JPH05504470A - Ｐａｄｇｅｍを介した細胞結合の阻害 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 即呵叶介騒を相結合の阻害 本発明は、その一部を政府の援助によってなされたものであり、政府は本発明に 関して一定の権利を有する。

発叫Φ背景 本発明は、血球細胞凝集の阻害に関するものである。

１［１，Ｉ販は、体正し、不活性な状態ご血液中を循環する無核の細胞である。

止血が開始する間、これらの細胞は活性化されへ例えば急速な粒子のエキソサイ トーノスあるいは、血小板のアルファ粒子膜が外側の形質膜と融合したり、他の 活性型置ｔＷＸ＝よび他の細胞に結合する能力など、新しい機能を活性型血小板 に与える新たな細胞表面タンパク質が発現されるような脱粒子化といった、重要 な形態的、生化学的および機能的変化を起こす、活性型血小板は、成長しつつあ る血栓へ補給されるか、あるいは血流力１ら速やかに除かれる。活性型血小板は 単球δよび好中球（ユンギら（１９８６］、Ｂｆｏｏｄ　６７、６２９−６３６ 　）　、ならびに１（Ｌ６０や１４９３７などの、単球様細胞系列（ユンギら、 　１９８６、同上；ンルハーシュタインら＜１９８７）、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎ ｖｅｓｔ、堕、　８６７−８７４１を含む食作用を持つリンパ球に結合する。

ＰＡＤＧＥＭ　（血ノド阪活性化依存性粒子の外股タンパク質）はまたＧＭＰ− １４０としても知られるが、血１Ｉｅｌ激あるいは粒子の分泌によって活性型皿 ノｊ販の表面に発現される分子蟹１４０．０００のアルファ粒子膜タンパク質で ある（スーーリンら（１９８４）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋＋、２５９　、 ９１２１−９１２６　；ツユテンハーグら（１９８５３，Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ ｏｌ、川し：８８（Ｌ８８６；　バー７ンら（１９８６）、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、 　１ｎｖｅｓＬ、７８．１３０−１３７　）　、また、それは巨核球（ヘノクン ユテフドら、１９８６．　Ｂｌｏｏｄ　６７、２８５−２９３　）およびワイヘ ルーバラード体（ボンファンティら（１９８９＞、　Ｂｌｏｏｄ　７３．１１０ ９４１１２　）内の上皮細胞（マツクエバーら（１９８７）；　Ｂｌｏｏｄ　７ ０：３５５８　）においても見っがっている。本明細Ｓに参Ｋにより組み込まれ ている、フリーらの米国特許第４，７８３．３３０号明細書は、ＰＡＤＧＥ　Ｍ と反応性のあるモノクローナル抗体について述べている。

発叫Ｑ概要 われわれは、ＰＡ圓Ｅ１がＰＡＤＧ団を待つ細胞、例えば活性型血小板やか１激 された一ヒ皮細胞と、ＰＡＤＧＩＪｆｆ李異的なリガンドを持つ、単球および好 中球といった特にリンパ球との結合を仲介することを発見した。われわれの発見 は、ＰＡＤ）ＧＥＭあるいはＰＡｏｃＥ−多異的リガントに結合する物質を用い るごとによって、ＰＡＤＧＥＲ？異的リガントをもつ細胞に対するＰＡＤＧＥＭ を持つ細胞の結合を阻害することを可能とする。病的であるまたは病的であるか も知れないような４つの生物学的な過程に関する例は、本発明によって阻害され ることができるが、かゆ状動脈硬化症、血液凝固および炎症である。

かゆ状動脈硬化症に関するわれわれのモデル、および予防的な抗かゆ状動脈硬（ ＩＪｔ治療は以下の通りである。血管壁中の損傷した上皮細胞はその表面にＰＡ ＤＧＥＭを発現する。これにより、ＰＡＤＧＥＭのリガンドを持つ単球がこの領 域に補給され、これらの単球はＰＡＤＧＥＭリガンドの結合による仲介を経て上 皮細胞に接着し、脂質、血小板断片および他の分子の補給によって、最終的に病 的な泡細胞となる。このサイクルは、上皮細胞上のＰＡＤＧＥＭへの結合、ある いは単球上のＰＡＤＧＥ川貫的リ用ンドへの結合によって、単球への上皮細胞の 結合を拮抗的に阻害する可溶性藁荊を投与することで、本発明にし１こかつて中 断される。もし活性型血小板もそれが持つＰＡＤＧＥＭによって単球の補給に関 連しているとすれば、その補給も同様に阻害されるだろう、それに加え、もし単 球に加えてＰＡＤＧＥ−をもつ細胞が有害な酵素を分泌する好中球の補給を引き 起こすとすれば、その過程もまた阻害されるだろう。

血液凝集に関するゎれＶれのモデルは以下のものである。血液凝集過程のはしめ に、活性型血小板が損傷した血管の表面に蓄積する。活性型血小板は、それがＰ ＡＤＧＥＭを発現しているため、その領域への卓球の補給を起こす、単球はその 領域において、血液凝集カスケードを開始するタンパク質である組織因子の分泌 あるいは蓄積を引き起こす０本発明の阻害的物質は、卓球の活性型血小板への結 合を阻害することによって、この過程を妨害している。

炎症に関するわれわれのモデルは以下のものである。活性型血小板は、その表面 にあるＰＡＤＧＥＭによって組織の損傷部に蓄積し、その領域に単球および好中 球を補給する０次いで、それらの単球はＦ員傷部に炎症要素を伝達する０本発明 にょる阻害は、Ｉ！Ｊ１球と血小板の結合るよび好中球と血小板の結合を妨害す る。

本発明の阻害Ｔｈ１ｆｆはＰＡＤＧＥ門上のりガント結合部位を模倣することに より、リンパ球に結合して１４な細胞への結合事象を妨げるか、あるいはリンパ 球上のりガントの結合活性に似ていることにより、ＰＡＤＧＥＭに結合して有毒 細胞　細胞結合事象を阻害する炭水化物であることも可能である。その物質がＰ ＡＩＸ；ＥＭのリガンド結合部位に似ている場合、ＰＡＤＧＥＭの疎水的膜透過 領域を含まないが、しかしその断片がリンパ球上のりガントへ結合するために充 分な置のＰＡＤＧＥＭを含んでいる、可溶性タンパク譬断片であることが好まし い、可溶性のＰＡＤＧＥ−断片は、少なくとも４つの、さらに好ましくは１０か ら１５アミノ酸を含んでいることが望ましく、また天然に存在するＰＡＤＧε粉 子のある領域と少なくとも９０％相同であることが好ましい、この断片は、膜透 過領域を含まないことに加えて、例えばＰ＾ＤＧＥＭ分子の他の領域は含まない が、レクチンドメインを含むことができ、このレクチンドメインはマツクエバー 、前出、において説明されているように、アミノｔａｌから１１８で規定される 領域である。もうひとつの候補分子は、ＰＡＤＧＥＭのＣ３ｂ反復ドメインのひ とつである。レクチンドメイン自身、Ｃ３ｂ−Ｃ４ｂ調節タンパク質反復ドメイ ン自身あるいはさらに別のドメインは、その断片の生物学的活性ではなくて結合 性のみが必要とされる目的とする拮抗阻害効果を示すために充分であり得る。

本発明のその他の特長および利点は好ましい態様についての記載および請求の範 囲から明かとなるであろう。

吐象し虻態榎Ω説朋 Ｖれわれは、はしめに簡単な図面の説明を行う。

凹面 第１図は、血小板とＨＬ６０細胞および好中球との相互作用に対する抗ＰＡＤＧ ＥＭ抗体と精製されたＰＡＤＧＥＭの効果を示した写真である。

第２図は、活性ｍ小板へのＨＬ６０細胞の接着相互作用に対する異なる薬剤の効 果を定量化したグラフである。

第３（ａ〕図および第３（ｂ）図は、ＰＡＤＧ曲および抗ＰＡＤＧＥ阿抗体によ る、ｏ９３７細胞への活性型血小板の接着に対する定量的阻害を表わしたグラフ である。

第４図は、休止型および活性型血小板と種々の細胞型との相互作用を示したグラ フである。

第５図は、好中球とＵ９３７細胞に対する、ＰＡ［）ＧＥｊ’ｌを含むリン脂質 粒子の結合を示す写真である。

第６図は、Ｕ９３７１１胞に対する、ＰＡＤＧＥＭを含むリン脂質粒子の結合の 定量的分析を示すグラフである。

第７図は、ＰＡＤＧＥＭをコードする複合ヌクレオチド配列と、推定されるアミ ノ酸配列を合わせて模式化したものである（ジョンストンら（１９８９）、Ｃｅ １ｌＳ５６：１０３３から適用、参照により本明細書に含まれている）。

第８図は、タンパク質ドメインの表示と共に、ＰＡＤＧＥＭタンパク質を模式化 したものである。

第９図から第１Ｏ図は、フコイジン、コンドロイチン硫酸およびヘパリンの、血 小板／ＨＬ６０結合阻害を措いたグラフである。（３つは全て硫酸化された炭水 化物である。） 摸匹嬰９７パク買 ＰＡＤＧＥＭは後述のように、好中球および単球への活性型血小板ならびに、好 中球および単球への、刺激を受けた上皮細胞の結合を仲介する受容体タンパク質 である。　ＰＡＤＧＥＭのＤＮＡ配列（ジョンストン、前出）は、レクチンドメ イン、上皮成長因子様ドメイン、コンセンサス反復配列、膜貫通ドメインおよび 短い細胞質ドメインを含むドメイン構造を示している。　ＰＡＤＧＥＭの推定さ れる一次構造は、ＥＬＡＭ−１′８よびＭＥＬ−１４という血管細胞−細胞相互 作用に関与する２種のタンパク質と構造的相同性を示している（ベヴイラクアら （１９８９）、５ｃｉｅｎｃｅ　２４３　。

１１６０−１１６５　；　’ｉミーゲルマン（１９８９）、５ｃｉｅｎｃｅ　２ ４３　、１１６５−１１７２、ラスキーら（１９８９）、Ｃｅｌｌ　５６．１０ ４５−１０５５　）　。

以下に述べた実験は、ＰＡＤＧＥ肋（異型（ヘテロタイプ）の細胞間接着分子と じて機能することができることを示している。これらの実験は、休止型血小板で はなく、活性型態／１週が旧−６０、ｔｊ　９３７、単球および好中球などのＰ ＡＤＧＥＭ’ｌ容体を持った細胞に結合すること；ならびに抗ＰＡＤＧＥＭ抗体 が特異的に結合を阻害するために、ＰＡＤＧＥＭがこの結合相互作用を仲介して いること；８よび休止型血小板、活性型血小板のいずれも他のタイプの直管系細 胞、すなわらＰＡＤＧＥ授容体を持たないものとは相互作用しないごと：および ＰＡＤＧＥＭを含むリン脂質粒子がＰＡＤＧＥｆｉ容体を持つ細胞に特異的に結 合することを示している。

ＰＡＤＧＥＭの種々のタンパク質断片は、ＰＡＤＧＥＭを介した血球細胞の接着 を拮抗的に阻害することにより、血栓症および炎症の治療に用いられるであろう と考えられる。天然分子の、タンパク質分解酵素による分解に由来するＰＡ圓Ｅ Ｍタンパク質断片、あるいは合成ＰＡＤＧＥＭタンパク質断片は、以下に述べた ように、それらが血小板−ＨＬ６０結合を阻害する能力によって検索され得る請 求めるＰＡＤＧＥＭタンパク質断片は、ＰＡＤＧＥＭ発現細胞力？ＡＤＧＥＭリ ガンド発現細胞へ接着することを阻害するために、その断片をコードする合成り ＮＡを発現することによるが、あるいは以下に述べるように、天然のＰＡＤＧＥ Ｍ遺伝子のクローン化した断片を発現することによって生産され得る。

証小板番用しｉ旦礪惣およびそ舅將盈の相互作用に・する、ＰＡＤＧＥ佑よび坑 ハ四Ｖ抗体の効釆 ＰＡＤＧＥ肋（活性型血小板−ＨＬ６０の相互作用を仲介していることを示すた めに、精製されたＰＡＤＧＥＭタンパク質存在下で細胞接着アッセイが行われた 。活性型血小板−ＨＬ６０相互作用の特異性は、抗ＰＡＤＧＥＭ抗体を用いて単 球様ヒＩ−ＨＬ６０細胞上のＰ＾ＤＧＥＩ容体を飽和し、それによるロゼツト形 成の妨害を試みることにより試験された。ＰＡＤＧＥＭを介した血小板の結合は 、好中球と単球様ヒト細胞系列Ｕ９３７を用いても試験された。これらの結果は 以下に述べた。

血！Ｊ」（ｊ丑共昧、旦上旦則βよびＵ９３７細胞の−と維持血〕］藏は、正常 なヒト供与者から得られた、抗血液凝固処理した新鮮な血液より、ゲル濾過によ って鵜された（スーーリンら、１９８４、前出）。活性型血小板は終濃度０．２ ５１／ｍｌのトロンビンとともに、２２℃で２０分間、撹拌せずに細胞をインキ ユベーシヨンする事によって調製された。新鮮な血小板は、：Ｊ４製後３０分以 内に細胞接着アッセイに用いられた。好中球はイングリッシュとアンダージン（ １９７４）、Ｊ、　ｉｗ＋ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　５　、２４９−２５２ の方法によって２１２された。好中球標品は、光学顕微鏡によって９５％以上の 純度であった。

細胞系列ＨＬ６０およびＵ９３７　（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，番号　それぞ娠ＣＣＬ２ ４０およびＣＲＬ　１５９３）はペニシリンＧナトリウム（ｆｏｏｌ／■Ｉ）、 硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ７ｇり　、　ＨＥＰＥＳ（１０ｗＭ）（０ ，１４Ｍ　〜ａｃｌ、ｌｂＭ　ＮａＨＣＯ，、０，００８Ｍ　ＭＣＩ、０．００ １Ｍ　ＭｇＣｈB ０．４５ｇ　）Ｉｅｐｅｓ　（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２− エタンスルホン酸、シグマ、セントルイス、ＭＯ）　、Ｉｇ　デキストロース、 ρ１１７．３５＞　、ピルビン酸ナトリウム（１１℃Ｍ）、し−グルタミン（２ ■Ｍ）、β−メルカプトエタノール（０，０００４χ）およびｌＯχウシ胎児血 清を補ったＲＰＭ［１６４０培＋ｆｉ　（Ｍ、Ａ、ハイオブロダク゛人つォーカ ーズヴイル、ＭＯ）中で培養することによって維持された。

−ＰＡＤＧＥＭモノクローナル　ＡＣｌ、２のｉＰＡＤＧＥＭに対するモノクロ ーナル抗体は、ＫＣ４を生産するためにはじめに用いられたものと同し方法を用 いてｊｊｌ！された（スーーリンら（１９８４）、前出；および米国特許第４， ７８３．３３０号明細書）、Ｂａ１ｂ／ｃマウス（ジャクジン研究所、バール・ ハーバ−１叩）はトロンビンによって活性化された血小板で免疫された。

肺細胞は、標準的方法（ケーラーとミルンユティン、■９７５、Ｎａｔｕｒｅ　 震［，４９５−４９７）を用いてＮＳｌ細胞（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，番号ＴｌＢ１８ 　）と融合され九ＡＣ１，２と名付けられたハイブリドーマは、ＫＣ４（スーー リンら、前出〕と類似の性質を持っていた。

この抗体、すなわちＩｇＧ、は活性型血小板には結合するが、休止型血小板には 結合せず、精製されｙ、：ＰＡＤＧＥＭど反応し、またＳＤＳゲル電気泳動し、 界面活性剤で可溶化したｌｌｌ１ｌＪ奢によるウェスタンブロッティングで得ら れる１４０，０００の分子費のハンドとも反応し、固定化し、透過性をもたせた 、？Ｉ：ａをしていない上皮細胞のワイヘルーパレイド体（ｈｅｉｂｅｌ−Ｐａ ｌａｄｅ　ｂｏｄｉｅｓ）に特異的に局在している（ボンファンティら、（１９ ８９）、前出）。

Ａｃｔ、２は製造者のプロトコルにし１こかつて、ラクトパーオキシダーゼ　グ ルコースオキシダーゼ法（エンザ１モビート、バイオラッド社、リノチモント、 ＣＡ）によってヨウ化さｎ、た。

髄−四部Ｍ久Ｚ尽久霞Φ単邸 ＰＡＤＧＥＭ４よ、以前に述べたイムノアフィニティー・クロマトグラフィーに わずかな修飾を加えることによって、血小板から精製された（スーーリンら、（ １９８４）、前出）、簡単に述べると、５０ユニツトの凍結した血小板を解凍し 、洗浄および超音波処理を行った。血小板溶解物は、４”Ｃで３０分間、ｔｏｏ 、ｏｏｏ　ｘ　ｇに３いて遠心することにより沈降さへ次に沈澱物は１％のルブ ロールＰＸ（シグマ）中で超音波処理さに４°Ｃで３０分間、１００．０００　 Ｘ　ｇにおいて遠心された。この上清は、宕法にしたがって作製されたＡＣｌ、 ２−セファロースカラム（セファロース、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ 、ナバヴイル、ＩＬ）に供された。界面活性剤を含まない緩衝液で二〇カラムを よく洗った後、結合したタンパク質はジエチルアミンにより溶出し、徹底的に透 析して、′ａｖＭし、再びトリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ　）　、ｐＨ７，５ （０，０２Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＣＩ、　０．１４Ｍ　ＮａＣ１）に対して透析された 、この標品をｐＨ７，５のＴＢＳで平衡化した、非免疫■〆−セファロース力ラ ムに供した。ある標品では、ＰＡＤＧＥＭはＳＤＳゲル電気泳動および電気溶出 によってさらに精製された。

ポリクローナル抗体Ω単醪 ポリクローナル抗体は、ウサギにおいて通常の免疫化を行うスケジュールで作製 さル抗ＰＡＤＧＥ−抗体はＰＡＤＧＥＭ−セファロースにおけるアフィニティク ロマトグラフィーによって精製された（バーマンら（＋９８６）、Ｂｌｏｏｄ　 ６７．２８５−２９３）、これらの抗体は以前に活性型血小板にのみ結合しくバ ーマンら、（１９８６＞、同書：パラブリ力ら、（１９８９）、Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８６．１０３６−１０４０　 ）　、また界面活性剤で可溶化した血小板のウェスタンブロッティングにおいて ＰＡＤＧＥＭとのみ相１作用することが示されている（バーマンら（１９８６） 、前出）。

以下の抗原およびその抗体が用いられた：すなわちトロンポスボンジンおよびポ リクローナル・ウサギ・抗トロンポスポンジン抗体（シルバーシュタインら、１ ９８７、前出）　、ＧｐＨｂ−１１１ａ、ウサギ抗ＧＰＩｌｂ−１１１ａおよび ＧＰＩνに対するモノクローナルならびにポリクローナル抗体（シルバーシュタ インら、Ｊ、Ｃ，１，、前出）（３３μｇ／ｍｌ）、およびＰＡＤＧＥＭに対す るモノクローナル抗体（１−１８，２−１５，２４７）（スーーリンら、１９８ ４、前出）などである。

ｗ１ｍｉヱヱ皇乙 ２０μｌの血小板＝ｉ液（２ｘｔｏ”　／ｍｌ　）を２０μｍの細胞懸濁液（２ ＸＩＯ’　／ｓｌ）と混合し、微量遠心管中において、２２℃で２０分間インキ ュベーションした、次に、この細胞懸濁液の一部をノイバウアー・チャンバーに δき、オリンパスモデルＢＨ−２２微鏡を用いた光学顕微鏡による評価を行った 。それぞれのアッセイから３つの試料について２００個の細胞を計数し、２つ以 上の接着性血小板に結合した細胞の割合を記録することによって評価した。抗体 阻害実験は、加μｍの血／Ｉ’１反懸濁液（２ＸＩＯ”　／ｍｌ　）と２０μｌ の抗体溶液を２２°Ｃで２０分間プレインキユヘーションすることによって行わ れた。このインキュベーシゴン混合液に、細胞（２０μｌ；３Ｘ１０’細胞／ｍ ｌ　）が２２℃で２０分間添加された。いくつかの実験に８いて、２０μＩの細 胞（３ＸＩＯ”細胞／耐）が２０μｍの精製されたＰＡＤＧＥＭ、トロンポスボ ンジンあるいはウシ直情アルブミン（シグマ、セントルイス、ＭＯ）とともに、 ２２°Ｃで２０分間プレインキヱベーシジンされた。その後、２０μＩの血ＩＪ ｔ’！濁液が、２２℃で２０分間添加された。

桔釆 トロンビンにより活性化されその表面にＰＡＤＧＥＭを持つ血小板は、ＨＬ６０ 細胞とインキュベーションした際、第１ａ図に示したようにＨＬ６０１１胞にロ ゼツトを形成させる。これとは対照的に、表面にＰＡＤＧＥＭを発現していない 、刺激を受けていない休止型血小板は、Ｈｌ、６０細胞に結合しないかあるいは ロゼツトの形成を行わない（第１ｂ図）、１−な特異性を持つイムノアフィニテ ィー精製されたポリクローナルなウサギ抗ＰＡＤＧＥＭ抗体（５０μｇ／ｍｌ　 ）は、第４Ｃ図および第ｉｆ図に見られるようにほぼ完全に、活性型血小板とＨ Ｌ６０細胞の結合を阻害したポリクローナルな抗ＰＡＤＧＥ叫九体が細胞接着を 阻害したにも関わらず、ＰＡＤＧＥＨに対ｔ　ル５　Ｊｌ類（７）モ／　りｏ− −ｊ−ル抗体（ＫＣ４（４２μｇ／ｍｌ）　、ＡＣｌ、２（１３０μｇ／ｍｌ） 　、１−１８．２４５　ｓヨび２４７　（全て腹水を１ｇ１ｏｏ希釈したも）） ）ハ、第２図ニ、ｒ＜すしているようにｌ［［Ｌ／Ｊｆ＆　ＨＬ　６０細胞の結 合を阻害することができなかった。ポリクローナル抗ＰＡＤＧＥＭ抗直清（１： １００希釈）は細胞接着を阻害したが、一方ポリクローナル８よびモノクローナ ル抗トロンポスポンジン抗体　抗ＴＳＰ　（１：１００希釈）、ポリクローナル 抗ＧＰ１１ｂ４１！ａ抗体（抗ＧＰＩＩｂ／ｌ［Ｉａ）　、ポリクローナルおよ びモノクローナル抗ＧＰＩＶ抗体（示していない）、並びに、抗プロトロンビン 抗血清（抗−ＦＴ）（Ｌ：１００希釈）および非免疫血清（血清）は、旧７６０ 細胞と活性型血小板の結合を阻害することができなかった（第２図）、第２図で は、休止型血小板は白抜きの棒で、一方、活性型血小板は、＠塗りの棒で示され ている。２つ以上の血小板に結合したＨ　Ｌ　６０細胞の割合は位相差ｗ４微鏡 下で観察された。

もしＰＡＤＧＥ肋（活性型血小板とＨＩ−６０細胞をつないでいる複合体の構成 要素であるなら、ＨＬ　６０細胞上のＰＡＤＧＥ−認識部位を可溶性のＰＡＤＧ ＥＭで飽和することにより、これらの細胞への活性型血小板の結合が阻害される はずである。第１ｄ図に示されるように、活性型血小板の添加に先立って、ＨＬ ６０細胞とともにインキユベーシヨンされた精製ＰＡＤＧＥＭ　（３０μｇ／ｍ ｌ　）ば活性型血小板とＨＬ　６０細胞との結合を８０％阻害した。第２図はＥ ＤＴＡ　（５ｍＭ　）も結合を阻害することを示している。これとは対照的に、 トロンポスボンジン（ＴＳＰ　）　（１００ｐｇ／曽１）、７／ｌｚ７’ミ７　 （１０μｇ／ｍｌ　）　、７７／−ｊス−６−’Ｊ　７酸（Ｍ−６−Ｐ　）　（ ｌｏ閣Ｍ）　オヨびペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａ　５ｐ−５ｅｒ　（ＲＧＤＳ） 　（ベニンスラ・ラボラトリーズ、ヘルモント、ＣＡ）　（３ｍＭ　）は活性型 血小板とＨＬ６０の結合を阻害しなかった（第２図）。

好中球（２０μｌ；２ＸＩＯ’細胞、’ｍｌ　）もトロンビンによって活性化さ れた血小板と相互作用したが（第１ｅ図）、休止型血小板とはしなかった。　Ｐ ＡＤＧＥＭに対する抗体はこの相互作用を妨害しく第１ｒ図）、精製されたＰＡ ＤＧＥＭは活性型血小板の好中球δよび末梢血単球への結合を阻害した。

第３ａ図および第３ｂ図は、Ｕ９３７細胞への活性型血小板の結合に関する、Ｐ ＡＤＧＥ−あるいは抗ＰＡＤＧＥＭ抗体を用いた、抗体による阻害を示している 。Ｕ９３７細胞と活性型皿１１噸との相互作用は、ロゼ７トの形成によってモニ ターした。第３ａ図において、アフィニティー精製されたポリクローナルウサギ 抗ＰＡＤＧＥＭ抗体が、血小板１０９３７細胞のインキユベーシヨンに先立って 、トロンビンによって活性化された血ＩＮ反とともに２０分間インキエヘーショ ンされた場合、５０％阻害は７ｄｇノー１の抗ＰＡＤＧＥＭ抗体で起こり、完全 阻害は２０Ｚｇ／−１以上の抗体濃度で起こった。　ＰＡＤＧＥＭタンパク質も 活性型血小板／Ｕ９３７細胞の接着を阻害した、第３ｂ図は、ＦＡＩ）ＧＥＭタ ンパク質をＵ９３７細胞（活性型血小板とＵ９３７細胞をインキュベーションす るに先立って、３Ｘ１０’細胞／履ｌで２０分間）とインキュベーションした後 、ＰＡＤＧＥ肋＜２μｇ／ｍｌで、結合の５０％阻害が起こり、ＰＡＤＧＥＭの 濃度が３０μｇ／ｍｌ　以上で最大阻害となることを示している。

活性型血小板上でのＰＡＤＧＥＨの発現は、拮抗剤非依存性であることが示され ている（スーーリンら（１９８４）、前出）、トロンビンによる活性を受けた血 小板に加え、ＡＤＰおよびコラーゲンならびにエピネフリンによって活性化され た血小板はＨＬ６０とＵ９３７１１胞に結合する。これらの相互作用はＰＡＤＧ ＥＭおよび抗ＰＡＤＧＥＭ抗体によって阻害される。

ｒｋＬｌ　と他の直　７、細　との相互作月国≧沙ＵＳ　ＰＡＩ叩基グ効釆単球 は単核のリンパ球画分をヒト血清１５ｍＭ　ＥＤＴＡで２回洗い、滅菌したプラ スチック皿に大振ＲＰＭ［／１０！ウシ胎児血清中で、３７　’Ｃ２時間インキ ュベージランすることによって調製された。接着しない細胞を除（ために、この 皿を、３７℃で３回、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によって洗った。０℃の ＰＢＳを加え、細胞を４°Ｃで１時間インキュベージランした。接着した細胞を ラバー・ポリスマンで穏やかにはがし、ＰＢＳで洗い、ＲＰＭＩ／ＬＸウシ胎児 誼清に再び懸濁した。リンパ球は、ＰＢＳで非接着性細胞を洗い、これらの細胞 をＲＰＭ１／ｌズウシ胎児血清に再懸濁することにより得られた。これらの標品 の純度は、ライトおよび特異的なエステラーゼならびに非特異的なエステラーゼ 株を用いて、光学顕微鏡によって９０％以上であることが確立された。ジャーカ ット（Ａ、Ｔ、Ｃ。

Ｃ番号ＣＲＬ８１３６）　、ＣＥＭ　（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ番号ＣＣＬ１１９）＃よ びダウディ（Ａ、Ｔ。

Ｃ，Ｃ，番号ＣＣＬ２１３）細胞系列はＨＬ　６０およびＵ９３７細胞に関して 上述されたような培養で維持された。

第４図は、休止状態あるいは活性型血小板と種々の細胞型との相互作用を示して いる。２つ以上の血小板に結合すること力魅された細胞の割合が、位相差顕＠鏡 下で決定された。試験された細胞は、好中球、単球、リンパ球、赤血球（ＲＢＣ ）、ＨＬ６０細胞、Ｕ９３７細胞、Ｃ巳Ｍ細胞、ジャーカット細胞およびダウデ ィ細胞を含んでおり、全ての細胞はｌＸｌ０’細胞／−１の濃度であり、血小板 の濃度は！、５　ＸＩＯ”細胞／−１だった。白抜きの棒は休止血小板のみを示 し、斜線をつけた棒は活性型血小板を示し、黒塗りの棒は抗ＰＡＤＧＥＭ抗体と インキュベーションした活性型血小板を示している。第４図は、単球および好中 球が活性型血小板には結合するが、通常のリンパ球、赤血球細胞、ヒトτ−細胞 様ジャーカット細胞あるいはヒトＢ−細胞様ダウディ細胞系列とは結合しないこ とを示している。したがって、４１球８よび好中球を含む食作用を持つ細胞は、 細胞膜上に活性型血小板の表面上に発現したＰＡＤＧＥＭに結合する認識部位を 含んでおり、この部位はＰＡＤＧＥ綬容体と呼ばれる。

臥匹堕炙倉むリン　の　への結合 ＰＡＤＧＥＭは膜内在性タンパク質であり（バーマンら、１９８６、前出）、膜 貫通ドメインを含んでいるようであるため（ジョンストンら、１９８９、前出） 、精製されたＰＡＤＧＥＭを、膜（すなわち下記粒子（ｖｅｓｉｃ！ｅ）　）に 結合したＰＡＤＧＥ肋（ＰＡＤＧＥ曖容体を含む細胞に結合するかを調べるため に、フォスファチジルコリンおよび蛍光性のフォスファチジルコリン類像体であ るＮ０Ｄ−フォスファチジルコリン（２−（６−（Ｎ−（７−ニドロベンジルー ２−オフサ−１，３−ジアゾールー４−イル）アミノ）カプロイル−３−バミト イル−し一α−フォスファチジルコリン）からなるリン脂質粒子（ｐｈｏｓｐｈ 。

１ｉｐｉｄ　ｖｅｓｉｃｌｅ）に取り込ませた。

即ち、ＰＡＤＧＥＭハＩＪヴネイトメ−／　ッｙ　（１９８２）、Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｗ、２５７　、１２８００−１２８０８の方法を使ってリン脂質粒 子に取り込まれた。簡単に述べると、クロロホルム中で、５−ｇのフォスファチ ジルコリンと０．２５ｖａｇのＮＢＤ−標識フォスファチジルコリン（アヴアン ティ・ポーラ−・リビッズ社、ペラム、＾Ｌ）を混合し、クロロホルムを３７° Ｃで蒸発させることによって除去した。この乾燥した脂質を塩化メｆ　し：ｚＣ ｐ４懸ｉＬ、溶媒は２回蒸発させて除いた。　ＰＡＤＧＥＭ　（１＋＋ｌ　：２ ００　ｔ１ｇ／ｖａＩ　ＴＢｓ）あルイはＧＰＩ　１ｂ−ＩＬＩａ　（４００ｕ ｇ／ｍｌ　ＴＢＳ）力樟シ鰻したリン脂Ｚに添加さａ。

ＣＩｌ＾ｐｓ　（３−１（３−コラミドブロビルノジメチルアンモニオ：ｌ　プ ロパンスルフォネート）（シグマ社）が、終濃度１０ａＭで添加され、この脂質 は再懸濁された。この標品は、アルゴンガス下でＴＢＳｌｏ、０２Ｚ　ＮａＮ、 に対して２時間透析され、沈降した物質は再懸濁されて、２４時間透析が続けら れた０粒子は、セファロース４Ｂカラムにおけるゲル濾過によって取り込まれな かったタンパク質から分離された０粒子へのＰＡＤＧＥＨの取り込みは、スーー リンら、１９８４、前出、にしたがってＡＣ１゜２抗体を用いてイムノブロッテ ィングを行うことによって確認さｆ５粒子へのＧＰ［１ｂ−ｒＨａの取り込みは 、抗ＧＰ［Ｉｂ−１１１ａを用いた同様な方法で確認された０粒子は暗所で、４ °Ｃにおいて保存された０粒子標品は、１χウシ胎児血清および２χウシ血清ア ルブミンを含むＲＰＭｒ　１６４０に＠濁された細胞（ｌ　ＸＩＯ″／−１）に よって、１：５に希釈された。２３℃で１０分間インキュベーションした後、細 胞は１５秒間１６，０００Ｘｇで沈降させられた。細胞はＴＢＳで一度洗浄して 同バッファーに再懸濁した。蛍光および位相差顕微鏡観察はツァイス・アクジオ スコープ顕微鏡を用いて行われた。

蛍光粒子と好中球、Ｕ９３７細胞およびジャーカット細胞との相互作用は蛍光顕 微鏡および放射性免疫アッセイ法によって調べられた。その結果は第５図に示さ れている。第５ａ図、第５ｂ図、第５ｃ図それぞれに８いて、上のパネルは位相 差顕微鏡観察であり、下のパネルは同じ視野の蛍光顕微鏡写真である（棒は１０ μ−を表わしている）、第５ａ図では、フォスファチジルコリンとＮＢロー４！ ！識フォスファチジルコリンからなる蛍光リン脂質粒子は、Ｕ９３７細胞あるい はジャーカット細胞とインキュベーションさ娠レーンＡはＵ９３７細胞およびＰ ＡＤＧＥＭを含むリン脂質粒子を表わし、レーンＢはジャーカット細胞とＰＡＯ ＧＥＭを含むリン脂質粒子を表わし、レーンＣは、ＰＡＤＧＥＨを含まないＵ９ ３７細胞とリン脂質粒子を表わしている。第５ａ図、レーンＡはＰＡＤＧＥＭを 含むリン脂質粒子がＵ９３７細胞の表面に結合することを示している。レーンＢ およびレーンＣはそれぞａ、　ＰＡ［ｌＧＥＭを含むリン脂質粒子がジャーカッ ト細胞に結合せず、ＰＡＤＧＥＭを含まないリン脂質粒子はＵ９３７細胞に結合 しないことを示している。＄１！タンパク質であるＩ　１ｂ−１［１ａを含むリ ン脂質粒子はＵ９３７細胞と相互作用しなかった（データは示していない）。

第５ｂ図では、蛍光リン脂質粒子は上述のように、好中球とインキュベーション された。第５ｂ図の結果は、蛍光粒子が好中球とインキュベーションされた場合 、好中球（レーンＡ）およびＰＡＯＧＥＭを含まない粒子（レーンＢ）あるいは 環タンパクｔｌｌｂ−１１１ａを含む粒子（レーンＣ）を含む粒子は、好中球と 相互作用しなかったことを示している。

ＰＡＤＧＥＭを介した細胞相互作用の特異性は、第５Ｃ図に示されており、そこ では抗ｐＡｏｃＥｍ九体がこの相互作用を阻害することが示されている。’Ｊ％ ５ｃ図、レーンＡでは、ＰＡＤＧＥＭを含むリン脂質粒子はＵ９３７細胞とイン キュベーションされ、これと結合しており、レーンＢではこの細胞相互作用は抗 ＰＡＤＧＥＭ抗体存在下で阻害されている。第５ｃ図、レーンＣでは、ＰＡＤ） ＧＥＭを含むリン脂質粒子は好中球とインキュベーションさｎ、、これと結合し ており、レーンＤでは抗ＰＡＤＧＥＭ抗体は、この相互作用を阻害している。こ れらの結果は、Ｕ９３７細胞および好中球へのＰＡＤＧＥ睦含む粒子の結合が、 ＰＡＤＧＥＭによって特異的に仲介されていることを示している。

ＰＡＤＧＥＭを含むリン脂質含存粒子とＵ９３７細胞の相互作用は、以下のよう に１２’＋４Ｌ１したＡＣｌ、２抗体を用いて定量化された０粒子標品は、１％ ウシ胎児血清およびウソ血清アルブミンを含むＲＰＭ＋　１６４０でｔｉｔに希 釈された。活性型血小板とし９３７細胞の相互作用を阻害しない、１．ｓ　Ｉ標 識ＡＣ１，２抗体の一定量とともに３７℃で４５分間プレインキユヘーションし た後、抗体−ＰＡ［ＩＧＥＭ　／粒子複合体は、表示された濃度の細胞懸濁液に 添加され、３７゛Ｃで３０分間インキエベーンヲンされた。結合しな力１っだ粒 子は、油層（ｎ−ブチルフタル酸（アルドリッチ・ケミカルズ、ミルウォーキー 、−■）ニアビニシンオイル（＾ｐｉａｚｏｎ　。

ｉｆ）　９３　：　７　ｖ／ｖ）を通して１０．ＯＯＯＸｇで５分間遠心するこ とにより、細胞と結合した粒子から分層さへ細胞沈澱物はｌ！ｓＩについてアッ セイされた０粒子上に露出したＰＡＤＧＥＭの濃度は、リン脂質２重層の内面と 外面におけるＰＡＤＧＥＭのランダムな方向性に基づいて推定された。第６図で は、Ｘ−軸（ＰＡＤＧＥＭ−ＰＬν）上に与えられた濃度が、ＰＡＤＧＥＭの全 濃度であり、黒丸はＵ９３７細胞を表わし、白丸がジャーカット細胞を表わす、 第６図の結果は、ＰＡＤＧＥＭを含む粒子とＵ９３７細胞の相互作用は特異的で かつ飽和性のものであり、粒子の最少結合量は、対照として用いられたジャーカ ット細胞を用いて記録された。

即興ｐ汐し７ε（ハ）υ帆用ｏ７クリーニング精製されたＰＡＤＧＥＭタンパク 質をタンパク質分解酵素による分解、例えばトリプノン分解によって、種々のＰ ＡＤＧＥＭタンパク質断片を作製し、常法にしたがって分層し、以下に述べるよ うなＨＬ６０／１ｍ小板接着アッセイに８いて、それぞれスクリーニングできる 。　（ＨＬ６０細胞は単球への結合特性を示す、一般に入手可能な細胞である。

）もうひとつの方法として、特定の長さを持ち、天然のＰＡＤＧＥＭタンパク質 断片のある領域に対応するペプチドを常法にしたがって合成し、スクリーニング できる。

ＰＡＤＧＥＭタンパク質の断片は、それぞれの断片の標品を活性型血小板の均質 な単層膜で覆われたプレートのウェルに添加し、そこに放射性標識したＨＬ６０ 細胞を添加することで、ＰＡＤＧＥＭによって促進される細胞接着の拮抗阻害に ついてスクリーニングすることができる。プレートへのＨＬ６０細胞の結合を阻 害する断片は、細胞と細胞の結合の阻害剤として働く。

良小仮単層腺□□□虐袈 １１１１Ｊ菫は以下のようにして調製し、活性化することができる。４５ｍ１の 全血を、ＩＱＩＩＭ　アセチルサリチル酸（終濃度１＋＋＋Ｍ　）を含むウェア ーの抗血液凝固剤（−ａｒｅ’ｓ　ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａａｔ）　（０，１Ｍ 　クエン酸ナトリウムを３と、０．１Ｍ　クエン酸を２の割合で混合したもの） ５ｍｌを加えた５０ｍ１容量の注射器に採る。血液をインターナシテナル・セン トリフエージで１１０ｏｒｐｍで遠心することにより、血小板に富んだｒｋＬｅ を赤血球とリンパ球から分離しく出発材料）、きれいなプラスチック試験管に吸 入した。７ｍｌの血小板に冨んだ血漿（ＰＰＰ）を、予め蒸留水（５００ｍｌ） で徹底的に洗った後ＨＥＰＥＳ緩衝液（５００ｍｌ）で洗った、５０ｍ１のセフ ァロース２Ｂカラム（１５ｃｍＸ２ｃｍカラム）にかける、全てのＰＰＰがゲル に入った後、緩衝液を再び流し始める。ｄＬ出してきた緩衝液がひとたび濁って きたら、血小板を１ｍｌの画分ごとに採取開始する。ゲル濾過された血小板のは じめのｍｌは棄却され、採取は緩衝液が透明になるまで続けられる。血小板は、 撹拌刺激を最小限にするために、濁った溶出緩衝液をブラスナ、りの採取管の側 壁を伝わらせることによって採取した。　Ｉ［ｌｌＪ潰の総容量と濃度は記録さ ｎ、、ゲル濾過された血小板はＨＥＰＥＳ！１衝液で１０’細胞／ｍｌの終濃度 に希釈される０次に、ＥＤＴＡが、２．５ｇＭの終濃度で添加される。もし休止 状態の血小板が必要なら、これ以降の調製は不要である。

活性型血小板は、トロンビンを０．１５単位／ｍｌの終濃度になるよう、ゲル濾 過された休止状態の血小板に加え、室温で２０分間インキュベーションすること によって調製される。インキュベーションしている間、血小板を撹拌しないよう に１意する。

均質にコートされた血小板単層プレートは以下のようにして調製される。血小板 の調製の前に、９６穴の＆ｌ織培養プレート（ヘクトン・ディフキンソン社、コ ノキースヴイル、咄）をポリ−し一リジン溶液（リン酸緩衝生理食塩水中、２０ ０μｇ／■１）で１時間コート（１００μｌ／ウエル）した後、ウェルは吸引さ Ｌｉ史用前に風乾される。一度乾けば、必要に応してプレートを一８０°Ｃで保 存することができる。それぞれのコートされたウェルに、４％のパラフォルムア ルデヒド固定側を加え、プレートを３７°Ｃでインキュベーションする。４％バ ラフォルムアルデヒド固定剤は４ｇのバラフォルムアルデヒドを６０°Ｃの、５ ０ｍ１の蒸留水に溶かした後、溶液が透明になるまで１Ｎの水酸化ナトリウムを １−３滴加えることにより調製される。パラフォルムアルデヒド混合液を冷やし た後、これを０．２２μ−のフィルターで濾過し、次に０．２Ｍのリン酸緩衝液 、ｐＨ７，２とｌ：Ｉに混合する。プレートの温度が３７”Ｃに平衡化したら、 １０７の血小板（１００ｕ１！！濁液）をそれぞれのウェルに加え、このプレー トを４°Ｃでｚｏｏｏｇ、１５分間遠心する０次にプレートをさらに４５分間４ ℃でインキュベーションし、その後トリス緩衝化生理食塩水（０，０２Ｍ　トリ ス／Ｃ１，０，１４Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ７，４）　（ＴＢＳ）　／冗−ヘ　塩化 アンモニウムで３回洗い、そして４回目はＴＢＳだけで洗う、その後、プレート は血小板単層膜に顕著な障害を与えることなく、４“Ｃで保存することができる 。

尋杭担胞懐識 ＨＬ　６０細胞あるいはその他の単核細胞を２００ｇで５分間遠心してベレット にし、終濃度ｌＯ１細胞／ｍｌとなるように、１％ウソ胎児血清とともに、ｂＭ 　ＣａＣ１ｚ、２−Ｍ　ＭｇＣｌ□を加えたハンクス・バランス塩溶液（ＨＢＳ Ｓ）（アッセイ緩衝液）に穏やかに懸濁する。インジウムＩＩＩ　（アマーンヤ ム・クリニカル、アーリントン・ハイツ、ＩＬ）　（１ｍｃｉ／−ｌ　）をｌμ Ｃｉ／１０’細胞となるように加え、細胞を室温で１５分間インキユヘーション する。細胞を２００ｇで遠心し、アッセイ緩衝液で２回洗い、１００μｍあたり １０’細胞の濃度となるように、同し溶液に懸濁する。標識効率は、１００μｍ のＨｔ、ｓｏ？Ａ濁液および遠心後に得られるｌＯｏμＩの上滑中の総カウント 数をカウントすることによって測定される。標識の割合は、次の式すなわち、　 （総カウントー上清のカウント）／Ｗカウントで算出される０通常、９０−９５ ％のカウントが細胞に伴う。

結合ヱヱ立随 保存緩衝液を血小板でコートしたウェルから除き、このウェルを１回アッセイ緩 衝液で洗った後、空にしておく、　ＰＡＤＧＥＭタンパク質断片標品はそれぞれ アッセイ緩衝液に溶解し、必要な濃度で適当なウェルに加える。それぞれの断片 標品について、濃度範囲外まで試験することが望まれるだろう、つぎに、ウェル を１９０μｍのアッセイ緩衝液で溝たし、対照用ウェルをアッセイ緩衝液で溝だ す、全ての試料および対照は３から６の複連で試験される。ＨＬ６１よび他の標 識された細胞を加え（１０’　／ウェル）、プレートを１００ｇで５分間遠心す る。プレートを都合２０分間室温でインキュベーションし、次にセルロース・ア セテート・プレート・シーラー（ダイナチック社、アレキサンドリア、ＶＡ）で 覆い、５ｇで１０分間、反転させて遠心する。プレートが反転されている間、液 体と接着しなかったＨＬ６０細胞は、慎重に除かれる。ウェルの側壁は、ｌ小板 単層膜および接着した細胞をそこなわないように注意しつつ、綿棒で乾燥させる 。

八８よびパーセント　の゛ それぞれのウェルの内容物を可溶化する前に、ウェルは結合の存在について倒立 顕微鏡を用いて視覚的に検査可を結合のパーセント阻害に関する、視覚による評 価がなされる。全てのウェルを検査した後、細胞をウェルあたり１００μｍの２ ％ＳＤＳによって１５分間溶解し、このウェルの内容物をガンマ・カウンターで 測定するための試験管に移す、パーセント阻害はそれぞれの実験の対照ウェルに 対する、χ験つェルに残ったカウントを比較することによって決められる。ウェ ルに残った高い値のカウントは、血小板単層膜に結合したＩＩＩ　ｌ標議ＨＬ６ ０纏胞が高い割合であることを示し、すなわち、細胞は血小板に対する結合を拮 抗的に阻害されなかったことを示す。

縦賭ユ榛胞結合奢　するー　ヒ　のスクリーニング上で述べたように、ＰＡＤＧ ＥＭを介した細胞−細胞結合の拮抗阻害は、ＰＡＤＧＥ−タンパク質断片を用い ることによってだけではなく、ＰＡＤＧＥＭに選択的に結合できる炭水化物、す なわち、あるＱ１晩よび好中球上に存在するＰＡＤ［、ＩＪＩ寺異的リガンドと 、その結合特性が似ているあるいは同一であるような炭水化物を用いることによ っても行うことができる。候補となる炭水化物は、ＨＬ６０細胞と血小板を用い た上述の方法によって検索される。

第９図および第１０図を参照すると、４種類の市販されている重合した炭水化物 が、ＨＬ６０と血小板の結合を阻害する能力について試験された。これらの炭水 化物は、フコイジン、コンドロイチン硫酸、ヘパリンおよびヒアルロン酸であっ た。もうひとつの炭水化物の、単純なａｔであるガラクトース硫酸も試験された （結果は図には示されていない）、第９図および第４０図に示されているように 、フコイジン、コンドロイチンｇＪｉ＃よびヘパリンは、全て効果的に結合を阻 害した。Ｍ化されていないヒアルロン酸は効果がなく、ガラクトース硫酸もマン ノース−６−硫酸も効果がなかった。

ＰＡＤＧＥＭりｚＩ９トｉ断片ｍ 第７図はジョンストンら、前出に記載されているＰＡＤＧＥ−遺伝子とタンパク 質の、ＤＮＡ配列およびそれに対応するタンパク質配列を示している。第７図に 示されているヌクレオチド配列は、４つの重複したｃＤＮＡクローン、λＧＭＰ ＥＩ−λＧＭＰＥ４からジョンストンらがひとつにまとめたものであり、これら のｃＤＮＡの相対的な位置は黒塗りの矢印で示されている０点線の矢印は、ある クローンでは見いだされているが、他のクローンでは欠損している領域を示して いる０図中のヌクレオチド番号は、量も５゛側のクローンのアダプター・オリゴ ヌクレオチド配列に続く最初の塩基を起点として、任意に開始したものである。

遺伝子内のオーブン・リーディング・フレームの翻訳されたアミノ酸配列は、１ 文字記号で与えられている。開始メチオニンは、翻訳開始のコンセンサス配列に 適合するフレーム内の最初のＡＴＧ配列を割り当てた。終止コドンはアステリス クで示されている。細い下線は、血小板ＰＡＤＧＥＭのＮ−末端および２６ベブ チドから決められたアミノ酸配列と一致した位置を示している。シグナルペプチ ドは、−４１から−１の位置に対応する。推定上の膜貫通ドメインは太い下線を 付しである。システィン残基は白丸で示してあり、アスパラギン結合型グリコジ ル化部位（ＮｘＳ／Ｔ）の回置性がある部分が黒丸で示されている。３゛非翻訳 領域にある、２つの潜在的ポリアデニル化シグナルは下線と上線を付しである。

ｐＡＸＥｄ伝子はジョンストンら、前出、に記載されているようにして得られ、 求めるＤＮＡ断片を作製するために制限酵素で切断することができ、また、この 断片は次にクローン化さへ発現させて、その結果生じたタンパク質断片は精製す ることもできるが、それらは全て当業者によく知られる常法にしたがって行わ娠 例えばマニアナイスら蘇モレキエラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニ エアル、コールド・スプリング・バーバー、ＮＹ、１９８２８よび、バラエルら 編、クローニング・ベクター、エルシーバー、アムステルダム、１９８５．１ｇ ８７を参照されたい、もう一点として、第７図に示されたヌクレオチド配列は、 ＰＡＤＧＥ−タンパク質の必要な領域あるいは全タンパク質いずれかをコードす る合成りＮＡ分子を作製するために用いることもでき、そして次にその合成りＮ Ａはクローン化して、発現させることもでき、そのタンパク質あるいはタンパク 質断片は常法にしたがって精製される。もし全タンパク質がこの方法で生産され れば、それは必要な断片を作製するためにタンパク質分解酵素によって切断され るかもしれない、最後に、第７図に示されているように、ＰＡＤＧＥＭの推定さ れるアミノ酸配列は合成ペプチドを作製するために用いられるかもしれない。

利用 本発明の６■溶性のＰ＾ＤＧＥＭタンパク質断片あるいは炭水化物は、適当な担 体あるいは希釈剤との混合、またはミセル、ゲルあるいはリポソームを用いて、 伝統的な様式のひとつ（例えば経口、静脈内、経腸あるいは生物学的に分解可能 で、生物学的に適合するポリマーを用いて、継続的に放出する形状で経皮投与す るなど）によってヒトに投与できる。

タンパク譬断片あるいは炭水化物は、ヒトＢ者に対し、０．５μｇ／ｋｇ／日か ら５μｇ／ｋ　ｇ１日の置で投与可能である。

他の態様は、以下の請求の範囲に含まれている。

Ｆ’ｉｇ、１ 浄書（内容に変更なし） ０　２０　４０　６０　８０　別 接着（％） 浄１（内容に変更なし） Ｆｊｇ、３（ａ） Ｆｉｇ、３（ｂ） （ＰＡＤＧＥＡ７１）　（ｕｇ／ｍｔ）Ａ　Ｂ　ＣＤ Ｆｉｇ、５ｆｃｌ 浄書（内容に変更なし） （ＰＡＤＧＥＭ−ＰＬＶ）（μｇ／ｍＬ）７１ｇ、７ 浄書（内容に変更なし） （μｇ／μｇ） 浄書（内容に変更なし） ＨＬ−６０／血小板結合アッセイ Ｃｆｌｏ　ｆ５０　ｆｌｏｏ　ｈＸ）　？＋）００　ｈｌｏｏＯ（μａ／ｍＬ） 手続補正帯（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９０１０６１０１ 平成３年特許願第５００４２３号 ２、発明の名称 ＰＡＤＧＥＭを介した細胞結合の阻害 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名　称　ニューイングランド・メディカル・センター・ホスピタルズ・インコー ホレーテッド ４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正命令の日付　平成　５年　２月　２日　（発送日）国際調査報告 ｍ１ｒ１１４＋１゛ａ＊ｅＩａｈｍ−ｍ、ＰＣＴ、’Ｕ３９０１０６１０１ＰＣ Ｔ／ＬＩＳ９０１０６１０１ ＰＣＴ／ＵＳ９０１０６１０１

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．生物試料あるいは生物系において、ＰＡＤＧＥＭを持つ第１細胞とＰＡＤＧ ＥＭ特異的リガンドをもつ第２細胞との結合を阻害する方法において、該試料を ＰＡＤＧＥＭあるいは該ＰＡＤＧＥＭ特異的リガンドに結合する阻害物質と接触 させることにより該第１細胞と該第２細胞との結合を阻害する上記方法。
2. ２．第１細胞か活性型血小板である、請求の範囲第１項の方法。
3. ３．第１細胞が上皮細胞である、請求の範囲第１項の方法。
4. ４．生物系がヒト患者である、請求の範囲第１項の方法。
5. ５．第２細胞が単球である、請求の範囲第１項の方法。
6. ６．第１細胞が好中球である、請求の範囲第１項の方法。
7. ７．阻害物質が、ＰＡＤＧＥＭリガンドと特異的に結合するＰＡＤＧＥＭの一部 位を模倣することができる可溶性タンパク質断片である、請求の範囲第１項の方 法。
8. ８．阻害物質が、第１細胞上のＰＡＤＧＥＭと結合できる可溶性炭水化物からな る請求の範囲第１項の方法。
9. ９．阻害物質がＰＡＤＧＥＭに対する抗体である、請求の範囲第１項の方法。
10. １０．リンパ球上のＰＡＤＧＥＭ特異的リガンドに結合するＰＡＤＧＥＭの一部 位を模倣することのできる可溶性タンパク質断片。
11. １１．リンパ球が単球あるいは好中球である、請求の範囲第１０項の断片。
12. １２．ＰＡＤＧＥＭの膜貫通領域を含まないかまたは、該断片の可溶化を妨げな い程度に十分に小さい膜貫通領域部分しか含まない、請求の範囲第１０項の断片 。
13. １３．ＰＡＤＧＥＭのレクチンドメインを含む請求の範囲第１２項の断片。
14. １４．ＰＡＤＧＥＭのＣ３ｂ−Ｃ４ｂ調節タンパク質反復ドメインを含む、請求 の範囲第１２項の断片。
15. １５．断片がＰＡＤＧＥＭの一領域と少なくとも９０％以上相同である、請求の 範囲第１２項の断片。
16. １６．断片が少なくとも４アミノ酸を含む、請求の範囲第１２項の断片。
17. １７．断片が少なくとも１０アミノ酸を含む、請求の範囲第１２項の断片。
18. １８．第１細胞が刺激された上皮細胞であり、第２細胞が単球または好中球であ り、該方法がかゆ状動脈硬化症を阻害する、請求の範囲第１項の方法。
19. １９．第１細胞が活性型血小板であり、該第２細胞が単球あるいは好中球であり 、該方法が血液凝固を阻害する、請求の範囲第１項の方法。
20. ２０．該第１細胞が活性型血小板であり、該第２細胞が単球あるいは好中球であ り、該方法が炎症を阻害する、請求の範囲第１項の方法。
21. ２１．請求の範囲第１０項で定義されている可溶性断片の異なる２種類以上を含 む治療用組成物。
22. ２２．請求の範囲第１０項の可溶性断片をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベク ター。
23. ２３．請求の範囲第２１項の発現ベクターを含む細胞。
24. ２４．請求の範囲第２３項の細胞を培養して生産される可溶性断片を単離するこ とからなる、可溶性ＰＡＤＧＥＭ断片の製造方法。