JP3334936B2 - 新規なヘキサペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【発明の背景】

【０００１】本発明は、ヒット好中球によって発現する
白血球応答インテグリン（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｒｅｓ
ｐｏｎｓｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）〔ＬＲＩ〕のリガンド
結合特異性を有する新規な合成ヘキサペプチドに関す
る。

【０００２】食細胞は、細胞−マトリックス及び細胞−
細胞の接着を仲介する接着性受容体のインテグリン（ｉ
ｎｔｅｇｒｉｎ）超集団の幾つかの群を発現する（総説
として、本明細書の後に付けた引用文献１を参照のこ
と）。かかるインテグリンは、ＶＬＡ（β₁ ）族（文献
２、３参照）及びよく記述されているＬｅｕ−ＣＡＭ
（β₂ ）族（文献１参照）の両方の群を含む。

【０００３】かかる分子種の外に、ヒト好中球（ＰＭ
Ｎ）及び単核細胞にて発現する新規のインテグリン（ｉ
ｎｔｅｇｒｉｎ）であって、白血球応答インテグリン
（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｉｎｔｅｇ
ｒｉｎ）〔ＬＲＩ〕として述べられている（文献４〜６
参照）新規なインテグリンがある。

【０００４】ＬＲＩの構造的及び免疫学的特性は、これ
まで、述べられたことのないインテグリンであることを
示唆している。しかしながら、ＬＲＩはβ₃ インテグリ
ン族〔細胞接着因子（ｃｙｔｏａｆｈｅｓｉｎ）〕に最
も関係している（文献４〜６参照）。それは、血小板抗
原ｇｐIII ａ（β₃ ）と免疫学上の交差反応性があり、
β₃ に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ ７Ｇ２）
は、ＬＲＩ関与の機能を止めることが出来る（文献６参
照）。

【０００５】ｍＡｂ ７Ｇ２は、基底膜蛋白であるエン
タクチン（文献７参照）から派生するＡｒｇ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ（ＲＧＤ）含有ペプチドに対するＰＭＮの接着と
化学走性（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ）と同じく、ＲＧＤに
刺激された（ＲＧＤ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）、ＰＭＮ
と単核細胞の両方による、食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏ
ｓｉｓ）を抑制する（文献６参照）。更に、ＬＲＩは、
物理的にも機能的にも、別個の５０Ｋｄのプラズマ膜抗
原のインテグリン関連蛋白（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ａｓｓ
ｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ）〔ＩＡＰ〕と関連し
ている（文献６）。

【０００６】ｍＡｂ ７Ｇ２と同じく、ＩＡＰに対する
モノクローナル及びポリクローナルの抗体は、ＰＭＮと
単核細胞（文献５、６）のＲＧＤ刺激の食作用及びＲＧ
Ｄエンタクチンペプチド（文献７）に対するＰＭＮの接
着や化学走性を抑制する。

【０００７】この様に、ＬＲＩとＩＡＰは、複合体（ｃ
ｏｍｐｌｅｘ）として、ＲＧＤ含有接着性蛋白による食
細胞の活性化のシグナル導入ユニット（ｓｉｇｎａｌ
ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）を構成している
と信じられている。

【０００８】ＲＧＤ配列を含む幾つかの接着性蛋白は、
ＬＲＩ及びＩＡＰを経由してＰＭＮ活性化のシグナルを
導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｅ）出来る。エンタクチン（文
献７）の他に、かかる蛋白にフィブリノーゲン、フィブ
ロネクチン、フォンウィレブラント因子（ｖｏｎ Ｗｉ
ｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ ｆａｃｔｏｒ）、ヴィトロネク
チン（ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）及びＩＶ型コラーゲン
が挙げられる（文献５）。

【０００９】ＬＲＩ−ＩＡＰは活性化に必要なシグナル
（ｓｉｇｎａｌｓ）を出す（ｔｒａｎｓｄｕｃｅ）一方
で、他の接着性受容体がリガント結合に関与しているか
も知れない。例えば、たとえ細胞結合ドメイン内のＲＧ
Ｄ配列が単核細胞（文献８、９）及びＰＭＮ（文献５）
の両方による食作用の増加に係わっているとしても、細
胞結合ドメインより他のフィブロネクチン内のドメイン
が、食細胞接着（文献８）に関与しているようだ。更
に、フィブリノーゲン（Ｆｇ）の刺激による摂食（ｆｉ
ｂｒｉｎｏｇｅｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｉｎｇｅｓ
ｔｉｏｎ）は、ＬＲＩ及びＩＡＰに対する抗体によって
完全に抑制されるが、Ｆｇはまたβ₂ インテグリン族の
一つのαｍβ ₂ （ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）（文献１０−
１２）にも結合する。

【００１０】これらの事実は、食細胞の活性化にインテ
グリン受容体が協調しているという興味ある可能性を提
起するものである。

【発明の簡単な説明】

【００１１】本発明によって、ヒト好中球にて発現する
白血球応答インテグリン（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｒｅｓ
ｐｏｎｓｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）〔ＬＲＩ〕のリガンド
結合特異性を有する、新規な合成ヘキサペプチドが提供
される。

【００１２】かかる新規ヘキサペプチドは次の配列を有
する、即ちＬｓｙ Ｇｌｙ ＡｌａＧｌｙ Ａｓｐ Ｖ
ａｌ（ＫＧＡＧＤＶ）〔配列番号ＩＤ ＮＯ：１〕であ
る。

【００１３】フィブリノーゲン（Ｆｇ）には、α鎖の内
とγ鎖、即γ３８４〜４１１、ここにアミノ酸配列ＡＫ
ＱＡＧＤＶ〔配列番号ＩＤ ＮＯ：２〕（文献１３〜１
５）があるが、このγ鎖のＣ末端領域の１５アミノ酸ペ
プチドの内とに、２つのＲＧＤ配列がある。これらの領
域は双方とも血小板ｇｐIIｂ／III ａ（αIIｂβ₃ ）
（文献１３−１５）へのフィブリノーゲンの結合に関与
している。

【００１４】Ｆｇの幾つかのドメインが、γ鎖ペプチド
或いはαｍβ₂ （文献１０）にて認識される領域部分の
如きＰＭＮにリガンド結合するのに関与しているかも知
れないが、ＲＧＤ配列はＬＲＩ活性化に特異的に作用す
るものであろうと仮定されて来た。

【００１５】本明細書で述べる研究によると、実際、Ｒ
ＧＤもγ鎖ペプチドの双方ともにＬＲＩのリガンドであ
るということが明らかになった。更に天然のγ鎖配列の
ＫＱＡＧＤＶ〔配列番号ＩＤ ＮＯ：３〕が本発明の新
規なペプチドのＫＧＡＧＤＶ〔配列番号ＩＤ ＮＯ：
１〕へ変異して、ＬＲＩリガンドの結合とＰＭＮ活性化
とは保たれていた。後者の配列は、これまでに唯一述べ
られている天然のＦｇのγ鎖ペプチドの受容体、αIIｂ
β₃ 、を含む他のいかなるインテグリン受容体に対して
もリガンドになり得ることは知られていない。

【００１６】面白いことに、ＰＭＮが、ＦＭＬＰ（Ｎ−
フォルメル−メチル−ロイシル−フェニルアラニン〕又
は免疫複合物（ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）で
刺激されると、ＬＲＩリガンドの結合特異性がアミノ酸
配列ＫＧＡＧＤＶに対して著しく増大し、ＲＧＤに対し
て減少した。

【００１７】即ち、天然の配列、ＫＱＡＧＤＶが、アラ
ニンがアルギニンに１アミノ酸置換にる変異を受けペプ
チドＫＱＲＧＤＶ〔配列番号ＩＤ ＮＯ：５〕となり、
核変異によってＦｇの刺激による摂食（Ｆｇ−ｓｔｉｍ
ｕｌａｔｅｄ ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ）をペプチドの抑制
する能力が１／３０以下に減少することが判った。

【００１８】対照的に、グルタミンをグリシンへ１アミ
ノ酸置換して生じた本発明の新規ペプチド、ＫＧＡＧＤ
Ｖで、驚くべきことにかつ予想外にもペプチドの能力が
４倍増した。

【００１９】β₁ 及びβ₂ のインテグリン族に対する抗
体は、ＬＲＩに対するＫＧＡＧＤＶの結合に何ら影響を
示さなかった、一方β₃ とＩＡＰの双方に対する抗体
は、ＬＲＩに対するＫＧＡＧＤＶの結合を抑制した。

【００２０】これらのデータは、ＬＲＩが細胞の活性化
状態によって調節を受けるかも知れないペプチドリガン
ドの認識能力を表わしていることを示す。

【００２１】その上、ユニークなアミノ酸配列ＫＧＡＧ
ＤＶは、ＬＲＩに対する特異なリガンドを表わしてい
る。

【００２２】本発明の詳細は、特別にさし示した特許請
求項や本発明を形づくっていると見なせる（主題内容
ｓｕｂｊｅｃｔ ｍａｔｔｅｒ）を明確に述べることで
結論を下す一方で、本発明は次に述べる図とともに挙げ
るより好ましい具体例の詳細な記述によって一層よく理
解されるものと信じる。

【００２３】即ち図１は、ＰＭＮによるフィブリノーゲ
ンの刺激によるＥＩｇＧ摂食に対する、フィブリノーゲ
ンのγ鎖ペプチドとＧＲＧＤＳＣ〔配列番号ＩＤ Ｎ
Ｏ：４〕の影響を示す図表示である。

【００２４】ＰＭＮ（１．０×１０⁵ ヶ）はコントロー
ル用ペプチド（ペプチド３２、ＧＨＧＰＧＥＱＱＬＲ）
〔配列番号ＩＤ ＮＯ：１１〕）、ＧＲＧＤＳＣ、或い
は１５アミノ酸のＦｇγ鎖ペプチドのいずれかの２５μ
ｇを室温で１５分間５，０００ユニットのカタラーゼ存
在下にインキュベートした。洗浄することなく、反応混
合物をＥｌｇＧと共に、バッファー或いは指示濃度のフ
ィブリノーゲンの存在下に１１５μｌの容量でインキュ
ベートした。３７℃で３０分間反応後、摂食（ｉｎｇｅ
ｓｔｉｏｎ）を食細胞性指数（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ
ｉｎｄｅｘ）として定量した。ＰＩ＝ＰＭＮ１００ヶに
て摂食されたＥＩｇＧの数。データは３回のテストの代
表である。ＧＲＧＤＳＣ及び１５アミノ酸のＦｇγ鎖ペ
プチドの双方ともフィブリノーゲンの刺激による摂食を
阻止する能力があり、一方そのいずれも刺激されてない
ＰＭＮによる摂食レベルには何の影響もなかった。

【００２５】図２は、ｍＡｂのＡｌＡ５（抗β₁ ）及び
７Ｇ２（抗β₂ ）の、ラミニンの刺激による摂食（ｌａ
ｍｉｎｉｎ−ｓｔｉｍｎｕｌａｔｅｄ ｉｎｇｅｓｔｉ
ｏｎ）に対する影響を図２におけるＡで示し、フィブリ
ノーゲンの刺激による摂食（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ−ｓ
ｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ）に対する影
響を図２におけるＢで示す図表示である。

【００２６】ＰＭＮ（１．０×１０⁵ ヶ）をＡｌＡ５、
７Ｇ２、あるいは対照の抗体β₃ Ｆ１２のいずれかの
０．２５μｇと共にカタラーゼ５，０００ユニットの存
在下で室温で１５分間インキュベートした。洗浄するこ
となく、反応混合物は、ＥｌｇＧと共に、バッファー又
は、指示濃度のラミン（図２におけるＡ）又はフィブリ
ノーゲン（図２におけるＢ）の存在下に、最終容量１１
５μｌでインキュベートした。３７℃で３０分間反応
後、摂食を評価した。ＰＩ＝１００ヶのＰＭＮによって
摂食されたＥｌｇＧの数。データは３回のテスト代表で
ある。

【００２７】抗β₁ は完全にラミンの刺激による摂食を
阻止したが、一方抗β₃ は何の効果も示さなかった。対
照的に抗β₃ はフィブリノーゲンの刺激による摂食を完
全に阻止したが、一方抗β₁ はフィブリノーゲンに対す
る量応答カーブを右側へシフトさせた。

【００２８】図３は、アミノ酸配列ＫＱＡＧＤＶ、ＫＱ
ＲＧＤＶ、及びＫＱＡＧＤＶを含むペプチドの、フィブ
リノーゲンの刺激による摂食に対する影響を示す図表示
である。

【００２９】ＰＭＮ（１．０×１０⁵ ヶ）は三つのヘキ
サペプチド（ＫＱＡＧＤＶ、ＫＱＲＧＤＶ、又はＫＧＡ
ＧＤＶ）の一つの濃度を増加させて（図３におけるＡ）
又は１５アミノ酸のＫＱＡＧＤＶペプチド或いは１２ア
ミノ酸のＫＧＡＧＤＶペプチドのいずれか（図３におけ
るＢ）と共に５，０００ユニットのカタラーゼ存在下に
室温で１５分間インキュベートした。洗浄することな
く、反応混合物を１０μｇ／mlのフィブリノーゲン存在
下でＥｌｇＧと共にインキュベートした。３７℃３０分
後に摂食を評価した。ＰＩ＝ＰＭＮ１００ヶによって摂
食されたＥｌｇＧの数。データは２回のテストを代表し
ている。

【００３０】データはペプチド濃度の対数に対してＦｇ
の刺激によるＰＩ（ＰＩ＝２５８）の百分率として示し
た。ペプチドのＩＤ₅₀は、２．５μＭ（ＫＧＡＧＤ
Ｖ）、１０μＭ（ＫＱＡＧＤＶ）、３１６μＭ（ＫＱＲ
ＧＤＶ）、３．５μＭ（１５アミノ酸ＫＱＡＧＤＶ）、
及び１．１μＭ（１２アミノ酸ＫＧＡＧＤＶ）であっ
た。

【００３１】対照ペプチドＫＧＡＬＥＶＡ〔配列番号Ｉ
Ｄ ＮＯ：６〕は７００μＭの濃度でＦｇの刺激による
摂食に何の影響もなかった。７００μＭのＫＧＡＬＥＶ
Ａに対するＦｇの刺激によるＰＩの百分率は１２０％で
あった。ＫＧＡＧＤＶの配列を含むペプチドは、フィブ
リノーゲンの刺激による摂食の阻害能力が最も大きかっ
た。

【００３２】図４は、アミノ酸配列のＲＧＤとＫＱＡＧ
ＤＶとＫＧＡＧＤＶを含む多価ペプチドの、ＰＭＮによ
るＥｌｇＧ摂食に対する影響を示す図表示である。

【００３３】ＰＭＮ（１．０×１０⁵ ヶ）とＥｌｇＧ
を、バッファー又は指示濃度の多価の分岐ペプチド（ｂ
ｒ−ＲＧＤ、ｂｒ−ＫＱＡＧＤＶ、又はｂｒ−ＫＧＡＧ
ＤＶ）と共に５，０００ユニットのカタラーゼ存在下に
インキュベートした。３７℃で３０分後、摂食を評価し
た。ＰＩ＝１００ＰＭＮによるＥｌｇＧ摂食数。データ
は３回のテストの代表である。

【００３４】アミノ酸配列ＫＧＡＧＤＶを含む多価ペプ
チドが配列ＲＧＤを含む多価ペプチドと比べて、刺激摂
食（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ）に
てより強力でかつより広い量応答範囲を示した。

【００３５】図５は、多価分岐ＲＧＤペプチド（図５に
おけるＡ）又は多価分岐ＫＧＡＧＤＶペプチド（図５に
おけるＢ）による刺激を受けたＥｌｇＧの摂食に対する
ｍＡｂのＡｌＡ５（抗β₁ ）の影響を示す図表示であ
る。

【００３６】ＰＭＮ（１．０×１０⁵ ヶ）を対照抗体
（３Ｆ１２）又はＡＩＡ５のいずれかの０．２５μｇと
共にカタラーゼ５，０００ユニット存在下に室温で１５
分間、インキュベートした。洗浄することなく、反応混
合物をＥｌｇＧと共に、バッファー又は指示濃度の分岐
ペプチドｂｒ−ＲＧＤ（図５におけるＡ）又はｂｒ−Ｋ
ＧＡＧＤＶ（図５におけるＢ）の存在下にインキュベー
トした。３７℃で３０分後、摂食を評価した。ＰＩ＝１
００ＰＭＮによるＥｌｇＧ摂食数。データは２回のテス
トの代表である。

【００３７】抗β₁ は、フィブリノーゲンの刺激による
摂食への影響（図２）と同じ様に分岐ＲＧＤに対して量
応答カーブを右方へシフトさせた。対照的に、抗β₁ は
分岐ＫＧＡＧＤＶの刺激による摂食に何の影響も与えな
かった。抗β₃ （７Ｇ２）は、両方の分岐ペプチドによ
る摂食を阻害した。

【００３８】図６は、無刺激のＰＭＮ及びＦＭＬＰの刺
激によるＰＭＮの、多価分岐ＫＧＡＧＤＶペプチドでコ
ートしたラテックスビーズを結合する能力に対する、Ａ
ＩＡ５（抗β₁ ）、７Ｇ２（抗β₃ ）及びポリクローナ
ル抗ＩＡＰの影響を示す棒グラフである。

【００３９】ＰＭＮ（３．０×１０⁵ ヶ）を、バッファ
ー、２μｇのネズミＩｇＧ１、６μｇのウサギＩｇＧ、
２μｇのＡＩＡ５、２μｇの７Ｇ２、又は６μｇのポリ
クローナル抗Ｂ６Ｈ１２のいずれかと共に、１５，００
０ユニットのカタラーゼの存在下に室温で１５分間イン
キュベートした。洗浄することなく、反応混合物を、Ｈ
ＳＡでコート、ＫＧＡＬＥＶＡでコート又は分岐ＫＧＡ
ＧＤＶでコートした１．３μｍのアルデヒド修飾ラテッ
クスビーズのいずれかと共に１μＭのＦＭＬＰ又はビー
クルコントロール（Ｖｅｈｉｅｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）
の存在下にインキュベートした。３７℃で１時間後に、
接着性を付加指数（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｉｎｄｅ
ｘ）として評価した。ＡＩ＝ＰＭＮ１００ヶによって結
合したビーズの数。

【００４０】ＨＳＡでコートしたビーズに対するＡＩは
対照細胞に対し５であり、ＦＭＬＰで刺激したＰＭＮに
対し５８であった。ＫＧＡＬＥＶＡでコートしたビーズ
に対するＡＩは対照細胞に対し１２であり、ＦＭＬＰで
刺激したＰＭＮに対し６５であった。分岐ＫＧＡＧＤＶ
でコートしたビーズのＦＭＬＰで刺激したＰＭＮに対す
る結合のＡＩは１４８〜４６８の範囲で変化した。ＦＭ
ＬＰで刺激したＰＭＮに結合する分岐ＫＧＡＧＤＶビー
ズの平均ＡＩは３１７±４７ＳＥＭ、ｎ＝７であった。

【００４１】抗β₁ も対照抗体のいずれも、分岐ＫＧＡ
ＧＤＶでコートのビーズが対照細胞又はＦＭＬＰで刺激
したＰＭＮのいずれかに結合するのに、何の影響もなか
った。対照的にＬＲＩ機能を阻害する二つの抗体７Ｇ２
及び抗ＩＡＰは、分岐ＫＧＡＧＤＶでコートしたビーズ
の結合を阻害した。

【００４２】図７は、ｍＡｂのＩＢ４（抗β₃ ）とＯＫ
ＭＩＯ（抗ｄｍ）の多価ＫＧＡＧＤＶペプチドコートの
ビーズ結合に対する効果（図７におけるＡ）及び多価Ｋ
ＧＡＧＤＶペプチドの刺激によるＥｌｇＧの摂食に対す
る効果（図７におけるＢ）を示す図表示である。

【００４３】図７におけるＡでは：ＰＭＮ（３．０×１
０⁵ ヶ）を、バッファー又は指示濃度のｍＡｂのいずれ
かと共に、１５，０００ユニットのカタラーゼの存在下
に室温で１５分間インキュベートした。洗浄することな
く、反応混合物を分岐ＫＧＡＧＤＶでコートしたラテッ
クスビーズと共に、１μＭのＦＭＬＰ存在下に３７℃で
１時間インキュベートした。ＡＩ＝ＰＭＮ１００ヶにて
結合したビーズの数。

【００４４】図７におけるＢでは：ＰＭＮ（１．０×１
０⁵ ヶ）をバッファー又は指示濃度のｍＡｂのいずれか
と共に、５，０００ユニットのカタラーゼの存在下に室
温で１５分間インキュベートした。洗浄することなく、
反応混合物をＥｌｇＧと共に、５μｇ／mlの分岐ＫＧＡ
ＧＤＶの存在下にインキュベートした。３７℃３０分後
に、摂食を評価した。ＰＩ＝ＰＭＮ１００ヶによって摂
食されたＥｌｇＧの数。

【００４５】菱形マークは無刺激のＰＭＮによるＥｌｇ
Ｇ摂食のレベルを表わしている。１．０×１０⁵ ヶのＰ
ＭＮに対する０．５μｇの抗体濃度で、ｍＡｂの７Ｇ２
のみが分岐ＫＧＡＧＤＶコートのビーズの結合を十分に
抑制しており、一方三つの抗体すべてが、同じ濃度では
ＥｌｇＧの分岐ＫＧＡＧＤＶで刺激された摂食を抑制し
ている。

【００４６】図８は、ヘキサペプチドＫＧＡＧＤＶ及び
ＫＱＲＧＤＶの、多価ＫＧＡＧＤＶペプチドでコートし
たビーズの対照（図８におけるＡ）及びＦＭＬＰで刺激
したＰＭＮ（図８におけるＢ）による結合に対する、影
響を示した図表示である。

【００４７】ＰＭＮ（３．０×１０⁵ ヶ）を、バッファ
ーと又は濃度を高くして行ったペプチドと共に、１５，
０００ユニットのカタラーゼの存在下に室温で１５分間
インキュベートした。洗浄することなく、反応混合物を
分岐ＫＧＡＧＤＶでコートしたラテックスビーズと共
に、１μＭのＦＭＬＰ（図８におけるＢ）又はビークル
コントロール（Ｖｅｈｉｃｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）（図
８におけるＡ）の存在下に、３７℃で１時間インキュベ
ートした。ＡＩ＝ＰＭＮ１００ヶにて結合したビーズ
数。データは２回のテストの代表である。

【００４８】対照ＰＭＮに結合するＨＳＡでコートした
ビーズに対するＡＩは６で、ＦＭＬＰで刺激したＰＭＮ
に結合するＨＳＡでコートしたビーズに対するＡＩは２
８であった。データは百分率コントロールの分岐ＫＧＡ
ＧＤＶビーズの結合〔（Ａ）ではＡＩ＝１６２、（Ｂ）
ではＡＩ＝４４４〕としてペプチド濃度の対数に対して
プロットして表示した。

【００４９】両ペプチドの、分岐ＫＧＡＧＤＶでコート
したビーズのコントロールＰＭＮへの結合の阻害に対す
るＩＤ₅₀は約１９μＭであった。対照的にＫＱＲＧＤＶ
の、分岐ＫＧＡＧＤＶでコートしたビーズのＦＭＬＰで
刺激したＰＭＮへの結合阻害に対する、ＩＤ₅₀は６０μ
Ｍであった。一方ＫＧＡＧＤＶの、刺激を受けたＰＭＮ
へのビーズの結合阻害に対するＩＤ₅₀は約２．５μＭで
あった。コントロールのペプチドＫＧＡＬＥＶＡは、分
岐ＫＧＡＧＤＶビーズの、コントロールＰＭＮ又は刺激
を受けたＰＭＮのいずれかに結合することに７００μＭ
の濃度でさえも影響しなかった。７００μＭのＫＧＡＬ
ＥＶＡに対する百分率コントロールのビーズ結合はコン
トロールのＰＭＮについて１０８％でありＦＭＬＰで刺
激されたＰＭＮについては１１３％であった。

【００５０】本明細書の中で括弧の中に挙げた引用文献
は本明細書の後にリストにして挙げた。

【００５１】本明細書の中で使った省略語は次の通りで
ある。即ちＡＩは付着指数（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｉ
ｎｄｅｘ）；ｂｒ−ＫＧＡＧＤＶはアミノ酸配列ＫＧＡ
ＧＤＶを含有する多価の分岐ペプチド；ＥｌｇＧはＩｇ
Ｇでオプソナイズ（ｏｐｓｏｎｉｚｅ）された羊の赤血
球；Ｆｇはフィブリノーゲン；ＦＭＬＰはＮ−フォルミ
ル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン；ＩＡＰ
はインテグリン関連蛋白；ＬＡＤは白血球付着欠陥（ｌ
ｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅ
ｎｃｙ）；ＬＲＩは白血球応答インテグリン（ｌｅｕｋ
ｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ）；
ＰＩは食細胞性指数（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｉｎｄｅ
ｘ）；ＰＭＮは多形核白血球（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎ
ｕｃｌｅａｒ ｌｅａｋｏｃｙｔｅ）；及びＲＧＤはＡ
ｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐである。

【００５２】本発明の新規ペプチドは、公知の溶液及び
個相のペプチド合成方によって調製できる。

【００５３】通常の溶液相ペプチド合成では、ペプチド
鎖は、構成成分のアミノ酸を望ましい順序で伸長中のペ
プチド鎖に付加する様な一連のカップリング反応を行う
ことによって調製することができる。様々なＮ末端保護
基、例えばカルボベンゾイルオキシのグループ又はｔ−
ブチルオキシカルボニルのグループ（ＢＯＣ）、様々な
カップリング剤、例えばジィシクロヘキシルカルボジイ
ミド又はカルボニル・ジミィダゾール、様々な活性エス
テル、例えばＮ−ヒドロキシフタルイミド又はＮ−ヒド
ロキシ−スクシィニイミドのエステル体、及び様々な開
裂試剤、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジオキサ
ン中の塩化水素、ボロン−トリス（トリフルオロアセテ
ート）やシアン化臭素、を使用し溶液で反応し、反応中
間体を分離し精製するのはよく知られた古典的なペプチ
ド調製の方法である。

【００５４】ペプチド合成方は、より好ましくは通常の
メリフィールドの固相工程に従う。メリフィールド著
Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第８５巻、２１４９
−５４ページ（１９６３年）及びＳｃｉｅｎｃｅ、第１
５０巻、１７８−８５ページ（１９６５年）を参照のこ
と。本工程は、多くの同じ化学反応及び古典的ペプチド
合成の保護基を使用しているにも係らず固相支持体、通
常は架橋ボリスチレン又はスチレン・ジビニルベンゼン
共重合体又は好ましくはペプチドのアミド合成用のｐ−
メチルベンズヒドリルアミンポリマーの固相支持体にカ
ルボキシ末端によってアンカーになっている伸長中のペ
プチド鎖を供給する。本方法は、各ステップで過剰の試
薬の除去を、単にポリマーを洗浄することで効率よく出
来るので、多くの工程上の操作を行ない易く簡素化して
いる。

【００５５】確立された固相合成工程について更に背景
となる情報は、スチュワートとヤングによる論文「Ｓｏ
ｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ」（Ｗ．Ｈ．フリーマン＆Ｃｏ．サンフランシス
コ、１９６９年版）やＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ；第３２巻、２２１〜２９６ページ
（Ｆ．Ｆ．ノールド編集、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ出版、ニューヨーク、１９６９
年）エリックソンとメリーフィールド著「Ｔｈｅ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ」１第２巻、２５５ページ及びその次のペ
ージ（ノイラースとヒル編集）〔Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ出版、ニューヨーク、１９７６年〕の参考文献
で得られる。

【００５６】本発明を更に例示する為に、次の典型的な
実験室的な調製操作を実施した。しかしながら本発明は
これらの実施例や以下に詳述することに限られるもので
はない。

【実施例】

【材料と方法】試薬とペプチド

【００５７】Ｎ−フォルミル−メチオニル−ロイシル−
フェニルアラニン（ＦＭＬＰ）とカタラーゼ（ボバイン
肝臓由来、５２，０００Ｕ／mg）はシグマ化学社（セン
トルイス、ミズーリ州）から購入した。ＦＭＬＰ（２
２．９ｍＭ）はＭｅ₂ ＳＯのストック溶液（アルドリッ
チ製）として調製し、−７０℃で保存し、使用直前に水
性溶媒に希釈した。

【００５８】溶媒効果のコントロール（対照）として等
量濃度のビークル（ｖｅｈｉｃｌｅ）を使用した。

【００５９】鶏卵アルブミン（オバルミン）はカルバイ
オケムーベリング・コープ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂ
ｅｈｒｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）、ラ・ホイア市、カリホル
ニア州から購入した。パイロジェン・フリーのヒト血清
アルブミン（ＨＳＡ）は２５％滅菌水溶液として米国赤
十字血液サービス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏ
ｓｓ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ワシントン、
ＤＣ．から入手した。ハンクの均衡塩溶液（Ｈａｎｋ’
ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）
（ＨＢＳＳ）の１０倍濃度ストック溶液はギブコ・ラボ
ラトリーズ、グランドアイランド市、ニューヨーク州、
から購入した。バッファー調製用のパイロジン・フリー
の水はケンダール・マックゴウ（Ｋｅｎｄａｌｌ Ｍｅ
Ｇａｗ）、イルヴィーン市、カリホルニア州から入手し
た。精製ヒト・フィブリノーゲン（Ｆｇ）はアメリカン
・ダイアグノスティカ社（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ．）、グリーンウィッチ市、コ
ネティカット州（ＣＴ．）から購入した。ＥＨＳ肉腫細
胞株からの精製ネズミ・ラミニン（ｍｕｒｉｎｅｌａｍ
ｉｎｉｎ）はヒンダ・クラインマン博士（Ｄｒ．Ｈｙｎ
ｄａ Ｋｌｅｉｎｍａｎｎ）、ナショナル・インスティ
チュート・オブ・デンテル・リサーチ、ベセスダ市、メ
リーランド州から与えて貰った。精製したウサギＩｇＧ
抗牛血清（ＢＳＡ）及び精製ＢＳＡはオルガノン・テク
ニカ社（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒ
ｐ．）ウエスト・チェスター市、ペンシルヴァニア州か
ら購入した。

【００６０】次に挙げるペプチドは、以下に指示する如
くして得た。即ち、１５アミノ酸のＦｇのγ鎖ペプチ
ド、ＧＱＱＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ〔配列番号ＩＤ
ＮＯ：７〕、はバッケム社（Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎ
ｃ．）、トレンス市、カリホルニア州から購入した。ヘ
キサペプチドのＧＲＧＤＳＣ、ＫＱＡＧＤＶ、ＫＧＡＧ
ＤＶ、ＫＱＲＧＤＶ、１２アミノ酸のＦｇのγ鎖ペプチ
ドでＨＨＬＧＧＡＫＧＡＧＤＶ〔配列番号ＩＤ ＮＯ：
８〕及びＨＨＬＧＧＡＫＱＲＧＤＶ〔配列番号ＩＤ Ｎ
Ｏ：９〕へ変異したもの、及びコントロールペプチドＫ
ＧＡＬＥＶＡは自動化固相合成によって調製した。多価
ペプチドの分岐したＧＲＧＤＳＰＡ（ｂｒ−ＲＧＤ）、
分岐したＫＧＡＧＤＶＡ（ｂｒ−ＫＧＡＧＤＶ）、分岐
したＫＱＡＧＤＶＡ（ｂｒ−ＫＱＡＧＤＶ）及び分岐し
たＫＧＡＧＤＶＡで最後から２番目の所にカルボキシ末
端Ｙ（ａ ｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙ
ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｙ）を持ったもの（分岐Ｙ−ＫＧＡ
ＧＤＶ）は、ポスネットら〔文献１７〕の合成概念に基
づき、９−フルオレニルメチロキシカルボニル（ｆｍｏ
ｃ）化学とＲＡＭＰＳシステム（デュポン社、ウィルミ
ントン市、デラウェア州〔ＤＥ〕）を用いて調製した。
ペプチドはすべてＨＰＬＣで純度８０％以上に精製しア
ミノ酸組成を分析した。更にドデカペプチドのＨＨＬＧ
ＧＡＫＧＡＧＤＶ及びＨＨＬＧＧＡＫＱＲＧＤＶは、ア
ミノ酸配列を解析して再度チェックした。

【００６１】ＰＭＮの機能に及ぼすペプチドの非特異的
影響のコントロールとして、５００〜７００μＭ濃度の
一価ペプチドを、ＰＤＢｕの刺激によるＥｌｇＧの摂食
の抑制についてチェックした。分岐ＲＧＤの調製と構造
については以前に述べている（文献６）。分岐Ｙ−ＫＧ
ＡＧＤＶに於るＹの位置で、受容体の結合部位から離れ
た部位に¹²⁵ Ｉで放射線標識ができた。抗体

【００６２】精製したｍＡｂ（モノクローナル抗体）は
次の様にして得た。即ち、ＯＫＭ１（ＩｇＧ−２ｂ）及
びＯＫＭ１０（ＩｇＧ２ａ）（抗ＣＤ１１ｂ）はパトリ
シア・ラオ博士（Ｒ．Ｗ．ジョンソン・ファーマセェオ
ティカル・リサーチ・インスティチュート、ラリタン
市、ニュージャージィー州）から与えて貰った。ＩＢ４
（ＩｇＧ２ａ抗ＣＤ１８）は以前に記述した（文献１
８）通りであった。ＡＩＡ５（ＩｇＧ１抗β₁ ）はマー
ティン・ヘムラー（ダナ・ファーバー・キャンサーセン
ター、ハーバード・メディカル・スクール、ボストン
市、マサチューセッツ州）から与えて貰った。４Ｂ４
（ＩｇＧ１抗β₁ ）はコウルター社（Ｃｏｕｌｔｅｒ，
Ｉｎｃ．）〔マイアミ市、フロリダ州〕から購入した。
７Ｇ２（ＩｇＧ１抗β₃ ）、Ｂ６Ｈ１２（ＩｇＧ１抗Ｉ
ＡＰ）及び３Ｆ１２（ＩｇＧ１抗ｄｖ）は以前に記述し
た（文献５）通りに調製した。ＩＡＰ抗原に対するポリ
クローナルのウサギＩｇＧは以前に記述した（文献６）
通りに産生・精製した。ＶＬＡ５に対する（ヤギのポリ
クローナルＩｇＧはルドルフ・ジュリア）博士（ノース
カロライナ大学、Ｃｈａｐｅｌｌ Ｈｉｌｌ市、ノース
カロライナ州）から与えて載いた。（ネズミＩｇＧ１、
ネズミＩｇＧ２ａ及びネズミＩｇＧ２ｂに対するコント
ロールの精製ウサギＩｇＧはサザーン・バイオテクノロ
ジー・アソシエーツ社（バーミンガム市、アラバマ州）
から購入した。

【００６３】抗β₁ 抗体、抗β₂ 抗体及び抗β₃ 抗体
の、非刺激のＰＭＮ及びＦＭＬＰの刺激によるＰＭＮに
対する結合は蛍光フロー・マイクロサイトメトリー（文
献５）によってチェックした。

【００６４】同型のコントロール抗体の平均蛍光強度
（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓ
ｉｔｉｔｅｓ）〔ＭＦ１〕を差し引いたテスト抗体での
ＭＦ１は次の様であった。即ち抗β₁ （ＡＩＡ５）は無
刺激ＰＭＮで４１及び刺激ＰＭＮで３９であった。抗β
₂ （ＩＢ４）は無刺激ＰＭＮで１１６及び刺激ＰＭＮで
１４５であった。そして抗β₃ （７Ｇ２）は無刺激ＰＭ
Ｎで４２及び刺激ＰＭＮで７４であった。

【００６５】抗β₁ でのデータは、β₁ インテグリンの
発現がβ₂ インテグリンと異なって、ＰＭＮ刺激を増加
しないことを示したボーンサックらのデータ（文献２）
を確認するものである。７Ｇ２でのデータは、７Ｇ２が
ＰＭＮを認識しなかったことを示唆したブラウンとグッ
ドウインのデータ（文献４）とは異なっている。この矛
盾の主原因は技術的なことである。即ち７Ｇ２のＰＭＮ
との反応性をフロー・サイトメトリーで最もよく検出す
るには、精製した抗体、組織培養上清がないこと、及び
ＰＭＮの刺激が必要である。これらのデータは、７Ｇ２
が多価ＲＧＤに刺激されたＰＭＮによる食作用を阻害す
るということを示す以前の公表データ（文献６）を確認
するものである。ＰＭＮの単離

【００６６】ＰＭＮは、ＰＭＮに与えられそうなダメー
ジを避けるために、混入した赤血球が低張性溶血（ｈｙ
ｐｏｔｏｎｉｃ ｌｙｓｉｓ）しない様に正常のボラン
ティアから以前に記述した（文献１９）と同じ方法で単
離した。血小板の計数はＰＭＮ調製で行ない、ＰＭＮ１
００ヶ当たり血小板１０ヶより少なかった。ＰＭＮは、
４．２ｍＭ ＮａＨＣＯ₃ 、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、
１．５ｍＭ Ｃａｃｌ₂、１．５ｍＭ Ｍｇｃｌ₂ 及び
１％オバルミンを含んだＨＢＳＳ〔ｐＨ７．４〕（ＨＢ
ＳＳ＋＋−１％ＯＶＡ）に懸濁させた。食作用アッセイ

【００６７】ＰＭＮ食作用は、先に記述した（文献５、
６）と同様にフル−イッド相アッセイ（ｆｌｕｉｄ−ｐ
ｈａｓｅ ａｓｓａｙ）で評価した。反応混合物につい
ては、本明細書の前の図の説明箇所で簡単に述べてい
る。羊の赤血球（Ｅ）はウイタッカーＭ．Ａ．バイオプ
ロダクツ（ｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｄ
ｕｃｔｓ）〔ウォーカースヴィレ市、メリーランド州〕
から購入した。ＩｇＧオプソナイズドＥは先述（文献１
９）と同様に調製した。食作用は光学顕微鏡で評価し、
ＰＭＮ１００ヶ当たり摂食されたＥｌｇＧの数を食作用
指数（ＰＩ）として定量した。血小板擬集アッセイ

【００６８】ヒト血小板の多い血漿を用いた擬集試験
は、先に述べた（文献２０）と同様に実施した。簡単に
述べると、過去２週間に抗小血板薬剤を服用していない
ボランティアの人から血液を、１／１０容量のＣＣＤバ
ッファー（１００ｍＭクエン酸ナトリウム、１３６ｍＭ
グルコース、ｐＨ６．５）に集めた。該血液を１０００
ｘｇで３分間遠心し、血小板リッチ血漿（ｐｌａｔｅｌ
ｅｔ ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ）〔ＰＲＰ〕をプラスチ
ック・ピペットでプラスチックチューブへ移した。この
ＰＲＰは血小板プーア血漿（抗凝固血液を２０００ｘｇ
で１５分間遠心して調製したもの）で２×１０⁸ ヶ血小
板／ｍｌに調製し、氷上に置いた。ＰＲＰとコントロー
ルの塩溶液又はテスト用ペプチド（５００μｌ）を５μ
ＭのＡＤＰと共にシリコン処理したガラス製キュベット
の中で攪拌（毎分９００回）し３７℃でインキュベート
した。

【００６９】凝集の広がりを、ＡＤＰ添加後２分、ペイ
トン・アグリメーター（Ｐａｙｔｏｎ ａｇｇｒｅｍｅ
ｔｅｒ）でモニターした。各サンプルに対する凝集阻害
は次の式を用いて決定した。即ち、阻害％＝（Ｔｐｅｐ
−Ｔｂａｓｅ）／（Ｔａｇｇ−Ｔｂａｓｅ）×１００、
ここでＴｂａｓｅ＝ＰＲＰでの光透過率（％）、Ｔａｇ
ｇ＝ペプチド用の塩類のコントロールを含んだ擬集した
ＰＲＰサンプルでの光透過率（％）、及びＴｐｅｐ＝ペ
プチド阻害剤を含んだ擬集ＰＲＰサンプルでの光透過率
（％）、である。阻害能力は、５０％擬集阻害をもたら
す阻害濃度（ＩＤ₅₀）として表現した。リガンド結合アッセイ

【００７０】ＬＲＩへの多価リガンドの結合はフルーイ
ッド・フェーズ・アッセイで評価した。リガンドでコー
トした粒子は１．３μｍのアルデヒド修飾の蛍光ラテッ
クスビーズ（モリキュラープローブス社、ユージィーン
市、オレゴン州）の４．０×１０⁸ ヶ／mlで５００μｇ
／mlのＨＳＡ又は分岐ＫＧＡＧＤＶ又はコントロールペ
プチドＫＧＡＬＥＶＡのいずれか一つと共にＨＢＳＳ⁺⁺
の中でインキュベートした。３７℃で３０分後、ビーズ
を２０００ｘｇで５分間遠心し、未反応の部位をクエン
チ（ｑｕｅｎｃｈ）する為に１％ＨＳＡを含む１mlのＨ
ＢＳＳ＋＋に再懸濁し、更に３０分間３７℃でインキュ
ベートした。

【００７１】コート用の蛋白の約９〜１１μｇが、ＢＣ
Ａ蛋白質試薬アッセイ（ピアース社、ロックフォード
市、イリノイ州）で評価された様に、ビーズに結合して
いた。擬集を防ぐ為に、ビーズ混合物はＰＭＮへ加える
前に１〜２秒間超音波にかけた。ＰＭＮ（３．０×１０
⁵ ヶ）はバッファー又はペプチド又は抗体（本明細書の
前で図の簡単な説明で示した様に）のいずれか一つと共
に１５，０００ユニットのカタラーゼの存在下に室温で
１５分間インキュベートした。洗浄することなく、反応
混合物は、４５μｌのＨＳＡでコートしたビーズ又はＫ
ＧＡＬＥＶＡでコートしたビーズ又は分岐ＫＧＡＧＤＶ
でコートしたビーズのいずれか一つと共に１μＭ ＦＭ
ＬＰ又はビィークル（ｖｅｈｉｃｌｅ）の存在下に３７
℃で１時間インキュベートした。ＦＭＬＰの他に免疫複
合物（ＢＳＡ−抗ＢＳＡ）をＰＭＮの刺激に使用した。
テストによっては未結合ビーズを、反応混合物を４００
μｌのハイパーク−フィコール（Ｈｙｐａｑｕｅ−Ｆｉ
ｃｏｌｌ）に重層し遠心することによってＰＭＮ−結合
ビーズから除去した。ペレットにＰＭＮ結合ビーズが含
まれていて、未結合ビーズは境界層に残っていた。付着
は蛍光顕微鏡で評価し、付着指数（ＡＩ）として、ＰＭ
Ｎ１００ヶにて結合したビーズ数を定量した。

【００７２】可溶性リガンドの結合は、ＰＭＮに対する
¹²³ Ｉ−ｃｃ−ＲＧＤＳの結合について以前に記述した
（文献５）と同じ様に、放射性標識した（ｒａｄｉｏｌ
ａｂｅｌｌｅｄ）分岐Ｙ−ＫＧＡＧＤＶをＰＭＮと共に
インキュベートすることによって評価した。分岐Ｙ−Ｋ
ＧＡＧＤＶ（１mg）の放射性標識は、酸化剤としてイオ
ドジェン（Ｉｏｄｏｇｅｎ）（Ｐｉｅｒｃｅ社、ロック
フォード市、イリノイ州）を用いて行った（文献５）。
標識したペプチドの特異活性は４．６×１０⁵ｃｐｍ／
μｇであった。ＰＭＮを、標識したペプチド（３μｇ／
５．０×１０⁵ＰＭＮ）と共に、カタラーゼの存在下に
１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中で３７℃で３０分
間インキュベートした。反応混合物はペレットに会合し
た放射能活性を評価する為にヴァーシィルーブ（Ｖｅｒ
ｓｉｌｕｂｅ）〔ジェネラル・エレクトリック社、ウィ
ルミントン市、マサチューセッツ州〕に重層し、１２，
０００×ｇで遠心した。特異結果は、１００〜２００μ
ｇの非標識の分岐Ｙ−ＫＧＡＧＤＶの存在下に結合した
放射能活性を、全結合から差し引くことで決定した。結果 ＲＧＤ含有ペプチド及びＦｇ γ鎖ペプチドは両方とも
にＬＲＩにてもたらされるＦｇ刺激摂食を止める。

【００７３】ＬＲＩのリガンド結合特異性を調べ始める
のに、Ｆｇに刺激された摂食が、ＲＧＤ配列を含むペプ
チドと同様にγ鎖のアミノ酸配列を含むペプチドに影響
を受け得るかどうかが問題であった。以前に示した（文
献５）様に、Ｆｇは二相様式（ｂｉ−ｐｈａｓｉｃ ｍ
ａｎｎｅｒ）でＥｌｇＧ摂食を３〜４倍に高める。ＰＭ
ＮをＧＲＧＤＳＣ又は１５アミノ酸のγ鎖ペプチドのい
ずれか一つとインキュベーションするとＥｌｇＧの摂食
を刺激するＦｇの能力が完全に止められたが、他方いず
れのペプチドも、無刺激のＰＭＮによるＥｌｇＧ摂食レ
ベルに何の影響も与えなかった（図１）。無関係のアミ
ノ酸配列のコントロール用ペプチド３２（文献５）では
Ｆｇ刺激での摂食に何の影響もなかった（図１参照）。

【００７４】これらのデータは、Ｆｇの中の二つの別箇
のアミノ酸配列が食作用の増大に関与している可能性を
示していた。これらのデータを説明出来る一つの可能性
は、摂食の増大の為には二つの別箇の受容体が関与し、
この両方が、Ｆｇによる信号導入に必須であろうという
ことであった。もう一つは、αIIｂβ₃ を用いた場合と
同じく、二つの部位が同じ受容体ＬＲＩによって認識さ
れ得るということであった。

【００７５】これらのいずれであるかを調べる為に、β
₁ 及びβ₃ に対するモノクローナル抗体の、Ｆｇに刺激
された摂食に及ぼす影響を調べた。初めに、抗β₁ のＦ
ｇ刺激摂食に及ぼす影響を調べた。議論のあるところだ
が、β₁ インテグリンはＰＭＮの上に存在すると述べら
れており（文献２及び３）、抗β₁ のＰＭＮに対する結
合が確認された。（〔実験材料と方法〕の項を参照せ
よ）。

【００７６】モノクローナル抗体ＡＩＡ５（抗β₁ ）
が、ＰＭＮによるβ₁ 依存の機能を阻害出来るかどうか
を決定するのに、ラミニン刺激によるＥｌｇＧ摂食に及
ぼす抗β₁ の影響を調べた。ＰＭＮはα₆ β₁ を経由し
てラミニンと相互作用している（文献２）。図２におけ
るＡに示される様に、抗β₁ は摂食を刺激するラミニン
の能力を完全に止めた。対照的に、抗β₁ はＦｇの投与
量応答カーブを右方へシフトするにも係らず、Ｆｇ刺激
での摂食を阻害しなかった（図２におけるＢ）。

【００７７】同じデータがβ₁ に対する他のモノクロー
ナル抗体（４Ｂ４）やα₅ β₁ に対するポリクローナル
抗体でも得られた。対照的に抗β₃ （モノクローナル抗
体７Ｇ２）はラミニン刺激摂食に影響することなく（図
２におけるＡ）Ｆｇ刺激摂食を完全に阻止した（図２に
おけるＢ）。

【００７８】これらのデータはβ₁ インテグリンがラミ
ニンによるＰＭＮ活性化に必須なることを示している。
更に、β₁ 族のあるものはＦｇ結合に関与しているかも
知れない、しかしながらＦｇにて高められた摂食の為の
全シグナル導入（ｓｉｇｎａｌ ｆｒａｎｓｄｕｃｔｉ
ｏｎ）はモノクローナル抗体７Ｇ２の阻害力あるβ₃様
インテグリンが必要なることを示している。

【００７９】これらのデータは、モノクローナル抗体７
Ｇ２が、単核細胞とＰＭＮの双方による多価ＲＧＤで刺
激された摂食を、阻害することを示した以前のデータ
（文献６）を確認するものである。ＬＲＩは抗β₃ 試薬
にて認識されるＰＭＮ上の唯一既知のインテグリンであ
る（文献６）故に、ＬＲＩは、ＦｇがＰＭＮ食作用機能
を刺激（ｓｔｉｍｕｌａｔｅ）するのに経由したインテ
グリンである。このことは、ＬＲＩがＲＧＤ配列及びＦ
ｇのγ鎖配列の両方を認識出来るという仮説を示持する
ものである。アミノ酸配列ＫＧＡＧＤＶを含むペプチド
は、ＲＧＤペプチド類よりも、ＬＲＩ介在の食作用増進
を特異的に阻害する

【００８０】ＬＲＩによるγ鎖認識で重要なアミノ酸を
調べるのに、まずＰＭＮを、三種のヘキサペプチド即ち
ＫＱＡＧＤＶとＫＱＲＧＤＶとＫＧＡＧＤＶの濃度を高
くしてインキュベートし、Ｆｇ刺激によるＥｌｇＧ摂食
への効果を評価した。ＫＱＡＧＤＶは、１５アミノ酸γ
鎖ペプチド中の６ヶの最Ｃ末端（ｍｏｓｔ ｃａｒｂｏ
ｘｙ ｔｅｒｍｉｎａｌ）アミノ酸を表わしていて、γ
鎖のαIIｂβ₃ 認識に必要である（文献１５）。このペ
プチドは、Ｆｇに刺激された摂食を約１０μＭのＩＤ₅₀
で阻害した（図３におけるＡ）。

【００８１】ＬＲＩはアミノ酸配列ＲＧＤを認識するこ
とが知られているので、アラニンがアルギニンへ単−ア
ミノ酸置換したペプチドＫＱＲＧＤＶを調べた。驚くべ
きことに、この変異によってＦｇに刺激された摂食を阻
害するペプチドの能力が３０倍以上減少した（図３にお
けるＡ）。対照的に、グルタミンをグリシンへ単一置換
し、本発明の新規ペプチドＫＧＡＧＤＶを作り出したも
のでは、４倍その能力を向上させた。このヘキサペプチ
ドのＫＧＡＧＤＶは、Ｆｇに刺激された摂食を約２．５
μＭのＩＤ₅₀で阻害した（図３におけるＡ）。コントロ
ールのペプチドＫＧＡＬＥＶＡは、７００μＭの濃度で
さえも、Ｆｇに刺激された摂食に何の影響もなかった。
７００μＭのＫＧＡＬＥＶＡに対する、Ｆｇに刺激され
た百分率ＰＩは１２０％であった。

【００８２】ＫＧＡＧＤＶへのアミノ酸末端に二つのヒ
スチジンを含む様にγ鎖ペプチドの長さを増すことで、
Ｆｇに刺激された血小板凝集の阻害に対するγ鎖ペプチ
ドの能力が増加する（文献１５）ので、ＫＧＡＧＤＶの
アミノ酸配列は、ヒスチジンがあれば、ＬＲＩに刺激さ
れた摂食の阻害に対してより能力が大きくなるかどうか
が問われた。それ故に、１５アミノ酸のＫＱＡＧＤＶペ
プチドのＦｇ刺激摂食の阻害能力を１２アミノ酸のＫＧ
ＡＧＤＶペプチド（両ペプチドともにヒスチジンを含ん
でいる）と比べた。

【００８３】図３におけるＢに於て示す様に、ヒスチジ
ン残基を付加しても、ＫＧＡＧＤＶ配列を含むペプチド
は、Ｆｇに刺激された摂食の阻害で、１５アミノ酸のＫ
ＱＡＧＤＶペプチドの場合より、３倍も能力が高かっ
た。１２アミノ酸のＫＧＡＧＤＶペプチドは約１．２μ
ＭのＩＤ₅₀でＦｇに刺激された摂食を阻害した。両ペプ
チドとも、その６アミノ酸の中核よりも２〜３倍の能力
があった。かかるデータは、ヘキサペプチド配列ＫＧＡ
ＧＤＶがＰＭＮのＦｇ活性化の強力な阻害物質であるこ
とを示している。ＦｇがＬＲＩを通して食作用を刺激す
るので、かかるデータはＫＧＡＧＤＶがＬＲＩに対する
ペプチドリガンドであることを示唆している。

【００８４】ＬＲＩはβ₃ インテグリンに密接に関係し
ていると思われるので、プロトタイプのβ₃ インテグリ
ンに対するＫＧＡＧＤＶ含有の配列の活性を確かめるこ
とが重要であった。αIIｂβ₃ をかかる研究に選んだ。
かかる目的を達成する為に、ＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ
とＨＨＬＧＧＡＫＱＲＧＤＶとＨＨＬＧＧＡＫＧＡＧＤ
Ｖについて、ヒト血小板富化血漿のＡＤＰで刺激された
凝集、即ちＦｇにも依存しているαIIｂβ₃ 依存の機
能、の阻害能力を調べた。表Ｉに表わす様に、かかるＦ
ｇのγ鎖由来のペプチドは、Ｆｇに刺激された血小板凝
集とＦｇに刺激されたＰＭＮによる摂食の阻害能力につ
いて比較した。公表の値（文献２２）に一致して、天然
のドデカペプチド配列は８０μＭのＩＤ₅₀で血小板凝集
を阻害した。アルギニン置換ペプチドは血小板凝集のも
っと強力な阻害剤（ＩＤ₅₀＝２８μＭ）であったが、他
方でＦｇに刺激された摂食への阻害効果は小さいもの
（８０μＭで０％阻害）であった。

【００８５】著しく対照的に、グリシン置換ペプチド
は、血小板凝集の阻害剤としては完全に効果なし（１０
０μＭで０％阻害）であったが、他方ではＦｇに刺激さ
れた摂食の強力な阻害剤（ＩＤ₅₀＝１．１μＭ）であっ
た。かかるデータはｇｌｙ置換のペプチド（ＨＨＬＧＧ
ＡＫＧＡＧＤＶ）がαIIｂβ₃ と、もしあるとしても非
常に弱く結合しており、ＬＲＩとαIIｂβ₃ は、別々の
ペプチドリガンド結合の特異性を持つということを示し
ている。

【００８６】Ｆｇのγ鎖由来のペプチド阻害剤がＬＲＩ
に対するアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）としても働き得
るかどうかを決定する為に、ＲＧＤ配列、ＫＱＡＧＤＶ
配列及びＫＧＡＧＤＶ配列を含む多価の分岐ペプチドを
構築した。ＬＲＩを経たＰＭＮのＥｌｇＧ摂食を刺激す
るのに多価ペプチドが必要であることは以前に示されて
いる（文献５及び６）。図４に示される様に、三つの分
岐ペプチドはすべてＥｌｇＧの摂食を刺激（ｓｔｉｍｕ
ｌａｔｅ）している。しかしながら、分岐ＫＧＡＧＤＶ
が最も強力で調べた量応答範囲が広いものであった。

【００８７】分岐ＲＧＤと分岐ＫＱＡＧＤＶは、Ｆｇに
刺激された摂食の阻害に対し一価のペプチドとして示し
たのと同じ相関的な能力を、摂食の刺激で示した（図４
を図３におけるＡと比べて見よ）。抗β₁ がＦｇに刺激
された摂食の量応答曲線を右側にシフトさせたので、分
岐ＲＧＤ及び分岐ＫＧＡＧＤＶのＥｌｇＧ摂食を刺激す
る能力に及ぼすβ₁ 抗体の効果を調べた。Ｆｇを用いた
場合の様に、抗β₁ は分岐ＲＧＤペプチドの量応答曲線
を右側にシフトさせた（図５におけるＡ）。

【００８８】対照的に、抗β₁ は分岐ＫＧＡＧＤＶの量
応答曲線に何の効果も示さなかった。抗ＬＲＩ（モノク
ローナル抗体 ７Ｇ２）は三つの分岐ペプチドの摂食刺
激能力を完全に阻害した。これらのデータは、多価ＲＧ
Ｄペプチドが、ＰＭＮ上の少なくとも２つの別箇のイン
テグリン族と結合すること、を示している。多価ＫＧＡ
ＧＤＶは、しかしながら、ＬＲＩに対して機能的な特異
性があるようだ。これらのペプチドのＬＲＩに対する機
能的能力の順位はＫＧＡＧＤＶ＞ＫＧＡＧＤＶ＞ＫＱＲ
ＧＤＶ＝ＧＲＧＤＳＰＡ〔配列番号ＩＤ ＮＯ：１０〕
である。多価の分岐ＫＧＡＧＤＶは特異的にＬＲＩに結
合し、β₁ インテグリともβ₂インテグリンとも結合し
ない

【００８９】分岐ＫＧＡＧＤＶがＬＲＩに対して特異的
なリガンドを表していたことを証明するために、二種類
のリガンド試験を行った。初めに、分岐ＫＧＡＧＤＶで
コートしたラテックス、ＫＧＡＬＥＶＡでコートしたラ
テックス及びＨＳＡでコートしたラテックスの各ビーズ
のＰＭＮに対する結合を調べて、抗ＬＲＩ（７Ｇ２）及
び抗ＩＡＰ（ポリクローナル）の結合阻害能力をテスト
した。

【００９０】分岐ＫＧＡＧＤＶビーズの無刺激ＰＭＮへ
の結合は中程度（ｍｏｄｅｓｔ）だが有意（ｓｉｇｎｉ
ｆｉｃａｎｔ）なものであり、ＦＭＬＰ（図６）又は免
疫複合物（文献２１）のいずれかを用いてＰＭＮを刺激
することで（かなり（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ））
高められた。ＦＭＬＰ刺激のＰＭＮに対する分岐ＫＧＡ
ＧＤＶビーズの結合の平均ＡＩは３１７±４７ＳＥＭ
（ｎ＝７）であった。かかる結合は、過剰のＫＧＡＧＤ
Ｖの包含で阻害出来る故に、特異的なものであった。

【００９１】対照のＰＭＮ又は刺激されたＰＭＮのいず
れかにＨＳＡでコートしたビーズが結合するのが最小で
あった。対照のＰＭＮ及びＦＭＬＰに刺激されたＰＭＮ
に対するＨＳＡビーズの結合のＡＩ値は夫々５及び５８
であった。対照用のペプチドＫＧＡＬＥＶＡでコートし
たビーズの結合のＡＩ値は、対照のＰＭＮ及びＦＭＬＰ
刺激のＰＭＮに対して、夫々１２及び６５であり、ＨＳ
Ａビーズの結合に対するものと充分に異なった数値であ
った。ＰＭＮがＦＭＬＰで刺激されようとされまいと、
抗ＬＲＩ及び抗ＩＡＰの両方は、同型のコントロール用
抗体でないが、分岐ＫＧＡＧＤＶビーズの結合を充分に
阻害した。（図６）

【００９２】三つのテストからの抗体阻害研究を比べて
見ると、抗ＬＲＩは、分岐ＫＧＡＧＤＶビーズの、ＦＭ
ＬＰに刺激されたＰＭＮへの結合を７９％（ｐ＜０．０
２）阻害し、抗ＩＡＰは９４％阻害した（ｐ＜０．００
６、ｔ−テストによる）。更に、抗ＩＡＰを３７℃で４
５分後添加すると、ＰＭＮ結合ビーズの７５％が除かれ
て、分岐ＫＧＡＧＤＶビーズは主にプラズマ膜結合し摂
食されなかったことを示した。かかるデータは分岐ＫＧ
ＡＧＤＶビーズが、ＬＲＩ依存様式及びＩＡＰ依存様式
で、ＰＭＮに結合することを示している。

【００９３】次に、放射線標識した分岐Ｙ−ＫＧＡＧＤ
ＶのＰＭＮに対する結合を調べ、抗ＬＲＩ及び抗ＩＡＰ
の結合阻害能力をテストした。

【００９４】ＰＭＮは特異的に分岐Ｙ−ＫＧＡＧＤＶに
結合し、分岐Ｙ−ＫＧＡＧＤＶ３７，４６３±３，４３
６分子／ＰＭＮであった（表II）。抗ＬＲＩ（７Ｇ２）
はＰＭＮに対する特異結合分子数を７，２１２±５，６
６２（ｐ＜０．０１）へ平均阻害率８０．８％で減少さ
せた。更に抗ＩＡＰ（モノクローナル抗体Ｂ６Ｈ１２）
はＰＭＮに対する結合分子数を１，０９８±７６２（ｐ
＜０．００１、ｔ−テスト）へ平均阻害率９７．１％で
減少させた。同型の対照用抗体は、特異的に放射性標識
したリガントの、ＬＲＩへの結合に影響しなかった。こ
れらのデータは、多価の分岐ＫＧＡＧＤＶペプチドが刺
激を受けていないＰＭＮ及び刺激を受けたＰＭＮの両方
によって発現するＬＲＩに特異的に結合することを示し
ている。

【００９５】β₁ 及びβ₂ インテグリンの分岐ＫＧＡＧ
ＤＶ結合への寄与を調べるために、抗β₁ （モノクロー
ナル抗体Ａ１Ａ５）と抗β₂ （ＩＢ４）と抗α_m （ＯＫ
ＭＩ及びＯＫＭ１０）について、分岐ＫＧＡＧＤＶビー
ズがＦＭＬＰに、刺激されたＰＭＮに結合するのを、阻
害する能力を調べた。

【００９６】図６に示される様に、抗β₁ は、分岐ＫＧ
ＡＧＤＶビーズを刺激ＰＭＮに結合する効果がなかっ
た。更にモノクローナル抗体ＩＢ４又は同型のモノクロ
ーナル抗体ＯＫＭ１０のいずれかの０．５μｇと共にＰ
ＭＮをインキュベートしても分岐ＫＧＡＧＤＶビーズ結
合に何ら影響しなかった（図７におけるＡ）、またモノ
クローナル抗体ＯＫＭＩも同じ結果を与えた。

【００９７】対照的に、この同じ濃度のモノクローナル
抗体７Ｇ２（抗ＬＲＩ）は、ＨＳＡビーズの場合に見ら
れるレベルに迄、分岐ＫＧＡＧＤＶビーズの結合を完全
に阻害した。面白いことに、同じ濃度の抗α_m β₂ 抗体
は、分岐ＫＧＡＧＤＶビーズ結合を阻害しないが、分岐
ＫＧＡＧＤＶのＥｌｇＧ摂食の刺激能力を完全に止めた
（図７におけるＢ）。これらのデータは、α_m β₂ が、
フォルボルエステルを含む沢山のＰＭＮ活性化剤により
刺激された食作用で、非リガント結合を演じるという以
前の観察（文献１８及び２１）と一致している。より高
濃度の抗体では、モノクローナル抗体７Ｇ２及びＯＫＭ
１０の効果は同じにとどまっており、他方でモノクロー
ナル抗体ＩＢ４は、分岐ＫＧＡＧＤＶビーズに結合する
のを２４％阻害する結果であった（図７におけるＡ）。
この同じ濃度のモノクローナル抗体ＩＢ４で、無刺激の
ＰＭＮによるＥｌｇＧの摂食も部分的に阻害された（図
７におけるＢ）。

【００９８】かかるデータは、無刺激のＰＭＮによる摂
食がβ₂ インテグリンを必要としないが、α_m （Ｍｏ
Ｉ）又はβ₂ （ＩＢ４）を認識する抗体は、この摂食を
非特異的に阻害できるということを示した、以前の仕事
（文献２１）と一致している。それ故に、かかるデータ
は、β₁ インテグリンもβ₂ インテグリンもともに、分
岐ＫＧＡＧＤＶコートのビーズの結合に何ら重要な働き
をしないことを示している。ＰＭＮの刺激はＬＲＩリガ
ンド結合特異性を調節する。

【００９９】本データは、ＲＧＤアミノ酸配列とＫＧＡ
ＧＤＶアミノ酸配列の両方がＬＲＩにて機能的に認識さ
れ得ること及び分岐ＫＧＡＧＤＶビーズの非刺激ＰＭＮ
への結合がＬＲＩを経由していることを示したので、ヘ
キサペプチドのＫＧＡＧＤＶとＫＱＲＧＤＶとコントロ
ールペプチドＫＧＡＬＥＶＡの、分岐ＫＧＡＧＤＶビー
ズの結合を阻害する能力を調べた。

【０１００】両ペプチドとも、分岐ＫＧＡＧＤＶビーズ
の非刺激ＰＭＮに結合するのを阻害する能力は等しく１
９μＭのＩＤ₅₀であった（図８におけるＡ）。はっきり
と対照的に、上のヘキサペプチドは分岐ＫＧＡＧＤＶビ
ーズのＦＭＬＰに刺激されたＰＭＮに結合するのを阻害
する能力に違いがあった（図８におけるＢ）。

【０１０１】刺激があると、ＫＱＲＧＤＶの阻害能力
は、６０μＭのｒｅｓｕｌｔａｎｔＩＤ₅₀で約３倍減少
した。面白いことに一価のＫＧＡＧＤＶの阻害能力は
２．５μＭのｒｅｓｕｌｔａｎｔ ＩＤ₅₀でＰＭＮ刺激
にて約８倍増加した（図８におけるＢ）。事実、ＫＧＡ
ＧＤＶのこの濃度は、Ｆｇ刺激での摂食を５０％阻害す
るのに必要な（図３におけるＡでの２．５μＭ）濃度と
同じであった。それ故に、ＫＧＡＧＤＶのリガンド結合
阻害の能力とリガンド結合に刺激される機能を阻害する
能力は同じものであった。

【０１０２】７００μＭの濃度でも、コントロール用ペ
プチドＫＧＡＬＥＶＡは、非刺激ＰＭＮ又はＦＭＬＰ刺
激のＰＭＮのいずれかに分岐ＫＧＡＧＤＶビーズが結合
するのに影響を与えなかった。７００μＭのＫＧＡＬＥ
ＶＡに対するコントロール用ビーズの結合は非刺激ＰＭ
Ｎで１０８％であり、ＦＭＬＰ刺激ＰＭＮで１１３％で
あった。かかるデータは、ＰＭＮの活性化状態がＬＰＩ
のリガンド結合の特異性を調節していることを示す。こ
の様にして、ＩｇＧオプソナイズ化標的又はカモタクテ
ック（ｃｈａｍｏｔａｃｔｉｃ）ペプチドの存在下で起
こるのと同様のＰＭＮ刺激で、ＫＧＡＧＤＶ配列をＲＧ
Ｄ配列と比べられる位にＬＲＩが好ましく認識する能力
はかなり増加していて、他方刺激のない場合には、両ア
ミノ酸配列は等しく認識される。

【０１０３】本明細書のデータは、白血球応答インテグ
リンＬＲＩに対する独特なリガンド結合特異性を述べて
いる。以前の仕事では、ＬＲＩが、細胞接着因子族β₃
（ｇｐIII ａ）（文献４〜６）のβ鎖と免疫学的に交差
反応することを示す新規でまだ記述されたことのないイ
ンテグリンであることを示した。クローン化したβ₃イ
ンテグリンの様に、ＬＲＩはペプチド配列Ａｒｇ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｐを認識する。（文献５）。本明細書で、ＬＲ
Ｉが、αIIｂβ₃ の様にＦｇのγ鎖のＣ末端ペプチドを
認識することを示した。該ペプチドはＫＧＡＧＤＶ配列
を含み、αIIｂのアミノ酸２９４番〜３１４番にクロス
リンクすることが示された（文献２３）。面白いこと
に、発表された研究では、他の細胞接着因子族のα_v β
₃ はＦｇ内で該アミノ酸配列を認識しないことを示して
いる（文献１４）。

【０１０４】本発明で、ＫＱＡＧＤＶ配列を含む１５ア
ミノ酸のペプチドとＰＭＮのインキュベーションは、Ｆ
ｇ刺激によるＥｌｇＧの摂食を著しく阻害することを開
示した。該応答のＩＤ₅₀は３．５μＭであった（図３に
おけるＢ）。比較として天然のγ鎖のドデカペプチドは
αIIｂβ₃ 依存の血小板凝集を８０μＭのＩＤ₅₀で阻害
した（表Ｉ）。かかるデータは、αIIｂβ₃ の様に、Ｌ
ＲＩがＦｇのγ鎖ペプチドを認識することを示してい
る。更に、他に知られているインテグリンとは異って、
ＬＲＩはアミノ酸配列ＫＧＡＧＤＶも認識する。このこ
とは、一価のＫＧＡＧＤＶによるＬＲＩ機能の阻害（図
３において、ＩＤ₅₀＝２．５μＭ）によって示される、
また該アミノ酸配列を含む多価の分岐したペプチド（分
岐 ＫＧＡＧＤＶ）がＬＲＩに特異的に結合し、ＬＲＩ
依存の食作用の増大を刺激出来る（表II、図５及び図６
を参照）という事実によって示される。かかることは、
ＫＧＡＧＤＶペプチドがαIIｂβ₃ 依存の血小板凝集を
阻害出来ない（表Ｉ）ことと直接対照的なことである。

【０１０５】Ｆｇのγ鎖由来ペプチドのＬＲＩ依存性機
能を阻害する能力の順はＫＧＡＧＤＶ＞ＫＱＡＧＤＶ＞
ＫＱＲＧＤＶであり、他方これらの配列を含むドデカペ
プチドのＦｇ依存性血小板凝集を阻害する能力の順は逆
順番を示す（表Ｉ）。これらのデータは、本発明の新規
配列ＫＧＡＧＤＶが、ＬＲＩによって好ましく認識され
ることを示唆し、既知の細胞接着因子類（ｃｙｔｏａｄ
ｈｅｓｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒｓ）と一層区
別するものである。

【０１０６】分岐ＫＧＡＧＤＶがＬＲＩに対し特異なリ
ガンドであって、ＰＭＮによって発現する他のインテグ
リンには認識されなかったことを証明するために、分岐
ＫＧＡＧＤＶでコートされたビーズのＰＭＮ結合を阻害
する、インテグリン認識の幾つかの抗体の能力（図６及
び図７）や、分岐ＫＧＡＧＤＶで刺激されたＥｌｇＧの
摂食を阻害するインテグリンを認識する抗体の能力（図
５におけるＢ及び図７におけるＢ）、を調べた。

【０１０７】β₁ 族の少なくとも２つの、α₅ β₁ （文
献３）及びα₆ β₁ （文献２）はＰＭＮ上に検出されて
いて、β₁ に対する抗体はこれら両方のインテグリンの
機能を抑制することが出来るので、β₁ を認識する三つ
の抗体（２つのモノクローナル抗体と１つのポリクロー
ナル抗体）の、分岐ＫＧＡＧＤＶコートのビーズの結合
を阻害する能力を調べた。

【０１０８】これら三つの抗体はＦｇ刺激の摂食の量依
存曲線を変化させてラミン刺激の摂食を抑制する（図
２）一方で、分岐ＫＧＡＧＤＶリガンド結合（図６）又
は分岐ＫＧＡＧＤＶ刺激の摂食（図５）には何の影響も
なかった。白血球インテグリンのα_m β₂ はＦｇを認識
することが知られていて、α鎖（文献１０）及びβ鎖
（文献１２）の両方に対する抗体は、ＰＭＮのＦｇとの
相互作用を抑制出来る。ＯＫＭ１とＯＫＭ１０（抗
α_m ）のいずれも、分岐ＫＧＡＧＤＶビーズのＦＭＬＰ
に刺激されたＰＭＮとの結合に何ら影響を与えなかった
（図７）。対照的に、ＯＫＭ１は、ＦｇのＤペプチドの
３ＯＫＤ領域がＦＭＬＰに刺激されたＰＭＮに結合する
のを抑制することが先に示されて来た（文献１０）。更
にモノクローナル抗体ＩＢ４（抗β₂ ）は、サイトカイ
ンに刺激されたＰＭＮのＦｇとの接着を抑制することが
示されており（文献１２）、他方では、本実験でテスト
した最高の濃度でさえも、分岐ＫＧＡＧＤＶビーズの結
合は２４％抑制されたのみであった（図７における
Ａ）。

【０１０９】かかるデータは、β₂ インテグリンがＬＲ
Ｉによるリガンドの結合に必要でないことを示した以前
のデータ（文献５）と一致している。更にＬＡＤの患者
から得たＰＭＮの、放射性標識した分岐ＫＧＡＧＤＶ
と、結合する能力を調べて、ＬＡＤのＰＭＮは、正常な
ＰＭＮと同様に分岐ＫＧＡＧＤＶに特異的な結合が等し
く出来ることが分った。面白いことに、たとえかかる抗
α_m β₂ 抗体がリガンドの結合を余り抑制しなくても、
三つともすべて、分岐にＫＧＡＧＤＶにて刺激されたＥ
ｌｇＧの摂食を抑制した（図７におけるＢ）。

【０１１０】α_m β₂ は、細胞外マトリックス蛋白やホ
ルボールエステル類を含む様々な試剤で刺激された食作
用で非リガンド結合（ｎｏｎ−ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄ
ｉｎｇ）の役割をしていると以前から提案されている
（文献１８、１９及び２１）。本発明のデータは、α_m
β₂ のリガンド結合の機能を、食作用における役割から
更に分化させることによって前述の仮説を確かなものに
している。

【０１１１】以前の研究で、ＬＲＩはＲＧＤ配列を含む
接着蛋白を認識すること及び多価ペプチドのｃｃ−ＲＧ
ＤＳは特異的にＰＭＮに結合しＦＩｇＧの摂食を刺激出
来ることが示された（文献５）。それ故に、本発明のデ
ータに照らし、ＬＲＩによるリガンド認識の為のＲＧＤ
ペプチドとＫＧＡＧＤＶペプチドの関係を理解すること
が重要となった。非刺激のＰＭＮは両アミノ酸配列を等
しく認識し（図８におけるＡ）、他方、ＦＭＬＰあるい
は免疫複合物のいずれかで刺激されたＰＭＮはＲＧＤに
較べられる程に、よくＫＧＡＧＤＶを認識した（図８に
おけるＢ）。

【０１１２】かかるデータは、ＲＧＤとＫＧＡＧＤＶの
両配列がＬＲＩに認識されて、ＰＭＮの活性化状態がこ
れら二つのアミノ酸配列に対するＬＲＩのリガンド結合
の特異性を調節していることを示している。かかる態様
で、αIIｂβ₃ インテグリン（文献１及び１３）やβ₂
インテグリン（文献１）の如きＬＲＩはリガンド結合の
刺激依存性の調節を示す。

【表１】 表Ｉ ＰＭＮによるＦｇ刺激血小板凝集とＦｇ刺激摂食の 阻害の為のγ鎖由来ペプチドの比較 ──────────────────────────────────── ペプチド 血小板ＩＤ₅₀ ^a ＰＭＮＩＤ₅₀ ^b ──────────────────────────────────── ＧＱＱＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ Ｎ．Ｄ． ３．５μＭ ＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ ８０μＭ Ｎ．Ｄ． ＨＨＬＧＧＡＫＱＲＧＤＶ ２８μＭ ＞８０μＭ^c ＨＨＬＧＧＡＫＧＡＧＤＶ ＞１００μＭ^d １．１μＭ ──────────────────────────────────── ａ 小血板凝集は「材料と方法」で述べた如く評価し
た。 ｂ ＰＭＮによるＦｇ刺激のＦＩｇＧ摂食は「材料と方
法」で述べた如く評価した。 ｃ ８０μＭで ０％の阻害 ｄ １００μＭで ０％の阻害

【表２】 表II 放射性標識した分岐Ｙ−ＫＧＡＧＤＶのＰＭＮへの結合 ──────────────────────────────────── 特異分子数／ＰＭＮ^a 阻害率（％） ──────────────────────────────────── バッファー ３７，４６３±３，４３６ ０ ＭＩｇＧ１ ３４，４１２±１，８７９ ８．１ ＭＩｇＧ２ｂ ３７，２１９±４，１２２ ０．６ ７Ｇ２ ７，２１２±５，６６２ ８０．８ Ｂ６Ｈ１２ １，０９８± ７６２ ９７．１ ──────────────────────────────────── ａ．ＰＭＮ（５．０×１０⁵ ヶ）をバッファー又は２．
５μｇの精製抗体と共にカタラーゼの存在下に室温で１
５分間インキュベートした。１００〜２００μｇの放射
性非標識の分岐Ｙ−ＫＧＡＧＤＶの存在下及び非存在下
で、「材料と方法」で述べた如く細胞に関連した特異的
結合を決定する為に放射性標識の分岐Ｙ−ＫＧＡＧＤＶ
（３μｇ）を加えた。データは三通りのサンプル（ｔｒ
ｉｐｌｉｃａｔｅ ｓａｍｐｌｅｓ）の平均値±ＳＥＭ
として表わした。日毎に結合の変化がある故に、一回の
実験からのデータは叙述（ｄｅｐｉｃｔ）されている。
ＰＭＮに結合する特異な分岐Ｙ−ＫＧＡＧＤＶ分子数
は、平均の二通り又は三通りのサンプルから平均＝２
７，４７５±５，４７１ＳＥＭ、ｎ＝４で１６，１００
〜３７，４６３の範囲であった。抗体の影響は、全実験
で定性的には同じものであった。

【０１１３】本発明の言わんとするところの精神と範囲
（ｓｐｉｒｉｔ ａｎｄ ｓｃｏｐｅ）から逸脱しない
限り、本発明の開示していることを読むことにより、本
発明で挙げた例の外の様々な例も当業界の技術に慣れた
者にとっては明らかなものである。かかる外の例もすべ
て、本発明で付記した特許請求の範囲内に包含されるべ
きである。引用文献 配列表 （１） 一般情報： （ｉ）出願人： グレシャム， ハッティ・ディー Ｇｒｅｓｈａｍ，Ｈａｔｔｉｅ，Ｄ． ブラウン，エリック・ジェー Ｂｒｏｗｎ，Ｅｒｉｃ Ｊ アグムス，スチィーヴン・ピー Ａｄａｍｓ，Ｓｔｅｖｅｎ Ｐ （ii） 発明の名称：新規なヘキサペプチド （iii ）配列の数：１１個 （iv）通信住所： （Ａ）名受人：スコット・ジャー、メイヤー、モンサン
ト社，Ａ３ＳＧ （Ｂ）町 名：８００Ｎ．リンドバーフ（Ｌｉｎｄｂｅ
ｒｇｈ） （Ｃ）都市名：セントルイス （Ｄ）州 名：ミズリー （Ｅ）国 名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：６３１６７ （ｖ）コンピューターでの読み取り型式： （Ａ）媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣコンパチブル （Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース（Ｐａｔ
ｅｎｔＩｎＲｅｌｅａｓｅ）♯１．０，ヴァージョン♯
１．２５ （vi) 最新出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）ファイル日： （Ｃ）分類 （viii）弁護人／代理人 情報 （Ａ）名前：メイヤー，スコット・ジェー （Ｂ）登録番号：２５，２７５ （Ｃ）照会／内容要旨 番号：０７−２４（８６７）Ａ （iv）電話通信情報： （Ａ）電話番号：（３１４）６９４−３１１７ （２） 配列番号ＩＤ ＮＯ：１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６アミノ酸 （Ｂ）型 ：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子の型：ペプチド （xi）配列の記述：配列番号ＩＤ ＮＯ：１： Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ １ ５ （２） 配列番号ＩＤ ＮＯ：２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７アミノ酸 （Ｂ）型 ：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子の型：ペプチド （xi）配列の記述：配列番号ＩＤ ＮＯ：２ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ １ ５ （２） 配列番号ＩＤ ＮＯ：３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６アミノ酸 （Ｂ）型 ：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子の型：ペプチド （xi）配列の記述：配列番号ＩＤ ＮＯ：３： Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ １ ５ （２） 配列番号ＩＤ ＮＯ：４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６アミノ酸 （Ｂ）型 ：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子の型：ペプチド （xi）配列の記述：配列番号ＩＤ ＮＯ：４： Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｃｙｓ １ ５ （２）配列番号ＩＤ ＮＯ：５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６アミノ酸 （Ｂ）型 ：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子の型：ペプチド （xi）配列の記述：配列番号ＩＤ ＮＯ：５： Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ １ ５ （２）配列番号 ＩＤ ＮＯ：６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７アミノ酸 （Ｂ）型 ：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子の型：ペプチド （xi）配列の記述：配列番号ＩＤ ＮＯ：６： Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｌａ １ ５ （２）配列番号 ＩＤ ＮＯ：７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５アミノ酸 （Ｂ）型 ：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子の型：ペプチド （xi）配列の記述：配列番号ＩＤ ＮＯ：７： Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｌｅｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ １ ５ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ １０ １５ （２）配列番号 ＩＤ ＮＯ：８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１２アミノ酸 （Ｂ）型 ：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子の型：ペプチド （xi）配列の記述：配列番号ＩＤ ＮＯ：８： Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｇｌｙ １ ５ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ １０ （２）配列番号 ＩＤ ＮＯ：９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１２アミノ酸 （Ｂ）型 ：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子の型：ペプチド （xi）配列の記述：配列番号ＩＤ ＮＯ：９： Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｇｌｎ １ ５ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ １０ （２）配列番号 ＩＤ ＮＯ：１０の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７アミノ酸 （Ｂ）型 ：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子の型：ペプチド （xi）配列の記述：配列番号ＩＤ ＮＯ：１０： Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ １ ５ （２）配列番号 ＩＤ ＮＯ：１１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０アミノ酸 （Ｂ）型 ：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子の型：ペプチド （xi）配列の記述：配列番号ＩＤ ＮＯ：１１： Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ １ ５ Ｌｅｕ Ａｒｇ １０

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はＰＭＮによるフィブリノーゲンの刺激に
よるＥｌｇＧ摂食に対する、フィブリノーゲンのγ鎖ペ
プチドとＧＲＧＤＳＣ〔配列番号 ＩＤ ＮＯ：４〕の
影響を示す。

【図２】図２は、ｍＡｂのＡＩＡ５（抗β₁ ）及び７Ｇ
２（抗β₂ ）の、ラミニンの刺激による摂食（ｌａｍｉ
ｎｉｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ）
に対する影響を図２におけるＡで示し、フィブリノーゲ
ンの刺激による摂食（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ−ｓｔｉｍ
ｕｌａｔｅｄ ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ）に対する影響を図
２におけるＢで示す。

【図３】図３は、アミノ酸配列ＫＱＡＧＤＶ，ＫＱＲＧ
ＤＶ，及びＫＧＡＧＤＶを含むペプチドの、フィブリノ
ーゲンの刺激による摂食に対する影響を示す。

【図４】図４は、アミノ酸配列のＲＧＤとＫＱＡＧＤＶ
とＫＧＡＧＤＶを含む多価ペプチドの、ＰＭＮによるＥ
ｌｇＧ摂食に対する影響を示す。

【図５】図５は、多価分岐ＰＧＤペプチド（図５におけ
るＡ）又は多価分岐ＫＧＡＧＤＶペプチド（図５におけ
るＢ）による刺激を受けたＥｌｇＧの摂食に対するｍＡ
ｂのＡＩＡ５（抗β₁ ）の影響を示す。

【図６】図６は、無刺激のＰＭＮ及びＦＭＬＰの刺激に
よるＰＭＮの、多価分岐ＫＧＡＧＤＶペプチドでコート
したラテックスビーズを結合する能力に対する、ＡＩＡ
５（抗β₁ ）、７Ｇ２（抗Ｂ₃ ）及びポリクローナル抗
ＩＡＰの影響を示す棒グラフである。

【図７】図７は、ｍＡｂのＩＢ４（抗Ｂ₃ ）とＯＫＭ１
0 （抗α_m ）の多価ＫＧＡＧＤＶペプチドコートのビー
ズ結合に対する効果（図７におけるＡ）及び多価ＫＧＡ
ＧＤＶペプチドの刺激によるＥｌｇＧの摂食に対する効
果（図７におけるＢ）を示す。

【図８】図８は、ヘキサペプチドＫＧＡＧＤＶ及びＫＱ
ＲＧＤＶの、多価ＫＧＡＧＤＶペプチドでコートしたビ
ーズの対照（図８におけるＡ）及びＦＭＬＰで刺激した
ＰＭＮ（図８におけるＢ）による結合に対する、影響を
示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハッティー ダーデン グレッシャム アメリカ合衆国ミズーリ州コロンビア, サウス エッジウッド アベニュー 602 審査官 冨永 みどり (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 7/06 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次のアミノ酸配列 Ｌｙｓ Ｇｌｙ ＡＬａ ＧＬｙ Ａｓｐ Ｖａｌ
   〔配列番号ＩＤ ＮＯ：１〕を有するヘキサペプチド。