CN1712964A

CN1712964A - 类风湿性关节炎特异性抗原性标志物及其应用

Info

Publication number: CN1712964A
Application number: CN 200510044046
Authority: CN
Inventors: 常晓天; 朱有名; 韩金祥
Original assignee: Shandong Provincial Pharmaceutical Biological Tech Research Center
Current assignee: Shandong Provincial Pharmaceutical Biological Tech Research Center
Priority date: 2005-07-18
Filing date: 2005-07-18
Publication date: 2005-12-28

Abstract

本发明公开了一种类风湿性关节炎特异性抗原性标志物——瓜氨酸化纤维连接蛋白，所述瓜氨酸化纤维连接蛋白特异地存在于类风湿关节炎病人的血浆和关节滑膜组织中。本发明还公开了所述类风湿性关节炎特异性抗原性标志物在制备检测类风湿性关节炎的临床诊断试剂和治疗类风湿性关节炎药物中的应用。本发明所述的瓜氨酸化纤维连接蛋白的特异性远远超过传统的类风湿性关节炎相关指标——类风湿因子，对及时有效诊断类风湿性关节炎病和制备其临床诊断试剂及治疗药物具有非常重要的意义，有着很好的推广和应用价值。

Description

类风湿性关节炎特异性抗原性标志物及其应用

技术领域

本发明涉及一种类风湿性关节炎标志物及其应用，尤其涉及一种类风湿性关节炎特异性抗原性标志物及其应用。

技术背景

类风湿性关节炎为一种慢性多发性关节炎，华人的发病率为千分之五。该疾病表现为关节肿痛，晚期时关节组织受到严重破坏，关节功能丧失。据报道中国每年新增类风湿性关节炎病例400万左右。同其它自身免疫疾病一样，目前仍无十分有效的针对性治疗，其病理机制也不清楚。类风湿性关节炎是一种自我免疫疾病。到目前为止，临床上都是通过检测病人血液中各种各样自我免疫抗体(类风湿因子，抗角蛋白微丝蛋白抗体，抗角蛋白抗体，抗核周因子和抗环瓜氨酸抗体)的水平来诊断类风湿性关节炎，而自我免疫抗体的产生往往是非特异的。例如，类风湿因子也存在于全身性红斑性狼疮、干燥症、硬皮症和皮肌炎等病人的血液中，并经常出现于其它许多慢性炎症病人血液中，包括慢性肝炎、肿瘤、结核病、亚急性细菌性心内膜炎等。因此，新的类风湿性关节炎特异标志物，尤其是抗原性标志物的研究与开发以及对其进行快速检测，将是及时有效诊断该病和制备其临床诊断试剂及治疗药物的重要发展方向。

发明内容

针对现有技术中，用类风湿因子诊断类风湿性关节炎存在有非特异性的缺陷，本发明的目的是提供一种类风湿性关节炎特异性抗原性标志物及其应用，利用该标志物的检测，可以快速、方便地实现类风湿性关节炎的准确诊断。

本发明的类风湿性关节炎特异性抗原性标志物，由瓜氨酸化纤维连接蛋白组成，即为瓜氨酸化纤维连接蛋白。

上述瓜氨酸化纤维连接蛋白是特指在肽基精氨酸脱亚胺酶及钙离子存在下，将多肽链中的精氨酸催化成瓜氨酸的纤维连接蛋白，即被瓜氨酸化的纤维连接蛋白。

上述瓜氨酸化纤维连接蛋白特异地存在于类风湿关节炎病人的血浆和关节滑膜组织中。

确定上述类风湿性关节炎特异性抗原性标志物的机理与实验证据：

肽基精氨酸脱亚胺酶(Peptidylarginine deiminase，PAD)是在人体组织中一种酶，目前，共发现了五种PAD酶(即PAD1、2、3、4和6)。它可以在钙离子存在的情况下对其它一些组织蛋白进行后翻译修饰(post-translational modification)。这个酶可将多肽链中的精氨酸(arginine)的氨基催化成羰基，从而使精氨酸转化成瓜氨酸(citrulline)。这个由PAD催化的多肽中精氨酸转化成瓜氨酸的过程被称做瓜氨酸化(citrullination)。申请人最新研究发现：PAD4酶在类风湿关节炎关节滑膜组织中有着广泛的表达，同时滑膜组织中的纤维连接蛋白已被瓜氨酸化；并且在对类风湿关节炎病人，全身性红斑性狼疮病人，正常人的血浆进行的进一步的检测后发现，类风湿关节炎病人血浆中的纤维连接蛋白(fibronectin)也呈现明显瓜氨酸化(见图1)，这与类风湿关节炎滑膜腔中存在的大量的PAD4酶不无关联，而且这种瓜氨酸化纤维连接蛋白在类风湿关节炎病人的关节炎滑膜组织和血液中具有高度的特异表达和存在，对比结果非常显著，其特异性远远超过传统的类风湿性关节炎相关指标——类风湿因子，用组织免疫化学和Western blot验证，也证实了此项结果(见图2，图3)，因此，瓜氨酸化纤维连接蛋白可以确定为一种新的类风湿性关节炎特异性抗原性标志物。

上述研究也表明瓜氨酸化后的纤维连接蛋白可以增强与细胞表皮生长因子(VEGF)结合，但降低了与整合素(integrin)的结合活性，并丧失了对细胞凋亡的抑制。纤维连接蛋白的这些变化都可能导致关节炎滑膜组织异常的细胞增殖(cellproliferation)和毛细血管增生(angiogenesis)，因为与纤维连接蛋白结合的细胞表皮生长因子和游离的整合素已被证明能够更强地刺激血管内皮细胞和干细胞的增生和分化以及抑制细胞凋亡。而异常的细胞增生和小血管增生和过低的细胞凋亡正是类风湿关节炎病关节滑膜组织的特征。经细胞免疫化学和三明治酶联免疫方法(SandwichELISA)证明瓜氨酸化的纤维连接蛋白特异地存在于类风湿关节炎病人的血浆中。这种瓜氨酸化的细胞纤维连接蛋白可能产生于含有大量PAD4酶的类风湿关节炎滑膜腔。

上述类风湿性关节炎特异性抗原性标志物在制备检测类风湿性关节炎的临床诊断试剂中的应用。

上述类风湿性关节炎特异性抗原性标志物在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。

根据本发明提出的类风湿性关节炎特异性抗原性标志物——瓜氨酸化纤维连接蛋白及相关病理和药物机理，药厂可以迅速地开发出试剂盒用于诊断类风湿性关节炎。Sandwich ELISA法是一种非常灵敏和快速的检测和测定样品中微量成分的方法。临床上Sandwich ELISA法经常用于检测病人血清或血浆中的成分变化，以判断疾病类型和病况。药厂往往根据某种疾病的特异成分开发出由抗体交联的平板和第二抗体简单组成的试剂盒，为医院提供方便、快捷、灵敏的检测手段。

以Sandwich ELISA法为基础，本发明提出的类风湿性关节炎特异性抗原性标志物——瓜氨酸化纤维连接蛋白的检测方法也同样可以快速实现，其整个过程只需要一个纤维连接蛋白单克隆抗体和一个碱性磷酸酶标记的抗瓜氨酸的多克隆抗体以及一块ELISA平板，所述两个抗体许多药厂都出售，因此，利用本发明提出的类风湿性关节炎特异性抗原性标志物——瓜氨酸化纤维连接蛋白在制备检测类风湿性关节炎的临床诊断试剂中具有很好的实用价值和广阔的发展前景，极易于推广使用。

下面以本发明提出的瓜氨酸化纤维连接蛋白为类风湿性关节炎特异性抗原性标志物提供几个可以用于临床检测瓜氨酸化纤维连接蛋白的检测试剂盒：

A.瓜氨酸化纤维连接蛋白的检测试剂盒，包括抗纤维连接蛋白抗体预包被的载体、标记好的抗瓜氨酸抗体以及相关的样品稀释液、洗液、显色剂、终止液。

其中，上述抗纤维连接蛋白抗体预包被的载体是指将抗纤维连接蛋白抗体以缓冲液稀释5～150ug/ml，常规包被的酶标板、酶标条、微球或薄膜。

其中，上述标记好的抗瓜氨酸抗体是指以常规方法经酶标记、荧光素标记、同位素标记、金标记或化学发光物质标记的抗瓜氨酸抗体。

B.瓜氨酸化纤维连接蛋白的检测试剂盒，包括由抗纤维连接蛋白抗体或抗瓜氨酸化抗体点标在硝酸纤维素膜上，以常规方法制成的渗滤板，和以胶体金标记的抗瓜氨酸抗体以及洗液。

C.瓜氨酸化纤维连接蛋白的检测试剂盒，包括以抗纤维连接蛋白抗体或抗瓜氨酸化抗体按比例稀释划线于硝酸纤维素膜上，由常规方法制成的快速检测瓜氨酸化纤维连接蛋白用金标试纸条。

另外，研究发现瓜氨酸化后的纤维连接蛋白可能是通过改变与表皮生长因子和整合素的结合活性以及对细胞凋亡的抑制导致类风湿性关节炎。此项发现揭示了该病可能的发病机制，对关节炎治疗药物的设计与制备提供了新的思路。

附图说明

图1.Sandwich ELISA法检测血浆中瓜氨酸化的纤维连接蛋白。

光吸收值(O.D.)代表样品中瓜氨酸化纤维连接蛋白浓度。结果表明类风湿关节炎患者血浆中瓜氨酸化纤维连接蛋白的含量明显高于健康组和红斑性狼疮组瓜氨酸化纤维连接蛋白的含量。

图2.瓜氨酸化纤维连接蛋白在类风湿性关节炎滑膜组织中的表达。

用组织免疫化学的方法，抗纤维连接蛋白抗体和抗瓜氨酸化蛋白抗体分别在类风湿性关节炎滑膜组织的连续切片(A1，A2和B1，B2)上探测到两种蛋白的共表达，说明病变组织的纤维连接蛋白呈瓜氨酸化。但在骨性关节炎滑膜组织里(C1，C2)，没观察到明显的细胞外纤维连接蛋白的存在。

图3.Western blot的方法证明只有类风湿性关节炎滑膜组织才特异地表达瓜氨酸化纤维连接蛋白。

用免疫沉淀法从类风湿性关节炎滑膜组织(1)和骨性关节炎滑膜组织(2)中提取的纤维连接蛋白经SDS-PAGE电泳后被转印在PVDF膜上。与抗瓜氨酸化蛋白抗体杂交后，只有类风湿性关节炎滑膜组织中的纤维连接蛋白呈现正信号(230，105，80，70和45kDa.)，说明只有该组织含有瓜氨酸化的纤维连接蛋白。

具体实施方式

实施例1：测定病人血中瓜氨酸化的纤维连接蛋白

(1)血浆制备.

用含终浓度为3.8％柠檬酸钠(sodium citrate)的血液收集管收集类风湿关节炎病人，全身性红斑性狼疮病人，正常人的新鲜血液。在1000X g下离心30分钟。收集上清液。血浆可在-80℃下保存。

(2)溶液准备

PBS缓冲液配方为：8g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.15g/L NaHPO₄和0.2g/L KH2PO₄，pH7.5；

PBS-Tween洗脱液：按1∶1000比例将Tween 20加入PBS缓冲液配制，搅拌混匀。

(3)步骤：

A.用0.05M、pH9.6碳酸/重碳酸(carbonate-bicarbonate)缓冲液稀释抗纤维蛋白单克隆抗体(Abcam公司产品)4000倍，滴加100ul抗体溶液于96孔ELISA反应平板的样品孔中，将平板置于4℃下，12小时，使抗体与平板交联；

B.用PBS-Tween清洗ELISA反应平板3次，洗去未交联的抗体；

C.滴加100ul用PBS缓冲液配制的重量百分比为5％脱脂奶粉于ELISA反应平板的样品孔中，室温下反应2小时，以阻止非特异性蛋白粘连到已交联的抗体上；

D.用PBS-Tween洗ELISA反应平板3次，洗去上述多余的脱脂奶粉；

E.用PBS缓冲液稀释样品血浆4000倍，滴加100ul的上述样品于ELISA反应平板样品孔中，将平板置于置37℃下，反应2小时，使血浆中的纤维连接蛋白与平板上的抗体交联；

F.用PBS-Tween洗ELISA反应平板3次，洗去未交联的蛋白；

G.用上述5％脱脂奶粉稀释兔抗瓜氨酸抗体(Biogenesis公司产品)5000倍，滴加100ul的抗体于ELISA反应平板样品孔中，所述抗体已事先被标记上碱性磷酸酶(APlabeling kit，Roche生产)，将平板置于置37℃下反应2小时，使抗瓜氨酸抗体与平板上已吸附的瓜氨酸化纤维连接蛋白交联；

H.用PBS-Tween洗ELISA反应平板3次，洗去未交联的抗体；

I.滴加100ul含碱性磷酸酶底物试剂A1kaline phosphatase yellow(Sigma产品)，使平板上吸附的抗瓜氨酸抗体显色，室温下，显色反应30分钟，直到反应颜色显著为止；

J.用分光光度计在405纳米下检测光吸收值，光吸收值结果代表样品中瓜氨酸化纤维连接蛋白的浓度；结果表明瓜氨酸化的纤维连接蛋白只存在于类风湿关节炎病人的血中(见图1)。

实施例2：测定病人血中瓜氨酸化的纤维连接蛋白

(1)血浆制备.

用含终浓度为3.8％柠檬酸钠(sodium citrate)的血液收集管收集类风湿关节炎病人，全身性红斑性狼疮病人，正常人的新鲜血液。在8000X g下离心30分钟。收集上清液。血浆可在-80℃下保存。

(2)溶液准备

PBS缓冲液配方为：8g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.15g/L NaHPO₄和0.2g/L KH2PO₄，pH7.6；

(3)步骤：

A.用0.05M、pH9.6碳酸/重碳酸(carbonate-bicarbonate)缓冲液稀释抗纤维蛋白单克隆抗体(Abcam公司产品)3000倍，滴加100ul抗体溶液于96孔ELISA反应平板的样品孔中，将平板置于4℃下，10～12小时，使抗体与平板交联；

B.用PBS-Tween清洗ELISA反应平板5次，洗去未交联的抗体；

C.滴加100ul用PBS缓冲液配制的重量百分比为5％脱脂奶粉于ELISA反应平板的样品孔中，室温下反应1小时，以阻止非特异性蛋白粘连到已交联的抗体上；

D.用PBS-Tween洗ELISA反应平板3次，洗去上述多余的脱脂奶粉；

E.用PBS缓冲液稀释样品血浆5000倍，滴加100ul的上述样品于ELISA反应平板样品孔中，将平板置于置34℃下，反应3小时，使血浆中的纤维连接蛋白与平板上的抗体交联；

F.用PBS-Tween洗ELISA反应平板4次，洗去未交联的蛋白；

G.用上述5％脱脂奶粉稀释兔抗瓜氨酸抗体(Biogenesis公司产品)4000倍，滴加100ul的抗体于ELISA反应平板样品孔中，所述抗体已事先被标记上碱性磷酸酶(APlabeling kit，Roche生产)，将平板置于置35℃下反应1.5小时，使抗瓜氨酸抗体与平板上已吸附的瓜氨酸化纤维连接蛋白交联；

H.用PBS-Tween洗ELISA反应平板4次，洗去未交联的抗体；

I.滴加100ul含碱性磷酸酶底物试剂Alkaline phosphatase yellow(Sigma产品)，使平板上吸附的抗瓜氨酸抗体显色，室温下，显色反应40分钟，直到反应颜色显著为止；

实施例3：试剂盒组成

1.抗纤维连接蛋白预包被酶标板(条)

取抗纤维连接蛋白抗体按1∶3000的比例，用PH9.6碳酸盐缓冲液稀释后，每孔加100ul，置室温4小时后，用含0.05％Tween-20PBS洗涤3遍后，每孔加200ul2％BSA置37℃2小时，扣干后，吹干，于锡铂袋中真空封上，4℃保存。

2.抗瓜氨酸抗体，用辣根过氧化物酶常规标记。

3.品稀释液：含2％BSA、PBS。

4.涤液：含0.05％Tween-20PBS。

5.显色剂：0.4％TMB。

6.终止液：2％H₂SO₄。

实施例4：检测应用：

1.取所需用量的预包被板(条)，将待检血浆用样品稀释液4000稀释后，每孔加100ul，置37℃1小时；

2.用洗涤液洗5遍；

3.每孔加酶标抗瓜氨酸抗体100ul，37℃1小时；

4.用洗涤液洗5遍；

5.每孔加显色剂100ul，37℃15分钟；

6.每孔加终止液50ul，于酶标仪405nm处测各孔的吸光度值；

7.根据各孔吸光度值大小，与对照孔吸光度值比较，计算结果。

实施例5：用免疫组织法检测类风湿关节炎滑膜组织瓜氨酸化纤维连接蛋白

1.将0.3立方厘米左右关节炎滑膜于10％的福尔马林缓冲液(buffered formalin)固定12小时。固定后的组织块按着标准程序进行脱水，包埋并制10微米厚的石蜡切片。

2.将载有石蜡切片的载玻片按着标准程序在二甲苯和酒精中脱蜡，复水，并暂停于蒸馏水中。

3.将组织切片置于95℃度的柠檬酸缓冲液处理品15分钟.然后将载有切片的柠檬酸缓冲液转移到常温下再冷却15分钟.柠檬酸缓冲液可以大大增强蛋白的组织抗原性。

4.将组织切片重新置于蒸馏水中水浸泡两次，每次3分钟。

5.将组织切片置于PBS缓冲液中浸泡两次，每次5分钟。

6.用PBS缓冲液配制的3％脱脂奶粉稀释抗纤维连接蛋白抗体(Abcam公司产品)和抗瓜氨酸化蛋白抗体(Upstate公司产品)。将适当浓度的抗体滴加在组织切片上。在4℃度下执行抗原抗体反应12小时。

7.将组织切片置于PBS缓冲液中浸泡3次，每次5分钟。

8.用以上脱脂奶粉稀释磷酸化酶标记的第二抗鼠或兔IgG抗体(例如Zemed公司产品)。将适当浓度的抗体滴在加组织切片上。在室温下反应进行1小时。

9.将组织切片置于PBS缓冲液中浸泡3次，每次5分钟。

10.用适当的发色剂处理组织切片，显示靶蛋白的位置。

11.用苏木精染色剂对组织切片进行对比染色。

12.脱水，封片。

13.镜检。

结果表明：瓜氨酸化的纤维连接蛋白只存在于类风湿关节炎病人的滑膜组织中(见图2)。

实施例6：用免疫沉淀法和Western blot法证明瓜氨酸化纤维连接蛋白特异地存在于类风湿性关节炎滑膜组中

(1)从滑膜组织中提取纤维连接蛋白

A.将关节置换手术中获得的类风湿性关节炎滑膜组织和骨性关节炎滑膜组织按常规方法匀浆，提取组织总蛋白。

B.向组织总蛋白中加入5ug抗纤维连接蛋白抗体(Abcam公司产品)。在4℃下进行抗体抗原联结反应12小时。

C.向上述反应中加入常规量的蛋白G沉淀珠(Immunoprecipitation kit，Sigma公司产品)。在4℃进行反应2小时，让蛋白G沉淀珠与纤维连接蛋白抗原抗体附合物结合。

D.15000转/分离心30分钟，将纤维连接蛋白抗原抗体附合物沉淀下来。用试剂盒提供的清洗缓冲液清洗3次，然后用1X Laemmli溶液将分离的纤维连接蛋白溶出。

(2)用抗瓜氨酸化蛋白抗体(Upstate公司产品)按常规对提取的纤维连接蛋白进行Western blot分析。

结果表明，只有从类风湿性关节炎滑膜组织提取的纤维连接蛋白呈现瓜氨酸化反应(见图3)。

类风湿性关节炎滑膜组织中特异存在的瓜氨酸化纤维连接蛋白分子量为230，105，80，70和45千道尔顿。

Claims

1.一种类风湿性关节炎特异性抗原性标志物，由瓜氨酸化纤维连接蛋白组成。

2.如权利要求1所述的类风湿性关节炎特异性抗原性标志物，其特征是，所述瓜氨酸化纤维连接蛋白是指在肽基精氨酸脱亚胺酶及钙离子存在下，将多肽链中的精氨酸催化成瓜氨酸的纤维连接蛋白，即被瓜氨酸化的纤维连接蛋白。

3.如权利要求1或2所述的类风湿性关节炎特异性抗原性标志物，其特征是，所述瓜氨酸化纤维连接蛋白特异地存在于类风湿关节炎病人的血浆和关节滑膜组织中。

4.权利要求1所述类风湿性关节炎特异性抗原性标志物在制备检测类风湿性关节炎的临床诊断试剂中的应用。

5.权利要求1所述类风湿性关节炎特异性抗原性标志物在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。