CN101957365B - 检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白g双特异性抗体的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测抗环瓜氨酸肽(CCP)和抗免疫球蛋白G(IgG)双特异性抗体的试剂盒，属于临床检验学领域。本发明的试剂盒基于酶联免疫吸附检测技术，利用双抗原夹心法，包括环瓜氨酸肽(CCP)和免疫球蛋白G(IgG)两种抗原，可以检测存在于类风湿关节炎患者血清中的一种天然双特异性抗体。该试剂盒使用方便，可以简单易行的检测双特异性抗体。

Description

检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白G双特异性抗体的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测抗环瓜氨酸肽(CCP)和抗免疫球蛋白G(IgG)双特异性抗体的试剂盒，属于临床检验学领域。

背景技术

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种常见的系统性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎症以及对称性、破坏性的关节病变为主要临床特征。RA的发病率在我国约为0.4％，全球为0.5％-1.0％。在RA早期，患者主要表现为近端指间关节和掌指关节的肿痛。随着病情的发展，膝、肘、腕和踝等大关节相继受累。此时，在滑膜组织可见大量激活的白细胞浸润，从而导致组织增生和炎症，最终造成关节的进行性破坏。由于RA是一种系统性疾病，因此，患者可伴有发热、贫血、皮下结节及淋巴结肿大等关节外表现。

RA的病因学机制尚未明了，但是已经发现一些与发病相关的所谓“危险因素”。跟其他自身免疫性疾病类似，女性发病较常见，男女发病率之比约为1∶3，因此，性激素可能在致病机制中发挥一定的作用。遗传学研究表明，HLA-DR基因座位包含了RA发病的遗传易感基因。另外，有研究发现，感染性物质、口服避孕药以及吸烟等环境因素也可能成为发病的“促进剂”。

1987年美国风湿病学会制订的类风湿关节炎的7项分类标准中，类风湿因子(rheumatoid factor，RF)是唯一的血清学指标。RF是一类针对免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)Fc段的自身抗体，主要包括IgM、IgA和IgG三类。多种实验室技术均可用于RF的检测。利用胶乳、炭或红细胞作为承载人或兔IgG的载体，从而发展了RF的颗粒凝集检测法。目前，凝集法检测IgM-RF仍然是最常用的实验室诊断RA的方法之一。但是，凝集法只能对RF进行半定量，且只能测定IgM型RF。另一种检测RF的方法为浊度法。其检测的原理是，包被人IgG的胶乳颗粒捕获血清中的RF后形成RF-IgG复合物，通过测定复合物产生的散射光强度可以对RF进行定量测定。浊度法检测的是血清中总RF水平，不能进行各类RF的分别测定。酶联免疫吸附检测(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)以人或兔IgG作为固相抗原，利用不同的酶标二抗可以分别测定IgM-、IgA-和IgG-RF并可实现定量检测。75％的RA患者体内可以检出RF。然而，在其他的自身免疫性疾病和某些感染性疾病以及10-30％的正常老年人血清中均可以检测出RF，即RF对RA的诊断特异性较差。

1964年，Nienhuis和Mandema在RA患者血清中发现了一种针对人口腔粘膜细胞内核周颗粒的自身抗体，并命名为抗核周因子(Antiperinuclear factor，APF)。1979年，Young等人发现，在RA血清中存在一种与大鼠食管上皮角质层成分起反应的自身抗体，并称其为抗角质素抗体(Antikeratin antibody，AKA)。研究发现，APF和AKA对RA具有高度的特异性，并均与丝聚合蛋白(filaggrin)或它的前体-丝聚合蛋白原(profilaggrin)存在反应性，因此将其统称为抗丝聚合蛋白自身抗体(antifilaggrin autoantibody，AFA)。APF和AKA的检测通常采用间接免疫荧光法，而AFA则可采用免疫印迹检测或ELISA。但是，以上检测存在一个共同的缺点，即抗原的来源有限，制备亦较繁琐，抗原均一性难以控制，从而导致检测的重复性较差。进一步研究表明，瓜氨酸在AFA的抗原识别表位起着不可或缺的作用。因此，采用人工合成的环瓜氨酸肽作为固相抗原的ELISA技术迅速发展起来，其检测的抗体称为抗环瓜氨酸肽抗体(Anti-cyclic citrullinatedpeptide antibody，Anti-CCP)。Anti-CCP ELISA解决了以上提及的抗原来源和制备问题，并克服了由自身抗体不均一性带来的结果解释难题。其检测的灵敏度通常为68％-75％，特异度则可达到98％。Anti-CCP在临床症状出现以前的RA早期即能被检出，因此可以用于疾病的早期诊断。目前，Anti-CCP ELISA已广泛应用于临床检验诊断学，与RF联合检测可以增加RA诊断的准确性。

通常所描述的抗体具有两个等价(双价)的抗原结合区域(Fab)，当抗原抗体的比例适合时，抗体可以交联抗原形成沉淀。早在1935年，人们就发现动物通过长期的抗原刺激后，体内除了产生沉淀性抗体外，还存在一种非沉淀性抗体。这种特殊的抗体能与相应的抗原结合，但即使抗原抗体的比例适合也不能与之形成沉淀，其在功能上表现为单价。非沉淀性抗体可以产生于多个物种，其中也包括人类，常见于狼疮性膜性肾病，丝虫病感染，妊娠以及过敏性疾病等。关于非沉淀性抗体的产生机制尚无定论。

近期，Schuurman等人关于天然双特异性抗体的研究在很大程度上丰富了非沉淀性抗体的内容。双特异性抗体(bispecific antibody)是一类具有双功能的抗体杂交分子，两价抗体中的Fab段具有不同的特异性，能与不同的抗原分子结合。目前，双特异性抗体均通过人工改造相应的单特异性抗体而获得，主要用于生物医学领域尤其是肿瘤免疫治疗方面。与以上描述的双特异性抗体不同，Schuurman等人报道了一种存在于人体内的天然双特异性抗体-IgG4。报道称，与其他的IgG亚型不同，血清中循环的IgG4具有双特异性。通过对过敏患者接受过敏原脱敏治疗过程中的血清IgG4进行研究，他们成功证实了分离的IgG4组分具有结合两种不同过敏原的特性。他们对IgG4的双特异性作出如下推断：IgG4在体内是动态性分子，一种特异性的IgG4半分子(一条轻链连同相应的重链)可以与另一种特异性的IgG4半分子发生交换，由此产生的杂交分子即具有同时结合两种抗原的特性。在接下来的研究中，Schuurman研究小组分别在体内和体外对以上推断进行了证实。

天然的双特异性抗体可能普遍存在于长期受免疫原刺激的疾病，抑或在多种疾病中所提及的非沉淀性抗体实际上就是一种双特异性抗体。类风湿关节炎的发病是一种自身抗原对机体反复刺激的过程，而研究表明，自身抗原是产生非沉淀性抗体的良好候选抗原。有报道指出，类风湿因子亦属于非沉淀性抗体，因为其不能与抗原IgG形成沉淀。而RF和Anti-CCP亚型分析表明，两种抗体的IgG4亚型均有显著升高，因而RA具备产生天然双特异性抗体的条件与潜力。但是目前还没有RA患者血清中抗CCP和抗IgG的双特异性抗体的报道和用于此检测的试剂盒。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白G双特异性抗体的试剂盒。该试剂盒基于酶联免疫吸附检测技术，利用双抗原夹心法，包括环瓜氨酸肽(CCP)和免疫球蛋白G(IgG)两种抗原，可以检测存在于类风湿关节炎患者血清中的一种天然双特异性抗体，所述的双特异性抗体可同时结合环瓜氨酸肽和免疫球蛋白G分子，是类风湿关节炎检测的一项新型指标。

本发明要解决的第二个技术问题是提供检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白G双特异性抗体的试剂盒在检测类风湿关节炎患者血清中抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白G双特异性抗体的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供的一种检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白G双特异性抗体的试剂盒，包括：环瓜氨酸肽包被微孔板、酶标抗原、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、底物液、洗涤液和终止液，其中所述酶标抗原为辣根过氧化物酶(HRP)标记的免疫球蛋白G。

所述环瓜氨酸肽(CCP)包被微孔板为市售产品或由市售的环瓜氨酸肽和合成的环瓜氨酸肽包被微孔板制成。

所述免疫球蛋白G为兔免疫球蛋白G或人免疫球蛋白G。

所述试剂盒中的样品稀释液为含1％明胶的磷酸盐缓冲液，洗涤液为含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液，底物液为3′，3′，5′，5′，-四甲基联苯胺(TMB)，所述终止液为0.5M硫酸。

所述阳性对照液为已确定双特异性抗体为阳性的类风湿关节炎患者血清，阴性对照液为健康人血清。

本发明还提供一种检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白G双特异性抗体的试剂盒，包括：免疫球蛋白G包被微孔板、酶标抗原、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、底物液、洗涤液和终止液，其中所述酶标抗原为辣根过氧化物酶标记的环瓜氨酸肽。

所述环瓜氨酸肽为市售产品或合成的环瓜氨酸肽。

所述免疫球蛋白G为兔免疫球蛋白G或人免疫球蛋白G。

所述试剂盒中的样品稀释液为含1％明胶的磷酸盐缓冲液，洗涤液为含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液，底物液为3′，3′，5′，5′，-四甲基联苯胺(TMB)，所述终止液为0.5M硫酸。

所述阳性对照液为已确定双特异性抗体为阳性的类风湿关节炎患者血清，阴性对照液为健康人血清。

本发明试剂盒中所述合成的环瓜氨酸肽(CCP)是按照现有技术中公开的CCP序列利用常规方法进行合成制备得到的。

利用本发明一个实施例所述的试剂盒检测抗CCP和抗IgG双特异性抗体的方法为：

(1)包被有CCP的微孔板捕获血清样本中具有CCP反应性的抗体；

(2)加入兔IgG-HRP检测具有抗CCP和抗IgG双特异性的抗体。

本发明人采用CCP包被微孔板作为固相抗原，经与血清样本温育后，加入HRP标记的兔IgG检测捕获的双特异性抗体。IgG的HRP标记反应采用过碘酸钠氧化法。其标记的原理为，HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化成醛基，醛基能与抗体分子上的氨基形成Schiff碱，加入硼氢化钠还原形成的Schiff碱便可得到稳定的酶标复合物。标记反应混合液经PBS透析除去小分子，浓缩至一定体积后于Sephacryl S-200层析柱上纯化，收集IgG-HRP组分，加入等体积的甘油，分装并储存于-20℃。用RF阳性血清对IgG-HRP进行棋盘滴定，确定的最佳稀释度用于双特异性抗体的测定。

利用本发明另一个实施例所述的试剂盒检测抗CCP和抗IgG双特异性抗体的方法为：

(1)包被有兔IgG的微孔板捕获血清样本中具有IgG反应性的抗体；

(2)加入CCP-HRP检测具有抗IgG和抗CCP双特异性的抗体。

本发明采用兔IgG包被微孔板作为固相抗原，经与血清样本温育后，加入HRP标记的CCP检测捕获的双特异性抗体。

本发明的优点：

目前，有关天然双特异性抗体的报道不多，而检测的方法也比较单一，主要是放射免疫测定。Schuurman等人首先将血清与抗原1(花粉)交联的Sepharose进行温育，然后加入碘标记的抗原2(尘螨)检测具有双特异性的抗体。这种检测模式虽然具备放射免疫测定的高度敏感性和特异性，但是由于用到了放射性元素，不仅需要特殊的仪器设备来检测放射性信号，而且还具有一定的生物危害性，不利于推广。如今，很多放射免疫测定方法在很大程度上已经被酶联免疫测定(ELISA)所取代，因为ELISA除了方法本身具有的敏感性和特异性之外，其操作简便，由酶促反应产生的颜色信号对环境没有任何污染威胁，从而更加适合广泛推行。本发明所描述的试剂盒的检测方法正是提供了一种简单易行的双特异性抗体检测模式，可以推广应用于各种双特性抗体的检测。

通过对RA患者血清和对照血清进行检测发现，抗CCP和抗IgG的双特异性抗体在类风湿关节炎患者中的检出率明显高于对照组(其他自身免疫病患者和健康人)，并具有统计学意义。因此，本发明人所发现的双特异性抗体可以看作是存在于RA患者血清中的一种新型指标。换言之，本发明人的发现开辟了类风湿关节炎血清学的一个新领域，为更进一步研究打下了基础。

附图说明

图1兔IgG-HRP洗脱图谱；

图2兔IgG-HRP棋盘滴定曲线；

图3双特异性抗体在类风湿关节炎血清和正常人血清中的分布图；图中RA表示类风湿关节炎患者血清，Non-RA表示其他自身免疫病患者血清，H表示健康人血清；

图4：混合血清的双特异性抗体测定和抗CCP抗体测定，其中虚线为CCP(+)血清与正常血清混合后的抗CCP测定结果。

具体实施方式

以下为实施例中涉及的主要材料和试剂：

IgG抗CCP ELISA试剂盒，EURO-DIAGNOSTICA Immunoscan

瑞士

兔免疫球蛋白G(IgG)，SIGMA，美国

辣根过氧化物酶(HRP)，SIGMA，美国

高碘酸钠(NaIO₄)，西陇化工，中国

硼氢化钠(NaBH₄)，天津福晨化学试剂，中国

无水乙酸钠，北京化学试剂公司，中国

冰醋酸，北京世纪红星化工，中国

Na₂HPO₄·12H₂O，北京化学试剂公司，中国

NaH₂PO₄·2H₂O，北京化学试剂公司，中国

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，北京化学试剂公司，中国

氯化钠，北京化学试剂公司，中国

氯化钾，北京化学试剂公司，中国

NaHCO₃，北京化学试剂公司，中国

Na₂CO₃，北京化学试剂公司，中国

SephacrylTM S-200，Pharmacia，瑞士

明胶，SIGMA，美国

层析柱(1.5×50cm)，Bio-Rad，美国

96孔酶标板，Costar，美国

吐温-20(Tween-20)，SIGMA，美国

蛋白分析仪，Eppendorf，德国

酶标仪，Labsystems，芬兰

标记反应的试剂配制

(1)0.01M，磷酸缓冲液PB(pH7.0)

7ml 0.01M Na₂HPO₄用6ml 0.01M NaH₂PO₄滴定至pH＝7.0。

(2)0.1M NaIO₄

 0.2139g NaIO₄溶解于10ml 0.01M，PB(pH7.0)，用前新鲜配制。

(3)1mM醋酸盐缓冲液(pH4.0)

0.2M醋酸：230μl冰醋酸用去离子水稀释至20ml；

0.2M醋酸钠：0.3281g无水醋酸钠溶解于20ml去离子水中；

5ml 0.2M醋酸用1.1ml 0.2M醋酸钠滴定至pH＝4.0，使用时进行200倍稀释即1mM醋酸盐缓冲液(pH4.0)。

(4)20mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)

0.02M Na₂CO₃∶0.0212g Na₂CO₃溶解于10ml去离子水中；

0.02M NaHCO₃∶0.0168g NaHCO₃溶解于10ml去离子水中；

用0.02M Na₂CO₃滴定一定体积的0.02M NaHCO₃至pH＝9.5。

(5)硼氢化钠溶液

用蒸馏水溶解NaBH₄，浓度为4mg/ml，用前新鲜配制。

(6)磷酸盐缓冲液(PBS)(0.01M，pH7.4)：

8g氯化钠，0.2g氯化钾，3.63g Na₂HPO₄·12H₂O，0.24g KH₂PO₄溶解于800ml去离子水，用盐酸调pH至7.4，加水至1000ml。

(7)样品稀释液：用PBS配制1％质量浓度的明胶溶液，明胶需加热溶解，用前须冷却。

(8)洗涤缓冲液(PBS-Tween-20，PBST)：1L PBS中加入500μl Tween-20，充分混匀。

(9)酶标稀释液：用洗涤缓冲液配制1％质量浓度的明胶溶液，加热溶解，用前冷却。

实施例1：兔IgG-HRP的制备

一、材料

1、兔免疫球蛋白G(IgG)：SIGMA，I5006-10mg，批号：017K7430，纯度≥95％。

2、辣根过氧化物酶：SIGMA，P8375-5KU，RZ＝3.1，批号：078K7675。

3、SephacrylTM S-200分子筛填料：Amersham Biosciences，批号：298473。

4、酶标板：96孔，Costar。

5、类风湿因子阳性血清。

6、包被缓冲液：50mmol/l碳酸盐缓冲液(pH9.5)，碳酸钠0.32g，碳酸氢钠0.58g，加水稀释至200ml。

二、方法

1、标记反应

(1)5.5mg辣根过氧化物酶充分溶解于1.32ml蒸馏水；

(2)向溶解的HRP溶液中逐滴加入0.1M NaIO₄，并不断搅拌，使HRP充分氧化，室温反应20分钟；

(3)透析袋处理

把透析袋剪成适当长度(10-20cm)的小段，在大体积的2％(W/V)碳酸氢钠和1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸10分钟。配EDTA：500ml水、0.146gEDTA，用NaOH调pH到8.0；500mlEDTA中加10gNaHCO₃。用蒸馏水彻底清洗透析袋。放在1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸10分钟。冷却后，存放于4度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋是必须戴手套。用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。

(4)将氧化好的HRP溶液装入准备好的透析袋内，于1mM醋酸盐缓冲液(pH4.0)中4℃透析过夜，期间换液2次；

(5)5.2mg兔IgG溶解于520μl 0.2M碳酸盐缓冲液(pH9.5)中(10mg/ml)；

(6)将HRP溶液从透析袋中回收并加入兔IgG溶液中，室温搅拌反应2小时；

(7)加入200μl新鲜配制的4mg/ml硼氢化钠溶液，4℃放置三小时，使刚形成的交联物稳定；

(8)将反应混合物于PBS中透析，除去小分子物质，以备纯化。

2.兔IgG-HRP的纯化

(1)层析柱的准备：倾去Sephacryl S-200上层20％乙醇储存液，加入与填料等体积的PBS，用玻璃棒轻轻搅动，沉降半小时后，再倾去上层溶液，此操作过程循环三次。层析柱洗净后，关闭下方阀门，并向内填充2ml PBS，然后将填料溶浆液沿玻璃棒一次性倾入层析柱内，让加入的填料在柱内自然沉降。待柱面积起1-2cm高的凝胶床后，打开阀门，随着柱内水的流出，上面不断加入凝胶液，使形成的凝胶床面上有凝胶连续下降。最终柱床体积为79.5ml，柱高45厘米。

(2)上样：层析柱用PBS平衡后，用吸管吸掉柱面上缓冲液，露出床面，然后将透析好的交联物(约2ml)轻轻加入到床面上。打开阀门，待交联物溶液完全渗入柱床后，关闭阀门，加入PBS进行洗脱。

(3)洗脱：洗脱速度为0.5ml/min，每管1ml，共收集25管，收集液均于280nm处测定吸光度值。

(4)挑选交联物集中的收集管，将管内溶液进行合并，加入50％的甘油，分装并储存于-20℃。

3.兔IgG-HRP最佳使用浓度的确定

(1)将66分类风湿关节炎血清分别用包被缓冲液进行1∶101倍稀释后包被于酶标微孔板内，然后用1∶100倍稀释的兔IgG-HRP进行检测，以此粗略筛选类风湿因子阳性样本用于棋盘滴定。

(2)棋盘滴定

类风湿因子阳性血清用包被缓冲液稀释成5个浓度，即1∶10²，1∶10³，1∶10⁴，1∶10⁵，1∶10⁶，每孔100μl包被酶标板的5列，第6列不加入血清而仅以包被液代替作为空白列。4℃放置过夜。

次日，酶标板用PBST洗涤3次，拍干。

每孔加入200μl 1％明胶/PBS，37℃封闭1小时。

PBST洗涤3次，拍干。

兔IgG-HRP用酶标稀释液稀释成7个浓度，从1∶50开始作系列倍比稀释，每孔100μl包被酶标板的7行，第8行作为空白行，以稀释液代替。37℃温育1小时。

PBST洗涤5次，拍干。

加入HRP底物液，37℃显色15min。

加入终止液终止显色反应。

于450nm波长处(以620nm为参考波长)读取各孔吸光度值。

三、结果

1、兔IgG-HRP的纯化

兔IgG和HRP进行标记反应后，用分子筛进行纯化，将兔IgG-HRP交联物与未交联的单体或多聚体进行分离。洗脱图谱见图1。图中的主峰为兔IgG-HRP交联物，滞后的小峰应为未进行交联的HRP单体。收集主峰中的第7、8、9管溶液，合并，与等体积的甘油混合，分装储存于-20℃。

2、棋盘滴定确定兔IgG-HRP的最佳使用浓度

表1：棋盘滴定结果(OD450/620)

表中的列为血清稀释度，行为兔IgG-HRP的稀释度。

滴定曲线见图2，横坐标为血清稀释度(1-4分别为102、103、104和105，106测定值减去背景值后出现负值，在此省略)，纵坐标为450nm处的吸光度值。图中显示，兔IgG-HRP进行1∶400稀释时，滴定曲线较陡，并且背景吸光度值亦较低，因此，选定1∶400为兔IgG-HRP的最佳稀释度，进行下述双特异性抗体的检测。

实施例2：检测抗环瓜氨酸肽(CCP)和抗兔IgG双特异性抗体的试剂盒

一.试剂盒组成

1.环瓜氨酸肽包被微孔板：来源IgG抗CCP ELISA试剂盒，EURO-DIAGNOSTICAImmunoscan

瑞士；

2.酶标抗原：辣根过氧化物酶标记的兔免疫球蛋白G，来源实施例1制备得到的兔IgG-HRP；

3.样品稀释液：含1％明胶的PBS溶液；(用PBS配制1％质量浓度的明胶溶液，明胶需加热溶解，用前须冷却)

4.洗涤液(PBST)：含0.05％吐温-20的PBS溶液；(1L PBS中加入500μl Tween-20，充分混匀)

5.底物液：3′，3′，5′，5′，-四甲基联苯胺(TMB)；

6.阳性对照液：已确定双特异性抗体为阳性的类风湿关节炎患者血清；

7.阴性对照液：健康人血清；

8.终止液：0.5M硫酸。

实施例3：检测抗环瓜氨酸肽(CCP)和抗兔IgG双特异性抗体的试剂盒

一.试剂盒组成

1.环瓜氨酸肽包被微孔板：合成的环瓜氨酸肽包被微孔板；

依照文献Schellekens GA，Visser H，de Jong BA，et al.The diagnostic properties ofrheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide(类风湿关节炎中识别环瓜氨酸肽抗体的诊断性能).Arthritis Rheum 2000；43：155-63.中公开的CCP序列合成CCP，经反相高效液相色谱纯化后纯度应达到95％以上，经氨基酸测序和质谱分析确认合成多肽序列的正确性。

序列共包含21个氨基酸：cfc1-cyc：

其中，X代表瓜氨酸，序列中的两个半胱氨酸(C)进行环化。

2.酶标抗原：辣根过氧化物酶标记的兔免疫球蛋白G，来源实施例1制备得到的兔IgG-HRP；

3.样品稀释液：含1％明胶的PBS溶液；(用PBS配制1％质量浓度的明胶溶液，明胶需加热溶解，用前须冷却)

4.洗涤液：含0.05％吐温-20的PBS溶液；(1L PBS中加入500μl Tween-20，充分混匀)

5.底物液：3′，3′，5′，5′，-四甲基联苯胺(TMB)；

6.阳性对照液：已确定双特异性抗体为阳性的类风湿关节炎患者血清；

7.阴性对照液：健康人血清；

8.终止液：0.5M硫酸。

二.CCP包被微孔板制备的条件及方法：

A：微孔板：MaxiSorp微量滴定板(Nunc，Roskilde，Denmark)；

B：包被缓冲液：0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)，pH7.4(8g氯化钠，3.63g十二水合磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，0.24g磷酸二氢钾，溶解于800ml蒸馏水中，用盐酸调pH至7.4，加蒸馏水至1000ml)；

C：CCP多肽包被浓度：10μg/ml；

D：包被条件：4℃过夜；

包被：每个微孔加入100μl浓度为10μg/ml的CCP溶液，4℃包被过夜；

封闭：1％明胶/PBS(100ml PBS溶解1g明胶)，每孔200μl，37℃温育2小时。

实施例4：检测抗环瓜氨酸肽(CCP)和抗兔IgG双特异性抗体的试剂盒

一.试剂盒组成

1.兔IgG包被微孔板

2.酶标抗原：辣根过氧化物酶标记的CCP，制备方法同兔IgG-HRP；

3.样品稀释液：含1％明胶的PBS溶液；(用PBS配制1％质量浓度的明胶溶液，明胶需加热溶解，用前须冷却)

4.洗涤液：含0.05％吐温-20的PBS溶液；(1L PBS中加入500μl Tween-20，充分混匀)

5.底物液：3′，3′，5′，5′，-四甲基联苯胺(TMB)；

6.阳性对照液：已确定双特异性抗体为阳性的类风湿关节炎患者血清；

7.阴性对照液：健康人血清；

8.终止液：0.5M硫酸。

二、兔IgG包被微孔板制备的条件及方法

A：微孔板：MaxiSorp微量滴定板(Nunc，Roskilde，Denmark)；

B：包被缓冲液：0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6(0.159g无水碳酸钠，0.293g碳酸氢钠溶解于100ml去离子水中)；

C：包被浓度：5μg/ml；

D：包被条件：4℃过夜；

包被：每个微孔加入100μl浓度为5μg/ml的兔IgG溶液，4℃包被过夜；

封闭：1％明胶/PBS(100ml PBS溶解1g明胶)，每孔200μl，37℃温育2小时。

实施例5：抗环瓜氨酸肽(CCP)和抗兔IgG双特异性抗体的检测

一.材料

1.实施例2所述的试剂盒

2.血清：66份类风湿关节炎血清，37例系统性红斑狼疮患者血清，16例原发性干燥综合症患者血清，9例硬皮病患者血清和50例健康人血清。分析前均储存于-80℃。

二.方法

1.双抗原夹心法检测抗CCP和兔IgG的双特异性抗体

(1)测定前，所有材料和试剂均平衡至室温。

(2)用样品稀释液将血清进行1∶50倍稀释，充分混匀。

(3)用加样枪吸取100μl稀释的血清加入到试剂盒提供的CCP包被微孔板中，每个样本均做复孔，室温温育1小时；

(4)PBST洗涤3次，拍干。

(5)兔IgG-HRP用酶标稀释液(含1％明胶的PBST)进行1∶400稀释，充分混匀，每个检测孔加入100μl。室温温育1小时。

(6)PBST洗涤5次，拍干。

(7)每孔加入100μl底物液，室温显色30分钟。

(8)每孔加入50μl终止液终止反应。

(9)读数：用双波长450nm/620nm测定各孔OD值。

2.双特异性抗体假阳性的排除

类风湿因子是针对免疫球蛋白G(IgG)Fc段的抗体，兔IgG是类风湿因子良好的候选抗原。在上述的双特异性抗体测定中，有两种可能性造成假阳性结果：其一为类风湿因子可以与捕获于微孔板的IgG抗CCP抗体结合而形成免疫复合物；另一个可能性为类风湿因子与抗CCP形成了多聚体。为了排除这两种可能性，我们筛选出抗CCP抗体阳性，但类风湿因子和双特异性抗体阴性(记为CCP(+))和类风湿因子阳性，但抗CCP和双特异性抗体阴性(记为RF(+))的两种血清，并进行混合后的双特异性抗体测定。

(1)血清的稀释：CCP(+)血清进行1∶25倍稀释，RF(+)从1∶25开始进行倍比稀释，共6个梯度。正常人血清进行1∶25倍稀释作为对照。

(2)血清的混合：1∶25稀释的CCP(+)血清分别与等体积不同稀释度的RF(+)血清及正常人血清混合，于旋涡振荡器上充分混匀。

(3)混合血清分别进行双特异性抗体和IgG抗CCP抗体的测定。

(4)双特异性抗体的测定同上。

(5)IgG抗CCP的测定按照IgG抗CCP ELISA试剂盒的说明书进行。

3.临界值(cut-off值)的确定

采用测定样本对阴性比值(Test to Negative Ratio，TNR)的方法设定cut-off值，以正常人血清OD均值的3倍作为阳性判定值。

三.结果

1.双特异性抗体测定

该测定中，以包被于微孔板上的CCP为固相抗原，HRP标记的兔IgG为检测抗原，检测类风湿关节炎血清中天然的抗CCP和兔IgG双特异性抗体。其他自身免疫病血清(Non-RA)和正常人血清(H)作为对照。检测结果见图3。图中结果显示，与对照血清相比较，我们所检测的双特异性抗体特异分布于类风湿关节炎患者血清(RA)中。

2.双特异性抗体假阳性的排除

混合血清进行双特异性抗体和IgG抗CCP抗体的检测结果如图4所示。图中虚线为CCP(+)血清与正常血清混合后的抗CCP测定结果。图中的曲线显示，CCP(+)血清与RF(+)血清混合后，能够检出高滴度的双特异性抗体。并且，随着RF(+)血清稀释度的增加，双特异抗体呈现下降的趋势。但是这种双特异性抗体并非由类风湿因子与抗CCP形成复合物或多聚体所造成的假阳性，因为CCP(+)血清与不同稀释度的RF(+)血清混合后，抗CCP抗体的检测结果基本保持不变。如果类风湿因子与抗CCP形成复合物或多聚体，势必会影响抗CCP抗体的检测。由此，我们所检测的双特异性抗体得到了验证。

3.临界值的确定

样本OD/0.099≥3.1判定为阳性，否则为阴性。

Claims (10)

1.一种检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白G双特异性抗体的试剂盒，其特征在于，包括：环瓜氨酸肽包被微孔板、酶标抗原、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、底物液、洗涤液和终止液，其中所述酶标抗原为辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G。

2.根据权利要求1所述的检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白G双特异性抗体的试剂盒，其特征在于，所述环瓜氨酸肽包被微孔板为市售产品或由市售的环瓜氨酸肽包被微孔板制成。

3.根据权利要求1所述的检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白G双特异性抗体的试剂盒，其特征在于，所述环瓜氨酸肽包被微孔板为合成的环瓜氨酸肽包被微孔板制成。

4.一种检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白G双特异性抗体的试剂盒，其特征在于，包括：免疫球蛋白G包被微孔板、酶标抗原、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、底物液、洗涤液和终止液，其中所述酶标抗原为辣根过氧化物酶标记的环瓜氨酸肽。

5.根据权利要求4所述的检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白G双特异性抗体的试剂盒，其特征在于，所述环瓜氨酸肽为市售产品。

6.根据权利要求4所述的检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白G双特异性抗体的试剂盒，其特征在于，所述环瓜氨酸肽为合成的环瓜氨酸肽。

7.根据权利要求1或4所述的检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白G双特异性抗体的试剂盒，其特征在于，所述免疫球蛋白G为兔免疫球蛋白G或人免疫球蛋白G。

8.根据权利要求1或4所述的检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白G双特异性抗体的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含1％明胶的磷酸盐缓冲液，洗涤液为含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液，底物液为3′，3′，5′，5′，-四甲基联苯胺，终止液为0.5M硫酸。

9.根据权利要求1或4所述的检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白G双特异性抗体的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照液为已确定双特异性抗体为阳性的类风湿关节炎患者血清，阴性对照液为健康人血清。

10.权利要求1-9中任一权利要求所述的检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白G双特异性抗体的试剂盒在检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白G双特异性抗体中的应用。

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