KR101779370B1 - 방사선 조사 된 흉선 림프종 세포에서 발굴 된 세포고사 조절 유전자 및 그 검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 방사선 조사 된 흉선 림프종 세포에서 발굴 된 세포고사 조절 유전자에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 저선량률 저준위 방사선 조사 된 마우스 흉선 림프종 세포에서 발굴 된 세포고사 조절 유전자 검출 방법에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 방사선 조사 된 흉선 림프종 세포에서 발굴 된 세포고사 조절 유전자 검출함으로써, 방사선 조사에 따른 세포고사 조절 유전자의 기능을 밝히고 유전자 프로파일을 제공하는 효과가 있다.
또한, 방사선 조사 된 흉선 림프종 세포에서 발굴된 세포고사 조절유전자는 저준위 방사선 환경에서 생활하는 산업 및 의료종사자의 선량-반응 관련성을 평가할 수 있는 유전자 프로파일을 구성하는데 사용할 수 있다.
방사선 조사 된 흉선 림프종 세포에서 발굴 된 세포고사 조절 유전자는 흉선 림프종 환자의 암 진행 정도 및 치료 정도를 평가할 수 있는 지표로 이용 할 수 있다.
방사선 조사 된 흉선 림프종 세포에서 발굴 된 세포고사 조절 유전자 검출방법은 흉선 림프종 진단용 조성물 및 진단키트 제작에 이용 될 수 있다.

Description

방사선 조사 된 흉선 림프종 세포에서 발굴 된 세포고사 조절 유전자 및 그 검출방법 {Apoptosis regulatory gene detected irradiated-thymic lymphoma and detecting method of thereof}
본 발명은 방사선 조사 된 흉선 림프종 세포에서 발굴 된 세포고사 조절 유전자에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 저선량률 저준위 방사선 조사 된 마우스 흉선 림프종 세포에서 발굴 된 세포고사 조절 유전자 검출 방법에 관한 것이다.
일반적으로 고준위 방사선은 DNA를 손상시키고 암을 발생시킨다고 알려져 있다. 반면에, 저선량 방사선은 암을 억제한다고 알려져 있으나, 관련 유전자와 암 억제 기전에 대해서는 알려져 있지 않다.
저선량 방사선은 강도가 낮은 방사선을 가리키며, 일반적으로 100mSv이하의 방사선을 의미한다. 다량의 방사선은 생물체에 해를 줄 수 있지만, 낮은 선량의 저선량 방사선은 생명체의 생리활동이 촉진되어 수명이 연장되거나 성장촉진 또는 종양 발생률이 저하되는 등 유익한 효과가 있다. 이러한 효과를 방사선 호르메시스(radiation hormesis)라고 한다.
밀리그레이(miligray, mGy) 범위의 저선량 방사선은 고선량 방사선과는 달리 질병에 대한 저항성을 유발하고 적응 보호(adaptive protection) 효과를 나타낸다고 보고되었고(Sakai K., et al., Dose Response, 2006, 4(4):327~332; Sakai K., et al, Int. J. Low Radiat., 2003, 1(1):142~146; Scott BR., Dose Response, 2008 6(3):299~318), 당뇨병 유전인자를 가진 실험 생쥐에 일정량의 저선량 방사선을 조사하였더니 병세가 호전되었다는 보고가 있다(Sakai K., et al., Dose Response, 2006, 4(4):327~332). 또한, 0.25Gy 이하의 방사선은 DNA 손상을 방어하고 손상된 DNA를 복구하는 효과(Le XC., et al., Science, 1998, 280(5366):1066~1069)가 있으며, 저선량 방사선은 면역증강효과가 있다고 보고되었다(Nogami M., et al., Int. J.Radiat. Biol., 1993, 63(6):775~783; Nogami M., et al., Radiat. Res., 1994, 139(1):47~52).
본 발명의 목적은, 방사선 조사 된 흉선 림프종 세포에서 발굴 된 세포고사 조절 유전자에 관한 것으로써, 더욱 상세하게는 저선량 저준위 방사선 조사 된 흉선암 세포에서 세포고사 조절 유전자를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포고사 조절 유전자의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 흉선 림프종 진단용 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 상기 흉선 림프종 진단용 조성물을 포함하는 흉선 림프종 진단용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 흉선 림프종 세포에서 세포고사 조절 유전자를 검출하는 방법은 흉선 림프종세포에 저선량률 저준위 방사선을 조사하는 단계 및 상기 방사선이 조사 된 각각의 마우스 흉선 림프종 세포에서 유전자 발현에 변화가 잇는 세포고사 조절 유전자를 검출하는 단계를 포함한다.
상기 흉선 림프종 세포는 마우스(Mus musculus) 흉선 림프종 EL4세포주인 것이 바람직하다.상기 저선량률 저준위 방사선은 2.58mGy/시간의 선량률로 최종 누적선량이 61.92mGy가 되도록 조사하는 것, 5.8mGy/시간의 선량률로 최종 누적선량이 139.2mGy가 되도록 조사하는 것 및 23.22mGy/시간의 선량률로 최종누적 선량이 557.28mGy가 되도록 조사하는 것일 수 있다.
상기 세포고사 조절 유전자를 검출하는 단계는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction) 및 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 수행하는 것을 포함할 수 있다.
상기 세포고사 조절 유전자를 검출하는 단계에서 검출된 유전자는 Bik((Genebank accession No : NM_007546), Bmf(Genebank accession No : NM_138313), Ddit3(Genebank accession No : NM_007837), Nod1(Genebank accession No : NM_172729) 및 Tnfrsf19(Genebank accession No : NM_013869)인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 흉선 림프종 진단용 조성물은 흉선 림프종의 세포고사 조절 유전자 Bik((Genebank accession No : NM_007546), Bmf(Genebank accession No : NM_138313), Ddit3(Genebank accession No : NM_007837), Nod1(Genebank accession No : NM_172729) 및 Tnfrsf19(Genebank accession No : NM_013869)으로 이루어진 군에서 1이상 선택 된 세포고사 조절 유전자의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함한다.
또한, 본 발명의 흉선 림프종 진단용 진단키트는 상기 흉선 림프종 진단용 조성물을 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 방사선 조사 된 흉선 림프종 세포에서 발굴 된 세포고사 조절 유전자 검출함으로써, 방사선 조사에 따른 세포고사 조절 유전자의 기능을 밝히고 유전자 프로파일을 제공하는 효과가 있다.
또한, 방사선 조사 된 흉선 림프종 세포에서 발굴된 세포고사 조절유전자는 저준위 방사선 환경에서 생활하는 산업 및 의료종사자의 선량-반응 관련성을 평가할 수 있는 유전자 프로파일을 구성하는데 사용할 수 있다.
방사선 조사 된 흉선 림프종 세포에서 발굴 된 세포고사 조절 유전자는 흉선 림프종 환자의 암 진행 정도 및 치료 정도를 평가할 수 있는 지표로 이용 할 수 있다.
방사선 조사 된 흉선 림프종 세포에서 발굴 된 세포고사 조절 유전자 검출방법은 흉선 림프종 진단용 조성물 및 진단키트 제작에 이용 될 수 있다.
도 1은 선량률 및 누적선량에 따른 RNA 수준에서 세포고사 조절 유전자의 발현 변화를 도시한 것이다.
도 2는 선량률 및 누적선량에 따른 세포고사 조절 단백질의 발현 변화를 도시한 것이다.
도 3은 마우스 흉선 림프종 세포에서 저선량률 저준위 방서선 조사에 의한 분자적 변화와 그에 따른 암 억제 기전을 도시한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 흉선 림프종 세포에서 세포고사 조절 유전자를 검출하는 방법은 흉선 림프종 세포에 각각 저선량률 저준위 방사선, 고선량률 저준위 방사선 및 고준위 방사선을 조사하는 단계 및 상기 방사선이 조사 된 각각의 마우스 흉선 림프종 세포에서 유전자 발현에 변화가 있는 세포고사 조절 유전자를 검출하는 단계를 포함한다.
상기 흉선 림프종 세포는 마우스(Mus musculus) 흉선 림프종에서 유래한 것이 바람직하다.
마우스 흉선 림프종 세포인 EL4 세포주는 화학 발암제가 투여 된 순계생쥐인 C57BL/6계에 발생한 림프종에서 확립된 T세포계 세포주이다. 세포표면에 Thy-1, 2 및 H2b 등을 발현하며, 식물성 혈구응집소 (PHA)에 반응성이 있다. 인터루킨2(IL-2)를 생산하기 때문에 세포성 면역실험 등에 쓰인다.
상기 저선량률 저준위 방사선은 2.58mGy/시간의 선량률로 최종 누적선량이 61.92mGy가 되도록 조사하는 것, 5.8mGy/시간의 선량률로 최종 누적선량이 139.2mGy가 되도록 조사하는 것 또는 23.22mGy/시간의 선량률로 최종누적 선량이 557.28mGy가 되도록 조사하는 것이 바람직하다.
상기 세포고사 조절 유전자를 검출하는 단계는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 및 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 포함할 수 있다.
상기 세포고사 조절 유전자를 검출하는 단계에서 검출 된 유전자는 Bik((Genebank accession No : NM_007546), Bmf(Genebank accession No : NM_138313), Ddit3(Genebank accession No : NM_007837), Nod1(Genebank accession No : NM_172729) 및 Tnfrsf19(Genebank accession No : NM_013869)을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 형태에 따른 흉선 림프종 진단용 조성물은 흉선 림프종의 세포고사 조절 유전자 Bik((Genebank accession No : NM_007546), Bmf(Genebank accession No : NM_138313), Ddit3(Genebank accession No : NM_007837), Nod1(Genebank accession No : NM_172729) 및 Tnfrsf19(Genebank accession No : NM_013869)으로 이루어진 군에서 1이상 선택 된 세포고사 조절 유전자의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함한다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 마우스 흉선 림프종 세포의 배양 및 방사선 조사
마우스 흉선 림프종 세포(EL4)(TIB-39, ATCC)는 10% 우태아혈청 및 1%페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 사용하여, 37℃, 5%CO2조건의 세포 배양기에서 배양하였다. 배양한 세포를 105cells/ml의 농도로 조정하여 세포를 준비하였다.
저선량률 저준위 방사선 조사 세포군은 상기 준비 된 세포에 저선량률 저준위 방사선(2.58mGy/시간, 5.8mGy/시간, 23.22mGy/시간)을 24시간동안 조사하여 세포의 누적선량이 각각 61.92mGy, 139.2mGy 및 557.28mGy되도록 조사하였다.
저선량률 저준위 방사선 조사 세포군과 비교하기 위한 고선량률 저준위 방사선 조사 세포군은 상기 준비 된 세포에 고선량률 저준위 방사선(0.8Gy/분)을 최종 누적선량이 각각 61.92mGy, 139.2mGy 및 557.28mGy이 되도록 조사하였다.
또한, 고선량률 고준위 방사선 조사 세포군은 고선량률 고준위 방사선(0.8Gy/분)을 최종 누적선량이 2Gy가 되도록 조사하였다.
실시예 2. 방사선 조사 된 마우스 흉선 림프종 세포의 세포고사 조절 유전자의 스크리닝 및 RNA 수준에서의 발현 측정
2-1 방사선 조사 된 마우스 흉선 림프종 세포의 세포고사 조절 유전자의 스크리닝
방사선 조사에 따른 세포고사 조절 유전자를 스크리닝하기 위하여 마이크로어레이(micro array)를 수행하였다.
상기 실시예 1의 저선량률 저준위 방사선 조사 세포군의 전체RNA를 추출하여, Cyanine3 표지한다. 전체 DNA의 유전자가 모두 배열되어 있는 마이크로어레이 칩과 Cyanine3 표지 된 전체RNA를 반응시킨다. 상기 반응에 따른 신호를 분석하여 각 RNA의 발현 정도를 확인하였다.
또한, 고선량률 저준위 방사선 조사 세포군 및 고선량률 고준위 방사선 조사 세포군도 상기와 같은 방법으로 마이크로어레이를 수행하였다.
상기 마이크로 어레이 수행 결과에 따르면, 비조사 세포군과 비교하여, 저선량률 저준위 방사선 조사 세포군에서 발현이 2배이상 증가한 유전자를 선별하였다. 상기 선별 된 유전자는 Adm, Btg2, Il12a, Mapt, Mnda, Bmf, Nod1, Bik, Ddit3, Prkcz 및 Tnfrsf19이다.
2-2 방사선 조사 된 마우스 흉선 림프종 세포의 세포고사 조절 유전자의 RNA 수준에서의 발현 측정
상기 마이크로어레이를 수행으로 선별 된 11개의 유전자의 RNA수준에서 발현을 확인하기 위하여, 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하였다.
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit(Applied Biosystems, USA)를 사용하여, 세포고사 조절 유전자의 RNA를 역전사(Reverse Transcription)하였다. 표 1에 기재 된 프라이머를 이용하여, 역전사 된 RNA의 PCR을 수행하였다. PCR 수행 결과는 항존 유전자인 GAPDH를 이용하여 표준화 하였다.
또한, 고선량률 저준위 방사선 조사 세포군 및 고선량률 고준위 방사선 조사 세포군도 같은 방법으로 세포고사 조절 유전자의 발현량을 측정하였다.
세포고사 조절 유전자의 발현 측정을 위한 중합효소 연쇄반응에 사용한 프라이머 염기서열
유전자 유전자 번호 정방향 (5‘→3’) 역방향 (5‘→3’)
Adm NM_009627 TCGCTGATGAGACGACAGTT GTTGTGTTCTGCTCGTCCAG
Bik NM_007546 ATGGCCAGAGACGTCATCAA CCTTCATGCTGGGAGTCTCA
Bmf NM_138313 CTCTCTGCTGACCTGTTTGC AATGGGTGAGAGGGAAGAGC
Btg2 NM_007570 ATGAGCCACGGGAAGAGAAC GCCCTACTGAAAACCTTGAGTC
Ddit3 NM_007837 TCGCTCTCCAGATTCCAGTC GCTCTTCCTCCTCTTCCTCC
Il12a NM_001159424 TGATGATGACCCTGTGCCTT TTGATGGCCTGGAACTCTGT
Mapt NM_001285455 TAGCAACGTCCAGTCCAAGT TCCTGGCTTGTGATGGATGT
Mnda NM_001033450 GACAACCAAGAGCAATACACCA ATCAGTTTGCCCAATCCAGAAT
Nod1 NM_172729 GAAGGCACCCCATTGGGTT AATCTCTGCATCTTCGGCTGA
Prkcz NM_008860 GCGTGGATGCCATGACAAC AATGATGAGCACTTCGTCCCT
Tnfrsf19 NM_013869 GCATGCTGTCAGTATCACCG CAGCACAAGGACGGAATCAG
방사선 조사에 따른 세포고사 조절 유전자의 RNA수준에서 발현 측정 결과는 도 1에 도시하였다.
저선량 저준위 방사선 조사 시, 상기 실시예2-1에서 선별 된 세포고사 조절 유전자 중 RNA 수준에서 비조사 세포군보다 발현이 증가 된 유전자를 검출하였다. 상기 검출 된 유전자는 Adm, Btg2, Il12a, Mnda, Bmf, Nod1, Bik, Ddit3 및 Tnfrsf19이다.
고선량률 저준위 방사선 조사 세포군 및 고선량률 고준위 방사선 조사 세포군에 있어서, 세포고사 조절 유전자는 RNA 수준에서의 발현이 감소하는 경향을 보였다.
실시예 3. 방사선 조사 된 마우스 흉선 림프종 세포의 세포고사 조절 단백질 발현 측정
상기 실시예 2-2에서 검출 된 세포고사 조절 유전자의 단백질 발현을 측정하기 위하여, 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 수행하였다.
세포용해 완충제는 150mM NaCl, 1% Triton X0199, 0.1% SDS, 0.5% sodiumdeoxycholate, 50mM Tris(pH 7.4) 및 1mM EDTA를 혼합하여 제조하였다. 또한, 제조 된 세포용해 완충제에 프로테아제 억제제(Thermo Scientific, USA)를 용액 전체의 1% 농도가 되도록 혼합하였다.
실시예 1의 저선량률 저준위 방사선 조사 세포군과 상기 세포용해 완충제를 혼합하여 세포를 용해시켜 단백질 샘플을 제조하였다. 상기 단백질 샘플을 이용하여 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 수행하여 단백질 발현량을 측정하였다. 상기 웨스턴 블로팅 수행 시, Ddit3, Tnfrsf19를 검출하기 위한 항체(1:200, Abcam, Cambridge, MA) 및 Nod1, Bmf, 및 Bik를 검출하기 위한 항체(1:200, Origene)를 사용하였다.
또한, 실시예1의 고선량률 저준위 방사선 조사 세포군 및 고선량률 고준위 방사선 조사 세포군도 같은 방법으로 세포고사 조절 단백질의 발현량을 측정하였다.
방사선 조사에 따른 세포고사 조절 단백질의 발현량 측정 결과는 도 2에 도시하였다. 저선량률 저준위 방사선 조사 세포군에서, 세포고사 조절 단백질인 Bmf, Nod1, Bik, Ddit3 및 Tnfrsf19는 비조사군과 비교하여 단백질 발현이 증가하였다.
상기의 결과로부터, 마우스 흉선 림프종 세포에 저선량률 저준위 방사선 조사 시 RNA 및 단백질 수준에서 발현이 증가하는 세포고사 조절 유전자를 검출하였다. 상기 검출 된 유전자는 Bmf, Nod1, Bik, Ddit3 및 Tnfrsf19이다. 상기 검출 된 세포고사 조절 유전자들은 마우스 흉선 림프종 세포에 저선량률 저준위 방사선 조사 시, RNA 및 단백질 수준에서 발현이 증가하여 세포고사를 촉진시킴으로써, 흉선 림프종이 억제된다는 것을 알 수 있다(도 3).
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
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Claims (7)

  1. 마우스 흉선 림프종세포에 저선량률 저준위 방사선을 조사하는 단계 및
    상기 방사선이 조사 된 각각의 마우스 흉선 림프종 세포에서 유전자 발현에 변화가 있는 세포고사 조절 유전자를 검출하는 단계
    를 포함하되,
    상기 저선량률 저준위 방사선 조사는 2.58mGy/시간의 선량률로 최종 누적선량이 61.92mGy가 되도록 조사하는 것, 5.8mGy/시간의 선량률로 최종 누적선량이 139.2mGy가 되도록 조사하는 것 또는 23.22mGy/시간의 선량률로 최종누적 선량이 557.28mGy가 되도록 조사하는 것을 특징으로 하고,
    상기 세포고사 조절 유전자는 Bik((Genebank accession No : NM_007546), Bmf(Genebank accession No : NM_138313), Ddit3(Genebank accession No : NM_007837), Nod1(Genebank accession No : NM_172729) 및 Tnfrsf19(Genebank accession No : NM_013869)인 것을 특징으로 하는
    마우스 흉선 림프종 세포에서 세포고사 조절 유전자를 검출하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 흉선 림프종 세포는 마우스(Mus musculus) 흉선 림프종 EL4 세포주인 것을 특징으로 하는 흉선 림프종 세포에서 세포고사 조절 유전자를 검출하는 방법.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포고사 조절 유전자를 검출하는 단계는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 및 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 수행하는 것을 특징으로 하는 흉선 림프종 세포에서 세포고사 조절 유전자를 검출하는 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
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