DE69733861T2

DE69733861T2 - Verwendung von neuronalem apoptose-inhibitorprotein

Info

Publication number: DE69733861T2
Application number: DE69733861T
Authority: DE
Inventors: G. Robert KORNELUK; E. Alexander MACKENZIE; Natalie Roy; George Robertson; Katsu Tamai
Original assignee: University of Ottawa
Current assignee: University of Ottawa
Priority date: 1996-01-19
Filing date: 1997-01-17
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2017-01-18
Also published as: EP1609864A2; ATE301192T1; JP4005135B2; GB9601108D0; US6994957B2; JPH11503620A; WO1997026331A2; WO1997026331A3; EP0815231B1; CA2215793A1; AU1614997A; ES2245790T3; US20060172348A1; EP0815231A2; EP1609864A3; DK0815231T3; DE69733861D1; US7235372B2; CA2215793C; US20020137028A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen die Funktion des NAIP-Inhibitorproteins bei Apoptose und insbesondere die Verwendung von NAIP-Proteinen und Nukleinsäuren zum Charakterisieren von NAIP, Identifizieren von Verbindungen, die NAIP modulieren, und Behandeln von Zuständen, die von Änderungen der NAIP-Konzentrationen beeinflusst werden.
Allgemeiner Stand der Erfindung
Bei Apoptose handelt es sich um eine morphologisch ausgeprägte Form des programmierten Zelltods, der bei der normalen Entwicklung und Aufrechterhaltung von mehrzelligen Organismen von Bedeutung ist. Die Disregulation von Apoptose kann die Form unangemessener Unterdrückung von Zelltod, wie sie bei der Entwicklung von einigen Krebsarten auftritt, oder eines Misslingens der Steuerung des Ausmaßes des Zelltods annehmen, von dem geglaubt wird, dass es in erworbenem Immunmangel und bestimmten neurodegenerativen Störungen, wie spinaler Muskelatrophie (SMA), auftritt.
Spinale Muskelatrophien im Kindesalter sind neurodegenerative Störungen, die durch progressive Depletion der Motorneuronen im Rückenmark gekennzeichnet sind, und zählen zu den üblichsten autosomal-rezessiven Störungen (V. Dubowitz, 1978, M.A. Brooke, 1986). Typ-I-SMA ist die häufigste ererbte Todesursache in der frühen Kindheit. Der Schwund von Motorneuronen bei SMA hat zu Andeutungen geführt, dass eine unangebrachte Fortsetzung oder Reaktivierung von normal auftretender Motorneuronapoptose der Störung zugrunde liegen kann (H.B. Sarnat, 1992). NAIP, ein mit SMA assoziiertes Gen, wurde auf das humane Chromosom 5q13.1 lokalisiert.
Einige Bakuloviren kodieren Proteine, die als Inhibitoren von Apoptoseproteinen (IAPs) bezeichnet werden, da sie die Apoptose inhibieren, die andernfalls auftreten würde, wenn Insektenzellen mit dem Virus infiziert werden. Von diesen Proteinen wird geglaubt, dass sie in einer von anderen viralen Proteinen unabhängigen Weise arbeiten. Die IAP-Gene vom Bakulovirus enthalten Sequenzen, die ein Ring-Zinkfinger-artiges Motiv (RZF), das an der DNA-Bindung beteiligt sein kann, und zwei N-terminale Domänen kodieren, die aus einem Wiederholungsmotiv aus 70 Aminosäuren bestehen, das als BIR-Domäne (Bakulovirus IAP Repeat, Bakulovirus-IAP-Wiederholung) bezeichnet wird.
Roy et al. (Cell, Bd. 80, Nr. 1, 13. Januar 1995, NA US Seiten 167–178) offenbart eine NAIP kodierende, 5502 Nukleotide lange Sequenz. Die Funktion von NAIP als einem Apoptoseinhibitor und bei der Entwicklung von spinalen Muskelatrophien (SMA) wird ebenfalls offenbart.
WO 9612016, vor dem internationalen Einreichungsdatum, jedoch nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Erfindung veröffentlicht, offenbart das NAIP kodierende Gen und die entsprechende, 1232 Aminosäuren lange Aminosäuresequenz. Die Verwendung der Sequenzinformation zum Nachweis von NAIP-Sequenzen und zur Diagnose und Behandlung von SMA wird ebenfalls offenbart.
Liston et al. (Nature, Bd. 379, Nr. 6563, 25. Januar 1996, Seiten 349–353), vor dem internationalen Einreichungsdatum, jedoch nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Erfindung veröffentlicht, befasst sich mit dem Testen von Sequenzen, die zu der NAIP kodierenden Sequenz homolog sind, auf antiapoptotische Aktivität.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartige Sequenz vom Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein (NAIP) und ein NAIP-Fragment mit antiapoptotischen Aktivitäten, die die Nukleotide 3734 bis 3886 (Exon 14a) und 4139 bis 4503 (Exon 17) von SEQ ID NO-21 oder die Nukleotide 3838 bis 3990 (Exon 14a) und die Nukleotide 4243 bis 4605 (Exon 17) von SEQ ID NO:23 umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine im Wesentlichen reine Nukleinsäure bereit, die mindestens 90 % Nukleinsäuresequenzidentität zur vollständigen Nukleinsäuresequenz vom Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein (NAIP) von SEQ ID NO:21 aufweist und die Nukleotide 3734 bis 3886 (Exon 14a) und 4139 bis 4503 (Exon 17) von SEQ ID NO:21 enthält oder mindestens 90 % Nukleinsäuresequenzidentität zur vollständigen NAIP-Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO:23 aufweist und die Nukleotide 3838 bis 3990 von SEQ ID NO:23 und die Nukleotide 4243 bis 4605 von SEQ ID NO:23 enthält, wobei die Nukleinsäure ein NAIP-Polypeptid kodiert, das Apoptose inhibiert.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine im Wesentlichen reine Nukleinsäure bereit, die die Sequenz von SEQ ID NO:21 oder degenerierte Varianten davon aufweist und ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:22 aufweist, wobei das Polypeptid Apoptose inhibieren kann.
Vorzugsweise ist die Nukleinsäure mit einer Regulationssequenz zur Expression des NAIP-Polypeptids funktionsfähig verknüpft und die Regulationssequenz umfasst einen Promotor.
Vorzugsweise ist der Promotor ein konstitutiver Promotor und ist von einem oder mehreren externen Agenzien induzierbar oder ist zelltypspezifisch.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Vektor bereit, der die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung umfasst, wobei der Vektor die Expression eines NAIP-Polypeptids regeln kann, das Apoptose inhibieren kann.
Die Erfindung stellt außerdem eine Wirtszelle bereit, die den oben beschriebenen Vektor enthält.
In einer alternativen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein im Wesentlichen reines NAIP-Polypeptid eines Säugers bereit, das von der Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung kodiert wird.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine therapeutische Zusammensetzung bereit, die eine wirksame Menge des NAIP-Polypeptids der Erfindung in einem physiologisch unbedenklichen Träger umfasst.
Außerdem wird ein nichtmenschliches tierisches Transgen für eine NAIP-Nukleinsäuresequenz der Erfindung bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein In-vitro-Verfahren zum Erhalten eines NAIP-Polypeptids bereit. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

(a) Versehen einer Zelle mit einer Nukleinsäure der Erfindung, wobei die Nukleinsäure zur Expression in der Zelle angeordnet ist;
(b) Kultivieren der Zelle unter Bedingungen zum Exprimieren der DNA und
(c) Isolieren des NAIP-Polypeptids.

Die Erfindung stellt außerdem ein In-vitro-Verfahren zum Identifizieren einer NAIP-Nukleinsäure in einer Säugerzelle bereit. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

(a) Bereitstellen eines Präparats von Säugerzell-DNA der Zelle;
(b) Bereitstellen einer nachweisbar markierten DNA-Sequenz, die sich spezifisch an die Nukleotide 3734 bis 3886 (Exon 14a) und 4139 bis 4503 (Exon 17) von SEQ ID NO:21 oder die Nukleotide 3838 bis 3990 (Exon 14a) und die Nukleotide 4243 bis 4605 (Exon 17) von SEQ ID NO:23 bindet;
(c) Kontaktieren des Präparats von Zell-DNA mit der nachweisbar markierten DNA-Sequenz unter Hybridisierungsbedingungen, die für den Nachweis von Nukleinsäuren, die mindestens 50 % Nukleinsäuresequenzidentität aufweisen, sorgen; und
(d) Identifizieren einer NAIP-Nukleinsäure durch deren Verbindung mit der nachweisbar markierten DNA-Sequenz.

In einer alternativen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein In-vitro-Verfahren zum Isolieren einer NAIP-Nukleinsäure der Erfindung oder eines Teils davon bereit. Das Verfahren umfasst das Amplifizieren der NAIP-Nukleinsäure oder des Teils davon mittels PCR unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern, wobei die Primer:

(a) jeweils länger als 13 Nukleotide sind;
(b) jeweils Regionen von Komplementarität mit gegenüber liegenden DNA-Strängen aufweisen, die die Nukleotide 3838 bis 3990 (Exon 14a) oder die Nukleotide 4243 bis 4605 (Exon 17) von SEQ ID NO:23 umfassen; und
(c) wahlweise Sequenzen enthalten, die im amplifizierten Produkt Restriktionsenzymschnittstellen erstellen können; und das Isolieren der NAIP-Nukleinsäure oder des Teils davon.

Außerdem wird von der vorliegenden Erfindung ein In-vitro-Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die Apoptose moduliert, bereitgestellt. Das Verfahren umfasst das Kontaktieren einer Zelle, die ein NAIP-Polypeptid exprimiert, in vitro mit einer in Frage kommenden Verbindung und Überwachen der Expression einer NAIP-Nukleinsäure der Erfindung durch Nachweisen einer Nukleinsäuresequenz, die die Nukleotide 3838 bis 3990 von SEQ ID NO:23 oder die Nukleotide 4243 bis 4605 von SEQ ID NO:23 umfasst. Eine Veränderung des Niveaus der Expression der Nukleinsäure weist auf das Vorliegen einer Verbindung hin, die Apoptose moduliert.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Nukleinsäure vom Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein (NAIP) der Erfindung oder ein Polypeptid, das von der Nukleinsäuresequenz kodiert wird, zur Verwendung als ein Arzneimittel bereit.
Außerdem wird die Verwendung einer NAIP-Nukleinsäure der Erfindung oder eines Polypeptids, das von der Nukleinsäuresequenz kodiert wird, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von spinaler Muskelatrophie, ALS, AIDS, einer neurodegenerativen Erkrankung, eines myelodysplastischen Syndroms oder einer ischämischen Verletzung bereitgestellt.
Die Erfindung stellt außerdem ein NAIP-Antisense-Molekül, das eine Nukleinsäure umfasst, die zu den Nukleotiden 3734 bis 3886 (Exon 14a) oder den Nukleotiden 4139 bis 4503 (Exon 17) von SEQ ID NO:21 oder den Nukleotiden 3838 bis 3990 von SEQ ID NO:23 oder den Nukleotiden 4243 bis 4605 von SEQ ID NO:23 komplementär ist, und die Verwendung dieses Antisense-Moleküls als ein Arzneimittel bereit.
Im Allgemeinen weist die Erfindung ein im Wesentlichen reines Nukleinsäuremolekül auf, wie ein genomisches, cDNA-, Antisense-DNA-, RNA- oder ein synthetisches Nukleinsäuremolekül, das ein NAIP-Polypeptid eines Säugers der Erfindung kodiert oder diesem entspricht. Diese Nukleinsäure kann in einen Vektor eingebaut werden. Ein solcher Vektor kann sich in einer Zelle befinden, wie einer Säuger-, Hefe-, Nematoden- oder Bakterienzelle. Die Nukleinsäure kann auch in ein nichtmenschliches transgenes Tier oder einen Embryo davon eingebaut werden. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Nukleinsäuremolekül eine humane NAIP-Nukleinsäure. In am meisten bevorzugten Ausführungsformen ist das NAIP-Gen ein humanes NAIP-Gen. In anderen verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle eine transformierte Zelle.
Die Nukleinsäuresequenz enthält die cDNA-Sequenzen, die die Exone 14a und 17 kodieren. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform enthält die Sequenz die Exone 1 – 14, 14a und 15 – 17. In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen enthält die Sequenz außerdem die vollständigen untranslatierten 5'- und 3'-Regionen des NAIP-Gens und wird als SEQ ID NO: 2, 21 oder 23, am meisten bevorzugt als SEQ ID NO:21 dargestellt. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist die Nukleinsäure eine gereinigte Nukleotidsequenz, die genomische DNA, cDNA, mRNA, Antisense-DNA oder andere DNA umfasst, die im Wesentlichen mit den cDNR-Sequenzen von SEQ ID NO:2, 21 oder 23 identisch ist, die den cDNA-Sequenzen der Erfindung entsprechen. Am meisten bevorzugt sind die Exone 1 bis 14 und 14a bis 17 wie in SEQ ID NO:21 beschrieben.
In spezifischen Ausführungsformen weist die Erfindung Nukleinsäuresequenzen auf, die im Wesentlichen mit den in 21 gezeigten Sequenzen oder Fragmenten davon identisch sind, wobei die Fragmente die Nukleotide 3734 bis 3886 (Exon 14a) und 4139 bis 4503 (Exon 17) von SEQ ID NO:21 oder die Nukleotide 3838 bis 3990 (Exon 14a) und die Nukleotide 4243 bis 4605 (Exon 17) von SEQ ID NO:23 umfassen und ein Polypeptid kodieren, das Apoptose inhibiert.
In einem anderen Gesichtspunkt weist die Erfindung außerdem RNA auf, die von der hierin beschriebenen DNA kodiert wird. Vorzugsweise handelt es sich bei der RNA um mRNA. In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei der RNA um Antisense-RNA, die zum kodierenden Strang von NAIP komplementär ist.
Die NAIP kodierende Nukleinsäure umfasst mindestens die 3 BIR-Domänen einer hierin bereitgestellten NAIP-Sequenz (z. B. die Nukleotide 1–1360 der in 6 bereitgestellten NAIP-Sequenz), es fehlen ihr jedoch mindestens einige der Sequenzen, die den Carboxyterminus des NAIP-Polypeptids kodieren. Vorzugsweise werden mindestens 30 Nukleinsäuren aus der Region des NAIP-Gens zwischen den Nukleinsäuren 1360 (d. h, dem Ende der BIR-Domänen) und 4607 (d. h. dem Ende der kodierenden Sequenz) der in 6 gezeigten NAIP-Sequenz, SEQ ID NO:21, deletiert. Mehr bevorzugt werden mindestens 100 Nukleotide deletiert und noch mehr bevorzugt werden mindestens 1000 Nukleotide deletiert. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform werden bis zu 3247 Nukleotide deletiert. Vorzugsweise resultiert die Deletion in einem statistisch signifikanten Anstieg der antiapoptotischen Aktivität des kodierten Proteins auf einem der hierin bereitgestellten Assays.
Die Erfindung weist eine im Wesentlichen reine DNA auf, die einen Promotor enthält, der das erfindungsgemäße NAIP-Gen oder die erfindungsgemäßen NAIP-Fragmente in einer Zelle, die für Apoptose anfällig ist, exprimieren oder die Expression dieses bzw. dieser aktivieren kann. In bevorzugten Ausführungsformen dieses Gesichtspunkts handelt es sich bei dem NAIP-Gen um erfindungsgemäßes humanes NAIP oder erfindungsgemäße humane NAIP-Fragmente, wie oben beschrieben. In weiter bevorzugten Ausführungsformen dieses Gesichtspunkts der Erfindung handelt es sich bei dem Promotor um den Promotor, der im NAIP-Gen nativ ist. Darüber hinaus sind transkriptionelle und translationelle Regulationsregionen vorzugsweise jene, die in einem NAIP-Gen nativ sind.
Die Erfindung stellt transgene Zelllinien bereit, die die NAIP-Nukleinsäuren der Erfindung enthalten. Die transgenen Zellen der Erfindung sind vorzugsweise Zellen, deren apoptotische Reaktion verändert worden ist. In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei der transgenen Säugerzelle um einen Fibroblast, eine Nervenzelle, eine Lungenzelle, eine Nierenzelle, eine Lymphzelle, eine Gliazelle, eine Myokardzelle, eine embryonale Stammzelle oder eine Insektenzelle. Am meisten bevorzugt handelt es sich bei dem Neuron um ein Motorneuron und der Lymphozyt ist eine CD4+-T-Zelle.
Es wird außerdem ein In-vitro-Verfahren zum Verändern des Apoptose-Niveaus beschrieben, das das Erzeugen einer transgenen Zelle umfasst, die ein Transgen aufweist, das ein NAIP-Polypeptid oder eine NAIP-Antisense-Nukleinsäure der Erfindung kodiert. Das Transgen ist im Genom der Zelle so integriert, dass eine Expression ermöglicht wird. Des Weiteren reicht das Niveau der Expression in der Zelle dazu aus, das Apoptose-Niveau zu verändern. Vorzugsweise befindet sich das Transgen in einem Motorneuron oder einer Myokardzelle.
In noch einem anderen verwandten Gesichtspunkt weist die Erfindung ein nichtmenschliches transgenes Tier auf, vorzugsweise einen Säuger, mehr bevorzugt einen Nager und am meisten bevorzugt eine Maus, das ein wie oben beschriebenes NAIP-Gen, das in das Genom (Mutation oder Wildtyp) insertiert wurde, oder einen Knock-out des NAIP-Gens im Genom oder beides aufweist. Ein nichtmenschliches transgenes Tier, das die NAIP-Antisense-Nukleinsäure der Erfindung exprimiert, ist ebenfalls beinhaltet. Die nichtmenschlichen transgenen Tiere können entweder eine erhöhte oder eine verminderte Menge an NAIP-Polypeptid exprimieren, je nach dem verwendeten Konstrukt und der Art der genomischen Veränderung. Die Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das ein NAIP der Erfindung kodiert, um eine Knock-out-Mutation in einem NAIP-Gen zu konstruieren, beispielsweise würde ein nichtmenschliches Tier mit verminderter Expression von entweder dem gesamten oder einem Teil des entsprechenden NAIP-Polypeptids hervorbringen. Im Gegensatz dazu würde das Insertieren exogener Kopien eines NAIP-Gens der Erfindung in das Genom, vorzugsweise unter der Steuerung aktiver Regulations- und Promotorelemente, zu einer gesteigerten Expression des entsprechenden NAIP-Polypeptids führen.
In einem anderen Gesichtspunkt weist die Erfindung ein In-vitro-Verfahren zum Nachweisen eines NAIP-Gens in einer Zelle durch Nachweisen des NAIP-Gens oder eines Teils davon (der länger als 9 Nukleotide und vorzugsweise länger als 18 Nukleotide ist) mit einem Präparat von genomischer DNA aus der Zelle auf. Das NAIP-Gen und die genomische DNA werden unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die eine Hybridisierung (und somit den Nachweis) von Nukleinsäuresequenzen in der Zelle ermöglichen, die zu mindestens 50 % mit der DNA identisch sind, die die NAIP-Polypeptide kodiert. Die verwendete Nukleinsäure umfasst mindestens einen Teil des Exons 14a oder Exons 17, wie in den 6 und 7 bereitgestellt.
In einem anderen Gesichtspunkt weist die Erfindung ein Verfahren zum Produzieren eines NAIP-Polypeptids in vitro auf. In einer Ausführungsform umfasst dieses Verfahren das Versehen einer Zelle mit Nukleinsäure, die das gesamte oder einen Teil eines NAIP-Polypeptids kodiert (das zur Expression in der Zelle angeordnet ist), Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die die Expression der Nukleinsäure ermöglichen, und Isolieren des NAIP-Polypeptids. In bevorzugten Ausführungsformen wird das NAIP-Polypeptid von DNA exprimiert, die unter der Steuerung eines konstitutiven oder induzierbaren Promotors steht. Wie hierin beschrieben kann der Promotor ein nativer oder heterologer Promotor sein. Die Nukleinsäure umfasst das Exon 14a oder das Exon 17. Am meisten bevorzugt handelt es sich bei der Nukleinsäure um die in entweder 6 oder 7 gezeigte Nukleinsäure. Am meisten bevorzugt ist sie die Sequenz von 6.
In einem anderen Gesichtspunkt weist die Erfindung im Wesentlichen reines NAIP-Polypeptid eines Säugers auf. Das Polypeptid enthält eine Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen mit einer der in einer beliebigen der 6 oder 7 gezeigten Aminosäuresequenzen identisch ist. Am meisten bevorzugt handelt es sich bei dem Polypeptid um das humane NAIP-Polypeptid von 6. Fragmente, die mindestens zwei BIR-Domänen enthalten, wie hierin bereitgestellt, sind ebenfalls Teil der Erfindung. Vorzugsweise weist das Fragment mindestens drei BIR-Domänen auf. Beispielsweise sind Polypeptide, die von den oben beschriebenen Nukleinsäuren kodiert werden und Deletionen zwischen den Nukleinsäuren 1360 und dem Ende des Gens aufweisen, Teil der Erfindung. In einer Ausführungsform beinhalten die erfindungsgemäßen NAIP-Fragmente diejenigen NAIP-Fragmente, die mindestens 15 sequentielle Aminosäuren von SEQ ID NO:22 oder 24 umfassen. Das Fragment enthält mindestens einen Teil des Exons 14a oder des Exons 17.
In einem anderen Gesichtspunkt weist die Erfindung ein rekombinantes Polypeptid eines Säugers auf, das von NAIP abgeleitet ist und Apoptose modulieren kann. Das Polypeptid kann mindestens zwei wie hierin definierte BIR-Domänen enthalten, vorzugsweise drei BIR-Domänen. In bevorzugten Ausführungsformen unterscheidet sich die NAIP-Aminosäuresequenz von den NAIP-Sequenzen von 6 oder 7 nur durch konservative Substitutionen oder unterscheidet sich von den Sequenzen, die von den Nukleinsäuren von SEQ ID NO:12, 21 oder 23 kodiert werden, durch Deletionen von Aminosäuren, die zu den BIR-Domänen carboxyterminal sind. In anderen bevorzugten Ausführungsformen verringert das rekombinante Protein die Apoptose im Verhältnis zu einer Kontrolle um mindestens 5 %, mehr bevorzugt um 25 %.
In einem anderen Gesichtspunkt weist die Erfindung ein In-vitro-Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung auf, die Apoptose moduliert. Das Verfahren beinhaltet das Kontaktieren einer Zelle, die ein NAIP-Polypeptid der vorliegenden Erfindung exprimiert oder exprimieren kann, in vitro mit einer in Frage kommenden Verbindung und Überwachen der Expression der NAIP-Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung durch Nachweisen einer Nukleinsäuresequenz, die die Nukleotide 3838 bis 3990 oder die Nukleotide 4243 bis 4605 von SEQ ID NO:23 umfasst. Eine Veränderung des Niveaus der Expression der NAIP-Nukleinsäure weist auf das Vorliegen einer Verbindung hin, die Apoptose moduliert. Die Verbindung kann ein Apoptoseinhibitor oder -Enhancer sein. In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei der Säugerzelle um eine Myokardzelle, einen Fibroblast, eine Nervenzelle, eine Gliazelle, einen Lymphozyten (T-Zelle oder B-Zelle) oder eine Insektenzelle.
In einem verwandten Gesichtspunkt weist die Erfindung Verfahren zum Nachweisen von Verbindungen, die Apoptose modulieren, unter Verwendung der Interaction-Trap-Technologie und NAIP-Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder Fragmente der vorliegenden Erfindung als einen Bestandteil des Köders („bait") auf. In bevorzugten Ausführungsformen ist die als ein Modulator von Apoptose geprüfte Verbindung ebenfalls ein Polypeptid.
NAIP-Nukleinsäure und Polypeptide der Erfindung können bei der Diagnose einer Zellproliferationserkrankung oder einer erhöhten Wahrscheinlichkeit einer solchen Erkrankung verwendet werden; es kann z. B. eine NAIP-Nukleinsäuresonde oder ein NAIP-Antikörper verwendet werden. Vorzugsweise handelt es sich bei der Erkrankung um eine Krebserkrankung des zentralen Nervensystems. Am meisten bevorzugt ist die Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Neuroblastom, Meningiom, Gliablastom, Astrozytom, Neuroastrozytom, Promyelozytenleukämie, einem Karzinom des HeLa-Typs, chronischer myelogener Leukämie (vorzugsweise unter Verwendung von xiap- oder hiap-2-verwandten Sonden), Lymphoblastenleukämie (vorzugsweise unter Verwendung einer xiap-verwandten Sonde), Burkittschem Lymphosarkom, kolorektalem Adenokarzinom, Lungenkarzinom und Melanom. Vorzugsweise wird eine Diagnose durch einen 2-fachen Anstieg der Expression oder Aktivität, mehr bevorzugt mindestens einen 10-fachen Anstieg der Expression oder Aktivität angezeigt.
NAIP-Nukleinsäure und Polypeptide der Erfindung können auch zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von schädlichen Apoptose-Niveaus verwendet werden. Wo der Patient mehr Apoptose als wünschenswert aufweist oder es ihm anderweitig an normalem NAIP mangelt, ist eine therapeutisch wirksame Menge von NAIP-Protein, NAIP-Nukleinsäure oder einer Verbindung, die die NAIP-Aktivitätsniveaus in einer Form steigert, die die Abgabe an Zellen ermöglicht, die mehr Apoptose erfahren, als therapeutisch wünschenswert ist, geeignet. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Zelle mit schädlichen Apoptose-Niveaus um eine Myokardzelle in einem Patienten, der mit einem Herzleiden diagnostiziert wurde.
Wo es wahrscheinlich ist, dass unzureichende Apoptose-Niveaus auftreten, ist eine Antisense-NAIP-Nukleinsäure der Erfindung, ein NAIP-Antikörper oder eine Verbindung, die anderweitig die NAIP-Aktivitätsniveaus vermindert, geeignet. Die Behandlung von SMA ist von dieser Ausführungsform der Erfindung speziell ausgeschlossen. Folglich kann Apoptose in einer Zelle induziert werden, indem der Zelle ein negativer Regulator des NAIP-abhängigen antiapoptotischen Stoffwechselwegs verabreicht wird. Der negative Regulator kann ein NAIP-Polypeptid-Fragment der Erfindung oder ein gereinigter NAIP-spezifischer Antikörper sein, ist aber nicht darauf beschränkt: Der negative Regulator kann auch ein NAIP-Antisense-RNA-Molekül der Erfindung sein.
Erfahrene Fachmänner werden erkennen, dass eine NAIP eines Säugers der vorliegenden Erfindung als ein Wirkstoff in einer therapeutischen Zusammensetzung dienen kann. Diese Zusammensetzung kann je nach dem enthaltenen NAIP oder Fragment der Erfindung zum Modulieren von Apoptose und dadurch zum Behandeln jeglichen Leidens verwendet werden, das von einer Störung der Apoptose verursacht wird. Folglich versteht sich, dass ein anderer Gesichtspunkt der hierin beschriebenen Erfindung die Verbindungen der Erfindung in einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger beinhaltet.
Wie oben zusammengefasst kann eine NAIP-Nukleinsäure oder ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung zum Modulieren von Apoptose verwendet werden. Des Weiteren kann eine NAIP-Nukleinsäure oder ein Polypeptid bei der Entdeckung und/oder Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation von Apoptose verwendet werden.
Mit „NAIP-Gen" ist ein Gen gemeint, das ein Polypeptid kodiert, das mindestens das Exon 14a oder Exon 17 von 6 oder 7 oder die Sequenz von 5, SEQ ID NO:1, aufweist, in der mindestens 10 carboxyterminale Nukleinsäuren deletiert worden sind, um die Aktivität zu steigern, wie oben beschrieben. Das NAIP-Gen kodiert ein Polypeptid, das Apoptose inhibieren kann. Ein NAIP-Gen ist eine Nukleinsäure mit 90 % oder mehr Nukleinsäuresequenzidentität zu den NAIP-Aminosäure kodierenden Sequenzen von 6 oder 7. Das NAIP-Gen kodiert ein Polypeptid, das Apoptose inhibiert. Bei der Sequenzregion, über die die Identität gemessen wird, handelt es sich um eine Region, die Nukleinsäure enthält, die Exon 14a oder Exon 17 kodiert. NAIP-Gene eines Säugers enthalten Nukleotidsequenzen, die aus einer beliebigen Säugerquelle isoliert wurden. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Säuger um einen Menschen.
Der Ausdruck „NAIP-Gen" soll ein beliebiges NAIP-Gen umfassen, das durch seine Fähigkeit zum Modulieren von Apoptose gekennzeichnet ist und ein Polypeptid kodiert, das 90 % Aminosäuresequenzidentität mit den in den 6 und 7 gezeigten NAIP-Polypeptiden aufweist.
Speziell ausgeschlossen ist die vollständige Sequenz, die in PCT/CA95/00581 offenbart und in SEQ ID NO:1 gezeigt ist.
Mit „NAIP-Protein" oder „NAIP-Polypeptid" ist ein Polypeptid oder erfindungsgemäßes Fragment gemeint, das wie oben beschrieben von einem NAIP-Gen kodiert wird.
Mit „Modulieren von Apoptose" oder „Verändern von Apoptose" ist Erhöhen oder Verringern der Anzahl von Zellen, die andernfalls in einer gegebenen Zellpopulation Apoptose erfahren würden, gemeint. Vorzugsweise ist die Zellpopulation aus einer Gruppe ausgewählt, die T-Zellen, Nervenzel len, Fibroblasten, Myokardzellen oder eine beliebige andere Zelllinie, von der bekannt ist, dass sie in einer Laborsituation Apoptose erfahren würde (z. B. die mit Bakulovirus infizierten Insektenzellen, beinhaltet. Man wird zu schätzen wissen, dass das Ausmaß der Modulation, das von einem NAIP oder einer modulierenden Verbindung bereitgestellt wird, in einem gegebenen Assay variieren wird, ein Fachmann kann jedoch die statistisch signifikante Veränderung des Apoptose-Niveaus ermitteln, die ein NAIP oder eine Verbindung, die ein NAIP moduliert, identifiziert.
Mit „Inhibieren von Apoptose" ist eine beliebige Verringerung der Anzahl von Zellen, die im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle Apoptose erfahren, gemeint. Vorzugsweise macht die Verringerung mindestens 25 % aus, mehr bevorzugt macht die Verringerung 50 % aus und am meisten bevorzugt ist die Verringerung mindestens einfach.
Mit „Polypeptid" ist eine beliebige Kette von mehr als zwei Aminosäuren gemeint, ungeachtet der posttranslationellen Modifizierung, wie Glykosylierung oder Phosphorylierung.
Mit „im Wesentlichen identisch" ist ein Polypeptid oder eine Nukleinsäure gemeint, die mindestens 90 % Identität zu einer Referenzaminosäure oder -nukleinsäuresequenz aufzeigt.
Sequenzidentität wird in der Regel unter Verwendung von Sequenzanalysensoftware mit den darin spezifizierten Standardparametern gemessen (z. B. Sequence Analysis Software Package der Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705, USA). Dieses Softwareprogramm gleicht ähnliche Sequenzen ab, indem es verschiedenen Substitutionen, Deletionen oder anderen Modifizierungen Homologiegrade zuordnet. Konservative Substitutionen beinhalten in der Regel Substitutionen in den folgenden Gruppen: Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin; Aspartinsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin.
Mit „im Wesentlichen reines Polypeptid" ist ein Polypeptid gemeint, das von den Bestandteilen getrennt worden ist, die mit diesem naturgemäß einhergehen. In der Regel ist das Polypeptid im Wesentlichen rein, wenn es zu mindestens 60 Gew.-% von den Proteinen und natürlich vorkommenden organischen Molekülen frei ist, mit denen es naturgemäß assoziiert ist. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Polypeptid um ein NAIP-Polypeptid, das zu mindestens 75 Gew.-%, mehr bevorzugt mindestens 90 Gew.-% und am meisten bevorzugt mindestens 99 Gew.-% rein ist. Ein im Wesentlichen reines NAIP-Polypeptid kann beispielsweise durch Extraktion aus einer natürlichen Quelle (z. B. einem Fibroblast, einer Nervenzelle oder einem Lymphozyt), durch Expression einer rekombinanten Nukleinsäure, die ein NAIP-Polypeptid kodiert, oder durch chemisches Synthetisieren des Proteins gewonnen werden. Die Reinheit kann mittels eines beliebigen geeigneten Verfahrens gemessen werden, z. B. mittels Säulenchromatographie, Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder HPLC-Analyse.
Ein Protein ist im Wesentlichen von naturgemäß assoziierten Bestandteilen frei, wenn es von diesen Kontaminanten getrennt ist, die mit diesem in seinem natürlichen Zustand einhergehen. Folglich wird ein Protein, das chemisch synthetisiert oder in einem Zellsystem, das sich von der Zelle unterscheidet, aus der es naturgemäß stammt, produziert wird, im Wesentlichen von seinen naturgemäß assoziierten Bestandteilen frei sein. Dementsprechend beinhalten im Wesentlichen reine Polypeptide die von eukaryotischen Organismen abgeleiteten, aber in E. coli oder anderen Prokaryoten synthetisierten. Mit „im Wesentlichen reine DNA" ist DNA gemeint, die von den Genen frei ist, die im natürlich vorkommenden Genom des Organismus, aus dem die DNA der Erfindung abgeleitet ist, das Gen flankieren. Der Ausdruck beinhaltet daher beispielsweise eine rekombinante DNA, die in einen Vektor; in ein autonom replizierendes Plasmid oder einen autonom replizierenden Virus oder in die genomische DNA eines Prokaryoten oder Eukaryoten eingebaut ist; oder die als ein separates Molekül existiert (z. B. eine cDNA oder eine genomische oder ein cDNA-Fragment, das mittels PCR oder Restriktionsendonukleaseverdau produziert wurde), unabhängig von anderen Sequenzen. Er beinhaltet auch eine rekombinante DNA, die Teil eines Hybridgens ist, das eine zusätzliche Polypeptidsequenz kodiert.
Mit „transformierte Zelle" ist eine Zelle gemeint, in die (oder in einen Vorfahr derer) mittels rekombinanter DNA-Techniken ein DNA-Molekül, das (wie hierin verwendet) ein NAIP-Polypeptid kodiert, eingeführt worden ist.
Mit „Transgen" ist ein beliebiges Stück DNA gemeint, das durch einen Kunstgriff in eine Zelle insertiert wird und Teil des Genoms des Organismus wird, der sich aus dieser Zelle entwickelt. Ein derartiges Transgen kann ein Gen beinhalten, das mit dem transgenen Organismus teilweise oder vollständig heterolog ist (d. h. diesem fremd ist), oder kann ein Gen repräsentieren, das zu einem endogenen Gen des Organismus homolog ist.
Mit „transgen" ist eine beliebige Zelle gemeint, die eine DNA-Sequenz enthält, die durch einen Kunstgriff in eine Zelle insertiert wird und Teil des Genoms des Organismus wird, der sich aus dieser Zelle entwickelt. Wie hierin verwendet sind transgene Organismen im Allgemeinen transgene Säuger (z. B. Nager, wie Ratten oder Mäuse), und die DNA (das Transgen) wird durch einen Kunstgriff in das Kerngenom insertiert.
Mit „Transformation" ist ein beliebiges Verfahren zum Einführen von Fremdmolekülen in eine Zelle gemeint. Lipofektion, Calciumphosphat-Präzipitation, retrovirale Abgabe, Elektroporation und biolistische Transformation sind nur ein paar der Lehren, die verwendet werden können. Bei biolistischer Transformation beispielsweise handelt es sich um ein Verfahren zum Einführen von Fremdmolekülen in eine Zelle unter Verwendung von mittels Geschwindigkeit angetriebenen Mikroprojektilen, wie Wolfram- oder Goldteilchen. Solche mittels Geschwindigkeit angetriebenen Verfahren rühren von Druckschüben her, die mittels Helium angetriebene, mittels Luft angetriebene und mittels Schwarzpulver angetriebene Techniken beinhalten, aber nicht darauf beschränkt sind. Biolistische Transformation kann auf die Transformation oder Transfektion einer großen Vielfalt von Zelltypen und intakten Geweben angewendet werden, einschließlich, ohne Einschränkung, intrazellulären Organellen (z. B. Mitochondrien und Chloroplasten), Bakterien, Hefe, Pilzen, Algen, tierischem Gewebe und kultivierten Zellen.
Mit „zur Expression angeordnet" ist gemeint, dass das DNA-Molekül neben einer DNA-Sequenz angeordnet ist, die die Transkription und Translation der Sequenz steuert (d. h. die Produktion z. B. eines NAIP-Polypeptids, eines rekombinanten Proteins oder eines RNA-Moleküls erleichtert).
Mit „Reportergen" ist ein Gen gemeint, dessen Expression geprüft werden kann; solche Gene beinhalten, ohne Einschränkung, Glucuronidase (GUS), Luciferase, Chloramphenicoltransacetylase (CAT) und β-Galactosidase und grünes fluoreszierendes Protein (GFP).
Mit „Promotor" ist die zur direkten Transkription ausreichende Mindestsequenz gemeint. Ebenfalls von der Erfindung umfasst sind jene Promotorelemente, die dazu ausreichen, promotorabhängige Genexpression für zelltypenspezifische, gewebespezifische oder von externen Signalen oder Agenzien induzierbare steuerbar zu machen; solche Elemente können sich in den 5'- oder 3'-Regionen des nativen Gens befinden.
Mit „funktionsfähig verknüpft" ist gemeint, dass ein Gen und eine oder mehrere Regulationssequenzen derart verbunden werden, um eine Genexpression zuzulassen, wenn die entsprechenden Moleküle (z. B. transkriptionelle Aktivatorproteine) an die Regulationssequenzen gebunden werden.
Mit „konservierte Region" ist eine beliebige Länge aus sechs oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren gemeint, die mindestens 30 %, vorzugsweise 50 % und am meisten bevorzugt 70 % Aminosäuresequenzidentität zwischen zwei oder mehreren der NAIP-Familienmitglieder (z. B. zwischen humanem NAIP und murinem NAIP) aufzeigt.
Mit „carboxyterminalen Aminosäuren von NAIP" sind die Aminosäuren vom Carboxy gemeint, das zu den drei BIR- Domänen des NAIP-Gens terminal ist. Beispielsweise die Aminosäuren, die jenseits der Nukleinsäure 1360 von SEQ ID NO:21 kodiert wurden, sind carboxyterminal.
Mit „nachweisbar markiert" ist ein beliebiges Mittel zum Kennzeichnen und Identifizieren des Vorliegens eines Moleküls gemeint, z. B, eine Oligonukleotidsonde oder ein Oligonukleotidprimer, ein Gen oder Fragment davon oder ein cDNA-Molekül. Verfahren zum nachweisbaren Markieren eines Moleküls sind in der Technik wohl bekannt und beinhalten, ohne Einschränkung, radioaktive Markierung (z. B. mit einem Isotop, wie ³²P oder ³⁵S) und nichtradioaktive Markierung (z. B. chemilumineszente Markierung, z. B. Fluoreszein-Markierung).
Mit „Antisense", wie hierin in Bezug auf Nukleinsäuren verwendet, ist eine Nukleinsäuresequenz gemeint, ungeachtet der Länge, die zum kodierenden Strang eines Gens komplementär ist.
Mit „gereinigter Antikörper" ist ein Antikörper gemeint, der zu mindestens 60 Gew.-% frei von Proteinen und natürlich vorkommenden organischen Molekülen ist, mit denen er naturgemäß assoziiert ist. Vorzugsweise ist das Präparat zu mindestens 75 Gew.-%, mehr bevorzugt 90 Gew.-% und am meisten bevorzugt mindestens 99 Gew.-% Antikörper, z. B. ein NAIP-spezifischer Antikörper. Ein gereinigter Antikörper kann beispielsweise durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von rekombinant produziertem Protein oder konservierten Motivpeptiden und Standardtechniken gewonnen werden.
Mit „bindet spezifisch" ist ein Antikörper gemeint, der ein Protein erkennt und bindet, der jedoch andere Moleküle in einer Probe, z. B. einer biologischen Probe, die naturgemäß Protein enthält, nicht im Wesentlichen erkennt und bindet. Der bevorzugte Antikörper bindet an die NAIP-Peptidsequenz von Sequenz ID NO:2, aber bindet nicht an die NAIP-Sequenz, die in PCT/CA 95/00581 offenbart wird.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen davon und aus den Ansprüchen offenbar werden.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Verschiedene Gesichtspunkte der Erfindung werden mit Bezug auf die Zeichnungen beschrieben, in denen:
1 die Expression von NAIP in gepoolten stabilen HeLa-, CHO- und Rat-1-Linien und mit Adenovirus infizierten Zellen zeigt, mittels Western-Blotting (A–D) und Immunfluoreszenz analysiert. A–B sind Zellen, die mit Adenovirus infiziert wurden, der NAIP-myc kodiert, das mittels eines monoklonalen Maus-Anti-myc-Antikörpers oder mittels eines polyklonalen Kaninchen-Anti-Mensch-NAIP-Antikörpers nachgewiesen wurde. C Zellen, die mit Adenovirus infiziert wurden, das NAIP kodiert, das mittels des polyklonalen NAIP-Antikörpers nachgewiesen wurde. D die Expression von myc-NAIP in repräsentativen gepoolten Zelllinien mittels Immunfluoreszenz, die mit Antikörpern gegen myc nachgewiesen wurde. E–F Rat-1-NAIP-Transfektanten, die mittels Anti-myc (E) und Anti-NAIP-Antikörpern (F) nachgewiesen wurden.
2 zeigt die Wirkung von NAIP auf durch Serumentzug, Menadion und TNF-α induzierten Zelltod. Die Lebensfähigkeit von CHO-Zellen, denen Serum entzogen wurde, in A: mit Adenovirus infizierte Zellen und in B: gepoolte Transformanten. C–H: Mittels Menadion induzierter Zelltod in mit Adenovirus infizierten CHO (C, D) und Rat-1 (E, F und G, H), mit Adenovirus infizierte Zellen bzw. gepoolte Transformanten. Mit Adenovirus infizierte (I) und gepoolte Transformanten (J) von mit TNF-α/Cyclohexamid behandelten HeLa-Zellen.
3 zeigt eine Immunfluoreszenzanalyse von humanem Rückenmarkgewebe. A: Vorderhornzellen. B: Intermediolaterale Neuronen. C: Hinterwurzeln. D: Vorderwurzeln.
4 stellt die genomische Struktur von PAC125D9 aus humanem Chromosom 5q13.1 bildlich dar. Beide Stränge der in der Figur gezeigten 131.708 bp langen Region sind sequenziert worden und können als GenBank-Zugangsnummer U80017 gefunden werden. NotI- (N), EcoRI- (E), HindIII- (H) und BamHI-Stellen (B) sind angezeigt. Die Exone von BTF2p44 (grün), NAIP (rot) und SMN (grau) sind oben durch nummerierte farbige Kästchen dargestellt. Die transkribierte (jedoch nicht translatierte) CCA-Sequenz ist durch das hellgrüne Kästchen angezeigt. Die Anzahl von Nukleotiden, die eine spezifische Region umspannt, ist wie angezeigt, z. B. der Gap zwischen NAIP und SMN macht 15.471 bp aus. Das minimale Tiling-Muster von Plasmidklonen, die die PAC bedecken, ist unten gezeigt. Die Buchstaben am Anfang jedes Klons zeigen die Restriktionsenzyme an, die zum Herstellen der Plasmid-Bibliotheken verwendet wurden, mit Ausnahme von 1C6, 2A8 und 2E2, die Klone aus den partiellen Sau3AI-Bibliotheken sind. (SstI-S). Der Ort und die Orientierung von acht Klassen von Wiederholungssequenzen, die mit dem NIH Sequin-Programm gefunden wurden, sind durch farbige Dreiecke bildlich dargestellt. Die Namen von Wiederholungen, die durch verschiedene Farben dargestellt sind, sind im rechten oberen Teil der Figur gezeigt. Mittels des GRAIL- (roter Pfeil) oder des Prestridge-Programms (D.S. Prestridge, J. Mol. Biol. 249, 923–932 (1995)) (grüner Pfeil) nachgewiesene Promotorsequenzen und CpG-Inseln sind als Pfeile bzw. blaue Blöcke über dem Balken gezeigt.
5 zeigt die Sequenzen, die bei 2 separaten Sequenzierungen des NAIP-Gens erhalten wurden.
6 zeigt eine bevorzugte NAIP-cDNA-Sequenz und die vorhergesagte NAIP-Polypeptidsequenz.
7 zeigt eine NAIP-Sequenz, die die Intron/Exon-Grenzen beinhaltet. (SEQ ID NO: 23).
Ausführliche Beschreibung
Obwohl die genaue Stelle und der genaue Mechanismus der antiapoptotischen Wirkung von NAIP unbekannt sind, wird nun demonstriert, dass NIAP klar an apoptotischen Stoffwechselwegen in Säugerzellen beteiligt ist. Darüber hinaus weist die Immunfluoreszenzlokalisierung darauf hin, dass NAIP in Motorneuronen, nicht jedoch in Sinnesneuronen exprimiert wird. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung mit dem Protein, das als ein negativer Regulator von Apoptose, ganz besonders neuronaler Apoptose fungiert, und, wenn es daran mangelt oder es abwesend ist, zu den neurodegenerativen Phänotypen, wie SMA und ALS, beiträgt.
I. Das NAIP-Gen
Es gibt zwei fast identische Kopien von NAIP an 5q13.1. Das komplette NAIP-Gen, in 6 gezeigt, enthält 18 Exone (1 bis 14 und 14a bis 17) und umspannt geschätzte 90 kb genomischer DNA. (Andere erhaltene Zwischensequenzen sind in den 5 und 7 gezeigt.) Die NAIP kodierende Region umspannt 4212 Nukleotide, was in einem vorhergesagten Genprodukt aus 1404 Aminosäuren resultiert (SEQ ID NO:22). Die Gesamtlänge des NAIP-Gens umspannt 6228 Nukleotide (SEQ ID NO:21), mit einer 5'-UTR aus 395 Nukleotiden und einer 3'-UTR aus 1621 Nukleotiden. Die komplette Sequenz, Sequenz ID NO:2, ermöglicht einem Fachmann, Sonden und Primer zur Identifizierung von homologen Sequenzen und zur Identifizierung von Mutationen in der DNA zu entwickeln. Sowohl die 5'- als auch die 3'-Region können außerdem als für Agenzien kodierende Bindungsstellen nützlich erweisen, die das Gen hoch- oder herunterregulieren könnten, wodurch der NAIP-Stoffwechselweg und die NAIP-Funktion weiter abgegrenzt werden. Die als SEQ ID NO:2 und 23 identifizierten Sequenzen sind außerdem zur Proteinexpression in geeigneten Vektoren und Wirten von Nutzen, um NAIP zu produzieren und dessen Funktion zu studieren sowie um Antikörper zu entwickeln. Die Sequenzierung des 154 kb langen PAC125D9, das als eine wahrscheinliche Stelle des SMA-Gens identifiziert wurde, resultierte in der Identifizierung der in 5 gezeigten NAIP-Sequenz, SEQ ID NO: 1. Eine zusätzliche kodierende Sequenz, Exon 14a, ist seitdem identifiziert worden und wird hiermit bereitgestellt. Die NAIP-DNA-Sequenz, die das Exon 14a enthält, scheint eine vorherrschende Gen-Isoform zu sein, die in SMA-Patienten nicht deletiert oder mutiert ist. Die zur Isolierung und Anwendung von Exon 14a aus den humanen fötalen Rückenmark-cDNA-Bibliotheken verwendeten Techniken und Primer waren wie zur Identifizierung der anderen Exone und in Beispiel 4 genau beschrieben. Ein zusätzliches Screening von cDNA-Bibliotheken in Kombination mit einer Analyse der genomischen DNA-Sequenz von PAC125D9 resultierte in der Identifizierung eines neuartigen 3'-Endes von NAIP, das eine zusätzliche Exon 17-Sequenz enthält.
II. Synthese von NAIP
Die Charakteristika der klonierten NAIP-Gensequenz kann mittels Einführen der Sequenz in verschiedene Zelltypen oder unter Verwendung von extrazellulären In-vitro-Systemen analysiert werden. Die Funktion des NAIP kann dann unter verschiedenen physiologischen Bedingungen untersucht werden. Die NAIP-DNA-Sequenz kann in Studien manipuliert werden, um die Expression des Gens und Genprodukts zu verstehen. Alternativ können Zelllinien produziert werden, die das Genprodukt überexprimieren, was die Reinigung von NAIP zur biochemischen Charakterisierung, Produktion im großen Maßstab, Antikörperproduktion und Patiententherapie ermöglicht.
Zur Proteinexpression können eukaryotische und prokaryotische Expressionssysteme erstellt werden, in denen die NAIP-Gensequenz in ein Plasmid oder einen anderen Vektor eingeführt wird, der dann in lebende Zellen eingeführt wird. Konstrukte, in denen die NAIP-cDNA-Sequenz, die den gesamten offenen Leserahmen enthält, in der korrekten Ausrichtung in ein Expressionsplasmid insertiert wurde, können zur Proteinexpression verwendet werden. Alternativ können Teile der Sequenz, einschließlich der Wildtyp- oder Mutanten-NAIP-Sequenzen, insertiert werden. Prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme ermöglichen, verschiedene wichtige funktionelle Domänen des Proteins als Fusions proteine wiederzugewinnen und dann zur Bindung, zu strukturellen und funktionellen Studien und auch zur Erzeugung von geeigneten Antikörpern zu verwenden. Wenn ein NAIP die Apoptose erhöht, kann es wünschenswert sein, dieses Protein unter Steuerung eines induzierbaren Promotors zu exprimieren.
Typische Expressionsvektoren enthalten Promotoren, die die Synthese von großen Mengen mRNA, die dem Gen entspricht, steuern. Sie können außerdem Sequenzen enthalten, die deren autonome Replikation im Wirtsorganismus ermöglichen, Sequenzen, die genetische Merkmale kodieren, die ermöglichen, die Vektoren enthaltende Zellen auszuwählen, und Sequenzen, die die Effizienz erhöhen, mit der die mRNA translatiert wird. Manche Vektoren enthalten selektierbare Marker, wie Neomycinresistenz, die die Isolierung von Zellen zulassen, indem sie diese unter selektiven Bedingungen züchten. Stabile Langzeitvektoren können als frei replizierende Einheiten aufrechterhalten werden, indem Regulationselemente von Viren verwendet werden. Es können auch Zelllinien produziert werden, die den Vektor in der genomischen DNA integriert haben, und auf diese Weise wird das Genprodukt auf einer kontinuierlichen Basis produziert.
Die Expression von Fremdsequenzen in Bakterien wie E. coli bedingt die Insertion der NAIP-Sequenz in einen Expressionsvektor, für gewöhnlich ein bakterielles Plasmid. Dieser Plasmidvektor enthält mehrere Elemente, wie Sequenzen, die einen selektierbaren Marker kodieren, der die Aufrechterhaltung des Vektors in der Zelle sicherstellt, einen steuerbaren transkriptionellen Promotor (d. h. lac), der bei Induktion große Mengen mRNA aus dem klonierten Gen produzieren kann, translationelle Steuersequenzen und einen Polylinker, um die Insertion des Gens in der korrekten Ausrichtung im Vektor zu vereinfachen. In einem einfachen E. coli-Expressionsvektor, der den lac-Promotor einsetzt, enthält das Expressionsvektor-Plasmid ein Fragment des E. coli-Chromosoms, das den lac-Promotor und das benachbarte lacZ-Gen enthält. In Gegenwart des Lactoseanalogons IPTG transkribiert RNA-Polymerase normalerweise das lacZ-Gen, das lacZ-mRNA produziert, die in das kodierte Protein, β-Galactosidase, translatiert wird. Das lacZ-Gen kann aus dem Expressionsvektor mit Restriktionsenzymen herausgeschnitten und durch die NAIP-Gensequenz ersetzt werden. Wenn dieses resultierende Plasmid in E. coli transfiziert wird, produziert Zugabe von IPTG und anschließende Transkription aus dem lac-Promotor NAIP-mRNA, die in NAIP translatiert wird.
Sobald der entsprechende Expressionsvektor, der das NAIP-Gen enthält, konstruiert ist, wird er mittels Transformationstechniken, einschließlich Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran-Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Protoplastenfusion und liposomenvermittelter Transfektion, in einen geeigneten E. coli-Stamm eingeführt.
Die Wirtszelle, die mit dem Vektor dieser Erfindung transfiziert werden kann, kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus E. coli-, Pseudomonas-, Bacillus subtillus- oder anderen Bazillen-, anderen Bakterien-, Hefe-, Pilz-, Insekten- (unter Verwendung von bakuloviralen Vektoren zur Expression), Maus- oder anderen Tier- oder menschlichen Gewebezellen besteht. Säugerzellen können ebenfalls zum Exprimieren des NAIP-Proteins unter Verwendung eines Vakziniavirus-Expressionssystems eingesetzt werden.
In-vitro-Expression von Proteinen, die von klonierter DNA kodiert wurden, ist ebenfalls unter Verwendung des T7-Spätpromotor-Expressionssystems möglich. Dieses System hängt von der regulierten Expression von T7-RNA-Polymerase ab, bei der es sich um ein Enzym handelt, das in der DNA vom Bakteriophagen T7 kodiert wird. Die T7-RNA-Polymerase transkribiert DNA, die in einer spezifischen 23 bp langen Promotorsequenz beginnt, die als der T7-Spätpromotor bezeichnet wird. Kopien des T7-Spätpromotors befinden sich an mehreren Stellen am T7-Genom, es liegen jedoch keine in chromosomaler DNA von E. coli vor. Aufgrund dessen katalysiert T7-RNA-Polymerase in mit T7 infizierten Zellen die Transkription von viralen Genen, jedoch nicht von E. coli-Genen. In diesem Expressionssystem werden rekombinante E. coli-Zellen zunächst dazu konstruiert, das Gen, das T7-RNA-Polymerase kodiert, neben dem lac-Promotor zu tragen. Bei Vorliegen des IPTG transkribieren diese Zellen das T7-Polymerase-Gen mit einer hohen Rate und synthetisieren große Mengen T7-RNA-Polymerase. Diese Zellen werden dann mit Plasmidvektoren transformiert, die eine Kopie des T7-Spätpromotor-Proteins tragen. Wenn IPTG zum Kulturmedium gegeben wird, das diese transformierten E. coli-Zellen enthält, werden große Mengen T7-RNA-Polymerase produziert. Die Polymerase bindet dann an den T7-Spätpromotor an den Plasmidexpressionsvektoren, wodurch die Transkription der insertierten cDNA mit einer hohen Rate katalysiert wird. Da jede E. coli-Zelle viele Kopien des Expressionsvektors enthält, können in diesem System große Mengen mRNA, die der klonierten cDNA entspricht, produziert werden und das resultierende Protein kann radioaktiv markiert werden. Plasmidvektoren, die Spätpromotoren und die entsprechenden RNA-Polymerasen aus verwandten Bakteriophagen, wie T3, T5 und SP6, enthalten, können ebenfalls zur In-vitro-Produktion von Proteinen aus klonierter DNA verwendet werden. E. coli kann gleichfalls zur Expression mittels Infektion mit dem M13-Phagen mGPI-2 verwendet werden. E. coli-Vektoren können ebenfalls mit Phage-Lambda-Regulationssequenzen eingesetzt werden, mittels Fusionsproteinvektoren, mittels maltosebindenden Proteinfusionen und mittels Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteinen.
Ein bevorzugtes Expressionssystem ist das Bakulovirussystem, unter Verwendung beispielsweise des Vektors pBacPAK9, der von Clontech (Palo Alto, CA, USA) erhältlich ist. Falls gewünscht kann dieses System in Verbindung mit anderen Proteinexpressionstechniken verwendet werden, beispielsweise dem myc-Tag-Ansatz, der von Evan et al. (Mol. Cell Biol. 5:3610–3616, 1985) beschrieben wird.
Eukaryotische Expressionssysteme ermöglichen entsprechende posttranslationelle Modifizierungen an exprimierten Proteinen. Dies erlaubt Studien des NAIP-Gens und Genprodukts, einschließlich der Bestimmung der korrekten Expression und posttranslationeller Modifizierungen für die biologische Aktivität, des Identifizierens von Regulationselementen, die sich in der 5'-Region des NAIP-Gens befinden, und deren Rolle bei der Geweberegulation von Proteinexpression. Es ermöglicht außerdem die Produktion großer Mengen normaler und Mutantenproteine zur Isolierung und Reinigung, Zellen, die NAIP exprimieren, als ein funktionelles Assaysystem für Antikörper, die gegen das Protein erzeugt wurden, zu verwenden, die Wirksamkeit pharmakologischer Agenzien oder als ein Bestandteil eines Signaltransduktionssystems zu prüfen, die Funktion des normalen kompletten Proteins, spezifische Teile des Proteins oder von natürlich vorkommenden Polymorphismen und künstlich hergestellten mutierten Proteinen zu studieren. Die NAIP-DNA-Sequenz kann unter Verwendung von Vorgängen, wie Restriktionsenzymverdau, Auffüllen mit DNA-Polymerase, Exonukleasedeletion, Verlängerung terminaler Desoxynukleotidtransferase, Ligation synthetischer oder klonierter DNA-Sequenzen und ortsgerichteter Sequenzveränderung unter Verwendung spezifischer Oligonukleotide zusammen mit PCR verändert werden.
Ein NAIP kann mittels einer stabil transfizierten Säugerzelllinie produziert werden. Eine Reihe von Vektoren, die zur stabilen Transfektion von Säugerzellen geeignet sind, sind der Öffentlichkeit zugänglich, z. B. siehe Pouwels et al. (oben), als auch Verfahren zur Konstruktion solcher Zelllinien zugänglich sind (siehe z. B. Ausubel et al. (oben)). In einem Beispiel wird cDNA, die ein NAIP kodiert, in einen Expressionsvektor kloniert, der das DHFR-Gen (DHFR = Dihydrofolatreduktase) enthält. Die Integration des Plasmids und somit die Integration des NAIP-kodierenden Gens in das Wirtszellenchromosom wird mittels Einbinden von 0,01–300 μM Methotrexat in das Zellkulturmedium selektioniert (wie beschrieben, Ausubel et al., oben). Diese dominante Selektion kann in den meisten Zelltypen erzielt werden. Die rekombinante Proteinexpression kann mittels DHFR-vermittelter Amplifikation des transfizierten Gens gesteigert werden.
Verfahren zum Selektionieren von Zelllinien, die Genamplifikationen tragen, werden in Ausubel et al. (oben) beschrieben. Diese Verfahren umfassen im Allgemeinen eine ausgedehnte Kultivierung in Medium, das allmählich ansteigende Methotrexat-Konzentrationen enthält. Die am häufigsten verwendeten DHFR-enthaltenden Expressionsvektoren sind pCVSEII-DHFR und pAdD26SV(A) (beschrieben in Ausubel et al., oben). Die oben beschriebenen Wirtszellen oder vorzugsweise eine DHFR-defiziente CHO-Zelllinie (z. B. CHO-DHFR-Zellen, ATCC-Zugangsnummer CRL 9096) zählen zu den für die DHFR-Selektion einer stabil transfizierten Zelllinie oder DHFR-vermittelten Genamplifikation am meisten bevorzugten.
Sobald das rekombinante Protein exprimiert ist, wird es mittels beispielsweise Affinitätschromatographie isoliert. In einem Beispiel kann ein Anti-NAIP-Antikörper, der mit den hierin beschriebenen Verfahren produziert werden kann, an eine Säule angefügt werden und zum Isolieren des NAIP-Proteins verwendet werden. Vor der Affinitätschromatographie kann mittels Standardverfahren eine Lyse und Fraktionierung von NAIP-beherbergenden Zellen durchgeführt werden (siehe z. B. Ausubel et al., oben). Nach dem Isolieren kann das rekombinante Protein, falls gewünscht, mittels z. B. Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC; z. B. siehe Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, Work und Burdon, Hrsg., Elsevier, 1980) weiter gereinigt werden.
Polypeptide der Erfindung, insbesondere kurze NAIP-Fragmente, können ebenfalls mittels chemischer Synthese produziert werden (z. B. mittels der Verfahren, die in Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Ausg., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA, beschrieben werden). Diese allgemeinen Techniken der Polypeptidexpression und -reinigung können auch zum Produzieren und Isolieren geeigneter NAIP-Fragmente oder -Analoga verwendet werden, wie hierin beschrieben.
Fachmänner der Molekularbiologie werden verstehen, dass eine große Vielfalt von Expressionssystemen zum Produzieren des rekombinanten Proteins verwendet werden kann. Die exakte verwendete Wirtszelle ist für die Erfindung nicht kritisch. Das NAIP-Protein kann in einem prokaryotischen Wirt (z. B. E. coli) oder in einem eukaryotischen Wirt (z. B. S. cerevisiae, Insektenzellen, wie Sf21-Zellen, oder Säugerzellen, wie COS-1-, NIH 3T3- oder HeLa-Zellen) produziert werden. Diese Zellen sind öffentlich zugänglich, beispielsweise von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA; siehe auch Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, USA, 1994. Das Transduktionsverfahren und die Wahl des Expressionsvehikels werden vom gewählten Wirtssystem abhängen. Transformations- und Transfektionsverfahren werden z. B. in Ausubel et al. (oben) beschrieben und Expressionsvehikel können aus den bereitgestellten, z. B. in Cloning Vectors: A Laboratory Manual (P.H. Pouwels et al., 1985, Anh. 1987), ausgewählt werden.
III. Prüfen auf das Vorliegen von biologischer Aktivität von NAIP
Um die Wirkung von NAIP auf Apoptose zu analysieren, wurden in einem ersten Ansatz Expressionsplasmide für sich oder fast vollständiges NAIP oder Bcl-2 (ein Protein, das unter normalen Bedingungen zum Schützen von Zellen vor Apoptose fungiert) kodierende in CHO-, Rat-1- und HeLa-Zellen transfiziert, worauf G418-Selektion folgte. Zunächst wurde eine NAIP-cDNA mittels Sondieren einer humanen fötalen Gehirn-cDNA-Bibliothek mit einem genomischen DNA-Insert eines Cosmids aus der konstruierten Cosmidbibliothek isoliert und es wurde ein cDNA-Fragment, das die meisten der drei BIR-Domänen kodiert, die der NAIP-Gensequenz entsprechen, isoliert.
IV. Zelluläre Verteilung von NAIP
Wir haben uns die Verteilung von NAIP unter Anwendung von Immunfluoreszenz von markierten Antikörpern angesehen und festgestellt, dass NAIP in zumindest den folgenden Geweben exprimiert wird: Motorneuronen, Myokardzellen, Leber, Plazenta und ZNS.
V. NAIP-Fragmente
Die BIR-Domänen von NAIP scheinen sowohl erforderlich als auch ausreichend für die biologische Aktivität von NAIP zu sein. Überraschenderweise haben wir Grund zu glauben, dass carboxyterminale Deletionen von NAIP-Aminosäuren tatsächlich die Inhibition von Apoptose durch NAIP verstärken. Deletionen können bis zum Ende der letzten NAIP-BIR-Domäne (d. h. der dritten) vorliegen, müssen jedoch nicht die gesamte Region deletieren, die zu den dritten BIR-Domänen carboxyterminal ist.
VI. NAIP-Antikörper
Zum Herstellen von polyklonalen Antikörpern können NAIP, Fragmente von NAIP oder Fusionsproteine, die definierte Teile des oder das gesamte NAIP-Protein enthalten, in Bakterien mittels Expression von entsprechenden DNA-Sequenzen in einem geeigneten Klonierungsvehikel synthetisiert werden. Fusionsproteine werden üblicherweise als eine Quelle für Antigen zum Produzieren von Antikörpern verwendet. Zwei weit verbreitete Expressionssysteme für E. coli sind lacZ-Fusionen unter Verwendung der pUR-Serie von Vektoren und trpE-Fusionen unter Verwendung der pATH-Vektoren. Das Protein kann dann gereinigt, mit einem Trägerprotein gekoppelt und mit Freundschem Adjuvans gemischt (um das Stimulieren der Antigenreaktion bei den Kaninchen zu unterstützen) und in Kaninchen oder andere Labortiere injiziert werden. Alternativ dazu kann das Protein aus NAIP-exprimierenden, kultivierten Zellen isoliert werden. Nach Boosterinjektionen in zweiwöchentlichen Abständen wird den Kaninchen oder anderen Labortieren dann Blut abgenommen und die Seren werden isoliert. Die Seren können direkt verwendet oder vor der Verwendung gereinigt werden, mittels verschiedener Verfahren, einschließlich Affinitätschromatographie unter Einsatz von Protein A-Sepharose, Antigen-Sepharose, Anti-Maus-Ig-Gel. Die Seren können dann zum Sondieren von Proteinextrakten aus Geweben verwendet werden, die auf einem Polyacrylamid-Gel laufen, um das NAIP-Protein zu identifizieren. Alternativ dazu können synthetische Peptide zu den antigenen Teilen des Proteins gemacht und zum Inokulieren der Tiere verwendet werden.
Zum Erzeugen von Peptid zur Verwendung beim Herstellen von NAIP-spezifischen Antikörpern kann eine NAIP-kodierende Sequenz (d. h. in SEQ ID NO:22 und 24 gezeigte Aminosäurefragmente) als eine C-terminale Fusion mit Glutathion-S-Transferase (GST; Smith et al., Gene 67:31–40, 1988) exprimiert werden. Das Fusionsprotein kann auf Glutathion-Sepharose-Kügelchen gereinigt, mit Glutathion eluiert und mit Thrombin (an der konstruierten Spaltungsstelle) gespalten und bis zum für das erfolgreiche Immunisieren von Kaninchen erforderlichen Grad gereinigt werden. Primäre Immunisierungen können mit dem Freundschen kompletten Adjuvans ausgeführt und anschließende Immunisierungen mit dem Freundschen inkompletten Adjuvans durchgeführt werden. Die Antikörpertiter wurden mittels Western-Blot- und Immun präzipitationsanalysen unter Verwendung des mit Thrombin gespaltenen NAIP-Fragments des GST-NAIP-Fusionsproteins überwacht. Immunsera wurden mit CNBr-Sepharose-gekoppeltem NAIP-Protein affinitätsgereinigt. Die Antiserumspezifität wurde unter Anwendung einer Testreihe nicht verwandter GST-Proteine (einschließlich GSTp53, Rb, HPV-16 E6 und E6-AP) und GST-Trypsin (das mittels PCR mit bekannten Sequenzen erzeugt wurde) ermittelt.
Fachmänner verstehen außerdem, dass monoklonale NAIP-Antikörper durch Kultivieren von Zellen, die das Protein aktiv exprimieren oder aus Geweben isoliert wurden, produziert werden können. Die Zellextrakte oder Extrakte von rekombinantem Protein, die das NAIP-Protein enthalten, können beispielsweise in Freundschem Adjuvans in Mäuse injiziert werden. Nach dem Injizieren können die Mausmilzen entfernt und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (phosphatebuffered saline, PBS) resuspendiert werden. Die Milzzellen dienen als eine Quelle von Lymphozyten, von denen einige Antikörper der entsprechenden Spezifität produzieren. Diese werden dann mit ständig wachsenden Myelompartnerzellen fusioniert und die Produkte der Fusion werden in eine Reihe von Gewebekulturwells bei Vorliegen eines selektiven Agens, wie HAT, plattiert. Die Wells werden dann mittels ELISA gescreent, um jene zu identifizieren, die Zellen enthalten, die bindenden Antikörper herstellen. Diese werden dann plattiert und nach einer Wachstumsphase werden diese Wells erneut gescreent, um antikörperproduzierende Zellen zu identifizieren. Es werden mehrere Kloniervorgänge ausgeführt, bis mehr als 90 % der Wells einzelne Klone enthalten, die für Antikörperproduktion positiv sind. Aus diesem Vorgang wird eine stabile Linie von Klonen, die den Antikörper produzieren, etabliert. Der monoklonale Antikör per kann dann mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung von Protein A-Sepharose, Ionenaustauschchromatographie sowie Variationen und Kombinationen dieser Techniken gereinigt werden. Verkürzte Versionen von monoklonalen Antikörpern können ebenfalls mit rekombinanten Verfahren produziert werden, in denen Plasmide erzeugt werden, die das gewünschte monoklonale Antikörperfragment bzw. die gewünschten monoklonalen Antikörperfragmente in einem geeigneten Wirt exprimieren.
Als ein alternierendes oder beigefügtes Immunogen zu GST-Fusionsproteinen können Peptide, die relativ eindeutigen hydrophilen Regionen von NAIP entsprechen, erzeugt und mit Hämocyanin der Schlüssellochnapfschnecke (keyhole limpet hemocyanin, KLH) mittels eines eingeführten C-terminalen Lysins gekoppelt werden. Antiserum zu jedem dieser Peptide wird auf ähnliche Weise auf Peptiden, die mit BSA konjugiert wurden, affinitätsgereinigt und die Spezifität wird mittels ELISA und Western-Blotting unter Verwendung von Peptidkonjugaten und mittels Western-Blotting und Immunpräzipitation unter Verwendung von NAIP, das als ein GST-Fusionsprotein exprimiert wurde, geprüft.
Alternativ dazu können monoklonale Antikörper unter Verwendung der oben beschriebenen NAIP-Proteine und Standard-Hybridomtechnologie hergestellt werden (siehe z. B. Kohler et al., Nature 256:495, 1975; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511, 1976; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292, 1976; Hammerling et al., in Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, New York, NY, USA, 1981; Ausubel et al., oben). Nach der Produktion werden die monoklonalen Antikörper ebenfalls auf spezifische NAIP-Erkennung mittels Western-Blot- oder Immunpräzipitations analyse geprüft (mit den in Ausubel et al., oben, beschriebenen Verfahren).
Antikörper, die NAIP (oder Fragmente von NAIP) spezifisch erkennen, wie die hierin beschriebenen, die eine oder mehrere BIR-Domänen enthalten, werden als in der Erfindung nützlich erachtet. Sie können beispielsweise in einem Immunoassay zum Überwachen der NAIP-Expressionsniveaus oder zum Bestimmen der subzellulären Lage eines NAIP oder NAIP-Fragments, das von einem Säuger produziert wurde, verwendet werden. Antikörper, die hierin beschriebenes NAIP inhibieren, können insbesondere beim Induzieren von Apoptose in Zellen, die eine unerwünschte Proliferation erfahren, nützlich sein.
Vorzugsweise werden Antikörper unter Verwendung der NAIP-Sequenz produziert, die sich nicht in stark konservierten Regionen befindet und bei der es wahrscheinlich zu sein scheint, dass sie antigen ist, wie durch Kriterien analysiert wurde, wie den vom Peptidstruktur-Programm bereitgestellten (Genetics Computer Group Sequence Analysis Package, Programmhandbuch für das GCG Package, Version 7, 1991), unter Anwendung des Algorithmus von Jameson und Wolf (CABIOS 4:181, 1988). Diese Fragmente können mittels Standardtechniken erzeugt werden, z. B. durch die PCR, und in den pGEX-Expressionsvektor kloniert werden (Ausubel et al., oben). Die Fusionsproteine werden in E. coli exprimiert und mit einer Glutathion-Agarose-Affinitätsmatrix gereinigt, wie in Ausubel et al. (oben) beschrieben. Zum Verringern des Potentials, Antiserum zu gewinnen, das nichtspezifisch ist oder Bindung an NAIP mit geringer Affinität aufzeigt, werden für jedes Protein zwei oder drei Fusionen erzeugt und jede Fusion wird in mindestens zwei Kaninchen inji ziert. Antisera werden mittels serienmäßigen Injektionen erzeugt, vorzugsweise einschließlich von mindestens drei Boosterinjektionen.
VII. Verwendung von NAIP-Antikörpern
Antikörper von NAIP können, wie oben angemerkt, zum Nachweisen von NAIP oder Inhibieren des Proteins verwendet werden. Darüber hinaus können die Antikörper an Verbindungen für diagnostische und/oder therapeutische Verwendungszwecke gekoppelt werden, wie Radionukleotide zur Bildgebung und Therapie und Liposome zum Richten von Verbindungen auf einen spezifischen Gewebeort.
VIII. Nachweis von NAIP-Genexpression
Wie angemerkt können die oben beschriebenen Antikörper zum Überwachen der NAIP-Proteinexpression verwendet werden. Darüber ist In-situ-Hybridisierung ein Verfahren, das zum Nachweisen der Expression des NAIP-Gens verwendet werden kann. Die In-situ-Hybridisierung beruht auf der Hybridisierung einer spezifisch markierten Nukleinsäuresonde mit der zellulären RNA in individuellen Zellen oder Geweben. Somit ermöglicht sie die Identifizierung von mRNA in intakten Geweben, wie dem Gehirn. In diesem Verfahren werden Oligonukleotide oder klonierte Nukleotid-Fragmente (RNA- oder DNA-Fragmente), die den eindeutigen Teilen des NAIP-Gens entsprechen, zum Nachweisen spezifischer mRNA-Spezies, z. B. im Gehirn, verwendet. In diesem Verfahren wird eine Ratte anästhesiert und mit kalter PBS transkardial perfundiert, worauf eine Perfusion mit einer Formaldehydlösung folgt. Das Gehirn oder die anderen Gewebe werden dann entfernt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und in dünne Mikrometersektionen geschnitten. Die Sektionen werden auf Objektträger aufgebracht und in Proteinase K inkubiert. Nach dem Spülen in DEP, Wasser und Ethanol werden die Objektträger in Prähybridisierungspuffer gelegt. Eine radioaktive Sonde, die dem Primer entspricht, wird mittels Nicktranslation hergestellt und mit dem sektionierten Hirngewebe inkubiert. Nach der Inkubation und Trocknen an der Luft werden die markierten Bereiche mit Autoradiographie sichtbar gemacht. Dunkle Flecken auf der Gewebeprobe zeigen eine Hybridisierung der Sonde mit NAIP-mRNA an, was die Expression des Proteins beweist.
IX. Identifizierung von Molekülen, die die NAIP-Proteinexpression modulieren
NAIP-cDNAs können zum Vereinfachen der Identifizierung von Molekülen verwendet werden, die die NAIP-Expression steigern oder vermindern. In einem Ansatz werden Kandidatenmoleküle in unterschiedlichen Konzentrationen zum Kulturmedium von Zellen, die NAIP-mRNA exprimieren, gegeben. Die NAIP-Expression wird dann beispielsweise mittels Northern-Blot-Analyse (Ausubel et al., oben) unter Verwendung einer NAIP-cDNA oder eines cDNA- oder RNA-Fragments als einer Hybridisierungssonde gemessen. Das Niveau der NAIP-Expression bei Vorliegen des Kandidatenmoleküls wird mit dem Niveau der NAIP-Expression bei Abwesenheit des Kandidatenmoleküls verglichen, wobei alle anderen Faktoren (z. B. Zelltyp und Kulturbedingungen) identisch sind.
Die Wirkung von Kandidatenmolekülen auf NAIP-vermittelte Apoptose kann stattdessen auf der Ebene der Translation durch Verwendung des oben beschriebenen allgemeinen Ansatzes mit Standardproteinnachweistechniken gemessen werden, wie Western-Blotting oder Immunpräzipitation mit einem NAIP-spezifischen Antikörper (beispielsweise dem hierin beschriebenen NAIP-Antikörper).
Verbindungen, die das Niveau der NAIP-Expression modulieren, können gereinigt oder im Wesentlichen gereinigt werden oder können ein Bestandteil einer Mischung von Verbindungen sein, wie ein Extrakt oder Überstand, der aus Zellen gewonnen wurde (Ausubel et al., oben). In einem Assay einer Mischung von Verbindungen wird die NAIP-Expression gegen stufenweise kleinere Teilmengen des Verbindungspools (z. B. mittels Standardreinigungstechniken produziert, wie HPLC oder FPLC,), bis von einer einzigen Verbindung oder einer minimalen Anzahl wirksamer Verbindungen bewiesen wird, dass sie die NAIP-Expression moduliert.
Verbindungen können ebenfalls auf ihre Fähigkeit zum Modulieren der die NAIP-Apoptose inhibierenden Aktivität gescreent werden. In diesem Ansatz wird das Ausmaß der Apoptose bei Vorliegen einer Kandidatenverbindung mit dem Ausmaß der Apoptose bei deren Abwesenheit unter äquivalenten Bedingungen verglichen. Wiederum kann das Screening mit einem Pool von Kandidatenverbindungen beginnen, von denen eine oder mehrere geeignete Modulatorverbindungen schrittweise isoliert werden. Die Apoptose-Aktivität kann mittels eines beliebigen Standardassays, beispielsweise den hierin beschriebenen, gemessen werden.
Ein anderes Verfahren zum Nachweisen von Verbindungen, die die Aktivität von NAIPs modulieren, besteht darin, auf Verbindungen zu screenen, die physikalisch mit einem gegebenen NAIP-Polypeptid interagieren. Diese Verbindungen können durch Anpassen von in der Technik bekannten Interaction- Trap-Expressionssystemen nachgewiesen werden. Diese Systeme weisen Proteininteraktionen unter Verwendung eines transkriptionellen Aktivierungsassay nach und werden von Gyuris et al. (Cell 75:791–03, 1993) und Field et al. (Nature 340:245–246, 1989) allgemein beschrieben und sind im Handel von Clontech (Palo Alto, CA, USA) erhältlich. Darüber hinaus beschreibt die PCT-Veröffentlichung WO 95/28497 ein Interaction-Trap-Assay, in dem an der Apoptose beteiligte Proteine aufgrund ihrer Interaktion mit Bcl-2 nachgewiesen werden. Ein ähnliches Verfahren kann zum Identifizieren von Proteinen und anderer Verbindungen, die mit NAIP interagieren, verwendet werden.
Verbindungen oder Moleküle, die als Modulatoren von NAIP-vermitteltem Zelltod agieren, können Peptid- und Nicht-Peptid-Moleküle umfassen, wie diejenigen, die in Zellextrakten, Serum eines Säugers oder Wachstumsmedium, in dem Säugerzellen kultiviert worden sind, vorliegen.
Ein Molekül, das eine Steigerung der NAIP-Expression oder NAIP-Aktivität fördert, wird als in der Erfindung besonders nützlich betrachtet; ein solches Molekül kann beispielsweise als ein Therapeutikum zum Erhöhen der zellulären NAIP-Konzentrationen und dadurch Ausnutzen der Fähigkeit von NAIP-Polypeptiden, Apoptose zu inhibieren, verwendet werden.
Ein Molekül, das die NAIP-Aktivität vermindert (z. B. durch Vermindern der NAIP-Genexpression oder Polypeptidaktivität), kann zum Verringern der zellulären Proliferation verwendet werden. Dies wäre bei der Behandlung von Neoplasmen oder anderen Zellproliferationserkrankungen vorteilhaft.
Moleküle, von denen mittels der oben beschriebenen Verfahren gefunden wird, dass sie die NAIP-Genexpression oder Polypeptidaktivität effektiv modulieren, können in Tiermodellen weiter geprüft werden. Wenn sie in einer In-vivo-Situation weiterhin erfolgreich funktionieren, können sie als Therapeutika verwendet, um die Apoptose je nach Bedarf zu inhibieren oder zu fördern.
X. Therapien
Therapien können entworfen werden, um einen NAIP-Gendefekt oder eine unangemessene NAIP-Genexpression zu umgehen oder zu überwinden und somit Apoptose zu mäßigen und möglicherweise zu verhindern. Das NAIP-Gen wird in der Leber, im Myokardium und in der Plazenta als auch im ZNS exprimiert. Folglich versteht sich in Anbetracht verschiedener Therapien, dass solche Therapien auf andere Gewebe als das Gehirn gerichtet sein können, wie die Leber, das Myokardium und beliebige andere Gewebe, von denen anschließend bewiesen wurde, dass sie NAIP exprimieren.
a) Proteintherapie
Behandlung oder Prävention von Apoptose kann durch Ersetzen von Mutanten- oder unzureichendem NAIP-Protein durch normales Protein, durch Modulieren der Funktion des Mutantenproteins oder durch Liefern von normalem NAIP-Protein an die entsprechenden Zellen erzielt werden. Sobald der biologische Stoffwechselweg des NAIP-Proteins vollständig verstanden worden ist, kann es auch möglich sein, den pathophysiologischen Stoffwechselweg (z. B. einen Signaltransduktionsstoffwechselweg) zu modifizieren, an dem das Protein beteiligt ist, um den physiologischen Defekt zu beheben.
Um ein Mutantenprotein durch normales Protein zu ersetzen oder Zellen, die nicht mehr genügend NAIP exprimieren, Protein hinzufügen, ist es erforderlich, große Mengen an reinem NAIP aus kultivierten Zellsystemen zu gewinnen, die das Protein exprimieren können. Die Lieferung des Proteins an die betroffenen Gewebe kann dann mit geeigneten Verpackungs- oder Verabreichungssystemen erzielt werden. Alternativ dazu können kleine Molekülanaloga verwendet und verabreicht werden, um als NAIP-Agonisten zu agieren und auf diese Weise eine erwünschte physiologische Wirkung zu erzeugen. Verfahren zum Finden solcher Moleküle sind hierin bereitgestellt.
b) Gentherapie
Bei Gentherapie handelt es sich um einen weiteren potentiellen therapeutischen Ansatz, bei dem normale Kopien des NAIP-Gens in ausgewählte Gewebe eingeführt werden, um für normales und reichlich vorhandenes Protein in betroffenen Zelltypen zu kodieren. Das Gen muss an diese Zellen in einer Form geliefert werden, in der es aufgenommen werden kann, und für ausreichend Protein kodieren, um eine wirksame Funktion bereitzustellen. Alternativ dazu kann es bei manchen Mutanten möglich sein, die Apoptose durch Einführen einer anderen Kopie des homologen Gens, die eine zweite Mutation in diesem Gen trägt, zu verhindern oder die Mutation zu verändern oder ein anderes Gen zu verwenden, um eine etwaige negative Wirkung zu blockieren.
Transduzierende retrovirale Vektoren können insbesondere aufgrund ihrer hohen Infektionseffizienz und stabilen Integration und Expression für die Gentherapie von Körper zellen verwendet werden. Die Zellen, auf die abgezielt wird, müssen sich jedoch teilen können und die Expression der Konzentrationen normalen Proteins sollte hoch sein. Das vollständige NAIP-Gen oder Teile davon können in einen retroviralen Vektor kloniert und aus dessen endogenen Promotor oder aus der retroviralen langen terminalen Wiederholung oder aus einem Promotor, der für den interessierenden Target-Zelltyp (wie Neuronen) spezifisch ist, getrieben werden. Andere virale Vektoren, die verwendet werden können, umfassen adenoassoziierten Virus, Vakziniavirus, bovinen Papillomavirus oder einen Herpesvirus, wie Epstein-Barr-Virus.
Der Gentransfer könnte mit nichtviralen Mitteln, die eine Infektion in vitro bedingen, erzielt werden. Dies würde Calciumphosphat, DEAE-Dextran, Elektroporation und Protoplastenfusion umfassen. Liposome können ebenfalls zur Lieferung von DNA in eine Zelle potentiell von Vorteil sein. Obwohl diese Verfahren zur Verfügung stehen, sind viele dieser weniger effizient.
Antisense-basierte Strategien können zum Untersuchen der NAIP-Genfunktion und als eine Basis für das Design therapeutischer Arzneimittel eingesetzt werden. Das Prinzip basiert auf der Hypothese, dass sequenzspezifische Unterdrückung von Genexpression durch intrazelluläre Hybridisierung zwischen mRNA und einer komplementären Antisense-Spezies erzielt werden kann. Die Bildung eines Hybrid-RNA-Duplex kann dann die Verarbeitung/den Transport/die Translation und/oder die Stabilität der Target-NAIP-mRNA beeinträchtigen. Antisense-Strategien können eine Vielfalt von Ansätzen einsetzen, einschließlich der Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden, Injektion von Antisense-RNA und Transfektion von Antisense-RNA-Expressionsvektoren. Antisense-Effekte können durch Kontrollsequenzen (Sense-Sequenzen) induziert werden, das Ausmaß phänotypischer Änderungen variiert jedoch stark. Phänotypische Effekte, die von Antisense-Effekten induziert werden, basieren auf Änderungen der Kriterien, wie Proteinkonzentrationen, Proteinaktivitätsmessung und Target-mRNA-Konzentrationen.
Die Transplantation von normalen Genen in die betroffenen Zellen eines Patienten kann ebenfalls in der Therapie von Nutzen sein. In diesem Vorgang wird normales NAIP in einen kultivierbaren Zelltyp, entweder exogen oder endogen zum Patienten, übertragen. Diese Zellen werden dann serologisch in das/die Gewebe, auf das/die abgezielt wird, injiziert.
Retrovirale Vektoren, adenovirale Vektoren, adenoassoziierte virale Vektoren oder andere virale Vektoren mit dem entsprechenden Tropismus für Zellen, von denen wahrscheinlich ist, dass sie an der Apoptose beteiligt sind (beispielsweise Epithelzellen), können als ein Gentransferlieferungssystem für ein therapeutisches NAIP-Genkonstrukt verwendet werden. Zahlreiche für diesen Zweck geeignete Vektoren sind allgemein bekannt (Miller, Human Gene Therapy 15–14, 1990; Friedman, Science 244:1275–1281, 1989; Eglitis und Anderson, BioTechniques 6:608–614, 1988; Tolstoshev und Anderson, derzeitige Meinung in Biotechnology 1:55–61, 1990; Sharp, The Lancet 337:1277–1278, 1991; Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987; Anderson, Science 226:401–409, 1984; Moen, Blood Cells 17:407–416, 1991; Miller et al., Biotechniques 7:980-990, 1989; Le Gal La Salle et al., Science 259:988–990, 1993; und Johnson, Chest 107:77S–83S, 1995). Retrovirale Vektoren sind besonders gut entwickelt und sind in klinischen Situationen verwendet worden (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323:270, 1990; Anderson et al., US-Patentschrift Nr. 5,399,346). Nichtvirale Ansätze können ebenfalls zur Einführung von therapeutischer DNA in Zellen, von denen vorhergesagt wurde, dass sie andernfalls Apoptose erfahren, eingesetzt werden. NAIP kann beispielsweise mittels Lipofektion (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987; Ono et al., Neurosci. Lett 117:259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger et al., Meth. Enz. 101:512, 1983), Asialoorosomucoid-Polylysin-Konjugierung (Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem. 264:16985, 1989) oder weniger bevorzugt Mikroinjektion unter chirurgischen Bedingungen (Wolff et al., Science 247:1465, 1990) in ein Neuron oder eine T-Zelle eingeführt werden.
Bei einem beliebigen der oben beschriebenen Anwendungsverfahren wird das therapeutische NAIP-DNA-Konstrukt vorzugsweise auf die Stelle des vorhergesagten Apoptose-Ereignisses angewendet (beispielsweise durch Injektion). Es kann jedoch auch auf Gewebe in der Nähe des vorhergesagten Apoptose-Ereignisses oder auf ein Blutgefäß, das die Zellen versorgt, von denen vorhergesagt wurde, dass sie Apoptose erfahren, angewendet werden.
In den beschriebenen Konstrukten kann die NAIP-cDNA-Expression von einem beliebigen geeigneten Promotor (z. B. dem humanen Cytomegalievirus- (CMV), Simianvirus 40- (SV40) oder Metallothionein-Promotor) gesteuert und von einem beliebigen geeigneten Regulationselement eines Säugers reguliert werden. Falls gewünscht können beispielsweise Enhancer, von denen bekannt ist, dass sie vorzugsweise die Genexpression in Nervenzellen, T-Zellen oder B-Zellen steuern, zum Steuern der NAIP-Expression verwendet werden. Die verwendeten Enhancer könnten jene, die in ihrer Expression als gewebe- oder zellspezifisch gekennzeichnet sind, umfassen, ohne Einschränkung. Alternativ dazu kann, wenn ein genomischer NAIP-Klon als ein therapeutisches Konstrukt verwendet wird (beispielsweise nach dessen Isolation mittels Hybridisierung mit der oben beschriebenen NAIP-cDNA), die Regulation von den kognaten Regulationssequenzen oder, falls gewünscht, von Regulationssequenzen, die von einer heterologen Quelle abgeleitet sind, einschließlich beliebiger der oben beschriebenen Promotoren oder Regulationselemente, vermittelt werden.
Weniger bevorzugt wird die NAIP-Gentherapie mittels direkter Verabreichung der NAIP-mRNA oder Antisense-NAIP-mRNA an eine Zelle, von der erwartet wird, dass sie Apoptose erfährt, durchgeführt. Die mRNA kann mittels einer beliebigen Standardtechnik produziert und isoliert werden, wird jedoch am einfachsten mittels In-vitro-Transkription mit einer NAIP-cDNA unter der Steuerung eines Promotors mit hoher Effizienz (z. B. dem T7-Promotor) produziert. Die Verabreichung der NAIP-Antisense-mRNA oder NAIP-mRNA an mRNA von Zellen kann mittels eines beliebigen der oben beschriebenen Verfahren zur direkten Nukleinsäureverabreichung ausgeführt werden.
Idealerweise wird die Produktion von NAIP-Protein mittels eines beliebigen Gentherapieansatzes in zellulären NAIP-Konzentrationen resultieren, die zur normalen, zellulären NAIP-Konzentration in einer nicht betroffenen Zelle zumindest äquivalent sind. Die Behandlung mit einem beliebigen NAIP-vermittelten Gentherapieansatz kann mit traditionelleren Therapien kombiniert werden.
Ein anderer therapeutischer Ansatz in der Erfindung umfasst die Verabreichung von rekombinantem NAIP-Protein, entweder direkt an die Stelle eines vorhergesagten Apoptose-Ereignisses (beispielsweise durch Injektion) oder systemisch (beispielsweise durch eine beliebige herkömmliche Technik zur Verabreichung von rekombinantem Protein). Die Dosierung von NAIP hängt von einer Reihe von Faktoren ab, einschließlich der Größe und des Wohlbefindens des individuellen Patienten, im Allgemeinen werden jedoch zwischen [0,1 mg und 100 mg] inklusive täglich in einer beliebigen pharmazeutisch unbedenklichen Formulierung an einen Erwachsenen verabreicht.
XI. Verabreichung von NAIP-Polypeptiden, NAIP-Genen oder Modulatoren von NAIP-Synthese oder -Funktion
Ein NAIP-Protein, -Gen oder -Modulator kann in einem pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmittel, Träger oder Vehikel in Einheitsdosisform verabreicht werden. Herkömmliche pharmazeutische Praxis kann eingesetzt werden, um geeignete Formulierungen oder Zusammensetzungen zum Verabreichen von NAIP an Patienten bereitzustellen, die an einer Erkrankung leiden, die durch übermäßige Apoptose verursacht wird. Die Verabreichung kann beginnen, bevor der Patient symptomatisch ist. Eine beliebige geeignete Verabreichungsroute kann eingesetzt werden; die Verabreichung kann beispielsweise parenteral, intravenös, intraarteriell, subkutan, intramuskulär, intrakraniell, intraorbital, ophthalmisch, intraventrikulär, intrakapsulär, intraspinös, intrazisternal, intraperitoneal, intranasal, Aerosoiverabreichung, mit Suppositorien oder orale Verabreichung sein. Therapeutische Formulierungen können in der Form von flüssigen Lösungen oder Suspensionen sein; zur oralen Verabreichung können Formulierungen in der Form von Tabletten oder Kapseln sein und bei intranasalen Formulierungen in der Form von Pulvern, Nasentropfen oder Aerosolen.
Verfahren, die in der Technik zum Herstellen von Formulierungen wohl bekannt sind, sind beispielsweise in „Remington's Pharmaceutical Sciences" zu finden. Formulierungen zur parenteralen Verabreichung können beispielsweise Hilfsstoffe, steriles Wasser oder Kochsalzlösung, Polyalkylenglykole, wie Polyethylenglykol, Öle pflanzlichen Ursprungs oder hydrierte Naphthaline enthalten. Biokompatibles, biologisch abbaubares Lactidpolymer, Lactid/-Glykolid-Copolymer oder Polyoxyethylen/Polyoxypropylen-Copolymere können zum Steuern der Freisetzung der Verbindungen verwendet werden. Andere potentiell geeignete parenterale Abgabesysteme für NAIP-modulatorische Verbindungen umfassen Ethylen/Vinylacetat-Copolymerteilchen, osmotische Pumpen, implantierbare Infusionssysteme und Liposome. Formulierungen zur Inhalation können Hilfsstoffe, beispielsweise Lactose, enthalten oder können wässrige Lösungen sein, die beispielsweise Polyoxyethylen-9-laurylether, Glykocholat und Desoxycholat enthalten, oder können ölige Lösungen zur Verabreichung in der Form von Nasentropfen oder als ein Gel sein.
Falls dies gewünscht wird, kann die Behandlung mit einem NAIP-Protein, einem NAIP-Gen oder einer NAIP-modulatorischen Verbindung mit traditionelleren Therapien für die Erkrankung kombiniert werden, wie chirurgischer Eingriff, Steroidtherapie oder Chemotherapie für Autoimmunkrankheit; antivirale Therapie für AIDS und Gewebeplasminogenaktivator (tissue plasminogen activator, TPA) für ischämische Verletzung.
XII. Nachweis von Zuständen, die veränderte Apoptose involvieren
NAIP-Polypeptide und -Nukleinsäuresequenzen finden diagnostische Anwendung beim Nachweis oder Überwachen von Zuständen, die aberrierende Apoptose-Niveaus involvieren. Eine verminderte NAIP-Expression kann beispielsweise mit erhöhter Apoptose in Menschen korreliert sein (siehe XII unten). Dementsprechend kann eine Verringerung oder ein Anstieg des Niveaus der NAIP-Produktion einen Hinweis auf einen schädlichen Zustand liefern. Niveaus der NAIP-Expression können mittels einer beliebigen Standardtechnik untersucht werden. Beispielsweise kann NAIP-Expression in einer biologischen Probe (z. B. einer Biopsie) kann mittels Standard-Northern-Blot-Analyse überwacht oder kann durch PCR unterstützt werden (siehe z. B. Ausubel et al., oben; PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Ehrlich, Hrsg. Stockton Press, NY; Yap et al., Nucl. Acids Res. 19:4294, 1991).
Alternativ dazu kann eine von einem Patienten erhaltene biologische Probe auf eine oder mehrere Mutationen in den NAIP-Sequenzen unter Anwendung eines Fehlpaarungnachweisansatzes analysiert werden. Im Allgemeinen umfassen diese Techniken die PCR-Amplifikation von Nukleinsäure aus der Patientenprobe, gefolgt von der Identifizierung der Mutation (d. h. Fehlpaarung) mittels entweder modifizierter Hybridisierung, aberrierender gelelektrophoretischer Migration, Bindung oder Spaltung, die von Fehlpaarungsbindungsproteinen vermittelt wird, oder direkter Nukleinsäuresequenzierung. Eine beliebige dieser Techniken kann zum Vereinfachen des Nachweises von Mutanten-NAIP verwendet werden und jede ist in der Technik wohl bekannt; Beispiele bestimmter Techniken werden in Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 2766–2770, 1989; Sheffield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:232–236, 1989, beschrieben, ohne Einschränkung.
In noch einem anderen Ansatz werden Immunoassays zum Nachweisen oder Überwachen von NAIP-Protein in einer biologischen Probe verwendet. NAIP-spezifische polyklonale oder monoklonale Antikörper (wie oben beschrieben hergestellt) können in einem beliebigen Immunoassay-Standardformat (z. B. ELISA, Western-Blot oder RIA) zum Messen der NAIP-Polypeptid-Konzentrationen verwendet werden. Diese Konzentrationen würden mit Wildtyp-NAIP-Konzentrationen verglichen werden, wobei eine Verringerung der NAIP-Produktion auf einen Zustand hinweist, der erhöhte Apoptose involviert. Beispiele von Immunoassays werden z. B. in Ausubel et al., oben, beschrieben. Immunhistochemische Techniken können ebenfalls zum NAIP-Nachweis eingesetzt werden. Beispielsweise kann eine Gewebeprobe von einem Patienten erhalten, sektioniert und auf die Gegenwart von NAIP unter Verwendung eines Anti-NAIP-Antikörpers und eines beliebigen Standardnachweissystems (z. B. einem, das einen sekundären Antikörper enthält, der an Meerrettichperoxidase konjugiert ist) gefärbt werden. Allgemeine Anleitungen in Bezug auf solche Techniken können in z. B. Bancroft und Stevens (Theory and Practice of Histological Techniques, Churchill Livingstone, 1982) und Ausubel et al. (oben) gefunden werden.
In einem bevorzugten Beispiel kann ein kombiniertes diagnostisches Verfahren eingesetzt werden, das mit einer Beurteilung der NAIP-Proteinproduktion (beispielsweise mittels immunologischen Techniken oder des Protein-Truncation-Tests (Hogerrorst et al., Nature Genetics 10:208–212, 1995)) beginnt und außerdem eine auf Nukleinsäure basierende Nachweistechnik umfasst, die zum Identifizieren feinerer NAIP-Mutationen (beispielsweise Punktmutationen) konzipiert ist. Wie oben beschrieben steht Fachmännern eine Reihe von Fehlpaarungsnachweisassays zur Verfügung und es kann eine beliebige bevorzugte Technik verwendet werden. Es können Mutationen des NAIP nachgewiesen werden, die entweder im Rückgang der NAIP-Expression oder dem Rückgang der biologischen Aktivität von NAIP resultieren. In einer Variation dieses kombinierten diagnostischen Verfahrens wird die biologische Aktivität von NAIP als antiapoptotische Aktivität unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Apoptoseassaysystems (beispielsweise den hierin beschriebenen) gemessen.
Fehlpaarungsnachweisassays bieten außerdem eine Gelegenheit zum Diagnostizieren einer NAIP-vermittelten Prädisposition für Erkrankungen, die von ungeeigneter Apoptose verursacht werden. Ein Patient, der heterozygot für eine NAIP-Mutation ist, kann beispielsweise keine klinischen Symptome zeigen und trotzdem eine höhere Wahrscheinlichkeit als normal zur Entwicklung einer oder mehrerer Arten neurodegenerativer oder myelodysplastischer Ereignisse besitzen oder schwerwiegende Folgekrankheiten von einem ischämischen Ereignis aufweisen. In Anbetracht dieser Diagnose kann ein Patient Vorkehrungen treffen, um seine Aussetzung gegenüber ungünstigen Umweltfaktoren (beispielsweise UV-Lichtaussetzung oder chemische Mutagene) zu minimieren und seine Krankheit sorgfältig zu überwachen (beispielsweise durch häufige physische Untersuchungen). Diese Art von NAIP-Diagnoseansatz kann auch zum Nachweisen von NAIP-Mutationen in pränatalen Untersuchungen verwendet werden. Die oben beschriebenen NAIP-Diagnoseassays können mit einer beliebigen biologischen Probe (beispielsweise einer Biopsieprobe oder einem anderen Gewebe) ausgeführt werden, in der NAIP normalerweise exprimiert wird. Die Identifizierung eines Mutanten-NAIP-Gens kann ebenfalls unter Verwendung dieser Quellen für Versuchsproben untersucht werden.
Alternativ dazu kann eine NAIP-Mutation, insbesondere als Teil einer Diagnose auf Prädisposition für NAIP-assoziierte degenerative Erkrankung, unter Verwendung einer DNA-Probe aus einer beliebigen Zelle beispielsweise mittels Fehlpaarungsnachweistechniken geprüft werden. Vorzugsweise wird die DNA-Probe vor der Analyse einer PCR-Amplifikation unterzogen.
XIII. Vorbeugende antiapoptotische Therapie
Bei einem Patienten, der als für eine NAIP-Mutation heterozygot oder als für NAIP-Mutationen empfänglich (selbst wenn diese Mutationen noch nicht in einer Veränderung oder einem Rückgang der biologischen Aktivität von NAIP resultieren) diagnostiziert wurde, oder einem Patienten, der mit einer degenerativen Erkrankung (z. B. degenerativen Motorneuronerkrankungen, wie SMA- oder ALS-Erkrankungen) oder als HIV-positiv diagnostiziert wurde, kann eine beliebige der obigen Therapien vor dem Auftreten des Krankheitsphänotyps verabreicht werden. Die Therapien können beispielsweise einem Patienten verordnet werden, der HIV-positiv ist, aber noch nicht eine verminderte T-Zellenzahl oder andere offenkundige Anzeichen von AIDS aufzeigt. Insbesondere Verbindungen, von denen gezeigt wurde, dass sie die NAIP- Expression oder die biologische Aktivität von NAIP steigern, können mittels einer beliebigen Standarddosierung und -verabreichungsroute (siehe oben) verabreicht werden. Alternativ dazu kann eine Gentherapie, die ein NAIP-Expressionskonstrukt verwendet, vorgenommen werden, um den Zelldefekt vor der Entwicklung der degenerativen Erkrankung umzukehren oder zu verhindern.
Die beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren können zum Mindern oder Diagnostizieren der hierin beschriebenen Störungen in einem beliebigen Säuger, beispielsweise Menschen, Haustieren oder Nutztieren, verwendet werden. Wenn ein nichtmenschlicher Säuger behandelt oder diagnostiziert wird, ist das eingesetzte NAIP-Polypeptid, die eingesetzte NAIP-Nukleinsäure oder der eingesetzte NAIP-Antikörper für diese Spezies besonders bevorzugt.
XV. Identifizierung weiterer NAIP-Gene
Standardtechniken, wie die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) und DNA-Hybridisierung, können zum Klonieren weiterer NAIP-Homologe in anderen Spezies verwendet werden. Southern-Blots von muriner genomischer DNA, die mit geringer Stringenz mit für humanes NAIP spezifischen Sonden hybridisiert wurde, offenbaren Banden, die NAIP und/oder verwandten Familienmitgliedern entsprechen. Folglich können weitere NAIP-Sequenzen unter Verwendung von Hybridisierung mit geringer Stringenz problemlos identifiziert werden. Beispiele von murinen und humanen NAIP-spezifischen Primern, die zum Klonieren weiterer Gene mittels RT-PCR verwendet werden können.
XVI. Charakterisierung der NAIP-Aktivität und Studien der intrazellulären Lokalisierung
Die Fähigkeit von NAIP, Apoptose zu modulieren, kann in In-vitro-Systemen definiert werden, in denen Veränderungen der Apoptose nachgewiesen werden können. Expressionskonstrukte eines Säugers, die NAIP-cDNAs tragen, die entweder vollständig oder verkürzt sind, können in Zelllinien, wie CHO-, NIH 3T3-, HL60-, Rat-1- oder Jurkat-Zellen, eingeführt werden. Darüber hinaus können SF21-Insektenzellen verwendet werden, wobei in diesem Fall das NAIP-Gen vorzugsweise mit einem Hitzeschockpromotor eines Insekts exprimiert wird. Nach der Transfektion kann die Apoptose mit Standardverfahren induziert werden, die Serumentzug oder die Anwendung von Staurosporin, Menadion (das Apoptose durch die Bildung von freien Radikalen induziert) oder Anti-Fas-Antikörpern umfassen. Als eine Kontrolle werden Zellen unter denselben Bedingungen wie die zum Erfahren von Apoptose induzierten kultiviert, aber entweder nicht transfiziert oder mit einem Vektor transfiziert, dem ein NAIP-Insert fehlt. Die Fähigkeit jedes NAIP-Konstrukts, Apoptose bei Expression zu inhibieren, kann durch Berechnen des Überlebensindex der Zellen, d. h. des Verhältnisses von überlebenden transfizierten Zellen zu überlebenden Kontrollzellen, quantifiziert werden. Diese Versuche können das Vorliegen von apoptoseinhibierender Aktivität bestätigen und können, wie unten erörtert, gleichfalls zum Bestimmen der funktionellen Region bzw. Regionen eines NAIP verwendet werden. Diese Assays können auch in Kombination mit der Anwendung von zusätzlichen Verbindungen durchgeführt werden, um Verbindungen zu identifizieren, die Apoptose durch NAIP-Expression modulieren.
XVII. Beispiele weiterer Apoptoseassays
Spezifische Beispiele von Apoptoseassays werden ebenfalls in den folgenden Referenzen bereitgestellt. Assays für Apoptose in Lymphozyten werden offenbart von: Li et al., „Induction of apoptosis in uninfected lymphocytes by HIV-1 Tat protein", Science 168:429–431, 1995; Gibellini et al., „Tat-expressing Jurkat cells show an increased resistance to different apoptotic stimuli, including acute human immunodeficiency virus-type 1 (HIV-1) infection", Br. J. Haematol. 89:24–33, 1995; Martin et al., „HIV-1 infection of human CD4⁺ T cells in vitro. Differential induction of apoptosis in these cells.", J. Immunol. 152:330–342, 1994; Terai et al., „Apoptosis as a mechanism of cell death in cultured T lymphoblasts acutely infected with HIV-1", J. Clin. Invest. 87:1710–1715, 1991; Dhein et al., „Autocrine T-cell suicide mediated by APO-1/(Fas/CD95)11", Nature 373:438–441, 1995; Katsikis et al., „Fas antigen stimulation induces marked apoptosis of T lymphocytes in human immunodeficiency virus-infected individuals", J. Exp. Med. 1815:2029–2036, 1995; Westendorp et al., „Sensitization of T cells to CD95-mediated apoptosis by HIV-1 Tat and gpl20", Nature 375:497, 1995; DeRossi et al., Virology 198:234–244, 1994.
Assays für Apoptose in Fibroblasten werden offenbart von: Vossbeck et al., „Direct transforming activity of TGF-beta on rat fibroblasts", Int. J. Cancer 61:92–97, 1995; Goruppi et al., „Dissection of c-myc domains involved in S phase induction of NIH3T3 fibroblasts", Oncogene 9:1537–1544, 1994; Fernandez et al., „Differential sensitivity of normal and Ha-ras transformed C3H mouse embryo fibroblasts to tumor necrosis factor: induction of bcl-2, c-myc, and manganese superoxide dismutase in resistant cells", Oncogene 9:2009–2017, 1994; Harrington et al., „c-Myc induced apoptosis in fibroblasts is inhibited by specific cytokines", EMBO J., 13:3286–3295, 1994; Itoh et al., „A novel protein domain required for apoptosis. Mutational analysis of human Fas antigen", J. Biol. Chem. 268:10932-10937, 1993.
Assays für Apoptose in Nervenzellen werden offenbart von: Melino et al., „Tissue transglutaminase and apoptosis: sense and antisense transfection studies with human neuroblastoma cells", Mol. Cell Biol. 14:6584–6596, 1994; Rosenbaum et al., „Evidence for hypoxia-induced, programmed cell death of cultured neurons", Ann. Neurol. 36:864–870, 1994; Sato et al., „Neuronal differentiation of PC12 cells as a result of prevention of cell death by bcl-2", J. Neurobiol. 25:1227–1234, 1994; Ferrari et al., „N-acetylcysteine D- and L-stereoisomers prevents apoptotic death of neuronal cells", J. Neurosci. 1516:2857–2866, 1995; Talley et al., „Tumor Necrosis Factor Alpha-Induced Apoptosis in Human Neuronal Cells: Protection by the Antioxidant N-Acetylcysteine and the Genes bcl-2 and crma", Mol. Cell. Biol. 15:2359–2366, 1995; Walkinshaw et al., „Induction of apoptosis in catecholaminergic PC12 cells by L-DOPA. Implications for the treatment of Parkinson's disease", J. Clin. Invest. 95:2458–2464, 1995.
Assays für Apoptose in Insektenzellen werden offenbart von: Clem et al., „Prevention of apoptosis by a baculovirus gene during infection of insect cells", Science 254:1388–1390, 1991; Crook et al., „An apoptosis-inhibiting baculovirus gene with a zinc finger-like motif", J. Virol. 67:2168-2174, 1993; Rabizadeh et al., „Expression of the baculovirus p35 gene inhibits mammalian neural cell death", J. Neurochem. 61:2318–2321, 1993; Birnbaum et al., „An apoptosis inhibiting gene from a nuclear polyhedrosis virus encoding a polypeptide with Cys/His sequence motifs", J. Virol. 68:2521–2528, 1994; Clem et al., Mol. Cell. Biol. 14:5212–5222, 1994.
XVIII. Konstruktion eines transgenen Tiers
Die Charakterisierung von NAIP-Genen liefert Informationen, die für ein NAIP-Knock-out-Tiermodell, das mittels homologer Rekombination entwickelt werden soll, erforderlich sind. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Modell um ein Säugetier, am meisten bevorzugt eine Maus. Analog dazu kann ein Tiermodell von NAIP-Überproduktion durch Integrieren einer oder mehrerer NAIP-Sequenzen in das Genom gemäß transgener Standardtechniken erstellt werden.
Ein Ersatztyp-Targetingvektor, der zum Erstellen eines Knock-out-Modells verwendet werden würde, kann unter Verwendung eines isogenen genomischen Klons, beispielsweise von einem Mausstamm wie 129/Sv (Stratagene Inc., LaJolla, CA, USA), konstruiert werden. Der Targetingvektor wird mittels Elektroporation in eine entsprechend abgeleitete Linie von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) eingeführt, um ES-Zelllinien zu erzeugen, die eine hochgradig verkürzte Form eines NAIP tragen. Um chimäre Foundermäuse zu erzeugen, werden die Target-Zelllinien in einen Mausembryo im Blastulastadium injiziert. Heterozygote Nachkommen werden zur Homozygosität gekreuzt. Knock-out-Mäuse würden in vivo die Mittel bereitstellen, um auf therapeutische Verbindungen zu screenen, die Apoptose über einen von NAIP abhängigen Stoffwechselweg modulieren. Das Herstellen solcher Mäuse kann aufgrund der Mehrfachkopien von NAIP auf dem Chromosom die Verwendung von loxP-Stellen bedingen (siehe Sauer und Henderson, Nucleic Acids Res. 17:147–161 (1989)).
Beispiele
Die Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, nicht einschränken.
Beispiel 1 Expression von NAIP in gepoolten stabilen Rat-1-, CHO- und HeLa-Linien und mit Adenovirus infizierten Zellen, mittels Western-Blotting und Immunfluoreszenz analysiert.
Um ein nahezu 3,7 kb langes NAIP-Konstrukt, das mit dem myc-Epitop (I) MTG-SP3.7 markiert war, zu erzeugen, wurde ein 2,5 kb langes Bsu36I/SalI-Fragment von NAIP, das in Bluescript und (ii) Bsu36I/XhoI-Abschnitt MTG-SE1.7 kloniert war, der Expressionsvektor pcDNA3, der ein 300 by langes myc-Epitop enthielt, und ein 1,7 kb langes Fragment von NAIP ligiert. HeLa-, CHO- und Rat-1-Zellen wurden mittels Lipofektion (Gibco BRL) mit 8 μg DNA transfiziert und G418-resistente Transformanten wurden zum Halten der Zellen in 250 μg/ml, 400 μg/ml bzw. 800 μg/ml G418 ausgewählt. Alle Zellen wurden in Eagles-Medium, das 10 fötales Kälberserum enthielt, gehalten. Zur Konstruktion des Adenovirus wurde ein 3,7 kb langes BamHI-Fragment von NAIP in die SwaI-Stelle des Adenovirus-Expressionscosmids pAdexICawt kloniert. Die Produktion von Vektoren, Reinigung mittels doppeltem Cäsiumchloridgradienten und Titerbestimmung waren wie in M.A. Rosenfeld et al., 1992, und F.L. Graham und A. Van der Eb, 1973, beschrieben.
Die Western-Blot-Analyse wurde mit monoklonalem Maus-Anti- Mensch-myc-Antikörper (M.J. Ellison und M.J. Hochstrasser, 1991) oder polyklonalem Kaninchen-Anti-Mensch-NAIP(E1.0)-Antikörper durchgeführt. Zur NAIP-Antikörperproduktion wurden Kaninchen mit gereinigtem, bakteriell produziertem Fusionsprotein in Freundschem komplettem Adjuvans immunisiert. Das Serum wurde mit GST-Protein und Anti-NAIP-Immunglobulin, das mit immobilisierten GST-NAIP-Fusionsproteinen gereinigt worden war, vorgereinigt.
Für die Immunfluoreszenz wurden Zellen auf Glasobjektträgern gezüchtet, mit Formaldehyd 10 Minuten lang fixiert, mit Anti-NAIP (1:200) oder Anti-myc (1:20) in PBS, 0,3 Triton X-100^TM 1 Stunde lang inkubiert, worauf eine Inkubation mit sekundären Antisera, FITC-markiertem Esel-Anti-Kaninchen-Immunglobulin (Amersham), biotinyliertem Ziege-Anti-Maus-Immunglobulin (Amersham) und Streptavidin Texas-Red^TM (Amersham) folgte.
Beispiel 2 Die Wirkung von NAIP auf durch Serumentzug, Menadion und TNF-α induzierten Zelltod.
Für jedes Assay wurden Zellen zu 5 × 104 ml in dreifacher Ausfertigung plattiert. CHO- oder Rat-1-Zellen wurden 1,5 Stunden lang mit Menadion behandelt, 5-mal in PBS gewaschen und in normalen Medien gehalten. Für Serumentzugassays wurden die Zellen 5-mal in PBS gewaschen und in Medien mit 0 % fötalem Kälberserum gehalten. HeLa-Zellen wurden mit 20 Einheiten/ml TNF-α in Kombination mit 30 g/ml Cyclohexamid 17 Stunden lang behandelt. Die Apoptose wurde für jeden Auslöser mittels Propidiumiodid-Färbung untersucht. Mit Adenovirus infizierte Zellen wurden 36 Stunden nach der Infektion den Auslösern ausgesetzt. Die lacZ-Expression wurde durch 5-Brom-4-chlor-3-indoyl-β-D-galactosid (X-gal) histochemisch bestätigt, wie in M.J. Ellison und M.J. Hochstrasser, 1991, beschrieben. Die Transkription von PIAN wurde mittels In-situ-Hybridisierung unter Verwendung des DIG-markierten Sense-Oligonukleotids gemäß der Vorschrift des Herstellers (Boehringer Mannheim) bestimmt. Der humane Bcl-2-Klon pB4 (ATCC) wurde mit EcoRI verdaut und in die EcoRI-Stelle von pcDNA3 ligiert.
Für Adenovirusassays wurden ein Adenovirus kodierendes lacZ, Antisense-NAIP (NAIP) oder Vektor für sich ohne Insert als Kontrollen verwendet. Bcl-2 wurde in Zelllinienassays als eine Positivkontrolle und pcDNA für sich als eine Negativkontrolle eingesetzt. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch Trypanblau-Ausschluss ermittelt. Die Daten wurden als Durchschnittswerte von drei unabhängig abgeleiteten transfizierten Pools oder Infektionen dargestellt.
Beispiel 3 Immunfluoreszenzanalyse von humanem Rückenmarkgewebe.
Humane Gewebe wurden aus der Autopsie eines 2 Monate alten Säuglings gewonnen, der an nichtneurologischen Ursachen starb, und bei –80 °C gelagert. 14 μM Kryostatschnitte wurden 20 Minuten lang in Formaldehyd fixiert, in PBS gespült und 15 Minuten lang in Blockierlösung (2 Pferdeserum, 2 % Casein, 2 % BSA in PBS) inkubiert, bevor über Nacht mit Anti-NAIP-Antiserum, das in dieser Blockierlösung verdünnt wurde, inkubiert wurde. CY-3-markiertes Esel-Anti-Kaninchen-Immunglobulin (Sigma) wurde als sekundäres Antiserum verwendet.
Beispiel 4 Isolieren und Klonieren des NAIP-Gens PAC-Contig-Array
Die 40G1-CATT-Subloki zeigten ein Verknüpfungsungleichgewicht auf und deshalb wurde ein zusammenhängendes PAC-Array (PAC contiguous array), das die CATT-Region enthielt, konstruiert. Dieses PAC-Contig-Array umfasste 9 Klone und erstreckte sich über ungefähr 400 kb. Eine genetische Analyse zusammen mit den physikalischen Kartierungsdaten zeigte an, dass der 40G1-CATT-Subloki-Marker, der das größte Ungleichgewicht mit SMA zeigte, dupliziert und am äußersten Centromer des kritischen SMA-Intervalls lokalisiert wurde. Folglich wurde der 154 kb lange PAC-Klon 125D9, der innerhalb von 10 kb seines Centromerendes das SMA-Intervall, das das CMS-Allel 9 definiert, enthielt und sich telemetrisch erstreckt, um den 40G1-CATT-Sublokus einzubinden, zur weiteren Untersuchung ausgewählt.
Zwei genomische Bibliotheken wurden konstruiert, indem vollständige und partielle (durchschnittliche Insertgröße 5 kb) Sau3AI an PAC125D9 durchgeführt und die eingeschränkten Produkte in BamH1-verdaute Bluescript-Plasmide kloniert wurden. An beiden Termini von 200 Klonen aus dem 5 kb langen Insert der partiellen Sau3AI-Bibliothek wurde nach Art und Weise von Chen et al., 1993, genomische Sequenzierung vorgenommen, was die Konstruktion von zusammenhängenden und überlappenden genomischen Klonen ermöglichte, die den Großteil des PAC abdecken. Dies erwies sich als hilfreich bei der Erläuterung der Genstruktur des Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein.
PAC125D9 wird durch eine NotI-Stelle (von der später gezeigt wurde, dass sie das Exon 7 des PAC125D9 am Beginn der Apoptoseinhibitordomäne halbiert) in 30 kb lange Centromer- und 125 kb lange Telomerfragmente gespalten. Die NotI-PAC-Fragmente wurden mittels präparativer PFGE isoliert und separat zum Sondieren von fötalen Gehirn-cDNA-Bibliotheken verwendet. Die physikalische Kartierung und die Sequenzierung der NotI-Stellenregion wurden ebenfalls vorgenommen, um auf das Vorliegen einer CpG-Insel zu prüfen, ein Ansatz, der schnell kodierende Sequenzen nachwies. Das PAC125D9 wurde auch als eine Matrize in einem Exon-Trapping-System verwendet, was in der Identifizierung der Exons resultierte, die im Gen des Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein enthalten sind.
Der Mehrfachansatz, zusätzlich zum Vorliegen von Transkripten, die zuvor durch Hybridisierung von Klonen aus dem Cosmidarray (wie GA1 und L7) identifiziert wurden, resultierte in der schnellen Identifizierung von sechs cDNA-Klonen, die im Gen des Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein enthalten sind. Die Klone wurden, sofern dies möglich war, in überlappenden Arrays angeordnet. Bei einer Reihe von Gelegenheiten wurde Chimärismus durch Nachweis von Kolinearität der cDNA-Klon-Termini mit Sequenzen aus Klonen, die aus dem PRC125D9 der genomischen partiellen Sau3AI-Bibliothek abgeleitet wurden, ausgeschlossen.
Klonieren des Gens des Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein
Eine humane fötale Rückenmark-cDNA-Bibliothek wurde mit dem gesamten genomischen DNA-Insert des Cosmids 250B6 sondiert, das einen der 5 CATT-Subloki enthält. Dies resultierte in einem Nachweis eines 2,2 kb langen Transkripts, das als GA1 bezeichnet wird. Es wurden weitere Sondierungen von fötalen Gehirn-Bibliotheken mit den zusammenhängenden Cosmid-Inserts (Cosmide 40G1) sowie Einzelkopie-Subklonen, die aus solchen Cosmiden isoliert wurden, vorgenommen. Eine Reihe von Transkripten wurde erhalten, einschließlich eines als L7 benannten. Es wurde keine kodierende Region für L7 nachgewiesen, wahrscheinlich aufgrund der Tatsache, dass ein erheblicher Teil des Klons nicht verarbeitete heteronukleare RNA enthielt. Es wurde jedoch später entdeckt, dass von L7 erwiesen wurde, dass es einen Teil dessen umfasst, von dem geglaubt wird, dass es sich um das Gen des Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein handelt. Analog dazu wurde letztendlich vom GA1-Transkript erwiesen, dass es das Exon 13 des Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein ist. Da von GA1 festgestellt wurde, dass es Exone enthält, was darauf hinwies, dass es ein exprimiertes Gen war, war es von besonderem Interesse. Das GA1-Transkript, das im PAC-Klon 125D9 enthalten war, wurde anschließend durch weitere Sondierung in cDNA-Bibliotheken verlängert.
Die verbleibenden Gaps in der cDNA wurden vervollständigt und die endgültige 3'-Verlängerung wurde durch Sondieren einer fötalen Gehirn-Bibliothek mit zwei „gefangenen" (trapped) Exonen erreicht. Es wurde eine physikalische Karte der cDNA mit überlappenden Klonen hergestellt. Die gesamte cDNA-Sequenz ist in Tabelle 1 gezeigt und enthält 18 Exone (1 bis 14a und 14 bis 17). Die Aminosäuresequenz startet mit Methionin, das dem Nukleotid-Triplett ATG entspricht.
DNA-Manipulation und -Analyse
Vier genomische Bibliotheken, die den PAC125D9-Insert enthalten, wurden durch Verdauungen des genomischen DNA- PAC-Inserts mit BamHI, BamHI/NotI und gesamtem und partiellem Sau3AI (für eine Insertgröße von 5 kb ausgewählt) konstruiert und in Bluescript-Vektor subkloniert. Es wurde eine Sequenzierung von ungefähr 400 bp beider Termini von 200 fünf kb langen Klonen aus der partiellen Sau3AI-Verdau-Bibliothek nach Art von Chen et al. (1993) vorgenommen.
Kodierende Sequenzen aus den PACs wurden mittels der Exon-Amplifikationsmethode isoliert, wie von Church et al. (1994) beschrieben. Die PACs wurden mit BamHI oder BamHI und BglII verdaut und in pSPL3 subkloniert. Gepoolte Klone jedes PAC wurden in COS-1-Zellen transfiziert. Nach einer 24 h dauernden Transfektion wurde die gesamte RNA extrahiert. Die Exone wurden in pAMP10 (Gibco BRL) kloniert und unter Anwendung des Primers SD2 (GTG AAC TGC ACT GTG ACA AGC TGC) sequenziert.
Die DNA-Sequenzierung wurde auf einem automatisierten DNA-Sequenzer ABI 373A vorgenommen. Zwei handelsübliche humane fötale Gehirn-cDNA-Bibliotheken in Lambda gt (Stratagene) und Lambda ZAP (Clontech) wurden für die Isolierung des Kandidatentranskripts verwendet. Der Northern-Blot wurde im Handel erworben (Clontech) und die Sondierung wurde unter Anwendung von Standardmethodik durchgeführt.
Im Allgemeinen wurden in der Veröffentlichung für die PCR verwendete Primer für eine T_ms von 60 °C ausgewählt und können mit den folgenden Bedingungen verwendet werden: 30 Zyklen bei 94 °C, 60 s; 60 °C, 60 s; 72 °C, 90 s. PCR-Primer-Kartierungen waren wie in den Legenden der Figuren und im Text genannt. Die Primersequenzen waren wie folgt:
1258 ATg CTT ggA TCT CTA gAA Tgg – Sequenz ID NO: 3
1285 AgC AAA gAC ATg Tgg Cgg AA – Sequenz ID NO: 4
1343 CCA gCT CCT AgA gAA AgA Agg A – Sequenz ID NO: 5
1844 gAA CTA Cgg CTg gAC TCT TTT – Sequenz ID NO: 6
1863 CTC TCA gCC TgC TCT TCA gAT – Sequenz ID NO: 7
1864 AAA gCC TCT gAC gAg Agg ATC – Sequenz ID NO: 8
1884 CgA CTg CCT gTT CAT CTA CgA – Sequenz ID NO: 9
1886 TTT gTT CTC CAg CCA CAT ACT – Sequenz ID NO: 10
1887 CAT TTg gCA TgT TCC TTC CAA g – Sequenz ID NO: 11
1893 gTA gAT gAA TAC TgA TgT TTC ATA ATT – Sequenz ID NO: 12
1910 TgC CAC TgC CAg gCA ATC TAA – Sequenz ID NO: 13
1919 TAA ACA ggA CAC ggT ACA gTg – Sequenz ID NO: 14
1923 CAT gTT TTA AgT CTC ggT gCT CTg – Sequenz ID NO: 15
1926 TTA gCC AgA TgT gTT ggC ACA Tg – Sequenz ID NO: 16
1927 gAT TCT ATg TgA TAg gCA gCC A – Sequenz ID NO: 17
1933 gCC ACT gCT CCC gAT ggA TTA – Sequenz ID NO: 18
1974 gCT CTC AgC TgC TCA TTC AgA T – Sequenz ID NO: 19
1979 ACA AAg TTC ACC ACg gCT CTg – Sequenz ID NO: 20
Unsere genetische und Kartierungsanalyse von SMA hat zur Identifizierung des 154 kb langen Inserts von PAC125D9 als der wahrscheinlichen Stelle des SMA-Gens geführt. Wir berichten hier von der kompletten DNA-Sequenz des 131 kb langen Teils des PAC125D9-Inserts, das sowohl NAIP als auch SMN^tel sowie das 3'-Ende einer Kopie des basischen Transkriptionsfaktor-Gens BTF2p44⁹ enthält. Das mit einer Vielfalt von Restriktionsenzymen verdaute PAC125D9-Insert wurde zum Erstellen von neun Bibliotheken verwendet. Shotgun-Sequenzierung von Klonen aus der Sau3AI-Bibliothek wurde durch die Alu-reiche Beschaffenheit des Bereichs behindert; die Sequenzierung wurde daher mittels eines modifizierten Transposon-basierten Ansatzes¹⁰ durchgeführt, der die in der Figur bildlich dargestellte Konfiguration ergab. Das NAIP- und das SMN^tel-Gen, die durch 15,5 kb getrennt sind, befinden sich in einer Schwanz-zu-Schwanz-Ausrichtung (5'→3':3'←5'), die 56 kb bzw. 28 kb genomischer DNA umspannt. Das Gen BTF2p44 existiert in einer Reihe von Kopien an 5q13.11¹⁰; die Exone 11 – 16 einer BTF2P44-Kopie belegen den Großteil der elf kb am 5'-Ende des PAC-Inserts, gefolgt von einem 11 kb langen Intervall vor dem NAIP-Exon 2. Das erste NAIP-Exon, wie ursprünglich berichtet³, liegt in diesem PAC nicht vor und kann ein heteronukleares Artefakt gewesen sein. Ein ungefähr 3 kb langer Abschnitt des 15,5 kb langen Intervalls zwischen NAIP und SMN (CCA, Figur) ist transkribiert, enthält jedoch keine proteinkodierende Sequenz. Tatsächlich wurde im gesamten Intervall keine kodierende Sequenz zusätzlich zu BTF2P44, NAIP und SMN identifiziert.
In der 5'-Region sowohl des SMN- als auch des NAIP-Gens wurden CpG-Inseln identifiziert. Einhundertfünfundvierzig Alu-Sequenzen wurden in der 131 kb langen Sequenz identifiziert, wobei fünf Cluster hoher Dichte erkannt wurden (Legende der Figur). Eine solche mit L1-Mangel (fünf Kopien) assoziierte Alu-Dichte ist in Übereinstimmung mit vorherigen Ergebnissen für leichte Giemsa-Färbung (oder umgekehrt) chromosomaler Banden¹¹ überein. Kopien anderer Wiederholungen (z: B. MIR2, MST und MER), wie durch das Sequin-Programm nachgewiesen, sind ebenfalls wie bildlich dargestellt¹². Die polymorphen Mikrosatelliten-Loki, die zuvor auf die SMA-Region kartiert wurden; (CMS1¹³, CATT¹⁴ oder C161¹⁵, C171¹⁵, C272¹⁵ oder Ag-1^16,17) sowie ungewöhnliche Einzel- und Dinukleotidwiederholungen sind wie gezeigt.
Die vollständige NAIP-cDNA (6228 bp mit einem ORF von 4212 bp) wurde ebenfalls mittels cDNA-Sequenzierung und Vergleich mit der PAC-Sequenz, die 17 Exone umfasste, die ein vorhergesagtes 156-kDa-Protein aus 1403 Aminosäuren kodiert, erläutert (Daten nicht gezeigt). Es wurde ein neuartiges NAIP-Exon 14 zwischen dem ursprünglichen Exon 14 und 15 identifiziert. Das ursprüngliche Exon 17 ist durch ein neuartiges Exon ersetzt worden, das das Stoppcodon, eine 1,6 kb lange 3'-UTR-Region und die Polyadenylierungskonsensusstelle (AATAAA), die durch 3'-RACE identifiziert wurde, enthält. Es wurden keine neuen Proteindomänen in dem NAIP-Gen gefunden.
Eine rigorose Definition davon, wie weit sich Deletionen an Typ-I-SMA-Chromosomen erstrecken, ist für unser Verständnis des Krankheitsverlaufs von Entscheidung. Wenn der am häufigsten an Typ-I-SMA-Chromosomen beobachtete Genotyp (d. h. Abwesenheit der NAIP-Exone 4 und 5 sowie der SMN^tel-Exone 7 und 8) das Resultat eines einzigen Ereignisses ist, legt unsere Sequenzierung eine Mindestdeletionsgröße von 60 kb nahe. Die hohe Deletionshäufigkeit an Typ-I-SMA-Chromosomen des CATT-40G1¹⁴ (das zwischen dem NAIP-Exon 7 und 8 kartiert wird) ist mit einer solchen Deletion konsistent.
Southern-Blots, die genomische DNA enthalten, die mit NAIP-cDNA sondiert wurde, offenbaren eine Mannigfaltigkeit von Banden, ein Resultat der polymorphen Anzahl von Variantenformen dieser Lokuskartierung auf 5g13.1³'¹⁸. Im Gegensatz dazu offenbaren die gleichen Blots, die mit SMN-cDNA sondiert wurden, nur die Banden, die mit dem intakten SMN-Lokus assoziiert sind, sowohl für SMA- als auch Nicht-SMA-Individuen. Folglich gibt es keinen Beleg für verkürzte oder teilweise deletierte SMN-Gene, wie sie beim NAIP-Gen gesehen wurden. Die Abwesenheit eines beliebigen nachweisbaren SMN-Junction-Fragments bei SMA-Patienten legt deutlich nahe, dass die Deletion der SMN^tel-Exone 7 und 8, die in der wesentlichen Mehrheit von SMA-Fällen nachgewiesen wurde, das gesamte SMN^tel-Gen einschließt, wodurch die putative Mindest-SMA-Typ-I-Deletion auf ungefähr 100 kb verlängert wird (Figur). Dies ist in Übereinstimmung mit der hohen Deletionshäufigkeit des C272¹⁵-Mikrosatelliten (oder AG-1^16,17-Mikrosatelliten) (der auf dem SMN-Exon 1 kartiert wird, Figur) an Typ-I-SMA-Chromosomen. Eine 15%-ige Deletionshäufigkeit einer Kopie von BTF2P44 wird in allen SMA-Fällen beobachtet, ungeachtet des klinischen Schweregrads⁹, was nahe legt, dass diese Mutation möglicherweise nicht eine Verlängerung der putativen SMN-NAIP-Deletion ist. Die Aufklärung dieses Problems muss auf Details dazu warten, welche Kopie von p44 deletiert wird.
Unsere Sequenzierung von PAC125D9 kartiert den intakten NAIP-Lokus und das klinisch relevante SMN^tel auf eine 100 kb lange Region, die jene Mikrosatellitenpolymorphismen enthält, die bei der wesentlichen Mehrheit der Typ-I-SMA-Chromosomen (d. h. CATT-40G1¹⁴, C272¹⁵ oder AG-1^16,17) vorzugsweise deletiert sind. Die Abwesenheit einer etwaigen proteinkodierenden Sequenz, bei der es sich nicht um NAIP und SMN handelt, in diesem Intervall richtet das Augenmerk auf diese zwei Gene als den Hauptmodulatoren von Typ-I-SMA. Ein potentielles pathogenes Modell besteht darin, dass die SMN^tel-Abwesenheit als der primäre neurotoxische Insult¹⁹ fungiert, wobei der NAIP-Depletion/Abwesenheit zu einer abgeminderten apoptotischen Resistenz⁵'⁶ führt, was eine Motorneuronenabnahme erschwert. Das Vorliegen von zusätzlichem SMN^cen kann außerdem zum Modulieren des Verlaufs der Erkrankung²⁰ fungieren. Zusätzlich dazu, dass sie uns dabei hilft, die molekulare Pathologie akuter SMA zu verstehen, sollte die hier präsentierte Sequenz bei der Studie transkriptioneller Steuerelemente für beide Gene helfen, wodurch möglicherweise die Formulierung von genetischen Therapien für diese verheerende neuromuskuläre Erkrankung erleichtert wird.
DNA-Sequenzierung
Aus dem PAC125D9-Insert wurden Partielle Sau3AI- (für 3–5 kb ausgewählt), BamHI-, EcoRI-, HindIII-, PstI-, SstI-, XbaI- und EcoRV-Bibliotheken hergestellt und unter Anwendung einer Transposon-basierten Methodik (TN1000 Gold Biotechnology¹⁰) sequenziert. Die Subklonierung einer großen Anzahl von Inserts in das handelsüblich bereitgestellte pMOB-Plasmid erwies sich als problematisch, daher wurden pUC18 und pBluescript SK verwendet. Im Allgemeinen wiesen weniger als 10 % der Klone Transposone in der Vektorregion auf. E. coli-Lysat wurde als Sequenzierungsmatrize unter Anwendung unserer modifizierten Vorschrift mit „Wärmedurchtränkung"²¹ eingesetzt. Die Sequenzierung war aus dem TN1000-Transposon, das willkürlich in die Target-DNA insertiert wurde, unter Anwendung von Primern mit entgegengesetzter Ausrichtung (5'-ATA TAA ACA ACGAAT TAT CTC C-3'; 5'-GTA TTA TAA TCA ATA AGTTAT ACC-3'), was ungefähr 1 kb Sequenz mit einer 5 by langen Überlappung erzeugte, die problemlos 300 bp Alu-Wiederholungen überspannte. Unser Ansatz ließ die Sequenzierung von Inserten mit einer Größe von bis zu 14 kb zu.
Da von der SMA-Region bekannt ist, dass sie instabil ist, wurde besondere Sorgfalt angewendet, um ein intaktes, unmodifiziertes PAC-Insert sicherzustellen, vor allem durch Vergleich von Hybridisierungsmustern des PAC125D9-Inserts und genomischer DNA auf Southern-Blots.
Unverarbeitete DNA-Sequenzdaten, die von unseren automatisierten Sequenzern (ABI 373 und ABI 373A) erstellt wurden, wurden verarbeitet und parallel vom Sequencher 3.0-Programm (Gene Codes Inc.) und vom GAP4-Programm aus dem Staden-Paket²⁷ zusammengestellt. Die bearbeiteten Ergebnisse wurden automatisch in GCG-Dateiformate²² konvertiert und für Suchvorgänge durch Benutzer von außerhalb mit unserem E-Mail-Server unter smafasta@mgcheo.med.uottawa.ca in eine separate Datenbank gegeben. GRRIL²⁸- und Blast²⁹-Suchen wurden angewendet, um auf proteinkodierende Sequenzen zu prüfen, und die PROSITE-Proteindatenbank²⁴ wurde zum Suchen nach Proteindomänen verwendet.
Beispiel 5 NAIP-Expressionsvektoren
Unter Anwendung der Information der identifizierten NAIP-Sequenz wurden ein vollständiges 3,7 kb langes NAIP-Konstrukt, das mit dem myc-Epitop (I) MTG-SP3.7 markiert war, ein 2,5 kb langes Bsu36I/SalI-Fragment von NAIP, das in Bluescript und (ii) Bsu36I/XhoI-Abschnitt MTG-SE1.7 kloniert war, der Expressionsvektor pcDNA3, der ein 300 bp langes myc-Epitop enthielt, und ein 1,7 kb langes Fragment von NAIP ligiert. HeLa-, CHO- und Rat-1-Zellen wurden mittels Lipofektion (Gibco BRL) mit 8 μg DNA transfiziert und G418-resistente Transformanten wurden zum Halten der Zellen in 250 μg/ml, 400 μg/ml bzw. 800 μg/ml G418 ausgewählt.
In einem zweiten Ansatz wurden Zellen mit Adenovirus für sich oder Adenovirus, der entweder NAIP, Antisense-NAIP oder lacZ exprimiert, infiziert. Zur Konstruktion des Adenovirus wurde ein 3,7 kb langes BamHI-Fragment von NAIP in die SwaI-Stelle des Adenovirus-Expressionscosmids pAdexICawt kloniert. Die Antisense-NAIP-RNA enthält eine Sequenz, die zur Region einer mRNA, die ein Initiatorcodon enthält, komplementär ist. Die Expression von NAIP wurde bei beiden Vorgängen mittels Western-Blot-Analyse und Immunfluoreszenz bestätigt. Nach der Infektion mit den rekombinanten Adenoviren wurden CHO-Zellen durch Serumentzug dazu bewegt, Apoptose durchzumachen, mit Überlebensraten von 48 % (kein Insert), 51 % (lacZ) und 45 % (Antisense-NAIP) zu 48 Stunden (1a). Im Gegensatz dazu zeigten CHO-Zellen, die mit Adenovirus infiziert waren, der NAIP exprimiert, 78 – 83 % Überleben. NAIP induzierte auch das Überleben in stabil transfizierten CHO-Pools, wenn auch etwas geringer, als es in mit Adenovirus infizierten Zellen zu erkennen war: 44 % der Vektor-Transfektanten und 65 % der NAIP-Transfektanten überlebten zu 48 Stunden (1b). Als Nächstes resultierte die Überexpression von NAIP in CHO-Zellen, die mit 20 μM Menadion (einem wirksamen Induzierer freier Radikale) behandelt worden waren, in einer 20–30%-igen Steigerung des Überlebens im Vergleich zu Kontrollen nach 24 Stunden (1c, 1d). Die Überexpression von NAIP schützte auch mit Menadion behandelte Rat-1-Fibroblasten vor dem Durchmachen von Zelltod (1e, 1f, 1g, 1h). Nur 15 % der Zellen, die mit lacZ infiziert waren, das Adenovirus exprimiert, waren zu 12 Stunden lebensfähig, im Gegensatz zu 80 % der mit NAIP infizierten Zellen; ein Effekt, der auch bei den gepoolten Rat-1-NAIP-Transfektanten nachgewiesen wurde. Ein sogar noch größeres Überleben wurde von NAIP-Überexpression bei einer geringeren Menadion-Konzentration (5 μM) induziert, wobei 98 % der gepoolten NAIP-Transfektanten und 33 % der Kontrolltransfektanten zu 24 Stunden lebensfähig waren (1g, 1h). Die Schutzwirkung von NAIP auf Zellen, die dem Cytokin TNF-α ausgesetzt wurden, wurde ebenfalls beurteilt. HeLa-Zellen, die mit TNF-α und Cyclohexamid behandelt worden waren, wurden zu 48 Stunden vor Apoptose geschützt, wenn sie mit Adenovirus infiziert wurden, der hohe NAIP-Konzentrationen exprimierte (139 %); ein Effekt, der mit Antisense-NAIP (52 %) nicht beobachtet wurde (1i, 1j). Ein ähnlicher Effekt wurde bei gepoolten HeLa-Transformanten beobachtet.
Zur Bestätigung, dass Zellen das von apoptotischen Agenzien exprimierte NAIP überlebten, wurde an einer Reihe der Zelltodassays Immunfluoreszenz mit Anti-NAIP-Antisera durchgeführt. Bei Immunfluoreszenz handelt es sich um eine Technik, die Proteine in einer Zelle mittels Lichtmikroskopie durch Verwendung von Antikörpern, die für ein gewünschtes Protein spezifisch sind, und eines Fluoreszenzmikroskops lokalisiert. Farbstoffe können chemisch an Antikörper gekoppelt werden, die gegen gereinigte Antikörper gerichtet sind, die für ein gewünschtes Protein spezifisch sind. Dieser Komplex aus Fluoreszenzfarbstoff und Antikörper bindet, wenn er permeabilisierten Zellen oder Gewebeschnitten zugegeben wird, an den gewünschten Antigen-Antikörper, der aufleuchtet, wenn er von der anregenden Wellenlänge erleuchtet wird. Fluoreszierende Antikörper können zur Sichtbarmachung auch in kultivierte Zellen mikroinjiziert werden. Unter Anwendung von Immunfluoreszenz wurde CY-3, ein Farbstoff, der rotes Licht abgibt, an einen sekundären Antikörper gekoppelt, der zum Nachweisen der gebundenen Anti-NAIP-Antikörper verwendet wurde. Es wurde eine drastische Anreicherung von NAIP-exprimierenden Zellen beobachtet, wobei bei der zytoplasmatischen Verteilung von NAIP keine Veränderung bemerkt wurde. Diese Daten bieten starke Unterstützung für die apoptotische Unterdrückungsaktivität von NAIP.
Beispiel 6 Zelluläre Verteilung von NAIP unter Verwendung von NAIP-Antikörpern
Es wurde zuvor (N. Roy et al., The gene for NAIP, a novel protein with homology to baculoviral inhibitor for apoptosis, is partially deleted in individuals with spinal muscle atrophy. Cell 80:167–178 (1995)) durch Reverse-Transkriptase-PCR-Analyse demonstriert, dass das NAIP-Transkript in humanem Rückenmark vorliegt. Um die zelluläre Verteilung von NAIP präziser zu definieren, wurde ein polyklonales Antiserum gegen NAIP gezüchtet. Die NAIP- Antikörper wurden dann sowohl in Immunzytochemie- als auch Immunfluoreszenztechniken verwendet, um das Protein direkt in Zellen und Geweben sichtbar zu machen, um den subzellulären Ort und die Gewebespezifität des Proteins zu ermitteln.
Die Fähigkeit des polyklonalen Antikörpers, NAIP nachzuweisen, wurde mittels Immunfluoreszenz von Zellen, die mit myc-markierten NAIP transfiziert waren, wobei sowohl die Anti-NAIP- als auch die Anti-myc-Antikörper eingesetzt wurden, als auch Western-Blot-Analyse an Proteinextrakten dieser Zellen bestätigt (1). Bei der Western-Blotting-Technik werden Proteine auf Polyacrylamid-Gel laufengelassen und dann auf Nitrocellulosemembrane übertragen. Diese Membrane werden dann in Anwesenheit des Antikörpers (primär) inkubiert und anschließend nach Waschen mit einem sekundären Antikörper inkubiert, der zum Nachweis des Komplexes aus Protein und primärem Antikörper verwendet wird. Nach wiederholtem Waschen wird der gesamte Komplex unter Anwendung von kolorimetrischen oder chemilumineszenten Verfahren sichtbar gemacht. Ein Protein mit dem erwarteten Molekulargewicht wurde von beiden Antikörpern in Western-Blots nachgewiesen und ihre zelluläre Kolokalisierung mittels Immunfluoreszenz demonstriert. Schnitte humanen Rückenmarks, die mit Anti-NAIP gefärbt waren, zeigten eine starke Immunreaktivität im Zytoplasma der Vorderhornzellen und intermediolateralen Neuronen (3a und 3b). Im Einklang mit der Motorneuronenfärbung wurde in den Vorderwurzeln, die motorische Axone enthalten, NAIP-Reaktivität beobachtet, jedoch nicht in den Hinterwurzeln, die aus sensorischen Axonen bestanden (3c und 3d). Die Beobachtung bei der Motorneuronenfärbung korreliert gut mit einer Rolle des Proteins in der Pathogenese von SMA. Das Vorliegen von NAIP in intermediolateralen Neuronen, von denen nicht berichtet wird, dass sie von SMA beeinträchtigt werden, impliziert jedoch Heterogenität bei den apoptotischen Stoffwechselwegen zwischen den zwei Klassen von Neuronen.
Andere Ausführungsformen
In anderen Ausführungsformen umfasst die Erfindung ein beliebiges Protein, das im Wesentlichen mit einem der NAIP-Polypeptide eines Säugers identisch ist, die in den 6 und 7 bereitgestellt sind (SEQ ID NO: 22 und 24); solche Homologe umfassen andere im Wesentlichen reine, natürlich vorkommende NAIP-Proteine eines Säugers sowie allelische Varianten; natürliche Mutanten; induzierte Mutanten; DNA-Sequenzen, die Proteine kodieren und außerdem zu den NAIP-DNA-Sequenzen der 6 und 7 hybridisieren (SEQ ID NO: 21 und 23), unter hohen Stringenzbedingungen oder weniger bevorzugt unter geringen Stringenzbedingungen (z. B. Waschen mit 2X SSC bei 400 °C mit einer Sondenlänge von mindestens 40 Nukleotiden); und Proteine, die spezifisch durch Antisera, die auf ein NAIP-Polypeptid gerichtet sind, gebunden wurden. Der Ausdruck umfasst auch chimäre Polypeptide, die einen NAIP-Teil enthalten. Die Sequenz von SEQ ID NO: 1 und die IAP-Proteine sind spezifisch ausgeschlossen.
Die Erfindung umfasst weiterhin Analoga beliebiger natürlich vorkommender NAIP-Polypeptide. Analoga können sich durch Aminosäuresequenzunterschiede, durch posttranslationelle Modifizierungen oder durch beides von dem natürlich vorkommenden NAIP-Protein unterscheiden. Analoga der Erfindung werden im Allgemeinen mindestens 85 %, mehr bevorzugt 90 % und am meisten bevorzugt 95 % oder sogar 99 % Identität mit der gesamten oder einem Teil einer natürlich vorkommenden NAIP-Aminosäuresequenz aufzeigen. Die Länge des Sequenzvergleichs beträgt mindestens 15 Aminosäurereste, vorzugsweise mindestens 25 Aminosäurereste und mehr bevorzugt mehr als 35 Aminosäurereste. Modifizierungen umfassen die chemische Ableitung von Polypeptiden in vivo und in vitro, z. B. Acetylierung, Carboxylierung, Phosphorylierung oder Glykosylierung; solche Modifizierungen können während der Polypeptidsynthese oder -verarbeitung oder nach Behandlung mit isolierten modifizierenden Enzymen erfolgen. Analoga können sich auch durch Veränderungen der primären Sequenz von dem natürlich vorkommenden NAIP-Protein unterscheiden. Diese umfassen genetische Varianten, sowohl natürliche als auch induzierte (beispielsweise aus Zufallsmutagenese durch Bestrahlung oder Aussetzung gegenüber Ethanmethylsulfat oder ortsspezifischer Mutagenese resultierend, wie in Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausg.), CSH Press, 1989, oder Ausubel et al., oben, beschrieben). Ebenfalls umfasst sind cyclisierte Peptide, Moleküle und Analoga, die Reste enthalten, bei denen es sich nicht um L-Aminosäuren handelt, z. B. D-Aminosäuren oder nicht natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäuren, z. B. B- oder γ-Aminosäuren. Zusätzlich zu vollständigen Polypeptiden umfasst die Erfindung auch NAIP-Polypeptid-Fragmente. Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „Fragment" mindestens 20 zusammenhängende Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 30 zusammenhängende Aminosäuren, mehr bevorzugt mindestens 50 zusammenhängende Aminosäuren und am meisten bevorzugt mindestens 60 bis 80 oder mehr zusammenhängende Aminosäuren. Fragmente von NAIP-Polypeptiden können mittels Fachmännern bekannten Verfahren erzeugt werden oder können aus normaler Proteinverarbeitung resultieren (z. B. Entfernen von Aminosäuren aus dem entstehenden Polypeptid, die für die biologische Aktivität nicht erforderlich sind, oder Entfernen von Aminosäuren durch alternatives mRNA-Spleißen oder alternative Proteinverarbeitungsereignisse).
Bevorzugte erfindungsgemäße Fragmente oder Analoga sind diejenigen, die den spezifischen Nachweis einer NAIP-Nukleinsäure- oder -Aminosäuresequenz in einer zu diagnostizierenden Probe erleichtern. Besonders geeignete NAIP-Fragmente für diesen Zweck umfassen, ohne Einschränkung, die in der Tabelle 2 gezeigten Aminosäurefragmente.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Im Wesentlichen reine Nukleinsäure, die mindestens 90 Nukleinsäurensequenzidentität zur vollständigen Nukleinsäuresequenz vom Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein (NAIP) von SEQ ID NO:21 aufweist und die Nukleotide 3734 bis 3886 (Exon 14a) und 4139 bis 4503 (Exon 17) von SEQ ID NO:21 enthält oder mindestens 90 % Nukleinsäurensequenzidentität zur vollständigen NAIP-Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO:23 aufweist und die Nukleotide 3838 bis 3990 von SEQ ID NO:23 und die Nukleotide 4243 bis 4605 von SEQ ID NO:23 enthält, wobei die Nukleinsäure ein NAIP-Polypeptid kodiert, das Apoptose inhibiert.
Im Wesentlichen reine Nukleinsäure nach Anspruch 1, die die Sequenz von SEQ ID NO:21 oder degenerierte Varianten davon aufweist und ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:22 aufweist, wobei das Polypeptid Apoptose inhibieren kann.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Nukleinsäure mit einer Regulationssequenz zur Expression des NAIP-Polypeptids funktionsfähig verknüpft ist und wobei die Regulationssequenz einen Promotor umfasst.
Nukleinsäure nach Anspruch 3, wobei der Promotor ein konstitutiver Promotor ist, von einem oder mehreren externen Agenzien induzierbar ist oder zelltypspezifisch ist.
Vektor, der die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst und die Expression eines NAIP-Polypeptids regeln kann, das Apoptose inhibieren kann.
Wirtszelle, die den Vektor nach Anspruch 5 enthält.
Im Wesentlichen reines NAIP-Polypeptid eines Säugers, das von der Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert wird.
Therapeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines NAIP-Polypeptids nach Anspruch 7 in einem physiologisch unbedenklichen Träger umfasst.
Nichtmenschliches tierisches Transgen für eine NAIP-Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
In-vitro-Verfahren zum Erhalten eines NAIP-Polypeptids, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Versehen einer Zelle mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 3 oder 4, wobei die Nukleinsäure zur Expression in der Zelle angeordnet ist; (b) Kultivieren der Zelle unter Bedingungen zum Exprimieren der DNA und (c) Isolieren des NAIP-Polypeptids.
In-vitro-Verfahren zum Identifizieren einer NAIP-Nukleinsäure in einer Säugerzelle, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Bereitstellen eines Präparats von Säugerzell-DNA der Zelle; (b) Bereitstellen einer nachweisbar markierten DNA-Sequenz, die sich spezifisch an die Nukleotide 3734 bis 3886 (Exon 14a) und 4139 bis 4503 (Exon 17) von SEQ ID NO:21 oder die Nukleotide 3838 bis 3990 (Exon 14a) und die Nukleotide 4243 bis 4605 (Exon 17) von SEQ ID NO:23 bindet; (c) Kontaktieren des Präparats von Zell-DNA mit der nachweisbar markierten DNA-Sequenz unter Hybridisierungsbedingungen, die für den Nachweis von Nukleinsäuren, die mindestens 50 % Nukleinsäurensequenzidentität aufweisen, sorgen; und (d) Identifizieren einer NAIP-Nukleinsäure durch deren Verbindung mit der nachweisbar markierten DNA-Sequenz.
In-vitro-Verfahren zum Isolieren einer wie in Anspruch 1 oder 2 definierten NAIP-Nukleinsäure oder eines Teils davon, wobei das Verfahren das Amplifizieren der NAIP-Nukleinsäure oder eines Teils davon mittels PCR unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern, wobei die Primer: (a) jeweils länger als 13 Nukleotide sind; (b) jeweils Regionen von Komplementarität mit gegenüber liegenden DNA-Strängen aufweisen, die die Nukleotide 3838 bis 3990 (Exon 14a) oder die Nukleotide 4243 bis 4605 (Exon 17) von SEQ ID NO:23 umfassen; und (c) wahlweise Sequenzen enthalten, die im amplifizierten Produkt Restriktionsenzymschnittstellen erstellen können; und das Isolieren der NAIP-Nukleinsäure oder des Teils davon umfasst.
In-vitro-Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die Apoptose moduliert, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Kontaktieren einer Zelle, die ein NAIP-Polypeptid exprimiert, in vitro mit einer in Frage kommenden Verbindung und Überwachen der Expression einer wie in Anspruch 1 oder 2 definierten NAIP-Nukleinsäure durch Nachweisen einer Nukleinsäuresequenz, die die Nukleotide 3838 bis 3990 von SEQ ID NO:23 oder die Nukleotide 4243 bis 4605 von SEQ ID NO:23 umfasst, wobei eine Veränderung des Niveaus der Expression der Nukleinsäure auf das Vorliegen einer Verbindung hinweist, die Apoptose moduliert.
Nukleinsäure vom Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein (NAIP) nach Anspruch 1 oder 2 oder ein Polypeptid, das von der Nukleinsäuresequenz kodiert wird, zur Verwendung als ein Arzneimittel.
Verwendung einer NAIP-Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 oder eines Polypeptids, das von der Nukleinsäuresequenz kodiert wird, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von spinaler Muskelatrophie, ALS, AIDS, einer neurodegenerativen Erkrankung, eines myelodysplastischen Syndroms oder einer ischämischen Verletzung.
NAIP-Antisense-Molekül, das eine Nukleinsäure umfasst, die zu den Nukleotiden 3734 bis 3886 (Exon 14a) oder den Nukleotiden 4139 bis 4503 (Exon 17) von SEQ ID NO:21 oder den Nukleotiden 3838 bis 3990 von SEQ ID NO:23 oder den Nukleotiden 4243 bis 4605 von SEQ ID NO:23 komplementär ist.
NAIP-Antisense-Molekül nach Anspruch 16 zur Verwendung als ein Arzneimittel.