CN110221335B - 一种利用转铁蛋白受体1评价低剂量伽马射线辐射损伤的方法 - Google Patents

一种利用转铁蛋白受体1评价低剂量伽马射线辐射损伤的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用转铁蛋白受体1评价低剂量伽马射线辐射损伤的方法。利用人体外周血AHH1淋巴细胞中TFRC1对低剂量伽马射线辐射非常敏感的特性,根据人体外周血AHH1淋巴细胞接受的低剂量伽马射线辐射剂量与TFRC1的相对表达量的上调率的剂量‑效应关系,通过检测人体外周血AHH1淋巴细胞中TFRC1的相对表达量的上调率,评估低剂量伽马射线辐射对人体血液的生物损伤。该方法具有操作简便快速、成本低廉、灵敏度高、特异性强、准确性好、环境风险小等多重优点。

Description

一种利用转铁蛋白受体1评价低剂量伽马射线辐射损伤的 方法
技术领域
本发明属于伽马射线辐射损伤评价技术领域,利用分子标记物进行低剂量伽马辐射损伤评价的方法,具体是利用人外周血AHH1淋巴细胞中转铁蛋白受体1(TFRC1)的相对表达量上调率来评价低剂量伽马射线辐射损伤的方法。
背景技术
在大规模核辐射事故医学救援中,对电离辐射暴露人群的接受的受照剂量和生物损伤进行快速有效的估算是救治的关键。随着分子生物学技术的深入发展,基因水平的生物标志物因其快速、简便和灵敏的特点而有可能被用作评价低剂量辐射损伤。
外周血淋巴细胞对于电离辐射非常敏感,由于其可从血液中获得,也易于培养,成为辐射损伤检测的最佳对象。有研究表明外周血淋巴细胞中DDB2、CDKN1A 和XPC 基因在0.2 −2 Gy 的高剂量电离辐射后,辐射剂量与mRNA 的表达量之间具有线性剂量−效应关系。然而对于低剂量辐射条件下,基于分子标记物的辐射损伤评价方法尚未建立。
由于放射性同位素、核能及放射性诊断和治疗的广泛应用,人体的血液在很多情况下都会受到低剂量照射,可引起血液的各种并发症,血液的辐射损伤引起人们的普遍关注,亟需筛选可以评估低剂量辐射损伤的生物分子标记物,对人体血液的低剂量辐射损伤进行评价。
发明内容
针对上述情况,本发明提供一种利用人体外周血AHH1淋巴细胞中转铁蛋白受体1(TFRC1)的相对表达量的上调率来评价低剂量伽马射线辐射损伤的方法。本发明利用人体外周血AHH1淋巴细胞中TFRC1对低剂量伽马射线辐射非常敏感的特性,根据人体外周血AHH1淋巴细胞接受的低剂量伽马射线辐射剂量与TFRC1的相对表达量的上调率的剂量-效应关系,通过检测人体外周血AHH1淋巴细胞中TFRC1的相对表达量的上调率,评估低剂量伽马射线辐射对人体血液的生物损伤。其原理是,TFRC1作为细胞内铁摄取和调节细胞生长相关的Ⅱ型跨膜糖蛋白,由两个单体通过二硫键连接的组成。每个单体结合一个全转铁蛋白分子,产生铁Tf-TfR复合物,其通过胞吞作用进入细胞。转铁蛋白受体转运的三价铁离子通过还原变成二价铁离子,可以与细胞内的过氧化氢发生芬顿反应生成活性氧自由基,即Fe2++ H2O2→Fe3++(OH)-+OH·,产生的活性氧自由基可导致细胞的死亡。该方法具有操作简便快速、成本低廉、灵敏度高、准确性好、环境风险小等多重优点。
具体步骤是:
(1)人体外周血AHH1淋巴细胞的培养;
(2)伽马射线辐射;
(3)TFRC1的相对表达量上调率的检测;
(4)辐射损伤综合评价。
其进一步的措施是:
所述的人体外周血AHH1淋巴细胞的培养具体方法为:
人体外周血淋巴细胞AHH-1(编号ATCC CRL-8146),用含10%血清(Gibco 澳洲胎牛)IMDM培养液中,置于37℃,5% 二氧化碳培养箱,每隔3 天换一次培养液,每隔3-5天进行一次细胞传代,取对数生长期细胞进行实验。
所述的伽马射线辐射具体方法为:
采用细胞计数仪将细胞密度调整为6×105细胞/ml,再取用6×106个细胞即10ml细胞溶液,将其移至新培养瓶,放在剂量率为14μGy/h的伽马射线下进行长时间持续辐照,分别收集持续辐照0、7、21、42和56天(辐照剂量分别为0、2.4、7.2、14.1和18.8 mGy)的外周血AHH1淋巴细胞。
所述的TFRC1的相对表达量上调率的检测具体方法为:
将收集的受过低剂量伽马射线辐照的外周血AHH1淋巴细胞进行蛋白提取、总蛋白浓度测定、蛋白质变性、凝胶电泳、转膜、免疫反应、化学发光反应、凝胶成像扫描分析、最后进行TFRC1的相对表达量上调率分析。
所述的蛋白提取具体步骤如下:
倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液,每瓶细胞加3ml 4oC预冷的PBS平放轻轻摇动1min洗涤,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。1ml裂解液加10ulPMSF,摇匀置于冰上。每瓶加400ul含PMSF的裂解液,于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。裂解完后,移至离心管,离心5min,上清于离心管保存。
所述的总蛋白浓度测定的具体步骤如下:
将0.2 mg/ml BSA 标准品溶液加稀释液依次稀释成0、5、10、20、50、100、150和200μg/ml 的标准品溶液。然后测定它们在562 nm下的吸光度值,绘制标准曲线。测定每个样品溶液562 nm下的吸光度值后,最后通过标准曲线计算出样品中蛋白质的浓度。
所述的蛋白质变性的具体步骤如下:
将蛋白质溶液按照4:1的比例加入5×蛋白质上样缓冲液,沸水浴变性15 min,放入-20 ℃冰箱保存备用。
所述的凝胶电泳的具体步骤如下:
将30%丙烯酰胺、1.5M TRIS-HCl、10%SDS、AP和TEMED按照一定比例配制成10%的分离胶和5%的浓缩胶,等分离胶凝固好后,在电泳槽中加入电泳液后,将变性后蛋白质样品加入电泳孔中,进行电泳。将浓缩胶电压调至75V,分离胶电压调至120V,电泳至溴酚蓝刚跑至分离胶底部,即可终止电泳,进行转膜。
所述的转膜的具体步骤如下:
先采用甲醇将PVDF膜进行活化,再在膜的底部放置6张7×9 cm的滤纸,再一同放置于转膜仪中,加入转膜液,300 mA恒流转膜半小时,转膜过程中,将转膜槽放置于冰水中降温。
所述的免疫反应的具体步骤如下:
将转好的膜用5%的脱脂牛奶(0.5% TBST稀释)封闭,在脱色摇床上混匀1 h。采用TBST溶解的5%脱脂牛奶对TFRC一抗(鼠抗人)进行1:100浓度稀释,然后将其与封闭好的膜进行混匀,4 ℃孵育过夜。 用2% TBST对TFRC一抗(鼠抗人)孵育过夜的膜进行清洗,室温下,在脱色摇床上清洗三次,每次5min。最后用TBST对二抗(羊抗鼠)稀释3000倍,室温下孵育30 min后,在脱色摇床上清洗三次,每次5 min。
所述的化学发光反应的具体步骤如下:
在暗室中将ECLA和ECLB两种试剂在离心管中等体积混合,将PVDF膜的蛋白面朝上,加入混合好的ECL溶液充分反应1-2min后,放入凝胶成像系统进行扫描分析。
所述的凝胶成像扫描分析的具体步骤如下:
采用凝胶成像系统对蛋白条带进行拍照,再采用Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。通过对TFRC1蛋白灰度值扫描获得TFRC1蛋白表达量,对内参蛋白GAPDH蛋白灰度值扫描获得GAPDH蛋白表达量;将TFRC1蛋白表达量除以内参蛋白GAPDH蛋白表达量获得了TFRC1相对表达量。
所述的TFRC1的相对表达量上调率分析的具体步骤如下:
TFRC1相对表达量上调率按公式(1)进行计算,
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE002
(1)
所述辐射损伤综合评价的方法是:
采用TFRC1相对表达量上调率来评估低剂量伽马射线辐射对人体外周血的生物损伤。当人体外周血淋巴细胞AHH-1中的TFRC1相对表达量上调率小于10%时,表明低剂量伽马射线辐射对人体外周血无损伤;当人体外周血淋巴细胞AHH-1TFRC1相对表达量上调率大于10%而小于30%时,此时的低剂量伽马射线辐射的损伤等级为
Figure DEST_PATH_IMAGE004
级;当人体外周血淋巴细胞AHH-1中的TFRC1相对表达量上调率大于30%而小于60%时,此时的低剂量伽马射线辐射的损伤等级为
Figure DEST_PATH_IMAGE006
级;当人体外周血淋巴细胞AHH-1中的TFRC1相对表达量上调率大于60%时,此时的低剂量伽马射线辐射的损伤等级为
Figure DEST_PATH_IMAGE008
级。当低剂量伽马射线辐射的损伤等级达到
Figure 870275DEST_PATH_IMAGE004
级时,职业工作人员应加强辐射防护;当低剂量伽马射线辐射的损伤等级达到
Figure 265484DEST_PATH_IMAGE006
级时,职业工作人员应及时休息一段时间;当低剂量伽马射线辐射的损伤等级达到
Figure 79856DEST_PATH_IMAGE008
级时,职业工作人员应调离原工作岗位,并接受适当治疗。
本发明提出的低剂量伽马射线辐射诱导的人体外周血损伤评价方法是,利用人体外周血淋巴细胞AHH-1中的TFRC1对低剂量伽马射线辐射非常敏感的特性,根据伽马射线辐射剂量与人体外周血淋巴细胞AHH-1中的TFRC1相对表达量上调率之间的剂量-效应关系,计算TFRC1相对表达量上调率,采用相对表达量上调率对低剂量伽马射线辐射诱导的生物损伤进行评估。该方法具有操作简便快速、灵敏度高、准确性好、环境风险小等多重优点。解决了现有低剂量伽马射线辐射生物损伤评价方法所需周期长、操作复杂、特异性不强等难题。
具体实施方式
下面将对本发明作进一步说明。
Ⅰ 材料组成
人体外周血AHH-1淋巴细胞、10%血清、二氧化碳培养箱、伽马射线辐照源。
Ⅱ 实施方法
人体外周血淋巴细胞AHH-1(编号ATCC CRL-8146),用含10%血清(Gibco 澳洲胎牛)IMDM培养液中,置于37℃,5% 二氧化碳培养箱,每隔3 天换一次培养液,每隔3-5天进行一次细胞传代,取对数生长期细胞进行实验。采用细胞计数仪将细胞密度调整为6×105细胞/ml,再取用6×106个细胞即10ml细胞溶液,将其移至新培养瓶,放在剂量率为14μGy/h的伽马射线下进行长时间持续辐照,分别收集持续辐照0、7、21、42和56天(辐照剂量分别为0、2.4、7.2、14.1和18.8 mGy)的外周血AHH1淋巴细胞。将收集的受过低剂量伽马射线辐照的外周血AHH1淋巴细胞进行蛋白提取、总蛋白浓度测定、蛋白质变性、凝胶电泳、转膜、免疫反应、化学发光反应、凝胶成像扫描分析、最后按照公式(1)进行TFRC1的相对表达量上调率分析。
Figure 964636DEST_PATH_IMAGE002
(1)
采用TFRC1相对表达量上调率来评估低剂量伽马射线辐射对人体外周血的生物损伤。当人体外周血淋巴细胞AHH-1中的TFRC1相对表达量上调率小于10%时,表明低剂量伽马射线辐射对人体外周血无损伤;当人体外周血淋巴细胞AHH-1中TFRC1相对表达量上调率大于10%而小于30%时,此时的低剂量伽马射线辐射的损伤等级为
Figure 231669DEST_PATH_IMAGE004
级;当人体外周血淋巴细胞AHH-1中的TFRC1相对表达量上调率大于30%而小于60%时,此时的低剂量伽马射线辐射的损伤等级为
Figure 492886DEST_PATH_IMAGE006
级;当人体外周血淋巴细胞AHH-1中的TFRC1相对表达量上调率大于60%时,此时的低剂量伽马射线辐射的损伤等级为
Figure 161765DEST_PATH_IMAGE008
级。当低剂量伽马射线辐射的损伤等级达到
Figure 217445DEST_PATH_IMAGE004
级时,职业工作人员应加强辐射防护;当低剂量伽马射线辐射的损伤等级达到
Figure 971775DEST_PATH_IMAGE006
级时,职业工作人员应及时休息一段时间;当低剂量伽马射线辐射的损伤等级达到
Figure 771104DEST_PATH_IMAGE008
级时,职业工作人员应调离原工作岗位,并接受适当治疗。
Ⅲ 实施例
实施例1
人体外周血淋巴细胞AHH-1(编号ATCC CRL-8146),用含10%血清(Gibco 澳洲胎牛)IMDM培养液中,置于37℃,5% 二氧化碳培养箱,每隔3 天换一次培养液,每隔3-5天进行一次细胞传代,取对数生长期细胞进行实验。采用细胞计数仪将细胞密度调整为6×105细胞/ml,再取用6×106个细胞即10ml细胞溶液,将其移至新培养瓶,放在剂量率为14μGy/h的伽马射线下进行长时间持续辐照,分别收集持续辐照7天,辐照剂量2.4 mGy的外周血AHH1淋巴细胞。将收集的受过低剂量伽马射线辐照的外周血AHH1淋巴细胞进行蛋白提取、总蛋白浓度测定、蛋白质变性、凝胶电泳、转膜、免疫反应、化学发光反应、凝胶成像扫描分析、最后按照公式(1)进行TFRC1的相对表达量上调率分析。
Figure 294489DEST_PATH_IMAGE002
(1)
外周血AHH1淋巴细胞在 14 μGy/h的剂量率下辐照7 d,接受2.4 mGy的低剂量伽马射线辐照后,TFRC1相对表达量上调率分别为5%,此时低剂量伽马射线辐照对人体外周血无损伤。
实施例2
人体外周血淋巴细胞AHH-1(编号ATCC CRL-8146),用含10%血清(Gibco 澳洲胎牛)IMDM培养液中,置于37℃,5% 二氧化碳培养箱,每隔3 天换一次培养液,每隔3-5天进行一次细胞传代,取对数生长期细胞进行实验。采用细胞计数仪将细胞密度调整为6×105细胞/ml,再取用6×106个细胞即10ml细胞溶液,将其移至新培养瓶,放在剂量率为14μGy/h的伽马射线下进行长时间持续辐照,分别收集持续辐照21天,辐照剂量7.2 mGy的外周血AHH1淋巴细胞。将收集的受过低剂量伽马射线辐照的外周血AHH1淋巴细胞进行蛋白提取、总蛋白浓度测定、蛋白质变性、凝胶电泳、转膜、免疫反应、化学发光反应、凝胶成像扫描分析、最后按照公式(1)进行TFRC1的相对表达量上调率分析。
Figure 786650DEST_PATH_IMAGE002
(1)
外周血AHH1淋巴细胞在 14 μGy/h的剂量率下辐照21 d,接受7.2 mGy的低剂量伽马射线辐照后,TFRC1相对表达量上调率为13.3%,此时低剂量伽马射线辐照的损伤等级为
Figure 28276DEST_PATH_IMAGE004
级,职业工作人员应增强辐射防护。
实施例3
人体外周血淋巴细胞AHH-1(编号ATCC CRL-8146),用含10%血清(Gibco 澳洲胎牛)IMDM培养液中,置于37℃,5% 二氧化碳培养箱,每隔3 天换一次培养液,每隔3-5天进行一次细胞传代,取对数生长期细胞进行实验。采用细胞计数仪将细胞密度调整为6×105细胞/ml,再取用6×106个细胞即10ml细胞溶液,将其移至新培养瓶,放在剂量率为14μGy/h的伽马射线下进行长时间持续辐照,分别收集持续辐照42 天,辐照剂量14.1 mGy的外周血AHH1淋巴细胞。将收集的受过低剂量伽马射线辐照的外周血AHH1淋巴细胞进行蛋白提取、总蛋白浓度测定、蛋白质变性、凝胶电泳、转膜、免疫反应、化学发光反应、凝胶成像扫描分析、最后按照公式(1)进行TFRC1的相对表达量上调率分析。
Figure 368646DEST_PATH_IMAGE002
(1)
外周血AHH1淋巴细胞在 14 μGy/h的剂量率下辐照42 d,接受14.1 mGy的低剂量伽马射线辐照后,TFRC1相对表达量上调率为45.0%,此时低剂量伽马射线辐照的损伤等级为
Figure 74434DEST_PATH_IMAGE006
级,职业工作人员应及时休息一段时间。
实施例4
人体外周血淋巴细胞AHH-1(编号ATCC CRL-8146),用含10%血清(Gibco 澳洲胎牛)IMDM培养液中,置于37℃,5% 二氧化碳培养箱,每隔3 天换一次培养液,每隔3-5天进行一次细胞传代,取对数生长期细胞进行实验。采用细胞计数仪将细胞密度调整为6×105细胞/ml,再取用6×106个细胞即10ml细胞溶液,将其移至新培养瓶,放在剂量率为14μGy/h的伽马射线下进行长时间持续辐照,分别收集持续辐照56 天,辐照剂量18.8 mGy的外周血AHH1淋巴细胞。将收集的受过低剂量伽马射线辐照的外周血AHH1淋巴细胞进行蛋白提取、总蛋白浓度测定、蛋白质变性、凝胶电泳、转膜、免疫反应、化学发光反应、凝胶成像扫描分析、最后按照公式(1)进行TFRC1的相对表达量上调率分析。
Figure 409600DEST_PATH_IMAGE002
(1)
外周血AHH1淋巴细胞在 14 μGy/h的剂量率下辐照56 d,接受18.8 mGy的低剂量伽马射线辐照后,TFRC1相对表达量上调率为68.3%,此时低剂量伽马射线辐照的损伤等级为
Figure 200838DEST_PATH_IMAGE008
级,职业工作人员应调离原工作岗位,并接受适当治疗。
以上仅仅是本发明的较佳实施方式,根据本发明的上述构思,本领域的熟练人员还可对此作出各种修改和变换。例如,变换辐照射线的类型、变换人体外周血淋巴细胞的类型、调整辐照剂量率、采用不同辐照时间和辐照剂量、变换辐射损伤评价体系等等。然而,类似的这种变换和修改均属于本发明的实质。

Claims (9)

1.一种利用转铁蛋白受体1评价低剂量伽马射线辐射损伤的方法,利用人体外周血AHH1淋巴细胞中TFRC1对低剂量伽马射线辐射非常敏感的特性,根据人体外周血AHH1淋巴细胞接受的低剂量伽马射线辐射剂量与TFRC1的相对表达量的上调率的剂量-效应关系,通过检测人体外周血AHH1淋巴细胞中TFRC1的相对表达量的上调率,评估低剂量伽马射线辐射对人体血液的生物损伤,其特征在于,具体步骤包括:
(1)人体外周血AHH1淋巴细胞的培养;
(2)伽马射线辐射;
(3)TFRC1的相对表达量上调率的检测;
(4)辐射损伤综合评价;
所述的人体外周血AHH1淋巴细胞的培养具体方法为:
人体外周血淋巴细胞AHH1,用含10%血清IMDM培养液中,置于37℃,5% 二氧化碳培养箱,每隔3 天换一次培养液,每隔3-5天进行一次细胞传代,取对数生长期细胞进行实验;
所述的伽马射线辐射具体方法为:
将细胞密度调整为6×105细胞/ml,再取用6×106个细胞,将其移至新培养瓶,放在剂量率为14μGy/h的伽马射线下进行持续辐照,分别收集持续辐照0、7、21、42和56天的外周血AHH1淋巴细胞,辐照剂量分别为0、2.4、7.2、14.1和18.8 mGy,
所述的TFRC1的相对表达量上调率的检测具体方法为:
将收集的受过低剂量伽马射线辐照的外周血AHH1淋巴细胞进行蛋白提取、总蛋白浓度测定、蛋白质变性、凝胶电泳、转膜、免疫反应、化学发光反应、凝胶成像扫描分析、最后进行TFRC1的相对表达量上调率分析,
TFRC1相对表达量上调率按公式(1)进行计算,
Figure DEST_PATH_IMAGE002
(1)
所述辐射损伤综合评价的方法是:
采用TFRC1相对表达量上调率来评估低剂量伽马射线辐射对人体外周血的生物损伤,当人体外周血淋巴细胞AHH-1中的TFRC1相对表达量上调率小于10%时,表明低剂量伽马射线辐射对人体外周血无损伤;当人体外周血淋巴细胞AHH-1TFRC1相对表达量上调率大于10%而小于30%时,此时的低剂量伽马射线辐射的损伤等级为Ⅰ级;当人体外周血淋巴细胞AHH-1中的TFRC1相对表达量上调率大于30%而小于60%时,此时的低剂量伽马射线辐射的损伤等级为Ⅱ级;当人体外周血淋巴细胞AHH-1中的TFRC1相对表达量上调率大于60%时,此时的低剂量伽马射线辐射的损伤等级为Ⅲ级。
2.根据权利要求1所述的一种利用转铁蛋白受体1评价低剂量伽马射线辐射损伤的方法,其特征在于,所述的蛋白提取具体步骤如下:
倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液,每瓶细胞加3ml 4oC预冷的PBS平放轻轻摇动1min洗涤,然后弃去洗液,重复以上操作两次,洗去培养液,将PBS弃净后把培养瓶置于冰上,1ml裂解液加10ulPMSF,摇匀置于冰上,每瓶加400ul含PMSF的裂解液,于冰上裂解30min,裂解完后,移至离心管,离心5min,上清于离心管保存。
3.根据权利要求1所述的一种利用转铁蛋白受体1评价低剂量伽马射线辐射损伤的方法,其特征在于,所述的总蛋白浓度测定的具体步骤如下:
将0.2 mg/ml BSA 标准品溶液加稀释液依次稀释成0、5、10、20、50、100、150和200 μg/ml 的标准品溶液,然后测定它们在562 nm下的吸光度值,绘制标准曲线,测定每个样品溶液562 nm下的吸光度值后,最后通过标准曲线计算出样品中蛋白质的浓度。
4.根据权利要求1所述的一种利用转铁蛋白受体1评价低剂量伽马射线辐射损伤的方法,其特征在于,所述的蛋白质变性的具体步骤如下:
将蛋白质溶液按照4:1的比例加入5×蛋白质上样缓冲液,沸水浴变性15 min,放入-20℃冰箱保存备用。
5.根据权利要求1所述的一种利用转铁蛋白受体1评价低剂量伽马射线辐射损伤的方法,其特征在于,所述的凝胶电泳的具体步骤如下:
将30%丙烯酰胺、1.5M TRIS-HCl、10%SDS、AP和TEMED按照一定比例配制成10%的分离胶和5%的浓缩胶,等分离胶凝固好后,在电泳槽中加入电泳液后,将变性后蛋白质样品加入电泳孔中,进行电泳,将浓缩胶电压调至75V,分离胶电压调至120V,电泳至溴酚蓝刚跑至分离胶底部,即可终止电泳,进行转膜。
6.根据权利要求1所述的一种利用转铁蛋白受体1评价低剂量伽马射线辐射损伤的方法,其特征在于,所述的转膜的具体步骤如下:
先采用甲醇将PVDF膜进行活化,再在膜的底部放置6张7×9 cm的滤纸,再一同放置于转膜仪中,加入转膜液,300 mA恒流转膜半小时,转膜过程中,将转膜槽放置于冰水中降温。
7.根据权利要求1所述的一种利用转铁蛋白受体1评价低剂量伽马射线辐射损伤的方法,其特征在于,所述的免疫反应的具体步骤如下:
将转好的膜用5%的脱脂牛奶封闭,在脱色摇床上混匀1 h,采用TBST溶解的5%脱脂牛奶对TFRC鼠抗人一抗进行1:100浓度稀释,然后将其与封闭好的膜进行混匀,4 ℃孵育过夜,用2% TBST对TFRC鼠抗人一抗孵育过夜的膜进行清洗,室温下,在脱色摇床上清洗三次,每次5min,最后用TBST对羊抗鼠二抗稀释3000倍,室温下孵育30 min后,在脱色摇床上清洗三次,每次5 min。
8.根据权利要求1所述的一种利用转铁蛋白受体1评价低剂量伽马射线辐射损伤的方法,其特征在于,所述的化学发光反应的具体步骤如下:
在暗室中将ECLA和ECLB两种试剂在离心管中等体积混合,将PVDF膜的蛋白面朝上,加入混合好的ECL溶液充分反应1-2min后,放入凝胶成像系统进行扫描分析。
9.根据权利要求1所述的一种利用转铁蛋白受体1评价低剂量伽马射线辐射损伤的方法,其特征在于,所述的凝胶成像扫描分析的具体步骤如下:
采用凝胶成像系统对蛋白条带进行拍照,再采用Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值,通过对TFRC1蛋白灰度值扫描获得TFRC1蛋白表达量,对内参蛋白GAPDH蛋白灰度值扫描获得GAPDH蛋白表达量;将TFRC1蛋白表达量除以内参蛋白GAPDH蛋白表达量获得了TFRC1相对表达量。
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