CN102023219B

CN102023219B - 胶体金侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物

Info

Publication number: CN102023219B
Application number: CN 200910196059
Authority: CN
Inventors: 朱绍荣
Original assignee: Shanghai Rongsheng Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shanghai Rongsheng Biological Pharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2009-09-22
Filing date: 2009-09-22
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2029-09-22
Also published as: CN102023219A

Abstract

一种胶体金侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物，包括CCP肽组合物、高分子聚合物和侧向层析检测介质，高分子聚合物通过共价或非共价形式结合于侧向层析检测介质上。其中，CCP肽组合物包含CCP肽I和CCP肽II，且与高分子聚合物共价或非共价结合，所述CCP肽I与所述CCP肽组合物的摩尔比比值为0-1。该组合物不仅能够在15分钟内实现类风湿关节炎免疫抗体的快速体外检测，而且便于患者自助诊断，并为及时了解病情发展提供参考。

Description

胶体金侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物

技术领域

本发明涉及一种检测类风湿关节炎抗体的组合物，尤其涉及一种胶体金侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物，实现对类风湿关节炎免疫抗体的快速、准确检测。

背景技术

临床上自身免疫疾病主要有系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征、皮肌炎、多发性肌炎、系统(多发)性硬化症、硬皮病等，这些疾病曾被命名为“结缔组织病”，后来国外和国内均将它们归为风湿性疾病。

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种较常见的以慢性多关节炎症为主要表现的系统性自身免疫疾病，其病程长，多反复，且会造成组织不可逆的损伤，而给患者造成很大痛苦。该病的发病率在世界范围内为0.5-1％，中国的发病率约为0.36％。患者发病年龄多在20～50岁，女性多于男性，男女之比为1∶3。最近流行病学统计，类风湿关节炎有逐年增加的趋势，其突出的早期临床表现为对称性关节红肿热痛、常见四肢小关节、指间近端关节肿胀、掌指、腕、肘和踝等关节肿痛及活动困难、晨间关节僵硬、午后逐渐减轻、关节外症状约有20％患者可出现皮下结节；长久不愈的晚期症状则有不同程度的关节畸形和强直，以及关节功能丧失等现象，还会损伤脏器和多组织器官，造成骨头缺血性坏死，对人体消耗大，致残率高。

类风湿关节炎的病因至今尚不十分清楚，且早期临床表现也不典型。在国内外临床实践中，该疾病的常用诊断工具是美国风湿学学会(American College of Rheumatology，ACR)在1987年制定的类风湿分类标准(Arthritis Rheum 1988，31，315-324)，该标准更依赖于类风湿关节炎所表现出的临床病症。但是，在该疾病早期，这些临床指标通常是不易操作的。因此，目前普遍认为这一标准不能较好适应于早期类风湿关节炎的诊断(Arthritis Rheum 2001，44，2485-91；Neth J Med 2002，60，383-388)。而目前使用的治疗类风湿关节炎的方法主要是采用消炎方法，这种方法虽能使得关节肿胀(swelling)和侵蚀(erosive)的程度得以减慢，却无法使疾病得到治愈。当前人们共同的观点认为，在该疾病早期采用多种方法治疗能得到最佳的治疗效果(Autoimmunity Reviews 2006，6，37-41)。由此，具有高专一性(Specificity)和高灵敏度(Sensitivity)的血清学检测标记对于类风湿关节炎在骨关节遭受损伤之前的早期诊断就显得尤为必要(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239-262)。

研究发现一些自身免疫抗体虽然与类风湿关节炎疾病相联系，如：抗calpastatin抗体(Proc Natl Acad Sci USA 1995，92，7267-7271)、抗中性粒细胞胞质抗体(anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)(Int Arch Allergy Immunol 1996，109，201-206)、核抗原抗体(anti-nuclear antigens，ANA)(Scand J Rheumatol 1986，15，185-192)、抗II型胶原抗体(anti-collagen type II)(J Immunol Methods 2001，247，191-203)和抗葡萄糖6磷酸异构酶(anti-glucose-6-phosphate isomerase，anti-GPI)(Nat Immunol 2001，2，746-753)等也都能在患有其它自身免疫疾病的病人中，甚至于在健康个体中检测出来(Clin Applied ImmunolRev 2004，4，239-262)。其中的某些抗体虽然能应用于风湿性疾病的识别，而且筛选这些抗体也有助于疾病监测和预测，但由于其对类风湿关节炎缺乏专一性，这些抗体中的绝大多数都很少应用于类风湿关节炎早期诊断(Clinica Chimica Acta 2004，350，17-34)。

对于类风湿关节炎早期诊断的理想标记(Marker)应当至少满足4个标准：(1)高灵敏度，能检测的病人达到高百分比；(2)高专一性，尽可能地限制错误阳性结果的发生；(3)能适用于早期诊断；(4)能预见到某些病人会发展成侵蚀性疾病(erosive disease)(AutoimmunityReviews 2006，6，37-41；MEDICINE 2006，34，441-444)。

类风湿因子(rheumatoid factor，RF)抗体作为血清学检测方法应用于ACR标准中，被公认为是IgG分子上Fc结构域的直接抗体。虽然其检测灵敏度范围可以达到60-80％，但其对于类风湿关节炎的专一性也比较一般，为60％。此外，RF同样可以在其它患有自身免疫疾病的病人中、患有感染性疾病的病人中以及3-5％健康人群中(其中10-30％的老年人)检测到(Ann Rheum Dis 2003，62，261-263)。

抗BiP(p68)抗体，抗Sa抗体和抗环状胍氨酸化蛋白抗体(APF、AKA、抗filaggrin和抗CCP)则对类风湿关节炎有更高的专一性。64％的类风湿关节炎病人能产生直接针对BiP的抗体，还有报道称其对该疾病具有高度的专一性，但目前没有数据支持BiP在预测类风湿关节炎方面具有作用，而且这些报道的BiP抗体还需要等待进一步通过独立的临床研究加以确认(Clinica Chimica Acta 2004，350，17-34)。抗Sa抗体是源自于人脾脏和胎盘的提取物当中，分子量为50kDa的蛋白(Internal Medicine 2005，44，1122-1126)。另有研究揭示Sa抗原对于类风湿关节炎的专一性可以高达92-99％，但其灵敏度则显得一般，仅为30-40％(J Rheumatol1994，21，1027-33；J Rheumatol 1999，26，7-13)。

抗核周因子(antiperinuclear factor，APF)首次披露于1964年。经研究这些自身免疫抗体对类风湿关节炎具有专一性，并能通过以人颊粘膜细胞为抗原底物的免疫荧光法间接测得(Ann Rheum Dis 1964，23，302-305)。

1979年研究者描述了一种类风湿关节炎专一性角质蛋白抗体，它能直接抑制角质层上皮细胞角质化，并将这类抗体的名称暂定为抗角质蛋白抗体(anti-keratin andtibody，AKA)(BMJ 1979，2，97-99)。之后的研究证实，虽然AKA和APF的发现是互相独立的，但是两者所直接对应的抗原是一致的(J.Clin.Invest 1995，95，2672-2679)。许多研究进一步表明AKA和APF具有许多共同的特性，它们均对于RA患者表现出高度的专一性(Internal Medicine 2005，44，1122-1126)。Filaggrin(filamentaggregating protein)是一种互相交联的角蛋白丝状体，作用是形成非常坚固的细胞骨架结构，其也是AKA和APF的常见抗原(Clin AppliedImmunol Rev 2004，4，239-262)。其中，APF的目标抗原为profilaggrin，而AKA的抗原为filaggrin(J Clin Invest 1995，95，2672-2679)。

虽然AKA和APF对于类风湿关节炎具有专一性，但其缺陷也很突出。这两种抗体的检测灵敏度严重依赖于filaggrin的纯化方法。实践中，由于难以分离得到纯的且胍基含量具有可重复性的抗原，再加上其检测手段不简便，以及荧光免疫检测过程需要耗费较大的工作量，从而使得实验室间难以形成标准化，导致AKA和APF没有成为类风湿关节炎检测的主流方法(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239-262)。

基于filaggrin和profilaggrin是AKA和APF抗体靶点的知识，人们合成了含有瓜氨酸的多肽以检测类风湿关节炎血清中AKA和APF抗体的活性。由于瓜氨酸不是基本氨基酸而无法在蛋白质翻译中加入，因此通常的方法是通过肽精氨酸脱亚胺酶(peptidylargnine deiminine，PAD，EC3.5.3.15)催化精氨酸残基脱氨基得到。根据这些事实，一些从filaggrin序列中衍生出来的精氨酸侧链经修饰的，尤其是含有瓜氨酸的多肽被合成出来，并用于类风湿关节炎抗体的体外检测(US6,858,438)。在用酶联免疫吸附(Enzyme-Linked immunosorbent Assay，ELISA)方法检测实验中，这一方法合成的含有瓜氨酸直线性多肽能从类风湿关节炎患者血清中检测出抗瓜氨酸肽抗体，在保持高专一性(大于90％)的情况下，还大大提高了检测的灵敏度(达到63％)。实验还证明，只有含瓜氨酸的多肽才能实现该反应，若将多肽中的瓜氨酸用其它氨基酸代替则完全没有反应发生。这些结果表明，瓜氨酸部分是决定能被AKA和APF抗体识别的抗原决定因子(J Clin Invest 1998，101，273-281)。

其它研究者发现将含有瓜氨酸的直线性多肽通过二硫键(S-S键)形成环形结构的方式能模拟类似β-转角结构，从而模仿最初抗原决定簇的β-转角结构，并可增加多肽-抗体的亲和力(FASEB J 1995，9，37-42；Mol Immunol 1985，22，1255-1264)。由此，一种环状肽被人工合成出来，其将filaggrin主要表位上的两个丝氨酸换成半胱氨酸后，再由二硫键环化形成，即第一代环瓜氨酸肽(the first generation cyclic citrullinatedpeptide，CCP1)(Internal Medicine 2005，44，1122-1126)。研究者将一条由19个氨基酸残基组成的瓜氨酸肽中两个丝氨酸替换为半胱氨酸形成与β-转角具有相似结构的二硫键，得到人工合成CCP，并将CCP1与直线肽的检测结果作了比较。结果显示，采用CCP1为抗原的多肽用ELISA法检测RA患者的抗CCP抗体，灵敏度较用直线性瓜氨酸肽为抗原有显著提高，分别为68％和49％，二者专一性相似(Arthritis Rheum2000，43，155-163)。穆荣等人在266例RA患者和186例对照者血清中检测RF和AKA抗体、APF和抗CCP抗体的方式，评估了抗聚丝蛋白抗体群(anti-filaggrin antibodies，AFAs)与RF联合检测的意义。由于AKA和APF的敏感性太低，临床上以RF和抗CCP抗体的联合测定更为实用(北京大学学报(医学版)2005，37，894)。研究还发现，通过检测抗CCP抗体还能作为类风湿关节炎早期病人一项重要指标，为这类人群的早期防治提供参考(J India Rheumatol Assoc 2004，12，143-146)，其还能预测侵蚀性疾病(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239-262)。

在含有不同瓜氨酸多肽的反应模式中，类风湿关节炎血清检测表现出巨大的可变性。类风湿关节炎患者的血清/血浆中除了filaggrin精氨酸残基被瓜氨酸化外，Sa抗原、胶原蛋白(I和II型)、组蛋白、髓磷脂碱蛋白、纤维连接蛋白等也出现瓜氨酸化，并产生抗CCP抗体。深入研究表明，瓜氨酸化的自身抗原中并非所有精氨酸脱氨基转化为瓜氨酸；已瓜氨酸化的瓜氨酸也不完全参与形成抗原表位，即产生抗CCP抗体。综上，抗瓜氨酸抗体的产生与瓜氨酸密切相关，并且瓜氨酸的侧翼序列对抗瓜氨酸抗体的产生起重要作用，这一事实暗示着瓜氨酸残基的周边氨基酸对于抗原表位(antigen episode)具有重要作用，以及抗瓜氨酸化蛋白(如：AKA和APF抗体)活性是多克隆反应(J Clin Invest 1998，101，273-281)。基于filaggrin的属性，它被认为是模拟瓜氨酸抗原表位的天然库藏(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239-262)。

第二代CCP(CCP2)检测方法产生于2002年，通过将含有瓜氨酸的多肽库与类风湿关节炎血清筛选得到与filaggrin无关的第二代CCP，其具有更有利于抗体检测的表位(Report on the 5th Dresden symposium onautoantibodies.Lengerich，Germany：Pabst Science Publishers；2000.p.140-145)。将CCP1和CCP2经同一组病人测试后表明，CCP2不仅保持了较高专一性(96％)，而且其分析灵敏度也有显著的提高(Ann.Rheum.Dis.2005，64，1510-2)。许多研究者在最近5年的研究证明，抗含瓜氨酸多肽的测试的灵敏度具有较高的可变性，范围在40％-94％(Clin.ExpRheumatol.2005，23(Suppl39)，569-276；Ann.Rheum.Dis.2006，65，845-851)。CCP2在类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测中得到应用说明了在该领域的检测抗原的筛选并不需要仅仅依赖filaggrin，也说明与filaggrin不同的结合表位能更有利于体外检测。

Bizzaro N等人(Clin Chem 2007，53，1527-1533)和Lutteri L等人(Clinica Chimica Acta 2007，386，76-81)分别针对现在市场上使用的第二代和第三代CCP试剂盒(Kit)进行了比较，结果发现，伊诺瓦诊断(InovaDiagnostics)公司开发的三种检测方法中，其CCP3试剂盒与使用CCP2为抗原的方法相比仅仅略有改善，各自的灵敏度分别为67％和64％。相反地，用于抗IgG的CCP3.0与即能检测IgG又能检测IgA的CCP3.1的检测方法相比后发现，两者竟然没有丝毫差别。可见，同时检测IgG和IgA抗体的方法并没有象看上去那样有显著改进。他们的结论是由于测试的诊断试剂盒灵敏度可能与胍基化精氨酸残基的位置和数量有关，而专一性则可能受到蛋白质或杂多肽序列的影响，因此，对此二者而言，抗原的种类显得更为重要。两者综合考虑，实验数据表明抗原的制备是决定测定方法优劣的最重要的可变因素。

Lutteri L等人(Clinica Chimica Acta 2007，386，76-81)的研究还发现了抗CCP的另一个价值，他们指出，IgM-RF是最灵敏的标记，能在77.9％的类风湿关节炎患者中发现。必须注意的是，作为ACR标准中的RF，其类风湿关节炎诊断中灵敏度不能直接与那些没有包括在诊断标准中的其它方法相比较。IgM-RF被认为在疾病专一性方面略有欠缺。使用IgM-RF检测类风湿关节炎患者，其中有13-19％的人为RF阴性，与之相比，当这些患者使用抗CCP方法检测时均为阳性。

类风湿关节炎的遗传因素会影响瓜氨酸化蛋白的出现和产生，也会影响针对这些修饰蛋白的抗体产物(Clinica Chimica Acta 2004，350，17-34)。一系列相关研究表明，类风湿关节炎与某些HLA-DR等位基因有密切联系，尤其是HLA-DRB1*0401和HLA-DRB1*0404(Cell 1996，85，307-310)。与相应的含有精氨酸的多肽相比，将多肽瓜氨酸化就能与HLA-DRB1*0401和HLA-DRB1*0404两种“袋形”抗原更好地结合(J India Rheumatol Assoc 2004，12，143-146)。在不同地区的人群中，这些等位基因也略有不同。DRB1*0401主要出现在北欧和北美地区的人群中，有证据表明该基因与类风湿关节炎所导致的“特大关节”表征(extraarticular manifestations)有联系，在DRB1*0401/DRB1*0404杂合基因型中尤为突出。DRB1*0403、DRB1*0406和DRB1*0407与DRB1*0401、*0404或*0101基因组合后会增加类风湿关节炎病情的发展可能。DRB1*0404与DRB1*0408只要存在于白色人种中。DRB1*0405很少在北欧人群中，但在亚洲和环地中海沿岸国家的人群中极其普遍。DRB1*0101主要存在于北欧和北美人群中。美洲印第安人群中则为DRB1*1402和*1406(Hum Immuno 2000，61，1254-1261)。虽然这些与类风湿关节炎相关的基因在各地区人群中各有不同，但研究发现在DRB1的第三高度可变区(HV3)具有共享表位(shared epitope，SE)，在70-74位氨基酸残基都为QKRAA、QRRAA或RRRAA(ClinicaChimica Acta 2004，350，17-34)。

将一群有几个共享表位基因型的类风湿关节炎患者与具有抗CCP2抗体的患者比较研究表明，一种共享表位等位基因与抗CCP2抗体的产生具有密切的内在联系(Arthritis Rheum 2000，50，2113-21；Arthritis ResTher 2004，6，R303-308)。经证实，这一关联是由于MHC分子共享表位β链的70-74位氨基酸残基(Q/R，K/R，R，A，A)形成第4个锚定袋(P4)，其与电中性或负电荷氨基酸具有高度亲和性(J Immuno 2003，171，538-541)。当带正电荷精氨酸在PAD酶作用下转换成电中性的瓜氨酸后，得到的翻译后修饰蛋白/多肽亲和力远远大于精氨酸与P4的亲和力，并能够激活CD4⁺T细胞，这些“瓜氨酸特异T细胞”可有助于抗瓜氨酸蛋白(多肽)抗体的产生(J Immuno 2003，171，538-541；ArthritisRheum 1987，30，1205-1213；Rheum Dis Clin North Am 1992，18，741-759；Arthritis Rheum 2005，52，1063-1068)。这些结果表明具有共享表位的DBR1等位基因能激活类风湿关节炎患者自身免疫反应。

综合目前的研究结果，抗CCP抗体对RA具有较高的专一性，能将RA与其它与RA相似的疾病相区分，这类抗体存在于绝大多数的病人体内，在疾病的早期就能检测到，有助于对疾病的预测，能通过简单的方式加以检测(J India Rheumatol Assoc 2004，12，143-146)。

将CCP肽用于类风湿关节炎的体外ELISA检测已得到广泛研究，也有诸多商业化的检测试剂盒。单次ELISA检测通常需要较大的样本数，检测所用的时间也较长，其检测过程还需要专业的人员进行操作，对医疗机构的依赖度较大，从而不利于普通病患对病程的自助监测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胶体金侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物，包括CCP肽组合物、与CCP肽共价或非共价结合的高分子聚合物和侧向层析检测介质，实现对类风湿关节炎免疫抗体的快速、准确体外检测。

CCP肽是一种由5-50个氨基酸通过酰胺键互相连接，且在不相邻的两个氨基酸侧链之间通过共价键形成的环形结构有机分子。氨基酸为分子结构中同时含有氨基和羧基的有机化合物，选自于甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和脯氨酸。CCP肽的序列如：美国专利申请2006/0039924A1、中国发明专利申请02133648.2、02824647.0、200410093354.1、200510044046.4和文献J.Clin.Invest.1998，273-281中所记载的多肽。在所述CCP肽序列当中至少有一个精氨酸侧链被修饰，修饰的精氨酸侧链具有式I所示的结构，

式I

其中G1为O、NH或CH₂；G2为NH₂、CH₃、NHCH₃或N(CH₃)₂；G3为O、NH、NHCH₃或NHCH₃；n为2、3或4；当G1为NH，G2为NH₂时，G3为O、NHCH₃或NHCH₃。

本发明所述的CCP肽组合物包含CCP肽I和CCP肽II，CCP肽I与CCP肽组合物的摩尔比比值为0-1；

CCP肽I从N端至C端包含如下氨基酸序列：His-Gln-Cys-Xaa1-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Cys-Gly，

其中，Xaa1为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为修饰的Arg；Xaa6为Gly或His；Xaa7为Arg；Xaa8为Ser或Arg；Xaa9为Arg或Leu；Xaa10为Ala或Ile；Xaa11为Ala或Arg，其中至少有两个精氨酸侧链被修饰；

CCP肽II从N端至C端包含如下氨基酸序列：His-Gln-Cys-Xaa1-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Arg-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Cys-Gly，

其中，Xaa1为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为Gly或His；Xaa6为Arg；Xaa7为Ser或Arg；Xaa8为Arg或Leu；Xaa9为Ala或Ile；Xaa10为Ala或Arg，其中至少有一个精氨酸侧链被修饰。

另一种本发明所述的CCP肽组合物，包含CCP肽I和CCP肽II，所述CCP肽I从N端至C端包含如下氨基酸序列：His-Gln-Cys-Xaa1-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Gly-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Cys-Gly，

其中，Xaa1为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为修饰的Arg；Xaa6为Arg；Xaa7为Ser或Arg；Xaa8为Arg或Leu；Xaa9为Ala或Ile；Xaa10为Ala或Arg，其中至少有两个精氨酸侧链被修饰；

CCP肽II从N端至C端包含如下氨基酸序列：His-Gln-Cys-Xaa1-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Arg-His-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Cys-Gly，

其中，Xaa1为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为Arg；Xaa6为Ser或Arg；Xaa7为Arg或Leu；Xaa8为Ala或Ile；Xaa9为Ala或Arg，其中至少有一个精氨酸侧链被修饰。

另一种本发明所述的CCP肽组合物，包含CCP肽I和CCP肽II，所述CCP肽I从N端至C端包含如下氨基酸序列：His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Gly-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Cys-Gly，

其中，Xaa1为Arg或Gln；Xaa2为Phe或Met；Xaa3为修饰的Arg；Xaa4为修饰的Arg；Xaa6为Ser或Arg；Xaa7为Arg或Leu；Xaa8为Ala或Ile；Xaa9为Ala或Arg，其中至少有两个精氨酸侧链被修饰；

CCP肽II从N端至C端包含如下氨基酸序列：His-Gln-Cys-Ala-Arg-Phe-Xaa1-Xaa2-Xaa3-His-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Cys-Gly，

其中，Xaa1为Arg或Gln；Xaa2为Phe或Met；Xaa3为修饰的Arg；Xaa4为修饰的Arg；Xaa5为Ser或Arg；Xaa6为Arg或Leu；Xaa7为Ala或Ile；Xaa8为Ala或Arg，其中至少有两个精氨酸侧链被修饰。

另一种本发明所述的CCP肽组合物，包含CCP肽I和CCP肽II，所述CCP肽I从N端至C端包含如下氨基酸序列：His-Gln-Cys-Xaa1-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Arg-Gly-Arg-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Cys-Gly，

其中，Xaa1为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为Ser或Arg；Xaa6为Arg或Leu；Xaa7为Ala或Ile；Xaa8为Ala或Arg，其中至少有两个精氨酸侧链被修饰；

CCP肽II从N端至C端包含如下氨基酸序列：His-Gln- Cys-Xaa1-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Arg-His-Arg-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Cys-Gly，

其中，Xaa1为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为Ser或Arg；Xaa6为Arg或Leu；Xaa7为Ala或Ile；Xaa8为Ala或Arg，其中至少有两个精氨酸侧链被修饰。

另一种本发明所述的CCP肽组合物，包含CCP肽I和CCP肽II，所述CCP肽I从N端至C端包含如下氨基酸序列：

His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Xaa1-Gly-Xaa2-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gly，

其中，Xaa1为修饰的Arg；Xaa2为修饰的Arg；

所述的CCP肽II从N端至C端包含如下氨基酸序列：His-Gln-Cys-Xaa1-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-His-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Cys-Gly，

其中，Xaa1为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为修饰的Arg；Xaa6为修饰的Arg；Xaa7为Ser或Arg；Xaa8为Arg或Leu；Xaa9为Ala或Ile；Xaa10为Ala或Arg。

本发明所述的CCP肽的环化可以通过序列上不相邻的两个氨基酸侧链形成共价键的方式实现。在其序列当中至少有一个精氨酸残基被修饰，如：修饰成瓜氨酸残基(Cit)。

CCP肽序列中可以采用在两个不相邻的半胱氨酸侧链巯基之间形成二硫键的方式实现多肽的环化，如：第三位与第十六位半胱氨酸之间形成二硫键，并得到最终的CCP肽。对于具有相同氨基酸序列的多肽，其所形成的环形多肽对于类风湿关节炎抗体的结合能力亦有较大差异。如：两个不相邻的半胱氨酸在多肽序列中的相对位置对所形成的CCP肽与类风湿关节炎抗体结合的灵敏度和专一性起到重要作用，并影响到检测的结果。本领域技术人员可以通过将组成本发明所述的CCP肽序列中半胱氨酸与其它一种或几种氨基酸互换后，结合组合化学和蛋白质组学进行高通量筛选，以便在多肽序列中寻找到另外的两个不相邻的半胱氨酸位置，进而使其与类风湿关节炎抗体结合也具有相对较高的灵敏度(≥60％)和专一性(≥90％)。

一种本发明CCP肽组合物的具体组合方式，所述CCP肽I包含的氨基酸序列选自于SEQ ID No：1-118之一；所述CCP肽II包含的氨基酸序列选自于SEQ ID No：119-261之一，如：由SEQ ID No：1或SEQ ID No：118和SEQ ID No：119所组成的CCP肽组合物。

另一种本发明CCP肽组合物的具体组合方式，所述CCP肽I包含的氨基酸序列选自于SEQ ID No：1-118之一；所述CCP肽II包含的氨基酸序列选自于SEQ ID No：1-118之一，且CCP肽I与CCP肽II的序列不相同。如：由SEQ ID No：1和SEQ ID No：118所组成的CCP肽组合物。

本发明CCP肽组合物，CCP肽I与CCP肽组合物的摩尔比比值为0.1-0.9；可以选择0.2-0.8，如：0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75或0.80，优先选择0.50，即CCP肽I∶CCP肽II＝1∶1。

高分子聚合物(polymer)是指分子量大于2,000Da的化合物，分子间由结构单位(structural unit)或单体经由共价键相互连接在一起。其可以是多个结构不同的单体或由不同结构分子所形成的结构单位的多聚体，也可以是相同单体的寡聚体，还可以是由两个以上的聚合物直接或间接相结合或聚合，如：聚乙二醇(PEG)与聚乳酸(PLA)形成的嵌段共聚物PEG-PLA或PLA-PEG-PLA。聚合物的形态结构可以为直线型(linear)、分枝型(branch/multi-arm)或分叉型(dendrimer)。所述聚合物选自于聚乙二醇、聚氨基酸、聚核苷酸、聚乳酸、聚赖氨酸、聚亚胺和10个以上单糖通过糖苷键形成的多聚糖(polysaccharide)，如：淀粉及其水解产物、纤维素、甲壳素或葡聚糖。

分叉型聚合物(dendrimer)一般为聚氨基胺(poly(amidoamine)，PAMAM)，可以分别由氨或乙二胺为起始物制备(Clin.Chem.，1994，40，1845-1849)，也有使用氨基酸聚合而成(J Immuno Method，1996，196，17-32)，如：赖氨酸和精氨酸。所得聚合物具有活性基团，如：氨基、羟基或羧基，聚合次数越多，其分子量越大，官能团也越多，所能结合的分子数量也相应增加。

聚乙二醇选自于两端均未封闭或一端封闭的聚乙二醇，封闭基团选自于C1-C30的烷基，C1-C30的脂肪酸或C3-C30的糖基。聚乙二醇选自于分子量2,000Da-100,000Da，可以选择2,000Da-50,000Da，一般选择5,000Da一50,000Da。进一步的，所述封闭基团选自于C1-C20的烷基，通常选择C1-C10的烷基，优先选择甲基、乙基或丙基。

聚氨基酸包括由相同氨基酸聚合而成的寡聚分子，也包括由不同分子聚合而成的多聚分子，蛋白质或多肽是其天然存在形式。这些蛋白质包括从生物体中分离得到的天然产物及其水解产物，也包括基因工程重组的产物及其水解产物，还包括通过化学方式直接合成的或将不同多肽片段连接而成的产物。多肽的长度应当15个氨基酸以上，包括从生物体中分离得到的天然产物及其水解产物，也包括基因工程重组的产物及其水解产物，还包括通过化学方式直接合成的或将不同多肽片段连接而成的产物。

本发明所述的CCP肽与高分子聚合物共价结合(covalent conjugate)，形成的共价键如：酰胺键(amide bond)、尿键(urine bond)、酯键或二硫键。CCP肽通过其氨基酸侧链、N末端氨基或C末端羧基与高分子聚合物相结合。这种结合可以通过如：N-羟基琥珀酰亚胺、马来酸酐或丙/乙醛基等试剂将氨基酸侧链、N末端氨基或C末端羧基进行活化后再与高分子聚合物相结合，也可以适用前述相同或不同的方式，先活化高分子聚合物的基团后，再与CCP肽相结合。其它还有通过腙(hydrazone)、肟(oxime)、巯基或噻唑烷(thiazolidine)等方式结合(J.Immuno.Method，1996，196，17-32)。

上述CCP肽与糖类分子之间的结合方式可以参见文献：J.Pharma.Sci.87，326-332；Adv.Drug deliv.Rev.，6，103-131；Adv.Drug deliv.Rev.，13，251-267。聚乙二醇与上述CCP肽的结合方式参见文献：Adv.Drugdeliv.Rev.，28，275-299；Adv.Drug deliv.Rev.，54，453-609；Adv.Drugdeliv.Rev.，60，1-88。由于CCP肽聚合物结合所涉及的化学反应相同或相似，本领域技术人员可以将这些结合方式应用于CCP肽与其它聚合物共价结合的反应当中。

CCP肽连接还可以通过连接子(space linker)以化学反应的方式(如：有机合成)与高分子聚合物间接连接，如：在化学合成CCP肽过程中，将连接子先连接于CCP肽，然后再由该连接子与高分子聚合物连接。这类连接子选自于长度为1-500个氨基酸的多肽或蛋白质、分子量在100Da-2,000Da的大分子或有机小分子。如：分子量为200Da-2,000Da的两端活化的聚乙二醇(NOF Corporation)、NH₂(CH₂)_nCOOH、SH(CH₂)_nCOOH或两端活化的C1-C30的脂肪酸(J.Gene.Med.，2005，7，604-612)。化学连接可以是CCP肽N末端或C末端与上述连接子上的活化基团连接，也可以由CCP肽某一个氨基酸侧链与连接子上的活化基团连接。连接子与抗原之间形成共价键，如：酰胺键、尿键、酯键、硫醚键、腙键(-CH＝N-NH-)、肟键(-CH＝N-O-)和二硫键。

有机小分子选自于各类氨基酸、各类单糖、各类维生素(Vitamin)、由两个单糖单元通过糖苷键形成的二糖(disaccharide)(如：蔗糖、乳糖或麦芽糖)、由2-10个单糖通过糖苷键形成的寡聚糖(oligosaccharide)(如：低聚异麦芽糖、低聚木糖或低聚半乳糖)和分子量在100Da-2,000Da的有机分子，如：生物素(Biotin)。

本发明所述的CCP肽与高分子聚合物以非共价键结合，如：将序列上结合有生物素的CCP肽与亲和素非共价结合。亲和素(Avidin)是一种分子量为68,000Da，pI为10.5的碱性糖蛋白，又称卵白素，在鸡蛋清中含量比较丰富，因此一般从蛋白清中提取。链霉亲和素(Streptavidin)是一种从链霉菌(Streptomyces avidinii)培养物中提取的蛋白质，相对分子质量60,000Da，不具有糖链。其特性与亲和素一样，也具有4个生物素结合位点，与生物素具有高亲和力。

一种胶体金侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物，包括CCP肽组合物、高分子聚合物和侧向层析检测介质。其中，CCP肽组合物包含CCP肽I和CCP肽II，CCP肽组合物与高分子聚合物共价或非共价结合形成的CCP肽聚合物共价或非共价地结合于侧向层析检测介质上。

在侧向层析(Lateral Flow Immunoassay，LFIA)当中，检测介质包括样品垫(sample pad)、标记结合垫(conjugate pad)、检测垫(membrane)、吸水垫(wick)、支撑底板(backing)以及结合于介质上的必需物质，如：标记结合垫上的标记物，与标记物相结合的配基和结合于检测垫C线上的抗体等。其中，配基如：葡萄球菌蛋白A(Protein A)、链球菌蛋白G(Protein G)、葡萄球菌蛋白A和链球菌蛋白G的融合蛋白(ProteinA/G)、链球菌蛋白L(Protein L)、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素和牛血清白蛋白等。

侧向层析通常采用试纸条，待测样品经样品垫上样，在毛细现象的作用下依次经过标记结合垫、检测垫和吸水垫后完成一次检测。样品中的待测分子与标记结合垫中的显色标记结合，当其与检测垫的检测区(testline，T线)分子特异结合时被留置，未被检测区分子留置的标记物被控制区(control line，C线)的抗体结合，从而实现目标分子的检测。侧向层析试纸条的各个组成部分由塑料制成。样品垫、标记结合垫、检测垫和吸水垫都固定于支撑底板。

塑料应当理解为全部或部份由碳与氧、氢、氮及其它有机及无机元素化合而成，在制造的最后阶段成为固体，在制造中某些阶段是液体(塑料材料在成为最终产品以前，在某些阶段必需要能够流动)，因而可以加热或加压力，或二者并用的方式，使其形成各种形状，此庞大而变化多端的材料族类中的任何一种，如：树脂、热固性树脂和纤维素衍生物等，在一条长链的分子结构中存在众多的重复原子或分子。塑料包括人工合成或自然界有机材料，如：聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚酯或纤维素及其衍生物等。制成试纸条所用的塑料或使用一种塑料材料，或使用几种塑料材料在物理上的叠加或相加后的复合。

标记结合垫上结合有显色标记物，可以使用的标记物有：胶体碳、胶体金、胶体硒、脂质体、顺磁粒子、量子点、金属离子、有机荧光分子或彩色微球。这些标记物上通常结合有配基，配基能与待测样品中的分子结合并使分子标记上标记物。这些配基选自于Protein A、Protein G、ProteinA/G、Protein L、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素和牛血清白蛋或与待测样品中的分子相结合的有机分子。

由于脂质体具备包含高浓度分子的能力，将其应用于侧向流层析就能够将检测灵敏度增加2-3个数量级。根据检测的实际需要，可见光染料、荧光染料、酶或电活化复合物能直接包被于大小为50nm-800nm的脂质体内。用于侧向流层析的脂质体一般为200nm-400nm，染料通常为红色的硫氰酸盐。为了适应检测配基的种类，脂质体表面的功能基团衍生化后就能交联识别待测配基的其它分子。

胶体碳(Colloidal Carbon)也称为“India Ink”，可作为一种标记物用于快速免疫化学检测(J.Biotechnol.，1993，30，185-195)。美国专利5,641,689公开了一种用于蛋白质吸附的胶体碳制备方法，从而解决了胶体碳颗粒不稳定的问题。在运用侧向流层析法进行免疫检测中，胶体碳颗粒的粒径一般选择100nm-200nm。

量子点(Quantum Dots)是一种直径在1-100nm之间，能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒。其由CdSe，CdS，ZnSe，InP或InAs组成，或在CdSe的核上有一层AnS或CdS。现有技术已能够将量子点大小制备成极度一致，并在10-50nm内具有极窄的发射光带宽。

根据所需要的颗粒大小，有多种方式能在实验室当中制备胶体金(Colloidal Gold)(Methods for Synthesis of Colloidal Gold.In“ColloidalGold：Principles，Methods，and Applications”，Academic Press，Inc.SanDiego，Vol.1，1989)。几乎所有的方法都是使用还原剂在可控的范围内将金离子转化为单质金。所用的还原剂包括硼氢化钠、黄磷、乙醇、抗坏血酸、柠檬酸钠和柠檬酸-单宁酸。Frens等人(J.Microsc.(Oxford)1981，123，201)以氯金酸(HAuCl₄)为原料使用柠檬酸钠制备胶体金是最常用的方法。

在加入还原剂之前，溶液中含有100％金离子。加入还原剂之后，溶液中金原子的含量立即出现急剧的上升，直到其达到过饱和。紧接着在一个被称作核化的过程中发生凝集，在核化位点形成由11个金原子构成的中央的二十面体金核心。还原剂越多，产生的晶核越多，从而产生的金颗粒也越多。在一个含既定数目氯化金的溶液中，形成的核化位点的数目越多，最终形成的每个金颗粒的尺寸就越小。因而微粒的大小可通过所加入的还原剂的量来精细调控。如果生产条件经过优化，所有的核化位点都可以在瞬间同时发生，使得所形成的金颗粒大小都完全一致(即单分散型)。

金颗粒悬浮于液体当中形成了胶体金。由于溶液中残留有负离子，从而使每一个颗粒都由负电荷层所围绕。这种电荷层称之为Zeta电势，它能使金颗粒之间互相排斥并悬浮于液体中。随着溶液当中的总离子浓度改变，Zeta电势也能被压缩或扩张。

大分子配基(如：蛋白质、多肽或抗体)通过静电力(electrostatic)和疏水相互作用而吸附于胶体金上。胶体金上标记抗体时，不能有过量的待标记抗体存在。因为过量的游离的抗体会跟胶体金上的抗体与抗原发生竞争反应，导致出现假阴性，而且过量的抗体蛋白会影响到标记物的稳定性。蛋白质和胶体金结合的最佳条件在蛋白质的等电点附近。蛋白通过以下机制于几秒之内吸附于金表面：金粒子所带负电荷与蛋白内带阳性电荷氨基酸(如：赖氨酸)相互吸引；蛋白通过色氨酸与金粒子表面之间的疏水吸附作用；蛋白中的半胱氨酸的硫基与金粒子间的配价结合。

在与胶体金结合的过程中，控制配基和胶体金的pH至关重要。在结合之前，应当将两者的pH调节至略高于配基等电点。低于配基的pKi，会发生配基诱导的凝聚，而高于配基的pKi，则会由于配基与胶体金之间的电荷排斥而限制吸附量。这种依赖pH的情况一般只在蛋白质配基上发生，可以采用聚乙二醇来作为胶体金的稳定剂来解决。结合胶体金最佳的pH值可以使用一种简单的方法来确定(Experimentia 1975，31，1147)。对于大多数抗体而言，pH7.5是一个具有普遍适用的值。碳酸钾、氯化钾和稀释的盐酸可用于胶体金pH的调节。制备好的胶体金结合体(colloidalgold conjugate)可以通过低速离心或切相流滤膜收集，为了避免结合体的大量损耗，最好用BSA溶液预处理切相流滤膜。

随着特异蛋白的结合，胶体金结合体必须用适当的试剂进行稳定，通常使用BSA、明胶、聚乙二醇或酪蛋白。使用稳定剂有双重功能，一是它可通过封闭胶体表面未和特异性蛋白结合的位点而减少了非特异性反应；二是它可有助于更稳定的悬液的形成。胶体金最常用的防腐剂为0.1％叠氮化合物。

在标记抗体时，粒径在40-100nm的胶体金颗粒能比较顺利标记到IgG抗体上。抗体标记后，可以用紫外分光光度计在280nm处测定胶体金标记IgG前后的蛋白溶液吸光度，以计算标记率，当标记率大于60％时，该经标记的胶体金才能作为标记物用于检测。40nm的胶体金颗粒提供最大的可视性和最小的空间位阻。如果用于标记分子的分子量小于160kD，20nm胶体金颗粒更适合。20nm胶体金颗粒通常用于标记链霉亲和素、Protein A和抗原，这些被标记蛋白的分子量小于60kD。

光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，这个光吸收峰的波长(λmax)在510-550nm范围内，随胶体金颗粒大小而变化，大颗粒胶体金的λmax偏向长波长，反之，小颗粒胶体金的λmax则偏于短波长。呈色性微小颗粒胶体呈红色，但不同大小的胶体呈色有一定的差别。最小的胶体金(2-5nm)是橙色的，中等大小的胶体金(10-20nm)是酒红色的，较大颗粒的胶体金(30-80nm)则是紫红色的。根据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色可粗略估计金颗粒的大小。

由于胶体金的粒径不同其在可见光区的最大吸收波长(λmax)亦有区别，可以采用分光光度计扫描λmax来估计胶体金颗粒的粒径。电镜观察能比较精确地测定胶体金的平均粒径，如：用预先处理好的覆有Formvar膜的镍网浸入胶体金溶液内，取现放在空气中干燥或37℃烤箱烤干，然后在透射电镜下观察，主要观察金颗粒的大小和颗粒是否均匀一致。

Danscher(Histochemistry，1984，81，331；Histochemistry，1981，71，81)和Holgate(J.Histochem.Cytochem.，1983，31，938)在免疫组织染色中通过单质银来增强胶体金显色，从而发现银盐(如：乳酸银或醋酸银)可增强金标信号(Mikroskopie(Vienna)1985，42，318)。当在传统的胶体金侧向流免疫检测中使用银原子后，金标信号能提高1-2数量级(J.Immunol.Meth.，140，131-134)。所有的反应物(包括金结合体及增强剂银盐)都被干燥于测试条带上仅由样品溶开。这种间接的增强技术有望在pg/ml的范围内对待分析物进行检测。增强剂银盐通常置于试剂条上的样品垫与胶体金标记垫之间。

检测垫使用的材料选自于醋酸纤维素、硝酸纤维素、再生纤维素、尼龙和聚偏二氟乙烯。其中，硝酸纤维素是最常用的材料。膜孔径在15-20μm时，液体在膜上的流速会更快。由于普通膜孔平行于膜平面而无法测量，侧向流膜通常依据侧向流的流速进行分类，以“s/4cm”为单位，即每4cm膜水的层析时间。Millipore公司提供的6种型号的膜(Hi-FlowPlus 240、180、135、90、120、90和75)，其上数值就代表相应的每4cm膜水的层析时间，但是流速越快其检测灵敏度也越低，一般以135s/4cm和180s/4cm两种型号最为常用。

CCP肽组合物与高分子聚合物共价结合形成CCP肽聚合物，其上高分子物质结合于检测载体，使得每平方厘米滤膜上的CCP肽聚合物大于20ng，可以为100ng-1000μg/cm²，一般选择100ng-500μg/cm²，优先选择1μg-100μg/cm²，如：5μg/cm²、10μg/cm²、15μg/cm²、20μg/cm²、25μg/cm²、30μg/cm²、35μg/cm²、40μg/cm²、45μg/cm²、50μg/cm²、55μg/cm²、60μg/cm²、65μg/cm²、70μg/cm²、75μg/cm²、80μg/cm²、85μg/cm²、90μg/cm²和95μg/cm²。其中，高分子聚合物的平均重量分子量大于2,000Da，优先选择20kD-100kD。

另一种本发明所述的胶体金侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物，包括CCP肽组合物、高分子聚合物和侧向层析检测介质。其中，CCP肽组合物包含CCP肽I和CCP肽II，CCP肽组合物与高分子聚合物非共价结合形成的CCP肽聚合物共价或非共价地结合于侧向层析检测介质上，检测介质上结合的CCP肽聚合物含量为1μg-50μg/cm²，如：5μg/cm²、10μg/cm²、15μg/cm²、20μg/cm²、25μg/cm²、30μg/cm²、35μg/cm²、40μg/cm²、45μg/cm²和50μg/cm²。

另一种本发明所述的胶体金侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物，包括CCP肽组合物、高分子聚合物和侧向层析检测介质。其中，CCP肽组合物包含CCP肽I(如：SEQ ID No：1)和CCP肽II(如：SEQID No：118)，CCP肽组合物与高分子聚合物共价结合形成的CCP肽聚合物共价或非共价地结合于侧向层析检测介质上，检测介质上结合的CCP肽聚合物含量为1μg-50μg/cm²，如：5μg/cm²、10μg/cm²、15μg/cm²、20μg/cm²、25μg/cm²、30μg/cm²、35μg/cm²、40μg/cm²、45μg/cm²和50μg/cm²。

另一种本发明所述的胶体金侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物，包括CCP肽组合物、高分子聚合物和侧向层析检测介质。其中，CCP肽组合物包含SEQ ID No：1和SEQ ID No：118，CCP肽组合物通过其上连接的生物素与亲和素非共价结合形成的CCP肽聚合物共价或非共价地结合于侧向层析检测介质上，检测介质上结合的CCP肽聚合物含量为1μg-50μg/cm²，如：5μg/cm²、10μg/cm²、15μg/cm²、20μg/cm²、25μg/cm²、30μg/cm²、35μg/cm²、40μg/cm²、45μg/cm²和50μg/cm²。

用于本发明所述胶体金侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物，其高分子聚合物优先选自于牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、人血清白蛋白(Humal serum albumin，HSA)、兔血清白蛋白(RSA)、鸡卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、dendrimer、聚赖氨酸、聚乙二醇、亲和素或抗体。

本发明技术方案实现的有益效果

与其它检测方法，如：ELISA相比，本发明能够实现类风湿关节炎免疫抗体的体外检测。其抗体检测的灵敏度和专一性与ELISA相比基本一致，扩大了检测的适用人群。

本发明胶体金侧向层析法不仅能够实现类风湿关节炎免疫抗体的快速体外检测，而且提高了检测的准确性，便于患者自助诊断，为及时了解病情发展提供参考。

本发明所涉及的术语与其一般概念相同。

所述的“修饰的Arg”为侧链修饰的精氨酸，其结构如式I所示。

所述的“CCP肽”与所述的“高分子聚合物”共价结合指CCP肽与高分子聚合物直接结合形成共价键，或CCP肽与高分子聚合物之间通过连接子间接结合，其CCP肽与连接子之间，连接子与高分子聚合物之间所形成的键均为共价键。

所述的“CCP肽”与所述的“高分子聚合物”非共价结合指CCP肽与高分子聚合物直接结合形成非共价键，或CCP肽与高分子聚合物之间通过连接子间接结合，其CCP肽与连接子之间，连接子与高分子聚合物之间所形成的键至少有一个为非共价键，如：亲和素(高分子聚合物)与生物素(连接子)之间的连接。非共价键如：疏水相互作用、离子键、氢键或范德华力等。

所述的“检测线”或“检测区”均指在侧向层析中结合有CCP肽的区域。

所述的“控制线”或“控制区”均指在侧向层析中结合有能与标记物上配基相结合的分子的区域，如：标记物上结合有鼠抗人IgG，而该区域可以结合有羊抗鼠IgG，以实现与鼠抗人IgG相结合并在该区域显色，以判断标记物是否有效。

所述的“C1-C10烷基”、“C1-C20烷基”和“C1-C30烷基”指直链或支链烷基，如：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基或异丁基等。其中，字母C表示碳原子，其后数字为正整数，如：1、2、3、4或5等，表示基团所含的碳原子个数。

所述的“C1-C30的脂肪酸”指饱和或不饱和的直链或支链碳链，其上至少有一个羧基，如：甲酸、乙酸、丙酸、油酸、亚油酸、软脂酸，十八碳四烯酸、琥珀酸和苹果酸等。其中，字母C表示碳原子，其后数字为正整数，如：1、2、3、4或5等，表示基团所含的碳原子个数。

所述的“C3-C30的糖基”，如：丙糖基、丁糖基、戊糖基和己糖基等。其中，字母C表示碳原子，其后数字为正整数，如：3、4或5等，表示基团所含的碳原子个数。

所述的“灵敏度”和“敏感性”均指在抗原对抗体的检测当中，因检测样品的改变而产生的检测结果差异，其计算方式为：真阳性/(真阳性+假阴性)。

具体实施方式

以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自于西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。

实施例1CCP肽I和CCP肽II的合成

CCP肽可以采用Fmoc化学方法，通过固相合成技术合成。该方法的具体步骤参见Eur.J.Immunol.1994，24，3188-3193；J.Org.Chem.1972，37，3404-3409；黄惟德，陈常庆多肽合成，北京：科学出版社，1985。

二硫键的形成方法及其步骤可以参见文献：黄惟德，陈常庆多肽合成，北京：科学出版社，1985，p85；Michael W.Pennington Peptide SynthesisProtocols(Methods in Molecular Biology)，Humana Press，1994，p91-169。

本实施例中，各种CCP肽均由吉尔生化(上海)有限公司合成，具体序列如下：

CCP肽I：His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Cit-Gly-Cit-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gly，其上第三位和第十六位Cys通过巯基形成二硫键，并使多肽形成环状结构，并能模拟β-转角结构。

CCP肽II：His-Gln-Cys-Ala-Arg-Phe-Gln-Met-Cit-His-Cit-Arg-Leu-Ile-Arg-Cys-Gly，其上第三位和第十六位Cys通过巯基形成二硫键，并使多肽形成环状结构，并能模拟β-转角结构。

实施例2CCP肽I和CCP肽II与高分子聚合物的结合

将2mg载体蛋白BSA溶于200μl去离子水，2mgCCP肽I和CCP肽II(摩尔比为1∶1)溶解于0.5ml偶联缓冲液(0.1mol/L MES，0.9mol/LNaCl，0.2g/L NaN₃，pH4.7)中。将0.5ml CCP溶液加入200μl载体蛋白溶液。将1ml浓度为10mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)溶液加入CCP和BSA的混合液中，轻轻混匀，在室温下反应2h，用0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液于4℃透析3天，分装后在4℃保存。

实施例3IgG标记胶体金

加热99ml超纯水至80-90℃，加入1％(w/v)的HAuCl₄ 1ml，继续加热搅拌至沸腾。充分沸腾约10s，迅速加入现配的柠檬酸三钠溶液(0.0236g柠檬酸三钠，配成约1％(w/v)的浓度)，搅拌沸腾反应10min。室温冷却后加超纯水补足至100ml。将得到的胶体金在400-700nm进行全波长扫描，要求在525-535nm波长下的吸收值达到0.92-0.98。

在100ml制备好的已冷却至室温的胶体金溶胶中，用1％(w/v)K₂CO₃的调pH至8.2。

加入1.5mg鼠抗人IgG(杭州基隆生物技术有限公司)(0.1M磷酸缓冲液稀释到1mg/ml)，室温搅拌30min。

加入BSA溶液封闭30min(5％(w/v)的溶液，加25ml)。10,000rpm离心25min，弃上清。用紫外分光光度计在280nm处测定胶体金标记IgG前后的蛋白溶液吸光度，计算后标记率为70％。表明胶体金上已标记有IgG，该标记物可用于免疫检测。

沉淀用浓度为1％(w/v)BSA的Tris-HCl缓冲液清洗(0.02M，pH8.0)；10,000rpm离心25min，弃上清；沉淀用含1％(w/v)BSA的Tris-HCl溶解，加入20％(w/v)的蔗糖和5％(w/v)的海藻糖重悬，最后通过免疫反应检测标记后抗体活性。

实施例4CCP肽组合物-BSA结合于侧向层析检测介质

取适当浓度的CCP-BSA抗原(CCP肽聚合物)，用点膜机包被在检测区上，包被后的纤维素膜经干燥箱适当干燥后备用。

在硝酸纤维素膜上点控制线(control line，C线)和检测线(test line，T线)，喷量为1.2μl/cm。

C线溶液为用稀释液1×PBS(3％海藻糖)配制成1mg/ml的羊抗鼠IgG(杭州基隆生物技术有限公司)。

T线溶液为用稀释液0.02M Tris(2％海藻糖，0.5％NaCl，pH8.0)配制成CCP-BSA抗原，其中CCP肽聚合物的浓度为2.0mg/ml。

将点好的片材于37℃烘箱中烘2h。

实施例5胶体金侧向层析法检测类风湿关节炎免疫抗体

抗-CCP抗体金标检测试纸，包括底板、吸水垫、硝酸纤维素膜、结合有鼠抗人IgG单克隆抗体金标(如：实施例3)的标记结合垫和样品垫；底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设置有一条试验线(T线)和一条控制线(C线)，底板一端为吸水垫，另一端为样品吸收垫，硝酸纤维素膜的两端分别与吸水垫和金标垫相互交叠连接，采用侧向层析(间接固相免疫金层析法)定性检测样品中的抗-CCP抗体。试验线上结合有CCP-BSA结合物(如：实施例2)，控制线上结合有羊抗鼠IgG(如：实施例4)。

在胶体金颗粒上标记鼠抗人IgG，在试纸的检测区(T线)包被CCP多肽，控制区(C线)包被有羊抗鼠IgG抗体。检测时，样品中的抗-CCP抗体与免疫金垫的胶体金标记鼠抗人的IgG结合成结合物，该结合物随着膜的毛细管作用迁移到达检测区，与膜上的CCP多肽相结合，出现一条红色条带，不管标本中是否存在抗-CCP抗体，当液面继续迁移至固定有羊抗鼠IgG区带时，控制区必定会出现一条红色条带。如果检测区出现有色条带，则提示阳性结果，表明被检测者体内有类风湿关节炎抗体；只有控制区出现红色条带，则提示阴性结果，表明被测者没有类风湿关节炎免疫抗体；红色条带同时作为试纸的内控标准，有助于判定样品量是否足够或层析过程是否正常。整个检测过程在15分钟内即可完成。

实施例6胶体金侧向层析法检测与ELISA检测的比较

使用250位类风湿关节炎病人的血清和250位健康人的血清。

根据美国专利US6,858,438中所记载的方式制备本发明CCP肽组合物-BSA(如：实施例2)的ELISA检测板。参考本说明书记载的方法制备CCP肽组合物-BSA(如：实施例2)的胶体金侧向层析试纸条，检测介质上的CCP肽聚合物含量为30μg/cm²。使用两种检测方法分别检测上述血清，专一性和敏感性结果分别见表1和表2。

表1CCP肽组合物检测类风湿患者的专一性对比

表2CCP肽组合物检测类风湿患者的敏感性对比

从表1和表2可见，胶体金侧向层析法能够实现类风湿关节炎免疫抗体的体外检测，其抗体检测的灵敏度和专一性与ELISA相比基本一致，从而能使检测更快速简便，从而扩大了检测的适用人群。

实施例7胶体金侧向层析法检测与ELISA检测的比较

根据文献Reviews in Molecular Biotechnology 2002，90，195-229，及其所引用的参考文献中所公开的合成聚合赖氨酸方法得到三聚赖氨酸pLys，化学合成C末端连有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的CCP肽I-NHS和CCP肽II-NHS(CCP肽侧链及N末端有保护基)。在pH7.4磷酸缓冲盐溶液中，CCP肽I-NHS和CCP肽II-NHS按摩尔比1∶1结合到pLys，再经RP-HPLC(乙腈-三氟乙酸体系)纯化得到在pLys上各结合有2个CCP肽I和CCP肽II的pLys-CCP聚合物。

以pLys-CCP聚合物为检测类风湿关节炎免疫抗体的抗原，并分别用于ELISA和胶体金侧向层析检测(微孔滤膜上的CCP肽聚合物含量为20μg/cm²)，结果见表3。

表3ELISA和胶体金侧向层析法检测类风湿患者的比较

从表3可见，胶体金侧向层析法能够实现类风湿关节炎免疫抗体的体外检测，其抗体检测的灵敏度和专一性与ELISA相比基本一致，从而能使检测更快速简便，扩大了检测的适用人群。

序列表

<110>上海荣盛生物药业有限公司

<120>胶体金侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物

<130>BRS.HF.9004

<160>261

<170>PatentIn version 3.3

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<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>74

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1 5 10 15

Gly

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<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>75

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1 5 10 15

Gly

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<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>76

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1 5 10 15

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<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>77

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1 5 10 15

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<211>17

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<213>人工合成

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<223>Xaa为瓜氨酸

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

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1 5 10 15

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1 5 10 15

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1 5 10 15

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<400>137

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<213>人工合成

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<213>人工合成

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<400>144

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1 5 10 15

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>145

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1 5 10 15

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>146

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1 5 10 15

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<213>人工合成

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<400>147

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<213>人工合成

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<400>148

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<213>人工合成

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<213>人工合成

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<400>151

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<213>人工合成

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<400>152

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<213>人工合成

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<400>153

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>154

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1 5 10 15

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<213>人工合成

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<400>155

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<213>人工合成

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<400>156

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>157

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>158

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1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 159

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>159

His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Arg His Xaa Arg Leu Ile Ala Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 160

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>160

His Gln Cys Ala Arg Phe Gln Phe Arg His Xaa Ser Leu Ile Arg Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 161

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>161

His Gln Cys Ala Arg Phe Gln Phe Arg His Xaa Arg Arg Ile Arg Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 162

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>162

His Gln Cys Ala Arg Phe Gln Phe Arg His Xaa Arg Leu Ala Arg Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 163

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>163

His Gln Cys Ala Arg Phe Gln Phe Arg His Xaa Arg Leu Ile Ala Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 164

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>164

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1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 165

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>165

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1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 166

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>166

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1 5 10 15

Gly

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<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>167

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1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 168

<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>168

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1 5 10 15

Gly

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<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>169

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1 5 10 15

Gly

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<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>170

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1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 171

<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>171

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1 5 10 15

Gly

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<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>172

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1 5 10 15

Gly

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<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>173

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1 5 10 15

Gly

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<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>174

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1 5 10 15

Gly

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<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>175

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1 5 10 15

Gly

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<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>176

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1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 177

<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>177

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1 5 10 15

Gly

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<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>178

His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Arg His Xaa Ser Leu Ile Arg Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 179

<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>179

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>180

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1 5 10 15

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<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>181

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1 5 10 15

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>182

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<211>17

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>184

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>185

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1 5 10 15

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>186

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1 5 10 15

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>187

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1 5 10 15

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>188

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>189

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>190

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>191

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>192

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1 5 10 15

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>193

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1 5 10 15

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<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>1

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1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 195

<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>195

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1 5 10 15

Gly

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>196

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1 5 10 15

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<210>SEQ ID No 197

<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>197

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1 5 10 15

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<210>SEQ ID No 198

<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>198

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<211>17

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<213>人工合成

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<211>17

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<400>201

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<213>人工合成

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<400>202

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<213>人工合成

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<400>203

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<213>人工合成

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<400>204

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>205

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>206

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>208

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>209

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>210

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>211

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>212

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<210>SEQ ID No 213

<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>213

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<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>214

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1 5 10 15

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<210>SEQ ID No 215

<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>215

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1 5 10 15

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<210>SEQ ID No 216

<211>17

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<213>人工合成

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<400>216

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1 5 10 15

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<210>SEQ ID No 217

<211>17

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<213>人工合成

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<400>217

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1 5 10 15

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>218

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>219

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<213>人工合成

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<400>220

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>221

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>222

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<211>17

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<400>223

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<213>人工合成

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<400>224

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>225

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1 5 10 15

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>226

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>227

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1 5 10 15

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<211>17

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<213>人工合成

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<400>228

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1 5 10 15

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<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>229

His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Arg Gly Xaa Ser Leu Ile Arg Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 230

<211>17

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<213>人工合成

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<400>230

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1 5 10 15

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<210>SEQ ID No 231

<211>17

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<213>人工合成

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<400>231

His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Arg Gly Xaa Arg Leu Ala Arg Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 232

<211>17

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<213>人工合成

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<400>232

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1 5 10 15

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<210>SEQ ID No 233

<211>17

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<213>人工合成

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<400>233

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1 5 10 15

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<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>234

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1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 235

<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>235

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1 5 10 15

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<210>SEQ ID No 236

<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>236

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1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 237

<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>237

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1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 238

<211>17

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<213>人工合成

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<400>238

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1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 239

<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>239

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1 5 10 15

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<210>SEQ ID No 240

<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>240

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1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 241

<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>241

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<210>SEQ ID No 242

<211>17

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<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>242

His Gln Cys Ala Arg Phe Gln Met Arg His Xaa Ser Arg Ala Ala Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 243

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>243

His Gln Cys Ala Arg Phe Gln Phe Arg His Xaa Ser Arg Ala Arg Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 244

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>244

His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Arg His Xaa Ser Arg Ala Arg Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 245

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>245

His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Arg His Xaa Ser Arg Ala Arg Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 246

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>246

His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Arg His Xaa Ser Arg Ala Arg Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 247

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>247

His Gln Cys Ala Arg Phe Gln Met Arg Gly Xaa Arg Arg Ala Ala Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 248

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>248

His Gln Cys Ala Arg Phe Gln Phe Arg His Xaa Arg Arg Ala Ala Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 249

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>249

His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Arg His Xaa Arg Arg Ala Ala Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 250

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>250

His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Arg His Xaa Arg Arg Ala Ala Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 251

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>251

His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Arg His Xaa Arg Arg Ala Ala Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 252

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>252

His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Arg His Xaa Arg Leu Ile Arg Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 253

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>253

His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Arg Gly Xaa Arg Leu Ile Arg Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 254

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>47

His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Arg Gly Xaa Ser Leu Ile Arg Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 255

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>255

His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Arg Gly Xaa Arg Arg Ile Arg Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 256

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>256

His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Arg Gly Xaa Ser Arg Ala Arg Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 257

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>257

His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Arg Gly Xaa Ser Arg Ala Ala Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 258

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>258

His Gln Cys His Gln Phe Gln Met Arg Gly Xaa Ser Leu Ile Ala Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 259

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>259

His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Arg Gly Xaa Ser Leu Ala Ala Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 260

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>260

His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Arg His Xaa Ser Arg Ala Ala Cys

1 5 10 15

Gly

<210>SEQ ID No 261

<211>17

<212>PRT

<213>人工合成

<223>Xaa为瓜氨酸

<400>261

His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Arg Gly Xaa Ser Leu Ala Ala Cys

1 5 10 15

Gly

Claims

1.一种胶体金侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物，包括CCP肽组合物、高分子聚合物和侧向层析检测介质；CCP肽组合物与高分子聚合物共价结合形成的CCP肽聚合物共价或非共价地结合于侧向层析检测介质上；其中，所述CCP肽组合物包含SEQID No：1和SEQ ID No：118；所述SEQ ID No：1与所述SEQ ID No：118的摩尔比为1∶1。

2.根据权利要求1所述的胶体金侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物，其特征在于所述CCP肽与高分子聚合物之间的共价键选自于酰胺键、尿键、酯键、硫醚键、腙键、肟键或二硫键。

3.一种胶体金侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物，包括CCP肽组合物、高分子聚合物和侧向层析检测介质；CCP肽组合物与高分子聚合物非共价结合形成的CCP肽聚合物共价或非共价地结合于侧向层析检测介质上；其中，所述CCP肽组合物包含SEQID No：1和SEQ ID No：118；所述SEQ ID No：1与所述SEQ ID No：118的摩尔比为1∶1。

4.根据权利要求1或3所述的胶体金侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物，其特征在于所述侧向层析检测介质上结合的CCP肽聚合物含量为100ng-500μg/cm²。

5.根据权利要求1或3所述的胶体金侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物，其特征在于所述侧向层析检测介质上结合的CCP肽聚合物含量为1μg-100μg/cm²。

6.根据权利要求1或3所述的胶体金侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物，其特征在于所述侧向层析检测介质上结合的CCP肽聚合物含量为1μg-50μg/cm²。

7.根据权利要求1或3所述的胶体金侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物，其特征在于所述高分子聚合物分子量大于2,000Da。

8.根据权利要求1或3所述的胶体金侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物，其特征在于所述高分子聚合物选自于牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白、鸡卵清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、分叉型聚合物、聚赖氨酸、聚乙二醇、亲和素或抗体。

9.根据权利要求1或3所述的胶体金侧向层析检测类风湿关节炎免疫抗体的组合物，其特征在于所述侧向层析检测介质上还结合有增强剂银盐。