ES2311601T3 - Receptores acoplado a proteina que se une a trifosfato de guanosina place 6002312 y su gen y produccion y uso del mismo. - Google Patents

Receptores acoplado a proteina que se une a trifosfato de guanosina place 6002312 y su gen y produccion y uso del mismo. Download PDF

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Tomoyasu Sugiyama
Noriyuki Astellas Pharma Inc. MORIKAWA
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Tamaki Oda
Ryotaro Irie
Takao Isogai
Yasuhiko Masuho
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Abstract

Uso in vitro de un polipéptido codificado por un polinucleótido seleccionado de uno cualquiera de (a) hasta (d): (a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (b) un polinucleótido que comprende una región codificadora de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1; (c) un polinucleótido que se hibrida a un ADN que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 en una condición restrictiva; (d) un polinucleótido que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; como receptor que se fija a histamina.

Description

Receptor acoplado a proteína que se une a trifosfato de guanosina place 6002312 y su gen y producción y uso del mismo.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un nuevo polipéptido que pertenece a la familia de los receptores acoplados a proteína G, a un polinucleótido que codifica el polipéptido, y a la producción y uso de estas moléculas.
Técnica anterior
En muchos procesos biológicos con importancia médica intervienen proteínas y/o segundos mensajeros (por ejemplo, es bien conocido que en tales procesos interviene cAMP; Lefkowitz, Nature 1991, 351: 353-354), que están implicados en rutas de señalización en las cuales participan proteínas G (en lo sucesivo se denominará a estas proteínas "proteínas asociadas con proteínas G o con las rutas que implican proteínas G"). Tales proteínas incluyen, por ejemplo, receptores acoplados a proteína G para agentes adrenérgicos y dopamina (Kobilka, B. K. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84: 46-50; 1987, Kobilka, B. K. y otros, Science, 1987, 238: 650-656; Bunzow, J. R. y otros, Nature, 1988, 336: 783-787); las mismas proteínas G; proteínas de efector (por ejemplo fosfolipasa C, adenilato-ciclasa, y fosfodiesterasa); y proteínas de actuador (por ejemplo proteína-cinasa A y proteína-cinasa C; Simon, M. I. y otros, Science, 1991, 252: 802-8).
Por ejemplo, la señalización se puede iniciar cuando una hormona se fija a adenilato-ciclasa en una célula para activar la enzima. La activación enzimática mediada por hormona depende del nucleótido GTP. El GTP influye también en la fijación de la hormona. La proteína G liga un receptor hormonal a adenilato-ciclasa. Cuando ha sido activada por el receptor hormonal, la proteína G libera el GDP fijado, y después se fija a GTP. La forma fijada de GTP se fija posteriormente a adenilato-ciclasa activada. La hidrólisis de GTP a GDP está catalizada por la proteína G misma, y así la proteína G vuelve a su estado inactivo basal. Así, la proteína G desempeña dos funciones; una de ellas es servir como intermedio que transmite una señal desde un receptor hasta un efector, y la otra es ser un reloj para regular la duración de la señal.
Los miembros de la superfamilia génica de proteínas membránicas de receptores acoplados a proteína G se caracterizan por contener siete dominios transmembranales putativos. Se cree que estos dominios corresponden a \alpha-hélices transmembranales conectadas entre sí a través de bucles extracelulares y bucles citoplasmáticos. Los receptores acoplados a proteína G incluyen muchos receptores biológicamente activos, tales como receptores hormonales, receptores víricos, receptores de factor de crecimiento, y receptores neuronales.
Los receptores acoplados a proteína G (también denominados "receptores hepta-transmembranales") se caracterizan por contener siete regiones hidrófobas conservadas que constan de aproximadamente 20 a 30 aminoácidos, que se enlazan a al menos ocho bucles hidrófilos diferentes. La familia de receptores acoplados a proteína G incluye receptores dopamínicos que se fijan a agentes neurolépticos empleados para el tratamiento de trastornos mentales y neuropatías. Otros miembros ilustrativos de esta familia incluyen, pero sin estar limitados a éstos, receptores de calcitonina, adrenalina, endotelina, cAMP, adenosina, muscarina, acetilcolina, serotonina, histamina, trombina, cinina, folitropina, opsina, gen 1 de diferenciación celular endotelial, rodopsina, odorante, y citomegalovirus.
La mayoría de los receptores acoplados a proteína G poseen un resto de cisteína conservado en cada uno de los dos primeros bucles extracelulares. Estos restos de cisteína forman enlaces disulfuro de los que se espera que estabilicen estructuras proteicas funcionales. Las siete regiones transmembranales se denominan TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6, y TM7. TM3 participa en la transducción de señales.
La fosforilación y la lipidación (palmitoilación o farnesilación) de los restos cisteínicos puede influir en la señalización de eventos en los que intervengan algunos receptores acoplados a proteína G. La mayoría de los receptores acoplados a proteína G contienen sitios de fosforilación dentro del tercer bucle citoplasmático y/o el extremo carboxílico. Algunos receptores acoplados a proteína G, tales como el receptor \beta-adrenalínico, intervienen en la desensibilización de receptores a través de fosforilación por proteina-cinasa A y/o una cinasa de receptor específica.
Los sitios de fijación de ligando en algunos receptores acoplados a proteína G comprenden una oquedad hidrófila formada por varios dominios transmembranales de receptor acoplado a proteína G. Se ha imaginado que esta oquedad está rodeada por restos hidrófobos de un receptor acoplado a proteína G. Se ha supuesto que las superficies hidrófilas de cada una de las hélices transmembranales del receptor acoplado a proteína G están orientadas hacia el interior, y forman así un sitio fijador de ligandos polares. TM3 tiene un sitio fijador de ligando tal como el resto de aspartato de TM3, y participa por tanto en la fijación a ligando de algunos receptores acoplados a proteína G. La serina de TM5, la asparagina de TM6, y la fenilalanina o la tirosina de TM6 o de TM7 participan también en la fijación a
ligando.
Los receptores acoplados a proteína G pueden fijarse a diversas enzimas intracelulares, canales de iones y transportadores, a través de una proteína G heterotrimérica de las células (véase Johnson y otros, Endoc. Rev., 1989, 10: 317-331). La subunidad \alpha de cada proteína G estimula de manera preferente efectores particulares, y modifica así diversas funciones biológicas intracelulares. Se ha identificado a la fosforilación de restos intracelulares de receptores acoplados a proteína G como un importante mecanismo para la regulación de la copulación de algunos receptores acoplados a proteína G con proteínas G. Se han encontrado receptores acoplados a proteína G en una amplia variedad de tejidos en sujetos mamíferos.
El 90% o más de los agentes farmacéuticos creados hasta la fecha en el mundo por los fabricantes farmacéuticos están dirigidos hacia interacciones extracelulares. La mayoría de dichos agentes farmacéuticos están dirigidos hacia receptores acoplados a proteína G, y han sido comercializados con éxito. Este hecho demuestra que estos receptores poseen un historial de dianas terapéuticas reconocidas y comprobadas.
Uno de los receptores acoplados a proteína G que han atraído la atención son los receptores de histamina. La histamina, que está contenida en mastocitos de todos los tejidos periféricos, es un mediador importante asociado con la inflamación, la inmunidad y la alergia. La histamina desempeña también una función importante en la secreción de ácido gástrico por parte de la membrana mucosa gástrica. En el cerebro, la histamina está distribuida en neuronas y células no neurales. Existe un número limitado de neuroplasmas positivos respecto a histamina en el lóbulo posterior del hipotálamo, pero se proyectan hacia casi todas las regiones del cerebro, entre ellas la médula espinal y la corteza cerebral. Se ha pensado que la histamina participa en funciones nerviosas centrales, tales como la reacción de activación, la conducta sexual, y la analgesia. Se ha pensado que en estas actividades fisiológicas de la histamina intervienen tres tipos de receptores específicos, que se denominan respectivamente H1, H2, y H3 (Pharmacol. Rev. (1997) 49: 253). Además, se ha informado recientemente de la existencia de H4 (J. Biol. Chem. (2000) 275: 36781).
El receptor H1 (número de acceso GenBank D14436) está expresado en el cerebro, músculos de las vías respiratorias, órganos gastrointestinales y digestivos, aparato urogenital, órganos circulatorios, médula adrenal, células endoteliales, linfocitos, etc. Los estudios sobre el receptor H1 se han centrado en el receptor H1 presente en los vasos sanguíneos y los músculos lisos. La histamina induce la contracción del músculo liso. Se ha pensado que esta acción va acompañada de un incremento, inducido por la histamina, de la concentración intracelular de Ca, en la cual interviene el 1,4,5-trifosfato de inositol (Eur. J. Pharmacol. (1987) 135: 69). En las células endoteliales vasculares, la histamina induce: (1) un cambio en la permeabilidad vascular como consecuencia de la contracción de células endoteliales; (2) la biosíntesis de prostaciclina; (3) la producción de factor activante de plaquetas (PAF); (4) la liberación de factor de von Willebrand (VWF); y (5) la síntesis de óxido nítrico (NO). Se ha demostrado que el receptor H1 está presente en linfocitos T (Gen. Pharmacol. (1996) 27: 289). Además, se ha publicado que la función fisiológica del receptor H1 incluye la liberación de catecolamina en la médula adrenal (Biochem. Pharmacol. (1988) 37: 221); la supresión del latido cardíaco en el músculo cardíaco (J. Pharmacol. Exp. Ther. (1990) 1: 71); y funciones en el sistema nervioso central (Agents Actions (1990) 30: 13). El receptor H1 actúa para incrementar las concentraciones de fosfato de inositol e ion calcio intracelulares, mediadas por proteínas G que pertenecen a la familia Gq/11 insensibles a la toxina tosferínica (Br. J. Pharmacol. (1994) 112: 847).
Se ha publicado que el receptor H2 (número de acceso GenBank AB023486) está expresado a niveles elevados en los núcleos basales, el núcleo amigdalino, y la corteza cerebral en el cerebro, y está expresado a bajos niveles en el cerebelo y el hipotálamo (J. Neurochem. (1992) 59: 290). El receptor H2 está expresado también en el estómago y en el corazón. Un estudio que empleaba un antagonista específico para receptor H2 reveló que, en el estómago, el receptor H2 desempeña una importante función en la secreción de ácido gástrico (Br. J. Pharmacol. (1985) 86: 571). Se ha publicado que, en el corazón, la actividad de histamina mediada por receptor H2 origina acciones cronotrópicas e inotrópicas en la aurícula y en el ventrículo (J. Pharmacol. Exp. Ther. (1988) 246: 377). Además, se sabe que el receptor H2 participa en la relajación del músculo liso en las vías respiratorias, el útero, y el músculo liso vascular (Br. J. Clin. Pharmacol. (1989) 27: 139) y en la función del sistema inmunitario (Pharmacol. Rev. (1990) 42: 45). Se ha descrito que esta señalización intracelular mediada por el receptor H2 implica la acumulación de cAMP y el incremento de la actividad de la adenilil-ciclasa (Br. J. Clin. Pharmacol. (1987) 91: 213).
El receptor H3 está localizado originalmente en neuronas que contienen histamina, y se ha sugerido que existe como un receptor presináptico que controla la producción y liberación de histamina (Nature (1983) 302: 832). En el cerebro de los mamíferos, las neuronas que contienen histamina se proyectan hacia toda la región cortical cerebral, y por tanto se ha presumido que el receptor H3 desempeña un papel importante en la función cerebral (Trends Pharmacol. Sci. (1998) 19: 177). Además, el receptor H3 no sólo participa en la liberación de histamina, sino que también regula, en la pre-sinapsis, la liberación de diversos neurotransmisores, tales como acetilcolina, dopamina, ácido \gamma-aminobutírico, ácido glutámico, noradrenalina, y serotonina. Además, el receptor H3 está implicado en la neurotransmisión periférica en el sistema digestivo, el sistema cardiovascular, y las vías respiratorias (Pharmacol. Rev. (1997) 49: 253). El gen del receptor H3 (número de accesión GenBank NM007232) fue identificado en 1999 (Mol. Pharmacol. (1999) 55: 1101). Aunque las homologías globales de este receptor con respecto a los receptores H1 y H2 son sólo de aproximadamente 22% y 20%, las homologías regionales en la región transmembranal son 27% y 33%, respectivamente (Trends Pharmacol. Sci. (2000) 21: 11). Se ha sugerido que existen dos subtipos, H3a y H3b, de receptor H3, con propiedades experimentalmente diferentes (Mol. Pharmacol. (1990) 38: 610). Además, un informe anterior sugiere que en los eosinófilos está presente otro receptor, cuyas propiedades son diferentes de las de los tres receptores de histamina antes descritos, y que interacciona con agonistas específicos para receptor H3 (Am. J. Respir. Crit. Care. Med. (1994) 149: 1506).
El receptor H4 tiene aproximadamente un 30% de homología con el receptor H3 al nivel de aminoácido. Sin embargo, el perfil de expresión del receptor H4 difiere del perfil del receptor H3. Se ha publicado que el receptor H4 es indetectable en el cerebro, pero está expresado en linfocitos de la sangre periférica, el bazo, el timo, y el intestino delgado (J. Biol. Chem. (2000) 275: 36781).
Descripción de la invención
Existe una clara necesidad de identificar y caracterizar un nuevo receptor como diana para la prevención, mejora y tratamiento de trastornos funcionales o enfermedades que incluyen la infección, por ejemplo la infección bacteriana, infección fúngica, protozoiasis, y la infección vírica, con inclusión de la infección por HIV-1 o HIV-2 en particular, el dolor, cáncer, diabetes, obesidad, pérdida de apetito, hiperfagia, asma, enfermedad de Parkinson, insuficiencia cardíaca aguda, hipotensión, hipertensión, retención de orina, osteoporosis, estenocardia, infarto de miocardio, úlcera, alergia, hipertrofia prostática benigna, y trastornos mentales y neurológicos, entre ellos ansiedad, esquizofrenia, psicosis maníaco-depresiva, delirio, demencia, deficiencias mentales graves, tales como la enfermedad de Huntington o el síndrome de Gilles de la Tourette, y discinesia. La presente invención proporciona tal receptor. La presente invención proporciona en particular un nuevo receptor acoplado a proteína G, fijador de histamina, su gen, un método para producirlos, y sus usos.
Los autores de la presente invención han preparado una biblioteca de cADN de longitud completa a partir de ARN total placentario humano, empleando el método de oligo-rematamiento, y han analizado las estructuras de clones contenidos en la biblioteca de cADN. Como consecuencia, los autores de la invención han hallado que un clon con la referencia PLACE6002312 contenía dominios hidrófobos que se supone son siete dominios transmembranales característicos de receptores acoplados a proteína G. Además, la estructura de PLACE6002312 contenía algunos restos de aminoácido característicos de receptor acoplado a proteína G cuyo ligando es monoamina o histamina, entre ellos el ácido aspártico situado inmediatamente después del primer dominio transmembranal, la secuencia DRY (o ERY) situada inmediatamente después del tercer dominio transmembranal, el triptófano en el cuarto dominio transmembranal, la cisteína entre el cuarto y el quinto dominio transmembranal, y la secuencia WXP en el sexto dominio transmembranal. Estos hechos revelan que PLACE6002312 codifica un receptor acoplado a proteína G, tal como se ha divulgado con anterioridad en la Solicitud de Patente Mundial WO 02/10387. Según las búsquedas en las bases de datos, PLACE6002312 tiene la mayor homología con el receptor H2 de histamina. Los análisis de la distribución de la expresión del gen PLACE 6002312 en tejidos humanos ha revelado que el gen está expresado en diversos tejidos, tales como el corazón, hígado y ovario. Además, un ensayo de fijación de ligando ha revelado que la histamina es uno de los ligandos de PLACE6002312. Empleando el sistema de ensayo de fijación de ligando, se puede realizar un escrutinio en búsqueda de antagonistas y agonistas de PLACE6002312 que puedan ser empleados como agentes farmacéuticos. Además, como se ha hallado que PLACE6002312 se fija a histamina, se puede utilizar para purificar histamina.
Además, los autores de la presente invención han aislado un cADN de longitud completa homólogo murino de PLACE6002312, y han hallado que la secuencia de aminoácidos deducida de su marco abierto de lectura comprende dominios hidrófobos que se supone son siete dominios transmembranales característicos de receptores acoplados a proteína G.
Se ha predicho que PLACE6002312 desempeña importantes funciones in vivo, y así las mutaciones en este gen y la expresión anormal de este gen pueden originar diversas enfermedades. Estas enfermedades incluyen, por ejemplo, la infección, por ejemplo la infección bacteriana, infección fúngica, protozoiasis, y la infección vírica, con inclusión de la infección por HIV-1 o HIV-2 en particular, el dolor, cáncer, diabetes, obesidad, pérdida de apetito, hiperfagia, asma, enfermedad de Parkinson, insuficiencia cardíaca aguda, hipotensión, hipertensión, retención de orina, osteoporosis, estenocardia, infarto de miocardio, úlcera, alergia, hipertrofia prostática benigna, y trastornos mentales y neurológicos, entre ellos ansiedad, esquizofrenia, psicosis maníaco-depresiva, delirio, demencia, deficiencias mentales graves, tales como la enfermedad de Huntington o el síndrome de Gilles de la Tourette, y discinesia. Se puede emplear la actividad o el nivel de expresión inadecuados de PLACE6002312 como importantes indicadores para el diagnóstico de dichas enfermedades.
La presente invención se refiere a un nuevo receptor acoplado a proteína G que se fija a histamina, a su gen, a un método para producirlos, y a sus usos. Más específicamente, se proveen los siguientes (1) a (22):
(1) Un polinucleótido codificador de receptor acoplado a proteína G que fija trifosfato de guanosina - seleccionado de uno cualquiera de (a) hasta (d):
(a)
un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 20;
(b)
un polinucleótido que comprende una región codificadora de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 ó 19;
(c)
un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 20 en donde han sido sustituidos, eliminados, añadidos y/o insertados uno o más aminoácidos; y
(d)
un polinucleótido que se hibrida a un ADN que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 ó 19 en una condición restrictiva.
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(2) Un polinucleótido que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 20.
(3) El polinucleótido según (1) o (2), en donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad fijadora de histamina.
(4) Un vector que contiene el polinucleótido según uno cualquiera de (1) a (3).
(5) Una célula anfitrión que porta el polinucleótido según uno cualquiera de (1) a (3) o el vector según (4).
(6) Un polipéptido codificado por el polinucleótido de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (3).
(7) Un método para producir el polipéptido según (6), que comprende los pasos de cultivar la célula anfitrión según (5) y recuperar el polipéptido producido a partir del sobrenadante de cultivo de la célula anfitrión.
(8) Un método para preparar una célula que produce el polipéptido según (6), que comprende el paso de transformar una célula anfitrión con el vector según (4) para permitir que la célula anfitrión produzca el polipéptido según (6) en un estado de cultivo adecuado.
(9) La célula anfitrión según (5) que expresa el polipéptido según (6) sobre la superficie celular, o la membrana celular de la misma.
(10) Un anticuerpo que se fija al polipéptido según (6).
(11) Un método para identificar un ligando para el polipéptido según (6), que comprende los pasos de:
(a)
poner en contacto el polipéptido según (6) con un compuesto candidato; y
(b)
determinar si el compuesto candidato se fija o no se fija al polipéptido según (6).
(12) Un método para identificar un agonista del polipéptido según (6), que comprende los pasos de:
(a)
poner en contacto una célula que expresa el polipéptido según (6) con un compuesto candidato; y
(b)
determinar si el compuesto candidato induce o no induce la generación de una señal que pueda ser usada como un indicador para la activación del polipéptido según (6).
(13) Un método para identificar un antagonista del polipéptido según (6), que comprende los pasos de:
(a)
poner en contacto un agonista del polipéptido según (6) con una célula que expresa el polipéptido según (6) en presencia de un compuesto candidato; y
(b)
determinar si una señal como indicador de la activación del polipéptido según (6) es o no atenuada en comparación con el caso en que está ausente el compuesto candidato.
(14) Un ligando identificado por el método según (11).
(15) Un agonista identificado por el método según (12).
(16) Un antagonista identificado por el método según (13).
(17) Un "kit" o conjunto para ser empleado en los métodos según uno cualquiera de (11) a (13), que comprende al menos una molécula seleccionada de (a) hasta (c):
(a)
el polipéptido según (6);
(b)
la célula anfitrión según (9) o la membrana celular de la célula; y
(c)
el anticuerpo según (10).
(18) Una composición farmacéutica para ser empleada en el tratamiento de un paciente que necesita actividad incrementada o un nivel incrementado de expresión del polipéptido según (6), en donde dicha composición comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula seleccionada de (a) y (b):
(a)
un agonista del polipéptido según (6); y
(b)
el polinucleótido según uno cualquiera de (1) a (3), que está en una forma que asegura la expresión in vivo.
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(19) Una composición farmacéutica para ser empleada en el tratamiento de un paciente que necesita actividad disminuida o un nivel disminuido de expresión del polipéptido según (6), que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula seleccionada de (a) y (b):
(a)
un antagonista del polipéptido según (6); y
(b)
un polinucleótido que suprime la expresión endógena in vivo de un gen que codifica el polipéptido según (6).
(20) Un método para diagnosticar una enfermedad que está asociada con la expresión de un gen que codifica el polipéptido según (6) o la actividad de dicho polipéptido, que comprende el paso de:
(a)
detectar mutaciones en un gene que codifica el polipéptido según (6) en el genoma de un sujeto empleando una muestra obtenida del sujeto; o bien
(b)
detectar la expresión de un gen que codifica el polipéptido según (6) empleando la muestra obtenida del sujeto.
(21) Un "kit" para ser empleado en el método según (20), que comprende al menos una molécula seleccionada de (a) hasta (c):
(a)
el polinucleótido según (1) ó (2);
(b)
el polipéptido según (6); y
(c)
el anticuerpo según (10).
(22) Una composición para ser empleada para inducir una respuesta inmunitaria hacia el polipéptido según (6) en mamíferos, que comprende una molécula seleccionada de (a) y (b):
(a)
el polinucleótido según (1) ó (2); y
(b)
el polipéptido según (6).
A continuación se definen diversos términos para ilustrar claramente la presente invención. Sin embargo, las definiciones que se describen a continuación se ofrecen para ayudar a la comprensión de términos empleados con frecuencia en la presente memoria, pero no se utilizan para limitar la presente invención.
Tal como se emplea en la presente memoria, el término "PLACE6002312" se refiere típicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 20, o un mutante alélico del polipéptido.
Las frases "actividad de receptor" y "actividad biológica de un receptor" se refieren a una función metabólica o fisiológica de PLACE6002312, con inclusión de actividades similares, actividad intensificada, y aquellas actividades que acompañan a efectos secundarios indeseados disminuidos. Además, estas frases se refieren también a actividades antigénicas y a actividades inmunogénicas del PLACE6002312 antes descrito.
La expresión "gen de PLACE6002312" se refiere a un polinucleótido que tiene la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 ó 19, o un mutante alélico del polinucleótido, y/o la cadena complementaria del mismo.
El término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos policlonales y monoclonales, a anticuerpos quiméricos, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos humanizados, y a un fragmento Fab o Fab que contiene otro producto procedente de una biblioteca de expresión de inmunoglobulina.
El término "aislado" se refiere a "modificado artificialmente desde el estado natural". Si una composición o sustancia "aislada" existe en la naturaleza, debe ser diferente y/o transferida desde el entorno donde exista originalmente. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido naturalmente presente en un organismo animal vivo no está "aislado". Cuando se separa un polinucleótido o polipéptido de sustancias con las que coexiste en el estado natural, se puede decir que está "aislado" en el sentido en que se emplea en la presente memoria.
El término "polinucleótido" se refiere típicamente a cualquier polirribonucleótido o polideoxirribonucleótido, que puede ser un ARN o ADN sin modificar, o bien ARN o ADN modificado. El término "polinucleótido" incluye, pero sin quedar limitado a ello, un ADN monocatenario y bicatenario; un ADN que comprende regiones monocatenarias y regiones bicatenarias; un ARN monocatenario y bicatenario; un ARN que comprende regiones monocatenarias y regiones bicatenarias; una molécula híbrida que comprende ADN y ARN (que puede ser monocatenaria, más típicamente bicatenaria, o bien puede comprender regiones monocatenarias y regiones bicatenarias). Además, el término "polinucleótido" se refiere también a una región tricatenaria que puede comprender tanto ARN como ADN, o ambos. El término "polinucleótido" incluye también ADN o ARN que contiene uno o más nucleótidos modificados, y ADN o ARN que contienen un esqueleto modificado con vistas a su estabilización u por otra razón. Tales nucleótidos "modificados" incluyen, por ejemplo, nucleótidos tritilados y nucleótidos especiales tales como inosina. Existen diversas técnicas de modificación ya establecidas para modificar ADN y ARN. Así, el "polinucleótido" incluye diversas formas obtenidas mediante la modificación química, enzimática, o metabólica de un polinucleótido presente en la naturaleza, y formas químicamente modificadas de ADN y ARN característicos de virus y células. El término "polinucleótido" incluye también polinucleótidos relativamente cortos, que a menudo se denominan "oligonucleótidos".
El término "polipéptido" se refiere a cualquier péptido o proteína que comprenda dos o más aminoácidos unidos entre sí por medio de un enlace peptídico o un enlace peptídico modificado (concretamente isósteros peptídicos). El término "polipéptido" se refiere tanto a polipéptidos de cadena corta (típicamente denominados péptidos, oligopéptidos, u oligómeros) y polipéptidos de cadena larga (denominados generalmente proteínas). Un polipéptido puede contener aminoácidos distintos de los 20 tipos de aminoácidos codificados por los receptores. El término "polipéptido" puede incluir secuencias aminoacídicas modificadas a través de un proceso natural, por ejemplo una elaboración post-traduccional, o un método químico de modificación conocido en la técnica. Tales modificaciones se describen con detalle en libros de texto básicos, artículos científicos más detallados, y artículos de investigación. Se puede modificar un polipéptido en cualquier parte del mismo, entre ellas el esqueleto peptídico, cadenas laterales de aminoácidos, y extremos amino y carboxilo. Se puede efectuar la misma modificación en varios lugares, en un grado comparable o con grados diversos. Como alternativa, se puede someter a un polipéptido a diversas modificaciones.
Un polipéptido puede estar ramificado como consecuencia de la ubicuitinación, o bien se puede tratar de un anillo ramificado o no ramificado. Se puede producir un polipéptido cíclico, ramificado, o cíclico ramificado en un proceso pos-traduccional espontáneo, o bien mediante un método sintético. Los ejemplos de modificaciones de polipéptidos incluyen la acetilación; acilación; ribosilación de ADP; amidación; unión covalente con flavina; unión covalente con restos heme; unión covalente con nucleótidos o derivados de nucleótidos; unión covalente con lípidos o derivados de lípidos; unión covalente con fosfatidilinositoles; reticulación; ciclización; formación de enlace disulfuro; desmetilación; formación de reticulación covalente; formación de cistina; formación de piroglutamato; formilación; \gamma-carboxilación; glicosilación; formación de anclajes GPI; hidroxilación; yodación; metilación; miristoilación; oxidación; tratamiento proteolítico; fosforilación; prenilación; racemización; selenoilación; sulfación; y adición de aminoácidos mediada por ARN a una proteína, por ejemplo arginilación; ubicuitinación. Véase, por ejemplo, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2ª edición, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, páginas 1-12 en POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICACIÓN OF PROTEINS (compilado por B. C. Johnson), Academic Press, New York, 1983; Seifter y otros, "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182: 626-646; y Rattan y otros, "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663: 48-62.
El término "mutante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere del polinucleótido o polipéptido estándar, pero mantiene las características esenciales. Un mutante típico de un polinucleótido difiere del polinucleótido estándar en la secuencia nucleotídica. Estas variaciones en la secuencia nucleotídica mutante pueden cambiar o no la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por el polinucleótido estándar. Como se describirá más adelante, las alteraciones nucleotídicas pueden dar como resultado la sustitución de aminoácidos, adición, deleción, fusión, y la escisión terminal (truncamiento) en el polipéptido codificado por la secuencia estándar. Un polipéptido mutante típico difiere de su polipéptido estándar en la secuencia de aminoácidos. En general, estas diferencias son limitadas, de manera que la secuencia mutante es muy similar a la secuencia polipeptídica estándar en su conjunto, y muchas regiones de las dos secuencias casan entre sí. Un mutante puede diferir del polipéptido estándar en la secuencia de aminoácidos por substitución de aminoácidos, adición, deleción, o una combinación de dos o más de éstas. Un resto de aminoácido a sustituir o insertar puede estar codificado o no por un código genético. Un mutante polinucleotídico o polipeptídico puede ser un mutante espontáneo, por ejemplo los mutantes alélicos, o bien un mutante que no se encuentre en la naturaleza. Un mutante no espontáneo de un polinucleótido o polipéptido se puede preparar por mutagénesis o bien se puede sintetizar directamente.
El término "identidad" se refiere a la medida de la de identidad de secuencia nucleotídica o a la identidad de secuencia de aminoácidos. En general, se alinean juntas varias secuencias de manera que casen de la manera máxima (o sean iguales) entre sí. El término "identidad" en sí tiene el significado reconocido en la técnica, y se puede determinar empleando una técnica ya establecida. Véase, por ejemplo, COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, compilado por Lesk, A. M., Oxford University Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, compilado por Smith, D. W., Academic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, compilado por Griffin, A. M. y Griffin, H. G., Humana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, compilado por Gribskov, M. y Devereux, J., M Stockton Press, New York, 1991. Hay muchos métodos para determinar la identidad entre dos polinucleótidos o polipéptidos. El término "identidad" es conocido para los especialistas en la técnica (Carillo, H. y Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48: 1073).
Los métodos que se emplean extensamente para determinar la identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, pero sin estar limitados a éstos, los métodos según la Guide to Huge Computers, compilada por Martin J. Bishop, Academic Press, San Diego, 1994; y Carillo, H. y Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48: 1073. Estos métodos para determinar la identidad y similitud están integrados en algunos programas de ordenador. Los programas de ordenador empleados con preferencia para determinar la identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, pero sin quedar limitados a éstos, el paquete de programas GCS (Devereux, J. y otros, Nucleic Acids Research (1984) 12 (1): 387), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul, S. F. y otros, J. Mol. Biol. (1990) 215: 403).
Por ejemplo, la frase "un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica que tenga, por ejemplo, al menos 95% de "identidad" con la secuencia nucleotídica estándar de SEQ ID NO: 1 o 19" significa que la secuencia nucleotídica del polinucleótido es idéntica a la secuencia nucleotídica estándar de SEQ ID NO: 1 ó 19, salvo en que la secuencia nucleotídica puede contener un máximo de cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia estándar. En otras palabras, se puede preparar un polinucleótido que comprenda una secuencia nucleotídica que sea idéntica en al menos 95% a la secuencia nucleotídica estándar, eliminando hasta 5% de los nucleótidos de la secuencia estándar, reemplazando hasta 5% de los nucleótidos por otros nucleótidos, o insertando, en la secuencia estándar, nucleótidos que correspondan hasta 5% de todos los nucleótidos de la secuencia estándar. Estas mutaciones en la secuencia estándar pueden estar situadas en el extremo 5' o 3' de la secuencia nucleotídica estándar, o entre estos extremos, y se pueden realizar para cada uno de los nucleótidos en posiciones diferentes dentro de la secuencia nucleotídica estándar, o para uno o más grupos de restos consecutivos en la secuencia estándar.
De manera similar, la frase "un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene, por ejemplo, al menos 95% de "identidad" con respecto a la secuencia de aminoácidos estándar de SEQ ID NO: 2 o 20" significa que la secuencia polipeptídica es idéntica a la secuencia nucleotídica estándar de SEQ ID NO: 2 ó 20, salvo en que la secuencia del polipéptido puede contener un máximo de cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia estándar. En otras palabras, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos estándar se puede preparar eliminando hasta 5% de los restos de aminoácido de la secuencia estándar, sustituyendo hasta 5% de los restos de aminoácido por otros aminoácidos, o bien insertando, en la secuencia estándar, aminoácidos que correspondan hasta 5% de todos los restos de aminoácido de la secuencia estándar. Estas alteraciones de la secuencia estándar pueden estar situadas en el extremo amino o carboxílico de la secuencia de aminoácido estándar, o entre estos dos extremos, y pueden realizarse para cada aminoácido en diferentes posiciones dentro de la secuencia estándar o bien para uno o más grupos de restos consecutivos dentro de la secuencia estándar.
El término "ligando" se refiere a moléculas que se fijan a un polipéptido de los aquí descritos, e incluye ligandos naturales y ligandos sintéticos. El término "agonista" se refiere a moléculas que se fijan a un polipéptido de los aquí descritos y lo activan. Por otra parte, el término "antagonista" se refiere a moléculas que inhiben la activación de uno de los polipéptidos aquí descritos.
Polipéptido
Se proporciona un nuevo polipéptido que pertenece a la familia de receptores acoplados a proteína G. El polipéptido aquí descrito incluye un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 20 y un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 20. La proteína humana PLACE6002312 codificada por el cADN que tiene la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1, está relacionado estructuralmente con otras proteínas que pertenecen a la familia de receptores acoplados a proteína G. El cADN de la SEQ ID NO: 1 contiene el marco abierto de lectura (nucleótidos desde la posición 735 hasta la 1724) de SEQ ID NO: 2 que codifica el polipéptido consistente en 330 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, que consiste en 330 restos de aminoácidos, tiene una identidad de aproximadamente 27% (estimada mediante el programa BLAST) con la del receptor H2 de histamina humano (número de accesión GenBank P97292). Además, la, proteína homóloga PLACE6002312 de ratón codificada por el cADN que tiene la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 19, está relacionada estructuralmente con otras proteínas que pertenecen a la familia de receptores acoplados a proteína G. El cADN de SEQ ID NO: 19 contiene el marco abierto de lectura (nucleótidos de las posiciones 131 hasta 1120) que codifica el polipéptido compuesto por 329 aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 20.
Por tanto, se puede predecir que un polipéptido y un polinucleótido de los aquí descritos tendrán funciones biológicas y propiedades similares a las de los polipéptidos y polinucleótidos homólogos, y por ello la utilidad de un polipéptido y un polinucleótido de los aquí descritos es obvia para los especialistas en la técnica.
Los polipéptidos aquí descritos incluyen polipéptidos que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 87%, preferiblemente una identidad de al menos 90%, más preferiblemente una identidad de al menos 95% (por ejemplo, de 97% a 99%) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 20 en el conjunto de la secuencia. La identidad de la secuencia de aminoácidos se puede determinar, por ejemplo, con el algoritmo BLAST de Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993). Basándose en este algoritmo se ha desarrollado el programa BLASTX (Altschul y otros, J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). Cuando se analizan mediante BLASTX secuencias de aminoácidos, se fijan los parámetros, por ejemplo, como sigue: score = 50; y wordlength = 3. Cuando se utilizan para el análisis los programas BLAST y Gapped BLAST, se utilizan en cada programa los parámetros por defecto. Las técnicas específicas utilizadas en estos métodos de análisis ya son conocidas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.). Estos polipéptidos se pueden preparar a partir de un polinucleótido que comprenda una secuencia nucleotídica con elevada homología con respecto a la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 ó 19, que haya sido aislada utilizando la técnica de hibridación, la técnica de multiplicación génica, o la técnica de mutagénesis que se describirá más adelante.
Se prefiere que los polipéptidos aquí descritos presenten al menos una de las actividades biológicas del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 20. Dichas actividades biológicas incluyen actividades de receptor de receptores acoplados a proteína G, tales como la actividad de fijación de ligando, cambio del pH extracelular como consecuencia de la activación del receptor, cambio de la concentración intracelular de calcio, cambio de la concentración intracelular de cAMP, y cambio de la concentración de adenilato-ciclasa. Un ligando que se fija a un polipéptido aquí descrito incluye, por ejemplo, pero sin quedar limitado a éste, la histamina.
Los polipéptidos aquí descritos pueden encontrarse en forma de una proteína "madura", o bien pueden ser también parte de una proteína mayor, por ejemplo proteínas de fusión. Los polipéptidos aquí descritos pueden contener secuencias secretoras, en concreto secuencias líderes; prosecuencias; secuencias útiles para la purificación, por ejemplo múltiples restos de histidina; y secuencias aditivas con el propósito de asegurar la estabilidad durante la producción recombinante.
Fragmentos de polipéptido
También se proporcionan fragmentos de los polipéptidos aquí descritos. Estos fragmentos son polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que son parcialmente idénticas, pero no completamente idénticas, a las de los anteriores polipéptidos aquí descritos. De manera similar a los polipéptidos aquí descritos, los fragmentos pueden ser "autosuficientes" (pueden existir de manera independiente) o bien estar contenidos en un polipéptido mayor. Específicamente, un fragmento puede constituir una porción o región de un polipéptido mayor, muy preferiblemente una región consecutiva de un polipéptido mayor. Los ejemplos de fragmentos de polipéptido aquí descritos representativos son, en una aproximación grosera, fragmentos de aminoácidos en la posición 1 a 20, 21 a 40, 41 a 60, 61 a 80, y 81 a 100, y el fragmento que cubre los aminoácidos desde la posición 101 hasta el final del polipéptido. En este caso, una "estimación grosera" significa que se pueden añadir o eliminar un aminoácido, o dos, tres, cuatro, cinco, o varios aminoácidos en cualquiera de los extremos, o en ambos, de cada una de las regiones antes descritas.
Los ejemplos de fragmentos preferidos incluyen polipéptidos de truncamiento, que tienen secuencias de aminoácidos que carecen de una serie de restos de aminoácido que incluye o bien el extremo amino o bien el extremo carboxilo, o dos series de restos de aminoácido, una que incluye el extremo amino y otra que incluye el extremo carboxilo. Además, también son preferibles los fragmentos que se distinguen por características estructurales o funcionales, que incluyen los que tienen regiones de hélice \alpha y regiones formadoras de hélice \alpha, lámina \beta y regiones formadoras de lámina \beta, giros y regiones formadoras de giros, arrollamientos y regiones formadoras de arrollamientos, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones \alpha-anfipáticas, regiones \beta-anfipáticas, regiones variables, regiones formadoras de superficie, regiones fijadoras de sustrato, y regiones con elevado índice de antigenicidad. También se prefieren fragmentos biológicamente activos. Los fragmentos biológicamente activos intervienen en las actividades de los polipéptidos, y estos fragmentos incluyen aquellos que tienen actividades similares o mejoradas, o bien aquellos que tienen actividades indeseadas reducidas. Por ejemplo, se incluyen fragmentos que tienen la actividad de transducir señales a células a través de la fijación de un ligando, y además fragmentos que tienen antigenicidad o inmunogenicidad en animales, especialmente seres humanos.
Estos fragmentos de polipéptido conservan preferiblemente las actividades biológicas de los polipéptidos, actividades que incluyen la antigenicidad. También se proporcionan mutantes de secuencias específicas o fragmentos. Son mutantes preferidos aquellos que se diferencian del polipéptido original por el reemplazo con aminoácidos conservadores, en concreto, aquellos en los cuales el resto o los restos han sido reemplazados por otro u otros restos que tienen propiedades similares. Son reemplazos típicos los que se producen entre Ala, Val, Leu, y Ile; Ser y Thr; restos ácidos Asp y Glu, Asn, y Gln; restos básicos Lys y Arg; o restos aromáticos Phe y Tyr. Son mutantes particularmente preferibles aquellos en los cuales se han reemplazado, eliminado o añadido de 5 a 10, de 1 a 5, o de 1 a 2 aminoácidos, en cualquier combinación. Como posibilidad alternativa, también pueden ser útiles como inhibidores competitivos para los polipéptidos aquí descritos los fragmentos que se fijen a ligandos sin transducir señales al interior de las células. Los fragmentos aquí descritos comprenden 8 o más restos de aminoácido, preferiblemente 12 o más (por ejemplo, 15 o más) restos de aminoácido.
Los polipéptidos de la presente invención pueden producirse mediante cualquier método apropiado. Dichos polipéptidos incluyen polipéptidos presentes en la naturaleza, aislados, y polipéptidos que se producen mediante recombinación génica, síntesis, o por una combinación de ambos métodos. Los procedimientos para producir estos polipéptidos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar polipéptidos recombinantes transfiriendo un vector, en el cual esté insertado el polinucleótido aquí descrito, a una célula anfitriona apropiada, y purificando el polipéptido expresado dentro del transformante resultante. Por otra parte, se pueden preparar polipéptidos presentes en la naturaleza, por ejemplo, mediante el empleo de columnas de afinidad, en las cuales están inmovilizados anticuerpos contra el polipéptido aquí descrito (se describen más adelante) (Current Protocols in Molecular Biology, compilado por Ausubel y otros (1987), editorial John Wiley & Sons, secciones 16.1-16.19). Los anticuerpos para la purificación por afinidad pueden ser tanto anticuerpos policlonales como anticuerpos monoclonales. Los polipéptidos aquí descritos se pueden preparar también por el método de traducción in vitro (véase, por ejemplo, "On the fidelity of mRNA translation in the nuclease-treated rabbit reticulocyte lysate system." Dasso, M. C. y Jackson, R. J. (1989) NAR 17: 3129-3144 ), y otros.
Polinucleótidos
También se proporcionan polinucleótidos que codifican los polipéptidos aquí descritos. Los polinucleótidos de esta invención incluyen: aquellos que codifican polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 20; los que comprenden la región codificadora de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 ó 19; y los que comprenden secuencias nucleotídicas diferentes de las de SEQ ID NO: 1 ó 19 a causa de la degeneración del código genético pero que siguen codificando polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 20.
Además, los polinucleótidos aquí descritos incluyen los que comprenden secuencias nucleotídicas que tienen una identidad de al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, y aún más preferiblemente al menos 97% (por ejemplo, de 98% a 99%) con respecto a la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 ó 19 en toda su longitud. La identidad de las secuencias nucleotídicas se puede determinar, por ejemplo, por medio del algoritmo BLAST de Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877 (1993)). Basándose en este algoritmo se ha desarrollado otro algoritmo denominado BLASTN (Altschul y otros, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Cuando se analiza una secuencia nucleotídica mediante el programa BLASTN, se fijan los parámetros, por ejemplo, en score = 100 y wordlength = 12. Cuando se usan a la vez los programas BLAST y Gapped BLAST, se utilizan los parámetros por defecto de cada programa. Las técnicas específicas de estos métodos analíticos son bien conocidas en la técnica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.). Los polinucleótidos aquí descritos incluyen también polinucleótidos que tienen secuencias nucleotídicas complementarias a las de los polinucleótidos antes descritos.
Los polinucleótidos aquí descritos se pueden obtener, por ejemplo, de bibliotecas de cADN inducidas a partir de mARNs intracelulares (por ejemplo, derivados de células placentarias) a través de métodos de clonación y escrutinio estándares. Además, los polinucleótidos aquí descritos se pueden obtener de fuentes naturales, por ejemplo bibliotecas genómicas, y también se pueden sintetizar empleando técnicas comercialmente disponibles conocidas en la técnica.
Se pueden preparar polinucleótidos que comprenden secuencias nucleotídicas significativamente homólogas con respecto a las secuencias nucleotídicas de SEQ ID NO: 1 ó 19, por ejemplo, empleando técnicas de hibridización (Current Protocols in Molecular Biology, compilado por Ausubel y otros (1987), editorial John Wiley & Sons, secciones 6.3-6.4) y la técnica de multiplicación génica (PCR) (Current Protocols in Molecular Biology, compilado por Ausubel y otros (1987), editorial John Wiley & Sons, secciones 6.1-6.4). Es decir, basándose en las secuencias de ADN que codifican proteínas PLACE6002312 (SEQ ID NO: 1 ó 19), o porciones de las mismas, y mediante técnicas de hibridación, se pueden aislar ADNs sumamente homólogos con respecto a estos polinucleótidos a partir de muestras de ADN derivadas de la misma especie de organismo o de especies distintas. Además, se pueden aislar fragmentos de ADN sumamente homólogos con las secuencias de ADN que codifican proteínas PLACE6002312 empleando la técnica de multiplicación génica, diseñando cebadores que se basen en porciones de las secuencias de ADN que codifican proteínas PLACE6002312 (SEQ ID NO: 1 ó 19). Por tanto, también están incluidos polinucleótidos que se hibridan en condiciones restrictivas para proporcionar los polinucleótidos que comprenden la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 ó 19.
Tal como se emplea aquí, la expresión "condición restrictiva" se refiere a una condición bajo la cual dos secuencias se hibridan entre sí si comparten una identidad de al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, aún más preferiblemente al menos 97% a 99%. Una condición restrictiva ilustrativa incluye la incubación de un filtro en una disolución que contiene 5x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5x disolución de Denhardt, 10% de ácido dextrano-sulfúrico, y ADN de esperma de salmón desnaturalizado y cizallado a 20 \mug/ml, a una temperatura de 65ºC durante una noche, y el posterior lavado en 0,1x SSC a una temperatura de aproximadamente 65ºC.
También se puede preparar un polinucleótido que comprenda una secuencia nucleotídica significativamente homóloga con la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 ó 19 empleando un método para introducir mutaciones en la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 ó 19 (por ejemplo, mutagénesis localmente dirigida (Current Protocols in Molecular Biology, compilado por Ausubel y otros, (1987), editorial John Wiley & Sons, secciones 8.1 a 8.5)). Dicho polinucleótido se puede producir también por mutaciones espontáneas. También se incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 20, en la cual se han reemplazado, eliminado, insertado y/o añadido uno o más aminoácidos.
No existe limitación para el número de mutaciones de aminoácidos y sitios de mutación de aminoácidos en dichos polipéptidos, con tal que los polipéptidos conserven su actividad original. Típicamente, el número de mutaciones es de 30 aminoácidos o menos, preferiblemente de 10 aminoácidos o menos, más preferiblemente de 5 aminoácidos o menos (por ejemplo, 3 aminoácidos o menos). Los restos de aminoácido a emplear para la sustitución son, preferiblemente, los que tienen propiedades similares a las de los restos de aminoácido que van a ser sustituidos. Por ejemplo, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, y Trp están clasificados como aminoácidos no polares, y se consideran que tienen propiedades similares entre sí. Además de esto, son ejemplos de aminoácidos sin carga Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, y Gln. Además de esto, son ejemplos de aminoácidos ácidos Asp y Glu, y de aminoácidos básicos Lys, Arg, e His.
Los polinucleótidos aquí descritos que son idénticos o sustancialmente idénticos a la secuencia nucleotídica contenida en SEQ ID NO: 1 ó 19, o fragmentos de los mismos, pueden ser empleados como sondas para la hibridación de cADN y de ADN genómico, con el fin de aislar cADN de longitud completa y polipéptido PLACE6002312 codificador de clon genómico, y con el fin de aislar cADNs y clones genómicos para otros genes que comprendan una secuencia muy similar a la del gen PLACE6002312 (entre ellos genes que codifiquen homólogos y ortólogos derivados de especies distintas de la humana y el ratón). La secuencia nucleotídica de una de tales sondas tiene, típicamente, una identidad de 80%, preferiblemente 90%, más preferiblemente 95%, con respecto a la secuencia nucleotídica del objetivo. La sonda comprende típicamente 15 o más nucleótidos, preferiblemente 30 o más nucleótidos, y puede comprender 50 o más nucleótidos. Una sonda particularmente preferida consta de 30 a 50 nucleótidos.
Los polinucleótidos empleados para la producción recombinante del polipéptido aquí descrito incluyen las secuencias codificadoras del polipéptido maduro o de fragmentos del mismo aisladas; y secuencias codificadoras del polipéptido maduro o de fragmentos del mismo en el mismo marco de lectura que otras secuencias codificadoras (por ejemplo, secuencias líderes o secretoras; secuencias pre-, pro-, o preproproteínicas; o secuencias que codifican otras porciones de péptidos de fusión). Por ejemplo, puede estar codificada en el mismo marco de lectura una secuencia marcadora que facilite la purificación del polipéptido de fusión. También se incluyen secuencias marcadoras específicas, tales como el péptido de hexahistidina o la marca Myc proporcionada por el vector pcDNA3.1/Myc-His (Invitrogen), que está descrito en la bibliografía (Gentz y otros, Proc. Natl. Acad, Sci. USA (1989) 86: 821-824). Además, este polinucleótido puede comprender una secuencia no codificadora 5' y 3', por ejemplo secuencias transcritas pero no traduci-
das; señales de escisión y de poliadenilación; sitios de fijación a ribosomas; y secuencias de estabilización de mARN.
Los polinucleótidos y polipéptidos aquí descritos se pueden emplear, por ejemplo, como reactivos y materiales de investigación para descubrir agentes terapéuticos y agentes de diagnóstico para enfermedades de animal y seres humanos, tal como se describe más adelante.
Sistema de expresión de polipéptido
También se proporciona un vector que contiene un polinucleótido aquí descrito, células anfitrionas genéticamente manipuladas mediante el empleo de tal vector, y métodos para producir, mediante la técnica recombinante, polipéptidos de los aquí descritos. También se puede emplear un sistema de traducción sin células para producir tales polipéptidos a partir de ARNs derivados de un constructo de ADN aquí descrito.
Generalmente, para producir células recombinantes se manipulan células anfitrionas para introducir un sistema de expresión para un polinucleótido aquí descrito. Se puede introducir un polinucleótido en células anfitrionas mediante el empleo de uno de los métodos que se describen en diversos manuales estándar de laboratorio tales como el de Davis y otros, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986) y el de Sambrook y otros, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), y que incluyen, por ejemplo, la transfección mediante el empleo de fosfato cálcico, la transfección mediada por DEAE-dextrano, la transfección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transformación, carga por raspado, introducción balística, e infección.
Los ejemplos representativos de las células anfitrionas preferidas incluyen células bacterianas (por ejemplo Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, Bacilus subtilis), células fúngicas (por ejemplo levaduras, Aspergillus), células de insecto (por ejemplo de Drosophila S2, Spodoptera SF9), células animales (por ejemplo CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, células de melanoma de Bowes), y células vegetales.
Se encuentran disponibles diversos sistemas de expresión. Dichos sistemas de expresión incluyen, en particular, sistemas cromosómicos, sistemas episómicos, y sistemas víricos. Los ejemplos específicos de sistemas de expresión incluyen, por ejemplo, vectores derivados de plásmido bacteriano, bacteriófago, transposón, episoma de levadura, elemento de inserción, elemento cromosómico de levadura, y virus (por ejemplo baculovirus, papovavirus tales como SV40, virus de la vacuna, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la seudorrabia), y vectores derivados de combinaciones de los vectores arriba descritos, por ejemplo vectores que comprenden elementos genéticos derivados de plásmidos y bacteriófagos, por ejemplo cósmidos y fagémidos. Estos sistemas de expresión pueden contener no sólo secuencias esenciales para la expresión, sino también secuencias reguladoras secuencias implicadas en la regulación de la expresión. En general, se puede utilizar cualquier sistema y vector en tanto que sea adecuado para mantener, multiplicar, y expresar un polinucleótido para la producción del polipéptido correspondiente en un anfitrión. Se puede introducir una secuencia nucleotídica apropiada en un sistema de expresión empleando una cualquiera de las técnicas de rutina conocidas tales como las que descritas por Sambrook y otros, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (ver más arriba).
Se puede introducir una señal de secreción apropiada en un polipéptido de interés de manera que la proteína traducida pueda ser segregada al retículo endoplásmico, a la periferia celular o al entorno extracelular. Dicha señal puede ser una señal endógena o exógena para el polipéptido de interés.
Cuando los polipéptidos aquí descritos se van a expresar para ser empleados en ensayos de escrutinio, es preferible producir polipéptidos en la superficie celular. En estos casos se recolectan las células antes de emplearlas en el ensayo de escrutinio. Cuando los polipéptidos aquí descritos son segregados al medio de cultivo, se recoge el medio de cultivo para purificar los polipéptidos. Cuando los polipéptidos se producen intracelularmente, hay que recuperar los polipéptidos después de lisar las células.
Los polipéptidos aquí descritos pueden ser recuperados y purificados a partir del cultivo de células recombinantes empleando métodos conocidos, por ejemplo la precipitación con sulfato amónico o la precipitación con etanol, la extracción ácido-base, la cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía sobre fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía sobre hidroxiapatito, y cromatografía sobre lectina. Muy preferiblemente, en la purificación se emplea la cromatografía líquida de altas prestaciones. Si los polipéptidos se desnaturalizan durante el aislamiento y/o la purificación, se puede restaurar su conformación activa mediante el empleo de una técnica conocida para el replegamiento proteico.
Ensayo diagnóstico
También se proporciona el empleo de polinucleótidos aquí descritos como agentes de diagnóstico. Se espera que la detección de mutaciones en los genes que codifican los polipéptidos aquí descritos que se correlacionan con trastornos funcionales sea un medio útil para diagnosticar una enfermedad causada por la infraexpresión, sobreexpresión, o expresión alterada del gen, o para evaluar la susceptibilidad a la enfermedad. Los pacientes que tengan mutaciones en los genes que codifican los polipéptidos aquí descritos pueden ser detectados a nivel de ADN, a nivel de ARN, o a nivel de proteína, mediante el empleo de diversas técnicas.
Los polinucleótidos o polipéptidos a diagnosticar se pueden obtener de las células del paciente, por ejemplo, de muestras de sangre, de orina, de saliva, y de muestras de tejidos por biopsia o autopsia. Para la detección se puede emplear directamente ADN genómico como polinucleótido a diagnosticar. Como opción alternativa, se puede multiplicar enzimáticamente a través de PCR u otro método de multiplicación el ADN genómico, como polinucleótido a diagnosticar, antes del análisis. También se pueden utilizar de una manera similar ARN o cADN como polinucleótido a diagnosticar. La presencia de mutaciones de deleción y de inserción se puede detectar basándose en cambios del tamaño del producto multiplicado, en comparación con el genotipo normal. La mutaciones puntuales se pueden identificar mediante la hibridación de un ADN multiplicado, con polinucleótido aquí descrito, marcado. Se puede distinguir una secuencia perfectamente emparejada de una secuencia bicatenaria mal emparejada, digiriendo con ARNasa o basándose en la diferencia de temperatura de fusión entre las dos. Además, se pueden detectar variaciones en la secuencia de ADN basándose en la diferencia de movilidad electroforética entre fragmentos de ADN en un gel, con o sin desnaturalizante, o bien mediante la secuenciación directa del ADN (véase, por ejemplo, Myers y otros, Science (1985) 230: 1242). Las variaciones de secuencia en posiciones particulares se pueden detectar mediante el ensayo de protección contra nucleasa (por ejemplo, protección contra ARNasa y protección contra S1) o la escisión química (véase Cotton y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85: 4397-4401).
En otra realización, por ejemplo, se puede construir una matriz de sondas oligonucleotídicas que contengan los polinucleótidos aquí descritos, o fragmentos de los mismos, con el fin de lograr un escrutinio eficaz de mutaciones génicas. La tecnología de matrices está ya establecida, tiene aplicaciones generales, y se ha utilizado para resolver diversos problemas en la genética molecular, entre ellos la expresión génica, el encadenamiento genético, y la mutabilidad genética (véase, por ejemplo, M. Chee y otros, Science, volumen 274, páginas 610-613 (1996)).
El ensayo diagnóstico que comprende la operación de detectar mutaciones en los genes que codifican los polipéptidos aquí descritos, según el método antes descrito, proporciona un método para diagnosticar o determinar la susceptibilidad a infecciones, por ejemplo infecciones bacterianas, infecciones fúngicas, protozoiasis, e infecciones víricas, entre ellas la infección por HIV-1 o HIV-2 en particular, dolor, cáncer, diabetes, obesidad, pérdida de apetito, hiperfagia, asma, enfermedad de Parkinson, insuficiencia cardíaca aguda, hipotensión, hipertensión, retención de orina, osteoporosis, estenocardia, infarto de miocardio, úlcera, alergia, hipertrofia prostática benigna, y trastornos mentales y neurológicos, entre ellos ansiedad, esquizofrenia, sicosis maníaco-depresiva, delirio, demencia, deficiencias mentales graves, por ejemplo enfermedad de Huntington o el síndrome de Gilles de la Tourette, y discinesia.
Además, se puede realizar el diagnóstico de enfermedades tal como se ha descrito antes, empleando un método que detecte niveles de expresión extraordinariamente bajos o altos (entre ellos la expresión a nivel de mARN y a nivel de proteína) de los genes que codifican los polipéptidos aquí descritos en muestras obtenidas de pacientes. Se puede determinar la disminución o el incremento del nivel de expresión a nivel de ARN mediante cualquiera de los métodos de cuantificación de polinucleótidos conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, PCR, RT-PCR, protección contra ARNasa, tinción tipo Northern, y otros métodos de hibridación.
Los métodos de ensayo para medir la cantidad de proteínas, por ejemplo de los polipéptidos aquí descritos, en una muestra obtenida de un paciente, son bien conocidos por los especialistas en la técnica. Estos métodos de ensayo incluyen el radioinmunoensayo, ensayo de fijación competitiva, análisis mediante tinción tipo Western, ELISA, etc.
También se proporcionan equipos o "kits" para diagnosticar las enfermedades antes descritas o para estimar la susceptibilidad a dichas enfermedades. Uno de tales kits comprende: (a) un polinucleótido aquí descrito (preferiblemente, un polinucleótido que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 ó 19, un fragmento del mismo, o un polinucleótido que tiene la secuencia nucleotídica complementaria a dicha secuencia); (b) un polipéptido aquí descrito (preferiblemente, el polipéptido de SEQ ID NO: 2 ó 20 o un fragmento del mismo); o bien (c) un anticuerpo contra un polipéptido aquí descrito (preferiblemente, el polipéptido de SEQ ID NO: 2 ó 20). Un especialista en la técnica apreciará que en un kit semejante (a), (b), o (c) es un componente esencial.
Ensayo cromosómico
Las secuencias nucleotídicas aquí descritas se pueden emplear también para determinar de manera precisa el mapa del cromosoma humano. El mapeo se realiza como el primer paso importante para correlacionar las secuencias nucleotídicas aquí descritas con una enfermedad asociada a gen. Así, la localización física de una secuencia en el cromosoma se puede correlacionar con los datos del mapa genético. Estos datos se pueden encontrar, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, disponible en línea desde la John Hopkins University Welch Medical Library. Así, se puede identificar mediante el análisis del encadenamiento la relación entre un gen mapeado en una región cromosómica idéntica y una enfermedad (co-heredabilidad de genes físicamente adyacentes).
Es posible determinar la diferencia en la secuencia de cADN o genómica entre pacientes y sujetos normales. Cuando se halla que algunos o todos los pacientes son portadores de una mutación, pero ningún sujeto normal tiene la mutación, dicha mutación puede ser una de las causas de la enfermedad.
Anticuerpos
Un polipéptido de los aquí descritos o un fragmento del mismo, o análogos del mismo, o una célula que los expresa, pueden ser empleados como inmunógeno para producir anticuerpos que se fijen al polipéptido aquí descrito. Preferiblemente, los anticuerpos son inmunoespecíficos hacia un polipéptido aquí descrito. El término "inmunoespecífico" significa que el anticuerpo tiene una afinidad sustancialmente mayor hacia los polipéptidos de la presente invención que hacia otros polipéptidos relacionados, conocidos en la técnica.
Se pueden preparar anticuerpos que se fijen a un polipéptido aquí descrito, administrando un fragmento, análogo, o célula que contengan el polipéptido o epítope a un animal (preferiblemente, distinto del ser humano) empleando un protocolo convencional. Para preparar anticuerpos monoclonales se puede emplear cualquier técnica que utilice un sistema de células en cultivo continuo que produzca anticuerpos. Por ejemplo, tales técnicas incluyen la técnica del hibridoma (Kohler, G. y Milstein, C., Nature (1975) 256: 495-497), la técnica del trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor y otros, Immunology Today (1983) 4:72), y la técnica del hibridoma EBV (Cole y otros, MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, páginas 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).
Se pueden emplear ratones transgénicos u otros animales no humanos, entre ellos otros mamíferos no humanos, para expresar anticuerpos humanizados contra un polipéptido aquí descrito. Se puede aislar un clon que exprese el polipéptido, e identificarlo mediante el empleo del anticuerpo antes mencionado, y se puede purificar el polipéptido mediante cromatografía de afinidad utilizando el anticuerpo. Un anticuerpo que se fije a un polipéptido aquí descrito se puede emplear para tratar, en particular, la infección, por ejemplo una infección bacteriana, infección fúngica, protozoiasis, e infección vírica, con inclusión de la infección por HIV-1 o HIV-2 en particular, el dolor, cáncer, diabetes, obesidad, pérdida de apetito, hiperfagia, asma, enfermedad de Parkinson, insuficiencia cardíaca aguda, hipotensión, hipertensión, retención de orina, osteoporosis, estenocardia, infarto de miocardio, úlcera, alergia, hipertrofia prostática benigna, y trastornos mentales y neurológicos, entre ellos ansiedad, esquizofrenia, psicosis maníaco-depresiva, delirio, demencia, deficiencias mentales graves, tales como la enfermedad de Huntington o el síndrome de Gilles de la Tourette, y discinesia.
Vacuna
También se proporciona un método para potenciar la respuesta inmunitaria en mamíferos. El método comprende la operación de inocular una cantidad suficiente de un polipéptido de los aquí descritos o un fragmento del mismo para producir anticuerpos y/o provocar respuesta inmunitaria de células T para proteger a los animales contra, en particular, la infección, por ejemplo una infección bacteriana, infección fúngica, protozoiasis, e infección vírica, con inclusión de la infección por HIV-1 o HIV-2 en particular, el dolor, cáncer, diabetes, obesidad, pérdida de apetito, hiperfagia, asma, enfermedad de Parkinson, insuficiencia cardíaca aguda, hipotensión, hipertensión, retención de orina, osteoporosis, estenocardia, infarto de miocardio, úlcera, alergia, hipertrofia prostática benigna, y trastornos mentales y neurológicos, entre ellos ansiedad, esquizofrenia, psicosis maníaco-depresiva, delirio, demencia, deficiencias mentales graves, tales como la enfermedad de Huntington o el síndrome de Gilles de la Tourette, y discinesia.
También se proporciona un método para potenciar la respuesta inmunitaria en mamíferos, que comprende administrar un polipéptido de los aquí descritos in vivo a través de un vector que dirige la expresión de un polinucleótido aquí descrito, para potenciar la respuesta inmunitaria de manera que produzca anticuerpos que evitan enfermedades en mamíferos.
También se proporcionan preparaciones (composiciones) inmunológicas/vacunas para potenciar la respuesta inmunitaria a un polipéptido de los aquí descritos en un anfitrión mamífero cuando son introducidas en el anfitrión mamífero. Esta composición contiene un polipéptido o polinucleótido de los aquí descritos. Las preparaciones de vacuna pueden contener además vehículos apropiados. El polipéptido PLACE6002312 puede ser descompuesto en el estómago, y por tanto se administra preferiblemente por vía parenteral (lo que incluye la inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa, e intracutánea). Las preparaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen la disolución aséptica para inyección, acuosa o no acuosa, que puede contener un antioxidante, un tampón, un bacteriostático, y un soluto que haga a la preparación isotónica con la sangre del paciente, y la suspensión aséptica, acuosa o no acuosa, que puede contener un emulsionante o un agente espesante. Estas preparaciones se pueden proveer en envases de dosis única o en envases multidosis, (por ejemplo, ampollas y viales cerrados) o, como alternativa, conservarse en forma liofilizada a la cual se añade un vehículo líquido aséptico inmediatamente antes del uso. Las preparaciones de vacuna pueden comprender un sistema de adyuvante con el fin de intensificar la inmunogenicidad de tal preparación, por ejemplo, un sistema de adyuvante aceite-en-agua y otros sistemas de adyuvante conocidos en la técnica. La dosis de vacuna depende de su actividad específica, y se puede determinar de manera sencilla mediante un procedimiento experimental de rutina.
Ensayo de escrutinio
Los polipéptidos aquí descritos pueden ser utilizados en un método de escrutinio en busca de un compuesto (es decir, un agonista) que active los polipéptidos, o bien en busca de un compuesto (es decir, un antagonista, también denominado inhibidor) que inhiba sus actividades. Los polipéptidos aquí descritos se pueden emplear, por ejemplo, para evaluar la fijación de sustratos y ligandos de bajo peso molecular presentes en células, preparaciones exentas de células, bibliotecas de sustancias químicas, o mezclas de productos naturales. Dichos sustratos y ligandos pueden ser sustratos o ligandos naturales, o bien imitadores estructurales o funcionales (véase Coligan y otros, Current Protocols in Immunology 1 (2): capítulo 5(1991)).
Los polipéptidos aquí descritos están implicados en diversas funciones biológicas, entre ellas muchas patologías. Así, por una parte, se desea escrutinizar en busca de compuestos y fármacos que puedan activar los polipéptidos aquí descritos, pero por otra parte es deseable escrutinizar en busca de aquellos compuestos que puedan inhibir la función de los polipéptidos aquí descritos. En general, se emplean agonistas y antagonistas para tratar y prevenir síntomas de infección, por ejemplo una infección bacteriana, infección fúngica, protozoiasis, e infección vírica, con inclusión de la infección por HIV-1 o HIV-2 en particular, el dolor, cáncer, diabetes, obesidad, pérdida de apetito, hiperfagia, asma, enfermedad de Parkinson, insuficiencia cardíaca aguda, hipotensión, hipertensión, retención de orina, osteoporosis, estenocardia, infarto de miocardio, úlcera, alergia, hipertrofia prostática benigna, y trastornos mentales y neurológicos, entre ellos ansiedad, esquizofrenia, psicosis maníaco-depresiva, delirio, demencia, deficiencias mentales graves, tales como la enfermedad de Huntington o el síndrome de Gilles de la Tourette, y discinesia, etc.
Típicamente, uno de estos métodos de escrutinio se lleva a cabo empleando células apropiadas que expresan en su superficie un polipéptido de los aquí descritos. Tales células incluyen células derivadas de mamíferos, levaduras, Drosophila, y E. coli. Después se pone en contacto un compuesto de prueba con células que expresan un receptor (o con la membrana celular que contiene el polipéptido aquí descrito, expresado) para observar su fijación, o la activación o inhibición de la respuesta funcional.
Una realización de las técnicas de escrutinio comprende el uso de células que expresan un receptor de los aquí descritos (por ejemplo, células CHO transfectadas) en un sistema de ensayo referido al cambio del pH extracelular o al cambio del nivel intracelular de calcio, que se producen por la activación del receptor. En este método, se puede poner en contacto un compuesto con células que expresen un polipéptido de los aquí descritos. Después se detectan las respuestas en las que interviene un segundo mensajero (por ejemplo transducción de señal, cambio de pH, o cambio del nivel de calcio) a fin de determinar si un compuesto candidato activa o inhibe el receptor.
Otro método de escrutinio en busca de inhibidores de receptor comprende determinar la inhibición o activación de la acumulación, mediada por receptor, de CAMP y/o de adenilato-ciclasa. Este método comprende transfectar células eucariotas con un polipéptido de los aquí descritos y permitir la expresión del receptor sobre la superficie celular. Entonces se determina la cantidad de CAMP acumulado después de que se hayan puesto en contacto las células con un antagonista candidato, en presencia del receptor aquí descrito. Cuando la fijación del antagonista candidato al receptor da como resultado la inhibición de la fijación a receptor, disminuirá o aumentará el nivel de actividad de cAMP mediado por receptor o de adenilato-ciclasa.
Además, se pueden emplear un polinucleótido (por ejemplo, cADN) o un polipéptido de los aquí descritos, o un anticuerpo contra el polipéptido, para construir un sistema de ensayo con el fin de determinar la acción de un compuesto sobre la expresión intracelular (producción de mARN o proteína) de un gen que codifique el polipéptido aquí descrito. Por ejemplo, se puede emplear un anticuerpo monoclonal o policlonal para establecer un ELISA para determinar el nivel segregado o el nivel de fijación a células de un polipéptido de los aquí descritos, empleando un método estándar conocido en la técnica. El método ELISA se puede emplear para explorar sustancias que supriman o que intensifiquen la producción de un polipéptido de los aquí descritos, en células o tejidos adecuadamente manipulados. El método del ensayo estándar de escrutinio es bien conocido en la técnica.
Los antagonistas potenciales ilustrativos de un polipéptido de los aquí descritos incluyen anticuerpos y, en algunos casos, oligonucleótidos o proteínas estrechamente relacionadas con un ligando (por ejemplo, un fragmento de un ligando), y moléculas pequeñas que se fijan a un polipéptido de los aquí descritos pero que no inducen la respuesta (es decir, inhiben la actividad del receptor).
También se proporciona un equipo o "kit" de escrutinio para identificar agonistas, antagonistas, ligandos, receptores, sustratos, enzimas, o similares, de polipéptidos aquí descritos, o compuestos que disminuyan o incrementen la producción de polipéptidos aquí descritos. Dicho kit comprende: (a) un polipéptido de los aquí descritos (preferiblemente, el polipéptido de SEQ ID NO: 2 ó 20); (b) células recombinantes que expresan el polipéptido de los aquí descritos (preferiblemente, el polipéptido de SEQ ID NO: 2 ó 20) o membranas celulares de las mismas; (c) un anticuerpo contra el polipéptido de los aquí descritos (preferiblemente, el polipéptido de SEQ ID NO: 2 ó 20). Un especialista en la técnica apreciará que, en uno de tales kits, (a), o (c) son un componente esencial.
Métodos profilácticos y terapéuticos
También se proporciona un método para tratar estados anormales que se asocien con la sobreexpresión y la infraexpresión de la actividad de polipéptidos aquí descritos. Dichos estados incluyen la infección, por ejemplo la infección bacteriana, infección fúngica, protozoiasis, y la infección vírica, con inclusión de la infección por HIV-1 o HIV-2 en particular, el dolor, cáncer, diabetes, obesidad, pérdida de apetito, hiperfagia, asma, enfermedad de Parkinson, insuficiencia cardíaca aguda, hipotensión, hipertensión, retención de orina, osteoporosis, estenocardia, infarto de miocardio, úlcera, alergia, hipertrofia prostática benigna, y trastornos mentales y neurológicos, entre ellos ansiedad, esquizofrenia, psicosis maníaco-depresiva, delirio, demencia, deficiencias mentales graves, tales como la enfermedad de Huntington o el síndrome de Gilles de la Tourette, y discinesia. Existen algunos posibles modos de actuación cuando un polipéptido de los aquí descritos está excesivamente activado. Un modo de actuación comprende administrar un antagonista tal como los anteriormente descritos, en combinación con vehículos farmacéuticamente aceptables a un paciente, en una cantidad eficaz para inhibir la actividad, inhibiendo de este modo la fijación de un ligando al polipéptido de los aquí descritos o suprimiendo la segunda señal con el fin de mejorar las condiciones anormales. Dichos antagonistas incluyen un polipéptido soluble de la presente invención capaz de fijarse a un ligando de manera competidora con un polipéptido endógeno de los aquí descritos. Un ejemplo típico de dichas sustancias competidoras es un fragmento de polipéptidos aquí descritos.
Otro modo de actuación comprende suprimir la expresión de un gen que codifique un polipéptido endógeno de los aquí descritos mediante el empleo de un método de inhibición de la expresión. Esta técnica conocida requiere el empleo de una secuencia antisentido que se produce in vivo o bien se administra por separado. Véase, por ejemplo, O'Connor, J. Neurochem. (1991) 56: 560, en Oligodeoxinucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988). Como opción alternativa, es posible administrar un oligonucleótido que forme una hélice triple con este gen. Véase, por ejemplo, Lee y otros, Nucleic Acids Res (1979) 6: 3073; Cooney y otros, Science (1988) 241: 456; y Dervan y otros, Science (1991) 251: 1360. Se pueden administrar estos oligómeros como tales, o bien se pueden expresar in vivo oligómeros relacionados.
Se pueden emplear diversos modos de actuación para tratar estados anormales que resulten de la infraexpresión de la actividad de un polipéptido de los aquí descritos. Un modo de actuación comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto (en concreto, un agonista tal como se ha descrito antes) que active un polipéptido de los aquí descritos, en combinación con vehículos farmacéuticamente aceptables, para mejorar los estados anormales. Otro modo de actuación es la terapia génica para producir endógenamente un polipéptido de los aquí descritos en células relacionadas de un paciente. Por ejemplo, se modifica genéticamente un polinucleótido de los aquí descritos con el fin de expresarlo en un vector retrovírico de replicación deficiente tal como se ha descrito más arriba. Después se aísla el constructo de expresión retrovírica y se introduce en células empaquetadoras transformadas con un vector plásmido retrovírico que contienen ARN que codifica el polipéptido aquí descrito. Las células empaquetadoras resultantes producen partículas víricas infecciosas que contienen el gen de interés. Estas células productoras de virus se introducen en el paciente para tratar células in vivo y expresar el polipéptido in vivo. Si se desea tener una visión general de la terapia génica, véase el capítulo 20 de "Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches" (y las referencias allí citadas) en "Human Molecular Genetics", de T. Strachanand y A.P. Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996). Otro modo de actuación comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de los aquí descritos en combinación con vehículos farmacéuticamente aceptables apropiados.
Una preparación y una forma soluble administrable de un polipéptido, agonista, antagonista, o molécula pequeña de los aquí descritos se puede formular en combinación con vehículos farmacéuticamente aceptables apropiados. Dicha preparación contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido o compuesto y vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. Dichos vehículos incluyen, pero sin quedar limitados a éstos, solución salina, solución salina fisiológica, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos. La preparación dependerá del modo de administración, y esto se puede conseguir empleando una técnica conocida en la técnica.
Además, se proporciona un estuche o "kit" farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más componentes de una composición de las aquí descritas, que se han descrito más arriba. Un polipéptido y otros compuestos de los aquí descritos pueden ser empleados solos o en combinación con otros compuestos, por ejemplo, compuestos terapéuticos.
Un procedimiento preferido para la administración sistémica de una composición farmacéutica es la infusión (inyección), típicamente la inyección intravenosa. También es posible emplear otras rutas de infusión, por ejemplo la inyección subcutánea, intramuscular, o intraperitoneal. Los medios de administración sistémica incluyen la administración transmucosal y transdérmica con el empleo de un agente penetrante, por ejemplo una sal biliar, ácido fusídico, u otro tensioactivo. También se pueden administrar los compuestos por vía oral, si se formulan adecuadamente como una preparación con revestimiento entérico o una cápsula. Estos compuestos se pueden aplicar de manera tópica y/o localizada como una forma farmacéutica, por ejemplo una pomada, pasta, o gel.
El intervalo de dosis requerido depende del tipo de péptido elegido, de la ruta de administración, de las propiedades de la preparación, el estado del paciente, y del criterio del médico. No obstante, la dosis apropiada se encuentra típicamente dentro del intervalo de 0,1 to 100 \mug por kg de peso del paciente. Puesto que existen diversos compuestos disponibles y su ruta de administración y su eficacia difieren dependiendo del compuesto, se debe señalar que la dosis requerida puede variar dentro de un amplio intervalo. Por ejemplo, se prevé que la administración por vía oral precisa una dosis superior en comparación con la administración por inyección intravenosa. Estas modificaciones de la dosis se pueden determinar empleando los procedimientos estándar de optimización empírica bien conocidos en la
técnica.
Un polipéptido que ha de ser empleado en la terapia puede ser producido en el organismo de un paciente con el método terapéutico denominado "terapia génica" tal como se ha descrito más arriba. Por ejemplo, se manipulan genéticamente ex vivo células derivadas de un paciente, con un polinucleótido, por ejemplo ADN o ARN, que codifica un polipéptido, por ejemplo utilizando un vector plásmido retrovírico. Después se introducen las células en el paciente.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra el resultado obtenido mediante la búsqueda BLAST de todas las secuencias SWISS-PROT utilizando como "Query" la secuencia de aminoácidos de PLACE6002312. La secuencia de aminoácidos de PLACE6002312 tiene la homología más alta (27%) con el RECEPTOR H2 DE HISTAMINA (número de accesión GenBank P97292).
La Figura 2 muestra el resultado obtenido mediante la búsqueda BLAST de GenBank utilizando como "Query" la secuencia nucleotídica de PLACE6002312. La secuencia nucleotídica de PLACE6002312 tiene la homología más alta (99%) con un clon de las secuencias provisionales del genoma humano (número de accesión GenBank AC021016, clon del cromosoma 2 de Homo sapiens RP11-378A13, SECUENCIA PROVISIONAL DE TRABAJO, 7 fragmentos sin ordenar). Además, las secuencias de fragmentos de partes de escisión de la secuencia nucleotídica de PLACE6002312 eran homólogas, respectivamente, con diferentes regiones en una secuencia continua del genoma. Es presumible que los restos nucleotídicos que no son idénticos entre las secuencias nucleotídicas sean el resultado de polimorfismos genéticos.
La Figura 3 es continuación de la Figura 2.
La Figura 4 es continuación de la Figura 3.
La Figura 5 es una fotografía que muestra un perfil de expresión obtenido mediante análisis RT-PCR para el gen PLACE6002312. Se multiplicó un fragmento de ADN con aproximadamente 600 pares de bases utilizando muestras de derivadas de pulmón, corazón, ovario, testículo, hígado, colon, y placenta.
La Figura 6 es una fotografía que muestra un perfil de expresión obtenido mediante análisis de tinción tipo Northern para el gen PLACE6002312. Se detectó un fragmento de ARN de aproximadamente 1,7 kbases, en forma de mARN de PLACE6002312, en muestras derivadas de corazón, placenta, hígado, riñón, páncreas, bazo, ovario, intestino delgado, colon, y leucocitos de la sangre periférica.
La Figura 7 muestra la fijación, dependiente de la concentración, entre polipéptido PLACE6002312 e histamina. La fijación específica a histamina se midió utilizando células cultivadas, y se determinó a partir de la diferencia entre la actividad de fijación total y la actividad de fijación inespecífica frente a [3H]-histamina (cada punto de datos se determinó con n= 6; se indica la desviación típica). Se detectó fijación específica a histamina en células HEK293 en las cuales se había introducido un vector de expresión para polipéptido PLACE6002312. Por el contrario, no se pudo detectar fijación específica a histamina en células HEK293 en las cuales se había introducido un plásmido que no expresaba polipéptido PLACE6002312. Por tanto, se demostró que el gen PLACE6002312 codifica un polipéptido que se fija específicamente a histamina.
La Figura 8 muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos de PLACE6002312 y de su homólogo murino. La parte superior de la alineación corresponde a la secuencia de PLACE6002312; la parte inferior corresponde al análogo murino.
Mejor modo de poner en práctica la invención
A continuación se ilustra con detalle la presente invención, haciendo referencia a Ejemplos, pero no se ha de considerar que queda limitada a los mismos. Salvo que se indique otra cosa, los experimentos que se muestran en estos Ejemplos se pueden llevar a cabo según métodos conocidos (Maniatis, T. y otros, (1982) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY).
Ejemplo 1 Aislamiento de receptor PLACE6002312 acoplado a proteína G
El receptor PLACE6002312 acoplado a proteína G se aisló utilizando una biblioteca de cADN preparada a partir de ARN placentario humano (Clontech). En concreto, se trató la muestra de ARN completa con fosfatasa alcalina bacteriana (BAP), y después se trató adicionalmente con fosfatasa alcalina de tabaco (TAP) para convertir la estructura CAP del extremo 5' del mARN de longitud completa en un grupo fosfato. Empleando ARN-ligasa, se ligó el mARN resultante con un enlazador de oligo-ARN sintético (secuencia: 5'- AGC AUC GAG UCG GCC UUG UUG GCC UAC UGG -3'/SEQ ID NO: 3). Una vez que se hubo sintetizado la primera cadena de cADN empleando el mARN como plantilla y un cebador adaptador oligo-dT (secuencia: 5'-GCG GCT GAA GAC GGC CTA TGT GGC CTT TTT TTT TTT TTT TTT -3'/SEQ ID NO: 4), se llevó a cabo una PCR empleando el kit Gene Amp XL PCR (Perkin Elmer), el cebador en sentido directo (5'- AGC ATC GAG TCG GCC TTG TTG -3'/SEQ ID NO: 5) y el cebador en sentido inverso (5'- GCG GCT GAA GAC GGC CTA TGT GGC CTT TTT TTT TTT TTT TTT -3'/SEQ ID NO: 6), en las condiciones cíclicas de 1 ciclo de 95ºC durante 5 minutos, seguido de 15 ciclos de 95ºC durante 1 minuto, 58ºC durante 1 minuto, y 72ºC durante 10 minutos. Después de que se hubieron digerido los productos de multiplicación PCR con la enzima de restricción SfiI, utilizando la versión 1 del kit de ligación a ADN (Takara Shuzo), se ligó el fragmento resultante al vector de clonación pME18SFL3 pre-digerido con la enzima de restricción DraIII. Se analizó la secuencia nucleotídica del cADN clonado, mediante el método del terminador dideoxi, utilizando el secuenciador de ADN ABI3700 (Applied Biosystems). En SEQ ID NO: 1 se muestra la secuencia determinada.
Esta secuencia consta de 1869 restos de nucleótido, y contiene un marco abierto de lectura de 990 nucleótidos (SEQ ID NO: 7). En SEQ ID NO: 2 se muestra la secuencia de aminoácidos (330 restos de aminoácido) deducida del marco de lectura abierta. La secuencia de aminoácidos deducida contiene un dominio hidrófobo que se estima como siete dominios transmembranales característicos del receptor acoplado a proteína G. Además, se halló que esta secuencia contenía restos de aminoácido característicos de receptor acoplado a proteína G cuyo ligando puede ser monoamina o histamina (Leurs, I., Hoffmann, I., Wieland, I., y Timmerman, I. (2000) Trends Pharmacol. Sci. 21: 11), entre ellos resto de ácido aspártico situado inmediatamente después del primer dominio transmembranal, la secuencia DRY (o ERY) situada inmediatamente después del tercer dominio transmembranal, el resto de triptófano en el cuarto dominio transmembranal, el resto de cisteína entre el cuarto y el quinto dominios transmembranales, y la secuencia WXP en el sexto dominio transmembranal. Así, se demostró que el gene codifica un receptor acoplado a proteína G.
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Ejemplo 2 Búsqueda BLAST en SWISS-PROT de la secuencia de aminoácidos de receptor PLACE6002312 acoplado a proteína G
Se buscó en el banco de datos SWISS-PROT la secuencia de aminoácidos de PLACE6002312 utilizando BLAST (siglas de "Basic local alignment search tool"; S. F. Altschul y otros, J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)). En la Figura 1 se muestran los resultados obtenidos. No se encontró ninguna secuencia idéntica, pero la secuencia tenía la máxima homología (27%) con el RECEPTOR H2 de HISTAMINA (número de accesión GenBank P97292). Estos hallazgos demostraron que PLACE6002312 era un nuevo receptor acoplado a proteína G.
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Ejemplo 3 Búsqueda BLAST en GenBank del gen de receptor PLACE6002312 acoplado a proteína G
Se llevó a cabo una búsqueda BLAST en GenBank de la secuencia nucleotídica de PLACE6002312. En las Figuras 2 a 4 se muestran los resultados obtenidos. La secuencia nucleotídica tiene la homología máxima (99%) con un clon de las secuencias provisionales del genoma humano (número de accesión GenBank AC021016; clon de cromosoma 2 de Homo sapiens RP11-378A13, SECUENCIA PROVISIONAL DE TRABAJO, 7 fragmentos desordenados). Así, se demostró que el gen de receptor PLACE6002312 acoplado a proteína G estaba situado en el cromosoma humano 2 y comprendía dos exones. Además, en la secuencia nucleotídica de AC021016, se halló que una secuencia nucleotídica situada más arriba hacia 5' que una secuencia nucleotídica homóloga a la secuencia nucleotídica del extremo 5' de PLACE6002312 correspondía a la región reguladora transcripcional del gen PLACE6002312. Además, se estimó que restos nucleotídicos no idénticos entre sí eran resultado de polimorfismos genéticos.
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Ejemplo 4 Distribución de expresión del gen PLACE6002312 en tejidos humanos
La distribución tisular de PLACE6002312 se estudió empleando el panel MTC (Clontech). Los cebadores utilizados estaban diseñados para flanquear la región que multiplica un fragmento de aproximadamente 600 pares de bases en el ORF (marco de lectura abierto) del clon; cebador 1: 5'- CAT GGC AGT CCT GAG GCC ACT CCA GC -3' (SEQ ID NO: 8) y cebador 2: 5'- AGG CAC CTT TGG GCG GCT GCC CTC CA -3' (SEQ ID NO: 9). Se llevó a cabo la PCR empleando polimerasa de ADN LA Taq (Takara Shuzo) en las condiciones cíclicas de 1 ciclo de 94ºC durante 5 minutos, seguido por 33 ciclos de 98ºC durante 20 segundos y 68ºC durante 5 minutos. Como resultado de ello, se multiplicó un fragmento de cADN de aproximadamente 600 pares de bases procedente de cADNs derivados de pulmón, corazón, ovario, testículo, hígado, colon, y en particular placenta, pero tal multiplicación no fue detectable cuando se preparó cADN a partir de otros órganos (próstata, timo, cerebro, páncreas, leucocitos, músculo esquelético, riñón y bazo) (Figura 5). También se estudió el perfil de expresión mediante análisis por tinción tipo Northern. Empleando el kit de marcado de ADN BcaBEST (Takara Shuzo), se preparó una sonda marcada a partir de un segmento de 528 pares de bases (SEQ ID NO: 10) que se había obtenido tratando ADN de PLACE6002312 con la enzima de restricción Eco47III. Se realizó la tinción tipo Northern hibridando la sonda a tinciones MTN (Clontech). El resultado demostró que el gen PLACE6002312 era transcrito a mARN de aproximadamente 1,7 kbases, y la banda correspondiente al transcripto era detectable en tejidos y células, entre ellos corazón, placenta, hígado, riñón, páncreas, bazo, ovario, intestino delgado, colon, y leucocitos de la sangre periférica. Sin embargo, el transcripto era indetectable en mARNs de otros órganos (cerebro, pulmón, músculo esquelético, timos, próstata, y testículo) (Figura 6).
Ejemplo 5 Construcción de plásmido de expresión para PLACE6002312
Con el fin de maximizar el nivel de expresión del polipéptido codificado por el gen PLACE6002312, se eliminaron del cADN todos los restos nucleotídicos de las regiones no traducidas (UTRs) 5' y 3', antes de insertar el gen PLACE6002312 en el vector de expresión. Específicamente, para obtener un expresión fragmento de ADN que contuviese sólo la región codificadora para el polipéptido del gen PLACE6002312, se preparó un par de cebadores consistente en el cebador 3: 5'- GGA ATT CAT TTA GTC TCA CGA TAG GCA TG -3'/SEQ ID NO: 11 y el cebador 4: 5'- CGG GAT CCT CAG TGC GGG GTC AAA CAG AGG CA -3'/SEQ ID NO: 12, que eran portadores de los sitios de enzima de restricción añadidos EcoRI y BamHI, respectivamente, y después se efectuó la PCR utilizando ADN-polimerasa LA Taq (Takara Shuzo), junto con el ADN de PLACE6002312 ligado con pME18SFL3 como ADN plantilla. Se multiplicó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,2 kbases en las condiciones cíclicas de 1 ciclo de 94ºC durante 5 minutos, seguido por 30 ciclos de 98ºC durante 20 segundos y 68ºC durante 5 minutos. Se trató el fragmento con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI, y después se ligó, utilizando la versión 1 del kit de ligación de ADN (Takara Shuzo), al vector de expresión pcDNA3.1(-) (Clontech) pre-digerido con las mismas enzimas de restricción, EcoRI y BamHI. Se analizó la secuencia nucleotídica del fragmento de ADN ligado, mediante el método de terminador dideoxi en un secuenciador de ADN ABI 377. Una vez confirmada la secuencia nucleotídica, se denominó al plásmido construido pcDNA3.1(-)-PLACE6002312.
Ejemplo 6 Fijación específica entre células 293 que expresan proteína PLACE6002312 e histamina
El ensayo de fijación de ligando puede servir como un método directo de farmacología de receptor, y es aplicable a sistemas de alta productividad. Los experimentos descritos a continuación se llevaron a cabo para demostrar que el polipéptido codificado por el gen PLACE6002312 tiene actividad de fijación de histamina. Primeramente se cultivaron en placas células 293 de riñón embrionario humano (HEK293) en una placa de cultivo celular de 10 cm, con una densidad de células de 1x10^{6} células por placa, y se incubaron en un incubador humidificado, bajo 5% de CO_{2} y a 37ºC durante 24 horas. Después se transfectaron 10 \mug de plásmido pcDNA3.1(-)-PLACE6002312 por placa, por el método del fosfato cálcico (Mol. Pharm. (1997) 51: 171). Tras haber continuado el cultivo durante 14 horas, se cambió el medio a D-MEM fresco que contenía 10% de FBS, y se incubaron las células durante 2 días más. Cuando se hubo completado el cultivo, se lavaron las células con PBS(-), y después se suspendieron en D-MEM exento de FBS, con una densidad de células de 1x10^{6} células/ml. Se dividió en alícuotas la suspensión celular (50 \mul/pocillo) en placas de 96 pocillos con fondo plano (Sumitomo Bakelite Co.) pre-siliconizadas con Siliconize L-25 (Fuji Systems). Se añadieron a cada pocillo alícuotas de 50 \mul de D-MEM, y después se añadió a los mismos [^{3}H]-histamina radiactivamente marcada a las concentraciones finales de 0, 40, 80, y 160 nM. Se incubó la placa a temperatura ambiente durante 1 hora. Se llevaron a cabo análisis de fijación inespecífica de [^{3}H]-histamina utilizando D-MEM al cual se había añadido previamente histamina sin marcar, a la concentración final de 1x10^{-5} M.
Cuando se completó la reacción, se filtró la suspensión de células mediante filtración con vacío, utilizando filtros de 96 pocillos. Se utilizó como filtro de 96 pocillos una microplaca blanca con filtro GF/B incorporado (Packard). Previamente se trató cada uno de los pocillos por filtración con 150 \mul de polietilenimina al 0,3%. Después se lavaron los pocillos siete veces con 150 \mul de tampón de lavado (Tris-Cl 50 mM (pH 7,4), MgCl_{2} 5 mM) enfriado con hielo, por pocillo, y después se secó el filtro a 47ºC durante aproximadamente 14 horas. Se determinó la radiactividad de la [^{3}H]-histamina fijada, añadiendo 40 \mul de MICROSCINT-40 (Packard) por pocillo y empleando TOPCOUNT (Packard). Se determinó la actividad de fijación específica a [^{3}H]-histamina basándose en la diferencia entre la actividad de fijación total (sin histamina marcada) y la actividad de fijación inespecífica (con histamina sin marcar). Como consecuencia, se detectó la fijación específica a [^{3}H]-histamina en las células HEK293 en las cuales se había introducido pcDNA3.1
(-)-PLACE6002312. Por el contrario, se observó fijación inespecífica a [^{3}H]-histamina, pero no fijación específica, en células HEK293 (simulación) en las cuales se había introducido pcDNA3.1(-) (Figura 7). Por consiguiente, se demostró que PLACE6002312 codifica un polipéptido que se fija específicamente a histamina. Empleando este sistema de ensayo de fijación a ligando, se pueden realizar escrutinios con el fin de seleccionar antagonistas y agonistas de receptor PLACE6002312 acoplado a proteína G.
Ejemplo 7 Aislamiento de cADN homólogo murino de PLACE6002312
Se aisló cADN homólogo murino de PLACE6002312 mediante el método de multiplicación rápida de extremos de cADN (siglas inglesas RACE). El cADN plantilla utilizado era cADN derivado de hígado de ratón Marathon-Ready^{TM} (Clonetech). Se realizó la PCR empleando la ADN-polimerasa termoestable Pfu ADN polymerase (Stratagene). Específicamente, se prepararon el cebador 3' para la multiplicación (secuencia: 5'- CAGCTCCCAGGCTATCTTCCCAGC -3'/SEQ ID NO: 13) y el cebador adaptador 2 (secuencia: 5'- ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC -3'/SEQ ID NO: 14) basándose en una secuencia nucleotídica particular en el marco abierto de lectura de PLACE6002312. Se aisló mediante PCR el fragmento 3' del cADN homólogo murino de PLACE6002312, utilizando los cebadores en las condiciones cíclicas de 1 ciclo de 95ºC durante 5 minutos, seguido por 30 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 3 minutos, y después 1 ciclo de 72ºC durante 10 minutos. El fragmento 5' del cADN homólogo murino de PLACE6002312 se aisló mediante PCR empleando el cebador 5' para la multiplicación (secuencia: 5'- GCACTCGTAGACACCTTTGGGCAGC -3'/SEQ ID NO: 15) y el cebador adaptador 1 (secuencia: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC -3'/SEQ ID NO: 16), en las condiciones cíclicas de 1 ciclo de 95ºC durante 5 minutos, seguido por 30 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 3 minutos, y después 1 ciclo de 72ºC durante 10 minutos. Se ligaron estos fragmentos de cADN con el vector de clonación pCR®2.1-TOPO. Se analizaron las secuencias nucleotídicas de los cADNs clonados mediante el método de terminador dideoxi en un secuenciador de ADN ABI3700 (Applied Biosystems). Se prepararon el cebador de clonación de longitud completa 1 (secuencia: 5'- ATGGCCCGAAGACCTGCAAGAGTG -3'/SEQ ID NO: 17) y el cebador de clonación de longitud completa 2 (secuencia: 5'-TGGCCAGAGATTTATTTGGTCTGGGTAGGT -3'/SEQ ID NO: 18) a fin de clonar el cADN murino de longitud completa, basándose en las secuencias nucleotídicas de los cADNs de ratón descritas más arriba. Se llevó a cabo la PCR en las condiciones cíclicas de 1 ciclo de 95ºC durante 4 minutos, seguido por 30 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 3 minutos, y después 1 ciclo de 72ºC durante 10 minutos, para aislar el cADN de longitud completa para el homólogo murino de PLACE6002312. Se insertó el cADN de longitud completa en el vector de clonación pCR®2.1-TOPO, y se analizó la secuencia nucleotídica de longitud completa mediante el método de terminador dideoxi. La secuencia determinada se muestra en SEQ ID NO: 19.
Esta secuencia consta de 1237 nucleótidos, y contiene un marco abierto de lectura de 990 nucleótidos. La secuencia de aminoácidos deducida del marco abierto de lectura (329 aminoácidos) se muestra en SEQ ID NO: 20. La secuencia de aminoácidos deducida contiene regiones hidrófobas que se estiman como los siete dominios transmembranales característicos de receptor acoplado a proteína G. La secuencia tiene 82% de homología a nivel de nucleótidos y 82% a nivel de aminoácidos con PLACE60023. En la Figura 8 se muestra una alineación de PLACE6002312 y su secuencia aminoácidos homóloga. Estos hallazgos demuestran que el gen es el homólogo murino de PLACE6002312.
Aplicabilidad industrial
Se proporcionan nuevos receptores acoplados a proteína G que se fijan a histamina, polinucleótidos que codifican los polipéptidos, vectores que contienen los polinucleótidos, células anfitrionas que contienen los vectores, y un método para producir los polipéptidos. También se proporciona un método de escrutinio en busca de compuestos que modifiquen la actividad de los polipéptidos. Se espera que los polipéptidos y polinucleótidos aquí descritos, y los compuestos que modifican la actividad de polipéptidos aquí descritos, sean empleados para desarrollar nuevos agentes profilácticos y terapéuticos para enfermedades en las cuales estén implicados los receptores de histamina aquí descritos. Además, se proporciona un método para determinar si una enfermedad determinada está causada por mutaciones en genes que codifican polipéptidos aquí descritos y mutaciones en las regiones flanqueadoras de la secuencia genómica de los genes y, por tanto, se espera que se utilicen en el diagnóstico génico.
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<110> Helix Research Institute
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<120> Nuevos receptores PLACE6002312 acoplados a proteína G y genes que los codifican, y su producción y uso.
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<130> H1-A01O1P
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<140>
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<141>
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<150> JP 2001-127836
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<151> 25-04-2001
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<160> 20
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 1869
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (735)..(1727)
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<400> 1
1
2
3
4 
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<210> 2
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<211> 330
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
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5
6
60 
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<210> 3
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<211> 30
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<212> ARN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia enlazadora de oligo sintetizada artificialmente
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<400> 3
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7 
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<210> 4
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<211> 42
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador adaptador de oligo dT sintetizada artificialmente
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<400> 4
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\hskip1cm
8 
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<210> 5
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
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<400> 5
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9 
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<210> 6
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<211> 42
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
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<400> 6
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10 
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<210> 7
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<211> 990
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 7
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11 
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<210> 8
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<211> 26
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
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12 
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
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<400> 9
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\hskip1cm
13 
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<211> 528
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 10
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14 
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<210> 11
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
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<400> 11
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15 
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<210> 12
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<211> 32
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
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<400> 12
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\hskip1cm
16 
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<210> 13
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<211> 24
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
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<400> 13
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\hskip1cm
17 
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<210> 14
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<211> 23
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
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<400> 14
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\hskip1cm
18 
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<211> 25
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
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<400> 15
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\hskip1cm
19 
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<210> 16
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
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<400> 16
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\hskip1cm
20 
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<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
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<400> 17
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\hskip1cm
21 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
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<400> 18
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\hskip1cm
22 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1237
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (131)..(1120)
\newpage
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<400> 19
23
24
25 
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<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 329
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
26
27

Claims (1)

1. Uso in vitro de un polipéptido codificado por un polinucleótido seleccionado de uno cualquiera de (a) hasta (d):
(a)
un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;
(b)
un polinucleótido que comprende una región codificadora de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1;
(c)
un polinucleótido que se hibrida a un ADN que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 en una condición restrictiva;
(d)
un polinucleótido que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;
como receptor que se fija a histamina.
ES02720601T 2001-04-25 2002-04-25 Receptores acoplado a proteina que se une a trifosfato de guanosina place 6002312 y su gen y produccion y uso del mismo. Expired - Lifetime ES2311601T3 (es)

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JP2001127836 2001-04-25

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