JP2846470B2 - Ｈｌａペプチドによるリンパ球活性の調節 - Google Patents
Ｈｌａペプチドによるリンパ球活性の調節Info
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Description
【発明の詳細な説明】 序論 技術分野 本発明の分野はクラスIHLAペプチドに由来するペプチ
ドフラグメントを利用する細胞障害性Ｔ−リンパ球の調
節に属する。
ドフラグメントを利用する細胞障害性Ｔ−リンパ球の調
節に属する。
背景 細胞障害性Ｔ−細胞、特に細胞障害性Ｔ−リンパ球
（「CTL」）は、標的細胞の表層上の特異的な主要組織
適合性複合（「MHC」）抗原、及びこのMHC抗原の裂片
（クレフト）の中に結合したペプチドを認識することに
よりその活性において制御されている。この外来抗原は
同種異系宿主からの移植、ウィルス感染、突然変異、新
形成等の結果物でありうる。MHCタンパク質の関与は、
外来抗原を含む細胞に対してのCTLによる攻撃にとって
必須であると思われる。CTLは外来抗原の存在をモニタ
ーすることにより細胞を破壊でき、それがなければこれ
らは増殖して、病原又は新形成細胞の増殖をもたらして
しまうであろう。
（「CTL」）は、標的細胞の表層上の特異的な主要組織
適合性複合（「MHC」）抗原、及びこのMHC抗原の裂片
（クレフト）の中に結合したペプチドを認識することに
よりその活性において制御されている。この外来抗原は
同種異系宿主からの移植、ウィルス感染、突然変異、新
形成等の結果物でありうる。MHCタンパク質の関与は、
外来抗原を含む細胞に対してのCTLによる攻撃にとって
必須であると思われる。CTLは外来抗原の存在をモニタ
ーすることにより細胞を破壊でき、それがなければこれ
らは増殖して、病原又は新形成細胞の増殖をもたらして
しまうであろう。
外来抗原の存在をモニターするうえで、CTLは同種異
系宿主に由来する器官、組織及び細胞の移植片も認識す
る。移植片をCTLから守るために、様々な免疫抑制手順
が利用されている。これらの手順は完璧に保護性でない
ことにおいてしばしば不満足たるものであり、また患者
は日和見感染にかかりやすくなってしまう。
系宿主に由来する器官、組織及び細胞の移植片も認識す
る。移植片をCTLから守るために、様々な免疫抑制手順
が利用されている。これらの手順は完璧に保護性でない
ことにおいてしばしば不満足たるものであり、また患者
は日和見感染にかかりやすくなってしまう。
CTLの数及びその活性を高める又は低めることができ
ることにおける非常に大いなる感心の観点において、病
原に対する実質的な保護を供しながら、CTLを調節する
ことを可能とするであろう新たな技術の開発についての
実質的な機会がある。
ることにおける非常に大いなる感心の観点において、病
原に対する実質的な保護を供しながら、CTLを調節する
ことを可能とするであろう新たな技術の開発についての
実質的な機会がある。
関連文献 Clayberger,ら、J.Exp.Med.（1985）11:1709−1714
は、HLA−Aw68及びAw69と比較しながらHLA−A2抗原を述
べている。Townsend,ら、Cell（1986）44:959−968は、
ヘルパーＴ−細胞と同じようにCTLが変性又は劣化タン
パク質の断片エピトープを認識することを示唆してい
る。HolmesとParham,EMBO J.（1985）4:2849−2854は、
HLA−A2,Aw68及びAw69との関係を述べている。CTL標的
特異性はヒトクラスＩ分子の構造変化に非常に感受性で
あると教示されている（DurnaとPease,Transplantatio
n,（1986）41:279−285:Biddison,らJ.Immunol.,（198
0）124:548−552:Spits,ら、Immunoqenetics，（1982）
16:503−512:Gaston,らJ.Exp.Med.（1983）158:280−29
3）。
は、HLA−Aw68及びAw69と比較しながらHLA−A2抗原を述
べている。Townsend,ら、Cell（1986）44:959−968は、
ヘルパーＴ−細胞と同じようにCTLが変性又は劣化タン
パク質の断片エピトープを認識することを示唆してい
る。HolmesとParham,EMBO J.（1985）4:2849−2854は、
HLA−A2,Aw68及びAw69との関係を述べている。CTL標的
特異性はヒトクラスＩ分子の構造変化に非常に感受性で
あると教示されている（DurnaとPease,Transplantatio
n,（1986）41:279−285:Biddison,らJ.Immunol.,（198
0）124:548−552:Spits,ら、Immunoqenetics，（1982）
16:503−512:Gaston,らJ.Exp.Med.（1983）158:280−29
3）。
CTLによる認識に影響を及ぼす突然変異はマウス（Nat
henson,ら、Ann.Rev.Immunol.（1986）4:471−502:Schu
lz,ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1983）80:2007−201
1）及びヒト（Krangel,Biochemistry（1982）21:6313−
6321:Krangel,ら、J.Immunol.（1983）130:1856−1862:
Cowan,ら、J.Immunol.（1985）135:2835−2841:Taketan
i,ら、同書（1984）133:816−821;及びVega,ら、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA（1985）82:7394−7398）において研
究されている。
henson,ら、Ann.Rev.Immunol.（1986）4:471−502:Schu
lz,ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1983）80:2007−201
1）及びヒト（Krangel,Biochemistry（1982）21:6313−
6321:Krangel,ら、J.Immunol.（1983）130:1856−1862:
Cowan,ら、J.Immunol.（1985）135:2835−2841:Taketan
i,ら、同書（1984）133:816−821;及びVega,ら、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA（1985）82:7394−7398）において研
究されている。
これらの報告は、残基147〜157の間の領域にかなり注
目しているが、その他の領域も機能的特異性をもたらし
うる（Ezquerra,ら、J.Immunol.（1985）134:2727−273
3）。変異性のクラスターが第一細胞外ドメインのカル
ボキシ末端及び第二細胞外ドメインのアミノ末端におい
て報告されている（Ways,ら、J.Biol.Chem.（1985）26:
11924−11933）。全てのクラスＩ分子の残基105〜108の
間の配列はフィブロネクチン結合テトラペプチドのそれ
にかかわり（AuffrayとNovotry,J.Human Immunology（1
986）15:381−390）、いづれの配向においてもこのテト
ラペプチドは細胞付加特性を有することが見い出されて
いる（PierschbacherとRuoslahti,Nature（1984）309:3
0−33;YamadaとKennedy,J.Cell.Biol.（1985）28:99−1
04）。HLA−A2のエピトープを特定する単一のモノクロ
ーナル抗体に影響する位置107での置換が、Salter,ら、
J.Exp.Med.（1987）166:283−288に報告されている。
目しているが、その他の領域も機能的特異性をもたらし
うる（Ezquerra,ら、J.Immunol.（1985）134:2727−273
3）。変異性のクラスターが第一細胞外ドメインのカル
ボキシ末端及び第二細胞外ドメインのアミノ末端におい
て報告されている（Ways,ら、J.Biol.Chem.（1985）26:
11924−11933）。全てのクラスＩ分子の残基105〜108の
間の配列はフィブロネクチン結合テトラペプチドのそれ
にかかわり（AuffrayとNovotry,J.Human Immunology（1
986）15:381−390）、いづれの配向においてもこのテト
ラペプチドは細胞付加特性を有することが見い出されて
いる（PierschbacherとRuoslahti,Nature（1984）309:3
0−33;YamadaとKennedy,J.Cell.Biol.（1985）28:99−1
04）。HLA−A2のエピトープを特定する単一のモノクロ
ーナル抗体に影響する位置107での置換が、Salter,ら、
J.Exp.Med.（1987）166:283−288に報告されている。
発明の概要 クラスＩ抗原α１−及びα２−ドメインの配列を基礎
とする方法及び組成物を提供する。これらのフラグメン
トは、クラスＩ抗原の位置55と120と間のアミノ酸の少
なくとも一部を含み、そして標的細胞に対する細胞障害
性Ｔ−リンパ球（「CTL」）活性を調節するために用い
られる。様々なペプチドがCTL又はCTLのサブセットにか
かわる様々な効果を誘発する。
とする方法及び組成物を提供する。これらのフラグメン
トは、クラスＩ抗原の位置55と120と間のアミノ酸の少
なくとも一部を含み、そして標的細胞に対する細胞障害
性Ｔ−リンパ球（「CTL」）活性を調節するために用い
られる。様々なペプチドがCTL又はCTLのサブセットにか
かわる様々な効果を誘発する。
図面の簡単な説明 図１はHLA−A2特異的CTLによる細胞溶解の阻止に必要
なペプチド配列の最小サイズを示す。
なペプチド配列の最小サイズを示す。
図２はHLA−A2特異的CTLによる細胞溶解の阻止に及ぼ
すCTL及び標的細胞の予備処理の効果を示す。
すCTL及び標的細胞の予備処理の効果を示す。
図３はCTLによる標的細胞の細胞溶解中での、セリン
エステラーゼを含む顆粒の放出に及ぼすペプチドA2.98
−113の効果を示す。
エステラーゼを含む顆粒の放出に及ぼすペプチドA2.98
−113の効果を示す。
図４は、クラスIHLA分子のα1,α２及びα３領域を構
成するペプチドの共通配列、並びに様々な特異的HLA分
子におけるこれらの配列における変化を示す。
成するペプチドの共通配列、並びに様々な特異的HLA分
子におけるこれらの配列における変化を示す。
図５は、様々な特異性のCTLによる標的細胞の細胞溶
解に及ぼす様々なHLA−A2エピトープ由来のペプチドの
効果を示す。
解に及ぼす様々なHLA−A2エピトープ由来のペプチドの
効果を示す。
図６はペプチドA2.56−69により生ずるクローンA2/B1
7細胞による細胞溶解に対するHLA−Aw69標的細胞の感作
を示す。
7細胞による細胞溶解に対するHLA−Aw69標的細胞の感作
を示す。
図７はペプチドA2.56−69との標的細胞又はクローンA
2/B17細胞のインキュベーションの感作に及ぼす効果を
示す。
2/B17細胞のインキュベーションの感作に及ぼす効果を
示す。
特定の態様の詳細 本発明に従い、患者におけるCTL活性は、宿主のクラ
スＩ主要組織適合性複合抗原の多形領域の配列を患者に
投与することにより調節される。この多形領域は、α−
１及びα２ドメインを含んで成り、ここでα１−ドメイ
ンが特に、より詳しくはα１−ヘリカルペプチドの残基
が特に注目される。ヒトにおけるクラスＩ抗原はA,B,C,
E,F及びＧと呼ばれており、そのうちでA,B,E及びＧ抗原
が特に注目される。
スＩ主要組織適合性複合抗原の多形領域の配列を患者に
投与することにより調節される。この多形領域は、α−
１及びα２ドメインを含んで成り、ここでα１−ドメイ
ンが特に、より詳しくはα１−ヘリカルペプチドの残基
が特に注目される。ヒトにおけるクラスＩ抗原はA,B,C,
E,F及びＧと呼ばれており、そのうちでA,B,E及びＧ抗原
が特に注目される。
CTLの活性を調節する他に、本ペプチドは、Ｔ−細胞
の組成物又はその一部等からCTLの特定のサブセットを
取出す特定のペプチドに結合するCTLを同定するために
も利用できうる。たいてい、課題の組成物は、CTL活性
を調節する次の長い配列： ここで aa55はＥ又はＫ、特にE; aa62はG,Q,E又はＲ、時にＲ又はG; aa63は酸性アミノ酸又はそのアミド、特にE; aa65はQ,R又はＧ、特にＱ又はR; aa66はI,N又はＫ、特にＩ又はK; aa67は脂肪族中性又はＹアミノ酸、特にC,S,V又はY; aa69は脂肪族中性又は塩基性アミノ酸、特にA,R又はT; aa70はQ,H,S,N又はK; aa71は脂肪族中性アミノ酸、特にA,L,S又はT; aa74はD,Y又はH; aa76はE,V又はM; aa77はD,S,A,G又はN; aa79はR,Q又はG; aa80はT,I又はN; aa81は脂肪族非極性アミノ酸、特にＡ又はL; aa82はＲ又はL; aa83はＧ又はR; aa94はＴ又はI; aa95は５〜６個の炭素原子の非極性脂肪族アミノ酸； aa97は脂肪族アミノ酸又はW; aa99は芳香族アミノ酸； aa103５〜６個の炭素原子の非極性脂肪族アミノ酸； aa105はＰ又はS; aa107はＧ又はW; aa109はＬ又はF; aa113はＹ又はH; aa114はH,Q,D,N又はR; aa116はY,D,S,F又はＨである） 内に属する配列を有する少なくとも８個のアミノ酸、通
常は少なくとも12個のアミノ酸のペプチド、そして最大
でこの長い配列全体のペプチドの純粋組成物又は製剤化
組成物を含んで成るであろう。
の組成物又はその一部等からCTLの特定のサブセットを
取出す特定のペプチドに結合するCTLを同定するために
も利用できうる。たいてい、課題の組成物は、CTL活性
を調節する次の長い配列： ここで aa55はＥ又はＫ、特にE; aa62はG,Q,E又はＲ、時にＲ又はG; aa63は酸性アミノ酸又はそのアミド、特にE; aa65はQ,R又はＧ、特にＱ又はR; aa66はI,N又はＫ、特にＩ又はK; aa67は脂肪族中性又はＹアミノ酸、特にC,S,V又はY; aa69は脂肪族中性又は塩基性アミノ酸、特にA,R又はT; aa70はQ,H,S,N又はK; aa71は脂肪族中性アミノ酸、特にA,L,S又はT; aa74はD,Y又はH; aa76はE,V又はM; aa77はD,S,A,G又はN; aa79はR,Q又はG; aa80はT,I又はN; aa81は脂肪族非極性アミノ酸、特にＡ又はL; aa82はＲ又はL; aa83はＧ又はR; aa94はＴ又はI; aa95は５〜６個の炭素原子の非極性脂肪族アミノ酸； aa97は脂肪族アミノ酸又はW; aa99は芳香族アミノ酸； aa103５〜６個の炭素原子の非極性脂肪族アミノ酸； aa105はＰ又はS; aa107はＧ又はW; aa109はＬ又はF; aa113はＹ又はH; aa114はH,Q,D,N又はR; aa116はY,D,S,F又はＨである） 内に属する配列を有する少なくとも８個のアミノ酸、通
常は少なくとも12個のアミノ酸のペプチド、そして最大
でこの長い配列全体のペプチドの純粋組成物又は製剤化
組成物を含んで成るであろう。
特に注目されるペプチドのサブセットは以下の長い配
列内に属する： ここで： aa94はＴ又はI; aa95は５〜６個の炭素原子の非極性脂肪族アミノ酸； aa97は脂肪族アミノ酸又はW; aa99は芳香族アミノ酸； aa103は５〜６個の炭素原子の非極性脂肪族アミノ酸； aa105はＰ又はS; aa107はＧ又はW; aa109はＬ又はF; aa113はＹ又はH; aa114はH,Q,D,N又はR; aa116はY,D,S,F又はＨである。
列内に属する： ここで： aa94はＴ又はI; aa95は５〜６個の炭素原子の非極性脂肪族アミノ酸； aa97は脂肪族アミノ酸又はW; aa99は芳香族アミノ酸； aa103は５〜６個の炭素原子の非極性脂肪族アミノ酸； aa105はＰ又はS; aa107はＧ又はW; aa109はＬ又はF; aa113はＹ又はH; aa114はH,Q,D,N又はR; aa116はY,D,S,F又はＨである。
特に注目される上記の長い配列内に属する配列の別の
サブセットは、次の長い配列に属する配列である： ここで： aa55はＥ又はＫ、特にE; aa62はG,Q,E又はＲ、時にＲ又はG; aa63は酸性アミノ酸又はそのアミド、例えばＥ又はＮ、
特にE; aa65はQ,R又はＧ、特にＱ又はR; aa66はI,N又はＫ、特にＩ又はK; aa67は脂肪族中性アミノ酸、例えばV,M,S,C又はＹ、特
にV; aa69は脂肪族中性アミノ酸、例えばA,T又はＰ、特にA; aa70はQ,H,S,N又はＫ、特にＱ又はH; aa71は脂肪族中性アミノ酸、例えばS,A又はＴ、特にS; aa74はD,Y又はＨ、特にＤ又はH; aa76はＥ又はV; aa77はD,S又はＮ、特にD; aa79はＲ又はＧ、特にG; aa80はT,I又はＮ特にＴ又はI; aa81は脂肪族非極性アミノ酸、例えばＬ又はＡ、特にL; aa82はＲ又はＬ、特にR; aa83はＧ又はＲ、特にＧ、である。
サブセットは、次の長い配列に属する配列である： ここで： aa55はＥ又はＫ、特にE; aa62はG,Q,E又はＲ、時にＲ又はG; aa63は酸性アミノ酸又はそのアミド、例えばＥ又はＮ、
特にE; aa65はQ,R又はＧ、特にＱ又はR; aa66はI,N又はＫ、特にＩ又はK; aa67は脂肪族中性アミノ酸、例えばV,M,S,C又はＹ、特
にV; aa69は脂肪族中性アミノ酸、例えばA,T又はＰ、特にA; aa70はQ,H,S,N又はＫ、特にＱ又はH; aa71は脂肪族中性アミノ酸、例えばS,A又はＴ、特にS; aa74はD,Y又はＨ、特にＤ又はH; aa76はＥ又はV; aa77はD,S又はＮ、特にD; aa79はＲ又はＧ、特にG; aa80はT,I又はＮ特にＴ又はI; aa81は脂肪族非極性アミノ酸、例えばＬ又はＡ、特にL; aa82はＲ又はＬ、特にR; aa83はＧ又はＲ、特にＧ、である。
特に注目される少なくとも８個のアミノ酸のペプチド
の別のシリーズは次の長い配列内に属する： QEGPEYWD（Ｇ又はＲ）（Ｅ又はＮ）Ｔ（Ｒ又はＱ）
（Ｋ又はＮ）VKA（Ｈ又はＱ）SQT（Ｈ又はＤ）Ｒ（V,M
又はＥ）（D,S又はＮ）Ｌ（Ｇ又はＲ）（Ｔ又はＩ）
（Ｌ又はＡ）（Ｒ又はＬ）（Ｇ又はＲ）YYNQSEA。
の別のシリーズは次の長い配列内に属する： QEGPEYWD（Ｇ又はＲ）（Ｅ又はＮ）Ｔ（Ｒ又はＱ）
（Ｋ又はＮ）VKA（Ｈ又はＱ）SQT（Ｈ又はＤ）Ｒ（V,M
又はＥ）（D,S又はＮ）Ｌ（Ｇ又はＲ）（Ｔ又はＩ）
（Ｌ又はＡ）（Ｒ又はＬ）（Ｇ又はＲ）YYNQSEA。
特に注目されるのは、下記の配列のいづれかを活性配
列として有する約10〜25個のアミノ酸のオリゴペプチド
である： Ｒ（E,V又はＭ）（Ｎ又はＳ）Ｌ（Ｒ又はＱ）（I,N又
はＴ）（Ａ又はＬ）（Ｌ又はＲ）（Ｒ又はＧ）Ｙ ８個のアミノ酸フラグメントが由来することで注目さ
れる他の長い配列には： が含まれる。
列として有する約10〜25個のアミノ酸のオリゴペプチド
である： Ｒ（E,V又はＭ）（Ｎ又はＳ）Ｌ（Ｒ又はＱ）（I,N又
はＴ）（Ａ又はＬ）（Ｌ又はＲ）（Ｒ又はＧ）Ｙ ８個のアミノ酸フラグメントが由来することで注目さ
れる他の長い配列には： が含まれる。
特に注目されるのは次の短い配列である： とりわけ注目される配列は、α１−ドメインの中の配
列であり、即ち、位置55−85、より特に55−80又は70−
85のアミノ酸配列であり、望ましくはその配列の中にテ
トラペプチド、DGET,GETR,DRAT,YWDG,RE（Ｎもしくは
Ｄ）Ｌ又は（ＡもしくはＹ）LAYを含む。α２−ドメイ
ンについての特に注目されるのは、位置90−112、より
特に94−116のアミノ酸配列であり、望ましくはその配
列の中にテトラペプチドSTWR又はSDGRを含んでいる。
列であり、即ち、位置55−85、より特に55−80又は70−
85のアミノ酸配列であり、望ましくはその配列の中にテ
トラペプチド、DGET,GETR,DRAT,YWDG,RE（Ｎもしくは
Ｄ）Ｌ又は（ＡもしくはＹ）LAYを含む。α２−ドメイ
ンについての特に注目されるのは、位置90−112、より
特に94−116のアミノ酸配列であり、望ましくはその配
列の中にテトラペプチドSTWR又はSDGRを含んでいる。
レセプター結合性ペプチドとして働くである注目のペ
プチドは少なくとも８個のアミノ酸、通常は少なくとも
10個のアミノ酸、より通常には少なくとも12個のアミノ
酸、しばしば15個以上のアミノ酸、そして通常は約30個
より少ないアミノ酸、より通常には約25個より少ないア
ミノ酸、所望するには約12〜25個のアミノ酸を有するで
あろう。そのアミノ酸配列は通常は天然配列とは、２個
より多く、より通常には約１個より多くのアミノ酸、又
は突然変異、例えば欠失もしくは挿入で相異しないであ
ろう。採用する配列は通常、MHC制御Ｔ−細胞の宿主のM
HC抗原、特にHLA−A,−B,−Ｅ又は−Ｇグループ抗原の
α１ドメインのＣ末端部分の多形領域に由来するか、又
はα２ドメインのＮ末端部分に由来するであろう。
プチドは少なくとも８個のアミノ酸、通常は少なくとも
10個のアミノ酸、より通常には少なくとも12個のアミノ
酸、しばしば15個以上のアミノ酸、そして通常は約30個
より少ないアミノ酸、より通常には約25個より少ないア
ミノ酸、所望するには約12〜25個のアミノ酸を有するで
あろう。そのアミノ酸配列は通常は天然配列とは、２個
より多く、より通常には約１個より多くのアミノ酸、又
は突然変異、例えば欠失もしくは挿入で相異しないであ
ろう。採用する配列は通常、MHC制御Ｔ−細胞の宿主のM
HC抗原、特にHLA−A,−B,−Ｅ又は−Ｇグループ抗原の
α１ドメインのＣ末端部分の多形領域に由来するか、又
はα２ドメインのＮ末端部分に由来するであろう。
特に注目されるのは次の配列又はそのうちの少なくと
も８個のアミノ酸の配列フラグメントである： 同じ位置において２個以上のアミノ酸を表示している
とき、表示のアミノ酸のいづれかが存在していてよい。
も８個のアミノ酸の配列フラグメントである： 同じ位置において２個以上のアミノ酸を表示している
とき、表示のアミノ酸のいづれかが存在していてよい。
特に注目される領域は、アミノ酸位置110〜116の領域
であろう。
であろう。
課題のペプチドは様々なふうに改質されていてよい。
このペプチドは、このペプチドにわたる任意の好都合な
部位において、様々な目的のためにその他の様々な化合
物に共有結合によって連結していてよい。従って、この
ペプチドは抗体生産の免疫のための宿主への投与のため
に免疫原に連結されていてよく、又は合成により、合成
遺伝子の発現等により、特定のMHC抗原の非隣接MHC配列
に連結されていてよく；資質もしくはポリアルキレンオ
キシ基に連結；糖に連結；又は核酸に連結されていてよ
い。特に注目されるのは、合成又は合成遺伝子の発現に
よる課題のペプチドの別のペプチドへの連結であって、
この別のペプチドが、この課題のペプチドが宿主に投与
されたときにそれに長期安定性を供することである。様
々なペプチド、例えばイムノグロブリン定常領域、例え
ばIgGFcが利用されうる。他方、課題のペプチドは毒
素、例えばジフテリア毒素、リシン、アブリン等に、特
に結合性鎖が排除又は不活性化されて、結合性鎖の細胞
への結合が妨げられている場合に、連結されていてよ
い。
このペプチドは、このペプチドにわたる任意の好都合な
部位において、様々な目的のためにその他の様々な化合
物に共有結合によって連結していてよい。従って、この
ペプチドは抗体生産の免疫のための宿主への投与のため
に免疫原に連結されていてよく、又は合成により、合成
遺伝子の発現等により、特定のMHC抗原の非隣接MHC配列
に連結されていてよく；資質もしくはポリアルキレンオ
キシ基に連結；糖に連結；又は核酸に連結されていてよ
い。特に注目されるのは、合成又は合成遺伝子の発現に
よる課題のペプチドの別のペプチドへの連結であって、
この別のペプチドが、この課題のペプチドが宿主に投与
されたときにそれに長期安定性を供することである。様
々なペプチド、例えばイムノグロブリン定常領域、例え
ばIgGFcが利用されうる。他方、課題のペプチドは毒
素、例えばジフテリア毒素、リシン、アブリン等に、特
に結合性鎖が排除又は不活性化されて、結合性鎖の細胞
への結合が妨げられている場合に、連結されていてよ
い。
課題のペプチドは多重活性を有する一本鎖ポリペプチ
ドを供するように互いに連結されているか、又は同一の
一般活性を供するよう混合物の中に組合されてよい。
ドを供するように互いに連結されているか、又は同一の
一般活性を供するよう混合物の中に組合されてよい。
アミノ酸のクラスは以下のように表わされる： 脂肪族 非極性G,A,P,L,I,V 極性 中性C,S,T,M,N,Q 酸性D,E 塩基性K,R 芳香族F,H,W,Y これらのペプチドは様々なふうに製造されうる。好都
合には、それらは自動合成装置、例えばBeckman,Applie
d Biosystem Inc.,もしくはその他の有用なペプチド合
成装置を用いる常用の技法により合成でき、又は手動式
に合成されうる。他方、特定のペプチドをエンコードす
るDNA配列を作り、そして所望のペプチドを供するよう
にクローンし、そして発現させることができる。この場
合、メチオニンが第一アミノ酸でありうる。
合には、それらは自動合成装置、例えばBeckman,Applie
d Biosystem Inc.,もしくはその他の有用なペプチド合
成装置を用いる常用の技法により合成でき、又は手動式
に合成されうる。他方、特定のペプチドをエンコードす
るDNA配列を作り、そして所望のペプチドを供するよう
にクローンし、そして発現させることができる。この場
合、メチオニンが第一アミノ酸でありうる。
これらのペプチドは天然起源から単離し、そして公知
の技術、例えばイオン交換材料でのクロマトグラフィ
ー、サイズ分別、イムノアフィニティークロマトグラフ
ィー及び電気泳動によって精製もできうる。本明細書で
利用している語「実質的に純粋なペプチド化合物の調製
品」は、そのポリペプチドが天然的に結合している物質
を通常約70％より大、そして好ましくは約80％より大で
含まないペプチドの調製品を意味する；ところで、これ
らの物質は、薬理組成物の調製においてそのペプチドと
混合する物質は除かれる。これらの配列はその最終目的
に応じて様々なふうに改質されうる。このペプチドの固
相支持体又はその他の分子への連結を可能とする様々な
Ｎ−又はＣ−末端基を導入してよい。合成手順において
は、このペプチドを何の目的のために調製するかに応じ
て、その後の反応を可能とするであろう任意の分子をこ
のＮ−又はＣ−末端に導入してよい。
の技術、例えばイオン交換材料でのクロマトグラフィ
ー、サイズ分別、イムノアフィニティークロマトグラフ
ィー及び電気泳動によって精製もできうる。本明細書で
利用している語「実質的に純粋なペプチド化合物の調製
品」は、そのポリペプチドが天然的に結合している物質
を通常約70％より大、そして好ましくは約80％より大で
含まないペプチドの調製品を意味する；ところで、これ
らの物質は、薬理組成物の調製においてそのペプチドと
混合する物質は除かれる。これらの配列はその最終目的
に応じて様々なふうに改質されうる。このペプチドの固
相支持体又はその他の分子への連結を可能とする様々な
Ｎ−又はＣ−末端基を導入してよい。合成手順において
は、このペプチドを何の目的のために調製するかに応じ
て、その後の反応を可能とするであろう任意の分子をこ
のＮ−又はＣ−末端に導入してよい。
診断目的のために、広範囲にわたる様々なラベルをこ
の末端に連結してよく、これらは直接又は間接的な検出
可能シグナルを供しうる。例えば、その末端に蛍光物質
又はその他の分子であって蛍光物質、酵素、粒子等の如
きのラベルへの連結を供するものをこの末端に導入して
よい。例えば、ビオチンとの連結を末端に導入してよ
く、これは酵素又は蛍光物質を抱合するアビジンに結合
するであろう。他方、粒子、固相支持体、巨大分子等へ
の連結のために様々な反応性部位をその末端に導入して
よい。例えば、中間側鎖基が保護された、固相支持体に
結合している成長中の鎖の内部アミノ成分をメチルジチ
オ安息香酸（MDTB）に抱合させてよい。その後、その自
由なメルカプタン基が活性化オレフィンとの抱合のため
に用いられうる。従って、タンパク質、例えば血清アル
ブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、牛β−グ
ロブリン等を、イムノアッセイ、アファニティークロマ
トグラフィー等における利用のためのこのペプチドに対
する抗体を産生せしめる免疫原を供するよう、このペプ
チドに抱合してよい。他方、このペプチドは、タンパク
質のＮ−末端、Ｃ−末端又は内部に課題の結合性ペプチ
ドを含む融合タンパク質を供するために、DNA配列を作
ることにより、別のポリペプチドに結合していることが
できる。この場合、融合タンパク質は酵素活性を有して
いることがあり、この酵素活性は課題のペプチドに結合
する巨大分子、例えば抗体により調節されうる。従っ
て、本発明のペプチドは生物活性を保持しながら、様々
な最終目的のために広範囲にわたる様々な方法で改質さ
れうる。
の末端に連結してよく、これらは直接又は間接的な検出
可能シグナルを供しうる。例えば、その末端に蛍光物質
又はその他の分子であって蛍光物質、酵素、粒子等の如
きのラベルへの連結を供するものをこの末端に導入して
よい。例えば、ビオチンとの連結を末端に導入してよ
く、これは酵素又は蛍光物質を抱合するアビジンに結合
するであろう。他方、粒子、固相支持体、巨大分子等へ
の連結のために様々な反応性部位をその末端に導入して
よい。例えば、中間側鎖基が保護された、固相支持体に
結合している成長中の鎖の内部アミノ成分をメチルジチ
オ安息香酸（MDTB）に抱合させてよい。その後、その自
由なメルカプタン基が活性化オレフィンとの抱合のため
に用いられうる。従って、タンパク質、例えば血清アル
ブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、牛β−グ
ロブリン等を、イムノアッセイ、アファニティークロマ
トグラフィー等における利用のためのこのペプチドに対
する抗体を産生せしめる免疫原を供するよう、このペプ
チドに抱合してよい。他方、このペプチドは、タンパク
質のＮ−末端、Ｃ−末端又は内部に課題の結合性ペプチ
ドを含む融合タンパク質を供するために、DNA配列を作
ることにより、別のポリペプチドに結合していることが
できる。この場合、融合タンパク質は酵素活性を有して
いることがあり、この酵素活性は課題のペプチドに結合
する巨大分子、例えば抗体により調節されうる。従っ
て、本発明のペプチドは生物活性を保持しながら、様々
な最終目的のために広範囲にわたる様々な方法で改質さ
れうる。
課題のペプチドはCTLを活性化するために抗原性ペプ
チド又はタンパク質と組合せて利用もできる。従って、
課題のペプチドはこのタンパク質に直接的又は間接的に
結合されていてよく、これによりCTLが結合することが
でき、且つ活性化されうるCTLに対する２つのエピトー
プを示すことができるようになる。特に注目されるの
は、課題のペプチドを、その他の決定部位を供するペプ
チド又はタンパク質と一緒にリポソーム又は二層脂肪膜
に結合させることができることである。
チド又はタンパク質と組合せて利用もできる。従って、
課題のペプチドはこのタンパク質に直接的又は間接的に
結合されていてよく、これによりCTLが結合することが
でき、且つ活性化されうるCTLに対する２つのエピトー
プを示すことができるようになる。特に注目されるの
は、課題のペプチドを、その他の決定部位を供するペプ
チド又はタンパク質と一緒にリポソーム又は二層脂肪膜
に結合させることができることである。
ペプチド又はタンパク質を脂質、特にリン脂質に結合
させて、リポソーム表層上にこのペプチド又はタンパク
質の存在を供する様々な技術が有用である。ホスファチ
ジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、又はそ
の他の脂質が、二価連結剤、例えばMBSE、グリタルアル
デヒド、メチルジチオ安息香酸等と共に利用できうる。
抱合タンパク質とのリポソームの形成は論文の中に十分
な裏付けが見い出せる。例えば、米国特許第3,887,698;
4,261,975及び4,193,983号を参照のこと。改質ペプチド
又はタンパク質を脂質と、水性媒体の中で合わせ、そし
て音波処理して所望のリポソームを供している。これら
のリポソームを次に回収し、そして記載の通りに利用し
ている。
させて、リポソーム表層上にこのペプチド又はタンパク
質の存在を供する様々な技術が有用である。ホスファチ
ジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、又はそ
の他の脂質が、二価連結剤、例えばMBSE、グリタルアル
デヒド、メチルジチオ安息香酸等と共に利用できうる。
抱合タンパク質とのリポソームの形成は論文の中に十分
な裏付けが見い出せる。例えば、米国特許第3,887,698;
4,261,975及び4,193,983号を参照のこと。改質ペプチド
又はタンパク質を脂質と、水性媒体の中で合わせ、そし
て音波処理して所望のリポソームを供している。これら
のリポソームを次に回収し、そして記載の通りに利用し
ている。
単独の、又は他のペプチド又はタンパク質との組合せ
における課題のペプチドは、課題のペプチドに、又は課
題のペプチドとその他のペプチド又はタンパク質との組
合せに結合するCTLの存在を診断するために用いること
ができる。この状況では、課題のペプチドと、抗原性ペ
プチド又はタンパク質との抱合体、前述の通りに連結剤
を利用することにより製造できうる。他方、課題のペプ
チド及び抗原性ペプチドは固相面、例えば粒子、容器面
等に結合させてよい。所望するなら、課題のペプチド及
び抗原性ペプチド又はタンパク質は蛍光物質である粒子
又はタンパク質に抱合させてよい。この粒子又はタンパ
ク質の結合は蛍光活性セルソーターでの選別及び計測を
可能にする。
における課題のペプチドは、課題のペプチドに、又は課
題のペプチドとその他のペプチド又はタンパク質との組
合せに結合するCTLの存在を診断するために用いること
ができる。この状況では、課題のペプチドと、抗原性ペ
プチド又はタンパク質との抱合体、前述の通りに連結剤
を利用することにより製造できうる。他方、課題のペプ
チド及び抗原性ペプチドは固相面、例えば粒子、容器面
等に結合させてよい。所望するなら、課題のペプチド及
び抗原性ペプチド又はタンパク質は蛍光物質である粒子
又はタンパク質に抱合させてよい。この粒子又はタンパ
ク質の結合は蛍光活性セルソーターでの選別及び計測を
可能にする。
課題のペプチドは哺乳動物宿主におけるCTL活性を調
節するためにも利用できうる。この調節はCTL活性の阻
害、特にCTL分化（Differentiation）の阻害、又は標的
細胞の感作によるものでありうる。これはアフェーレシ
スを採用することにより達成でき、この場合、患者の血
液をその患者から抜き取り、そしてこの課題のペプチド
によりCTL活性を排除するために、このペプチドが表層
に結合して存在している装置に、又はCTLを捕捉し、そ
してその活性を阻害するために生理学的に許容される媒
体の中にそのペプチドが存在している装置を通じて循環
させる。他方、この課題のペプチドは動脈又は静脈のい
づれかで血管内的に宿主に投与して、CTLの阻害または
刺激を供することができうる。
節するためにも利用できうる。この調節はCTL活性の阻
害、特にCTL分化（Differentiation）の阻害、又は標的
細胞の感作によるものでありうる。これはアフェーレシ
スを採用することにより達成でき、この場合、患者の血
液をその患者から抜き取り、そしてこの課題のペプチド
によりCTL活性を排除するために、このペプチドが表層
に結合して存在している装置に、又はCTLを捕捉し、そ
してその活性を阻害するために生理学的に許容される媒
体の中にそのペプチドが存在している装置を通じて循環
させる。他方、この課題のペプチドは動脈又は静脈のい
づれかで血管内的に宿主に投与して、CTLの阻害または
刺激を供することができうる。
阻害性ペプチドの例は以降（実施例２及び９）に示
し、それらはHLA−A2のα１及びα２ドメインの両者に
由来する。各ケースにおいて、この阻害性ペプチドの配
列はCTLのエピトープ特異性に関与する。更に、実施例
４に示す通り、阻害はオクタペプチドにより媒介され、
そして、ペプチドが標的細胞ではなくCTLに結合するこ
とによって生ずる（実施例５を参照のこと）。個々のペ
プチドの阻害能力はCTLの特異性に関係するため、これ
らのペプチドは様々なＴ細胞レセプターへの結合により
阻害するようである。異質反応性CTLによるHLA−クラス
Ｉを抱える標的細胞の細胞溶解を刺激するペプチドの例
は以降の実施例10の中に示す。実施例10−12における結
果の最も簡単な解釈は、HLA−A2/B17特異性CTLが、制限
因子としてのHLA−Aw69の関与のうえでA2 56−69ペプチ
ドを認識することにある。このことは、このペプチドは
HLA−Aw69分子に結合することを意味する。このデータ
ー及び解釈はインフルエンザ（Bastinら、J.Exp.Med.,1
65:1508（1987）;Gotchら、Nature326:881（1987））及
び異種組織移植系（Maryanskiら、Nature324:578（198
6））に類似しており、そして異質反応性CTLがクラスＩ
制限状況（ファッション）におけるペプチドに由来する
クラスＩを認識できることを示す。しかしながら、感作
を及ぼすのに必要なペプチドの量は他の研究において報
告されているものより有意に高い。これに関する分子ベ
ースは未だ未知であるが、ある可能な説明は、外因、
対、内因分子の相対的な取扱い性を包括する。例えば、
HLAは内因性分子であり、そして外因性HLAペプチドは内
因性HLAペプチドと競合しうる。他の考えは、A2.56−69
ペプチドが、標的細胞に対する高い親和結合性にとって
必要な残基の全てを含まないことがあることにある。
し、それらはHLA−A2のα１及びα２ドメインの両者に
由来する。各ケースにおいて、この阻害性ペプチドの配
列はCTLのエピトープ特異性に関与する。更に、実施例
４に示す通り、阻害はオクタペプチドにより媒介され、
そして、ペプチドが標的細胞ではなくCTLに結合するこ
とによって生ずる（実施例５を参照のこと）。個々のペ
プチドの阻害能力はCTLの特異性に関係するため、これ
らのペプチドは様々なＴ細胞レセプターへの結合により
阻害するようである。異質反応性CTLによるHLA−クラス
Ｉを抱える標的細胞の細胞溶解を刺激するペプチドの例
は以降の実施例10の中に示す。実施例10−12における結
果の最も簡単な解釈は、HLA−A2/B17特異性CTLが、制限
因子としてのHLA−Aw69の関与のうえでA2 56−69ペプチ
ドを認識することにある。このことは、このペプチドは
HLA−Aw69分子に結合することを意味する。このデータ
ー及び解釈はインフルエンザ（Bastinら、J.Exp.Med.,1
65:1508（1987）;Gotchら、Nature326:881（1987））及
び異種組織移植系（Maryanskiら、Nature324:578（198
6））に類似しており、そして異質反応性CTLがクラスＩ
制限状況（ファッション）におけるペプチドに由来する
クラスＩを認識できることを示す。しかしながら、感作
を及ぼすのに必要なペプチドの量は他の研究において報
告されているものより有意に高い。これに関する分子ベ
ースは未だ未知であるが、ある可能な説明は、外因、
対、内因分子の相対的な取扱い性を包括する。例えば、
HLAは内因性分子であり、そして外因性HLAペプチドは内
因性HLAペプチドと競合しうる。他の考えは、A2.56−69
ペプチドが、標的細胞に対する高い親和結合性にとって
必要な残基の全てを含まないことがあることにある。
以降の実施例に記載のペプチドが由来しているCTLの
２つのエピトープはHLA−A2分子のうちの非常に異なる
部分に位置している。残基62−65はペプチド結合部位
（Bjorkmanら、Nature329:506（1987））の一部を構成
するアルファーヘリックスであり、これ自体のアルファ
ーヘリックスペプチドに結合できると考えられている。
実施例の中で示す通り、この領域中のペプチドは細胞溶
解性を阻害又は誘発できうる。細胞溶解の誘発において
は、このペプチドは標的細胞HLAクラスＩ抗原に結合で
き、これによりCTLによって認識される構造を作り上げ
ることができる。例えば、HLA−Aw69細胞に基づくクロ
ーンA2/B17細胞に感受性を授けるA2.56−69ペプチドの
場合、その結合したペプチドはおそらくは、α1ドメイ
ンのαヘリックスを置換するものであり、その理由はHL
A−Aw69及びHLA−A2は同一のα2ドメインを有するから
である。
２つのエピトープはHLA−A2分子のうちの非常に異なる
部分に位置している。残基62−65はペプチド結合部位
（Bjorkmanら、Nature329:506（1987））の一部を構成
するアルファーヘリックスであり、これ自体のアルファ
ーヘリックスペプチドに結合できると考えられている。
実施例の中で示す通り、この領域中のペプチドは細胞溶
解性を阻害又は誘発できうる。細胞溶解の誘発において
は、このペプチドは標的細胞HLAクラスＩ抗原に結合で
き、これによりCTLによって認識される構造を作り上げ
ることができる。例えば、HLA−Aw69細胞に基づくクロ
ーンA2/B17細胞に感受性を授けるA2.56−69ペプチドの
場合、その結合したペプチドはおそらくは、α1ドメイ
ンのαヘリックスを置換するものであり、その理由はHL
A−Aw69及びHLA−A2は同一のα2ドメインを有するから
である。
反対に、残基107はアルファーヘリックス及びペプチ
ド結合性領域から若干離れたβ構造の２本の鎖の間のタ
ーンの一部である（Bjorkmanら、前掲）。A2.98−113ペ
プチドは溶液中でこの構造の要素を維持することがで
き、そしてクラスＩ分子のペプチド結合性部位に対して
弱い親和性を有する。この解釈は、この領域に相当する
ペプチドがHLA−A2特異性細胞溶解のインヒビターであ
るが、細胞溶解はできないという実施例の中の所見を説
明しうる。
ド結合性領域から若干離れたβ構造の２本の鎖の間のタ
ーンの一部である（Bjorkmanら、前掲）。A2.98−113ペ
プチドは溶液中でこの構造の要素を維持することがで
き、そしてクラスＩ分子のペプチド結合性部位に対して
弱い親和性を有する。この解釈は、この領域に相当する
ペプチドがHLA−A2特異性細胞溶解のインヒビターであ
るが、細胞溶解はできないという実施例の中の所見を説
明しうる。
このペプチドの様々な活性は適当なアッセイにより決
定されうる。ペプチドによるCTLの阻害は、標的HLAを保
有する標的細胞系の中の特定のHLAに対して特異的なCTL
系を採用することにより決定されうる。この標的細胞は
例えば51Crによりラベルされている。これらの細胞は適
当な培地の中で組合され、そして細胞溶解の度合いの指
標としてこのラベルの遊離が決定される。このペプチド
は細胞を一緒にするときに同時に加えてよく、CTLとイ
ンキュベートしてよく、又はペプチドの作用態様を調べ
るために標的細胞とインキュベートしてよい。
定されうる。ペプチドによるCTLの阻害は、標的HLAを保
有する標的細胞系の中の特定のHLAに対して特異的なCTL
系を採用することにより決定されうる。この標的細胞は
例えば51Crによりラベルされている。これらの細胞は適
当な培地の中で組合され、そして細胞溶解の度合いの指
標としてこのラベルの遊離が決定される。このペプチド
は細胞を一緒にするときに同時に加えてよく、CTLとイ
ンキュベートしてよく、又はペプチドの作用態様を調べ
るために標的細胞とインキュベートしてよい。
外因性マーカーを利用する代りに、CTL及び標的細胞
をこのペプチドと共に組合せることに基づくセリンエス
テラーゼ活性の遊離を決定してよい。セリンエステラー
ゼ活性の存在は顆粒の放出に関係しうる。
をこのペプチドと共に組合せることに基づくセリンエス
テラーゼ活性の遊離を決定してよい。セリンエステラー
ゼ活性の存在は顆粒の放出に関係しうる。
記載した通り、このペプチドは単独で、又は様々な課
題の決定部位を供するよう抗原と組合せて存在していて
よい。課題のペプチドのみを含ませるか、又はこのペプ
チドをその他のペプチドと組合せるかに応じて、活性化
又は阻害が達せられうる。不可逆的な阻害が所望される
なら、課題のペプチドと抗原との抱合体を、細胞障害剤
に、細胞障害剤含有リポソームに、又は特異的モノクロ
ーナル抗体もしくはイムノグロブリンに連結してよく、
これによりこの抱合体のCTLへの結合はCTLの補体媒介溶
解をもたらすであろう。
題の決定部位を供するよう抗原と組合せて存在していて
よい。課題のペプチドのみを含ませるか、又はこのペプ
チドをその他のペプチドと組合せるかに応じて、活性化
又は阻害が達せられうる。不可逆的な阻害が所望される
なら、課題のペプチドと抗原との抱合体を、細胞障害剤
に、細胞障害剤含有リポソームに、又は特異的モノクロ
ーナル抗体もしくはイムノグロブリンに連結してよく、
これによりこの抱合体のCTLへの結合はCTLの補体媒介溶
解をもたらすであろう。
加えて、特定のペプチドはCTLの分化を阻止するのに
も寄与し、この阻止は特異的又は非特異的でありうる。
課題のペプチドはCTL活性を調節するにも利用でき、こ
こで調節は、細胞溶解活性の阻害を含み、その阻害は可
逆的又は不可逆的でありうる。ある状況において、課題
のペプチドはMHC制御型CTLの特定のセット又はサブセッ
トの存在を決定するために利用できうる。
も寄与し、この阻止は特異的又は非特異的でありうる。
課題のペプチドはCTL活性を調節するにも利用でき、こ
こで調節は、細胞溶解活性の阻害を含み、その阻害は可
逆的又は不可逆的でありうる。ある状況において、課題
のペプチドはMHC制御型CTLの特定のセット又はサブセッ
トの存在を決定するために利用できうる。
この課題のペプチドは少なくとも一つの約27kDの細胞
性タンパク質にも結合することができる。このタンパク
質はCD8＋Ｔ細胞の中で発現され、そして表層膜タンパ
ク質と考えられる。このタンパク質は実質的に純粋な状
態で獲得できうるか、ゲル電気泳動及び本発明にかかわ
るペプチドのいづれかによる同定、課題のペプチドを用
いるアフィニティークロマトグラフィーカラムによる精
製、等により獲得できうる。50重量％以上の純度が既知
の方法に従って達せられうる。課題のペプチドをウェル
に結合させたとき、Ｔ細胞はこのウェルの壁に直ちに結
合する。このタンパク質又はその活性フラグメントは、
細胞過程に及ぼす課題のペプチドの作用を逆にする、活
性ペプチドのスクリーニングする、及びこのタンパク質
を発現する細胞を同定する抗体を作る、ために利用でき
うる。このタンパク質又はそのフラグメントはCTLの活
性、例えば阻害活性、他の細胞の溶解、又はその他の細
胞との相互作用を調節するのに利用でき、他の細胞の刺
激又は不活性化をもたらしうる。
性タンパク質にも結合することができる。このタンパク
質はCD8＋Ｔ細胞の中で発現され、そして表層膜タンパ
ク質と考えられる。このタンパク質は実質的に純粋な状
態で獲得できうるか、ゲル電気泳動及び本発明にかかわ
るペプチドのいづれかによる同定、課題のペプチドを用
いるアフィニティークロマトグラフィーカラムによる精
製、等により獲得できうる。50重量％以上の純度が既知
の方法に従って達せられうる。課題のペプチドをウェル
に結合させたとき、Ｔ細胞はこのウェルの壁に直ちに結
合する。このタンパク質又はその活性フラグメントは、
細胞過程に及ぼす課題のペプチドの作用を逆にする、活
性ペプチドのスクリーニングする、及びこのタンパク質
を発現する細胞を同定する抗体を作る、ために利用でき
うる。このタンパク質又はそのフラグメントはCTLの活
性、例えば阻害活性、他の細胞の溶解、又はその他の細
胞との相互作用を調節するのに利用でき、他の細胞の刺
激又は不活性化をもたらしうる。
このような様々な能力は、CTLを含んで成る細胞性組
成物を、所望の特性を発揮するのに十分な量のこのペプ
チドと組合せることによって達しうる。分離が所望され
るとき、アフィニティーカラム、抱合ビーズ、例えば磁
性ビーズ、又はその他の技術が利用でき、ここでそのペ
プチド−結合細胞は、結合していないか又は非特異的に
結合しているその他の細胞から分けられうる。
成物を、所望の特性を発揮するのに十分な量のこのペプ
チドと組合せることによって達しうる。分離が所望され
るとき、アフィニティーカラム、抱合ビーズ、例えば磁
性ビーズ、又はその他の技術が利用でき、ここでそのペ
プチド−結合細胞は、結合していないか又は非特異的に
結合しているその他の細胞から分けられうる。
課題のペプチドは、単独で、又は抱合体として、薬理
学的に許容されている媒体、例えば食塩水、PBS及びグ
ルコースの中で、一般に薬理学的に有効な投与量におい
て調製でき、その濃度は特定の目的のために常用の手順
に従って実験的に決定されるであろう。添加剤には殺菌
剤、安定化剤、バッファー等が含まれうる。宿主に投与
すべき量は、何を投与するか、投与の目的、例えば予防
又は治療、阻害又は活性化のいづれが所望されるか、宿
主の状態、投与方法等に応じて変わるであろう。この課
題のペプチド又は課題のペプチドの抱合体の半減期を長
めるため，このペプチドは、封入、リポソームのルーメ
ンの中に導入、コロイドとして調製してよく、又はこの
ペプチドの長い半減期を供するようにその他の慣用技術
が利用できうる。
学的に許容されている媒体、例えば食塩水、PBS及びグ
ルコースの中で、一般に薬理学的に有効な投与量におい
て調製でき、その濃度は特定の目的のために常用の手順
に従って実験的に決定されるであろう。添加剤には殺菌
剤、安定化剤、バッファー等が含まれうる。宿主に投与
すべき量は、何を投与するか、投与の目的、例えば予防
又は治療、阻害又は活性化のいづれが所望されるか、宿
主の状態、投与方法等に応じて変わるであろう。この課
題のペプチド又は課題のペプチドの抱合体の半減期を長
めるため，このペプチドは、封入、リポソームのルーメ
ンの中に導入、コロイドとして調製してよく、又はこの
ペプチドの長い半減期を供するようにその他の慣用技術
が利用できうる。
下記の実施例は、限定ではなく、例示のために提供す
る。
る。
実施例 実施例１ 標準の固相法を利用する慣用の合成法によって４本の
ペプチドを調製した。引用することで本明細書に組入れ
る、EricksonとMerrifiedのThe Proteins第２巻、第３
版（Neurath,H.＆ Hill,R.L.編）頁255−527（Academi
c Press,N.Y.1970）を参照のこと。これらのペプチドの
うちの３つはα2ドメインに由来するアミノ酸を有し、
そして１つのペプチドはHLA−A2抗原のα2ドメインに由
来するアミノ酸を有していた。この４本のペプチドは下
記の組成及び表示名を有する： A2.56−69GPEYWDGETRKVKA A2.94−112TLQRMYGCDVGSDWRFLRG A2.98−113MYGCDVGSDWRFLRGY Aw.68 98−113MYGCDVGSDGRFLRGY この表示名はそのペプチドが由来している主要組織適
合性抗原及び抗原の中でのアミノ酸の位置を表示してい
る。
ペプチドを調製した。引用することで本明細書に組入れ
る、EricksonとMerrifiedのThe Proteins第２巻、第３
版（Neurath,H.＆ Hill,R.L.編）頁255−527（Academi
c Press,N.Y.1970）を参照のこと。これらのペプチドの
うちの３つはα2ドメインに由来するアミノ酸を有し、
そして１つのペプチドはHLA−A2抗原のα2ドメインに由
来するアミノ酸を有していた。この４本のペプチドは下
記の組成及び表示名を有する： A2.56−69GPEYWDGETRKVKA A2.94−112TLQRMYGCDVGSDWRFLRG A2.98−113MYGCDVGSDWRFLRGY Aw.68 98−113MYGCDVGSDGRFLRGY この表示名はそのペプチドが由来している主要組織適
合性抗原及び抗原の中でのアミノ酸の位置を表示してい
る。
実施例２ HLA−A2.98−113及びHLA−A2.94−112に由来するペプチ
ドによるHLA−A2特異的CTLの阻害 実施例１で調製したペプチド、即ち、HLA−A2.56−6
9,HLA−A2.94−112,HLA−A2.98−113及びHLA−Aw68.98
−113に該当するものを、103CPMの51Cr−ラベル化Ｂ−
リンパ芽球標的細胞の添加前に１〜３×103のCTLと30分
プレインインキュベートした。細胞障害アッセイは、引
用することで本明細書に組入れる、Claybergerら、J.Ex
p.Med.（1984）162:1709−1714;及びReissら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA（1980）77:5432−5436に記載の通りに
行った。
ドによるHLA−A2特異的CTLの阻害 実施例１で調製したペプチド、即ち、HLA−A2.56−6
9,HLA−A2.94−112,HLA−A2.98−113及びHLA−Aw68.98
−113に該当するものを、103CPMの51Cr−ラベル化Ｂ−
リンパ芽球標的細胞の添加前に１〜３×103のCTLと30分
プレインインキュベートした。細胞障害アッセイは、引
用することで本明細書に組入れる、Claybergerら、J.Ex
p.Med.（1984）162:1709−1714;及びReissら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA（1980）77:5432−5436に記載の通りに
行った。
第一の研究においては、CTL細胞系AJY,HLA−A2に特異
的な長期（long term）CD8+CTL細胞系であり、そして標
的細胞はＢ−リンパ芽球細胞系JY（HLA−A2,B7）とし
た。第二の研究においては、CTLはPWSB、即ち、HLA−B1
7に対する反応性を有するバルク培養物とし、そして標
的はFMBとし、これはHLA−A1,A32,B17を発現する。各ケ
ースにおいて、ペプチドの非存在下で得られる比放出の
パーセンテージを決定した。この第二研究における比放
出の低い値は、細胞溶解が阻害され易いように潜在的に
した。PBS中で1mg/mlでのペプチドのストックを表１に
示す通りのアッセイにおける最終濃度へと希釈した。コ
ントロールインヒビターとして、HLA−A,B,6分子の単形
決定基に対して特異的なモノクローナル抗体PA2.6を使
用した（Reissら、前掲:McMichael,J.Exp.Med.（1980）
152:195 s−203S）。使用したペプチドはA2.98−113,A
2.94−112,Aw68.94−112及びA2.56−69とした。下記の
表に結果を示す。
的な長期（long term）CD8+CTL細胞系であり、そして標
的細胞はＢ−リンパ芽球細胞系JY（HLA−A2,B7）とし
た。第二の研究においては、CTLはPWSB、即ち、HLA−B1
7に対する反応性を有するバルク培養物とし、そして標
的はFMBとし、これはHLA−A1,A32,B17を発現する。各ケ
ースにおいて、ペプチドの非存在下で得られる比放出の
パーセンテージを決定した。この第二研究における比放
出の低い値は、細胞溶解が阻害され易いように潜在的に
した。PBS中で1mg/mlでのペプチドのストックを表１に
示す通りのアッセイにおける最終濃度へと希釈した。コ
ントロールインヒビターとして、HLA−A,B,6分子の単形
決定基に対して特異的なモノクローナル抗体PA2.6を使
用した（Reissら、前掲:McMichael,J.Exp.Med.（1980）
152:195 s−203S）。使用したペプチドはA2.98−113,A
2.94−112,Aw68.94−112及びA2.56−69とした。下記の
表に結果を示す。
第一のケースにおいては、ペプチドの非存在下で得ら
れたパーセンテージ比放出は約54であり、一方、第二の
ケースにおいては約28であった。
れたパーセンテージ比放出は約54であり、一方、第二の
ケースにおいては約28であった。
HLA−A2抗原により抑制される上記のCTLによる結果は
特異的な細胞障害の阻害を示した。A2により抑制されな
いCTLでは、ランダムな標的細胞の溶解がペプチドの非
存在下で得られた標的比放出に近い結果で起きた。これ
らの結果は、位置107でのトリプトファンが重要であり
うることを示唆する。ペプチドA2.98−113及びペプチド
Aw68.98−113はこの位置でのトリプトファンに対するグ
リシンの置換を除き同一である；この置換はHLA−A2特
異的CTLによる細胞障害の阻害性の欠失をもたらした。
特異的な細胞障害の阻害を示した。A2により抑制されな
いCTLでは、ランダムな標的細胞の溶解がペプチドの非
存在下で得られた標的比放出に近い結果で起きた。これ
らの結果は、位置107でのトリプトファンが重要であり
うることを示唆する。ペプチドA2.98−113及びペプチド
Aw68.98−113はこの位置でのトリプトファンに対するグ
リシンの置換を除き同一である；この置換はHLA−A2特
異的CTLによる細胞障害の阻害性の欠失をもたらした。
別々のプロテアーゼ、即ちトリプシン又はキモトリプ
シンによるペプチドA2.98−113の処理の結果は、アルギ
ニン108が重要であるが、ペプチド109−113は重要でな
いことを示唆する。トリプシン及びキモトリプシンの作
用の主要部位はそれぞれArg,Lys、及びTrp,Phe,Tyrであ
る。ペプチドの、トリプシンではなくキモトリプシン処
理が、阻害活性を下げた（結果を示さず）。
シンによるペプチドA2.98−113の処理の結果は、アルギ
ニン108が重要であるが、ペプチド109−113は重要でな
いことを示唆する。トリプシン及びキモトリプシンの作
用の主要部位はそれぞれArg,Lys、及びTrp,Phe,Tyrであ
る。ペプチドの、トリプシンではなくキモトリプシン処
理が、阻害活性を下げた（結果を示さず）。
実施例３ HLAに由来するペプチドにより生ずる細胞障害の阻害に
及ぼすCTL及び標的細胞の特異性の効果 いくつかの種々のCTL細胞系を調べたところ、その細
胞系の特異性は異なっていた。表２に示す結果は、CTL
と標的細胞とは、A2由来のペプチドが供する阻害性につ
いてのみ特異性を共有していた。
及ぼすCTL及び標的細胞の特異性の効果 いくつかの種々のCTL細胞系を調べたところ、その細
胞系の特異性は異なっていた。表２に示す結果は、CTL
と標的細胞とは、A2由来のペプチドが供する阻害性につ
いてのみ特異性を共有していた。
実施例４ HLA−A2特異的CTLの阻害にとって必要な最小ペプチド配
列 HLA−A2特異的CTLによる細胞溶解の阻害にとって必要
な最小ペプチド配列を、阻害に及ぼすサイズを調べるこ
とによって決定した。
列 HLA−A2特異的CTLによる細胞溶解の阻害にとって必要
な最小ペプチド配列を、阻害に及ぼすサイズを調べるこ
とによって決定した。
HLA−A2又はHLA−Aw68の位置98−104で始まり、そし
位置108で終わる一連のペプチドを合成した。17種の異
なるHLA−Ａ特異的系又はクローンによるJY細胞（HLA−
A2,B7,DR4,6）の細胞溶解に及ぼすこれらのペプチドの
効果を試験した。HLA−A2特異的系又はクローンはClayb
ergeら、前掲に記載の通りに作製した。ペプチド（200m
g/ml）を１〜３×103のCTLと30分インキュベートし、次
いで103CPMの51Cr−ラベル標的細胞を添加した。これら
のペプチドは細胞障害アッセイの間にわたって存在さ
せ、このアッセイは、引用することで本明細書に組入れ
るClaybergerら、前掲及びKrenskyら、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 79:2365（1982）に記載の通りに実施した。ペ
プチドはリン酸バッファー食塩水の中で1mg/mlのストッ
ク溶液として用意し、そして完全培地（10％の牛血清の
加えたMEN）の中で、使用する最終濃度に希釈した。
位置108で終わる一連のペプチドを合成した。17種の異
なるHLA−Ａ特異的系又はクローンによるJY細胞（HLA−
A2,B7,DR4,6）の細胞溶解に及ぼすこれらのペプチドの
効果を試験した。HLA−A2特異的系又はクローンはClayb
ergeら、前掲に記載の通りに作製した。ペプチド（200m
g/ml）を１〜３×103のCTLと30分インキュベートし、次
いで103CPMの51Cr−ラベル標的細胞を添加した。これら
のペプチドは細胞障害アッセイの間にわたって存在さ
せ、このアッセイは、引用することで本明細書に組入れ
るClaybergerら、前掲及びKrenskyら、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 79:2365（1982）に記載の通りに実施した。ペ
プチドはリン酸バッファー食塩水の中で1mg/mlのストッ
ク溶液として用意し、そして完全培地（10％の牛血清の
加えたMEN）の中で、使用する最終濃度に希釈した。
CTL−A2による細胞溶解の阻害に及ぼす結果を図1Aに
示し、ここでは阻害は （１−〔ペプチドの存在下での比細胞溶解／ペプチドの
存在下での比細胞溶解〕）×100で表わしている。
示し、ここでは阻害は （１−〔ペプチドの存在下での比細胞溶解／ペプチドの
存在下での比細胞溶解〕）×100で表わしている。
図においてわかる通り、ペプチド104−108は阻害をせ
ず、ペプチド102−108及び103−108は弱い阻害を示し、
そして残りのペプチドは良好な細胞溶解の阻害をもたら
した。従って、残基101−108を含んで成るオクタペプチ
ドが阻害効果を起こすのに十分であった。阻害効果にお
ける大きな低下は位置101でのシステインの欠失により
起こる。この欠失はシステイン101がないときの２本の
ペプチド分子のジスルフィド架橋の欠失に基づくもので
ありうる。
ず、ペプチド102−108及び103−108は弱い阻害を示し、
そして残りのペプチドは良好な細胞溶解の阻害をもたら
した。従って、残基101−108を含んで成るオクタペプチ
ドが阻害効果を起こすのに十分であった。阻害効果にお
ける大きな低下は位置101でのシステインの欠失により
起こる。この欠失はシステイン101がないときの２本の
ペプチド分子のジスルフィド架橋の欠失に基づくもので
ありうる。
実施例５ ペプチドA2.98−113の活性の位置 ペプチドA2.98−113が相互作用して、HLA−A2特異的C
TL媒介細胞溶解、即ちCTL及び／又は標的細胞に及ぼす
阻害効果をもたらす位置を以下の通りに決定した。
TL媒介細胞溶解、即ちCTL及び／又は標的細胞に及ぼす
阻害効果をもたらす位置を以下の通りに決定した。
CTL（１×106のCTL−A2）及び／又は標的細胞（51Cr
ラベルJY標的細胞）を100μｇのA2.98−113と30min、37
℃で、又はコントロールペプチド、Aw68.98−113とイン
キュベートした。これらのペプチドの配列は実施例１に
示している。追加のコントロールとして、これらの細胞
をペプチドを除く完全培地とインキュベートした。イン
キュベーションの後、これらの細胞を完全培地で３回洗
い、そして51Cr−放出アッセイを試験した（実施例２参
照）。
ラベルJY標的細胞）を100μｇのA2.98−113と30min、37
℃で、又はコントロールペプチド、Aw68.98−113とイン
キュベートした。これらのペプチドの配列は実施例１に
示している。追加のコントロールとして、これらの細胞
をペプチドを除く完全培地とインキュベートした。イン
キュベーションの後、これらの細胞を完全培地で３回洗
い、そして51Cr−放出アッセイを試験した（実施例２参
照）。
その結果を図２に示し、ここでは、溶解は、標的細胞
でなく、CTLをA2.98−113で予備処理したときに阻害さ
れることがわかりうる。阻害効果は、CTL又は標的細胞
をコントロールペプチド、Aw68.98−113で予備処理した
ときは観察されなかった。
でなく、CTLをA2.98−113で予備処理したときに阻害さ
れることがわかりうる。阻害効果は、CTL又は標的細胞
をコントロールペプチド、Aw68.98−113で予備処理した
ときは観察されなかった。
実施例６ CTLの生存性に及ぼすA2.98−113作用によるCTLの阻害機
構 CTLがA2.98−113により誘発されるその自己溶解に基
づいて阻害されるのかどうかを調べるため、51Cr−ラベ
ルCTL−A2細胞又は非ラベルCTL−A2細胞を完全培地の中
で37℃で６時間ペプチドとインキュベートした。この６
時間のインキュベーションの間、トリパンブルーの排出
又は51Cr−放出により判定される細胞生存率の検出可能
な低下は認められなかった（結果を示さず）。
構 CTLがA2.98−113により誘発されるその自己溶解に基
づいて阻害されるのかどうかを調べるため、51Cr−ラベ
ルCTL−A2細胞又は非ラベルCTL−A2細胞を完全培地の中
で37℃で６時間ペプチドとインキュベートした。この６
時間のインキュベーションの間、トリパンブルーの排出
又は51Cr−放出により判定される細胞生存率の検出可能
な低下は認められなかった（結果を示さず）。
実施例７ セリンエステラーゼ含有顆粒の放出に及ぼすA2.98−113
効果によるCTLの阻害機構 CTLによる標的細胞の細胞溶解の際のセリンエステラ
ーゼ含有顆粒の放出に及ぼすA2.98−113の効果を下記の
通りに決定した。
効果によるCTLの阻害機構 CTLによる標的細胞の細胞溶解の際のセリンエステラ
ーゼ含有顆粒の放出に及ぼすA2.98−113の効果を下記の
通りに決定した。
放出の特異性を、３×105のHLA−A2特異的CTLを、JY
細胞（HLA−A2;B7;Dr4,6）又はIBW4細胞（HLA−A3;B35;
DR1）とＶ底マイクロタイターウェルの中で２時間イン
キュベートすることにより決定した。CTL:標的細胞の比
は1:0.01,1:0.05,1:0.10,1:0.5及び1:1とした。インキ
ュベーション後、このプレートを1000RPMで２分遠心
し、次いでその上清液を、引用することで本明細書に組
入れるYoungら、Cell47:183（1986）に本質的に記載の
通りにセリンエステラーゼ活性についてアッセイした。
この反応混合物は、20μｌの上清液と、200μｌの基質
（２×10-4ＭのＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リ
ジンチオベンジルエステル、2.2×10-4Ｍのニトロ安息
香酸、0.1Mのトリス−HCl、pH8.0）より成る。37℃で30
min後、410nmでのその吸光度を決定した。総セリンエス
テラーゼ活性は、刺激性細胞を0.01％のトリトンＸ−10
0に置き換えることにより決定した。図3Aに示す結果
は、HLA−A2特異的CTLをJY細胞とインキュベートしたと
き（べた塗り丸）に顆粒の放出が起き、HLA−A2特異的C
TLを1BW4細胞とインキュベートしたとき（べた塗り四
角）では起きないことを示した。
細胞（HLA−A2;B7;Dr4,6）又はIBW4細胞（HLA−A3;B35;
DR1）とＶ底マイクロタイターウェルの中で２時間イン
キュベートすることにより決定した。CTL:標的細胞の比
は1:0.01,1:0.05,1:0.10,1:0.5及び1:1とした。インキ
ュベーション後、このプレートを1000RPMで２分遠心
し、次いでその上清液を、引用することで本明細書に組
入れるYoungら、Cell47:183（1986）に本質的に記載の
通りにセリンエステラーゼ活性についてアッセイした。
この反応混合物は、20μｌの上清液と、200μｌの基質
（２×10-4ＭのＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リ
ジンチオベンジルエステル、2.2×10-4Ｍのニトロ安息
香酸、0.1Mのトリス−HCl、pH8.0）より成る。37℃で30
min後、410nmでのその吸光度を決定した。総セリンエス
テラーゼ活性は、刺激性細胞を0.01％のトリトンＸ−10
0に置き換えることにより決定した。図3Aに示す結果
は、HLA−A2特異的CTLをJY細胞とインキュベートしたと
き（べた塗り丸）に顆粒の放出が起き、HLA−A2特異的C
TLを1BW4細胞とインキュベートしたとき（べた塗り四
角）では起きないことを示した。
セリンエステラーゼ含有顆粒の放出に及ぼすペプチド
A2.98−113の効果を似たような方法で決定したが、ただ
しHLA−A2特異的CTLを、A2.98−113もしくはAw68.98−1
13のいづれかのペプチド100μｇと、又は完全培地のみ
と、37℃で30分プレインキュベートし、次いで1:0.01,
1:0.05,1:0.1,1:0.5及び1:1の比のCTL:標的細胞でこのJ
Y標的細胞を加えた。
A2.98−113の効果を似たような方法で決定したが、ただ
しHLA−A2特異的CTLを、A2.98−113もしくはAw68.98−1
13のいづれかのペプチド100μｇと、又は完全培地のみ
と、37℃で30分プレインキュベートし、次いで1:0.01,
1:0.05,1:0.1,1:0.5及び1:1の比のCTL:標的細胞でこのJ
Y標的細胞を加えた。
図3Bにおいてわかる通り、エステラーゼ放出の阻害が
100μg/mlのA2.98−113により、1:0.1のエフェクター、
対、標的の比で見られる（べた塗り丸）。コントロール
ペプチドAw68.98−113はエステラーゼ放出（べた塗り三
角）に効果を及ぼさず、なぜならこのケースでの放出は
完全培地でコントロール細胞をプレインキュベートした
ときに得られる結果に等しかったからである（べた塗り
丸）。
100μg/mlのA2.98−113により、1:0.1のエフェクター、
対、標的の比で見られる（べた塗り丸）。コントロール
ペプチドAw68.98−113はエステラーゼ放出（べた塗り三
角）に効果を及ぼさず、なぜならこのケースでの放出は
完全培地でコントロール細胞をプレインキュベートした
ときに得られる結果に等しかったからである（べた塗り
丸）。
これらの結果は、実施例５のそれと一緒に、A2.98−1
13ペプチドが、CTLに直接結合することにより、Ｔ細胞
活性化の早期に生ずる現象を阻止することを示唆する。
13ペプチドが、CTLに直接結合することにより、Ｔ細胞
活性化の早期に生ずる現象を阻止することを示唆する。
実施例８ HLA−A2及びHLA−B17に共通するエピトープに対して、H
LA−B17に対して、並びにHLA−A2に対して特異的なCTL
の単離 様々な特異性を有するCTLを、Claybergerら、（198
5）前掲に本質的に記載の通りに正常トナーの末梢血液
リンパ球から誘導した（HLA−A3;B7;DR6）、HLA−A2及
びHLA−B17で共有されるエピトープに特異的なCTLにつ
いては、それらの細胞を一次培養物において照射済（1
0,000R）Ｂ−リンパ球芽細胞系Mag（HLA−A26,33;B17,5
1）で刺激し、そして刺激因子としてSB細胞系（HLA−A
1,2;B17,44;DR2,6）を用いてクローンした。B17に特異
的なCTLは同じ一次培養物に由来するが、しかし刺激因
子としてSH細胞系（HLA−A3,w33;B7,17（w57））を用い
てクローンした。HLA−A2特異的CTLはJY細胞系による一
次培養物における細胞刺激に由来し、そして刺激因子と
してHerluff細胞系（HLA−A2;B12,35;DR4,7）を用いて
クローンした。これらのCTLクローンの良好な特異性
を、HLA−B17を発現する11の標的、HLA−A2を発現する
８の標的、及び無関係のHLA分子を有する15の標的のパ
ネルを利用して評価した。所望の特異性の複数のクロー
ンが得られた。HLA−A2タイプ標的細胞及びHLA−B17タ
イプ標的細胞の両方の細胞溶解を引き起こす１個のクロ
ーンをクローンA2/B17と表示した。クローンA2/B17の標
的細胞の細胞溶解は抗体MA2.1により阻害された。HLA−
B17標的細胞は全て溶解するがその他は溶解しない第二
のクローンをB17を表示する。HLA−A2標的細胞は全て溶
解するがその他は溶解しない第三のクローンをCTL−A2
と表示す。
LA−B17に対して、並びにHLA−A2に対して特異的なCTL
の単離 様々な特異性を有するCTLを、Claybergerら、（198
5）前掲に本質的に記載の通りに正常トナーの末梢血液
リンパ球から誘導した（HLA−A3;B7;DR6）、HLA−A2及
びHLA−B17で共有されるエピトープに特異的なCTLにつ
いては、それらの細胞を一次培養物において照射済（1
0,000R）Ｂ−リンパ球芽細胞系Mag（HLA−A26,33;B17,5
1）で刺激し、そして刺激因子としてSB細胞系（HLA−A
1,2;B17,44;DR2,6）を用いてクローンした。B17に特異
的なCTLは同じ一次培養物に由来するが、しかし刺激因
子としてSH細胞系（HLA−A3,w33;B7,17（w57））を用い
てクローンした。HLA−A2特異的CTLはJY細胞系による一
次培養物における細胞刺激に由来し、そして刺激因子と
してHerluff細胞系（HLA−A2;B12,35;DR4,7）を用いて
クローンした。これらのCTLクローンの良好な特異性
を、HLA−B17を発現する11の標的、HLA−A2を発現する
８の標的、及び無関係のHLA分子を有する15の標的のパ
ネルを利用して評価した。所望の特異性の複数のクロー
ンが得られた。HLA−A2タイプ標的細胞及びHLA−B17タ
イプ標的細胞の両方の細胞溶解を引き起こす１個のクロ
ーンをクローンA2/B17と表示した。クローンA2/B17の標
的細胞の細胞溶解は抗体MA2.1により阻害された。HLA−
B17標的細胞は全て溶解するがその他は溶解しない第二
のクローンをB17を表示する。HLA−A2標的細胞は全て溶
解するがその他は溶解しない第三のクローンをCTL−A2
と表示す。
クローンA2/B17の標的特異性及びこのクローンによる
細胞溶解がモノクローナル抗体MA2.1により阻止される
発見は、クローンA2/B17の細胞がHLA−A2及びHLA−B17
で共有されるエピトープを認識することを示唆する。
細胞溶解がモノクローナル抗体MA2.1により阻止される
発見は、クローンA2/B17の細胞がHLA−A2及びHLA−B17
で共有されるエピトープを認識することを示唆する。
実施例９ 種々の特異性のCTLによる標的細胞の細胞溶解に及ぼす
種々のHLA−A2エピトープに由来するペプチドの効果 実施例２−７、前掲はα２ドメイン中のトリプトファ
ン17のまわりの領域に由来するペプチドの効果を包括し
ている。β−プリーツシートの二本の鎖の間の屈曲点上
にあるこの残基（Bjorkmanら、（1987）、前掲）はHLA
−A2の血清学的エピトープにとって重要である。Salter
ら、J.Exp.Med.166:283（1987）:Layetら、J.Immunol.1
38:2197（1987）。
種々のHLA−A2エピトープに由来するペプチドの効果 実施例２−７、前掲はα２ドメイン中のトリプトファ
ン17のまわりの領域に由来するペプチドの効果を包括し
ている。β−プリーツシートの二本の鎖の間の屈曲点上
にあるこの残基（Bjorkmanら、（1987）、前掲）はHLA
−A2の血清学的エピトープにとって重要である。Salter
ら、J.Exp.Med.166:283（1987）:Layetら、J.Immunol.1
38:2197（1987）。
別の重要なエピトープは、α1ドメインのα−ヘリッ
クス領域の残基62−65に関与する。Bjorkmanら、前掲。
このエピトープはモノクローナル抗体MA2.1により本来
特定され（McMichaelら、Hum.Immunol.1:121（199
0））、そしてHLA−A2及びHLA−B17の全ての既知のサブ
タイプに共有されている（WaysとParham,Biochem.J.21
6:423（1983））。HLA−A2及びHLA−B17、並びに８種の
その他のHLA−A,B,Cタンパク質のアミノ酸配列の比較
は、位置62でのグリシン残基のみが独特であることを示
し、この残基が共有決定基に貢献していることを示唆す
る（Waysら、J.Immunol.137:217（1986））。
クス領域の残基62−65に関与する。Bjorkmanら、前掲。
このエピトープはモノクローナル抗体MA2.1により本来
特定され（McMichaelら、Hum.Immunol.1:121（199
0））、そしてHLA−A2及びHLA−B17の全ての既知のサブ
タイプに共有されている（WaysとParham,Biochem.J.21
6:423（1983））。HLA−A2及びHLA−B17、並びに８種の
その他のHLA−A,B,Cタンパク質のアミノ酸配列の比較
は、位置62でのグリシン残基のみが独特であることを示
し、この残基が共有決定基に貢献していることを示唆す
る（Waysら、J.Immunol.137:217（1986））。
上記の２つの領域に由来するペプチドを、種々の特異
性を有するCTLによる標的細胞の細胞溶解に及ぼす阻害
作用について調べた（即ち、クローンA2/B17、クローン
CTL−A2及びクローンB17のそれ（実施例８、前掲を参照
のこと）。CTLを下記のペプチドとインキュベートした:
A2.56−69,Aw68.56−69,A2.98−113又はAw68.98−113。
性を有するCTLによる標的細胞の細胞溶解に及ぼす阻害
作用について調べた（即ち、クローンA2/B17、クローン
CTL−A2及びクローンB17のそれ（実施例８、前掲を参照
のこと）。CTLを下記のペプチドとインキュベートした:
A2.56−69,Aw68.56−69,A2.98−113又はAw68.98−113。
調べたエピトープ及びこの試験に用いたペプチドを図
４に示す。ここで８種のHLA−A,B分子の３つの細胞外ド
メイン（α1，α2及びα3）におけるタンパク質配列
を、標準の一文字アミノ酸コードを用いて示している。
HLA−B17のサブタイプであるHLA,Bw58の配列はWaysら、
J.Biol.Chem.260:11924（1985）由来し、HLA−A3.1のそ
れはStrachenら、EMBO J.3:887（1984）に由来し、そし
てHLA−A2/28科の残りの配列はHolmesら、J.Immunol.13
9:936（1987）に由来する。ペプチドA2.56−69及びAw6
8.56−69、並びにA2.98−113及びAw68.98−113（それぞ
れα1及びα2に由来する）はクロスハッチングにより示
す。HLA−A2及びHLA−B17のサブタイプ（グリシン62）
並びにサブタイプHLA−A2及びHLA−Aw69（トリプトファ
ン107）に共有されるエピトープにとって重要であると
見い出された２つの残基は、点及び鉛直矢印により表示
している。その共通配列は23のHLA−A,B,C配列全体に由
来する。
４に示す。ここで８種のHLA−A,B分子の３つの細胞外ド
メイン（α1，α2及びα3）におけるタンパク質配列
を、標準の一文字アミノ酸コードを用いて示している。
HLA−B17のサブタイプであるHLA,Bw58の配列はWaysら、
J.Biol.Chem.260:11924（1985）由来し、HLA−A3.1のそ
れはStrachenら、EMBO J.3:887（1984）に由来し、そし
てHLA−A2/28科の残りの配列はHolmesら、J.Immunol.13
9:936（1987）に由来する。ペプチドA2.56−69及びAw6
8.56−69、並びにA2.98−113及びAw68.98−113（それぞ
れα1及びα2に由来する）はクロスハッチングにより示
す。HLA−A2及びHLA−B17のサブタイプ（グリシン62）
並びにサブタイプHLA−A2及びHLA−Aw69（トリプトファ
ン107）に共有されるエピトープにとって重要であると
見い出された２つの残基は、点及び鉛直矢印により表示
している。その共通配列は23のHLA−A,B,C配列全体に由
来する。
CTLを、100μg/ml、200μg/ml又は300μg/mlの濃度で
のペプチドとインキュベートした。コントロールサンプ
ルをペプチドの非存在下でインキュベートした。100μg
/mlでのアッセイにおいて用いたペプチドの最終濃度
は、A2.98−113については4.9×10-5M:Aw68.98−113に
ついては5.2×10-5M:A2.56−69については5.6×10-5M:
そしてAw68.56−69については5.9×10-5Ｍとした。CTL
細胞をペプチドと20分インキュベートし、次いで103の
51Cr−ラベルT7529細胞（HLA−Aw33;B17（w58）;DR
6））又はJY細胞（HLA−A2;B17;DR4,6）を添加した。全
てのケースにおいて、エフェクター、対、標的の比は1:
1とした。
のペプチドとインキュベートした。コントロールサンプ
ルをペプチドの非存在下でインキュベートした。100μg
/mlでのアッセイにおいて用いたペプチドの最終濃度
は、A2.98−113については4.9×10-5M:Aw68.98−113に
ついては5.2×10-5M:A2.56−69については5.6×10-5M:
そしてAw68.56−69については5.9×10-5Ｍとした。CTL
細胞をペプチドと20分インキュベートし、次いで103の
51Cr−ラベルT7529細胞（HLA−Aw33;B17（w58）;DR
6））又はJY細胞（HLA−A2;B17;DR4,6）を添加した。全
てのケースにおいて、エフェクター、対、標的の比は1:
1とした。
標的細胞からの51クロム放出により決定した細胞障害
性の結果を図５に示す。図5A及び5Bは、クローンA2/B17
の細胞に及ぼすペプチドの効果の結果を示す；図5Cはク
ローンB17の細胞に及ぼす効果、そして図5DはCTL−A2に
及ぼす効果を示す。これらのペプチドは下記のように表
示してある：（白抜き丸）A2.56−69:（白抜き四角）Aw
68.56−69;（白抜き三角）Aw.98−113;そして（べた塗
り四角）Aw68.98−113。共有された血清学的エピトープ
を含むペプチドA2.56−69は、クローンA2/B17細胞によ
る、HLA−A2及びHLA−B17発現標的細胞の両者の殺傷を
特異的に阻害した。他方、このペプチドはクローンB17
細胞によるHLA−B17発現細胞の溶解に対しては何ら効果
がなかった。クローンA2/B17細胞は、HLA−Aw68.1の残
基56−69に由来するペプチドによっては、又は一連の無
関係のペプチドによっては阻害されなかった。A2.98−1
13ペプチドは、クローンA2/B17細胞によるHLA−B17発現
標的の溶解には影響を及ぼさなかったが、高濃度ではHL
A−A2発現標的について若干の阻害が認められた。この
違いは、クローンA2/B17細胞により認識されるHLA−A2
及びHLA−B17のエピトープは正確に同一でないことを示
す。
性の結果を図５に示す。図5A及び5Bは、クローンA2/B17
の細胞に及ぼすペプチドの効果の結果を示す；図5Cはク
ローンB17の細胞に及ぼす効果、そして図5DはCTL−A2に
及ぼす効果を示す。これらのペプチドは下記のように表
示してある：（白抜き丸）A2.56−69:（白抜き四角）Aw
68.56−69;（白抜き三角）Aw.98−113;そして（べた塗
り四角）Aw68.98−113。共有された血清学的エピトープ
を含むペプチドA2.56−69は、クローンA2/B17細胞によ
る、HLA−A2及びHLA−B17発現標的細胞の両者の殺傷を
特異的に阻害した。他方、このペプチドはクローンB17
細胞によるHLA−B17発現細胞の溶解に対しては何ら効果
がなかった。クローンA2/B17細胞は、HLA−Aw68.1の残
基56−69に由来するペプチドによっては、又は一連の無
関係のペプチドによっては阻害されなかった。A2.98−1
13ペプチドは、クローンA2/B17細胞によるHLA−B17発現
標的の溶解には影響を及ぼさなかったが、高濃度ではHL
A−A2発現標的について若干の阻害が認められた。この
違いは、クローンA2/B17細胞により認識されるHLA−A2
及びHLA−B17のエピトープは正確に同一でないことを示
す。
これらの結果は、異質反応性CTLを阻害するペプチド
の能力が、α2ドメインの残基101−108を含む領域に限
定されず、そしてHLA−A2の第２エピトープに由来しう
ることを示す。
の能力が、α2ドメインの残基101−108を含む領域に限
定されず、そしてHLA−A2の第２エピトープに由来しう
ることを示す。
クローンA2/B17を用いてのペプチドA2.56−69により
得られた結果と、PWSB細胞系により得られた結果との、
このペプチドの阻害効果についての不一致（表２参照の
こと）はPWSB細胞のポリクローナル的性質により説明さ
れる。即ち、PWSB系はおそらくはHLA−A2又はHLA−B17
に特異的な個々のクローンを含むCTLの混合物である。
得られた結果と、PWSB細胞系により得られた結果との、
このペプチドの阻害効果についての不一致（表２参照の
こと）はPWSB細胞のポリクローナル的性質により説明さ
れる。即ち、PWSB系はおそらくはHLA−A2又はHLA−B17
に特異的な個々のクローンを含むCTLの混合物である。
実施例10 HLA−２由来ポリペプチドにより生ずるCTLに対する標的
細胞の感作 クローンA2/B17をA2.56−69及び51Cr−ラベル標的細
胞と、5:1のエフェクター、対、標的の比で５時間イン
キュベートし、その後、放出された51クロムを測定し
た。ペプチドの濃度は10,30,100及び300μg/mlとした。
クローンA2/B17細胞による標的細胞の比溶解のパーセン
トに及ぼすペプチドの効果の結果を図６に示す。この標
的細胞は：（べた塗り四角）、IBW4（HLA−A3;B35;DR
1）；（べた塗り三角）、LB（HLA−Aw68.1;B40,DR6）；
（べた塗り丸）、Pally（HLA−Aw68.2,26;B14,38;DR1,
4）又は（白抜きひし形）、IDF（HLA−Aw69,26;B15,38,
DR5）である。
細胞の感作 クローンA2/B17をA2.56−69及び51Cr−ラベル標的細
胞と、5:1のエフェクター、対、標的の比で５時間イン
キュベートし、その後、放出された51クロムを測定し
た。ペプチドの濃度は10,30,100及び300μg/mlとした。
クローンA2/B17細胞による標的細胞の比溶解のパーセン
トに及ぼすペプチドの効果の結果を図６に示す。この標
的細胞は：（べた塗り四角）、IBW4（HLA−A3;B35;DR
1）；（べた塗り三角）、LB（HLA−Aw68.1;B40,DR6）；
（べた塗り丸）、Pally（HLA−Aw68.2,26;B14,38;DR1,
4）又は（白抜きひし形）、IDF（HLA−Aw69,26;B15,38,
DR5）である。
ペプチドの非存在下では、クローンA2/B17細胞はHLA
−Aw69,HLA−Aw68.1及びHLA−Aw68.2発現標的を溶解し
た（データーは示さず）。これらの標的を溶解するクロ
ーンA2/B17細胞の能力のなさはHLA−A2及びHLA−B17の
中で見いだされるような位置62のまわりの重要な残基に
おける違いに基づく。しかしながら、ペプチドA2.56−6
9を細胞障害アッセイに含ませたとき、A2/B17細胞によ
るHLA−Aw69発現標的の有意義な溶解があった（図
５）。他方、HLA−Aw68.1、HLA−Aw68.2又は無関係のHL
A−A3分子を発現する標的は溶解されなかった。
−Aw69,HLA−Aw68.1及びHLA−Aw68.2発現標的を溶解し
た（データーは示さず）。これらの標的を溶解するクロ
ーンA2/B17細胞の能力のなさはHLA−A2及びHLA−B17の
中で見いだされるような位置62のまわりの重要な残基に
おける違いに基づく。しかしながら、ペプチドA2.56−6
9を細胞障害アッセイに含ませたとき、A2/B17細胞によ
るHLA−Aw69発現標的の有意義な溶解があった（図
５）。他方、HLA−Aw68.1、HLA−Aw68.2又は無関係のHL
A−A3分子を発現する標的は溶解されなかった。
ペプチドA2.56−69の存在下でのクローンA2/B17細胞
によるHLA−Aw69細胞の溶解は、標的細胞のHLA−Aw69に
のみ結合するモノクローナル抗体DR11−351により阻害
された。他方、このモノクローナル抗体MA2.1は溶解は
阻害しなかった（結果は示さず）。MA2.1は残基56−69
により構成されるHLA−A2及びHLA−B17のエピトープに
は結合するが、しかしHLA−Aw69又はペプチドA2.56−69
には結合しない。これらの結果は、ペプチドA2.56−69
による感作におけるHLA−Aw69分子の関与を説明する。
によるHLA−Aw69細胞の溶解は、標的細胞のHLA−Aw69に
のみ結合するモノクローナル抗体DR11−351により阻害
された。他方、このモノクローナル抗体MA2.1は溶解は
阻害しなかった（結果は示さず）。MA2.1は残基56−69
により構成されるHLA−A2及びHLA−B17のエピトープに
は結合するが、しかしHLA−Aw69又はペプチドA2.56−69
には結合しない。これらの結果は、ペプチドA2.56−69
による感作におけるHLA−Aw69分子の関与を説明する。
HLA−A2を発現しないＢ細胞系へのA2.98−113ペプチ
ドの添加は、様々なHLA分子を発現する標的細胞を使用
したときに、溶解に対する感作をもたらさなかった。こ
れは広範囲に及ぶペプチド濃度（0.1〜300μg/mlを使
用）のときでさえもそうであった。
ドの添加は、様々なHLA分子を発現する標的細胞を使用
したときに、溶解に対する感作をもたらさなかった。こ
れは広範囲に及ぶペプチド濃度（0.1〜300μg/mlを使
用）のときでさえもそうであった。
A2.56−69結合において、HLA−Aw69分子はHLA−A2の
天然構造を擬態するエピトープを示すことができる。HL
A−A2/28科の他のメンバーでなく、HLA−Aw69が注目さ
れるほど感作されうる。HLA−Aw69はHLA−Aw6Bに由来す
るα1並びにHLA−A2.1に由来するα2及びα3を有する組
換分子である（HolmesとParham,EMBO J.4:2849（198
5））。従って、HLA−2.1及びHLA−Aw69は６個のみのア
ミノ酸で相違し、それらは全てα1ドメインの中にあ
り、そしてそのうちの３個はA2.56−69ペプチドの中に
存在している。
天然構造を擬態するエピトープを示すことができる。HL
A−A2/28科の他のメンバーでなく、HLA−Aw69が注目さ
れるほど感作されうる。HLA−Aw69はHLA−Aw6Bに由来す
るα1並びにHLA−A2.1に由来するα2及びα3を有する組
換分子である（HolmesとParham,EMBO J.4:2849（198
5））。従って、HLA−2.1及びHLA−Aw69は６個のみのア
ミノ酸で相違し、それらは全てα1ドメインの中にあ
り、そしてそのうちの３個はA2.56−69ペプチドの中に
存在している。
実施例11 感作におけるペプチド相互作用の位置 CTL又は標的とのペプチドの相互作用に感作が由来す
るかどうかを評価するため、細胞をA2.56−69で予備処
理し、洗い、次いで細胞溶解について試験した。より詳
しくは、１×106のクローンのA2/B17細胞又は51Cr−ラ
ベルIDF（HLA−Aw69,26;B18,38;DR5）を100μｇのペプ
チド又は培地と37℃で30分インキュベートし、３回洗
い、そして細胞障害性を51クロム放出を測定することに
より決定した。
るかどうかを評価するため、細胞をA2.56−69で予備処
理し、洗い、次いで細胞溶解について試験した。より詳
しくは、１×106のクローンのA2/B17細胞又は51Cr−ラ
ベルIDF（HLA−Aw69,26;B18,38;DR5）を100μｇのペプ
チド又は培地と37℃で30分インキュベートし、３回洗
い、そして細胞障害性を51クロム放出を測定することに
より決定した。
図７に示す結果からわかる通り、HLA−Aw69を発現す
る標的細胞は、CTLでなく標的をA2.56−69で予備処理し
たときに溶解した。
る標的細胞は、CTLでなく標的をA2.56−69で予備処理し
たときに溶解した。
実施例12 セリンエステラーゼ含有顆粒の放出に及ぼすペプチドA
2.56−69の効果 A2/B17細胞とHLA−Aw69発現細胞との同時培養の際の
セリンエステラーゼ含有顆粒の放出に及ぼすペプチドA
2.56−69の効果を、前掲の実施例７に本質的に記載の通
りに実施したが、ただしCTLはクローンA2/B17に由来
し、標的細胞はHLA−Aw69を発現するものとし、そして
細胞をペプチドA2.56−69の非存在下又は存在下で培養
した。
2.56−69の効果 A2/B17細胞とHLA−Aw69発現細胞との同時培養の際の
セリンエステラーゼ含有顆粒の放出に及ぼすペプチドA
2.56−69の効果を、前掲の実施例７に本質的に記載の通
りに実施したが、ただしCTLはクローンA2/B17に由来
し、標的細胞はHLA−Aw69を発現するものとし、そして
細胞をペプチドA2.56−69の非存在下又は存在下で培養
した。
実施例13 溶解に及ぼすアミノ酸60−84のHLAペプチド及びHLA−B2
702/05.145−169の変異体の効果 これらのペプチドを合成し、そして下記の配列を有す
る： HLA−A2,−B2705,−Bw46,−Bw62及び−Cw4に特異的な
長期CTLの溶解に及ぼす上記の配列の効果を実施例２及
び３に記載の通りに決定し、そして更にHLA−B27及びHL
A−Cw4に特異的なCTLも含ませた。B2702.60−84ペプチ
ドを除くどのペプチドも、溶解を阻害も高めもしなかっ
た。このペプチドはそのHLA特異性にもかかわらず、全
てのCTLによる溶解を阻止した。この効果はCTLとの相互
作用に起因し、予備処理実験（実施例５）により示す通
り標的細胞には起因しない。
702/05.145−169の変異体の効果 これらのペプチドを合成し、そして下記の配列を有す
る： HLA−A2,−B2705,−Bw46,−Bw62及び−Cw4に特異的な
長期CTLの溶解に及ぼす上記の配列の効果を実施例２及
び３に記載の通りに決定し、そして更にHLA−B27及びHL
A−Cw4に特異的なCTLも含ませた。B2702.60−84ペプチ
ドを除くどのペプチドも、溶解を阻害も高めもしなかっ
た。このペプチドはそのHLA特異性にもかかわらず、全
てのCTLによる溶解を阻止した。この効果はCTLとの相互
作用に起因し、予備処理実験（実施例５）により示す通
り標的細胞には起因しない。
これらのペプチドを限界希釈アッセイにおいてCTL前
駆体からのCTLの分化に及ぼす効果について試験した。
その手順は、SkinnerとMarbrook（J.Exp.Med.143:1562;
1976）のそれを、下記のように改良したものである：正
常HLAタイプドナー由来のPBLをFicoll−Hypaqueで精製
し、そして丸底マイクロタイターウェルの中で、課題の
HLAアレルを発現する照射剤（10,000R）EBV形質転換Ｂ
−リンパ球芽細胞と同時培養した。レスポンダーPBLを
ウェル当り3000,6000,10000及び30000細胞で加え、また
刺激因子をウェル当り6000細胞で加えた。20−４のレプ
リケートを各レスポンダー細胞濃度について、10％の胎
児牛血清＋Ｌ−グルタミンの加えたRPMI−1640培地の中
で用意した。プレートを５％のCO2/95％のエアーの多湿
インキュベーターの中で６日間インキュベート、その
時、各ウェルの内容物を多重チャンネルピペットで５回
ピペッティングすることにより混合した。50μｌのアリ
コートをＶ底マイクロタイターウェルに移し、それに既
知のHLAタイプの51Crラベル標的を加えた。溶解は４時
間の細胞障害アッセイで決定した（実施例２）。ウェル
は比溶解が＞10％なら陽性と表示した。CTL前駆体率を
コンピュータープログラムを用いて直線回帰分析により
決定した。
駆体からのCTLの分化に及ぼす効果について試験した。
その手順は、SkinnerとMarbrook（J.Exp.Med.143:1562;
1976）のそれを、下記のように改良したものである：正
常HLAタイプドナー由来のPBLをFicoll−Hypaqueで精製
し、そして丸底マイクロタイターウェルの中で、課題の
HLAアレルを発現する照射剤（10,000R）EBV形質転換Ｂ
−リンパ球芽細胞と同時培養した。レスポンダーPBLを
ウェル当り3000,6000,10000及び30000細胞で加え、また
刺激因子をウェル当り6000細胞で加えた。20−４のレプ
リケートを各レスポンダー細胞濃度について、10％の胎
児牛血清＋Ｌ−グルタミンの加えたRPMI−1640培地の中
で用意した。プレートを５％のCO2/95％のエアーの多湿
インキュベーターの中で６日間インキュベート、その
時、各ウェルの内容物を多重チャンネルピペットで５回
ピペッティングすることにより混合した。50μｌのアリ
コートをＶ底マイクロタイターウェルに移し、それに既
知のHLAタイプの51Crラベル標的を加えた。溶解は４時
間の細胞障害アッセイで決定した（実施例２）。ウェル
は比溶解が＞10％なら陽性と表示した。CTL前駆体率を
コンピュータープログラムを用いて直線回帰分析により
決定した。
B2702.60−84,Bw46.60−84及びBw62.60−84ペプチド
は全てCTLの分化を阻止し、他方、その他のペプチドは
何の効果も有さなかった。
は全てCTLの分化を阻止し、他方、その他のペプチドは
何の効果も有さなかった。
限界希釈分析により決定された、CTL前駆体率に 及ぼすHLA領域に対応するペプチドの効果 ペプチド 1/CTL前駆体率 B2705.60−84 164,245 B2702.60−84 3,349,990 B38.60−84 3,334,937 A2.160−84 164,245 Bio46.60−84 2,995,400 Bio62.60−84 2,995,400 B27,145−169 164,245 正常ドナー（HLA−A3;B7,38;Cw4;DR4.6）由来のPBLを
ty（HLA−A2;B7;DR4,6）又はHOM2（HLA−A3;B27）と、1
0〜100μg/mlのペプチドの存在下で培養した。６時間
後、溶解をHLA−A2.5又はHLA−B2705のいづれかを発現
する。51Cr−ラベルCIR細胞で試験した。結果をHLA−A2
特異的溶解について示すが、類似の結果がHLA−B27特異
的溶解について得られた。
ty（HLA−A2;B7;DR4,6）又はHOM2（HLA−A3;B27）と、1
0〜100μg/mlのペプチドの存在下で培養した。６時間
後、溶解をHLA−A2.5又はHLA−B2705のいづれかを発現
する。51Cr−ラベルCIR細胞で試験した。結果をHLA−A2
特異的溶解について示すが、類似の結果がHLA−B27特異
的溶解について得られた。
その結果はアレル特異的でなく、なぜならいくつかの
異なるHLA分子に特異的CTLの分化が阻害されたからであ
る。どのペプチドも、リンパ球応答及びミトゲン誘発増
列を含むクラスII制限応答に影響を及ぼさなかった。
異なるHLA分子に特異的CTLの分化が阻害されたからであ
る。どのペプチドも、リンパ球応答及びミトゲン誘発増
列を含むクラスII制限応答に影響を及ぼさなかった。
正常ドナー由来のPBLを５×105細胞／丸底マイクロタ
イターウェルで、10％の胎児牛血清及びL-グルタミンの
加えたRPMI−培地の中で培養した。培養物に、５×103
の照射済（10,000R）PBV形質転換Ｂリンパ球芽細胞又は
10μg/mlのフィタヘムアグルチニンＰ（PHA−Ｐ）のい
づれかを付加した。細胞を、37℃で、PHA−Ｐについて
は３日間、そして異質抗原については５日間インキュベ
ードし、そして3H−チミジンを加えた（２μli/ウェ
ル）。16時間後、ウェルを集め、そして3H−チミジンの
組込みをシンチレーションカウンターにより決定した。
イターウェルで、10％の胎児牛血清及びL-グルタミンの
加えたRPMI−培地の中で培養した。培養物に、５×103
の照射済（10,000R）PBV形質転換Ｂリンパ球芽細胞又は
10μg/mlのフィタヘムアグルチニンＰ（PHA−Ｐ）のい
づれかを付加した。細胞を、37℃で、PHA−Ｐについて
は３日間、そして異質抗原については５日間インキュベ
ードし、そして3H−チミジンを加えた（２μli/ウェ
ル）。16時間後、ウェルを集め、そして3H−チミジンの
組込みをシンチレーションカウンターにより決定した。
実施例14 溶解及び分化に及ぼすトランケート配列の効果 B2702.60−84とB2705.60−84ペプチドは３個のアミノ
酸でしか異ならないため、これらの相違の効果を調べる
ために更なるペプチドを作った。３つの異なるペプチド
を合成した： HLA−B2702.75−84 RENLRIALRY HLA−B2705.75−84 REDLRTLLRY HLA−B2702/05.60−69 WDRETQICKA 実施例13に記載の手順に従い、HLA−B2702/05の残基6
0−69に対応するペプチドは上記のアッセイで何の効果
もなかった。HLA−B2702の残基75−84に対応するペプチ
ドはクラスＩ特異的CTL応答の全てを阻止し、一方、HLA
−B2705の同じ領域に対応するペプチドは阻止しなかっ
た。
酸でしか異ならないため、これらの相違の効果を調べる
ために更なるペプチドを作った。３つの異なるペプチド
を合成した： HLA−B2702.75−84 RENLRIALRY HLA−B2705.75−84 REDLRTLLRY HLA−B2702/05.60−69 WDRETQICKA 実施例13に記載の手順に従い、HLA−B2702/05の残基6
0−69に対応するペプチドは上記のアッセイで何の効果
もなかった。HLA−B2702の残基75−84に対応するペプチ
ドはクラスＩ特異的CTL応答の全てを阻止し、一方、HLA
−B2705の同じ領域に対応するペプチドは阻止しなかっ
た。
どの残基が阻害効果を媒介するかを調べるため、更に
３つのペプチドを合成、それにおいては１個のアミノ酸
変化を残基77,80及び81に導入して、その位置でB2702配
列をB2705配列へと変換した。B2702.75−84（Ｄ）及びB
2702.75−84（Ｌ）ペプチドは現存のCTLによる溶解及び
pre−CTLの分化を阻止し続けたが、B2702.75−84（Ｔ）
ペプチドは阻害活性を有していなかった。従って、位置
80でのイソロイシンが阻害のために必要であった。
３つのペプチドを合成、それにおいては１個のアミノ酸
変化を残基77,80及び81に導入して、その位置でB2702配
列をB2705配列へと変換した。B2702.75−84（Ｄ）及びB
2702.75−84（Ｌ）ペプチドは現存のCTLによる溶解及び
pre−CTLの分化を阻止し続けたが、B2702.75−84（Ｔ）
ペプチドは阻害活性を有していなかった。従って、位置
80でのイソロイシンが阻害のために必要であった。
HLA−B2702.75−84（Ｄ） REDLRIALRY HLA−B2702.75−84（Ｔ） RENLRTALRY HLA−B2702.75−84（Ｌ） RENLRILLEY B2702.60−84,B38.60−84及びB2702.75−84はプラス
チックに予め結合させておいたとき、細胞が結合するこ
とを引き起こすことも下記のアッセイにより見い出され
た。その他のどのペプチドもこの効果を有することが見
い出せなかった。しかしながら、B2702.60−84ペプチド
を残基67にあるシステインを介して牛血清アルブミン又
はビーズに抱合させたとき、その阻止効果及びプラスチ
ックに細胞を結合させる能力は失われた。
チックに予め結合させておいたとき、細胞が結合するこ
とを引き起こすことも下記のアッセイにより見い出され
た。その他のどのペプチドもこの効果を有することが見
い出せなかった。しかしながら、B2702.60−84ペプチド
を残基67にあるシステインを介して牛血清アルブミン又
はビーズに抱合させたとき、その阻止効果及びプラスチ
ックに細胞を結合させる能力は失われた。
このプラスチック結合手順は下記の通りであ：ペプチ
ド（100μg/ml）をPBSの中に溶かし、そして50μｌを丸
板マイクロタイターウェルに、又は５〜10μｌをペトリ
皿に加えた。37℃で60分又は４℃で一夜後、その溶液を
除去し、そしてそのプレートを10％の胎児牛血清の加え
たRPMI−1640培地で２回洗った。細胞を加え、そして４
℃で30分インキュベートした。ペトリ皿への結合は、そ
の皿をゆっくり撹拌してから顕微鏡で観察することによ
り決定した。マイクロタイターウェルへの結合は、500r
pmで３分遠心した後に決定した。結合しなかった細胞ウ
ェルの底に小さなペレットを形成し、一方、結合した細
胞はペレットを形成しない。
ド（100μg/ml）をPBSの中に溶かし、そして50μｌを丸
板マイクロタイターウェルに、又は５〜10μｌをペトリ
皿に加えた。37℃で60分又は４℃で一夜後、その溶液を
除去し、そしてそのプレートを10％の胎児牛血清の加え
たRPMI−1640培地で２回洗った。細胞を加え、そして４
℃で30分インキュベートした。ペトリ皿への結合は、そ
の皿をゆっくり撹拌してから顕微鏡で観察することによ
り決定した。マイクロタイターウェルへの結合は、500r
pmで３分遠心した後に決定した。結合しなかった細胞ウ
ェルの底に小さなペレットを形成し、一方、結合した細
胞はペレットを形成しない。
結合は４°,25°及び37°で同等に起こり、そして外
生的に付加した二価カチオンに依存せず、なぜなら結合
はEDTA含有培地の中で観察されたからである。しかしな
がら、もし細胞を１％のNaN3とプレインキュベートする
か、又はパラホルムアルデヒドで固定すると、結合は観
察されず、生存細胞そして最もおそらくはATPの作製が
必要とされることを示唆している。
生的に付加した二価カチオンに依存せず、なぜなら結合
はEDTA含有培地の中で観察されたからである。しかしな
がら、もし細胞を１％のNaN3とプレインキュベートする
か、又はパラホルムアルデヒドで固定すると、結合は観
察されず、生存細胞そして最もおそらくはATPの作製が
必要とされることを示唆している。
実施例15 ラット異所性（ヘテロトピック）心臓移植生存の延期に
及ぼすペプチドの効果 ペプチド白体又は免疫抑制薬についての効果を調べる
ため、DA又はルイスラットにPVG（ギニアピッグ）ドナ
ー由来の腹部異所性心臓同種移植片を付与した。移植片
受容体（グループ当り10〜12匹）は、処置を施さないか
（グループ１）又は別の療法を施した（グループii〜v
i）。移植生存を、移植心臓鼓動触診によって評価し
た。グループiiの動物には２〜10mgのB2702.75−84、I.
V.を、移植の７〜10日前に注射した。わずかではあるが
有意な移植生存の延期がグループii処置動物において認
められた。
及ぼすペプチドの効果 ペプチド白体又は免疫抑制薬についての効果を調べる
ため、DA又はルイスラットにPVG（ギニアピッグ）ドナ
ー由来の腹部異所性心臓同種移植片を付与した。移植片
受容体（グループ当り10〜12匹）は、処置を施さないか
（グループ１）又は別の療法を施した（グループii〜v
i）。移植生存を、移植心臓鼓動触診によって評価し
た。グループiiの動物には２〜10mgのB2702.75−84、I.
V.を、移植の７〜10日前に注射した。わずかではあるが
有意な移植生存の延期がグループii処置動物において認
められた。
グループiiiは動物の半治療的用量のシクロスポリン
Ａ（CsA）で処置した（20mg/kg、経口、０〜４日目に毎
日）。これらの動物は移植して15日後にその移植片を拒
絶した。グループivの動物にはラット当りの10mgのB.27
02−75−84を、移植の７日及び１日前に与え、０日目に
心臓同種移植を施し、次いでグループiiiのようにCsA
（20mg/kg）で０〜４日目において処置した。非常に有
意な移植生存の延期が認められ、これらの動物のうちの
約40％が100日以上その移植片を維持した。
Ａ（CsA）で処置した（20mg/kg、経口、０〜４日目に毎
日）。これらの動物は移植して15日後にその移植片を拒
絶した。グループivの動物にはラット当りの10mgのB.27
02−75−84を、移植の７日及び１日前に与え、０日目に
心臓同種移植を施し、次いでグループiiiのようにCsA
（20mg/kg）で０〜４日目において処置した。非常に有
意な移植生存の延期が認められ、これらの動物のうちの
約40％が100日以上その移植片を維持した。
グループＶの動物はグループＶのように半治療用量の
抗−胸腺細胞グロブリン（ATG,20mg/kg I.V.,−３及び
−２日目）で、そして−１及び０日目に10mg I.V.のB.2
702.75−84で処置し、そして０日目に心臓同種移植を施
した。これらの動物もその移植の有意義な延期を示し
た。
抗−胸腺細胞グロブリン（ATG,20mg/kg I.V.,−３及び
−２日目）で、そして−１及び０日目に10mg I.V.のB.2
702.75−84で処置し、そして０日目に心臓同種移植を施
した。これらの動物もその移植の有意義な延期を示し
た。
更に、60％以上のラットがペプチドB7.75−84（RESLR
NLRGY）で処置したときに＞100日にわたってその移植片
を維持した。採用したペプチドはヒトHLAペプチドであ
り、ラットペプチドでないことに注目すべきである。に
もかかわらず、これらのペプチドは強い活性を示した。
NLRGY）で処置したときに＞100日にわたってその移植片
を維持した。採用したペプチドはヒトHLAペプチドであ
り、ラットペプチドでないことに注目すべきである。に
もかかわらず、これらのペプチドは強い活性を示した。
以下の表でその結果をまとめた。
実施例16 細胞性タンパク質に対するB.2702.75−84ペプチドの結
合性 細胞をラジオラベルし、そしてリゼートを、B.2又は
無関係ペプチドでコートしたマイクロタイターウェルに
結合させた。108のCD8+Ｔ細胞を、10％の透析胎児牛血
清及び1mMのＬ−グルタミンの付加したシステイン−メ
チオニン無含有RPMI−1640の中でそれらを4hにわたり予
備培養することにより、システイン及びメチオニンの内
部貯蔵を枯渇させた。35S−メチオニン及びシステイン
（5mCiづつ）を加え、そして細胞を37℃で更に4hインキ
ュベートした。これらの細胞をペレット化し、そして1m
lの溶解バッファー（10mMのCHAPS、１μg/mlのロイペプ
チン、0.2mMのPMSF、0.03％のアジ化ナトリウム、150mM
のNaCl、50mMのトリス−HCl、pH8.0）の中に再懸濁させ
た。細胞を２周期の凍結融解により溶解させ、そして核
を20,000gで20分の遠心によりペレット化した。その上
清液を取出し、そして100μｌを、ペプチド又は抗−ク
ラスIMHC抗体PA2.6で予備コートしたマイクロタイター
ウェル（50μg/ml、200μl/ウェル、PBS/2％の胎児牛血
清で洗浄及びブロック）に加えた。各ペプチドについて
６レプリケートのウェルを用意した。このプレートを４
℃で一夜ローテーター上でインキュベートし、その上清
液を除去し、そして各ウェルをPBS/2％の胎児牛血清で
２回、そして0.5％のノニデットｐ−40、0.1％のデオキ
シコレート及び0.05％のドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）の付加されたPBSで１回洗った。結合タンパク質を２
％のSDSを含むバッファーで溶離させ、そして11％のSDS
−PAGEで分離した。ラベルタンパク質の識別化のため、
そのゲルをEnhanceに浸した。このペプチドB.2702.75−
84は27kDの分子に結合していることが示された。更に、
CTLによる細胞溶解の阻害にとって重要であると示され
た同じ残基も27kDの分子に結合した。
合性 細胞をラジオラベルし、そしてリゼートを、B.2又は
無関係ペプチドでコートしたマイクロタイターウェルに
結合させた。108のCD8+Ｔ細胞を、10％の透析胎児牛血
清及び1mMのＬ−グルタミンの付加したシステイン−メ
チオニン無含有RPMI−1640の中でそれらを4hにわたり予
備培養することにより、システイン及びメチオニンの内
部貯蔵を枯渇させた。35S−メチオニン及びシステイン
（5mCiづつ）を加え、そして細胞を37℃で更に4hインキ
ュベートした。これらの細胞をペレット化し、そして1m
lの溶解バッファー（10mMのCHAPS、１μg/mlのロイペプ
チン、0.2mMのPMSF、0.03％のアジ化ナトリウム、150mM
のNaCl、50mMのトリス−HCl、pH8.0）の中に再懸濁させ
た。細胞を２周期の凍結融解により溶解させ、そして核
を20,000gで20分の遠心によりペレット化した。その上
清液を取出し、そして100μｌを、ペプチド又は抗−ク
ラスIMHC抗体PA2.6で予備コートしたマイクロタイター
ウェル（50μg/ml、200μl/ウェル、PBS/2％の胎児牛血
清で洗浄及びブロック）に加えた。各ペプチドについて
６レプリケートのウェルを用意した。このプレートを４
℃で一夜ローテーター上でインキュベートし、その上清
液を除去し、そして各ウェルをPBS/2％の胎児牛血清で
２回、そして0.5％のノニデットｐ−40、0.1％のデオキ
シコレート及び0.05％のドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）の付加されたPBSで１回洗った。結合タンパク質を２
％のSDSを含むバッファーで溶離させ、そして11％のSDS
−PAGEで分離した。ラベルタンパク質の識別化のため、
そのゲルをEnhanceに浸した。このペプチドB.2702.75−
84は27kDの分子に結合していることが示された。更に、
CTLによる細胞溶解の阻害にとって重要であると示され
た同じ残基も27kDの分子に結合した。
実施例17 結合及び細胞性効果におけるペプチド活性 先に記載の手順に従い、いくつかの異なるペプチドを
その活性について調べた。特に、まれなHLA−Ｅ及びＧ
抗原のペプチドをHLA−Ａ及びＢ抗原のペプチドと比較
した。以下の表に結果を示す。
その活性について調べた。特に、まれなHLA−Ｅ及びＧ
抗原のペプチドをHLA−Ａ及びＢ抗原のペプチドと比較
した。以下の表に結果を示す。
上記の結果から、クラスI MHC抗原の多形領域のフラ
グメントは、CTL活性の調節、並びにクラスI MHC抗原及
びかかる抗原に結合するタンパク質の結合にかかわるそ
の他の目的において有用でありうることが明らかであ
る。課題の組成物は例えば移植のケースにおけるような
標的に対するCTL毒性であって、そのような活性が所望
されない状況でのその阻止にとって利用されうる。他
方、課題の組成物はCTLに分子を誘導するのに利用され
うる。他方、課題のペプチドは、課題の抗原に抱合させ
て、CTLにより認識されるもの以外の抗原を保有する細
胞を溶解するようにCTLを活性化させ、その故寄生病及
び新形成におけるような宿主に隠れた抗原を保有する細
胞を溶解するためにCTLを誘発させうる。課題の化合物
はウィルス感染症のケースにおけるＴ−細胞の抑制にか
かわるMHC配列の決定のためのウィルス研究におてい有
用でありうる。このペプチドは特定のMHC抗原の中のペ
プチドに特異的に結合するＴ細胞を同定するのにも利用
できうる。従って、CTLのサブセットを単離でき、特定
のCTLの存在を同定することができ、これは同種異系移
植の成功を予測するうえで有用であることがあり、又は
治療的手段が保証されているとき、レパートリーにおけ
る寛容化又は穴（holes）の調査において、及び自己免
疫疾患の検査において有用でありうる。
グメントは、CTL活性の調節、並びにクラスI MHC抗原及
びかかる抗原に結合するタンパク質の結合にかかわるそ
の他の目的において有用でありうることが明らかであ
る。課題の組成物は例えば移植のケースにおけるような
標的に対するCTL毒性であって、そのような活性が所望
されない状況でのその阻止にとって利用されうる。他
方、課題の組成物はCTLに分子を誘導するのに利用され
うる。他方、課題のペプチドは、課題の抗原に抱合させ
て、CTLにより認識されるもの以外の抗原を保有する細
胞を溶解するようにCTLを活性化させ、その故寄生病及
び新形成におけるような宿主に隠れた抗原を保有する細
胞を溶解するためにCTLを誘発させうる。課題の化合物
はウィルス感染症のケースにおけるＴ−細胞の抑制にか
かわるMHC配列の決定のためのウィルス研究におてい有
用でありうる。このペプチドは特定のMHC抗原の中のペ
プチドに特異的に結合するＴ細胞を同定するのにも利用
できうる。従って、CTLのサブセットを単離でき、特定
のCTLの存在を同定することができ、これは同種異系移
植の成功を予測するうえで有用であることがあり、又は
治療的手段が保証されているとき、レパートリーにおけ
る寛容化又は穴（holes）の調査において、及び自己免
疫疾患の検査において有用でありうる。
ペプチド化合物の一般的な阻止能力は全てのHLAタイ
プ、特に器官移植片との一般的利用を可能にするであろ
う。現存のCTLによる溶解に対してではなく、CTLの発生
に及ぼすこのペプチド化合物の特異的な効果は、ドナー
の特異的な応答の発生を阻止しながら、記憶応答を共有
することを可能にする。
プ、特に器官移植片との一般的利用を可能にするであろ
う。現存のCTLによる溶解に対してではなく、CTLの発生
に及ぼすこのペプチド化合物の特異的な効果は、ドナー
の特異的な応答の発生を阻止しながら、記憶応答を共有
することを可能にする。
本明細書に記載の全ての文献及び特許出願は、引用す
ることで本明細書に組入れる。
ることで本明細書に組入れる。
上記に本発明を理解の目的で詳しく説明してきたが、
当業者は本発明の教示により、本発明の範囲を逸脱する
ことなく本発明の一定の変更及び改質をなし得ることを
理解するであろう。
当業者は本発明の教示により、本発明の範囲を逸脱する
ことなく本発明の一定の変更及び改質をなし得ることを
理解するであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クレンスキー，アラン エム. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94305，スタンフォード，メイフィール ド アベニュ 812 (56)参考文献 米国特許5073540（ＵＳ，Ａ) 国際公開88／5784（ＷＯ，Ａ１) 国際公開90／10016（ＷＯ，Ａ１) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙ（1989）Ｖｏｌ．143，Ｎｏ５, ｐ．1441−1446 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙ（1990）Ｖｏｌ．144，Ｎｏ. ８ ｐ．3228−3233 Ｉｍｍｕｎｏｇｏｎｅｔｉｃｓ （1987）Ｖｏｌ．25，Ｎｏ．５，ｐ. 313−322 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/74 A61K 38/17 G01N 33/53 ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (13)
- 【請求項１】CTLと接触したときにかかるCTLの活性を阻
害することのできるペプチド因子であって、30個以下の
アミノ酸の長さを有し、且つ次式のアミノ酸配列 RX1X
2LX3X4X5X6X7Y （ここで： X1はＥ及びＶより成る群から選ばれ、 X2はD,S及びＮより成る群から選ばれ、 X3はＲ及びＧより成る群から選ばれ、 X4はＩ及びＮより成る群から選ばれ、 X5はＬ及びＡより成る群から選ばれ、 X6はＲ及びＬより成る群から選ばれ、そして X7はＧ及びＲより成る群から選ばれる） を含んで成り、前記CTL活性をアレル非特異的な態様で
阻害することのできる、前記ペプチド。 - 【請求項２】前記式RX1X2LX3X4X5X6X7YがMHCクラスＩの
Ｂ型アレルのアルファー−１ドメインの残基75〜84に相
当する請求項１記載のペプチド化合物。 - 【請求項３】前記式RX1X2LX3X4X5X6X7YがヒトMHCクラス
ＩのHLA−Ｂ型アレルのアルファー−１ドメインの残基7
5〜84に相当する請求項１記載のペプチド化合物。 - 【請求項４】前記ヒトHLA−Ｂ型アレルがB2702,B38,B7,
B62及びBw46アレルより成る群から選ばれる、請求項３
記載のペプチド化合物。 - 【請求項５】前記ヒトHLA−Ｂ型アレルがB2702及びB7ア
レルより成る群から選ばれる、請求項４記載のペプチド
化合物。 - 【請求項６】前記ペプチドが下記の群： より選ばれるアミノ酸配列より成る、請求項１記載のペ
プチド。 - 【請求項７】検出可能な成分に共有結合した、請求項１
記載のペプチド。 - 【請求項８】固相支持体に結合した、請求項１記載のペ
プチド。 - 【請求項９】CTLのCTL活性を調節する方法であって： CTLを、CTL活性を調節する量ののペプチド化合物と組合
せることを含んで成り、ここで当該ペプチド化合物は30
個以下のアミノ酸の長さであり、且つヒトクラスＩのHL
Aアルファー１−ドメインの配列を有し、請求項１記載
の配列に属することを特徴とする、方法。 - 【請求項１０】前記ペプチド化合物が、前記配列を含ん
で成る天然HLA抗原の野生型配列以外の配列に少なくと
も一方の末端で連結したものであり、そして連結してい
ないとき、前記配列で終結するものである、請求項９記
載の方法。 - 【請求項１１】前記ペプチドが次の配列： 又は少なくとも10個のアミノ酸のそのフラグメントであ
るか、又は前記配列が、前記配列を含んで成る天然HLA
抗原の野生型配列以外の配列に少なくとも一方の末端で
連結したものであり、そして連結していないとき、前記
配列で終結するものである、請求項９記載の方法。 - 【請求項１２】前記ペプチドがHLA−Ｂ抗原のアミノ酸7
5−84を含んで成る、請求項９記載の方法。 - 【請求項１３】CTLの分化を阻止する方法であって： CTLを、分化を阻止するのに十分な量の下記の群： より選ばれる配列を含んで成るペプチドと接触させるこ
とを含んで成る方法。
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