CMHIに対してHLA‐A2、HLA‐A3
、HLA‐A11等)に応じて異なっていることに注意したほうがよい。動物の
同じ種の中では、ある個体から他の個体へ、CMHシステムの分子に遺伝子コー
ドを指定する遺伝子が大きく異なっている(この問題については、ジョージ他、
1995年、今日の免疫学 16:209‐212)。
CD4+およびTリンパ細胞CD+のような細胞が、自らの表面にターゲットに
なっているペプチドの特異な抗体を示すように変えられている。ペプチドは細胞
の表面に示される抗体によって中和される。これらの細胞は特に免疫性があり、
特に患者のものであり、特に細胞毒素があり、変えられて、ターゲットになって
いるポリペプチドの特異な抗体の全て、あるいはその一部を示している。
細胞(リンパ細胞および単球)を効率よく(理論的な効率は50%で、これは即
ち、1mlの血液あたり106個の細胞に相当する)分離することができる、迅
速な技術について記述している。無菌状態でヘパリン管に採取される50lmの
抹消血液は、20分間150gを20℃で遠心分離したものである。回収される
細胞は2種類の抹消血液の量で、最初に無菌PBS[燐酸緩衝食塩水]によって
希釈される。10mlのこうした懸濁液は、3mlのフィコール‐ハイパック溶
液(リンパ細胞分離媒質、フロー)に沈殿させる。20分間400gを20℃で
減速抑制せずに遠心分離した後で、単核細胞はフィコールPBSの界面に、緻密
な層を成して、乳白色を帯びて沈殿して、ほぼ全ての赤血球および多核球が管の
底に沈殿する。単核細胞は無菌PBSで回収して、洗浄する。
p/v)のPBS‐BSA緩衝液で洗浄してから数え上げ、更にこれらの細胞を
異なる減退抑制剤が存在している間に、最後に10μMから10mMのDTNB
(5,5‘‐ジチオ‐ビス‐2‐ニトロ安息香酸)あるいはNEM(N‐エチル
・マレイン・イミド)を含有している0.5%のPBS‐BSAによって、前以
って3回保温する。これに引き続いて、抗原を細胞の表面に固定する、あるいは
抗原を内部に移動させる段階は、同様に異なる抑制剤濃度によっておこなわれる
。
る蛋白質の飽和量がある間に、70μlの微小ホールの内部に移動させる。1時
間4℃で撹拌しながら保温した後で、抗原を細胞の表面に固定する。細胞懸濁液
を2回PBS‐BSAによって洗浄して、細胞残滓を70μlの緩衝液によって
再び採取し、37℃で2時間までの異なる時間で保温する。細胞および浮遊物を
800g、4℃で5分間遠心分離して分離させる。更に長い保温時間のために、
抗原を細胞の表面に前以って固定させる予備段階を取り止める。細胞をRPMI
‐10%SVF媒質によって、20mMのヘペスが存在している間に、1mlあ
たり106個の細胞で希釈する。細胞を過剰の抗原が存在している間に、異なっ
た時間で37℃で保温する(1μgの分子/5.107個の単核細胞/大食細胞
あるいは/108個のB‐EBV細胞)。
/あるいは神経症、および/あるいは自己免疫症を、単独であるいは他と組み合
わせて予防して治療するために使用される。こうした治療薬は同様に、試験管内
あるいは生体内で自らの効力を評価するためにも使用することができる。
とができる。同様に、注射器あるいはこれと同じ他の全ての方法を用いた表皮注
射、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射および脳内注射が考えられる。経口投
与による他の実施方法あるいは他の全ての方法が、完全に専門家に知られており
、本発明に適用することができる。投与は1回だけの服用、あるいは服用を続け
て、あるいは一定の間隔期間の後で1回あるいは数回おこなうことができる。更
に相応しい投与方法および適量は、例えば治療を施す個人あるいは病気、発病時
期および/あるいは病気の進展状態、あるいは更に転移させる核酸、および/あ
るいは蛋白質、および/あるいはペプチド、および/あるいは分子、および/あ
るいは細胞、またあるいは器官/組織のパラメーターに従って異なっている。
は動物への投与に薬理学的見地から受け入れられる媒体と結合している、前述し
たような生物学的物質を含有している薬品成分を処方することができる。このよ
うな媒体の使用方法については、文献に記述されている(例えば、リミントン製
薬科学第16版1980年、マーク出版社を参照)。薬理学的見地から受け入れ
られるこのような媒体は、スクロース溶液のように、主に等張、低張あるいは弱
い高張を示して、イオン強度は比較的低くなっている。更に前述した成分は、発
熱剤および分散媒質を含んでいない、無菌水のような水性、あるいは部分的に水
性である溶媒および媒体を含有していることがある。これらの薬品成分のpH値
は、従来の技術に従って、適切に調整されて、和らげられている。
)から、異なる容積の尿の試料を採取した。ネズミの星芽細胞に対する各試料の
毒性を、MTTテストを使用して、インビトロでテストした。総量20リッタの
尿グループを構成した(グループのSEP:マイナス)。併行して、多発硬化症
に罹った疾病段階の異なる個体(SEP:プラス)から、異なる容積の尿の試料
を採取した。ネズミの星芽細胞に対する各試料の毒性を、MTTテストを使用し
て、インビトロでテストした。総量80リッタの尿グループを構成した(グルー
プのSEP:プラス)。
、実施例1で捕集してテストしたSEPプラスおよびSEPマイナスの尿グルー
プを精製した。
ニウム(Prolabo‐参照記号21333365)による沈殿を実施した。
尿40%について濃度60%の飽和硫酸アンモニウム、即ち、尿1リッタについ
て390gの硫酸アンモニウムを使用した。沈殿改善のため、各グループを、2
リッタフラスコに1,8リッタづつ分割した。沈殿は、ゆっくり撹拌しながら、
室温において2×8h実施した。尿グループを3000rpmで10min遠心
分離した後、得られた沈渣を、CaCl21mMおよび尿素0,25Mを含むト
リス緩衝液20mM中に回収した。次いで、混合物を3000rpmで10mi
n遠心分離した。上澄液は、濃縮タンパク質を含む。上澄液は、次工程のために
直ちに使用するか、次工程を連続的に実施できない場合は、冷凍する。
AEファースト・フロー(PHARMMACIAから市販されている)上を通過
させた。この工程は、ゲルを充填したカラムPHARMMACIAにおいて低圧
で実施した。流量を調節できる蠕動ポンプによって、カラムに緩衝液を供給した
。カラムの平衡緩衝液は、pH7のトリス緩衝液20mMである。沈澱上澄液に
対応し極めて多量の塩を含む分画を、カラムにおける沈澱前に、上記緩衝液に対
して透析した。塩勾配による溶離によって、タンパク質を回収できる。溶離勾配
は、カラムの平衡緩衝液中のNaCl100,200,300,500mMで段
階的に構成した。溶離分画をMTTテストによってテストし、プラスの分画、即
ち、200mMNaClで溶離した分画のみを保存した。この分画は、直ちに処
理できるか、凍結乾燥状態で保存できる。
グラフィーを使用した。200mMNaCl溶離に対応する分画をカラムに供給
した。溶離中、低分子量のタンパク質は、留保され、従って、大きい分子よりも
遥かにゆっくり溶離される。精製は、径21,5mmおよび長さ300mmのカ
ラムTosoHaas TSK PrepG3000SWを有するHPLCにお
いて実施した。分子量の排除限界は、500000ダルトンである。使用した溶
離緩衝液は、100mMホスフェートおよび100mM硫酸ナトリウムであり、
pHは6,8である。タンパク質混合物の分離は、60minで実施した。分子
量15‐20000ダルトンに対応する分画のみを保存した。この分画は、0,
2mM CaCl2を含むpH7,2の20mMトリス緩衝液中で透析し、次い
で、凍結乾燥した。
タンパク質の毒性の監視は、各工程において、MTTテストによって実施した。
実施例3に記載の補足精製工程のために、有意の毒性を有する分画のみを留保し
た。
よび非SEP患者(SEPマイナスのグループ)の尿グループを蒸留水で回収し
、次いで、約130‐140μg/mlの最終濃度を得るため、0,2%TFA
/10%アセトニトリル溶液で希釈した。
rownlee Aquaporeカラム(商品名)(カラム特性:300オン
グストローム/7μm/(100×4,6)mm)で実施した。プラスのグルー
プおよびマイナスのグループについて、それぞれ、別個の2つのカラムを使用し
た。注入は、250μlの多重インジェクタによって実施した。タンパク質を、
流量0,5ml/minにおいて、緩衝液Bの5%‐15%の線形勾配で5mi
n溶離し、次いで、緩衝液Bの15%‐100%の線形勾配で95min溶離し
た。使用した分離緩衝液A,Bは、それぞれ、0,1%TFA(Pierce
no.28904)/水MilliQ緩衝液および0,09%TFA/80%ア
セトニトリル緩衝液(Barker)である。検知は、205nmおよび280
nmのUV吸収の測定によって実施した。興味あるゾーンの分画の1,5ml,
0,5‐1mlを収集した。カルボガラスに収集した分画を凍結した。
、0,1%TFA/30%アセトニトリル100μl中に回収した。分画20μ
lを500μlエッペンドルフに移し、乾燥し、100μlの水MilliQで
2回洗浄し、次いで、改めて乾燥した。
測定した。有意の毒性を有する分画21のみを留保した。この分画のナンバーは
、本実施例に示した溶離条件に依存する溶離順序に対応する。
たタンパク質の分析 実施例3に記載の如くHPLCによって調製され、SEPプラスのグループの
20の注入から得られた分画21の収集グループを、10ヶのピットにあらかじ
め注入した厚さ1mmの16%SDS‐TRICINEゲル(Novex社から
市販されている)に供給した。ゲルの使用条件は、メーカ推奨の条件に対応する
。試料を、1回濃縮した試料緩衝液75μl(SDS‐TRICINE No.
LC1676,2回濃縮物1ml+水で1/2に希釈したβ‐メルカプトエタノ
ール(Pierce)50μl)中に回収し、試料25μlをゲルで3回処理し
た。SEPマイナスのグループの6の注入から得られた分画21の収集グループ
を、SEPプラスのグループについて記載した条件と同一の条件においてゲルで
処理した。2つのゲル上の移動は、同一の移動キュベット(XCELL II
NOVEX(商品名))において一定電圧125mVで2h、並行して実施した
。ガラス容器内にキュベットを設置した。可逆のネガティブ染色を達成できるよ
う、移動直後に、亜鉛/イミダゾール(BIORAD社から市販されている染色
キット161‐0440)による染色によって染色した。タンパク質バンドは、
光学的バックにおいて半透明である。
って分解した。
片を落下させるためエッペンドルフを遠心分離ピークで処理し、遠心分離後、洗
浄緩衝液(100mM NH4CO3/50%CH3)100μlをゲル片に加え
た。室温における30minの消化後、20μlの分画から上澄液を除去し、改
めて2回の洗浄工程を実施した。エッペンドルフをスピード・バックで5min
乾燥した。トリプシン20μg(段階的改質グレードPROMEGA V511
1)を消化緩衝液(5mMトリス,pH8)200μlに回収し、室温において
間欠的に撹拌しながら30min溶解し、再懸濁させたトリプシン20‐30μ
lをゲル片に加えた。エッペンドルフを遠心分離し、28℃の室内に一晩、保存
した。消化後、ゲルバンドを重量測定に直ちに使用できるか、最終用途のために
保管できる。
パク質の場合、16kD‐20kDの範囲のバンドをCNBRによって処理した
。トリプシンによる消化に既に使用したゲルバンドをスピード・バックで5ー1
0min乾燥した。
ゲル片の再水化のめ、この溶液20μlを使用した。暗室で室温において20h
反応させた。0,1%TFA/60%アセトニトリルで30min,3回、ペプ
チドを抽出した。抽出溶液を統合し、20μlに濃縮した。0,1%TFA/水
中で上記試料を5倍に希釈した。分離条件は、トリプシンによるペプチドの消化
について記載した条件と同一とした。
分析すべきエッペンドルフを5min遠心分離し、次いで、5min音波処理し
、更に、1min遠心分離した。
4‐ヒドロキシトランスケイ皮酸)0,5μlを14箇所に塗布した。均一な微
細な微結晶層が得られた。2%TFA/水の溶液0,5μlを、上記下層の上に
14箇所に塗布し、次いで、被分析試料0,5μlを加えた。かくして形成され
た液滴に、50%アセトニトリル/水に溶解したα‐シアノ‐4‐ヒドロキシト
ランスケイ皮酸飽和溶液0,5μlを加えた。室温において30min乾燥した
後、沈殿結晶を水2μlで洗浄し、直ちに、空気ブローによって排気した。リフ
レクトロンを備えた質量分析計BRUKER BIFLEX(商品名)によって
、すべてのスペクトル測定を行った。サンドウィッチ・マトリックス試料中に存
在するペプチド群をより良く表現する質量スペクトルを得るため、測定値(沈着
体群に対して90‐120のレーザショット)を集積した。各沈着体について、
100ppmよりも小さい測定精度を使用できるよう、トリプシンの自己消化ペ
プチドによる校正を行った。
spector.ucsf.edu)において、データバンクの検討を行った。
上記検討において使用した共通のパラメータは、(1)データベース:NCBI
nr,(2)100‐50ppmの公差,(3)未修飾のシステエイン,(4)
酸化可能なメチオニン,(5)分子量範囲:1000‐100000ダルトン,
(6)無視できる3つ以下の切断サイトである。
トニトリルで30min間、3回、ペプチド残渣を抽出した。抽出溶液を統合し
、20μlになるまでスピード・バックで乾燥した。80μlの緩衝液A(0,
1%TFA/水)中で希釈後、トリプシンで消化されたゲルバンド抽出体をカラ
ムC18/MZ‐Vydac/(125X1,6)mm/5μmに注入した。1
50μl/minの流量で且つ緩衝液B(0,09%TFA/80%アセトニト
リル)5%から緩衝液B40%の勾配で40min、次いで、40%緩衝液Bか
ら緩衝液B100%の勾配で10min、ペプチドの溶離を行った。検知は、2
05nmにおけるUV吸収の測定によって行った。500μlエッペンドルフ管
でピーク収集を行った。分画をガラス上に保存し、SEPプラスのグループ21
の18‐20kDバンドについて、MALDI‐TOF質量分析計で分析した。
バーキンエルマー/Applied Biosystem)においてEdman
の分解によって分析した。シークエンシングの条件は、設計者が記載している条
件とした。試料の沈着のためマイクロカートリッジを使用し、PTHアミノ酸を
HPLCオンライン・システム(モデル120A バーキンエルマー/Appl
ied Biosystem)で同定した。シークエンシングすべき分画の沈着
は、15μlの複数の沈着によって行い、中間で乾燥を行った。ペプチドを含む
管を85%ギ酸(BAKER)15μlで洗浄した。アミノ酸のシークエンスは
、常に、測定した質量に対応する。同定された主タンパク質に対応しない質量を
有するペプチドを優先的にシークエンシングした。かくして、1つのゲルバンド
について3つまでのタンパク質を同定できた。
後、各溶離分画の毒性をMTTテストを使用して測定した。SEPプラスのグル
ープの分画21のみが、インビトロで毒性を示した。SEPプラスの対照グルー
プの分画21は、全く毒性を示さなかった。特許出願WO98/11439にネ
ズミの星芽細胞について記載の如く、SEPプラスのグループの分画21の毒性
をインビトロでFACSによって確認した。
によってSEPマイナスの対照グループおよびSEPプラスのグループの分画2
1のタンパク質含量を観察した。見かけ分子量の大きいタンパク質が、2つの分
画に認められた。他方、SEPプラスのグループの分画21にのみ、見かけ分子
量の小さい5種のバンドが認められた(バンド8,14,18および20kD)
。各バンドには、少なくとも1つのタンパク質および天然タンパク質に近い見か
け分子量を有する上記タンパク質のバリエーションが対応する。上記シークエン
スバリエーションは、天然シークエンスに対して少なくとも70%(好ましくは
、少なくとも80%、有利には少なくとも98%)の相同性または同一性を有す
る。
および/またはシークエンシングおよびデータバンクにおける相同性追跡によっ
て分析した。結果は、SEPプラスのグループの分画21中の22と5kDとの
間を移動する5つのタンパク質バンドおよび上記タンパク質のバリエーションの
存在を示した。
シークエンスのアミノ酸3464から始まりアミノ酸3707で終わるPerl
ecanのC末端フラグメント、配列番号4で与えられるシークエンスを有する
レチノール結合ブラズマタンパク質の前駆体、配列番号8で特定されるガングリ
オシドGM2の活性化物質の前駆体,配列番号17で特定されるカルグラヌリン
Bおよび配列番号24で表されるサポシンBである。上記の如く、上記タンパク
質の相同体またはバリエーションは、同じく、シークエンシングによって同定し
た。上記の相同タンパク質シークエンスまたはバリエーションのシークエンスは
、上記タンパク質のコーディング遺伝子のレベルにおける突然変異生成物である
。例えば、配列番号9は、ガングリオシドGM2の活性化物質の前駆体の配列番
号8に対して99%の相同性または同一性を有し、アミノ酸3464から始まり
アミノ酸3707で終わる配列番号9のフラグメントは、配列番号8で特定され
る天然タンパク質の対応するフラグメントに対して98,88%の相同性または
同一性を有する。
プロトコルにもとづき、これらの尿試料を精製した。最終溶離分画21を質量分
析計で別個に分析した。各尿試料に対応する各分画の質量プロフィルを、先行例
で特定されたタンパク質について得られた質量プロフィルと比較した。結果から
、SEPプラスの患者の尿試料について、質量は、(i)PerlecanのC
末端フラグメント,(ii)ガングリオシドGM2の活性化タンパク質の前駆体,
(iii)カルグラヌリンBおよび(iv)先に特定されたサポシンBの分子に対応
する。他方、上記質量の何れも、SEPマイナスの個体の尿試料の分析後に得ら
れた質量プロフィルには認められなかった。上記方法は、診断のテストに使用で
きる。
タンブロット法を実施した。健常個体および多発硬化症に罹患した患者の尿試料
を並行してテストした。電界の作用下で分子量に依存して各種タンパク質を分離
できる電気泳動ゲルで試料を処理した。タンパク質をゲルから膜に移行した後、
ウエスタンブロット法を実施した。移行したタンパク質を採取するため、膜に飽
和緩衝液を飽和させ、次いで、アルカリ性ホスファターゼで直接にマーキングし
た抗体とともに培養した。使用した抗体は、アンチカルグラヌリン抗体である(
ネズミのモノクロナール抗体,Valbiotech社から市販されているクロ
ーンCF145サブタイプIgG2b:参照記号MAS696p lotPC9
6G696)。酵素基体は、3,3’‐(1,1’‐ビフェニル)‐4,4’ジ
アゾニウムの二塩化物であり、バンド採取および抗体に結合されたタンパク質の
可視化のために、2‐ナフタレニルホウ酸ナトリウム(β Naphtyl a
cid phosphate Sigma 参照記号N7375およびo di
anisine Tetrazotized D3502なる名称で市販されて
いる)を加えた。見かけ分子量14000の分子を、SEPに罹患したシグナル
が比較的強い患者の精製ずみ尿から採取した。このタンパク質は、カルグラヌリ
ンB(見かけ分子量:14kD)に対応する。他方、健常個体の尿からは、何ら
のシグナルも認められなかった。この観察から、SEPに罹患した患者の尿中の
上記の特殊なタンパク質の存在が確認され、タンパク質を識別する抗体を使用す
る検知法の使用が確認された。
の生成物との間のH‐2システムの両立性が必要である。腹水生成のため、生後
6週間の20匹のメスハツカネズミの腹膜キャビティに、Pristan(2‐
6‐10‐14‐テトラメチルペンタデカン酸)0,5mlを注入した(Por
terら,1972)。7日‐10日後以内に、無菌緩衝液(0,145M N
aCl,10mM Na2HPO4,2,7mMKCl2,7mM,1,5mM
KH2PO4(pH7,4))0,5mlに希釈したハイブリドーマ5・106‐
10・106を腹膜を介して注入した。腹水は、1‐2週間以内に現れた。次い
で、腹膜切開後、注射器で腹膜キャビティ内に存在する腹水の液体を回収した。
回収した液体を、室温において3000gで15min遠心分離し、脂肪除去の
ためガーゼで濾過し、次いで、その容積の1/20の1M トリスHCl(pH
8,0)を添加して緩衝状態とした。この方法にもとづき、ハイブリドーマ培養
によって得られた量の10倍の量の抗体を得ることができる。
トリウム)で塩析した。腹水の液体を40%硫酸アンモニウムによって沈殿させ
た。低温に20min保持した後、4℃において、溶液を8000gで15mi
n遠心分離した。沈殿物を洗浄し、低温で40%硫酸アンモニウム溶液中に再懸
濁させ、次いで、改めて遠心分離した。IgGに富んだ新しい沈殿物を緩衝液P
BSに溶解し、緩衝液(25mM トリスHCl,150mM NaCl;pH
7,4)に対して一晩、透析した。並行して、アガロース・タンパク質A(また
はタンパク質G)カラム(冷凍乾燥した形で市販されている,Piere)を、
緩衝液(25mM トリスHCl,150mM NaCl;pH7,4)によっ
て強力に洗浄した。IgGに富む溶液をカラムで処理し、次いで、カラムを洗浄
した。カラムに捕獲されたIgGを酸性pH(グリシン200mM,pH2,8
)において溶離した。溶離した分画を塩基性の1Mトリス(pH10,5)で中
和した。回収した各分画の免疫グロブリンの含量を、280nmにおける吸収を
読むことによって定量した(e 1%,1cm=14.0,Prahlら,19
68)。高濃度の分画を収集した。収集したIgGの純度を、SDSの存在下で
アクリルアミドゲルにおける電気泳動によって分析した。精製したIgGを、緩
衝液(25mMトリスHCl,150mM NaCl;pH7,4)に対して一
晩、透析し、無菌状態で濾過し、分割し、‐20℃に保存した。その最終濃度を
、280nmにおける吸収の読取によってまたはマイクロBCA検量によって測
定した。免疫原性ペプチド配列番号58,配列番号54,SEQID No.5
5,配列番号56,配列番号57,配列番号58,配列番号59および配列番号
65を、上記のプロトコルにもとづき、モノクロナール抗体の調製に使用した。
しかしながら、モノクロナール抗体の調製のために、例えば、Kohlerらに
よっておよびGalfreらによって記載された既に引用した技術またはその誘
導技術から、他のプロトコルを決定することは、当業者の能力の範囲内にある。
Q IDNO:73)およびSapocine B(SEQ IDNO:74)
を原核生物系から調製し、当業者に公知の方法およびプロトコルを使用して出願
人の研究室において調製したこれら2つのタンパク質のクローンから精製した。 アンチGM2AP抗体またはアンチSapocine B抗体: 研究実施のために使用したアンチGM2AP抗体またはアンチSapocin
e B抗体は、出願人の研究室で調製するか、好意的に提供を受けた。研究のた
め、アンチSapocine Bポリクロナール抗体およびアンチGM2APポ
リクロナール抗体(Liら、Glycoconjugate,1984)を使用
した:これらは、SAP84およびGM2AP84と呼ぶ。
クロナール抗体を、当業者に十分に知られているプロトコルおよび方法を使用し
て研究室において調製、精製した:購入した原核物質のタンパク質GM2APま
たはSapocine B50μgを、生後日数JO,J28,J56のウサギ
に注入した。連続2ヶ月の間に、毎月1回、2つの注入を反復した。かくして、
2つのアンチGM2APポリクロナール抗体および2つのアンチSapocin
e Bポリクロナール抗体が得られ、組換えタンパク質に対するその特異性をウ
エスタンブロット法およびエリザ法によって検証した。
クロナール抗体を、当業者に十分に知られているプロトコルおよび方法を使用し
て研究室において調製、精製した:出願人の研究室において、調製してKLHに
結合したタンパク質GM2APまたはSapocine B75μgを、生後日
数JO,J28,J56のウサギに注入した;連続5ヶ月の間に、毎月1回、そ
れぞれ、75μgを注入して複数のboost(ブースト)を構成した。かくし
て、4つのアンチペプチドGM2APポリクロナール抗体、4つのアンチペプチ
ドSapocine Bポリクロナール抗体およびウサギの4つのアンチペプチ
ドMRP14抗体が得られ、組換えタンパク質に対するその特異性をウエスタン
ブロット法およびエリザ法によって検証した。選択したペプチドGM2AP、ペ
プチドSapocine BおよびペプチドMRP14のシークエンスを図1‐
3に示した。
:189‐190;GM2APの18のアミノ酸のペプチドに対する抗体:19
1‐192(図2参照)、 ‐MRP14の13,19のアミノ酸の2つのペプチドの混合物に対する抗体
:193;MRP14の17のアミノ酸のペプチドに対する抗体:195‐19
6(図2参照)、 ‐Sapocine Bの12,15,15のアミノ酸の3つのペプチドの混
合物に対する抗体:74‐75;Sapocine Bの12,15,15のア
ミノ酸の3つのペプチドに対する他の抗体:72‐73(図3参照)。
ルおよび方法を使用して研究室において調製、精製した。“活性分画”は、SE
P患者の精製後の尿80リッタのグループから得られた細胞障害溶離分画に対応
する。これは、3つのタンパク質GM2AP,Sapocine B,MRP1
4を含む最後の溶離分画である。上記精製分画30μgを、生後日数JO,J2
8,J56の3匹のハツカネズミに注入し、38日後、採取を行った。ハイブリ
ドーマおよびモノクロナール抗体の構成のため、“スクリーニング”および細胞
融合を行った後、当業者に公知のプロトコルにもとづき、ハイブリドーマをハツ
カネズミに再注入し、10日後、腹水の液体を回収した。セファロース・タンパ
ク質Aカラムで抗体を精製し、免疫に使用した分画に対するその特異性をウエス
タンブロット法およびエリザ法によって検証した。かくして、4つのモノクロナ
ール抗体が得られた:19C1A7,3D3F9,18C8C5および7D12
A8。
施例に記載のアンチMRP抗体を使用することによって、あるいは、(ii)BM
A Biomedicals AG(在アウグスト、スイス)から市販されてい
るキット‘MRP酵素免疫アッセイ’を使用してキットの抗体を使用することに
よって、ヒトの尿中のタンパク質MRP14、MRP8および異種錯体MRP8
/14を検量した。この場合、プロトコルは、キットの注意書きにもとづき実施
した。
SEP)および他の神経疾病に罹患した患者の7の尿(AMN)を検量した。
P8の濃度は、ほぼゼロであるが、尿TSとSEPとの間には、実際、分布差は
ない。しかしながら、観察された差は、ほぼ無視できる。なぜならば、検量濃度
は、極めて僅かであるからである。
との間には、実際、濃度差はないので、濃度は、若干のSEP尿中では高い。
:TS尿とAMN尿との間には、実際、濃度差はないが、疾病作用で特徴づけら
れるSEP患者のサブ集団に対応する若干のSEP尿中では濃度はより高い。尿
中で検量されたMRP8/14は、炎症ピークによって特徴づけられるSEP疾
病の作用マークである。
およびMRP14濃度の有意の差はないことが確認される。但し、上記尿中には
MRP8/14濃度の僅かな差が認められるが、この濃度は、平均的にSEP尿
中ではより高く、疾病作用マークである(炎症ピーク)。
したエリザ・プロトコル Gardasらが記載したエリザプロトコル(Glycoconjugate
Journal 1,37‐42,1984)にもとづき、アンチペプチドG
M2APポリクロナール抗体またはアンチペプチドSapocine Bポリク
ロナール抗体?を使用して、ヒトの尿中のタンパク質GM2APまたはSapo
cine Bを検量した。以下に、主工程を略述する: 各工程において、96ピット・マイクロプレートのピットに、指示溶液200
μlを充填した。ピットに、まず、炭酸塩‐炭酸水素塩・緩衝液(pH9,6)
中で50ng/mlに希釈したGM2AP(原核物質の組換えタンパク質)溶液
を“コーチング”した。4℃において一晩、培養した後、溶液を除去し、ピット
を、0,05%トゥイーン20(PBSトゥイーン)を含む緩衝液PBS(pH
7,4)で4回、洗浄した。かくしてコーチングされたマイクロプレートを4℃
に約2週間、貯蔵した。
試料を、適切に希釈したウサギのアンチGM2APポリクロナール抗体またはア
ンチSapocine Bポリクロナール抗体とともに4℃において一晩、培養
した。基準範囲の構成のために、2,0‐62,5ng/mlの範囲の組換えタ
ンパク質の標準希釈シリースを使用し、同様に処理した。すべての希釈は、オボ
アルブミン1mg/mlを含むPBS・トゥイーン緩衝液によって行った。更に
、培養した各溶液を、“コーチング”したピットに同様に添加し、プレートを室
温に2h放置した。次いで、ピットをPBS・トゥイーンによって4回、洗浄し
、更に、ペルオキシダーゼと結合させ約1200倍に希釈したウサギのアンチI
gG抗体溶液をピットに充填した。室温において2h培養した後、ピットをPB
S・トゥイーンによって4回、洗浄し、改めて、染色剤をピットに充填した。染
色剤は、2,2’‐アジノジ(3‐エチルベンゾチアゾリン)スルホン酸100
mgと30%過酸化水素10μlとからなり、室温において1h保持し、各マイ
クロピットの染色度を、405nmの吸収の読取りによって評価した。
プロットし、縦軸に吸収%を線形尺度でプロットして、標準曲線を構成した。試
料の吸収%は、尿試料と、可溶抗原を含まず抗血清のみを含む対照との吸収度の
比である。
溶液を50mM炭酸塩緩衝液(pH9,6)で希釈し、96ピットのマイクロプ
レートの各ピットに50μlを加えるか、0,5μg/ml溶液50μlをピッ
ト毎に加えた。このように調製したプレートを室温において一晩、培養した。研
究室で調製したアンチGM2APポリクロナール抗体(ウサギ79)を精製し、
ウマの10%血清の存在下で0,05%PBSトゥイーン緩衝液で希釈した。上
記溶液を1/8000に希釈した。0‐500ng/mlの範囲の濃度をカバー
する8つの範囲点を有する基準範囲を構成するため、この溶液を使用した。抗体
100μlと被検量尿試料100μlまたは基準範囲に役立つ組換えタンパク質
GM2APまたはSapocine B溶液との間で、室温において一晩、予培
養を行った。PBSトゥイーンでマイクロプレートを洗浄した後、ピット毎に培
養混合物50μlを添加し、次いで、室温において2h培養した。マイクロプレ
ートを、改めて、PBSトゥイーンで洗浄し、次いで、ペルオキシダーゼと結合
させ1/5000に希釈したウサギのアンチIgG抗体50μlをプレートの各
ピットに添加し、室温において2h培養した。マイクロプレートを改めて洗浄し
た後、OPD100μlを各ピットに添加し、室温において20min培養した
。使用した特殊の抗体によって確認されたGM2APまたはSapocine
Bの濃度に比例する各ピットの染色度を、吸収の読取りによって評価した。
ine Bの濃度3mg/mlの溶液を、50mM炭酸塩緩衝液で希釈し、96
ピットのマイクロプレートの各ピットに50μlを加えるか、1,5μg/ml
溶液50μlをピット毎に加えた。このように調製したプレートを室温において
一晩、培養した。研究室で調製、精製したアンチGM2APポリクロナール抗体
(ウサギ190およびウサギ191)を、単独でまたは0,05%PBSトゥイ
ーン緩衝液でそれぞれ1/1000に希釈した混合物として、ウマの10%血清
の存在下で使用した。8つの点によって0‐1500ng/mlの濃度範囲をカ
バーするよう希釈した原核物質の組換えタンパク質GM2APまたはSapoc
ine Bを使用して、基準範囲を構成した。抗体(1つの抗体または2つの抗
体の組合せ)100μlを、被検尿試料または組換えGM2APまたはSapo
cineB溶液100μlの存在下で、室温において一晩、予培養した。PBS
トゥイーンでマイクロプレートを洗浄した後、培養混合物50μlをピット毎に
添加し、次いで、室温において2h培養した。マイクロプレートを、改めて、P
BSトゥイーンで洗浄し、次いで、ペルオキシダーゼと結合させ1/5000に
希釈したウサギのアンチIgG抗体50μlをプレートの各マイクロピットに添
加し、次いで、室温において2h培養した。マイクロプレートの洗浄後、OPD
100μlを各ピットに添加し、室温において20min培養した。使用した特
殊の抗体によって確認されたGM2APまたはSapocine Bの濃度に比
例する各ピットの染色度を、吸収の読取りによって評価した。
に罹患した5人の患者の尿および活動集団から選択し病院来訪時に採尿した9人
の健常者(Healthy)の尿中のタンパク質GM2APを、下記のエリザ・
プロトコルにもとづき、アンチGM2APポリクロナール抗体を使用して検量し
た。この研究のために選択したSEP患者は、あらゆる方向の患者、即ち、疾病
段階、疾病プロフィル、処置,etc.の異なる患者である。
althy’尿の2/9のみが、200ng/mlを越えるGM2AP濃度を有
し、10/22(即ち、45%)が、200ng/mlを越えるGM2AP濃度
を有する。
M2APは、極めて低濃度(<400ng/ml)であり、一方、SEP患者の
尿に存在するGM2APは、より高濃度である。しかしながら、SEPの12の
尿のGM2APの割合は、同じく、低い。これらの12人の患者のうち、10人
が、処置中である。尿中のGM2APの高濃度は、SEP病理学のマーカであり
、更に詳細に云えば、疾病の段階または形、疾病の作用のマーカであり、途中の
すべての処置によって確実に影響される。ここで注意するが、活動集団のうちの
2名は、高濃度のGM2APを示した。(これらの2例は、本研究に自発的に含
まれたものである。なぜならば、2例の何れも、この同一カテゴリの他の個体と
は異なり、グリオ毒性を示したからである。)即ち、健常者または疾病罹患者ま
たは多発硬化症の罹患者が対象であり得る。なぜならば、いわゆる“Healt
hy”個体の試料は、匿名で採取され、臨床記録が確認されていないからである
。
GM2APは、SEP病理学のマーカであり、更に詳細に云えば、疾病の形、疾
病の段階、作用周期のマーカであり、途中のすべての処置によって確実に影響さ
れる。尿中の高濃度のGM2APは、同じく、疾病悪化開始の予見値、進行開始
時の軽症のSEPの予見値、等である。
異性に依存するが、一般に、3つの個体グループの間の傾向は、使用した個体の
如何に関せず、保持される。
apocine Bを検知した。検量は、下記のエリザ・プロトコルにもとづき
、アンチSapocine Bポリクロナール抗体を使用して、GM2APの検
量と並行して実施した。
ealthy尿の2/9が、2μg/mlよりも高いSapocine B濃度
を有し、一方、6/22(即ち、27%)が、2μg/mlよりも高い濃度を有
する。
い濃度、即ち、<2μg/mlの濃度で各尿中(いわゆる健常集団またはいわゆ
る疾病集団)に存在する。これらの検量結果は、文献に記載の結果と同等である
。しかしながら、Sapocine Bは、各尿中に存在するが、若干のSEP
尿中には高濃度で存在する。SEP尿中のSapocine Bのこの濃度増加
は、正常状態の上記タンパク質の基本的濃度によってマスクできる。従って、尿
中の高濃度のSapocine Bは、SEP病理学のマーカであり、更に詳細
に云えば、疾病の段階、疾病の形、作用周期のマーカであり、途中のすべての処
置によって確実に影響される。しかしながら、検量したSapocine Bは
、GM2APよりも疾病の形または疾病の作用の識別度が劣るマーカと思われる
。もう一度、注意するが、活動集団の2つの個体は、高濃度のSapocine
Bを有し、更に、これらの2つの個体の場合、更に、尿中のGM2APの濃度
も高い。
知された;高濃度のSapocine Bは、SEP病理学のマーカであり、更
に詳細に云えば、疾病の形、疾病の段階、作用周期のマーカであり、途中のすべ
ての処置によって影響される。尿中のこの高濃度のGM2APは、同じく、疾病
悪化開始の予見値、進行開始時の軽症のSEPの予見値、等である。しかしなが
ら、一般に、高濃度のSapocineBは、高濃度のGM2APよりも識別度
が劣るマーカと思われる。
異性に依存するが、一般に、3つの個体グループの間の傾向は、使用した個体の
如何に関せず、保持される。
量 図10に、図5に示した尿試料について検量したGM2AP濃度および図6に
示した同一の尿試料について検量したSapocine B濃度を対比して示し
た。このグラフには、SEP試料(濃色菱形)、OND試料および‘Healt
hy’試料(白抜き菱形)を示した。
い。(ここで付言するが、これは、他のタンパク質について一般的であるのでは
なく、各被検試料について並行して検量したクレアチニンにもとづき、腎不全を
意味するものではない);
る(但し、上記の活動集団の2つの尿は除く)。GM2APおよびSapoci
ne Bの同時の高濃度は、SEP病理学のマーカであり、更に詳細に云えば、
疾病の窓である(グラフの右上象限)。
)およびSapocine B(>2μg/ml)が、SEP患者の尿中に同時
に検知され、SEP病理学のマーカであり、更に詳細に云えば、疾病の形、疾病
の段階、作用周期のマーカであり、途中のすべての処置によって影響されること
が確認される。各試料について、2つのタンパク質を並行して検量し、2つの濃
度を考慮するのが有利である。
院させた。J1に、コルチコイドをフラッシュし、次いで、臨床的観点から経時
的に追跡した(フラッシュは、臨床的改善を与えた)。図11に、進行中の上記
尿のGM2APおよびSapocine Bの検量プロフィルを示し、図12に
、高濃度の共検知を表すGM2APおよびSapocine Bの2つの濃度の
積のプロフィルを示した。悪化時および入院時に採取したGM2APおよびSa
pocine Bの濃度は、コルチコイドのフラッシュ後、90日まで漸次的に
減少した。
院させた。J1に、エンドクサンをフラッシュし、次いで、臨床的観点から経時
的に追跡した(フラッシュは、臨床的改善を与え、J60に、疾病の悪化の兆候
が認められた)。図13に、進行中の上記尿のGM2APおよびSapocin
e Bの検量プロフィルを示し、図14に、高濃度の共検知値を表すGM2AP
およびSapocine Bの2つの濃度の積のプロフィルを示した。悪化時お
よび入院時に採取したGM2APおよびSapocineBの濃度は、エンドク
サンのフラッシュ後、23日まで漸次的に減少し、J60に増加して高濃度にな
り、従って、臨床的兆候の変化との完全な関連性を示した。
共役タンパク質の高濃度の共検知値(2つの濃度の積で表される)がマーカであ
る;
の場合、悪化中の作用)のマーカであるか、濃度を低下する免疫抑制剤(例えば
、コルチコイドまたはエンドクサン)の処理によって影響されるマーカである。
られる:‐患者の治療調査を実施し、所与の患者について処置の治療利点を評価
するため;または‐疾病の悪化の予見、作用ピークの予見,etc....を行
うため;
e Bの検知量と上記尿中で測定されたグリオ毒性との間の関係 尿中の上記タンパク質の単独の存在または組合せの存在と尿のグリオ毒性との
間の関係を検証するため、問題のタンパク質の濃度と、多発硬化症(SEP)に
罹患した患者、他の神経疾病(OND)に罹患した患者およびいわゆる“Hea
lthy”の活動集団から選択した個体の尿試料のグリオ毒性とを並行して検量
した。SEP患者のうち、処置中のまたは未処置の、疾病の形または段階、疾病
作用の異なる患者に注目した。
APおよびSapocine Bを検量した。この実施例で分析した検量値は、
先行例に記載の検量値である。各試料のグリオ毒性の測定のため、エリザ法で分
析した各尿試料をMTTテストによって分析した。グリオ毒性は、遠心分離した
尿の存在下で48h培養後のネズミの星芽細胞系統(CLTT1.1)の致死細
胞の%で示した(テトラゾリウム塩を使用して測色法によって測定した)。
を示した。22のSEP尿(グレーの菱形)、5つのAMN尿(黒の菱形)およ
び9の“Healthy”尿(黒の菱形)をグラフに示した。これは、実施例1
5,16において検討した尿と同一である。すべての対照尿(ONDおよびHe
althy)は、低い割合のGM2AP(<400ng/ml)および僅かなグ
リオ毒性(<15%)を有する。但し、高濃度のGM2APおよびグリオ毒性が
認められた1つのHealthy対照尿は除く(実施例15に既に述べた)
%)尿,
)尿,本質的に3つの尿,
)尿。
病作用、治療利点などの異なる集団を表すと云える。
く、強いグリオ毒性を有する。
APが高濃度のすべての尿はグリオ毒性を有し(10/10)、GM2APが低
濃度のすべての尿は、グリオ毒性が低い(<15%)。但し、3つの尿/12S
EPは例外である)。これは、アンチGM2AP抗体によって確認されるが、グ
リオ毒性の機構における、天然の形または修飾された形のタンパク質GM2AP
の単独またはその組合せの結果と解釈される。更に、尿中の高濃度のGM2AP
および強いグリオ毒性の共検知値は、SEPに罹患した患者のサブ集団と関連す
る。
リオ毒性との関係を示した。
Healthy”尿(明るい灰色の菱形)をグラフに示した。これは、実施例1
5,16において検討した尿と同一である。尿のSapocine B濃度が高
くなると、そのグリオ毒性も大きくなるということが認められる。尿のSapo
cine B濃度とグリオ毒性との間に十分に明確な関連性がある。
められる。これは、検量に使用したアンチGM2AP抗体によって確認されるが
、グリオ毒性の機構における、天然の形または修飾された形のSapocine
Bの単独またはその組合せの結果と解釈される。
ストによって求めた尿のグリオ毒性との関係を示した。
形)および9つの“Healthy”尿(明るい灰色の菱形)を図17に示した
。上記尿のグリオ毒性を、GM2APの濃度とSapocine Bの濃度との
積の関数として、即ち、尿中の2つのタンパク質の共検知値の関数として分析し
た。M2APおよびSapocine Bの2つの濃度の積とグリオ毒性との間
の関連性が、唯一つのタンパク質のみを考慮した場合よりも遥かに十分に認めら
れる。OND尿の5/5が、GM2APの濃度とSapocine Gの濃度と
の小さい積および低いグリオ毒性を有し;“Healthy”尿の8/9が、G
M2APの濃度とSapocine Bの濃度との小さい積および低いグリオ毒
性を有するということが認められた。他方、SEP尿の3つのサブ集団は、下記
の如く区別される:
15%)尿、‐GM2AP、Sapocine Bの濃度が高く、グリオ毒性の
大きい(>15%)尿 これらの2つのサブ集団は、SEPサブ集団、即ち、疾
病の形または段階、疾病作用、治療利点などの異なる集団を表すと云える。しか
しながら、極めて重要であるのだが、高濃度のGM2APおよびSapocin
e Bを有する、即ち、共役的に高濃度のGM2APおよびSapocine
Bを有するすべての尿は、同じく、強いグリオ毒性を有する。3つのマーカ、即
ち、グリオ毒性、高濃度のGM2APおよび高濃度のSapocine Bを同
時に考慮すれば、SEP患者の2つのサブ集団は、ますます顕著で明確になる。
これは、図18において確認される。
の間に関連性が認められる。GM2APおよびSapocine Bが高濃度の
すべての尿はグリオ毒性を示し、GM2APおよびSapocine Bが低濃
度のすべての尿はグリオ毒性を示さない(<15%)。但し、2つの尿/22S
EPは例外である。これは、検量に使用したアンチGM2AP抗体およびアンチ
Sapocine B抗体によって確認されるが、グリオ毒性の機構における、
天然の形または修飾された形の共役的なまたは組合せた2つのタンパク質GM2
APおよびSapocine Bの結果と解釈される。更に、尿中の高濃度のG
M2APおよびSapocine Bと強いグリオ毒性との共検知値は、他のサ
ブ集団に比して、SEPに罹患した患者のサブ集団(段階、形、作用、疾病の処
置?)と関連する。共役的に考慮したこれらの3つのマーカは、SEP患者の2
つのサブ集団を識別できる。
AP濃度およびSapocine B濃度の進行
ことによって、SEP尿および病理学におけるグリオ毒性、高濃度のGM2AP
およびSapocineの間の関連性を確認した。
にコルチコイド・フラッシュ処置。フラッシュ後、J60まで臨床的改善が認め
られた(図11,12参照)。
にエンドクサン・フラッシュ処置。J60に、再び、その疾病の悪化の臨床的兆
候が現れた(図13,14参照)。
オ毒性が増大する;処置に続いて臨床兆候が軽減した場合、グリオ毒性が、減少
して一定となる;処置後に悪化兆候が現れた場合、グリオ毒性は、再び、増大す
る),
濃度との関連性、
連性。
SEPのサブ集団(段階、形、作用、疾病の処置)の良好な識別マークである。
タンパク質GM2APおよび/またはSapocine Bは、グリオ毒性の機
構に、単独でまたは組合せて、天然の形または検量に使用したポリクロナール抗
体によって識別される形で関与する。タンパク質GM2APおよびSapoci
neは、グリオ毒性尿中では高濃度で共検知されるので、これらの2つのタンパ
ク質が、グリオ毒性の誘導のため組合せて作用できる。
パク質GM2A,SAPB,MRP14およびMRP8の発現の免疫組織化学的
分析 プロトコル:略述した本プロトコルにもとづき、SEP罹患の患者および対照
健常者の単球の培養を並行して実施した。ACDで採取した上記の2名の志願者
の抹消血液から、当業者に周知の技術を使用して、FicollでPBMC(抹
消血液単核細胞)を分離した。(リングのレベルで)回収した細胞をRPMI媒
体で2回、洗浄した。次いで、細胞をKovasスライド上で計数し、25cm 2 の第1フラスコ内にまたはLabteck片(8ピット)(パーマノックス製
)上に、J0において、ヒトの15%血清ABを補足した媒体RPMIによって
散布した。担体に接着し、最終的にマクロファージに分化する単球の分析のため
、担体に直接に塗布するために、“Labteck”タイプの蜂巣片上で細胞を
培養した。かくして、片について、2・106の細胞を0,25・106/ピット
の割合で散布した。フラスコについて、4・106の細胞を0,25・106/ピ
ットの割合で散布した。J1において、懸濁細胞を回収し、ヒトの5%血清AB
を補足した媒体RPMIを加える前に、(37℃に予熱した)RPMIでLab
teckのピットまたはフラスコを2回、洗浄した。J1、J3,J6,J9,
J12または14,J15に、培養媒体を交換した;上澄液を採取し、当業者に
周知の技術を使用して片上に細胞を固定した。媒体の変更毎に、少なくとも2つ
の片をパラホルムアルデビで固定し、免疫組織化学的分析のために保管した。
トリウム5mlと、非必須アミノ酸(100×)5mlと、抗生物質であるペニ
シリンおよびストレプトマイシン100000U/μlと、ヒトのアンチインタ
ーフェロン抗体100U/μlとを含むRPMI(500ml)。
体の血液の2つの単球培養およびSEP患者の2つの単球培養。各培養時点(J
0,J1、J3,J6,J9,J12...)において、対応する上澄液を同様
に回収した。回収が完了したならば、各培養日に対応する片を、アンチGM2A
,SAP‐B,MRP‐8およびMRP‐14ポリクロナール抗体の存在下で培
養した。かくして回収した上澄液のグリオ毒性をMTTテストによって評価した
。実施例13,14に記載した如きエリザ・プロトコルにもとづき各上澄液のタ
ンパク質GM2A,MRP14およびSapocine Bの濃度を測定した。
て認められたが、SEP培養の場合には、発現はより強い。この発現は、マクロ
ファージ分化段階と関連すると思われる。
められ、これは、マクロファージ系リソソーム中のGM2Aの生理学的存在に対
応すると思われる。‐SEP培養の場合、GM2Aの遥かに明確な発現(強度強
く且つ細胞数多い)が、J3‐J6の比較的均一な細胞質マーキングとともに認
められ、J9において消失し、J14‐J15に、細胞周辺に局在し細胞膜の内
部輪郭を描く強いマーキングとともに再び認められた。この現象は、対照片グル
ープには認められなかった。
ングは得られなかった。
し、2/3が、J6により弱いピークを示した。並行して分析した非SEP対照
試料の単球培養の場合、2/2に何らのピークも認められなかった。操作中の細
胞培養の上澄液中のMRP14,GM2APおよびSapocine Bの検量
から、培養のJ6に且つ特にJ9に、タンパク質SAP‐BおよびGM2APが
、エリザ法によって、SEP上澄液には検知されるが、対照単球の上澄液には検
知されないということが判った;この操作以後、タンパク質は検知されなかった
。ここで注意するが、検量のために使用した抗体は、タンパク質の生理学的形態
を識別でき、しかも、錯体および/または修飾体の形態も検知できる。
細胞内に、細胞発現(細胞発現量および局在)の定量的、定性的ゆらぎを伴うG
M2Aのマイナス対照の低分化の生成が観察されるJ3‐J15期間によってカ
バーされるということが確認される。
らキシレンおよびアルコールによってパラフィンを除去した;この前処理は、(
i)クエン酸ナトリウム・クエン酸緩衝液の存在下でマイクロ波の5min×2
回の照射,(ii)1%過酸溶液中の15minの培養または99%ギ酸溶液中の
5minの培養による酸処理に対応する。次いで、1%過酸化水素中で片を30
min培養して内在性ペルオキシダーゼをブロックし、次いで、15min強力
に水洗した。0,03%PBSトリトン、(ポリクロナール抗体のための)10
%ロバ血清または(モノクロナール抗体のための)10%ヤギ血清の存在下で片
を30min培養して、ベースノイズをブロックした。0,03%PBSトリト
ン中で1次抗体溶液100‐200μlを片毎に塗布し(タイトルにもとづき0
,5‐5μg/ml)、次いで、室温において2h培養した。次いで、PBSト
リトンで10min、3回、片を洗滌した。1次抗体に特定的に固定できるビオ
チニル化抗体(例えば、0,03%PBSトリトンで希釈したウサギのアンチI
gGまたはハツカネズミのアンチIgG)を使用して2次抗体のマーキングを行
った。片を洗浄し、溶液(ストレプタビジン・ビオチン・ペルオキシド錯体2μ
l,0,03%PBSトリトン1600μl)中で2h培養した。採取前に、緩
衝液A中で遮光して、片を再び洗浄し、次いで、顕微鏡観察前に水洗した。5つ
の片についての緩衝液A:0,05Mトリス(pH7,6)25ml,1Mイミ
ダゾール2,5ml,無菌水15ml,5mg/mlDAB2ml,10%ニッ
ケルアンモニウム5ml,1%H2O230μl。
および病理学的に非神経病の死後の対照から採取した脳をミクロトームによって
カットして得たパラフィン埋込片に、同一の抗体を使用した。
常な(無傷の)白色物質中に、“非SEP”脳およびSEP脳のマーキングはな
かった。この免疫組織化学的プロセスにおいて、不特定の反応性にもとづき、ア
ンチSapocineB抗体に関する結果は、判断できなかった。
、脱髄ゾーン(プレート)の全範囲にわたって比較的均一な分布を有する,
パ性浸潤液に起因する、
ンチGM2A反応性は、プレートの周縁に“神経膠障壁”を校正する。従って、
脱髄ゾーンには、任意の星芽細胞のマーキングが認められた。
P単核細胞の培養体およびSEP脳内に脱髄プレートを形成するゾーンには、タ
ンパク質MRP14およびGM2Aの特殊な高度発現が存在する。従って、かく
して、異常な共発現とグリオ毒性と脱髄障害との間の一致の現実性が証明される
。
胞および脳細胞中の異常なその生成から明らかな如く、SEPの病変作用および
炎症作用をその量と関連させるため、生物学的液体中のその検量実施に依拠する
。
81) 初期の培養媒体中に存在する痕跡のIL2を除去するため、培養媒体でT細胞
を2回洗浄した。抗原のプレゼンテーション細胞として把握されるリンパ細胞B
(EBV‐LCL)または単球細胞/マクロファージを、10000rdで照射
し、培養媒体(RPMI)で2回洗浄した。2・104のT細胞(2・105細胞
/ml)および自動的に照射された2・104のB細胞(2・105細胞/ml)
を、マイクロピット内で、抗原を増殖する濃度範囲において、最終容積が200
μlになるよう、一緒に培養した。37℃において48h培養後、3H‐チミジ
ン1μCiを含むRPMI媒体50μlを各ピットに添加した。独自に分離され
るT細胞は、DNA内で加水分解されたチミジンを含む。18h培養後、各マイ
クロピットの細胞をガラスウールペレット上に吸引、捕集した。細胞の浸透分解
後、DNAに組込まれた放射能をペレット(cell Harvester I
notech)に吸収させた。乾燥した各ペレットを、シンチレーター2mlを
含むプラスチック管内に設置した;各ペレットに吸収された放射能をβ‐液体シ
ンチレーションカウンタ(LKBRackbeta 1217)で定量した。c
pm/培養体の算術平均値で示した(‘cpm=ショット/min’)。
H1に固定されるペプチドによって形質変換されたAPCアプローチ) 1)材料: 組織適合分子のソースは、実際、2つの基本的タイプ、即ち、突然変異細胞お
よび精製した組織適合分子である。
1.174の融合によって生成された系列T1のバリエーションであるヒトのT
2細胞である(Salterら,Embo J 1986,5:943‐949
)。ペプチドの輸送体を除去したこの細胞は、外因性ペプチドを受容できる、ペ
プチドを含まないクラスIの分子の重い鎖を含む。
トグラフィーによって精製したクラスIの組織適合分子も使用できる。この場合
、内在性ペプチドを1,5Mウレアおよび12,5mM水酸化ナトリウム(pH
11,7)で4℃において1h処理によって除去し、次いで、脱塩カラム(PD
LO,Pharmacia)によって上記媒体を除去した。再結合を容易化する
ため2μg/mlのB2mの存在下で、0,05%トゥイーン20と、2mME
DTAと、0,1%NP40と、6mMCHAPSとを含む緩衝液PBS中の被
検ペプチドに、組織適合細胞を再統合させた(Gnjaticら、J Immu
nol 1995 25:1638‐1642)。
残基を有する。ペプチドは、Neosystem(ストラスブルグ)またはCh
iron mimotopes(ビクトリアネオーストラリヤ)によって合成し
た。ペプチドは、バリエーションを100μMから0,1nMに濃縮するのに使
用した。
:777;Couillinら,J Immunol 1995 25:728
‐732)
)の細胞を、10mMPBS,1%NP40(pH7,5),プロテアーゼ阻害
剤(1mMPMSF,100μMインドアセトアミド,2μg/mlアプロチニ
ン,10μMロイペプチン,10μMペブスタチンおよび10μg/mlトリプ
シン阻害剤)を含む分解緩衝液と統合した。分解は、被検ペプチドの存在下で、
37℃において30minまたは1h行った。4℃において15000rpmの
遠心分離によって未溶解材料を除去した後、0,05%トゥイーン20と、3m
Mアジ化ナトリウムと,1mM PMSFと,ウシの10mg/mlアルブミン
とを含むPBS140μlを上澄液に加えた。ペプチドのプレゼンテーションに
適し且つ細胞表面のコンホメーションに類似したコンホメーションを有する組織
適合細胞を識別するモノクロナール抗体(10μg/mlPBS)をあらかじめ
被覆したNunc(Maxisorb)タイプの微小滴定プレートの2つのピッ
ト内で、4℃において20h、各試料を培養した。試料採取前に、PBSトゥイ
ーン中で、抗体を被覆したプレートをウシの10mg/mlアルブミンであらか
じめ飽和させた。組織適合分子の統合を検知できる第2抗体をB2mへ向けた。
第2抗体を、ビオチン(NHS‐LCビオチン,Piere)またはアルカリ性
ホスファターゼ(P552,Sigma)に結合させ、37℃において1h,2
μg/mlで培養した。ビオチンの使用の場合、アルカリ性ホスファターゼ(E
‐2636,Sigma)と結合させたストレプトアビジンによって20‐25
℃において45minの培養を行った。1mM MgCl2を含む50mMジエ
タノールアミン(pH9,5)中で、100μMの4‐メチルウンベリフェリル
ホスフェートを基体として使用して、アルカリ性ホスファターゼの活性を測定し
た。細胞蛍光定量法によって、340/460nmにおいて測定を行った。
ゼンテーションおよびT2細胞の誘導の条件をなすからである。このため、精製
ずみHLAまたはT2細胞の分解体を使用した。精製ずみHLAによって、(2
に記載の如く)内在性ペプチドを除去し、次いで、エッペンドルフ管中で、37
℃において、数分から数日の範囲の多様な時間にわたって、被検ペプチドを生成
させた。(2に記載の如く)96ピット・プレートにおいてアンチHLA抗体に
よって、37℃において1h、次ぎの培養段階を実施した。すべてのプロテアー
ゼ阻害剤を加えた後、T2細胞の分解体によって、同じく、37℃においてすべ
ての培養を行った。
プチドGM2AP抗体の調製に使用されるペプチドの強調した局在を示す図面で
ある。
プチドMRP14抗体の調製に使用されるペプチドの強調した局在を示す図面で
ある。
びアンチペプチドSapocine B抗体の調製に使用されるペプチドの強調
した局在を示す図面である。
N)に冒された患者の尿および健康と考えられる対照者(TS)の尿中のタンパ
ク質MRP8の測定値(縦軸:ng/ml)を示す図面である(nは、カテゴリ
によってテストした尿数を表す)。
N)に冒された患者の尿および健康と考えられる対照者(TS)の尿中のタンパ
ク質MRP14の測定値(縦軸:ng/ml)を示す図面である(nは、カテゴ
リによってテストした尿数を表す)。
N)に冒された患者の尿および健康と考えられる対照者(TS)の尿中のタンパ
ク質MRP8/14の測定値(縦軸:ng/ml)を示す図面である(nは、カ
テゴリによってテストした尿数を表す)。
N)に冒された患者の尿および健康と考えられる対照者(TS)の尿中のタンパ
ク質MRP8,MRP14,MRP8/MRP14の測定値(縦軸:ng/ml
)を示す図面である(nは、カテゴリによってテストした尿数を表す)。
N)に冒された患者の尿および健康と考えられる対照者(TS)の尿中のタンパ
ク質GM2APの測定値(縦軸:ng/ml)を示す図面である(nは、カテゴ
リによってテストした尿数を表し、MSは、SEPを表し、ONDは、AMNを
表し、Healthyは、健康と想定された対照者(TS)からの採取数を表す
)。
N)に冒された患者の尿および健康と考えられる対照者(TS)の尿中のタンパ
ク質Sapocine Bの測定値(縦軸:μg/ml)を示す図面である(n
は、カテゴリによってテストした尿数を表し、MSは、SEPを表し、ONDは
、AMNを表し、Healthyは、健康と想定された対照者(TS)からの採
取数を表す)。
された患者の尿試料中のタンパク質Sapocine B(縦軸:μg/ml)
およびGM2AP(横軸:ng/ml)の共検知結果および2つのタンパク質の
比率の間に認められた関係を示す図面である。
APの測定値(細い曲線)およびMTTテストによって求めた致死細胞の%とし
て示したグリオ毒性(太い曲線)を示す図面である。(B)漸次的寛解の形のS
EP患者の尿中のタンパク質Sapocine Bの測定値(μg/ml)(細
い曲線)およびMTTテストによって求めた致死細胞の%として示したグリオ毒
性(太い曲線)を示す図面である。
濃度およびSapocine Bの濃度の積(ng×μg/ml2)(細い曲線
)およびMTTテストによって求めた致死細胞の%として示したグリオ毒性(太
い曲線)を示す図面である。
APの測定値(ng/ml)(細い曲線)およびMTTテストによって求めた致
死細胞の%として示したグリオ毒性(太い曲線)を示す図面である。(B)漸次
的寛解の形のSEP患者の尿中のタンパク質Sapocine Bの測定値(μ
g/ml)(細い曲線)およびMTTテストによって求めた致死細胞の%として
示したグリオ毒性(太い曲線)を示す図面である。
濃度およびSapocine Bの濃度の積(ng×μg/ml2)(細い曲線
)およびMTTテストによって求めた致死細胞の%として示したグリオ毒性(太
い曲線)を示す図面である。
(ng/ml)(横軸)およびMTTテストによって求めた致死細胞の%として
示したグリオ毒性(縦軸)との間の関係を示す図面である。
(μg/ml)(横軸)およびMTTテストによって求めた致死細胞の%として
示したグリオ毒性(縦軸)との間の関係を示す図面である。
度の積(ng×μg/ml2)(横軸)およびMTTテストによって求めた致死
細胞の%として示したグリオ毒性(縦軸)との間の関係を示す図面である。
ne Bの濃度(μg/ml‐右側の縦軸)とMTTテストによって求めた致死
細胞の%として示したグリオ毒性(横軸)との間の関係を示す図面である。(求
めた2つの関係直線をグラフに示した。太い線は、Sapocine Bの濃度
に関し、黒く細い線は、GM2APの濃度を表す。)
Claims (64)
- 【請求項1】 変性疾患及び/又は神経疾患及び/又は自己免疫疾患に付随
する病的状態を検出、予防又は治療することを目的とする診断、予後診断、予防
又は治療用組成物を得るための、1つのタンパク質の少なくとも1つのフラグメ
ントを含んで成る少なくとも1つのポリペプチドの使用において、前記タンパク
質は、未変性状態でのそのペプチド配列が、配列番号1、配列番号2、配列番号
3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号
10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号1
5、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20
、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、
配列番号26、配列番号27、配列番号28及び配列番号29、及びペプチド配
列番号1‐配列番号8及び配列番号10-配列番号29のいずれか1つと少なく
とも70%、好ましくは少なくとも80%そして有利には少なくとも98%の同
一性を呈するペプチド配列、及び、ペルルカン、レチノール結合血漿タンパク質
前駆体、ガングリオシドGM2、カルグラヌリンB及びサポシンBの賦活物質前
駆体の中から選ばれた同じタンパク質系統群に属するペプチド配列又はそのフラ
グメントに対応しているタンパク質の中から選択されている、使用。 - 【請求項2】 変性疾患及び/又は神経疾患及び/又は自己免疫疾患に付随
する病的状態を検出、予防又は治療することを目的とする診断、予後診断、予防
又は治療用組成物を得るための、1つのタンパク質の少なくとも1つのフラグメ
ントを各々含んで成る少なくとも2つのポリペプチドの組合せ使用において、前
記タンパク質は、未変性状態でのそのペプチド配列が、配列番号1-配列番号8
及び配列番号10、配列番号29の中から選ばれたペプチド配列、及びペプチド
配列配列番号1-配列番号8及び配列番号10-配列番号29のいずれか1つと少
なくとも70%、好ましくは少なくとも80%そして有利には少なくとも98%
の同一性を呈するペプチド配列、及び、ペルルカン、レチノール結合血漿タンパ
ク質前駆体、ガングリオシドGM2、カルグラヌリンB及びサポシンBの賦活物
質前駆体の中から選ばれた同じタンパク質系統群に属するペプチド配列又はその
フラグメントに対応しているタンパク質の中から選択されている、使用。 - 【請求項3】 変性疾患及び/又は神経疾患及び/又は自己免疫疾患に付随
する病的状態を検出、予防又は治療することを目的とする診断、予後診断、予防
又は治療用組成物を得るための、1つのタンパク質の少なくとも1つのフラグメ
ントを含んで成る少なくとも1つのポリペプチドの使用において、前記タンパク
質は、未変性状態でのそのペプチド配列が、配列番号2、配列番号4、配列番号
8、配列番号17及び配列番号24、及びペプチド配列配列番号2、配列番号4
、配列番号8、配列番号17及び配列番号24のいずれか1つと少なくとも70
%、好ましくは少なくとも80%そして有利には少なくとも98%の同一性を呈
するペプチド配列に対応しているタンパク質の中から選択されている、使用。 - 【請求項4】 変性疾患及び/又は神経疾患及び/又は自己免疫疾患に付随
する病的状態を検出、予後診断、予防又は治療することを目的とする診断、予後
診断、予防又は治療用組成物を得るための、1つのタンパク質の少なくとも1つ
のフラグメントを各々含んで成る5つのポリペプチドの組合せ使用において、前
記タンパク質は、未変性状態でのそのペプチド配列が、配列番号2、配列番号4
、配列番号8、配列番号17及び配列番号24、及びペプチド配列配列番号2、
配列番号4、配列番号8、配列番号17、配列番号24のいずれか1つと少なく
とも70%、好ましくは少なくとも80%そして有利には少なくとも98%の同
一性を呈するペプチド配列に対応しているタンパク質の中から選択されている、
請求項3に記載の使用。 - 【請求項5】 前記ポリペプチドのペプチド配列が、配列番号2、配列番号
4、配列番号8、配列番号17及び配列番号24のいずれか1つから選択された
1つの配列を含んで成る、請求項1-4のいずれか1項に記載の使用。 - 【請求項6】 前記ポリペプチドのペプチド配列が、配列番号2、配列番号
4、配列番号8、配列番号17及び配列番号24のいずれか1つから選択された
1つの配列で構成されている、請求項1-4のいずれか1項に記載の使用。 - 【請求項7】 ペプチドが配列番号58-65という番号のついた配列のう
ちの少なくとも1つの全部又は一部を含んで成ることを特徴とする、免疫原性ペ
プチドの調製のための請求項1又は請求項3に記載のポリペプチドフラグメント
の使用。 - 【請求項8】 変性疾患及び/又は神経疾患及び/又は自己免疫疾患に付随
する病的状態を検出、予後診断、予防又は治療することを目的とする診断、予後
診断、予防又は治療用組成物を得るための、タンパク質の少なくとも1つのヌク
レオチドフラグメントの使用において、ここで前記ヌクレオチドフラグメントは
、1つのタンパク質の少なくとも1つのフラグメントについてコードするフラグ
メントの中から選択されており、前記タンパク質は、未変性状態でのそのペプチ
ド配列が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配
列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号1
2、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17
、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、
配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配
列番号28及び配列番号29、及びペプチド配列配列番号1-配列番号8及び配
列番号10-配列番号29のいずれか1つと少なくとも70%、好ましくは少な
くとも80%そして有利には少なくとも98%の同一性を呈するペプチド配列、
前記フラグメントの相補的フラグメント及びペルルカン、レチノール結合血漿タ
ンパク質前駆体、ガングリオシドGM2、カルグラヌリンB及びサポシンBの賦
活物質前駆体の中から選ばれた同じタンパク質系統群に属するペプチド配列又は
そのフラグメントについてコードするフラグメントに対応しているタンパク質の
中から選択されている、使用。 - 【請求項9】 前記ヌクレオチドフラグメントが前記タンパク質についてコ
ードすることを特徴とする請求項8に記載の使用。 - 【請求項10】 未変性状態での前記タンパク質のペプチド配列が、配列番
号1-8及び配列番号10-29のうちのいずれか1つの中から選ばれた1つの配
列及び、ペルルカン、レチノール結合血漿タンパク質前駆体、ガングリオシドG
M2、カルグラヌリンB及びサポシンBの賦活物質前駆体の中から選ばれた同じ
タンパク質系統群に属するペプチド配列又はそのフラグメントで構成されている
ことを特徴とする請求項9に記載の使用。 - 【請求項11】 変性疾患及び/又は神経疾患及び/又は自己免疫疾患に付
随する病的状態を検出、予後診断、予防又は治療することを目的とする診断、予
後診断、予防又は治療用組成物を得るための、少なくとも1つのヌクレオチドフ
ラグメントの使用において、前記フラグメントが、配列番号30、配列番号31
、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、
配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配
列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46及び配
列番号47、配列番号48、配列番号49及び配列番号50、配列番号51、配
列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列
番号57、配列番号67、配列番号66、配列番号69、配列番号70及び配列
番号71のうちのいずれか1つ及びその相補的配列から選ばれた核酸配列のフラ
グメントである、使用。 - 【請求項12】 変性疾患及び/又は神経疾患及び/又は自己免疫疾患に付
随する病的状態を検出、予後診断、予防又は治療することを目的とする診断、予
後診断、予防又は治療用組成物を得るための請求項1-11のいずれか1項に記
載のポリペプチド又はヌクレオチドフラグメントの特異的リガンドの使用。 - 【請求項13】 変性疾患及び/又は自己免疫疾患が多発性硬化症であるこ
とを特徴とする請求項1-12のいずれか1項に記載の使用。 - 【請求項14】 生体標本中の変性疾患及び/又は自己免疫疾患に結びつけ
られる少なくとも1つのタンパク質を検出するための方法において、少なくとも
1つのポリペプチドの少なくとも1つの特異的リガンドと生体標本を接触させる
こと、ここで前記ポリペプチドが1つのタンパク質の少なくとも1つのフラグメ
ントを含んで成り、該タンパク質は、未変性状態でのそのペプチド配列が配列番
号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番
号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13
、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、
配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配
列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28及び配
列番号29、及びペプチド配列配列番号1-配列番号8及び配列番号10-配列番
号29のいずれか1つと少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%そして
有利には少なくとも98%の同一性を呈するペプチド配列、及び、ペルルカン、
レチノール結合血漿タンパク質前駆体、ガングリオシドGM2、カルグラヌリン
B及びサポシンBの賦活物質前駆体の中から選ばれた同じタンパク質系統群に属
するペプチド配列又はそのフラグメントに対応しているタンパク質の中から選択
されていること、及びその後、前記ポリペプチド及び前記リガンドの間の複合体
の形成を検出することを特徴とする、方法。 - 【請求項15】 前記リガンドがモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体
、レセプタ、酵素活性基質又は前記ポリペプチドを補因子とする酵素であること
を特徴とする請求項14に記載の方法。 - 【請求項16】 生体標本中の変性疾患及び/又は自己免疫疾患に結びつけ
られる少なくとも1つのリガンドを検出するための方法において、1つのタンパ
ク質の少なくとも1つのフラグメントを含む少なくとも1つのポリペプチドと生
体標本を接触させ、該タンパク質は、未変性状態でのそのペプチド配列が配列番
号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番
号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13
、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、
配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配
列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28及び配
列番号29、及びペプチド配列配列番号1-配列番号8及び配列番号10-配列番
号29のいずれか1つと少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%そして
有利には少なくとも98%の同一性を呈するペプチド配列、及び、ペルルカン、
レチノール結合血漿タンパク質前駆体、ガングリオシドGM2、カルグラヌリン
B及びサポシンBの賦活物質前駆体の中から選ばれた同じタンパク質系統群に属
するペプチド配列又はそのフラグメントに対応しているタンパク質の中から選択
されていること、及びその後、前記ポリペプチド及び前記リガンドの間の複合体
の形成を検出することを特徴とする方法。 - 【請求項17】 リガンドが、抗体、レセプタ、酵素活性基質又は前記ポリ
ペプチドを補因子とする酵素であることを特徴とする請求項16に記載の方法。 - 【請求項18】 前記ポリペプチドの配列が、配列番号1-8及び配列番号
10-29のいずれか1つの中から選択されたペプチド配列を含んで成ることを
特徴とする請求項14-17のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項19】 前記ポリペプチドの配列が、配列番号1-8及び配列番号
10-29のいずれか1つの中から選択されたペプチド配列で構成されているこ
とを特徴とする請求項14-17のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項20】 生体標本が尿、脳脊髄液又は血清であることを特徴とする
請求項14-19のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項21】 変性疾患及び/又は自己免疫疾患が多発性硬化症であるこ
とを特徴とする請求項14-20のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項22】 そのペプチド配列が配列番号9に対応する1つのタンパク
質の少なくとも1つのフラグメントを含んで成り、前記フラグメントが配列番号
8という基準配列との関係において少なくとも1つの突然変異を含んで成ること
を特徴とするポリペプチド。 - 【請求項23】 配列番号8という基準配列との関係において少なくとも2
つの突然変異を含んで成ることを特徴とする請求項22に記載のポリペプチド。 - 【請求項24】 配列番号68のアミノ酸配列FSWDNCFEGKDPA
VIR及び配列番号72のアミノ酸配列YSLPKSEFAVPDLELPを含
んで成るポリペプチドの中から選択されることを特徴とする請求項22に記載の
ポリペプチド。 - 【請求項25】 そのペプチド配列が配列番号9に対応するタンパク質を含
んで成ることを特徴とする請求項22-24のいずれか1項に記載のポリペプチ
ド。 - 【請求項26】 そのペプチド配列が配列番号9に対応するタンパク質で構
成されていることを特徴とする請求項22-25のいずれか1項に記載のポリペ
プチド。 - 【請求項27】 変性疾患及び/又は神経疾患及び/又は自己免疫疾患に付
随する病的状態を検出、予後診断、予防又は治療することを目的とする診断、予
後診断、予防又は治療用組成物を得るための、請求項22-26のいずれか1項
の少なくとも1つのポリペプチドの使用。 - 【請求項28】 請求項22-26のいずれか1項に記載のポリペプチドが
請求項1-5のいずれか1項に記載の少なくとも1つのポリペプチドとの混合状
態で使用されることを特徴とする請求項26に記載の使用。 - 【請求項29】 生体標本中の変性疾患及び/又は自己免疫疾患に結びつけ
られた少なくとも1つのリガンドを検出するための方法において、請求項22-
26のいずれか1項に記載の少なくとも1つのポリペプチドと生体標本を接触さ
せ、次に前記ポリペプチドとリガンドの間の複合体形成を検出することを特徴と
する方法。 - 【請求項30】 請求項22-26のいずれか1項に記載の1つのポリペプ
チド及び請求項1-5のいずれか1項に記載の少なくとも1つのポリペプチドと
生体標本を接触させることを特徴とする請求項29に記載の方法。 - 【請求項31】 前記リガンドが抗体、レセプタ、酵素活性基質又は前記ポ
リペプチドを補因子とする酵素であることを特徴とする請求項29又は30に記
載の方法。 - 【請求項32】 前記ポリペプチドの少なくとも1つの特異的リガンドと生
体標本を接触させ、次に前記ポリペプチドと前記リガンドの間の複合体の形成を
検出することを特徴とする、生体標本中の請求項22-26のいずれか1項に記
載の少なくとも1つのポリペプチドを検出する方法。 - 【請求項33】 前記リガンドがモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体
、レセプタ、酵素活性基質又は前記ポリペプチドを補因子とする酵素であること
を特徴とする請求項32に記載の方法。 - 【請求項34】 請求項31-33のいずれか1項に記載のリガンド及び請
求項1-5のいずれか1項に記載の少なくとも1つのポリペプチドの少なくとも
1つの特異的リガンドと生体標本を接触させ、次に前記ポリペプチドとその特異
的リガンドの間の複合体の形成を検出することを特徴とする請求項30又は31
に記載の方法。 - 【請求項35】 リガンドがモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、レ
セプタ、酵素活性基質又は前記ポリペプチドを補因子とする酵素であることを特
徴とする請求項34に記載の方法。 - 【請求項36】 請求項22-26のいずれか1項に記載のポリペプチドに
ついてコードすることを特徴とするヌクレオチドフラグメント。 - 【請求項37】 変性疾患及び/又は自己免疫疾患に付随する病的状態を検
出、予後診断、予防又は治療することを目的とする診断、予後診断、予防又は治
療用組成物を得るためのヌクレオチドフラグメントの使用において、前記ヌクレ
オチドフラグメントが、場合によって請求項8-11のいずれか1項に記載の少
なくとも1つのヌクレオチドフラグメントと結びつけた状態にある請求項35に
記載のヌクレオチドフラグメント、又はこれらのヌクレオチドフラグメントの相
補的フラグメントである、使用。 - 【請求項38】 生体標本が尿、脳脊髄液又は血清であることを特徴とする
請求項29-35のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項39】 変性疾患及び/又は自己免疫疾患が多発性硬化症であるこ
とを特徴とする請求項29-36のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項40】 請求項1-5のいずれか1項又は請求項22-26のいずれ
か1項に記載の少なくとも1つのポリペプチドを検出するための方法において、
変性疾患及び/又は神経疾患及び/又は自己免疫疾患に付随する病的状態を呈す
る患者の生体流体の標本を採取し、場合によっては前記生体流体標本の精製後に
、質量分析によって生体流体から得られた質量プロフィールを分析し、基準質量
プロフィールと比較する、方法。 - 【請求項41】 変性疾患及び/又は神経疾患及び/又は自己免疫疾患に付
随する病的状態を検出、予防又は治療することを目的とする診断、予後診断、予
防又は治療用組成物を得るための、1つのタンパク質の少なくとも1つのフラグ
メントを含んで成る少なくとも1つのポリペプチドの使用において、前記タンパ
ク質は、未変性状態でのそのペプチド配列が、配列番号8、配列番号9、配列番
号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号
15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号2
0、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25
、配列番号26、配列番号27、配列番号28及び配列番号29、及びペプチド
配列配列番号8-配列番号29のいずれか1つと少なくとも70%、好ましくは
少なくとも80%そして有利には少なくとも98%の同一性を呈するペプチド配
列、及びガングリオシドGM2、カルグラヌリンB及びサポシンBの賦活物質前
駆体の中から選ばれた同じタンパク質系統群に属し、かつ好ましくは配列番号8
、9、17及び24のペプチド配列又はそのフラグメントに対応しているタンパ
ク質の中から選択されている、使用。 - 【請求項42】 ペプチド配列が、ガングリオシドGM2及びサポシンBの
賦活物質前駆体の中から選ばれた同じタンパク質系統群に属するペプチド配列又
はそのフラグメントである、請求項41に記載の使用。 - 【請求項43】 グリオトキシン活性検出の使用に結びつけられる、請求項
41又は42のいずれか1項に記載の使用。 - 【請求項44】 病的状態を検出又は予防するため請求項41-43のいず
れか1項に記載の少なくとも1つのポリペプチドを秤量する診断又は予後診断方
法において、秤量により、変性疾患及び/又は神経疾患及び/又は自己免疫疾患
を表わす閾値に比較される濃度値を得ることが可能になる、方法。 - 【請求項45】 閾値が尿標本についてELISA検定により得られ、この
値は ・ GM2AP84抗体について、ガングリオシドGM2の賦活物質前駆体に関
し400ng/mlであり、 ・ SAPB84抗体について、サポシンBに関し2μg/mlである、 請求項44に記載の方法。 - 【請求項46】 病的状態を予防するため請求項41-43のいずれか1項
に記載の少なくとも1つのポリペプチドを検出する診断又は予後診断方法におい
て、検出が、変性疾患及び/又は神経疾患及び/又は自己免疫疾患に罹患してい
る可能性のある患者の細胞内又はその上清中で行なわれる、方法。 - 【請求項47】 検出が、変性疾患及び/又は神経疾患及び/又は自己免疫
疾患に罹患している可能性のある患者に由来する単球又はマクロファージ上又は
これらの細胞の上清中で行なわれる、請求項46に記載の方法。 - 【請求項48】 6-12日間の培養期間の後、好ましくは9日後、培養中
の細胞上又はその上清中で検出を行なう、請求項46又は47のいずれか1項に
記載の方法。 - 【請求項49】 検出は、in vivo又はex vivoの細胞上好ま
しくは、変性疾患及び/又は神経疾患及び/又は自己免疫疾患に罹患している可
能性のある患者の脳内で単球又はマクロファージについて実施される、請求項4
6又は47のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項50】 変性疾患及び/又は神経疾患及び/又は自己免疫疾患が多
発性硬化症或いはこの病気の1形態(進行性、弛張性、弛張性‐進行性)又は活
動期(増悪)であることを特徴とする請求項41-49のいずれか1項に記載の
使用又は方法。 - 【請求項51】 治薬剤の効能をテストするための1つのタンパク質の少な
くとも1つのフラグメントを含む少なくとも1つのポリペプチドの使用において
、前記タンパク質は、未変性状態でのそのペプチド配列が、配列番号1、配列番
号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番
号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13
、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、
配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配
列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28及び配
列番号29、及びペプチド配列配列番号1-配列番号29のいずれか1つと少な
くとも70%、好ましくは少なくとも80%そして有利には少なくとも98%の
同一性を呈するペプチド配列、及び、ペルルカン、レチノール結合血漿タンパク
質前駆体、ガングリオシドGM2、カルグラヌリンB及びサポシンBの賦活物質
前駆体の中から選ばれた同じタンパク質系統群に属するペプチド配列又はそのフ
ラグメントに対応しているタンパク質の中から選択されている、使用。 - 【請求項52】 多発性硬化症といったような変性疾患及び/又は神経疾患
及び/又は自己免疫疾患の治療を目的とする薬学組成物の調製のための、1つの
タンパク質の少なくとも1つのフラグメントを含んで成る少なくとも1つのポリ
ペプチドの使用において、前記タンパク質は、未変性状態でのそのペプチド配列
が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号
6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列
番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番
号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号
22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号2
7、配列番号28及び配列番号29、及びペプチド配列配列番号1-配列番号2
9のいずれか1つと少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%そして有利
には少なくとも98%の同一性を呈するペプチド配列、及び、ペルルカン、レチ
ノール結合血漿タンパク質前駆体、ガングリオシドGM2、カルグラヌリン及び
サポシンの賦活物質前駆体の中から選ばれた同じタンパク質系統群に属するペプ
チド配列又はそのフラグメントに対応しているタンパク質の中から選択されてい
る、使用。 - 【請求項53】 ポリペプチドが配列番号2、4、8、9、17、24の中
から選択されていることを特徴とする請求項51又は52に記載の使用。 - 【請求項54】 変性疾患及び/又は神経疾患及び/又は自己免疫疾患に付
随する病的状態のための治療剤の効能をテストすることを目的とする、少なくと
も1つのヌクレオチドフラグメントの使用において、前記ヌクレオチドフラグメ
ントが、タンパク質の少なくとも1つのフラグメントについてコードするフラグ
メント〔前記タンパク質は、未変性状態でのそのペプチド配列が、配列番号1、
配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、
配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番
号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号
18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号2
3、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28
及び配列番号29、ペプチド配列配列番号1-配列番号29のいずれか1つと少
なくとも70%、好ましくは少なくとも80%そして有利には少なくとも98%
の同一性を呈するペプチド配列の中から選択される〕、及び前記フラグメントの
相補的フラグメント及びペルルカン、レチノール結合血漿タンパク質前駆体、ガ
ングリオシドGM2、カルグラヌリンB及びサポシンBの賦活物質前駆体の中か
ら選ばれた同じタンパク質系統群に属するペプチド配列又はそのフラグメントに
ついてコードするフラグメントに対応しているタンパク質の中から選択されてい
る、使用。 - 【請求項55】 組換え型タンパク質及び/又は請求項54に記載のヌクレ
オチドフラグメントの全部又は一部によってコードされるタンパク質の、変性疾
患及び/又は神経疾患及び/又は自己免疫疾患に付随する病的状態のための治療
剤の効能をテストすることを目的とする使用。 - 【請求項56】 多発性硬化症といったような変性疾患及び/又は神経疾患
及び/又は自己免疫疾患の治療を目的とする薬学組成物の調製のための少なくと
も1つのヌクレオチドフラグメントの使用において、前記ヌクレオチドフラグメ
ントが、1つのタンパク質の少なくとも1つのフラグメントについてコードする
フラグメント〔前記タンパク質は、未変性状態でのそのペプチド配列が、配列番
号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番
号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、
配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配
列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列
番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番
号28及び配列番号29、ペプチド配列配列番号1-番号29のいずれか1つと
少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%そして有利には少なくとも98
%の同一性を呈するペプチド配列の中から選択される〕、及び、前記フラグメン
トの相補的フラグメント及びペルルカン、レチノール結合血漿タンパク質前駆体
、ガングリオシドGM2、カルグラヌリンB及びサポシンBの賦活物質前駆体の
中から選ばれた同じタンパク質系統群に属するペプチド配列又はそのフラグメン
トについてコードするフラグメントに対応しているタンパク質の中から選択され
ている、使用。 - 【請求項57】 組換え型タンパク質及び/又は請求項56に記載のヌクレ
オチドフラグメントの全部又は一部によりコードされるタンパク質の、多発性硬
化症といったような変性疾患及び/又は神経疾患及び/又は自己免疫疾患の治療
を目的とする薬学組成物の調製のための使用。 - 【請求項58】 前記ヌクレオチドフラグメントが前記タンパク質について
コードすることを特徴とする請求項54又は56に記載の使用。 - 【請求項59】 未変性状態での前記タンパク質のペプチド配列が、配列番
号1-29のいずれか1つの中から選択された1つの配列、ペプチド配列配列番
号1-配列番号29のいずれか1つと少なくとも70%、好ましくは少なくとも
80%そして有利には少なくとも98%の同一性を呈するペプチド配列、及び、
ペルルカン、レチノール結合血漿タンパク質前駆体、ガングリオシドGM2、カ
ルグラヌリンB及びサポシンBの賦活物質前駆体の中から選ばれた同じタンパク
質系統群に属するペプチド配列又はそのフラグメントで構成されていることを特
徴とする請求項58に記載の使用。 - 【請求項60】 ポリペプチドが配列番号2、4、8、9、17、24の中
から選択されることを特徴とする請求項59に記載の使用。 - 【請求項61】 変性疾患及び/又は神経疾患及び/又は自己免疫疾患に付
随する病的状態のための治療剤の効能をテストする目的での、少なくとも1つの
ヌクレオチドフラグメントの使用において、前記フラグメントが、配列番号30
、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、
配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配
列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列
番号46及び配列番号47、配列番号48、配列番号49及び配列番号50、配
列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列
番号56、配列番号57、配列番号66、配列番号67、配列番号69、配列番
号70及び配列番号71のうちのいずれか1つ及びその相補的配列から選ばれた
核酸配列のフラグメントである、使用。 - 【請求項62】 多発性硬化症といったような変性疾患及び/又は神経疾患
及び/又は自己免疫疾患の治療を目的とする薬学的組成物の調製のための、少な
くとも1つのヌクレオチドフラグメントの使用において、前記フラグメントが、
配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配
列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列
番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番
号45、配列番号46及び配列番号47、配列番号48、配列番号49及び配列
番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番
号55、配列番号56、配列番号57、配列番号66、配列番号67、配列番号
69、配列番号70及び配列番号71のうちのいずれか1つ及びその相補的配列
から選ばれた核酸配列のフラグメントである、使用。 - 【請求項63】 核酸配列が配列番号30、31、42、53の中から選択
されていることを特徴とする請求項61又は62に記載の使用。 - 【請求項64】 変性疾患及び/又は神経疾患及び/又は自己免疫疾患の予
防及び/又は治療のための組成物の調製を目的とするリコリンの使用。
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