KR101320741B1 - 전리방사선 조사된 마우스에서 암 발병 조절 디엔에이 회복 유전자를 검출하는 방법 - Google Patents
전리방사선 조사된 마우스에서 암 발병 조절 디엔에이 회복 유전자를 검출하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 전리방사선 조사된 마우스에서 암 발병 조절 디엔에이 회복 유전자를 검출하는 방법에 관한 것으로, a) 흉선 세포에 발암 유전자가 삽입된 AKR/J 마우스를 다수 준비하는 단계와, b) 상기 AKR/J 마우스를 세 개의 그룹으로 분할하고, 제1그룹의 AKR/J 마우스에 고선량률 전리 방사선을 조사 후 사육하고, 제2그룹의 AKR/J 마우스에 저선량률 전리 방사선을 조사한 후 사육하고, 나머지 제3그룹의 AKR/J 마우스는 일반 환경에서 사육하는 단계와, c) 상기 b) 단계를 수행하면서 제1그룹 또는 제2그룹의 AKR/J 마우스 중 죽은 마우스의 흉선을 채취하여 방사선 조사 전 장기의 중량에 비해 두 배 증가한 것을 암이 발생된 것으로 진단하는 단계와, d) 상기 제3그룹의 AKR/J 마우스가 최초 죽는 시점에서 제1그룹, 제2그룹 및 제3그룹의 모든 AKR/J 마우스를 희생시켜 흉선을 추출하는 단계와, e) 상기 d) 단계에서 추출된 흉선 중 방사선을 조사하지 않은 동일 연령의 AKR 마우스의 장기와 비교하여 상기 제1그룹 및 제2그룹의 AKR/J 마우스에서 추출한 흉선 중 중량 변화가 없는 흉선만을 선별하여 유전자 분석을 수행하여 증감한 유전자를 검출하여, 각 유전자가 디엔에이의 복구, 철분의 수송, 리보뉴클레오타이드 (ribonucleotide) 환원효소군의 기능을 수행하는지 확인하는 단계를 포함한다.
Description
본 발명은 전리방사선 조사된 마우스에서 암 발병 조절 디엔에이 회복 유전자를 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 교란변수의 개입을 차단하여 디엔에이의 회복 유전자를 정확하게 검출하고, 그 유전자의 반응을 정확하게 해석할 수 있는 전리방사선 조사된 마우스에서 암 발병 조절 디엔에이 회복 유전자를 검출하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 산업 및 의료적 방사선의 활용증가와 더불어 방사선의 인체영향에 대한 연구가 다양하게 이루어지고 있으며, 주로 방사선 조사를 이용한 암 치료과정의 기전을 명확하게 정의하고자 하는 연구가 진행 중이다.
알려진 바와 같이 고선량 전리방사선은 디엔에이 손상, 유전적 변형, 암을 포함한 질병을 일으키지만, 200 mGy이하 선량과 6 mGy/시간 이하의 선량률 방사선은 손상된 유전자를 회복할 뿐만 아니라 암 발생을 억제한다.
그러나 지금까지의 연구는 유전자 일부를 변경하였거나, 암 세포주를 이용하여서 신체를 구성하는 세포, 조직, 장기 그리고 신체단계에서 관찰되는 다양한 반응을 설명할 수 없었다.
이런 단점을 보완하기 위하여, 인간과 유전자가 95% 이상 유사한 마우스를 이용하여 방사선에 대한 암 발생연구가 수행되고 있으나, 일반 마우스는 자연 암 발생률이 매우 낮아 다양한 암 연구용 모델마우스가 이용되고 있다.
종래의 연구들은 암 발병에 관련 일부 유전자들의 기능 연구가 수행되었지만, 고선량률과 저선량률 방사선에 의하여 개체차원에서 흉선암 발병을 조절하는데 기여하는 디엔에이 회복 관련 유전자 프로파일을 발굴하고 기능을 설명한 적은 없었다.
대표적인 예로서 저선량 방사선 (0.35 또는 1.2 mGy/h) 조사한 MRL-lpr/lpr 형질전환 마우스는 면역체계에 영향을 받고 생존율이 증가했음이 보고된 바 있으며 (Ina Y, Sakai K. Prolongation of life span associated with immunological modification by chronic low-dose-rate irradiation in MRL-lpr/lpr mice. Radiat Res. 2004;161(2):168-73), 비상동 말단 복구에 관련된 lig4가 돌연변이 된 마우스에 방사선 조사할 경우 (137Cs, 조사선량 = 1, 2, 4, 8 Gy) 성장둔화와 생존율 감소되고 T 와 B 세포 생성을 억제되었음을 보고하였으며, 디엔에이 복구 기능의 중요성을 강조한 연구 (Rucci F, Notarangelo LD, Fazeli A, Patrizi L, Hickernell T, Paganini T, et al. Homozygous DNA ligase IV R278H mutation in mice leads to leaky SCID and represents a model for human LIG4 syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(7):3024-9)가 있었다.
또한 방사선 조사할 경우 PML IV이 WRN과 상호작용하고 손상된 디엔에이를 복구하였으며 특정 단백질이 디엔에이 복구에 참여하는 것으로 알려져 있다 (Liu J, Song Y, Qian J, Liu B, Dong Y, Tian B, et al. Promyelocytic Leukemia Protein Interacts with Werner Syndrome Helicase and Regulates Double-Strand Break Repair in γ-Irradiation-Induced DNA Damage Responses. Biochemistry (Mosc). 2011;76(5):550-4).
이들 연구보다 앞서 방사선 조사할 경우 갑상선 호르몬 수용체 알파1은 디엔에이 손상에 의한 세포 항상성을 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌으며 (Kress E, Rezza A, Nadjar J, Samarut J, Plateroti M. The thyroid hormone receptor-alpha (TRalpha) gene encoding TRalpha1 controls deoxyribonucleic acid damage-induced tissue repair. Mol Endocrinol. 2008;22(1):47-55), 저선량 방사선 조사는 MRN (Mre11, Rad50, Nbs1) 발현을 조절하여 디엔에이 복구 과정을 증진시키는 것이 보고되었다 (Singh S, Bala M, Kumar R, Kumar A, Dhiman SC. Modification in the expression of Mre11/Rad50/Nbs1 complex in low dose irradiated human lymphocytes. Dose Response. 2009;7(3):193-207).
그러나 이와 같은 연구들은 디엔에이 회복에 대한 중요성 등을 설명하고는 있으나, 구체적인 디엔에이 회복에 대한 기작을 설명하지 못했으며, 방사선 조사가 디엔에이 이중가닥 절단을 일으키고 MRE11-ATM-RNF168 신호전달 과정을 활성화시키며 PI3K 비의존 AKT 인산화를 촉진시켰다는 보고가 있었으며, 방사선 조사에 의한 디엔에이 회복에 대한 구체적 기작이 대두 되었다 (Fraser M, Harding SM, Zhao H, Coackley C, Durocher D, Bristow RG. MRE11 promotes AKT phosphorylation in direct response to DNA double-strand breaks. Cell Cycle. 2011;10(13)).
또한 손상된 디엔에이 회복 관련 유전자를 명확하게 밝혀낸 연구들이 있었다. 대표적으로 Msh2/Msh3 유전자가 이형복합체를 구성하고 불일치 염기 쌍을 인식하고 (Dowen JM, Putnam CD, Kolodner RD. Functional studies and homology modeling of Msh2-Msh3 predict that mispair recognition involves DNA bending and strand separation. Mol Cell Biol. 2010;30(13):3321-8), Wrn 유전자가 불일치 복구 개시인자로 작용하고 (Saydam N, Kanagaraj R, Dietschy T, Garcia PL, PeJ, Shevelev I, et al. Physical and functional interactions between Werner syndrome helicase and mismatch-repair initiation factors. Nucleic Acids Res. 2007;35(17):5706-16), 염색체 불안정성과 깊은 연관성이 있다는 것이 보고되었다 (Ariyoshi K, Suzuki K, Goto M, Watanabe M, Kodama S. Increased chromosome instability and accumulation of DNA double-strand breaks in Werner syndrome cells. J Radiat Res (Tokyo). 2007;48(3):219-31).
또한 방사선 조사하였을 경우 디엔에이 Ligase IV 유전자가 손상된 디엔에이 회복에 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있으며 (Gorski MM, Eeken JC, de Jong AW, Klink I, Loos M, Romeijn RJ, et al. The Drosophila melanogaster DNA Ligase IV gene plays a crucial role in the repair of radiation-induced DNA double-strand breaks and acts synergistically with Rad54. Genetics. 2003;165(4):1929-41), AP 연결 활성을 가지고 있는 NEIL3 유전자가 단일 가닥 디엔에이를 회복시킴이 보고되었다 (Takao M, Oohata Y, Kitadokoro K, Kobayashi K, Iwai S, Yasui A, et al. Human Nei-like protein NEIL3 has AP lyase activity specific for single-stranded DNA and confers oxidative stress resistance in Escherichia coli mutant. Genes Cells. 2009;14(2):261-70).
또한 G1 지연 특성을 가진 Rad51L1 및 불일치복구 관련된 Mbd4 유전자의 발현감소는 세포사멸을 감소시켰으며 (Bentley DJ, Harrison C, Ketchen AM, Redhead NJ, Samuel K, Waterfall M, et al. DNA ligase I null mouse cells show normal DNA repair activity but altered DNA replication and reduced genome stability. J Cell Sci. 2002;115(Pt 7):1551-61), CSA, Gtf2h2, Ogg1 유전자의 발현증가는 디엔에이 회복 과정을 활성화시켰으며 (Sansom OJ, Zabkiewicz J, Bishop SM, Guy J, Bird A, Clarke AR. MBD4 deficiency reduces the apoptotic response to DNA-damaging agents in the murine small intestine. Oncogene. 2003;22(46):7130-6), 종말체 (Telomere) 방어 활성을 지닌 Terf2 유전자의 발현 감소는 세포사멸을 증가시키는 것으로 보고되었다 (Karlseder J, Broccoli D, Dai Y, Hardy S, de Lange T. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. Science. 1999;283(5406):1321-5).
위의 연구들은 세포를 이용하였거나, 일반 마우스를 이용하였기 때문에 발현된 유전자가 매우 단편적이었을 뿐만 아니라 개체에 적용하기가 어려운 문제점이 있었다. 그 이유로는 암 연구를 위하여 세포를 이용하면서 세포의 유전자를 변경하거나 암 발생에서 중요한 p53 유전자가 결여된 암세포에 방사선을 조사하였기 때문에 정상세포의 반응과는 근본적인 차이가 있었다.
또한 일반 마우스를 이용하여 유전자 반응을 평가하였기 때문에 발현 유전자가 다양하고, 암 발생이 특정 장기에 한정되지 않았기 때문에 유전자 반응 해석하는 것이 매우 어려운 문제점이 있었다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 과제는, 개체적인 차원에서 방사선 조사에 의해 특이적으로 발현되는 유전자 프로파일을 확인할 수 있는 전리방사선 조사된 마우스에서 암 발병 조절 디엔에이 회복 유전자를 검출하는 방법을 제공함에 있다.
또한 본 발명의 다른 과제는, 암 발생을 특정 장기에 국한시켜 특이적으로 발현되는 유전자의 반응을 용이하게 해석할 수 있도록 하는 전리방사선 조사된 마우스에서 암 발병 조절 디엔에이 회복 유전자를 검출하는 방법을 제공함에 있다.
상기와 같은 과제를 달성하기 위한 본 발명 전리방사선 조사된 마우스에서 암 발병 조절 디엔에이 회복 유전자를 검출하는 방법은, a) 흉선 세포에 발암 유전자가 삽입된 AKR/J 마우스를 다수 준비하는 단계와, b) 상기 AKR/J 마우스를 세 개의 그룹으로 분할하고, 제1그룹의 AKR/J 마우스에 고선량률 전리 방사선을 조사 후 사육하고, 제2그룹의 AKR/J 마우스에 저선량률 전리 방사선을 조사한 후 사육하고, 나머지 제3그룹의 AKR/J 마우스는 일반 환경에서 사육하는 단계와, c) 상기 b) 단계를 수행하면서 제1그룹 또는 제2그룹의 AKR/J 마우스 중 죽은 마우스의 흉선을 채취하여 방사선 조사 전 장기의 중량에 비해 두 배 증가한 것을 암이 발생된 것으로 진단하는 단계와, d) 상기 제3그룹의 AKR/J 마우스가 최초 죽는 시점에서 제1그룹, 제2그룹 및 제3그룹의 모든 AKR/J 마우스를 희생시켜 흉선을 추출하는 단계와, e) 상기 d) 단계에서 추출된 흉선 중 방사선을 조사하지 않은 동일 연령의 AKR 마우스의 장기와 비교하여 상기 제1그룹 및 제2그룹의 AKR/J 마우스에서 추출한 흉선 중 중량 변화가 없는 흉선만을 선별하여 유전자 분석을 수행하여 증감한 유전자를 검출하여, 각 유전자가 디엔에이의 복구, 철분의 수송, 리보뉴클레오타이드 (ribonucleotide) 환원효소군의 기능을 수행하는지 확인하는 단계를 포함한다.
삭제
본 발명은 방사선 조사에 따라 특이적으로 발현되는 암 발병 조절 디엔에이 회복 유전자를 검출하고, 그 유전자군의 반응을 명확하게 함으로써, 그 유전자 프로파일을 의료와 산업 분야에서 다양하게 활용할 수 있도록 하는 효과가 있다.
예를 들어 본 발명에 의해 작용 기전이 명확하게 밝혀진 유전자 프로파일은, 흉선암 진단용 키트의 제작에 활용될 수 있으며, 암환자의 암 진행 및 치료 정도를 확인하는 용도로 활용이 가능하며, 산업 및 의료 종사자의 방사선 피폭과 발암과의 상관성을 평가할 수 있으며, 고선량 방사선의 피폭에 따른 암 발생 및 진행을 평가할 수 있으며, 반대로 저선량 방사선에 의한 암 억제효과를 평가하는 디엔에이 회복 유전자의 지표로 활용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 전리방사선 조사된 마우스에서 암발병 조절 디엔에이 회복 유전자를 검출하는 방법의 순서도이다.
도 2는 제3그룹의 AKR/J 마우스와 제2그룹의 AKR/J 마우스에서 채취한 흉선의 평균 무게를 비교한 그래프이다.
도 3은 저선량률의 방사선이 조사된 제2그룹의 AKR/J 마우스의 흉선 세포에서 일어나는 DNA 회복 유전자의 암 억제 관련 기작을 해석한 설명도이다.
도 4는 고선량률의 방사선이 조사된 제1그룹의 AKR/J 마우스의 흉선 세포에서 일어나는 DNA 회복 유전자의 발현 감소에 따른 암 발생 관련 기작을 해석한 설명도이다.
도 5는 위의 저선량률 및 고선량률의 방사선 조사에 따라 특이하게 발현되는 유전자들의 목록과, 그 유전자들을 기능적으로 분류한 표이다.
도 2는 제3그룹의 AKR/J 마우스와 제2그룹의 AKR/J 마우스에서 채취한 흉선의 평균 무게를 비교한 그래프이다.
도 3은 저선량률의 방사선이 조사된 제2그룹의 AKR/J 마우스의 흉선 세포에서 일어나는 DNA 회복 유전자의 암 억제 관련 기작을 해석한 설명도이다.
도 4는 고선량률의 방사선이 조사된 제1그룹의 AKR/J 마우스의 흉선 세포에서 일어나는 DNA 회복 유전자의 발현 감소에 따른 암 발생 관련 기작을 해석한 설명도이다.
도 5는 위의 저선량률 및 고선량률의 방사선 조사에 따라 특이하게 발현되는 유전자들의 목록과, 그 유전자들을 기능적으로 분류한 표이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 전리방사선 조사된 마우스에서 암 발병 조절 디엔에이 회복 유전자를 검출하는 방법에 관하여 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 전리방사선 조사된 마우스에서 암 발병 조절 디엔에이 회복 유전자를 검출하는 방법의 순서도이다.
도 1을 참조하면 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 전리방사선 조사된 마우스에서 암 발병 조절 디엔에이 회복 유전자를 검출하는 방법은, 흉선 세포에 발암 유전자가 삽입된 AKR/J 마우스를 다수 준비하는 단계 (S11)와, 상기 AKR/J 마우스를 각각 고선량률 전리 방사선을 조사하는 제1그룹, 저선량률 전리 방사선을 조사하는 제2그룹, 전리 방사선을 조사하지 않는 제3그룹으로 분할하는 단계 (S12)와, 상기 제1그룹의 AKR/J 마우스에 고선량률 전리 방사선을 조사하고, 상기 제2그룹의 AKR/J 마우스에 저선량률 전리 방사선을 조사하는 단계 (S13)와, 상기 제1그룹 또는 제2그룹의 AKR/J 마우스 중 죽은 마우스의 흉선을 채취하여 방사선 조사 전 장기의 중량에 비해 2배 이상 증가한 것을 암 발생된 것으로 진단하는 단계(S14)와, 제3그룹의 AKR/J 마우스가 최초 죽는 시점에서 제1그룹, 제2그룹 및 제3그룹의 모든 AKR/J 마우스를 희생시켜 흉선을 추출하는 단계 (S15)와, 상기 추출된 흉선 중 방사선을 조사하지 않은 AKR/J 마우스에서 중량 변화가 없는 흉선을 선별하여 유전자 분석을 수행하는 단계 (S16)를 포함한다.
이하, 상기와 같이 이루어지는 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 전리방사선 조사된 마우스에서 암 발병 조절 디엔에이 회복 유전자를 검출하는 방법을 보다 상세히 설명한다.
먼저, S11 단계에서는 특정 장기의 세포에 발암 유전자가 삽입된 AKR/J 마우스를 다수 준비한다. 특히 실험을 위하여 일본 SLC사에서 구입한 6 주령의 암컷 AKR/J 마우스를 이용하였으며, 이 AKR/J 마우스는 흉선세포에 발암 유전자가 삽입되어 흉선암 시작인자로 작용하는 특성이 있다.
이러한 흉선암 시작인자인 AKR/J 마우스를 S12 단계와 같이 세 그룹으로 나누고, S13 단계에서는 상기 제1그룹은 고선량률 전리 방사선을 조사하고, 제2그룹은 저선량률의 전리 방사선을 조사하였으며, 나머지 제3그룹은 방사선을 조사하지 않은 상태로 사육한다.
상기 제1그룹에 고선량률 전리 방사선을 조사하는 장치로는 감마선 발생장치 (IBL 147C, CIS bio-international, France)를 사용하여 최종선량이 4.5 Gy에 도달하도록 0.8 Gy/분의 선량으로 감마선 (Cs-137)을 조사한다.
이처럼 고선량률 전리 방사선을 조사한 제1그룹이 AKR/J 마우스들은 방사선이 차단된 저선량 조사시설로 옮겨 사육한다.
또한 상기 제2그룹은 0.7 mGy/시간의 저선량률 감마선 (Cs-137)이 조사되는 환경에서 누적 선량이 4.5 Gy에 이르도록 조사하며, 제3그룹의 AKR/J 마우스는 방사선이 조사되지 않는 일반 환경에서 사육한다.
그 다음, S14 단계에서는 상기 S13 단계의 수행과정에서 제1 내지 제3그룹에 속한 AKR/J 마우스가 죽은 경우 그 죽은 마우스를 부검하여 흉선을 채취한다.
이때, 채취한 흉선의 무게가 방사선을 조사하지 않은 동일 월령의 다른 AKR/J 마우스의 평균 흉선 무게의 2배가 넘는 경우 흉선암이 발병한 것으로 판단한다.
그 다음, S15 단계에서는 상기 제3그룹의 AKR/J 마우스가 최초 폐사하였을 때를 기준으로 모든 AKR/J 마우스를 희생시켜 각 AKR/J 마우스로부터 흉선을 채취한다.
일반 환경에서 사육되는 제3그룹의 AKR/J 마우스도 흉선세포에 발암 유전자가 삽입된 것으로 흉선암이 발생하게 되어 소정의 시간이 경과하면 폐사하게 된다. 실험적으로 130일 만에 최초 폐사가 발견되었다.
이처럼 흉선암이 발생되는 단계를 고정하여 교란 변수의 개입을 방지하였다.
도 2는 제3그룹의 AKR/J 마우스와 제2그룹의 AKR/J 마우스에서 채취한 흉선의 평균 무게를 비교한 그래프이다.
도 2를 참조하면 방사선 비조사된 AKR/J 마우스인 제3그룹에서 채취한 흉선의 평균 무게는 0.008g이었으나, 저선량률로 방사선이 조사된 제2그룹의 AKR/J 마우스에서 채취한 흉선의 평균 무게는 0.004g임을 알 수 있다.
즉, 저선량률로 방사선 조사된 제2그룹의 AKR/J 마우스의 흉선 무게는 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이는 저선량률 방사선 조사된 AKR/J 마우스가 흉선암의 발병이 억제되고 있는 것을 뜻한다.
그 다음, S16 단계에서는 상기 채취한 흉선 중 무게의 변화가 없는 흉선들만 액체 질소에 담근 후, 유전자 분석을 수행한다.
이때 유전자 분석을 위하여 흉선세포 염색체 디엔에이에 마우스 백혈병 바이러스 유전자 단편이 삽입되어 있으면서 시간이 경과하면서 자연적으로 암이 발생하는 AKR/J 마우스의 특성을 고려하여 디엔에이 회복, 디엔에이 손상 신호, 세포주기, 암 진행도 관찰지표, p53 신호계, 세포고사, T-와 B- 세포활성 유전자 프로파일을 확인하였다.
즉, 고선량률과 저선량률 방사선이 조사된 AKR/J 마우스의 흉선에서 특이하게 증가되거나 감소한 디엔에이 회복 관련 유전자를 발굴하고, 그 기능을 해석하였다.
이때의 유전자 분석의 방법으로는 채취된 AKR/J 마우스의 흉선세포를 분쇄하여 Agilent 사의 유전자 진단용 유리표면에 미리 부착된 유전자들과 반응시켜 상대적인 차이를 지표로 새로운 유전자를 찾아내는 분자생물학적 방법인 마이크로어레이 분석법을 사용하였으며, AKR/J 마우스의 시간경과에 따른 흉선암 발생은 통계프로그램 SAS (ANOVA, t-test)를 이용하여 분석한다.
도 3은 저선량률의 방사선이 조사된 제2그룹의 AKR/J 마우스의 흉선 세포에서 일어나는 디엔에이 회복 유전자의 암 억제 관련 기작을 해석한 설명도이다.
도 3을 참조하면 저선량의 방사선을 조사한 경우 철분결합 혈장 단백질인 트랜스페린 (Trf)의 발현이 증가하게 되며, 혈류 내의 2개의 철분3가 이온이 증가된 트랜스페린 각각에 결합되며, 그 트랜스페린이 트랜스페린 수용체 (Tfre)에 결합되어 복합체를 이룬다.
이 복합체는 함몰막을 형성하면서 세포의 내부로 들어오며, 상기 철분3가 이온은 철분2가 이온으로 환원되고 세포질로 방출된다.
세포질로 방출된 철분2가 이온은 철분산화능을 가지고 있는 FTH1 단백질에 결합된 후 철분3가 이온으로 산화된다. 상기 철분3가 이온은 리보뉴클레오타이드 (ribonucleotide) 환원효소 이형복합체의 RRM2 단백질로 전달되고, 그 이형복합체에서 RRM2B 단백질이 분리된 후 RRM1 단백질과 RRM2 단백질의 이형 복합체는 핵의 내부로 들어오게 된다.
이때 핵 내의 PARP1은 핵의 내부로 유입된 RRM2 단백질의 철분 공급에 의해 활성화되어 염기절단복구를 통해 디엔에이 복구를 활성화시키며, 결국 손상된 디엔에이를 회복하게 된다.
즉, 저선량률 방사선의 조사에 의해 철분의 수송량을 증가시키고, 뉴클레오타이드 환원효소를 증가시키며, 핵 내의 PARP1 유전자의 작용을 활성화시켜 상기 AKR/J 마우스의 손상된 흉선 세포의 디엔에이를 회복시키는 작용을 하게 된다.
도 4는 고선량률의 방사선이 조사된 제1그룹의 AKR/J 마우스의 흉선 세포에서 일어나는 디엔에이 회복 유전자의 발현 감소에 따른 암 발생 관련 기작을 해석한 설명도이다.
도 4를 참조하면 고선량률의 방사선이 조사된 제1그룹의 AKR/J 마우스의 흉선 세포에서는 고선량률의 방사선을 조사한 결과, 암 발생과 관련된 주요한 기작과 암의 억제에 관련된 부수적인 기작이 동시에 일어나게 된다.
그 주요한 기작으로는 고선량률 방사선 조사가 이루어지면 디엔에이 불일치염기복구와 관련된 Msh3 유전자를 활성화시키지만, Msh2 유전자의 발현에는 영향을 주지 못하고 불완전한 MutSBeta (Msh2/Msh3) 이형 복합체를 형성하게 된다. 이러한 불완전한 MutSBeta 이형 복합체는 WRN을 감소시켜 게놈 불안정성이 증가하게 된다.
이와 같은 게놈 불안정성의 증가에 의해 이중가닥 절단 복구에 관여하는 유전자인 Lig4, Neil3, Ube2b의 발현을 감소시키며, 따라서 디엔에이의 복구를 시작할 수 없게 된다.
또한 Ung와 Lig1의 발현 감소는 다시 게놈 불안정성을 증가시키며, G1 지연특성을 가지는 Rad51L1과 불일치염기복구에 관여하는 Mbd 유전자의 발현감소는 세포사멸을 감소시켜 결국 암 세포의 사멸을 감소시켜 암을 발생시키게 된다.
이와는 다르게 부수적인 기작에서는 고선량률의 방사선 조사에 의하여 CSA Gtf2h2, Ogg1 유전자의 발현을 증가시킨다. 이 유전자들은 디엔에이의 복구를 활성화시키는 유전자로 알려져 있으며, 따라서 손상된 디엔에이 복구가 촉진된다.
또한 종말체 (Telomere) 방어 활성을 지닌 Terf2 유전자가 감소되며, 따라서 고선량률 방사선을 조사한 경우, 암을 발생시키는 기작과 암을 억제하는 기작이 동시에 일어나게 되나, 암 발생 기작이 우세하게 작용하여 암을 발생시키게 된다.
도 5는 위의 저선량률 및 고선량률의 방사선 조사에 따라 특이하게 발현되는 유전자들의 목록과, 그 유전자들을 기능적으로 분류한 표이다.
도 5에서 고선량률 조사군과 저선량률 조사군은 각각 비조사군인 제3그룹의 마우스의 흉선에서 확인된 유전자들의 발현 값에 대한 상대적인 발현 값이다.
디엔에이의 복구는 염기절단복구, 세포주기조절, 이중가닥 절단 복구와 상동성 재조합, 불일치염기 복구, 뉴클레오타이드 절단 복구에 의해 이루어지며, 저선량 방사선을 조사한 경우 염기절단복구에 관여하는 Ung, Neil3, PARP1, CSB 유전자의 발현 값이 높게 나타나며, 그 유전자의 발현에 의해 염기절단복구가 이루어진다.
또한 세포주기를 조절하는 유전자인 Terf2 유전자 역시 저선량률 방사선이 조사된 경우 고선량률 방사선 조사의 경우에 비해 높게 나타나며, 이는 이중가닥 절단 복구와 상동성 재조합에 관련되는 모든 유전자들인 Mbd4, Lig4, Wrn, Rad51l1, Ube2b가 고선량률 방사선을 조사한 경우에 비하여 상대적으로 높은 발현 값을 나타내는 것으로 확인되었다.
또한 불일치염기 복구에 관여하는 Msh2 유전자의 발현이 높게 나타났으며, 뉴클레오타이드 절단 복구에 관여하는 Lig1 유전자 역시 높은 발현 값을 가지는 것을 알 수 있다.
이처럼 디엔에이를 직접 복구하는 유전자와는 다르게 세포의 핵에 철분을 수송하는 유전자인 Trf의 발현량이 매우 높게 나타났으며, 트랜스페린 수용체 유전자 TfR1과 철분의 산화에 관여하는 FTH1의 발현량도 증가하는 것으로 확인되었다.
아울러 리보뉴클레오타이드 (ribonucleotide) 환원효소군으로서 철분전자결합에 관여하는 RRM2가 상대적으로 발현 값이 높게 나타났으며, 리보뉴클레오타이드 (ribonucleotide) 환원효소인 RRM1 유전자가 상대적으로 발현 값이 높게 나타나 철분의 공급을 활성화하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
이와 같이 본 발명은 저선량 방사선의 조사로 특이하게 발현되는 유전자군과 그 기능을 명확하게 밝혀냄으로써, 이러한 유전자군을 통해 다양한 응용분야에의 적용이 가능하다.
본 발명은 상기 실시 예에 한정되지 않고 본 발명의 기술적 요지를 벗어나지 아니하는 범위 내에서 다양하게 수정, 변형되어 실시될 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.
Claims (9)
- a) 흉선 세포에 발암 유전자가 삽입된 AKR/J 마우스를 다수 준비하는 단계;
b) 상기 AKR/J 마우스를 세 개의 그룹으로 분할하고, 제1그룹의 AKR/J 마우스에 4.5 Gy에 도달하도록 0.8 Gy/분의 고선량률 전리 방사선을 조사 후 사육하고, 제2그룹의 AKR/J 마우스에 4.5Gy에 도달하도록 0.7 mGy/시간의 저선량률 전리 방사선을 조사한 후 사육하고, 나머지 제3그룹의 AKR/J 마우스는 일반 환경에서 사육하는 단계;
c) 상기 b) 단계를 수행하면서 제1그룹 또는 제2그룹의 AKR/J 마우스 중 죽은 마우스의 흉선을 채취하여 방사선 조사 전 장기의 중량에 비해 두 배 증가한 것을 암이 발생된 것으로 진단하는 단계;
d) 상기 제3그룹의 AKR/J 마우스가 최초 죽는 시점에서 제1그룹, 제2그룹 및 제3그룹의 모든 AKR/J 마우스를 희생시켜 흉선을 추출하는 단계;
e) 상기 d) 단계에서 추출된 흉선 중 방사선을 조사하지 않은 동일 연령의 AKR/J 마우스의 장기와 비교하여 상기 제1그룹 및 제2그룹의 AKR/J 마우스에서 추출한 흉선 중 중량 변화가 없는 흉선만을 선별하여 유전자 분석을 수행하여 증감한 유전자를 검출하여, 각 유전자가 디엔에이의 복구, 리보뉴클레오타이드 (ribonucleotide) 환원효소군의 기능을 수행하는지 확인함과 아울러 철분을 수송 유전자인 Trf 유전자, 트랜스페린 수용체인 TfR1 유전자, 철분 산화에 관여하는 FTH1 유전자가 관여하여 철분 수송하는지 확인하는 단계를 포함하는 전리방사선 조사된 마우스에서 암 발병 조절 디엔에이 회복 유전자를 검출하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 b) 단계는,
상기 제1그룹에 최종선량이 4.5 Gy에 도달하도록 0.8 Gy/분의 선량으로 Cs-137 감마선을 조사하며,
상기 제2그룹은 0.7 mGy/시간의 저선량률의 Cs-137 감마선이 조사되도록 하여 누적 선량이 4.5 Gy에 이를 때까지 조사하는 것을 특징으로 하는 전리방사선 조사된 마우스에서 암 발병 조절 디엔에이 회복 유전자를 검출하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 e) 단계는,
DNA 복구에 Ogg1, CSA, Gtf2h2, Ung, Neil3, CSB, PARP1, Terf2, Mbd4, Lig4, Wrn, Rad51l1, Ube2b, Msh2, Msh3 및 Lig1 유전자가 관여하는 것을 특징으로 하는 전리방사선 조사된 마우스에서 암 발병 조절 디엔에이 회복 유전자를 검출하는 방법.
- 제3항에 있어서,
상기 DNA 복구에 관여하는 유전자들은,
염기절단복구에 상기 Ogg1, CSA, Gtf2h2, Ung, Neil3, CSB, PARP1 유전자가 관여하며,
세포주기 조절에 상기 Terf2 유전자가 관여하고,
이중가닥 절단 복구와 상동성 재조합에 상기 Mbd4, Lig4, Wrn, Rad51l1, Ube2b 유전자가 관여하며,
불일치염기의 복구에 상기 Msh2와 Msh3 유전자가 관여하고,
뉴클레오타이드의 절단 복구에 상기 Lig1 유전자가 관여하는 것을 특징으로 하는 전리방사선 조사된 마우스에서 암 발병 조절 디엔에이 회복 유전자를 검출하는 방법.
- 제4항에 있어서,
상기 디엔에이 복구에 관여하는 유전자들 중 상기 저선량률의 방사선을 조사한 경우 발현 값이 증가하는 유전자는,
상기 염기절단복구에 관여하는 Ung, Neil3, CSB, PARP1 유전자이며,
상기 세포주기 조절에 관여하는 상기 Terf2,
상기 이중가닥 절단 복구와 상동성 재조합에 관여하는 상기 Mbd4, Lig4, Wrn, Rad51l1, Ube2b 유전자와,
상기 불일치염기의 복구에 관여하는 유전자인 상기 Msh2와,
상기 뉴클레오타이드의 절단 복구에 관여하는 유전자인 상기 Lig1인 것을 특징으로 하는 전리방사선 조사된 마우스에서 암 발병 조절 디엔에이 회복 유전자를 검출하는 방법.
- 삭제
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
e) 단계에 있어서,
상기 리보뉴클레오타이드 (ribonucleotide) 환원효소군으로 작용하는 유전자는,
철분전자결합에 관여하는 RRM2와 리보뉴클레오타이드 (ribonucleotide) 환원효소인 RRM1 유전자인 것을 특징으로 하는 전리방사선 조사된 마우스에서 암 발병 조절 디엔에이 회복 유전자를 검출하는 방법.
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