DE69833316T2

DE69833316T2 - Verwendung von ulip proteinen zur diagnose und therapie von krebs und paraneoplastischen neurologischen syndromen

Info

Publication number: DE69833316T2
Application number: DE69833316T
Authority: DE
Inventors: MichΠle AGUERA; Marie-Franυoise BELIN; Jωrρme HONNORAT; Pappachan Columbus KOLATTUKUDY; Tam Than QUACH; Tamara Byk; Andrω SOBEL; Dominique Aunis; Jean-Christophe Antoine
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1997-02-19
Filing date: 1998-02-19
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2018-02-20
Also published as: WO1998037192A1; EP0980427A1; DE69833316D1; FR2759701A1; ATE316574T1; FR2759701B1; JP2001512971A; US20070117166A1; ES2257804T3; US7183400B1; EP0980427B1

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von als ULIP/POP bezeichneten Proteinen zur Diagnostik und Therapie von Krebserkrankungen und paraneoplastischen neurologischen Syndromen.
Paraneoplastische neurologische Syndrome (PNS) treten gelegentlich plötzlich bei einer Krebserkrankung auf, oft vor deren Entdeckung, und stehen weder mit der Tumorproliferation selbst (direktes Übergreifen, Metastasen) noch mit der Therapie in Zusammenhang. Ihre Häufigkeit wird allgemein auf etwa 1 % der Krebserkrankungen geschätzt. Tatsächlich werden seit langem zahlreiche klinische Krankheitsbilder (Enzephalomyelitis, sensorische Denny-Brown-Neuropathie, zerebellare Atrophie, limbische Enzephalitis, Opsoklonus, ...) entsprechend der entweder effektiven oder bevorzugten Schädigung bestimmter Gruppen von Neuronen individualisiert. Die Häufigkeit von Entzündungszellen in der Nähe der Läsionen hatte bereits seit vielen Jahren die Möglichkeit eines autoimmunen oder viralen Prozesses hervorgerufen. Der kürzlich erfolgte Nachweis von Autoantikörpern im Serum und in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (Liquor cerebrospinalis) von an PNS leidenden Patienten, die spezifisch für den Tumortyp und für den Typ der degenerierten Neuronen waren, hat die Hypothese einer Beteiligung der Autoimmunität an der Entstehung dieser Pathologie wiederbelebt (Graus et al., 1985; Greenlee et al., 1983).
Neben dem Vorliegen eines erhöhten Titers dieser Antikörper im Blut und im Liquor der Patienten gibt es mehrere Argumente, die nahe legen, dass die PNS auf Autoimmunmechanismen hindeuten. So sind die Antigene, die im zentralen Nervensystem erkannt werden, auch in den Tumoren der Patienten vorhanden (Anderson et al., 1987). Im Inneren des Tumorgewebes findet man Antikörper, die spezifisch gegen diese Antigene gerichtet sind, sowie B- und T-Lymphozyten (Hetzel et al., 1990).
Diese Daten legen nahe, dass der Autoimmunvorgang durch die Expression von Tumorantigenen ausgelöst wird. Ein Kreuzimmunitätsprozess führt zu den Läsionen des zentralen Nervensystems. Weitere Argumente deuten ferner darauf hin, dass die zerebralen Läsionen durch die Autoimmunantwort entstehen. So ist im Gehirn der Patienten der Titer der spezifischen Antikörper höher als derjenige im Serum und im Liquor (Dalmau et al., 1991). Außerdem gibt es bei Enzephalomyeliten, die mit Anti-Hu-Antikörpern einhergehen, eine intensive lymphozytäre Reaktion, die aus B- und T-Zellen besteht, die sich in der Nähe von Neuronen befinden, die gerade zerstört werden (Dalmau et al., 1991; Graus et al., 1990).
Mehrere Typen von Autoantikörpern, die eine genaue Eingruppierung der Syndrome in Abhängigkeit von immunologischen, neurologischen und karzinologischen Kriterien ermöglichen, sind beschrieben worden.
So findet man die Anti-Yo-Antikörper im Serum und im Liquor von Frauen, die eine paraneoplastische zerebellare Atrophie und einen gynäkologischen Krebs (Ovar, Brust oder Uterus) aufweisen (Greenlee et al., 1983; Jaeckle et al., 1985).
Diese Antikörper erkennen zwei cytoplasmatische Proteine von 34 und 62 kDa, die für die Purkinje-Zellen des Kleinhirns spezifisch sind.
Die Anti-Ri-Antikörper findet man im Serum und im Liquor von Patienten (hauptsächlich Frauen), die einen Opso-Myoklonus, ein zerebellares Syndrom oder einen Brustkrebs aufweisen. Diese Antikörper erkennen zwei spezifische Proteine von 50 und 80 kDa der Neuronen des zentralen Nervensystems (Luque et al., 1991).
Die Anti-Hu-Antikörper werden im Verlauf der PNS am häufigsten gefunden. Man findet sie im Serum und im Liquor von Patienten, die ein Denny-Brown-Syndrom oder eine Enzephalomyeloneuropathie oder einen kleinzelligen Lungenkrebs aufweisen (Graus et al., 1985; Dalmau et al., 1992). Diese Autoantikörper erkennen mehrere Proteine von 37 bis 45 kDa, die spezifisch durch die Gesamtheit der Neuronen des Nervensystems exprimiert werden.
Vor kurzem wurde in Patienten, die an einem PNS aufwiesen, ein weiterer Autoantikörpertyp identifiziert: Anti-CV2-Antikörper (Antoine et al., 1993; Honnorat et al., 1996). Diese sind dahingehend atypisch, dass das im Erwachsenenalter erkannte Zielantigen im Wesentlichen nicht-neuronal ist, obwohl die Post-mortem-Analyse des Gehirns von vier Patienten die Bestätigung eines neuronalen Schwunds, einer Gliose und eines für PNS charakteristischen Entzündungsprozesses gestattete.
Die Einzigartigkeit der Entdeckung dieser Autoantikörper liegt einerseits in ihrem Nachweis. Sie waren sämtlichen üblichen Untersuchungen entgangen, welche die Aufdeckung der erkannten Antigene mittels Immunhistochemie im Gehirn post mortem umfasst.
Tatsächlich ist das erkannte Antigen löslich und verschwindet unter dem Großteil der Fixierungsbedingungen post mortem aus dem Gehirn. Nur durch eine Post-mortem-Fixierung des Gewebes mittels Eintauchen in Paraformaldehyd oder in situ mittels Perfusion von Paraformaldehyd beim Tier war es möglich, das Vorliegen dieser Antikörper im Liquor oder im Serum der von PNS betroffenen Patienten nachzuweisen (Antoine et al., 1993; Honnorat et al., 1996).
Die Anti-CV2-Autoantikörper, die im Serum von Patienten vorliegen, die an paraneoplastischem neurologischem Syndrom (PNS) leiden, wurden mittels indirekter Immunhistochemie anhand ihrer Fähigkeit definiert, ein cytoplasmatisches Antigen zu erkennen, das im Gehirn adulter Ratten von einer Subpopulation von Oligodendrozyten des Hirnstammes, des Rückenmarks und des Kleinhirns spezifisch exprimiert wird.
Die Einzigartigkeit dieser Autoantikörper liegt andererseits in ihrer diagnostischen Bedeutung. Ihr Vorhandensein im Serum oder im Liquor von Patienten ist von diagnostischem Wert, weil dadurch der paraneoplastische Ursprung eines neurologischen Syndroms genauer bestimmt werden kann. Die Entdeckung dieser Antikörper, wenn sie einem Krebs vorausgeht, dirigiert die Suche nach diesem und gestattet seine Entdeckung. Dies war für sechs von 19 Patienten mit Anti-CV2-Antikörpern der Fall. Die klinischen Beschwerden waren je nach den Patienten unterschiedlich, manche zeigten das Krankheitsbild einer limbischen Enzephalitis, andere eine Enzephalomyeloneuropathie und noch andere ein Lambert-Eaton-Syndrom. Dennoch herrschte bei mehr als 60% der Fälle das zerebellare Syndrom vor. Der am häufigsten damit einhergehende Tumor war kleinzelliger Lungenkrebs (60% der Fälle).
Experimente an den Gehirnen neugeborener Ratten haben gezeigt, dass die Anti-CV2-Antikörper mit einem Protein von 66 kDa reagieren (Honnorat et al., 1996).
Dieses Antigen befindet sich im adulten Gehirn in einer Subpopulation von Oligodendrozyten oder in Zellen, die im adulten Gehirn eine Differenzierungsfähigkeit beibehalten (Bulbus olfactorius, Gyrus dentatus). Das erkannte Antigen spielt eine Rolle beim neuronalen Überleben über Neuron-Oligodendrozyten-Wechselwirkungen, wie es der Schwund von Neuronen nahe legt, der post mortem im Gehirn von PNS betroffener Patienten beobachtet wird.
Seine im Erwachsenenalter sehr beschränkte Expression kontrastiert mit einer sehr starken und vorübergehenden Expression im zentralen und peripheren Nervensystem in der Entwicklung, was auf die mögliche Rolle dieses Antigens bei der Entwicklung des Nervensystems hindeutet.
Die Anmelderin hat das Zielantigen des Anti-CV2-Autiantikörpers charakterisiert, das einem im Folgenden als "POP-66" für "paraneoplastisches Oligodendrozyten-Protein 66 kDa" bezeichneten Protein entspricht.
Es ist überraschenderweise entdeckt worden, dass das Protein POP-66 zur Familie der so genannten ULIP-Proteine (für "Unc-33-like phosphoprotein") gehört, die bei der Kontrolle der neuronalen Entwicklung und des axonalen Transports impliziert werden (T. Byk et al., 1996) und die man auch in Form der Proteine CRMP (Goshima et al., 1995, Wang etail., 1996), TOAD-64 (Minturn et al., 1995) und DRPs (Hamajima et al., 1996) untersucht hat. Genauer gesagt, wurde tatsächlich festgestellt, dass es sich bei POP-66 um die humane Form von ULIP-4 handelt.
Die Gesamtheit der nachstehend beschriebenen Daten bestätigt die Komplexität dieser Proteinfamilie, das Vorliegen eines sehr großen Expressionsspektrums von Mitgliedern dieser Familie im Gehirn im Verlauf der Ontogenese, jedoch sehr beschränkt beim Erwachsenen, sowie der Spezifität der Anti-CV2-Antikörper für ein Mitglied dieser ULIP-Proteinfamilie, nämlich POP-66.
Somit hat die Anmelderin gezeigt, dass das von den Anti-CV2-Antikörpern erkannte Protein von Patienten, die an PNS leiden, POP-66/ULIP-4 ist, und hat eine Implikation von ULIP-Proteinen bei den paraneoplastischen neurologischen Syndromen und den damit einhergehenden Krebserkrankungen festgestellt. Außer ihrer Rolle bei den mit PNS einhergehenden Krebserkrankungen, hat die Anmelderin ferner entdeckt, dass die Proteine der ULIP-Familie eine Rolle bei jeder anderen Form von Krebs, die nicht mit PNS zusammenhängt, spielen können. Genauer gesagt, werden die ULIP-Proteine insbesondere bei Krebserkrankungen von Geweben impliziert, die einen mit dem zentralen Nervensystem gemeinsamen embryonalen Ursprung besitzen.
Somit ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein gereinigtes ULIP-Polypeptid, ein Derivat oder ein Polypeptidfragment dieses gereinigten Polypeptids, umfassend eine Aminosäuresequenz SEQ. ID. NR. 8.
Vorzugsweise ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein gereinigtes Polypeptid, ein biologisch aktives Derivat oder ein Polypeptidfragment des gereinigten Polypeptids, umfassend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NR. 8, wobei das Polypeptid als "POP-66/ULIP-4" bezeichnet wird.
Ein Polypeptid der Sequenz SEQ. ID. NR. 8 von Interesse ist insbesondere das antigene Fragement PARASCPGKIS (Aminosäuren Nr. 517 bis Nr. 527).
Bei der Beschreibung der Erfindung werden die folgenden Definitionen verwendet:

– Derivat: jede Polypeptidvariante des Polypeptids mit der Sequenz SEQ. ID. NR. 8 oder jedes andere Molekül, das aus einer genetischen und/oder chemischen Modifikation der Sequenz SEQ. ID. NR. 8 hervorgeht, d.h. das erhalten wird durch Mutation, Deletion, Addition, Substitution und/oder chemische Modifikation einer einzelnen oder einer beschränkten Anzahl von Aminosäuren, sowie jede isoforme Sequenz, d.h. eine Sequenz, die zur Sequenz SEQ. ID. NR. 8, zu einem ihrer Fragmente oder modifizierten Sequenzen identisch ist und die eine oder mehrere Aminosäuren in Form des D-Enantioners enthält, wobei diese modifizierten oder isoformen Sequenzvarianten mindestens eine der Eigenschaften beibehalten, die sie biologisch aktiv machen.

Biologisch aktiv: besitzt die Eigenschaften der Induktion und/oder der Kontrolle der neuronalen Entwicklung und/oder antigene Eigenschaften.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine isolierte Nucleinsäuresequenz SEQ. ID. NR. 7 oder eine von der Sequenz SEQ. ID. NR. 7 auf grund der Degeneration des genetischen Codes oder durch Mutation, Deletion oder Insertion von mindestens einem Nucleotid abstammende Sequenz, wobei diese Sequenzderivate eine biologische Aktivität besitzen, die zu derjenigen des durch die Sequenz SEQ. ID. NR. 7 codierten Peptids praktisch identisch ist.
Die verschiedenen erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen können künstlichen Ursprungs sein oder nicht. Es kann sich um DNA- oder RNA-Sequenzen handeln, die durch Screening von Sequenzbanken mithilfe von Sonden erhalten werden, die auf Basis der Sequenz SEQ. ID. NR. 8 erstellt wurden. Derartige Banken können durch herkömmliche molekularbiologische Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen können auch durch chemische Synthese oder auch durch gemischte Verfahren hergestellt werden, welche die chemische oder enzymatische Modifikation der durch Screening der Banken erhaltenen Sequenzen beinhalten.
Diese Nucleotidsequenzen gestatten die Herstellung von Nucleotidsonden, die mit einer Sequenz von Nucleinsäuren, von einer genomischen DNA oder von einer Boten-RNA, die für ein erfindungsgemäßes Peptid oder ein biologisch aktives Fragment von diesem codiert, stark und spezifisch hybridisieren können. Die geeigneten Hybridisierungsbedingungen entsprechen den üblicherweise vom Fachmann eingesetzten Temperatur- und Ionenstärkebedingungen (Sambrook et al., 1989), vorzugsweise Temperaturbedingungen zwischen (T_m minus 5°C) und (T_m minus 30°C) und ferner vorzugsweise Temperaturbedingungen zwischen (T_m minus 5°C) und (T_m minus 10°C) (hohe Stringenz). Dabei ist Tm die theoretische Schmelztemperatur, die als die Temperatur definiert ist, bei der sich 50% der gepaarten Stränge trennen. Derartige Sonden sind ebenfalls Teil der Erfindung. Sie können als Werkzeug zur In-vitro-Diagnose für den Nachweis spezifischer Transkripte der erfindungsgemäßen Polypeptide mittels Hybridisierungsexperimenten in biologischen Proben oder zum Nachweis aberranter Synthesen oder genetischer Anomalien verwendet werden, die durch einen Polymorphismus, Mutationen oder eine falsche Spleißung hervorgerufen werden.
Die erfindungsgemäßen Sonden weisen mindestens 10 Nucleotide auf und besitzen maximal die gesamte Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 oder ihres komplementären Stranges.
Die In-vitro-Diagnoseverfahren, bei denen diese Nucleotidsonden zum Nachweis von aberranten Synthesen oder genetischen Anomalien, wie dem Verlust von Heterozygotie und genetischer Umlagerung, auf Ebene der Nucleinsäuresequenzen, die ein erfindungsgemäßes ULIP-Polypeptid oder ein biologisch aktives Fragment codieren, verwendet werden, werden von der vorliegenden Erfindung umfasst. Ein derartiges Verfahren umfasst:

– In-Kontakt-Bringen einer erfindungsgemäßen Nucleotidsonde mit einer biologischen Probe unter solchen Bedingungen, dass die Bildung eines Hybridisierungskomplexes zwischen der Sonde und der obengenannten Nucleotidsequenz, gegebenenfalls nach einem vorherigen Amplifizierungsschritt der obengenannten Nucleotidsequenz, möglich ist;
– Nachweisen des gegebenenfalls gebildeten Hybridisierungskomplexes;
– gegebenenfalls Sequenzieren der Nucleotidsequenz, die den Hybridisierungskomplex mit der erfindungsgemäßen Sonde bildet.

Die erfindungsgemäßen cDNA-Sonden sind ferner vorteilhafterweise zum Nachweis von Chromosomenanomalien einsetzbar.
Die erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen eignen sich auch zur Herstellung und zur Verwendung von Sense- oder Antisense-Oligonucleotid-Primern für spezifische Sequenzierungs- oder Amplifizierungsreaktionen gemäß der so genannten PCR- (Polymerisationskettenreaktions-)Technik oder jeder anderen Variante davon.
Die erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen finden außerdem Anwendung auf therapeutischem Gebiet, zur Herstellung von Antisense-Sequenzen, die mit einer Nucleinsäuresequenz, einschließlich einer Boten-RNA, spezifisch hybridisieren können und in der Gentherapie einsetzbar sind. Aufgabe der Erfindung sind somit Antisense-Sequenzen, welche die Produktion eines erfindungsgemäßen Polypeptids, wie vorstehend definiert, zumindest teilweise hemmen können.
Sie sind insbesondere bei der Behandlung von Störungen des zentralen und peripheren Nervensystems und des Sehens, insbesondere zur Behandlung paraneoplastischer neurologischer Syndrome, sowie bei einer Antikrebsbehandlung, insbesondere von Tumoren, die mit paraneoplastischen neurologischen Syndromen einhergehen, einsetzbar.
Die erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen können außerdem zur Herstellung rekombinanter erfindungsgemäßer ULIP-Proteine verwendet werden.
Diese Proteine können ausgehend von den vorstehend definierten Nucleotidsequenzen gemäß Techniken zur Herstellung rekombinanter Produkte, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden. In diesem Fall wird die verwendete Nucleotidsequenz unter die Kontrolle von Signalen gestellt, die ihre Expression in der Wirtszelle gestatten.
Für ein effizientes System zur Produktion eines rekombinanten Proteins muss man über einen Vektor, der beispielsweise von einem Plasmid oder Virus stammt, und eine kompatible Wirtszelle verfügen.
Die Wirtszelle kann aus prokaryotischen, wie Bakterien, oder eukaryotischen Systemen, wie beispielsweise Hefen, Insektenzellen, CHO (Ovarzellen aus Chinesischem Streifenhamster), oder jedem anderen vorteilhafterweise verfügbaren System ausgewählt werden. Eine für die Expression der erfindungsgemäßen Proteine bevorzugte Wirtzelle ist das Bakterium E. coli.
Der Vektor muss einen Promoter, Translationsinitiations- und -terminationsignale sowie die geeigneten Regionen zur Regulation der Transkription tragen. Er muss stabil in der Zelle aufrechterhalten werden können und kann gegebenenfalls bestimmte Signale besitzen, welche die Sekretion des translatierten Proteins festlegen.
Diese verschiedenen Kontrollsignale werden in Abhängigkeit von der verwendeten Wirtzelle ausgewählt. Dazu können die erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen in Vektoren, die sich in dem gewählten Wirt autonom replizieren können, oder in Vektoren, die in den gewählten Wirt integrieren, eingebracht werden. Derartige Vektoren werden gemäß zurzeit vom Fachmann verwendeter Verfahren hergestellt, und die daraus erhaltenen Klone können durch Standardverfahren, wie beispielsweise Elektroporation, in einen geeigneten Wirt eingebracht werden.
Die Erfindung zielt ferner auf die mit den vorstehenden Vektoren transfizierten Wirtszellen. Diese Zellen können durch Einbringen einer Nucleotidsequenz, die in einen Vektor, wie vorstehend definiert, inseriert worden ist, in Wirtszellen und anschließendes Züchten dieser Zellen unter solchen Bedingungen, dass die Replikation und/oder Expression der transfizierten Nucleotidsequenz möglich ist, erhalten werden.
Diese Zellen sind bei einem Verfahren zur Produktion eines rekombinanten erfindungsgemäßen Polypeptids oder jedes biologisch aktiven Fragments oder Derivats davon einsetzbar.
Das Verfahren zur Produktion eines erfindungsgemäßen Polypeptids in rekombinanter Form selbst wird von der vorliegenden Erfindung umfasst und ist dadurch gekennzeichnet, dass die transfizierten Zellen unter solchen Bedingungen gezüchtet werden, dass die Expression eines rekombinanten erfindungsgemäßen Polypeptids oder jedes biologisch aktiven Fragments oder Derivats davon möglich ist, und dass das rekombinante Polypeptid gewonnen wird.
Die verwendeten Reinigungsverfahren sind dem Fachmann bekannt. Das rekombinante Polypeptid kann aus Zelllysaten und -extrakten, aus dem Überstand des Kulturmediums durch Verfahren gereinigt werden, die getrennt oder in Kombination verwendet wer den, wie Fraktionierung, Chromatographieverfahren, Immunaffinitätstechniken mithilfe mono- oder polyklonaler spezifischer Antikörper usw.
Bei einer Variante wird ein rekombinantes Polypeptid, fusioniert an ein "Träger" protein, (chimäres Protein) hergestellt. Der Vorteil dieses Systems ist, dass es eine Stabilisierung und eine Verringerung der Proteolyse des rekombinanten Produkts, eine Erhöhung der Löslichkeit im Verlauf der In-vitro-Renaturierung und/oder eine Vereinfachung der Reinigung gestattet, wenn der Fusionspartner eine Affinität zu einem spezifischen Liganden besitzt.
Die Nutzung der ULIP-Proteine und insbesondere von POP-66/ULIP-4 sowie der gegen diese Proteine gerichteten Antikörper ist auf verschiedenen Gebieten vielversprechend.
So wird zurzeit der Nachweis des Anti-CV2-Autoantikörpers durch Immunfluoreszenz am fixierten Tiergehirn als diagnostischer Test verwendet.
Die Produktion des rekombinanten erfindungsgemäßen POP-66/ULIP4-Proteins gestattet die Herstellung eines schnellen und zuverlässigen Tests (des Typs Elisa oder Westernblot) zum Nachweis der Anti-CV2-Antikörper.
Derartige Tests gibt es bereits für die Anti-Hu-, Anit-Yo- und Anti-Ri-Antikörper. Der Test zum Nachweis von Anti-CV2-Antikörpern im Serum von Patienten kann im Fall eines Verdachts auf ein paraneoplastisches neurologisches Syndrom vorgeschrieben werden und umfasst folglich die Anti-CV2-Antikörper im gleichen Titer wie die vorstehend genannten anderen Antikörper, die bei PNS identifiziert wurden.
Die Erfindung zielt somit auch auf ein Verfahren zur Diagnose paraneoplastischer neurologischer Syndrome und/oder zur frühzeitigen Diagnostik der Bildung von Tumoren kanzerösen Ursprungs, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man in einer von einem Individuum entnommenen Blutprobe Autoantikörper, die gegen ein POP-66/ULIP-4-Protein gerichtet sind, nachweist durch

– In-Kontakt-Bringen einer von einem Individuum entnommenen Blutprobe mit einem gereinigten Polypeptid (POP-66), einem biologisch aktiven Derivat oder Polypeptidfragment von POP-66/ULIP-4, das gegebenenfalls an einem Träger fixiert ist, unter solchen Bedingungen, dass die Bildung spezifischer Immunkomplexe zwischen dem Poly peptid und den gegebenenfalls in der Serumprobe vorhandenen Autoantikörpern möglich ist, und
– Nachweisen der gegebenenfalls gebildeten spezifischen Immunkomplexe.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit zur Diagnose paraneoplastischer neurologischer Syndrome und zur frühzeitigen Diagnose der Bildung von Tumoren ausgehend von einer biologischen Probe, umfassend:
mindestens ein gereinigtes POP-66/ULIP-4-Polypeptid, ein biologisch aktives Derivat oder Polypeptidfragment von POP-66/ULIP-4, das gegebenenfalls an einem Träger fixiert ist,

– Mittel zum Nachweis der Bildung spezifischer Antigen/Antikörper-Komplexe zwischen einem Anti-POP-66-Autoantikörper und dem gereinigten POP-66-Polypeptid, Derivat oder Polypeptidfragment und/oder Mittel zur Quantifizierung dieser Komplexe.

Gegenstand der Erfindung sind auch die monoklonalen Antikörper oder ihre Fab- oder F(ab')2-Fragmente oder Immunkonjugate, die gegen ein gereinigtes ULIP-Polypeptid, das eine Aminsäuresequenz SEQ ID Nr. 8 umfasst, ein biologisch aktives Derivat oder Polypeptidfragment von ULIP gerichtet sind, und ihre Verwendung zur Reinigung oder zum Nachweis eines ULIP-Proteins in einer biologischen Probe.
Polyklonale Antikörper können aus dem Serum eines Tieres, das gegen das Protein, das beispielsweise durch genetische Rekombination gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren produziert wurde, immunisiert wird, gemäß üblichen Arbeitsverfahren erhalten werden.
Die monoklonalen Antikörper können gemäß dem von Köhler und Milstein beschriebenen, herkömmlichen Verfahren zur Züchtung von Hybridomen erhalten werden. Die Antikörper können humanisierte Antikörper, Fab- und F(ab')2-Fragmente sein.
Sie können auch in Form von Immunkonjugaten oder markierten Antikörpern vorliegen. So werden die Antikörper, die gegen ein Protein aus der ULIP-Familie gerichtet sind, zum Nachweis einer anomalen Expression des ULIP-Proteins bei Patienten verwendet, die neurologische Syndrome aufweisen und bei denen durch herkömmliche Verfahren kein Krebs diagnostiziert wurde. Diese anomale Expression des ULIP-Proteins kann mit dem Vorliegen einer unentdeckten Krebserkrankung korreliert werden. Somit werden die gegen ein ULIP-Protein, insbesondere gegen POP-66/ULIP-4, gerichteten Antikörper zur frühzeitigen Diagnose einer Krebserkrankung eingesetzt.
Ein Verfahren zur Bestimmung einer Allelvariabilität, einer Mutation, einer Deletion, einer Insertion, eines Heterozygotieverlusts oder einer genetischen Anomalie des POP-66/ULIP-4-Gens, das sich auf Chromosom 10 in der Region 26q befindet, die an Pathologien beteiligt sein können, verwendet mindestens eine Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 7. Unter den Verfahren zur Bestimmung einer Allelvariabilität, einer Mutation, einer Deletion, einer Insertion, eines Heterozygotieverlusts oder einer genetischen Anomalie des POP-66/ULIP-4-Gens ist ein Verfahren bevorzugt, das Folgendes umfasst: mindestens einen Schritt der Amplifizierung der POP-66/ULIP-4-Nucleinsäuresequenz, die einen Polymorphismus, eine Mutation, eine Deletion oder eine Insertion aufweisen kann, durch PCR mithilfe eines Primer-Paars von Nucleotidsequenzen, einen Schritt, bei dem die amplifizierten Produkte mit geeigneten Restriktionsenzymen behandelt werden, und einen Schritt, bei dein mindestens eines der Produkte der enzymatischen Reaktion nachgewiesen oder quantifiziert wird.
Vorteilhafterweise kann man die mit Chromosom 10 verbundenen Mutationen in Bezug auf den Krebs untersuchen, insbesondere beispielsweise die peripheren kanzerösen Tumoren und zerebralen Primärtumoren glialen Ursprungs.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens ein gereinigtes POP-66-Protein, ein biologisch aktives Polypeptidfragment oder Derivat davon, eine Nucleotidsequenz oder ein Nucleotidsequenzfragment, die für das Protein codiert, eine Antisense-Sequenz, die in der Lage ist, spezifisch mit einer für das Protein codierenden Nucleotidsequenz zu hybridisieren, oder einen gegen das Protein gerichteten Antikörper in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel umfasst.
Vorzugsweise umfasst die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Wirkstoff ein gereinigtes POP-66-Polypeptid, ein Derivat oder Polypeptidfragment von POP-66, vorzugsweise in löslicher Form, in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel umfassen.
Solche Zusammensetzungen bieten einen neuen Ansatz zur Behandlung von Störungen des zentralen und peripheren Nervensystems und des Sehens und insbesondere von paraneoplastischen neurologischen Syndromen. Außerdem können sie zur Behandlung neurologischer Störungen in Verbindung mit einem neuronalen Schwund und/oder einer Unterexpression der ULIP-Proteine im Nervensystem eingesetzt werden.
So ist POP-66/ULIP-4 auch bei neurodegenerativen Pathologien beteiligt, wie multisystemischen Atrophien, die ähnliche Störungen wie PNS sind und bei denen einen Anomalie einer Oligodendrozyten-Subpopulation nachgewiesen wurde (Pappet al., 1992).
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden ferner zur Antikrebstherapie eingesetzt.
Die Antikörper, die gegen ein oder mehrere ULIP-Proteine gerichtet sind, können an antineoplastische Mittel gebunden werden, so dass ein Screening nach Medikamenten gegen Tumorzellen möglich ist.
Sie können außerdem an eine hydrophile chemische Gruppe gebunden werden, die je nach dem Tumortyp des derart ausgewählt wird, dass sie die Blut-Hirn-Schranke überquert oder nicht.
Die ULIP-Proteine und insbesondere POP-66 sowie die Nucleotidsequenzen, die für diese Proteine codieren, und die Antisense-Sequenzen oder -Oligonucleotide, können zur Therapie jedes Krebstyps eingesetzt werden, bei dem ein Gen, das ein ULIP-Protein codiert, impliziert wird. Unter den Beispielen für Krebserkrankungen kann man periphere Tumoren, wie kleinzelligen Lungenkrebs, Thymom, Brust- und Ovarkrebs, sowie zerebrale Tumoren, vorzugsweise zerebrale Primärtumoren glialen Ursprungs, nennen. Die Expression von POP-66 in den nicht-proliferierenden Zellen des normalen Gehirns, sein Fehlen in normalen Geweben, wie beispielsweise Lunge oder Thymus, seine erneute differenzielle Expression während der Tumorigenese dieser Gewebe und die Modulation seiner Expression in einer Tumorlinie im Verlauf der Differenzierung legen in dieser Hinsicht nahe, dass POP-66 ein Tumorsuppressorgen sein kann.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können vorzugsweise auf systemischem Weg, bevorzugt auf intravenösem, intramuskulärem, intradermischem oder oralem Weg, verabreicht werden.
Ihre Verabreichungsweisen, Posologien und optimalen galenischen Formen können gemäß den Kriterien bestimmt werden, die allgemein bei der Etablierung einer an einen Patienten angepassten therapeutischen Behandlung in Betracht gezogen werden, wie bei spielsweise dem Alter oder dem Körpergewicht des Patienten, der Schwere seines allgemeinen Zustands, der Toleranz der Behandlung und den festgestellten Nebenwirkungen usw.
Ein gereinigtes Protein aus der ULIP-Familie, ein biologisch aktives Polypeptidfragment oder Derivat davon, eine Nucleotidsequenz oder ein Nucleotidsequenzfragment, die für das Protein codiert, eine Antisense-Sequenz, die spezifisch mit einer für das Protein codierenden Nucleotidsequenz hybridisieren kann, oder ein gegen das Protein gerichteter Antikörper in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel können zur Herstellung eines Medikaments verwendet werden, das zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen und Neoplasmen bestimmt ist.
Ein Verfahren zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen und Neoplasmen beinhaltet die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines gereinigten Proteins aus der ULIP-Familie, eines biologisch aktiven Polypeptidfragments oder Derivats davon, einer Nucleotidsequenz oder eines Nucleotidsequenzfragments, die für das Protein codiert, einer Antisense-Sequenz, die spezifisch mit einer für das Protein codierenden Nucleotidsequenz hybridisieren kann, oder eines gegen das Protein gerichteten Antikörpers in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel an ein Individuum, das eine derartige Behandlung benötigt.
Die Beispiele und die Figuren, deren Legenden nachstehend dargestellt sind, werden zur Veranschaulichung gegeben.
FIGURLEGENDEN
1 zeigt ein zweidimensionales Elektrophoreseprofil, das ausgehend von an POP-66 angereicherten Gehirnproteinextrakten aus neugeborenen Ratten erhalten wurde.
A: Silberfärbung der Gesamtproteine.
B: Immunologischer Nachweis mit dem Anti-CV2-Serum von Patienten.
Die Pfeile deuten auf die POP-66 entsprechenden Flecken, die mit den Anti-CV2-Antikörpern sichtbar gemacht wurden.
2 zeigt ein zweidimensionales Elektrophoreseprofil, das ausgehend von Proteinextrakten aus Gehirnen neugeborener Ratten erhalten wurde.
Immunologischer Nachweis mit A – Antipeptid-3-Antikörper und B – Anti-CV2-Antikörper.
3 zeigt ein zweidimensionales Elektrophoreseprofil, das ausgehend von Proteinextrakten aus Gehirnen neugeborener Ratten erhalten wurde.
Immunologischer Nachweis mit a: Präimmunserum für Peptid 3.
Immunologischer Nachweis mit b: Anti-Peptid-3-Serum.
Immunologischer Nachweis mit c: Anti-Peptid-4-Serum.
Immunologischer Nachweis mit d: Präimmunserum für Peptid 4.
4 zeigt eine immunhistochemische Markierung von Gehirnschnitten adulter Ratten mit
A: Anti-CV2-Serum aus einem an PNS leidenden Patienten
B: Kaninchenserum mit Anti-Peptid-3-Antikörpern
C: Kaninchenserum mit Anti-Peptid-4-Antikörpern.
5 zeigt eine histologische Markierung von Kleinhirnschnitten junger Ratten 8 Tage postnatal.
A: Färbung mit Toluidinblau; ge = äußere granuläre Schicht, m = molekulare Schicht (× 400).
B: Immunmarkierung nach Einbau von BrdU (Bromdesoxyuridin). Die Zellen, in denen BrdU eingebaut wurde, befinden sich praktisch alle in der äußersten Zone der äußeren granulären Schicht (ge). Einige positive Zellen befinden sich in der inneren granulären Schicht (× 400).
C: Indirekte Immunperoxidasefärbung mit einem Patientenserum, das Anti-CV2-Antikörper enthält, (× 400). Die Immunreaktivität konzentriert sich auf den inneren Abschnitt der äußeren granulären Schicht (zukünftige molekulare Schicht (m)). Einige Zellen in der inneren granulären Schicht sind immunreaktiv. Die Purkinje-Zellen (p) sowie die Zellen des äußeren Abschnitts der äußeren granulären Schicht (ge) sind negativ.
D: Indirekte Immunperoxidasefärbung mit einem Patientenserum, das Anti-CV2-Antikörper enthält, (× 1000). Die Immunmarkierung konzentriert sich vorwiegend auf den inneren Abschnitt der äußeren granulären Schicht (zukünftige molekulare Schicht (m)). Man bemerkt eine reaktive Zelle in der inneren granulären Schicht (gi) (Pfeil).
6 zeigt eine immunhistochemische Markierung humaner Hippocampusschnitte post mortem (HPS-Färbung).
A: Gehirn eines Referenzpatienten,
B: Gehirn eines Patienten mit limbischer Enzephalitis und zirkulierenden Anti-CV2-Antikörpern. Man kann das Verschwinden der granulären Zellen erkennen.
7 zeigt ein zweidimensionales Elektrophoreseprofil mit dem ULIP-2-Protein (A) als Kontrolle und dem Protein ULIP-4 (B).
7C zeigt das Muster des Wanderungsprofils der Proteine ULIP-1, -2, -3 und -4 als Referenz.
Die Proteine werden folgendermaßen nachgewiesen:

a) durch Autoradiographie, um die in vitro translatierten Proteine zu lokalisieren, (Translation);
b) durch immunologischen Nachweis mit Anti-CV2-Serum.

8 zeigt ein Wanderungsprofil der mRNA von mittels RT-PCR amplifiziertem und in verschiedenen Zelltypen exprimiertem C-22/ULIP-3 (8A) und TOAD-64/ULIP-2 (8B):
Spuren 1-3: kleinzelliger Lungenkrebs
Spur 2: kleinzelliger Lungenkrebs mit Anti-CV2-Serum
Spur 4: Kontroll-cDNA
Spur 5: durch HTLV1-Infektion behandeltes Medulloblastom
Spuren 6-7: Medulloblastom
Spur 8: C6-Gliazellenlinie der Maus
Spur 9: Kontrolle
Spur 10: leer
Spur 11: kb-Marker.
Die schwarzen Pfeile entsprechen POP-66, die weißen Pfeile entsprechen dem Molekulargewichtsmarker.
9 zeigt die Nucleotidsequenz von ULIP-2 bei der Maus (SEQ ID Nr. 1) sowie die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2).
10 zeigt die Nucleotidsequenz von ULIP-3 bei der Maus (SEQ ID Nr. 3) sowie die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 4).
11 zeigt die Nucleotidsequenz von ULIP-4 bei der Maus (SEQ ID Nr. 5) sowie die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 6).
12 zeigt die Nucleotidsequenz von ULIP-4 beim Menschen (SEQ ID Nr. 7) sowie die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 8).
Ein fehlerhaftes Stoppcodon in der humanen ULIP-4-Sequenz (Sternchen) ist aus einem Fehler der reversen Transkriptase bei der Herstellung der Bank hervorgegangen. Nach einem Vergleich mit ULIP-4 aus Ratte und Maus ist es fast sicher, dass die Sequenz TAG, die für einen Stopp codiert, tatsächlich ein AAG-Codon ist, das bei der Ratte und der Maus für ein Lysin codiert. Außerdem ist die Region um diese Aminosäure in den drei Spezies vollständig konserviert.
Die Aminosäuresequenz wurde in der SEQ ID Nr. 8 durch 15 Aminosäuren am C-Terminus (Nr. 554 bis Nr. 568) vervollständigt. Diese in 12 fehlende C-terminale Region ist zwischen ULIP-4 aus Ratte und Maus sowie zwischen den verschiedenen ULIP sehr gut konserviert.
BEISPIEL 1:
Reinigung von POP-66 und Sequenzierung
Die Reinigung von POP-66 erfolgt gemäß dem Material und den Verfahren, die in dem Artikel von Honnorat et al., 1996, beschrieben sind, ausgehend von Serum von Patienten, die an PNS leiden.
Zur Identifizierung des POP-66-Proteins wurde eine Reinigungsstrategie gewählt, die es gestattet, eine partielle Sequenzierung zu erhalten. Das Screening einer cDNA-Expressionsbank aus Gehirn oder die Reinigung der Proteins mittels Immunaffinität waren aufgrund der beschränkten Mengen an Serum in Verbindung mit dem Tod der Patienten ausgeschlossen. Dank der humanen Anti-CV2-Seren, die es gestatteten, jeden Reinigungsschritt zu verfolgen, konnte ein biochemisches Reinigungsverfahren ausgehend von Gehirnen neugeborener Ratten entwickelt werden.
Die Gewebe, die vor der Verwendung bei –70°C aufbewahrt wurden, wurden mit einer Lösung behandelt, die 0,2 M DTT (Dithiothreitol) (Sigma), 2% Ampholine 3-10 (Pharmacia), 2% Triton X-100 (Merck) enthielt, und nach 2-4°C überführt. Unmittelbar vor der Verwendung wurde fester Harnstoff (Pharmacia) zugegeben, so dass eine 8 M Lösung erhalten wurde.
Das Protein POP-66 ist zumindest teilweise löslich und wird bei einer Ammoniumsulfatkonzentration von 40% vollständig ausgefällt.
Durch Zentrifugation bei 100 000 × g und Fällung mit Ammoniumsulfat (wobei die Proteine beseitigt werden, die unterhalb von 20% und oberhalb von 40% Ammoniumsulfat ausfallen) werden an POP-66 angereicherte Proteinextrakte erhalten. Die Proteine dieses Extrakts werden dann nach Dialyse durch isolelektrische Fokussierung auf einem Agarosegel (Peltre et al., 1982) aufgetrennt.
Nach dem Transfer auf eine Membran erkennen die Anti-CV2-Antikörper mehrere Banden mit isoelektrischen Punkten zwischen 5,85 und 6,55. Diese Banden entsprechen in ihrer Gesamtheit dem durch die Anti-CV2-Antikörper erkannten POP-66-Protein. Das Spektrum legt die Möglichkeit von posttranskriptionalen Modifikationen (Phosphorylierungen und/oder Glycosylierungen) des Proteins nahe.
Aus dem Agarosegel wird die Zone der Proteine mit einem pI zwischen 5,85 und 6,55 und für eine neue elektrophoretische Wanderung in denaturierendem Medium auf einem Polyacrylamidgel verwendet, das zuvor mit einer Äquilibrierungslösung (0,05 mol/l Tris/HCl, pH 6,8, 6 M Harnstoff, 30% Glycerin, 1 % Gew./Vol. SDS für 2 × 10 Minuten) äquilibriert wird, zu der DTT (0,25% Gew./Vol.) und Bromphenolblau hinzugegeben werden.
Es wurden zwei Nachweisverfahren verwendet:
Silberfärbung. Unmittelbar nach dem Ende der Wanderung wird das Gel für 30 Minuten in eine Fixierlösung (40% Ethanol, 10% Essigsäure) eingetaucht; es wird anschließend für 30 Minuten oder über Nacht in eine Inkubationslösung (30% Ethanol, 7% Gew./Vol. Natriumacetat, 0,1 % Glutaraldehyd, 0,2% Gew./Vol. Natriumthiosulfat) überführt. Nach Waschen wird das Gel in eine Silberlösung (0,1 % Gew./Vol. Silbernitrat + Formaldehyd) überführt und entwickelt (2,5% Gew./Vol. Natriumcarbonat + Formaldehyd). Die Reaktion wird mit EDTA-Na₂ (1,5% Gew./Vol.) gestoppt. Die Gele werden in einer Glycerinlösung aufbewahrt.

– Transfer auf PVDF-Membran (Immobilon-PB^®, Millipore). Die aufgetrennten Proteine werden unter Verwendung von 100 mM CAPS-Puffer (Sigma), pH 11, auf eine PVDF-Membran geblottet. Die Blots werden für eine Stunde in TBS-Puffer (Trisgepufferter Salzlösung) mit 5% Casein (Milch) und 18 Stunden in TBS-Puffer (+ 1 % Casein), der den Antikörper (Anti-CV2-Serum 1/500) enthält, inkubiert. Nach Waschen mit TBS-Casein (15 Minuten) erfolgt die Entwicklung durch Inkubation der Blots für 1 1/2 Stunden mit biotinylierten Anti-IgG-Antikörpern (1/1000) und für 1 1/2 Stunden mit Streptavidin-Peroxidase-Komplex (1/2000). Die Blots werden anschließend mit DAB (0,06% Gew./Vol. Diaminobenzidin in 0,05 M Tris) und H₂O₂ (0,02 μg/ml) entwickelt.

Eine einzige Bande, die einem Protein von 66 kDa entspricht, ist sichtbar. Diese wird durch die Anti-CV2-Antikörper spezifisch markiert (1). Anschließend wurde nach tryptischem Verdau eine N-terminale Sequenzierung dieses Proteins durchgeführt.
Es wurden sieben Peptide erhalten, die die folgenden Sequenzen aufwiesen:
1 – X-Met-Tyr-Asp-Gly-Pro
2 – X-Phe-Asn-Leu-Tyr-Pro-Arg
3 – X-Val-Leu-Glu-Asp-Gly-Thr-Leu-His-Val-Thr-Glu-Gly
4 – X-Ile-Gly-X-X-Ala-Gln-Val-(His?)-Ala-Glu-Asn-Gly-X-Ile-Ile-Ala-Glu-Glu-Gln
5 – X-X-Glu-Asn-Gln-Phe-Val-Ala-Val-Thr
6 – X-Val-Asn-Asp-(Asp?)-Gln-Ser-Phe-Tyr-Ala-Asp-Ile-Tyr-Met-Glu-(Asp?)-(Gly?)-Leu-Ile
7 – X-X-X-Phe-Val-Thr-X-Pro-X-Leu-X-Pro
X: entspricht einer nicht bestimmten Aminosäure,
(?): entspricht einer möglichen, aber nicht sicheren Aminosäure.
Einer Analyse der 1994 verfügbaren Datenbanken zufolge entsprach kein bekanntes Protein diesen Sequenzen.
BEISPIEL 2:
Klonierung der cDNA für POP-66 oder verwandte Proteine
Die Klonierung der cDNA des POP-66-Proteins oder verwandter Proteine wurde unter Verwendung degenerierter Oligonucleotidsonden durchgeführt, die ausgehend von Fragmenten der folgenden zwei Peptide erhalten wurden:
Ile-Ile-Ala-Glu-Glu-Gln
Tyr-Ala-Asp-Ile-Tyr-Met-Glu-(Asp?)
Somit werden vier Sätze von degenerierten (Sense-/Antisense-)Oligonucleotid-Primern (AT(C/T)ATTGC(T/A)GA(A/G)CA; TG(C/T)TC(T/C)AC(T/A)GCAT(A/G)AT; TATGC(A/T)GA(C/T)AT(C/T)ATGGA; TCCAT(G/A)TA(G/A)CT(T/A)GCATA) festgelegt und für die PCR-Amplifikation eingesetzt.
Die Matrize wird in Form von doppelsträngiger cDNA (Promega-Kit) aus Poly(A⁺)-RNA hergestellt, die aus dem Gehirn von Ratten mit einem Alter von 10 Tagen (Zivic-Miller, USA) unter Verwendung des Fast-Track-mRNA-Isolationskits (Invitrogen) extrahiert wurde.
Die Bedingungen der PCR-Amplifikation sind wie folgt: 35 Zyklen bei 94°C, 1 Minute, zur Denaturierung, 55°C, 1 Minute, zur Hybridisierung und 72°C, zwei Minuten, zur Extension.
Die PCR-Produkte werden mittels Elektrophorese auf einem 1 %igen Agarosegel analysiert, elektroeluiert, in einen TA-Klonierungsvektor (Invitrogen) kloniert und unter Verwendung der Stellen für die Primer der T7- und SP6-Promotoren sequenziert.
Die von dem Klon MFB-17 abgeleitete Aminosäuresequenz stimmt mit den Sequenzen der beiden ursprünglichen Peptide von POP-66, die durch Analyse der Aminosäuresequenz bestimmt worden waren, überein.
Eine vergleichende Analyse der Nucleinsäuresequenzen unter Verwendung der Genbank- und EMBL-Datenbanken zeigt, dass MFB-17 eine partielle cDNA ist, deren Nucleotidsequenz identisch zu derjenigen eines Segments von TOAD-64, eines neuronalen Proteins aus Ratte (Minturn et al.,1995), ist.
Die von der TOAD-64-cDNA abgeleitete Aminosäuresequenz stimmt mit den Sequenzen der sieben Peptide, die durch partielle Sequenzanalyse des durch die Anti-CV2-Antikörper erkannten Proteins nach Reinigung mittels Elektrophorese bestimmt wurde, überein.
Das Molekulargewicht, der isoelektrische Punkt, das immunhistochemische Profil und die Regulation von TOAD-64 sind ähnlich wie diejenigen des POP-66-Antigens. Weil der Klon MFB-17 nicht die vollständige codierende Region aufwies, war es notwendig, ein intaktes rekombinantes Protein herzustellen, um die Untersuchungen im Hinblick auf das Protein CV2 durchzuführen.
Um ein vollständiges TOAD-64-Protein zu erhalten, wurde die ds-cDNA-Matrix aus Gehirnen von Ratten mit zwei Sätzen von Primern amplifiziert, die sich an den 5'- und 3'-Enden der codierenden Regionen befanden (Sense: GGCATATGTCTTATCAGGGGAAG; Antisense: GCGAATTCTTAGCCCAGGCTGATG).
Dieser Ansatz ermöglichte die Produktion zweier unterschiedlicher Klone, von denen der eine der TOAD-64-Sequenz und der andere einem als C-22 bezeichneten Klon entsprach.
BEISPIEL 3:
Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz von C-22 mit den ULIP-Proteinen
Die vom offenen Leserahmen abgeleitete Aminosäuresequenz zeigt, dass der Klon C-22 zur Superfamilie der ULIP-Gene gehört, die durch mehrere Gene mit EST-Sequenzen repräsentiert wird.
Die abgeleitete Aminosäuresequenz von C-22 zeigt eine Homologie von 30% mit der Aminosäuresequenz des Proteins unc-33 aus Caenorhabditis elegans.
Vor kurzem wurden vier verschiedene, zu dem Protein unc-33 homologe Gene bei Säugern und beim Huhn beschrieben.
Eine Analyse der Sequenzen durch die Genbank-Datenbanken und Proteinbanken gestattete es, eine Klassifikation für die unc-33-ähnlichen (unc-33-like) Proteine (ULIP) in vier verschiedene Subgruppen vorzuschlagen (Byk et al. 1996).
Weil jedoch die wirklichen Funktionen dieser Proteine nicht eindeutig aufgeklärt sind, beruht die vorgeschlagene Klassifizierung einfach auf der prozentualen Identität der Aminosäuren. ULIP-1 wird durch ein "unc-3-like" Phosphoprotein aus Maus repräsentiert, das eine Homologie von 76% mit TOAD-64, Crmp-62, und Munc, einer seit kurzem in Genbank verfügbaren Sequenz aus Maus, aufweist.
ULIP-2 setzt sich aus TOAD-64, Crmp-62 und Munc zusammen, die untereinander eine Identität von 97% der Aminosäuren zeigen.
Die partiellen humanen EST-Sequenzen, d.h. hcrmp-1, das eine Identität von 75% mit ULIP-1 oder ULIP-2 aufweist, wurden gefunden. Sie gehören zu einer dritten, als U-LIP-3 bezeichneten Gruppe. Die letzte identifizierte Gruppe, die als ULIP-4 bezeichnet wird, umfasst r-CRMP-3 der Ratte und die ULIP-4-Formen der Maus und POP-66/ULIP-4 beim Menschen.
Der Vergleich der Aminosäuresequenz der drei ULIP-Gene, d.h. TOAD-64 der Ratte, Crmp-62 aus Huhn und ULIP-1 aus der Maus, mit der Aminosäuresequenz, die von dem offenen Leserahmen des erfindungsgemäßen Klons C-22 abgeleitet wurde, wobei das Clustal-V-Alignmentprogramm verwendet wurde, zeigt, dass C-22 eine Identität von 74% mit ULIP-1, 77% mit Crmp-62 und 76% mit TOAD-64 aufweist.
Die Nucleotidsequenz C-22 hat eine Identität von 97% mit der partiellen EST-Sequenz, hCrmp-1, und bildet somit das dritte Mitglied der ULIP-3-Gruppe. Die Gene TOAD-64, Crmp-62 und C-22 codieren jeweils für ein Protein mit 572 Aminosäuren Länge, während die von ULIP-1 abgeleitete Aminosäuresequenz ein Protein mit 570 Aminosäuren ergibt.
Die Analyse der Aminosäuresequenz von C-22 zeigt keinerlei Signalsequenz oder Transmembrandomäne, was darauf hindeutet, dass das oder die Produkte des C-22-Gens im Cytoplasma der Zellen lokalisiert sein könnte(n).
Über die Länge des Produkts des C-22-Gens gibt es mehrere Konsensusstellen für die Phosphorylierung durch Proteinkinase C (S/T X R/K). Diese Beobachtungen legen nahe, dass C-22 ein Phosphoprotein ist und dass leichte Unterschiede in der Phosphorylierung die Aktivität oder die Rolle der verschiedenen Mitglieder dieser Proteinfamilie im Verlauf des Zellzyklus bestimmen könnten.
Tabelle 1: Übersieht über Proteine mit Homologie zu ULIP.
BEISPIEL 4:
Regulation der Expression des C-22-Gens:
Die Untersuchung von Veränderungen in der Expression des C-22-Gens kann eine erhebliche Bedeutung für die Kenntnis der funktionellen Aspekte des C-22-Proteins haben. Folglich hat die Anmelderin die mögliche Regulation der Expression des C-22-Gens im Verlauf der Entwicklung untersucht. Gesamt-RNA wird extrahiert, durch Elektrophorese auf einem 1 %igen Agarosegel aufgetrennt und auf eine Nytran-Membran (Duchemin et al., 1987) transferiert. Die Blots werden mit einer codierenden C-22-Sequenz, die mit ³²P_i markiert ist, in 0,5 mM Phosphatpuffer mit 5% SDS bei 65°C für 16 Stunden hybridisiert.
Am Ende der Hybridisierung werden die Blots nacheinander dreimal mit 2 × SSC, 0,1% SDS bei Umgebungstemperatur, dann mit 1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C für 60 Minuten gewaschen und auf Röntgenfilmen exponiert.
Unter den verwendeten Bedingungen wird eine einzige Bande bei 3,8 kb nachgewiesen, die der C-22-mRNA entspricht, die zudem das kleinste Transkript aus der Familie der unc-33-Gene der Vertebraten ist. Die Größe des Transkripts bleibt während der pränatalen und postnatalen Zeiträume gleich.
Die Kinetik des C-22-Gens im Gehirn von Ratten im Verlauf der Entwicklung zeigt, dass der Bote während der Embryonalperiode am Tag E17 nachweisbar ist. Die Menge an C-22-Transkripten erhöht sich bis zum postnatalen Tag 7 und nimmt dann ab der zweiten Wochen nach der Geburt schnell bis auf ein praktisch nicht nachweisbares Niveau beim Erwachsenen ab.
Etwa bei der Geburt wird wahrscheinlich ein noch unbekanntes Regulationssignal empfangen, das die Expression des C-22-Gens erhöht, wobei dieses Signal zeitlich mit der neuronalen Differenzierung und der Axonentwicklung zusammenhängt.
Die C-22-mRNA konnte mittels Northernblot-Analyse in vielen Regionen des Gehirns, wie dem frontalen Cortex, dem Mittelhirn und dem Thalamus, beim Erwachsenen und bei mehr als zwei Jahre alten Ratten nicht nachgewiesen werden.
Ferner konnte die C-22-mRNA in nicht-neuronalen Geweben, wie dem Herzen, der Lunge, der Leber, der Niere, bei einwöchigen Ratten und adulten Ratten nicht nachgewiesen werden.
Die Daten zum Expressionsprofil der C-22-mRNA legen eine vorherrschende Rolle des C-22-Proteins bei der Entwicklung des Gehirns nahe.
BEISPIEL 5:
Immunologischer Nachweis von POP-66
A – Materialien und Verfahren
• Transfektion der ULIP in E. coli
Die Volllängen-cDNAs von ULIP-2 und ULIP-3 aus Ratte und ULIP-1 und ULIP-4 aus Maus wurden in den E.-coli-Expressionsvektor pET-21 a(+) nach Einfügen einer 5'-Ndel-Stelle und einer 3'-EcoRI-Stelle mittels PCR gerichtet subkloniert, und die vier Konstruktionen wurden resequenziert. Die durch IPTG induzierte Expression des Zielgens erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers (Novagen).
• Produktion von Anti-ULIP-Antikörpern
Kaninchen-Antikörper (Anti-Pep3) sind gegen das Peptid ITGPEGHVLSRPEEVE (Aminosäuren 217-232 der Sequenz SEQ ID Nr. 8) gerichtet, das an einer multiplen Peptidsynthese-Apparatur unter Verwendung von F-moc synthetisiert wurde (Peptid-Synthesizer 432A SYNERGY, Applied Biosystems). Die Reinheit wurde durch Analyse der Sequenz mittels HPLC und Massenspektrometrie bestätigt. Es wurden 1 mg des synthetischen Peptids, das mit Patella-Hämocyanin konjugiert war, in komplettem Freundschen Adjuvans sowie eine "Booster"-Dosis von 0,5 mg gebundenem Peptid in komplettem Freundschen Adjuvans nach 4 Wochen zur Immunisierung von Kaninchen verwendet. Die Anti-Pep3-Antikörper erkannten die vier in E. coli exprimierten rekombinanten ULIP-Proteine.
Die Markierung mit den Anti-Pep3-Antikörpern wurde nach Vorinkubation mit dem Peptid 3 beseitigt. Kontrollen mit Präimmunseren aus Kaninchen waren negativ. Die gegen das Peptid LEDGTLHVTEGS gerichteten Anti-Peptid-4-Antikörper wurden nach dem gleichen Protokoll hergestellt.
B – Ergebnisse
Antikörper gegen vier der sequenzierten Peptide wurden hergestellt. Zwei der Seren erwiesen sich als besonders interessant.
Eines enthielt Antikörper (Anti-Pep3-Ak), die bei der zweidimensionalen Elektrophorese von Proteinextrakten aus Gehirn neugeborener Ratten (2) und bei der eindimensionalen Elektrophorese (3) mehrere Mitglieder der ULIP-Familie erkannten. Ein anderer Antikörper (Anti-Pep4-Ak) erkennt im Westernblot eine einzige Bande von 66 kDa, die einem einzigen Mitglied der Familie, nämlich ULIP-2, entsprechen könnte (3).
BEISPIEL 6:
Immunohistochemie
Die Gewebepräparate für die Immunhistochemie werden aus Gehirnen neugeborener Ratten und menschlichen Gehirnen post mortem gewonnen, bei 4°C in 4% Paraformaldehyd und 0,2% Pikrinsäure, die in Phosphatpuffer (0,1 M, pH = 7,4) verdünnt wurden, fixiert und anschließend gefriergeschützt.
Die Immunhistochemie kann mit der indirekten Immunfluoreszenztechnik durchgeführt werden. Schnitte mit 12 μm Dicke werden am Cryostat hergestellt und dann auf einem mit Gelatine beschichteten Objektträger montiert, für 2 Stunden in PBS-Puffer und 1 % Rinderserumalbumin (BSA) mit 0,1 % Triton X100 behandelt und 12 Std. in PBS-1 % BSA bei Umgebungstemperatur mit Anti-CV2-Patientenserum (Serumverdünnung 1/100) inkubiert. Nach mehreren Wäschen mit PBS-1% BSA werden die Schnitte für 2 Std. in PBS-1 % BSA mit einem auf 1 % verdünnten, mit Fluorescein konjugierten Anti-Human-Antiserum aus Kaninchen (Dakopatts) inkubiert. Nach Waschen in PBS werden die Objektträger im Mikroskop untersucht. Die Kontrollschnitte werden entweder nur mit dem mit Fluorescein konjugierten Anti-Human-IgG-Antiserum oder nur mit PBS-1 % BSA oder nur mit dem Patientenserum allein oder schließlich mit dem Kontrollserum (nicht an PNS leidende Patienten) und mit Fluorescein-konjugierten Antikörpern in der gleichen Verdünnung inkubiert.
Um die Immunfluoreszenz zu bestätigen, kann man die direkte Markierung mit Immunperoxidase verwenden. Die in Paraformaldehyd fixierten, gefrorenen Gewebeschnitte werden mit 0,3% H₂O₂ (um die intrinsische Peroxidaseaktivität zu zerstören) und 10% normalem Kaninchenserum (um eine unspezifische Bindung der Kaninchen-IgG zu verhindern) oder 1% BSA inkubiert. Nach 12-stündiger Inkubation mit den 1/1000 verdünnten Patientenseren und nach Waschen werden die Schnitte für 2 Std. mit biotinyliertem Anti-Human-IgG-Antiserum aus Kaninchen, das 1/1000 in PBS-1% BSA verdünnt wird, inkubiert. Die gebundenen humanen IgG werden durch Inkubation mit einem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (Vectastain-ABC-Komplex, Vector) sichtbar gemacht und mit 0,05% DAB (Sigma) entwickelt. Die Kontrollschnitte werden mit Seren von 15 Patienten ohne PNS gemäß dem gleichen Protokoll erhalten.
A – Lokalisation der Proteine der ULIP-Familie mithilfe von Anti-Peptid-Antikörpern
Eine immunhistochemische Markierung wurde an einem Gehirnschnitten neugeborener und adulter Ratten durchgeführt. Der Antipeptid-3-Antikörper erkennt (ein) Antigen(e), das (die) in mehreren Zelltypen vorhanden ist (sind), an den Gehirnschnitten neugeborener und adulter Ratten (4). Wie das Anti-CV2-Patientenserum gestattet der Anti-Peptid-4-Antikörper keinen Nachweis eines Antigens an einem Gehirnschnitt aus neugeborener Ratte, während er spezifisch eine Subpopulation von Oligodendrozyten im Gehirn aus adulter Ratte erkennt (4).
B – Expression von POP-66 im Verlauf der normalen Gehirnentwicklung
5 zeigt, dass die durch die Akkumulation von Bromdesoxyuridin (BrdU) nachgewiesenen proliferierenden Nervenzellen in den Vorläuferzonen des Nervensystems POP-66 nicht exprimieren, während es in den nicht-proliferierenden Zellen, die den in der Differenzierung oder Wanderung begriffenen Nervenzellen entsprechen, exprimiert wird.
BEISPIEL 7:
Rolle POP-66 beim neuronalen Überleben
6 ermöglicht einen Vergleich von humanen Gehirnschnitten von gesunden Patienten und von Patienten, die an PNS leiden. Bei den Patienten, die an einem PNS leiden und zirkulierende Anti-CV2-Antikörper aufweisen, beobachtet man ein Verschwinden der Neuronen des Gyrus dentatus und der pyramidalen Neuronen (mittlere Zellbande) sowie eine intensive Reaktion mit Astrozyten.
BEISPIEL 8:
Charakterisierung des POP-66-Proteins – Identifizierung mit ULIP-4 Materialien und Verfahren
a) Partielle Reinigung von ULIP-1
Partiell gereinigtes ULIP-1 wurde aus Gehirnen neugeborener Mäuse durch drei Reinigungsschritte erhalten. Diese Gehirne wurden in 4 Volumina Homogenisationspuffer (25 mM Natriumphosphat, pH 7,8, 1 mM EGTA, 10 μg/ml Leupeptin, 25 μg/ml Aprotinin und 10 μg/ml Pepstatin) homogenisiert. Die Homogenate wurden für 10 Minuten bei 400 × g zentrifugiert. Die Sedimente wurden in 2 Volumina Homogenisationspuffer resuspendiert, homogenisiert und erneut zentrifugiert. Die aus zwei Zentrifugationen hervorgegangenen Überstände wurden vereinigt, ultraschallbehandelt und für 1 Stunde bei 100000 × g zentrifugiert. Der Überstand (S2) wurde auf eine DEAE-Sepharose CL-6B-Säule (1,75 cm² × 26 cm), die mit 100 ml Puffer A (25 mM Natriumphosphat, pH 7,8, 1 mM EGTA) äquilibriert worden war, bei einem Fluss von 30 ml pro Stunde aufgetragen. Die Proteine wurden in 300 ml eines linearen Gradienten von 0-250 mM Natriumchlorid in Puffer A eluiert, und Proben von 5 ml wurden genommen. Die Fraktionen, die ULIP enthielten, wurden gesammelt, und festes Ammoniumsulfat wurde bis zu 20%iger Sättigung zugegeben. Dieser "Pool" wurde auf eine Phenyl-Sepharose CL4B-Säule (1,75 cm² × 22 cm) aufgetragen, die zuvor mit 100 ml Puffer B (10 mM Natriumphosphat, pH 7,8, 1 mM EGTA), der 20% gesättigtes Ammoniumsulfat enthielt, äquilibriert worden war. Die Proteine wurden in einem abnehmenden linearen Gradienten von 20 bis 0% Ammoniumsulfatsättigung in Puffer B eluiert. Die Fraktionen, die ULIP enthielten, wurden gewonnen und zweimal gegen 20 Volumina Puffer A dialysiert. Die Proteine wurden auf einer kleinen (10 ml) DEAE-Sepharose C1-6B-Säule aufkonzentriert und mit 400 mM Natriumchlorid in Puffer A eluiert. Das Eluat wurde auf einer Sephadex G-25-Säule (NAP-10) entsalzt und durch Eindampfen auf ein Endvolumen von 0,5 ml eingeengt. Beim letzten Reinigungsschritt wurde die eingeengte Fraktion in drei aufeinanderfolgenden Schritten auf zwei in Reihe angeordneten Superose-l2-FPLC-(Fast Protein Liquid Chromotagraphy-)Säulen in Puffer C (50 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 150 mM Natriumchlorid) bei einem Durchsatz von 0,3 ml/Minute chromatographiert. Die Fraktionen (0,6 ml) wurden gewonnen, und die an ULIP angereicherten Fraktionen wurden analysiert. Das Vorliegen von ULIP bei den aufeinan derfolgenden Reinigungsschritten wurde durch einen eindimensionalen Westernblot unter Verwendung von Anti-Stathmin-Antikörpern, die kreuzreagieren konnten, getestet. Die Proteine wurden gemäß dem Verfahren von Bradford quantifiziert.
b) Wanderung auf einem Elektrophoresegel
Eine eindimensionale Elektrophorese wurde auf 13%igen Polyacrylamidgelen gemäß dem Verfahren von Laemmli durchgeführt. Die zweidimensionalen PAGE-Elektrophoresen erfolgten, wie vorstehend beschrieben. Die Gele zur isoelektrischen Fokussierung enthielten insgesamt 2% Ampholine, pH 6-8 und 3-10 in einem Verhältnis von 4:1. Die zweite Dimension wurde auf 10%igen Acrylamidgelen durchgeführt. Die Proteine wurden entweder einem immunologischen Nachweis unterzogen oder mittels Silber gefärbt.
c) Westernblot-Analyse
Die Proteine wurden aus den Gelen in einem Puffer, der 48 mM Tris, 39 mM Glycin und 5% Methanol enthielt, auf Nitrocellulose transferiert. Die Membran wurde mit Casein (2,5%) in der Immunnachweislösung (12 mM Tris-HCl, pH 7,4, 160 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100) gesättigt und mit einem gegen das Peptid I von Stathmin aus Ratte gerichteten Antiserum (Verdünnung 1/10000) oder mit einem gegen das rekombinante ULIP-Protein gerichteten Antiserum (Verdünnung 1/20000), die in einer Immunnachweislösung, die 1 % Casein enthielt, verdünnt wurden, getestet. Die gebundenen Antikörper wurden entweder mit I¹²⁵-markiertem Protein A und Autoradiographie oder mit Anti-Kaninchen-Antikörpern, die unter Verwendung des ECL-Kits (Amersham) an Peroxidase gebunden wurden, nachgewiesen.
d) Analyse der Proteinsequenz
Die an ULIP angereicherten Fraktionen wurden auf zweidimensionalen Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Die Gele werden für 30 Minuten in 25% Ethanol und 10% Essigsäure fixiert und für 3 Minuten in 0,1 % Amidoschwarz in 1 % Essigsäure und 40% Methanol gefärbt. Die Gele wurden in 1 % Essigsäure entfärbt, und die Flecken, die der Hauptform von ULIP entsprachen, wurden von diesen drei Gelen ausgeschnitten, gewonnen und mit 2 mg/ml Endoprotease Lys C gespalten. Die aus dem Gel eluierten Peptide wurden anschließend durch HPLC auf einer DEAE-C18-säule mit einem Gradienten von 0-55% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure aufgetrennt. Die Peptide wurden anschließend gemäß dem automatischen Abbau von Edman sequenziert.
e) In-vitro-Expression in einem Säuger
Es wurde 1 μg des Plasmids Bluescript, das die gesamte für ULIP-1, ULIP-2, ULIP-3 oder ULIP4 codierende cDNA enthielt, zur Durchführung der In-vitro-Transkription und -Translation mit dem "Retikulozytenlysat"-System (Promega) gemäß dem von Hersteller beschriebenen Protokoll verwendet. Es wurden 5 μg der insgesamt 25 μl des Transkriptions-/-Translationsgemischs auf einem zweidimensionalen Elektrophoresegel analysiert.
Ergebnisse
Weder das rekombinante ULIP-1-Protein, noch die rekombinanten Proteine TOAD64 (ULIP-2) und C-22 (ULIP-3) wurden von den Anti-CV2-Seren erkannt. Außerdem entsprach das Verteilungsprofil der Flecken, die POP-66 entsprachen und von den Anti-CV2-Antikörpern bei der zweidimensionalen Elektrophorese erkannt wurden, nicht den Flecken, die von den Anti-ULIP-1-Antikörpern erkannt wurden. POP-66 ist jedoch ein Mitglied der ULIP-Familie, weil die drei POP-66-Flecken von dem Anti-Pep3-Ak erkannt werden. Somit entspricht POP-66 einem Mitglied der Familie mit basischerem pHi.
Nach der In-vitro-Translation der vier Proteine (ULIP-1, -2, -3, -4) wurde gezeigt, dass ULIP-4 das gleiche 2D-Elektrophoreseprofil besitzt wie POP66 und von den Anti-CV2-Antikörpern erkannt wird (7).
Dazu wurden das ULIP-4-Protein und das ULPI-2-Protein als Kontrolle in vitro in Gegenwart von ³⁵S-Methionin ausgehend von cDNA-Klonen, die für die gesamten Proteine codierten, translatiert. Die Proteine wurden durch zweidimensionale Elektrophorese (in Gegenwart eines Gehirnextraktes, der die wesentlichen Marker zur Verfügung stellte) aufgetrennt, auf Nitrocellulose transferiert und folgendermaßen sichtbar gemacht:

– durch Autoradiographie, um die in vitro translatierten Proteine zu lokalisieren (Translation);
– durch immunologischen Nachweis mit CV2-Serum.

7 zeigt, dass die drei Flecken der In-vitro-Translation von ULIP-4 den durch CV2 erkannten Flecken entsprechen. Die Flecken werden bei der Translation von ULIP-2 nicht erkannt.
Das CV2-Serum erkennt somit spezifisch ULIP-4.
Dies gestattete die Identifizierung von POP-66 als ULIP-4.
BEISPIEL 9:
Chromosomale Lokalisation des Proteins POP-66/ULIP-4
Nachdem die cDNA von humanem ULIP-4 kloniert wurde, ist es jetzt möglich, die chromosomale Lokalisation des POP-66/ULIP-4-Gens mittels genetischer Kartierung durch isotopische In-situ-Hybridisierung zu bestimmten (Levy und Mattei et al., 1995).
Die In-situ-Hybrididisierung wird an Chromosomenpräparaten durchgeführt, die aus humane Lymphozyten erhalten werden, die mittels Phytohämagglutinin stimuliert und für 72 Stunden gezüchtet wurden. 5-Bromdesoxyuridin wurde während der letzten 7 Stunden der Kultur hinzugegeben (60 μg/ml Medium), um nach der Hybridisierung ein Bild der chromosomalen Banden von guter Qualität zu gewährleisten. Der Klon, der ein Insert von 1300 Basenpaaren, die für ULIP-4 codieren, im Bluescript-Vektor enthält, wird durch "Nick-Translation" mit Tritium in einer spezifischen Aktivität von 1 × 10⁸ dpm μg^–1 markiert. Die radioaktiv markierte Sonde wurde im Metaphasestadium in einer Endkonzentration von 200 ng pro ml der Hybridisierungslösung hybridisiert. Nach Bedecken mit Kodak-NTB₂-Emulsion wurden die Objektträger für 20 Tage bei +4°C exponiert und dann entwickelt. Um die Verlagerung der Silberkörner während dieses Verfahrens zu verhindern, wurden die ausgebreiteten Chromosomen zuvor mit einer Giemsa-Pufferlösung markiert, und die Metaphasen wurden photographiert. Das Sichtbarmachen der Banden erfolgte durch das "Fluorochrom-Photolyse-Giemsa"-(FPG-)Verfahren, und die Metaphasen wurden vor der Analyse erneut photographiert. In 100 Zellen in der Metaphase, die nach der In-situ-Hybridisierung untersucht wurden, wurden 246 an die Chromosomen gebundene Silberkörner gezählt, und 54 davon (21,9%) waren auf dem Chromosom 10 lokalisiert. Die Verteilung der Körner auf diesem Chromosom war nicht zufällig: 39 von 54 (72,2% davon) waren auf der Region q25.2-q26 auf dem langen Arm von Chromosom 10 lokalisiert.
Somit befindet sich das POP-66/ULIP-4-Gen auf dem Chromosom 10 in der Region g25.2-q26. In dieser Chromosomenregion hat man auch die Loci neurodegenerativer Erkrankungen und von Tumorsuppressorgenen, die bei verschiedenen Krebstypen impliziert wurden, lokalisiert. Der Locus einer frühzeitig einsetzenden zerebellaren Erkrankung ("infantil onset spinocerebellar ataxia") wurde in der Region 10q24-26 identifiziert (Varilo et al., 1996; Nikali et al., 1995). Die Symptome dieser rezessiven erblichen degenerativen Erkrankung, die durch eine Ataxie, eine Neuropathie und eine optische Atrophie gekennzeichnet ist, sind ähnlich denjenigen, die bei Patienten beobachtet werden, die an paraneoplastischen neurologischen Syndromen mit zirkulierenden Anti-CV2-Autoantikörpern leiden (Honnorat et al., 1996). Andererseits zeigen 80% der Glioblastome Mutationen in dieser Chromosomenregion, und mehrere supprimierende Loci, die bei verschiedenen Typen von Tumoren (Prostata, Niere, kleinzelligem Lungenkrebs und Endometriumkarzinomen) impliziert wurden, sind in dieser Chromosomenregion lokalisiert. Diese Daten unterstützen die Möglichkeit, dass POP-66/ULIP-4 eine entscheidende Rolle bei Neurodegeneration und der Tumorigenese spielt.
In dieser Hinsicht ist bemerkenswert, dass die Expression von ULIP-1 in Zellen von Neuroblastomen, die durch Retinsäure differenziert werden, hochreguliert wird, und dass in PC12-Zellen, die in Gegenwart von NGF differenziert werden, ULIP-1 und ULIP-3 hochreguliert werden, aber ULIP-4 abwärts reguliert wird, was nahe legt, dass das Anhalten des Zellwachstums mit dem Expressionsspiegeln der ULIP-Proteine zusammenhängen kann.
BEISPIEL 10:
Expression der ULIP-Proteine in transfizierten HeLa-Zellen
A – Materialien und Verfahren
Eine "Flag"-Sequenz (EcoRI-ATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGBamHI) (Kodak) wurde in die EcoRI-Stelle von pSGS kloniert, gefolgt von ULIP-1 (EMBEL X87817, Basenpaare: 309-2023), ULIP-2 (Y10339, Basenpaare: 23-1741), ULIP-3 (Y09080, Basenpaare: 269-1991) bzw. ULIP-4 (Y09079, Basenpaare: 102-1820). Die He-La-Zellen wurden in DMEM-Medien (Gibco), die mit 10% fötalem Kälberserum (Vol./Vol.) angereichert waren, gezüchtet. Die Transfektionen wurden durch Fällung mit Calciumphosphat (Maniatis et al., 1978) durchgeführt. Die HeLa-Zellen wurden mit 5 μg der Plasmide pSGSflag-ULIP-1, -2, -3, -4 und 10 μg pUC18 gemischt. Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion wurden die HeLa-Zellen mit 4% Paraformaldehyd fixiert und mit verschiedenen humanen Seren (Verdünnung 1/300), die durch mit FITC konjugierte Anti-Human-IgG-Antikörper (Biosys) nachgewiesen wurden, oder durch Anti-Flag-Antikörper (M2, Kodak) (Verdünnung 1/1000), die mit Texasrot-konjugierten Anti-Kaninchen-Antikörpern nachgewiesen wurden, immunologisch markiert.
Eine Doppelimmunmarkierung wurden an den HeLa-Zellen, die mit den ULIP transfiziert worden waren, unter Verwendung der Anti-Flag- und Anti-Pep3-Antikörper durchgeführt. In den mit einer beliebigen cDNA transfizieren Zellen zeigten 10 bis 20% unter ihnen eine Immunmarkierung mit den Anti-Flag-Antikörpern, die durch die mit Texasrot konjugierten Anti-Maus-Antikörper nachgewiesen wurden.
Alle transfizierten Zellen wurden durch die Antikörper doppelmarkiert, die gegen Pep3, ein gemeinsames Peptid der vier ULIP, gerichtet waren und die durch mit Fluorescein konjugierte Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper nachgewiesen wurden.
Eine Doppelimmunmarkierung wurde an den mit den ULIP transfizierten HeLa-Zellen auch unter Verwendung der Anti-Flag- und Anti-CV2-Antikörper durchgeführt. Die humanen Seren von Patienten, die an PNS mit zirkulierenden Anti-CV2-Autoantikörpern litten, markierten die mit ULIP-4 transfizierten Zellen, und ein Anti-CV2-Serum markierte ebenfalls die mit ULIP-3 transfizierten Zellen. Keinerlei Markierung der mit ULIP-4 transfizierten Zellen wurde mit den Kontrollseren von Patienten ohne Krebs oder ohne neurologische Erkrankung nachgewiesen.
B) Ergebnisse
Nach Transfektion der HeLa-Zellen mit den durch die Flags markierten cDNAs der vier ULIP reagierten 10 bis 20% der Zellen stark mit den Anti-Flag-Antikörpern und den Anti-Pep3-Antikörpern, die die 4 Säuger-ULIP erkennen. Die transfizierten Zellen wurden weder mit dem Kontrollserum von 10 neurologischen Patienten ohne PNS noch mit Kaninchen-Präimmunserum immunmarkiert. Dagegen zeigten die mit der ULIP-4-cDNA transfizierten Zellen eine intensive Immunreaktivität mit allen 7 getesteten Seren von Patienten mit zirkulierenden Anti-CV2-Autoantikörpern. Diese Seren sind bei den Zellen negativ, die mit den cDNAs der anderen ULIP transfiziert wurden, mit Ausnahme eines Serums, das auch die mit ULIP-3 transfizierten Zellen erkannte, und eines Serums, das auch die mit ULIP-1, -3 und -4 transfizierten Zellen erkannte. Keinerlei Markierung wurde an nicht transfizierten HeLa-Zellen mit einem Anti-CV2-Serum beobachtet.
Die nachstehende Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der indirekten Immunfluoreszenz mit verschiedenen Seren an HeLa-Zellen durch markierte cDNAs von Mitgliedern der U-LIP-Familie. Tabelle 1:

PCD:: paraneoplastische Degeneration des Kleinhirns;
LE:: lymbische Enzephalitis;
PEM:: paraneoplastische Enzephalomyelitis;
UC:: undifferenziertes Karzinom;
SCLC:: kleinzelliges Lungenkarzinom.

BEISPIEL 11:
Expression von POP-66/ULIP-4 und Mitgliedern der ULIP-Familie in Krebstypen
A – Expression von ULIP-2 und ULIP-3 in Krebsarten
1) Materialien und Verfahren: RT-PCR-Experimente
Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von 1 ml RNAZOL^TMB (Bioprobe) gemäß dem Verfahren von Chomczynski und Sacchi extrahiert. Die RNA-Menge wurde durch die bei 260 nm gemessene optische Dichte bestimmt, und ihre Reinheit wurde aus dem Verhältnis der bei 260 und 280 nm gemessenen Absorptionen bestimmt (Verhältnisse von 1,8-2,0). Die Unversehrtheit der RNA-Präparationen wurde ferner durch Elektrophorese auf einem 1 %igen Agarosegel in TBE (0,45 M Tris-Borat, 10 mM EDTA, pH 8) bestätigt. Die Spezifität der Primer wurde durch Vergleich ihrer Sequenzen mit verschiedenen Gendatenbanken (EMBL und FASTA) analysiert. Für eine relative Quantifizierung wurde das für G3PDH (Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Clontech) codierende Gen, das in zahlreichen Geweben, einschließlich Gehirn, ubiquitär exprimiert wird, zusammen mit der getesteten mRNA als interner Standard amplifiziert, um die Gleichwertigkeit der RNA-Mengen der Proben zu bestätigen und die Effizienz des reversen Transkriptionsschritts für die verschiedenen RNA-Proben zu testen. Die 5'-, 3'-Primer und die Oligonucleotide der internen Sonden der G3PDH wurden von Eurogentec synthetisiert und gereinigt. Gesamt-mRNA (1 μg) wurde denaturiert (15 Minuten bei 65°C) und in einem Endvolumen von 20 μl Puffer (50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, pH 8,3, Gibco BRL), der 5 ng pro μl Oligo-dT-Primer 12-18 (Pharmacia Biotech), 40 Einheiten reverse Transkriptase des Maus-Moloney-Leukämievirus (Mu-LV) (Gibco BRL), 40 Einheiten RNAsin (Promega), 10 mM DTT (Gibco BRL) und 0,5 mM von jedem der Desoxynucleotidtriphosphate (Promega) enthielt, in einzelsträngige cDNA transkribiert (1 1/2 Stunden, 42°C). Die cDNA-Proben wurden in destilliertem Wasser 1/10 verdünnt, und die PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von 1 μl, 4 μl oder 2 μl der cDNA-Probe für die Boten-RNA von ULIP-2 und ULIP-3 in einem Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 0,1% Triton X100, 0,4% Glycerin und 800 μM NaCl, pH 9), zu dem 40 μM DTT, 3 mM MgCl₂, 0,2 mM von jedem dNTP, 0,4 μM von jedem gewählten Primer und 2 Einheiten AmpliTaq-DNA-Polymerase (Promega) gegeben wurden, in einem Endvolumen von 50 μl durchgeführt. Die Proben wurden anschließend in einen Thermocycler (Biomed-Hybaid) überführt, für 5 Minuten bei 95°C denaturiert und in 35 Zyklen (ein Zyklus = Denaturierung 95°C für 65 Sekunden, Hybridisierung der Primer 60°C für 45 Sekunden, Extension 72°C für 4 Minuten und abschließende Verlängerung für 15 Minuten bei 72°C) amplifiziert. Die Produkte wurden durch Elektrophorese auf einem 1 %igen Seakem-Agarosegel aufgetrennt, und die Testbanden der RT-PCR-Produkte mit der erwarteten Größe sowie die Leiter des Molekulargewichtsmarkers (100 Basenpaare) (Promega) wurden unter Verwendung von Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht.
Zusammensetzung der für die ULIP-3-PCR verwendeten Oligonucleotidsonden
5'ATAGAGGAGCGGATGACG(899)3'
GCTGTTATGGTCTTCAACTTGTCGG(1092)
GGCCTGTTATGGTCTTCAACTTGTCG(1093)
Zusammensetzung der für die ULIP-2-PCR verwendeten Oligonucleotidsonden
5'AGGAGGAGTGAAGACCATCG(5227)3'
CTTATGCCACTCGCTGATGTCC(509).
2) Ergebnisse
Die RT-PCR-Experimente zeigen, dass TOAD-64 (ULIP-2) und C-22 (ULIP-3) in bestimmten kleinzelligen Lungentumoren exprimiert werden (vgl. 8) und in anderen fehlen, insbesondere in den Zellen von Patienten, die paraneoplastische neurologische Syndrome mit besserer Prognose entwickeln.
B – Expression von ULIP-4 in Krebsarten
1) Materialien und Verfahren
• RNA-Präparation und RT-PCR
Die Gesamt-RNAs werden aus in flüssigem Stickstoff aufbewahrten zerebralen Tumoren gemäß der herkömmlichen RNAZOL^TM-Technik (Bioprobe, Frankreich) extrahiert. Die reverse Transkription wurde unter Verwendung von Oligo(dT)₁₈ an 1 μg Gesamt-RNA durchgeführt, und die PCR erfolgte mit 1/20 des Volumens der Gemischs für die reverse Transkription (RT-Mix). Die für ULIP-4 verwendeten Primer sind:
5'CATCTGGCTGTCGCTGCAC3', 5'GCCGCCCCTACCAGAGACC3' und für GAPDH
5'GGAGATTCAGTGTGGTGG3', 5'GGCTCTCCAGAACATCATCC3'.
Die cDNA wurde für fünf Minuten bei 95°C denaturiert. Die Amplifikation mittels PCR wurde in 30 Zyklen durchgeführt. Ulip4: 95°C, 45 s; 62°C, 45 s; 72°C, 45 s. GAPDH: 95°C, 45 s; 55°C, 45 s; 72°C, 45 s. Die abschließende Extension wurde für 5 Minuten bei 72°C durchgeführt.
2) Ergebnisse
Von den 8 untersuchten Extakten von Glioblastomen exprimierten 4 (50%) die U-LIP-4-Boten-RNA. Dagegen exprimierte von 10 getesteten Extrakten von Oligodendrogliomen keiner die ULIP-4-Boten-RNA. Diese differenzielle Expression in Abhängigkeit vom zerebralen Primärtumor unterstützt eine potenzielle Rolle von ULIP-4 bei der Zellproliferation dieser Tumoren.
Das POP-66/ULIP-4-Protein sowie die Proteine der ULIP-Familie könnten in den peripheren Tumoren (kleinzelliger Lungentumor, Thymom, Brust- und Ovarkrebs) exprimiert werden. Ihr Vorhandensein könnte somit mit einer Prognose korreliert werden. Die Lokalisation des POP-66/ULIP-4-Gens im distalen Abschnitt des Chromosoms 10 bestätigt dies im Fall der zerebralen Tumoren.
Somit legen die differenzielle Expression der Mitglieder der ULIP-Familie in Tumoren, wie kleinzelligem Lungenkrebs, während das entsprechende ULIP-Gen in einem gesunden Gewebe fehlt, sowie die Modulation der Expression der Mitglieder der ULIP-Familie, die während der Differenzierung einer Medulloblastomlinie durch das humane HTLV1-Retrovirus erhalten werden, die Implikation der ULIP in kanzerösen Tumoren nahe.
BEISPIEL 12:
Produktion spezifischer Antikörper für jedes der humanen ULIP-Proteine
Spezifische Peptide von jedem Mitglied der ULIP-Familie wurde an einer multiplen Peptidsynthese-Apparatur unter Verwendung von F-moc (Peptid-Synthesizer 432A SYNERGY, Applied Biosystems) synthetisiert. Die Reinheit wurde durch Analyse der Sequenz mittels HPLC und Massenspektrometrie bestätigt.
Diese Peptide sind:
Für ULIP-1 spezifisches Peptid: GSARGSPTRPN (11 Aminosäuren)
Für ULIP-2 spezifisches Peptid: SSAKTSPAKQQA (12 Aminosäuren)
Für ULIP-3 spezifisches Peptid: PSAKSSPSKHQ (11 Aminosäuren)
Für ULIP-4 spezifisches Peptid: PARASCPGKIS (11 Aminosäuren)
Es wurde 1 mg des synthetischen Peptids, das mit Patella-Hämocyanin konjugiert war, in komplettem Freundschen Adjuvans zur Immunisierung von Kaninchen verwendet, wobei eine "Booster"-Dosis von 0,5 mg gebundenem Peptid in komplettem Freundschen Adjuvans nach 4 Wochen verabreicht wurde.
Die erhaltenen Antikörper erkannte jedes Proteinmitglied der ULIP-Familie spezifisch.
BEISPIEL 13:
Produktion transgener, ULIP-4 exprimierender Tiere
Drosophilae wurden mit der cDNA für humanes ULIP-4 transformiert.
Die ULIP-4-cDNA, die zuvor in ein pBluescript-SK-Phagemid kloniert worden war, wurde durch enzymatische Doppelspaltung mit Kpn1 und Xba1 ausgeschnitten. Nach Elektrophorese auf einem Agarosegel wurde das cDNA-Fragment gereinigt und dann in pUAST, ein Derivat von pCaSpeR3, der mit den Restriktionsenzymen Kpn1 und Xba1 gespalten worden war, kloniert. Das Plasmid 10-C geht aus der gerichteten Klonierung der ULIP-4-cDNA in pUAST in Verbindung mit den Reportergen mini-white hervor. Das Plasmid 10-C wurde mit einem p-Delta-2-3-Helferplasmid, das für die in der Keimlinie aktive Transposase des P-Elements codiert, injiziert.
Die transformierten Drosophilae werden anhand ihrer roten Augen, die durch die Expression des mini-White-Gens hervorgerufen werden, identifiziert. Diese mit der ULIP-4-cDNA unter der Kontrolle von UASGAL4-Regulationssequenzen transformierten Linien gestatten eine gesteuerte Expression der ULIP-4-cDNA.
Diese Produktion in transformierten Drosophilae ermöglicht es, spezifisch die Rolle von ULIP-4 in verschiedenen Zellen zu untersuchen und seine Implikation bei Humanpathologien zu verstehen.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Gereinigtes Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NR. 8, wobei das Polypeptid als "POP-66" bezeichnet wird.
Isolierte Nukleinsäure, umfassend eine Sequenz, die für ein Polypeptid der Aminosäuresequenz SEQ. ID. NR. 8 codiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 2, umfassend eine Sequenz SEQ. ID. NR. 7.
Klonierungs- und/oder Expressionsvektor, der eine Sequenz von Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 2 oder 3 enthält.
Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 4 transfiziert ist.
Monoklonaler Antikörper, der gegen ein POP-66-Polypeptid nach Anspruch 1 gerichtet ist, sowie die Fab- oder F(ab')₂-Fragmente oder die Immunkonjugate des monoklonalen Antikörpers.
Verwendung eines gereinigten POP-66-Polypeptids nach Anspruch 1 zum Nachweis der Anwesenheit von Anti-CV2-Antikörpern in einer biologischen Probe.
Verwendung eines monoklonalen Antikörpers oder seiner Fab- oder F(ab')₂-Fragmente oder Immunkonjugate nach Anspruch 6 zur Reinigung oder zum Nachweis eines POP-66-Proteins in einer biologischen Probe.
In-vitro-Verfahren zur Diagnose paraneoplastischer, neurologischer Syndrome und/oder zur frühzeitigen Diagnose der Bildung kanzerogener Tumore, dadurch ge kennzeichnet, dass man in einer von einem Individuum entnommenen Blutprobe Autoantikörper, die gegen ein POP-66-Protein gerichtet sind, nachweist durch – In-Kontakt-Bringen einer Blutprobe eines Individuums mit einem gereinigten Polypeptid (POP-66) nach Anspruch 1, das gegebenenfalls an einem Träger fixiert ist, unter Bedingungen, die die Bildung spezifischer Immunkomplexe zwischen dem Polypeptid und den gegebenenfalls in der Blutprobe vorhandenen Autoantikörpern ermöglichen, und – Nachweisen der gegebenenfalls gebildeten spezifischen Immunkomplexe.
Kit zur Diagnose paraneoplastischer, neurologischer Syndrome und zur frühzeitigen Diagnose der Bildung von Tumoren, ausgehend von einer biologischen Probe, umfassend: – mindestens ein gereinigtes POP-66-Polypeptid nach Anspruch 1, das gegebenenfalls an einem Träger fixiert ist, – Mittel zum Nachweis der Bildung spezifischer Antigen/Antikörper-Komplexe zwischen einem Anti-POP-66-Autoantikörper und dem gereinigten POP-66-Polypeptid und/oder Mittel zur Quantifizierung dieser Komplexe.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindestens ein gereinigtes POP-66-Polypeptid nach Anspruch 1, eine Nukleinsäure, die für das Polypeptid codiert, eine Antisense-Sequenz, die in der Lage ist, spezifisch mit einer für das Polypeptid codierenden Nukleotidsequenz zu hybridisieren, oder einen gegen das Polypeptid gerichteten Antikörper, in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel.