CN103308697A - 检测抗丙型肝炎病毒编码的非结构蛋白ns3和ns5的天然双特异性抗体的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测抗丙肝病毒编码的NS3和NS5抗原双特异性抗体的试剂盒，属于临床检验学领域。本发明的试剂盒基于酶联免疫吸附检测技术，利用双抗原夹心法，包括HCV NS3和NS5两种抗原，可以检测存在于丙型肝炎患者血清中的一种天然双特异性抗体。该试剂盒使用方便，可以简单易行的检测双特异性抗体。

Description

检测抗丙型肝炎病毒编码的非结构蛋白NS3和NS5的天然双特异性抗体的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测抗丙型肝炎病毒编码的非结构蛋白NS3和NS5的天然双特异性抗体的试剂盒，属于临床检验学领域。

背景技术

通常所描述的一个抗体（antibody）分子具有两个相同的抗原结合区域（Fab），只能识别一种抗原。双特异性抗体（bispecific antibody）是一类具有双功能的抗体分子，其两个Fab段具有不同的特异性，能与不同的抗原分子结合。目前应用于医学领域的双特异性抗体均是通过人工改造相应的单特异性抗体而获得。荷兰Schuurman等人首次报道了一种存在于人体内的天然双特异性抗体―IgG4。报道称，他们成功证实了分离的IgG4组分具有结合两种不同过敏原的特性。他们对IgG4的双特异性作出如下推断：IgG4在体内是动态性分子，一种特异性的IgG4半分子（一条轻链连同相应的重链）可以与另一种特异性的IgG4半分子发生交换，由此产生的杂交分子即具有同时结合两种抗原的特性。

天然的双特异性抗体可能普遍存在于长期受免疫原刺激的疾病，例如自身免疫疾病，细菌、病毒或者寄生虫感染，以及慢性肿瘤生长等过程。丙型肝炎病毒（HCV）感染是一种病毒在宿主肝细胞内不断复制的慢性感染过程，通常不能被治愈。HCV编码4个结构蛋白（core,E1,E2,ion channel p7）和6个非结构蛋白（NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A,和NS5B。研究表明，HCV编码的core,NS3,NS4B和NS5A是慢性丙型肝炎感染中引起体液免疫应答的主要抗原。慢性丙型肝炎病人血清中极有可能存在针对HCV病毒不同抗原的天然双特异性抗体。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种检测HCV编码的NS3和NS5双特异性抗体的试剂盒。该试剂盒基于酶联免疫吸附检测技术，利用双抗原夹心法，包括HCV NS3和NS5两种抗原，可以检测存在于丙型肝炎患者血清中的一种天然双特异性抗体，所述的双特异性抗体可同时结合HCV NS3和NS5两种抗原，是丙型肝炎检测的一项新型指标。

本发明要解决的第二个技术问题是提供检测抗HCV NS3和NS5双特异性抗体的试剂盒在检测丙型肝炎患者血清中抗HCV NS3和NS5双特异性抗体的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种检测抗HCV NS3和NS5双特异性抗体的试剂盒，包括：NS3包被的微孔板、生物素标记的NS5（NS5-biotin）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）、稀释液、阳性对照液、阴性对照液、底物液、洗涤液和终止液。

本发明所述的NS3和NS5两种抗原包括但不限于已经公开报道的，和根据已公开的NS3序列（Genbank:ADN30215.1）和NS5序列（Genbank:AAQ85803.1）利用现有技术手段制备的重组蛋白或合成的多肽。优选地，本发明所述的NS3为重组蛋白，其氨基酸序列为序列表SEQ ID No.1所示，所述的NS5为合成多肽，其氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2所示。

所述Streptavidin-HRP购自Thermo Fisher Scientific公司。

所述试剂盒中的稀释液为含20%（v/v）小牛血清的磷酸盐缓冲液，洗涤液为含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液，底物液为3′,3′,5′,5′,-四甲基联苯胺（TMB），所述终止液为0.5M硫酸。

所述阳性对照液为已确定双特异性抗体为阳性的丙型肝炎患者血清，阴性对照液为健康人血清。

利用本发明所述的试剂盒检测抗NS3和抗NS5双特异性抗体的方法为：

（1）包被有NS3的微孔板捕获血清样本中具有NS3反应性的抗体；

（2）加入生物素标记的NS5结合具有抗NS3和抗NS5双特异性的抗体。

（3）加入HRP标记的链霉亲和素检测具有抗NS3和抗NS5双特异性的抗体。

本发明人采用NS3包被微孔板作为固相抗原，经与血清样本温育后，加入生物素标记的NS5结合具有抗NS3和抗NS5双特异性的抗体，最后加入HRP标记的链霉亲和素检测检测捕获的双特异性抗体。使用PIERCE公司的

Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit试剂盒将NS5生物素化，用丙型肝炎抗体阳性血清对NS5-biotin进行稀释度测定，确定的最佳稀释度用于双特异性抗体的测定。

本发明的优点：

目前，有关天然双特异性抗体的报道不多，而检测的方法也比较单一，主要是放射免疫测定。Schuurman等人首先将血清与抗原1（花粉）交联的Sepharose进行温育，然后加入碘标记的抗原2（尘螨）检测具有双特异性的抗体。这种检测模式虽然具备放射免疫测定的高度敏感性和特异性，但是由于用到了放射性元素，不仅需要特殊的仪器设备来检测放射性信号，而且还具有一定的生物危害性，不利于推广。如今，很多放射免疫测定方法在很大程度上已经被酶联免疫测定（ELISA）所取代，因为ELISA除了方法本身具有的敏感性和特异性之外，其操作简便，由酶促反应产生的颜色信号对环境没有任何污染威胁，从而更加适合广泛推行。本发明所描述的试剂盒的检测方法正是提供了一种简单易行的双特异性抗体检测模式，可以推广应用于各种双特性抗体的检测。

其次，本发明所述检测双特异性抗体的方法引入生物素-链霉亲和素放大系统。不用辣根酶直接标记检测抗原，而是用生物素标记抗原，且在生物素和抗原之间引入长度为22.4埃的间隔臂，这样可以减少抗原结合目的抗体时的空间位阻。这两项措施可以提高了双特异性抗体的检出率。

通过对丙型肝炎患者血清和对照血清进行检测发现，抗NS3和抗NS5的双特异性抗体在丙型肝炎患者中的检出率明显高于对照组（健康人），并具有统计学意义。因此，本发明人所发现的双特异性抗体可以看作是存在于丙型肝炎患者血清中的一种新型指标。换言之，本发明人的发现开辟了丙型肝炎血清学的一个新领域，为更进一步研究打下了基础。

附图说明

图1NS5-biotin稀释度测定曲线。

图2双特异性抗体在丙型肝炎血清和正常人血清中的分布图；图中HCV infection表示丙型肝炎患者血清，Healthy controls表示健康人血清。

具体实施方式

以下为实施例中涉及的主要材料和试剂：

NS3：重组蛋白，氨基酸序列来自HCV编码的NS3区域，共含256个氨基酸。购自北京万泰生物药业，中国；

NS5：合成多肽，氨基酸序列来自HCV编码的NS5A区域，共含36个氨基酸。购自北京万泰生物药业，中国；

Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit,PIERCE公司,美国

Streptavidin-HRP,Thermo Fisher Scientific Inc,美国

Na₂HPO₄·12H₂O，北京化学试剂公司，中国

NaH₂PO₄·2H₂O，北京化学试剂公司，中国

磷酸二氢钾（KH₂PO₄），北京化学试剂公司，中国

氯化钠，北京化学试剂公司，中国

氯化钾，北京化学试剂公司，中国

NaHCO₃，北京化学试剂公司，中国

Na₂CO₃，北京化学试剂公司，中国

小牛血清，GIBCO，新西兰

96孔酶标板，Costar,美国

吐温-20（Tween-20），SIGMA，美国

酶标仪，Bio-rad iMark Microplate Reader，美国

抗体测定溶液配制

1)碳酸盐包被缓冲液（0.05M，pH9.6）：无水碳酸钠0.795g，碳酸氢钠1.465g，去离子水400mL，充分溶解后用1M HCl调节pH值至9.6，加入去离子水定容至500mL。

2)磷酸盐缓冲（PBS）溶液：NaCl8g，Na₂HPO₄.12H₂O3.63g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.24g，去离子水800mL，充分溶解后用1M HCl调节溶液的pH值至7.4，加去离子水定容至1L，高压灭菌后保存。

3)洗涤缓冲液PBST（洗板用）：PBS1L，Tween-20500μL，搅拌混匀，每次使用前新鲜配制。

4)稀释液：PBS80mL，小牛血清20mL，充分混匀，每次使用前新鲜配制。

实施例1：NS5-biotin的制备

一、材料

NS5多肽，购自北京万泰生物药业，中国

Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit,购自PIERCE公司,美国

酶标板：96孔，Nunc，丹麦。

二、方法

1.计算标记反应所需试剂量

反应要求Sulfo-NHS-LC-Biotin与待标记蛋白的摩尔比例超过20倍，欲标记1mL浓度为1mg/mL的NS5抗原，按试剂盒说明书所示公式计算需要10mMSulfo-NHS-LC-Biotin溶液体积为527.4μL。

2.标记反应

1)从冰箱中取出Sulfo-NHS-LC-Biotin，需先平衡至室温再开盖，以防止Sulfo-NHS-LC-Biotin变潮失效。

2)用去离子水将试剂盒提供的PBS粉剂溶解，定容至500mL，该溶液成分为0.1MPBS，含0.15M NaCl，pH7.2。

3)准确称取1mg HCV NS5多肽抗原，溶于1mL上述PBS。

4)准确称取8.8mg Sulfo-NHS-LC-Biotin，溶于1.6mL去离子水，得到10mMSulfo-NHS-LC-Biotin溶液，临用前配制。

5)将上述计算得到的相应体积10mM Sulfo-NHS-LC-Biotin溶液与蛋白溶液混合；

6)将混合物置于室温反应60min。

C.用脱盐柱除去未标记上的生物素

1)取出一个试剂盒配套的Zeba Spin脱盐柱，将脱盐柱的底部塑料塞子折断，置于一个15mL离心管中。1000g离心2min，弃去离心液，将脱盐柱放回收集管中。脱盐柱中的树脂因离心力作用在外沿会偏高，在该位置做标记，在后续的离心步骤中注意保持该面朝外放置。

2)在脱盐柱顶部加2.5mL PBS，平衡柱，1000g离心2min，弃去离心液，重复该步骤2-3次。

3)将脱盐柱放入一个新的15mL离心管中，将交联好的蛋白溶液直接加入树脂表面中央。若样本体积小于1mL，加100μL去离子水于柱顶样本，使蛋白加快复性。

4)将脱盐柱1000g离心2min，收集的液体即纯化好的生物素化蛋白，分装后于－40°C保存。

3.NS5-biotin的验证及其使用稀释度的确定。

用双抗原夹心法，丙肝阳性血清验证。

1)将多肽抗原NS5用包被缓冲液（0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6）配制成1μg/mL溶液，包被nunc酶标微孔板，每个微孔加入100μL，4°C包被过夜；

2)PBST洗板3次，拍干；

3)每孔加入200μL稀释液（20%小牛血清/PBS），37°C封闭2小时；

4)PBST洗板3次，拍干；

5)取20丙肝抗体阳性血清混合，以及阴性血清，分别加入对应酶标孔（100μL/孔），37°C温育1小时；

6)PBST洗板5次，拍干；

7)将标记好的NS5-biotin用稀释液按1:200,1:400,1;800,1:1600稀释，依次加入对应酶标孔（100μL/孔），37°C温育1小时；

8)PBST洗板5次，拍干

9)HRP标记的链霉亲和素用稀释液进行1:10,000（说明书推荐）稀释，充分混匀后加入各微孔（100μL/孔），37°C温育30min；

10)PBST洗板5次，拍干；

11)加入底物溶液（100μL/孔），于37°C避光显色10min；

12)每孔加入50μL终止液，于450/630nm处读取吸光度值。

三、结果

ELISA确定NS5-biotin的稀释度。

表1：NS5-biotin测定结果（OD450）

NS5-biotin稀释度	1:200	1:400	1:800	1:1600
					阳性血清	2.176	2.068	1.958	1.547
阴性血清	0.034	0.021	0.015	0.016

滴定曲线见图1，横坐标为NS5-biotin稀释度，纵坐标为450nm处的吸光度值。图中显示，NS5-biotin进行1:800稀释时，滴定曲线较陡，并且背景吸光度值亦较低，因此，选定1:800为NS5-biotin的最佳稀释度，进行下述双特异性抗体的检测。

实施例2：检测抗NS3和抗NS5双特异性抗体的试剂盒

一．试剂盒组成

1．NS3包被微孔板：重组的NS3包被微孔板；

2．NS5-biotin：来源实施例1制备得到的NS5-biotin；

3.Streptavidin-HRP,Thermo Fisher Scientific Inc,美国；

3．洗涤液（PBST）：含0.05%吐温-20的PBS溶液；（1L PBS中加入500μL Tween-20，充分混匀）；

4．稀释液：含20%（v/v）小牛血清的PBS；

5．底物液：3′,3′,5′,5′,-四甲基联苯胺（TMB）；

6．阳性对照液：已确定双特异性抗体为阳性的丙型肝炎患者血清；

7．阴性对照液：健康人血清；

8．终止液：0.5M硫酸。

二．NS3包被微孔板制备的条件及方法：

A:微孔板：MaxiSorp微量滴定板（Nunc,Roskilde,Denmark）；

B:包被缓冲液：碳酸盐包被缓冲液（0.05M，pH9.6），无水碳酸钠0.795g，碳酸氢钠1.465g，去离子水，400mL，充分溶解后用1M HCl调节pH值至9.6，加入去离子水定容至500mL；

C:NS3包被浓度：4μg/mL；

D:包被条件：4°C过夜；

包被：每个微孔加入100μL浓度为4μg/ml的NS3溶液，4°C包被过夜；

封闭：含20%（v/v）小牛血清的PBST，每孔200μL，37°C温育2小时。

实施例3：抗NS3和抗NS5双特异性抗体的检测

一．材料

1．实施例2所述的试剂盒

2．血清：354份丙型肝炎血清，100例健康人血清。分析前均储存于-80°C。

二．方法

1．双抗原夹心法检测抗NS3和抗NS5的双特异性抗体

（1）测定前，所有材料和试剂均平衡至室温。

（3）用加样枪吸取100μL血清加入到试剂盒提供的NS3包被微孔板中，每个样本均做复孔，37°C温育1小时；

（4）PBST洗涤3次，拍干。

（5）NS5-biotin用稀释液（含20%（v/v）小牛血清的PBS）进行1:800稀释，充分混匀，每个检测孔加入100μL。室温温育1小时。

（6）PBST洗涤5次，拍干。

（7）Streptavidin-HRP用稀释液进行1:10,000稀释，充分混匀后加入各微孔（100μL/孔），37°C温育30min；

（8）每孔加入100μL底物液，37°显色10分钟。

（9）每孔加入50μL终止液终止反应。

（9）读数：用双波长450nm/630nm测定各孔OD值。

3．临界值（cut-off值）的确定

采用测定样本对阴性比值（Test to Negative Ratio,TNR）的方法设定cut-off值，以正常人血清OD均值的3倍作为阳性判定值。

三．结果

1．双特异性抗体测定

该测定中，以包被于微孔板上的NS3为固相抗原，NS5-biotin为检测抗原，检测丙型肝炎患者血清中抗NS3和NS5的天然双特异性抗体。正常人血清（Healthy controls）作为对照。检测结果见图2。图中结果显示，与对照血清相比较，我们所检测的双特异性抗体特异分布于丙型肝炎患者血清（HCV infection）中。

2．临界值的确定

样本OD/0.099≥3.1判定为阳性，否则为阴性。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.一种检测抗丙型肝炎病毒编码的非结构蛋白NS3和NS5双特异性抗体的试剂盒，其特征在于，包括：NS3包被的微孔板、生物素标记的NS5、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素、稀释液、阳性对照液、阴性对照液、底物液、洗涤液和终止液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述NS3的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述NS5的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2所示。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液为含20%小牛血清的磷酸盐缓冲液，洗涤液为含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液，底物液为3′,3′,5′,5′,-四甲基联苯胺，终止液为0.5M硫酸。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照液为已确定双特异性抗体为阳性的丙型肝炎患者血清，阴性对照液为健康人血清。

6.权利要求1-5任一权利要求所述的试剂盒在检测抗HCV NS3和NS5双特异性抗体中的应用。

7.一种利用权利要求1-5任一权利要求所述的试剂盒检测抗NS3和抗NS5双特异性抗体的方法，其特征在于，该方法包括：

（1）包被有NS3的微孔板捕获血清样本中具有NS3反应性的抗体；

（2）加入生物素标记的NS5结合具有抗NS3和抗NS5双特异性的抗体；

（3）加入HRP标记的链霉亲和素检测具有抗NS3和抗NS5双特异性的抗体。

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