PT631502E - Regulacao da actividade de linfocitos por peptidos hla - Google Patents

Description

85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ DESCRICÃO "Regulação da actividade de linfócitos por péptidos HLA"

Campo técnico O presente invento refere-se à regulação de linfócitos T citotóxicos utilizando fragmentos peptídicos de péptidos HLA de classe I.

Antecedentes

As células T citotóxicas, em particular os linfócitos T citotóxicos ("CTL"), são restritos na sua actividade, reconhecendo um antigénio específico do complexo de histocompatibilidade prineipal ("MHC") na superfície da célula alvo, bem como um péptido ligado numa fenda do antigénio de MHC. O antigénio estranho pode ser resultado de um transplante a partir de um hospedeiro alogénico, de uma infecção virai, de uma mutação, de uma neoplasia, ou semelhantes. 0 envolvimento da proteína do MHC parece ser essencial ao ataque pelos CTL contra a célula que inclui o antigénio estranho. Os CTL, ao monitorizar a presença de antigénios estranhos, são capazes de destruir células, que se de algum outro modo conseguissem proliferar, resultariam na proliferação de patogénios ou de células neoplásicas.

Ao monitorizar a presença de antigénios estranhos, os CTL também reconhecem transplantes de órgãos, tecidos e células que provêm de hospedeiros alogénicos. De modo a proteger um transplante dos CTL, utilizam-se vários processos imunossupressores. Estes processos são frequentemente insatisfatórios, na medida em que não são completamente protectores, tornando o paciente susceptível a uma infecção oportunista.

Tendo em conta o grande interesse na capacidade para aumentar ou diminuir o número de CTL e a sua actividade, há a oportunidade excelente para o desenvolvimento de novas técnicas que permitam a regulação dos CTL, proporcionando ao mesmo tempo uma protecção substancial contra os patogénios. 2 85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ

Literatura relevante

Clayberger et a!., J. Exp. Med. (1985) 11:1709-1714 descrevem o antigénio HLA-A2 em comparação com HLA-Aw68 e Aw69. Townsend et ai, Cell (1986) 44:959-968 sugerem que o CTL reconhece epítopos segmentais de proteínas desnaturadas ou degradadas, de um modo semelhante ao das células T ajudantes. Holmes e Parham, EMBO J.. (1985) 4:2849-2854 descrevem a relação entre HLA-A2, Aw68 e Aw69. Pensa-se que a especificidade do CTL para o alvo é extremamente sensível a alterações na estrutura das moléculas de classe I humanas (Duma e Pease, Transplantation, (1986) 41:279-285: Biddison, et ai, J. Immunol., (1980) 124:548-552: Spits, et ai, Immunoqenetics. (1982) 16:503-512: Gaston et ai, J. Exp. Med (1983) 158:280-293).

Os mutantes que afectam o reconhecimento pelos CTL têm sido estudados em ratinhos (Nathenson et ai, Ann. Rev. Immunol. (1986) 4:471-502: Schulz, et ai, Proc. natl. Acad. Sei. USA (1983) 80:2007-2011) e humanos (Krangel, Biochemistrv (1982) 21:6313-6321: Krangel et ai, J^. Immunol. (1983) 130:1856-1862: Cowan et a!., J. Immunol. (1985) 135:2835-2841: Taketani et ai, ibid (1984) 133:816-821; e Vega et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1 985) 82:7394-7398).

Estes relatórios têm dado particular atenção à região entre os resíduos 147 e 157, embora outras regiões possam também produzir diferenças funcionais (Ezquerra, et ai, J. Immunol (1985) 134:2727-2733, WO-A-90/10016). Tem sido referida uma variabilidade de agrupamentos na extremidade do terminal carboxi do primeiro domínio extracelular e do terminal amino do segundo domínio extracelular (Ways, et ai, J. Biol. Chem. (1985) 26:11924-11933). As sequências entre os resíduos 105-108 de todas as moléculas de classe I estão relacionadas com as do tetrapéptido de ligação à fibronectina (Auffray e Novotny, J. Human Immunoloav (1986) 15:381-390), o qual se verifica ter, em qualquer das orientações, propriedades de ligação a células (Pierschbacher e Ruoslahti, Nature (1984) 309:30-33; Yamada e Kennedy, J. Cell. Biol. (1985) 28:99-104). Salter et ai, J. Exp. Med. (1987) 166:283-288 referem uma substituição na posição 107 que afecta um único epítopo definido do anticorpo monoclonal para o HLA-A2.

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SUMÁRIO DO INVENTO

Os métodos e composições são dados com base na sequência dos domínios a1 e a2 do antigénio de classe I. Estes fragmentos incluem pelo menos uma porção dos aminoácidos entre as posições 55 e 120 dos antigénios de classe I e são utilizados para modular a actividade de linfócitos T citotóxicos ("CTL") em relação a células alvo. Diferentes péptidos podem desencadear diferentes efeitos em relação aos CTL, ou subconjuntos de CTL.

DESCRICÃO SUMÁRIA DAS FIGURAS A Fig. 1 mostra o tamanho mínimo da sequência peptídica, necessário para a inibição da citólise por CTL específico para HLA-A2 A Fig. 2 mostra o efeito do pré-tratamento de CTL e de células alvo na inibição da citólise por CTL específico para HLA-A2. A Fig. 3 mostra o efeito do péptido A2.98-113 na libertação de grânulos que contêm serina-esterase, durante a citólise de células alvo, por CTL. A Fig. 4 mostra a sequência de consenso de péptidos que constituem as regiões ct1, a2 e a3 de uma molécula de HLA de classe I, bem como as alterações nestas sequências, em diferentes moléculas de HLA específicas. A Fig. 5 mostra o efeito de péptidos de diferentes epítopos de HLA-A2 na citólise de células alvo por CTL de diferentes especificidades. A Fig. 6 mostra a sensibilização de uma célula alvo HLA-Aw69 à citólise por células do clone A2/B17, provocada pelo péptido A2.56-69. A Fig. 7 mostra o efeito na sensibilização da incubação de células alvo ou células do clone A2/B17 com o péptido A2.56-69.

DESCRICÃO DAS CONCRETIZAÇÕES ESPECÍFICAS

De acordo com o presente invento, a actividade de CTL num paciente é modulada por administração ao paciente de uma sequência da região 4 85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ polimórfica de antigénios do complexo de histocompatibilidade principal de classe I, do hospedeiro. A região polimórfica compreende os domínios a1 e <x2, sendo o domínio a1 de interesse particular, mais particularmente os resíduos do péptido em hélice a1. Os antigénios de classe I nos humanos são designados por A, B, C, E, F e G, dos quais têm particular interesse os antigénios A, B, E e G.

Além de modular a actividade dos CTL, os péptidos do invento podem também ser utilizados para identificar os CTL que se ligam a um péptido particular, removendo subconjuntos particulares de CTL de uma composição de células T ou porções suas derivadas e semelhantes. Na sua maioria, as composições do invento compreenderão composições puras, ou composições formuladas de um péptido de pelo menos 8 aminoácidos, normalmente pelo menos 12 aminoácidos, tendo desde uma sequência que está incluída na sequência alargada e até a sequência alargada completa:

aa55 G P E Y W D aa82 aa63 T aa35 aa66 aa37 K aa69 aa70 aa71 Q T aa74 R aa76 aa77 L aa79 aa80 aa81 aa82 aa83 YYNQSEAGSH aa94 aa95 Q aa97 M aa99 G C D aa103 G aa105 D aa107 R aa109 L R G aa113 aa114 Q aa'16 A Y D G em que: aa55 é E ou K, particularmente E; aa62é G, Q, E ou R, particularmente R ou G; aa63é um aminoácido ácido ou uma sua amida, particularmente E; aa65é Q, R ou G, particularmente Q ou R; aa66é I, N ou K, particularmente I ou K; aa67 é um aminoácido alifático, neutro ou Y, particularmente C, S, V ou Y; aa69é um aminoácido alifático, neutro ou básico, particularmente A, R ou T; aa70é Q, H, S, N ou K; aa71 é um aminoácido alifático neutro, particularmente A, L, S ou T; aa74é D, Y ou H; aa76 é E, V ou M; aa77 é D, S, A, G ou N; aa79 é R, Q ou G; aa80 é T, I ou N; aa81 é um aminoácido alifático, não polar, particularmente A ou L; aa82 é R ou L;

85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ 5 aa83 é G ou R; aa94 é T ou I; aa95é um aminoácido alifático não polar de 5 a 6 átomos de carbono; aa97é um aminoácido alifático ou W; aa"é um aminoácido aromático; aa103é um aminoácido alifático não polar, de 5 a 6 átomos de carbono; aa'05 é P ou S; aa107é G ou W·; aa109 é L ou F; aa113é Y ou H; aa114é H, Q, D, N ou R; aa1l6é Y, D, S, F ou H; que modula a actividade de CTL.

Um subconjunto de péptidos de interesse particular está incluído na seguinte sequência alagada: G S H aa94 aa95 Q aa97 M aa" G C D aa103 G aa105 D aa'07 R aa109 L R G aa113 aa114 Q aa116 A Y D G em que: aa94 é T ou I; aa95 é um aminoácido alifático não polar de 5 a 6 átomos de carbono aa97 é um aminoácido alifático ou W; aa99 é um aminoácido aromático; aa103 é um aminoácido alifático não polar de 5 a 6 átomos de carbono; aa'05 é P ou S; aa107 é G ou W; aa109 é L ou F; aa113 é Y ou H; aa114 é H, Q, D, N, ou R; aa116 é Y, D, S, F ou H.

Um outro subconjunto de sequências de particular interesse, que estão incluídas na sequência alargada acima descrita, são as sequências incluídas na sequência alargada:

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aa55 G Ρ Ε Υ W D aa62 aa63 Τ aa65 aa66 aa67 K aa69 aa70 aa71 Q T aa74 R aa76 aa77 L aa79 aa80 aa81 aa82 aa83 Y Y N Q S E A em que aa55 é E ou K, particularmente E; aa62 é G, Q, E, ou R, particularmente R ou G; aa63 é um aminoácido ácido ou uma sua amida, incluindo E e N, particularmente E; aa65 é Q, R ou G, particularmente Q ou R; aa66 é I, N ou K, particularmente N ou K; aa67 é um aminoácido neutro alifático, incluindo V, M, S, C e Y, particularmente V; aa69 é um aminoácido neutro alifático, incluindo A, T e P, particularmente A; aa70 é Q, H, S, N ou K, particularmente Q ou H; aa71 é um aminoácido neutro alifático, incluindo S, A e T, particularmente S; aa74 é D, Y ou H, particularmente D ou H; aa76 é E ou V; aa77 é D, S ou N, particularmente D; aa79 é R ou G, particularmente G; aa80 é Τ, I ou N, particularmente T ou I; aa81 é um aminoácido não polar alifático, incluindo L ou A, em particular L; aa82 é R ou L, particularmente R; aa83 é G ou R, particularmente G.

Uma outra série de péptidos de pelo menos 8 aminoácidos de interesse particular está incluída na sequência alargada: Q E G P E Y W D (G ou R) (E ou N) T (R ou Q) (K ou N) V K A (H ou Q) S Q Τ (H ou D) R (V, M ou E) (D, S ou N) L (G ou R) (T ou I) (L ou A) (R ou L) (G ou R) Y Y N Q S E A.

De interesse particular são os oligopéptidos de cerca de 10 a 25 aminoácidos, que têm como sequência activa uma das seguintes sequências:

R (Ε, V ou Μ) (N ou S) L (R ou Q) (I, N ou Τ) (A ou L) (L ou R) (R ou G) Y 1 i 85 665

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Outras sequências alargadas, das quais têm interesse 8 fragmentos de aminoácidos incluem: TLQRMYGCDVGSDWRFLRG, MYGCDVGSDWRFLRGY, MYGCDVGSDGRFLRGY, GPEYWDGETRKVKA, WDRETQICKAKAQTDR(NouD) L R (I ou T) (A ou L) LRYY, WDRETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGY, WDRETQISKTNTQTYRESLRNLRGY, e WDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGY.

De interesse particular são as sequências mais curtas: RENLRIALRY; RESLRNLRGY; RVNLRTLRRY; RMNLQTLRGY; REDLRTLLRY; WDRETQICKA.

Entre as sequências de interesse incluem-se as sequências no domínio <x1, nomeadamente a sequência de aminoácidos das posições 55-85, mais particularmente 55-80 ou 70-85, que incluem desejavelmente na sequência um tetrapéptido DGET, GETR, DRAT, YWDG, RE(N ou D)L ou (A ou L)LRY. É de interesse particular para o domínio a2 a sequência de aminoácidos das posições 90-112, mais particularmente 94-116, incluindo desejavelmente na sequência, um tetrapéptido STWR ou SDGR.

Os péptidos de interesse que servirão como péptido de ligação ao receptor terão pelo menos 8 aminoácidos, normalmente pelo menos 10 aminoácidos, mais usualmente pelo menos 12 aminoácidos, tendo frequentemente 15 ou mais aminoácidos e normalmente não mais que cerca de 30 aminoácidos, mais usualmente não mais que cerca de 25 aminoácidos, tendo desejavelmente cerca de 12 a 25 aminoácidos. A sequência de aminoácidos não diferirá usualmente de uma sequência que ocorre naturalmente, em mais que 2 aminoácidos, ou mutações, e.g. deleções ou 8 85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ inserções, mais usualmente em não mais que 1 aminoácido. A sequência utilizada será usualmente das regiões polimórficas da metade de terminal-C do domínio a1 ou da metade de terminal-N do domínio a2, do antigénio MHC do hospedeiro das células T restritas do MHC, em particular um antigénio do grupo HLA-A, -B, -E ou -G. É de interesse particular uma sequência ou fragmento de sequência de pelo menos 8 aminoácidos de sequência:

G S Η T (V, I ou L) Q R Μ Y G C D V G S D (W ou G) R F L R G Y H Q Y A Y D G

Quando há dois ou mais aminoácidos indicados no mesmo local, pode estar presente qualquer dos aminoácidos indicados. A região de interesse particular será a região das posições de aminoácidos 110 a 116.

Os péptidos do invento podem ser modificados de diversas maneiras. Os péptidos podem ser ligados por ligações covalentes, em qualquer local conveniente no péptido, a uma variedade de outros compostos, para diferentes fins. Assim, os péptidos podem ser ligados a imunogénios para administração a um hospedeiro a imunizar, para produção de anticorpos, ou podem ser ligados a uma sequência do MHC não adjacente do antigénio do MHC particular, por meio de síntese, expressão de um gene sintético ou semelhantes; ligado a um lípido ou grupo polialquilenoxi; ligado a um açúcar; ou ligado a um ácido nucleico. É de interesse particular a ligação dos péptidos do invento a outro péptido, por síntese ou expressão de um gene sintético, em que o outro péptido proporciona uma estabilidade alargada aos péptidos do invento, quando administrados a um hospedeiro. Podem-se utilizar diversos péptidos, tais como a região constante de imunoglobulinas, e.g. IgGFc. Alternativamente, os péptidos do invento podem ser ligados a uma toxina, como a toxina da difteria, rícino, abrina, etc, particularmente quando a cadeia de ligação foi removida ou inactivada, de modo a impedir a ligação da cadeia de ligação às células.

Os péptidos do invento podem ser ligados uns aos outros, para proporcionar um único polipéptido com uma multiplicidade de actividades, ou

85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ 9 podem ser combinados numa mistura, para proporcionar a mesma actividade geral.

As classes de aminoácidos são designadas como se segue: alifático

não polar G, A, P, L, I, V polar neutro C, S, T, Μ, N, Q ácido D, E básico K, R aromático F, H, W, Y

Os péptidos podem ser preparados de várias formas. De modo conveniente, podem ser sintetizados por técnicas convencionais, utilizando sintetizadores automáticos, tais como o aparelho sintetizador de péptidos da Beckman, Applied Biosystems Inc., ou outros aparelhos úteis, ou podem ser sintetizados manualmente. Alternativamente, podem-se preparar sequências de ADN que codificam para o péptido particular e podem-se clonar e expressar para proporcionar o péptido desejado. Neste caso, o primeiro aminoácido pode ser uma metionina.

Os péptidos podem ser também isolados a partir de fontes naturais e purificados por técnicas conhecidas, incluindo, por exemplo, cromatografia em materiais de permuta iónica, separação por tamanho, cromatografia de imunoafinidade e electroforese. Tal como aqui utilizada, a expressão "uma preparação substancialmente pura de um composto peptídico" significa uma preparação do péptido que está normalmente mais que cerca de 70% isenta de materiais com os quais o polipéptido está naturalmente associado e de preferência mais do que cerca de 80% isento destes materiais; estes materiais, no entanto, excluem materiais com os quais o péptido pode ser misturado na preparação de composições farmacêuticas. As sequências podem ser modificadas de várias formas, dependendo da sua finalidade. Podem-se introduzir diferentes grupos nos terminais N ou C, que permitem a ligação do péptido a substratos sólidos ou outras moléculas. Num processo sintético, pode-se introduzir qualquer molécula no terminal N ou C, que permitirá uma reacção subsequente, dependendo da finalidade para a qual o péptido é preparado. 10 85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ

Para fins de diagnóstico, podem-se ligar uma diversidade de marcadores ao terminal, o que pode proporcionar, directa ou indirectamente, um sinal detectável. Por exemplo podem-se introduzir materiais fluorescentes no terminal, ou outras moléculas que proporcionem uma ligação a marcadores como materiais fluorescentes, enzimas, partículas ou semelhantes. Por exemplo, pode-se introduzir uma ligação no terminal, e.g. biotina, que se ligará a um conjugado de avidina com enzimas ou materiais fluorescentes. Alternativamente, podem-se introduzir vários locais reactivos no terminal, para ligar partículas, substractos sólidos, macromoléculas ou semelhantes. Por exemplo, pode-se conjugar uma porção amino interna de uma cadeia em crescimento ligada a um substrato sólido, com grupos laterais intermediários protegidos, com ácido metilditiobenzóico (MDTB). O grupo mercaptano livre pode então ser utilizado para conjugação com olefinas activadas. Assim, podem-se conjugar ao péptido proteínas como a albumina de soro, hemocianina de lapa do género Fissure/a, β-globulina ou semelhantes, para se obter um imunogénio para produzir anticorpos contra o péptido, para utilização em imunoensaios, para cromatografia de afinidade, ou semelhantes.

Alternativamente, o péptido pode ser ligado a outro polipéptido, preparando uma sequência de ADN que tem o péptido no terminal N, no terminal C ou interno na proteína, de modo a proporcionar uma proteína fundida que inclui o péptido de ligação de interesse. Deste modo, podem-se produzir proteínas fundidas que têm actividade enzimática, actividade enzimática esta que pode ser modulada por macromoléculas, e.g. anticorpos, que se ligam ao polipéptido de interesse. Assim, os péptidos do presente invento podem ser modificados por uma vasta variedade de formas, para uma variedade de fins, mantendo ainda a actividade biológica.

Os péptidos do presente invento podem também ser utilizados em combinação com péptidos antigénicos ou proteínas de interesse, para activar os CTL. Assim, os péptidos do invento podem ser ligados a uma proteína, quer directa quer indirectamente, de modo a serem capazes de apresentar dois epítopos ao CTL, aos quais o CTL se possa ligar e ser activado. É de interesse particular a possibilidade de os péptidos do invento poderem ser ligados a um lipossoma ou uma membrana lipídica em bicamada, em conjunção com um péptido ou proteína que proporcionem os outros locais determinantes.

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Estão disponíveis várias técnicas para ligar um péptido ou uma proteína a um lípido, particularmente um fosfolípido, para proporcionar a presença do péptido ou proteína na superfície do lipossoma. Pode-se utilizar fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina ou outro lípido com um agente de ligação bifuncional, como MBSE, glutaraldeído, ácido metilditiobenzóico ou semelhantes. A formação de lipossomas com proteínas conjugadas tem um grande suporte na literatura, veja-se, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 3,887,698; 4,261,975 e 4,193,983. O péptido ou proteína modificados são combinados com os lípidos num meio aquoso e submetidos a ultra-sons para proporcionar os lipossomas desejados. Os lipossomas podem então ser recolhidos e utilizados dos modos indicados.

Os péptidos do invento, por si próprios, ou em combinação com outros péptidos ou proteínas, podem ser utilizados para o diagnóstico da presença de CTL que se ligam a um péptido do invento, ou à combinação de um péptido do invento e outro péptido ou proteína. Deste modo, podem-se preparar conjugados do péptido do invento e do péptido ou proteína antigénicos utilizando agentes de ligação, como anteriormente descrito. Alternativamente, o péptido do invento e o péptido antigénico podem ser ligados a uma superfície sólida, como uma partícula, superfície de recipiente ou semelhantes. Se desejado, o péptido do invento e o péptido ou proteína antigénicos podem ser conjugados a uma partícula ou proteína que é fluorescente. A ligação da partícula ou proteína irá permitir a classificação e contagem num classificador de células activadas por fluorescência.

Os péptidos do invento podem também ser utilizados para modular a actividade de CTL no hospedeiro mamífero. A modulação pode ser efectuada por inibição da actividade de CTL, particularmente inibição da diferenciação de CTL, ou por sensibilização das células alvo. Esta pode ser conseguida utilizando aferese, em que o sangue do paciente é colhido do paciente e posto a circular através de um dispositivo em que está presente o péptido, quer ligado à superfície, para remover os CTL activos com o péptido do invento, ou num meio fisiologicamente aceitável, para se ligar aos CTL e inibir a sua actividade. Alternativamente, os péptidos do invento podem ser administrados a um hospedeiro intravascularmente, quer na artéria, quer na veia, para proporcionar a inibição ou o estímulo de CTL. 12 85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ A seguir apresentam-se exemplos de péptidos inibitórios Tvéjã-se exemplos 2 e 9), que derivam de ambos os domínios a1 e a2 de HLA-A2. Em cada caso, a sequência do péptido inibitório está correlacionada com a especificidade do epítopo do CTL. Além disso, como se mostra no exemplo 4, a inibição é mediada por um octapéptido e ocorre por ligação do péptido ao CTL e não à célula alvo (veja-se Exemplo 5). Uma vez que a capacidade inibitória de péptidos individuais se correlaciona com a especificidade do CTL, parece provável que estes péptidos exerçam a sua inibição por ligação ao receptor de células T variável.

No exemplo 10, infra, apresenta-se um exemplo de um péptido que estimula a citólise de células alvo que possuem HLA classe I, por CTL alorreactivo. A interpretação mais simples dos resultados nos exemplos 10-12, é que o CTL específico para HLA-A2/B17 reconhece o péptido A2 56-69 no contexto do HLA-Aw69, como um elemento de restrição. Isto implica que o péptido está ligado à molécula HLA-Aw69. Os dados e a interpretação são semelhantes aos obtidos para os sistemas da influenza (Bastin et a!., J. Exp. Med.. 165:1508 (1987); Gotch et a!., Nature 326:881 (1987)) e xenogénicos (Maryanski et al. Nature 324:578 (1986)) e demonstra que o CTL alorreactivo pode reconhecer péptidos derivados de classe I de um modo restrito à classe I. No entanto, as quantidades de péptido necessárias para sensibilizar são significativamente maiores do que as referidas noutros estudos. Embora a base molecular para este aspecto seja ainda desconhecida, uma explicação possível envolve o manuseamento relativo de moléculas exógenas versus endógenas. Por exemplo, o HLA é uma molécula endógena e os péptidos de HLA endógenos poderão ter que competir com péptidos HLA endógenos. Outra alternativa é que o péptido A2.56-69 poderá não incluir todos os resíduos necessários para a ligação de alta afinidade à célula alvo.

Dois dos epítopos de CTL, dos quais derivam os péptidos descritos nos Exemplos infra, estão localizados em partes muito diferentes da molécula de HLA-A2. Os resíduos 62-65 estão na hélice alfa que forma parte do local de ligação ao péptido (Bjorkman et a!., Nature 329:506 (1987)), que se pensa ser ele próprio capaz de se ligar a péptidos de hélice alfa. Como se mostra nos exemplos, os péptidos nesta região podem, ou inibir, ou induzir a citólise. Na indução da citólise é possível que o péptido se possa ligar a um antigénio HLA de classe I de uma célula alvo, criando deste modo uma estrutura que é 13 85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ reconhecida pelo CTL. Por exemplo, no caso do péptido A2.56-69, que confere sensibilidade a células do clone A2/B17 em células HLA-Aw69, o péptido ligado substitui presumivelmente a hélice a do domínio a1, uma vez que o HLA-Aw69 e o HLA-A2 têm domínios a2 idênticos.

Pelo contrário, o resíduo 107 é parte de uma volta entre duas cadeias de estrutura β, a alguma distância das hélices alfa e da região de ligação ao péptido (Bjorkman et a/., supra). O péptido A2.98-113 poderá manter elementos desta estrutura em solução e ter pouca afinidade para o local de ligação ao péptido de moléculas de classe I. Esta interpretação explicaria a observação, nos Exemplos, de que os péptidos que correspondem a esta região são inibidores da citólise dirigida por HLA-A2, mas não podem induzir a citólise.

As várias actividades dos péptidos podem ser determinadas por testes adequados. A inibição dos CTL por péptidos pode ser determinada utilizando linhas de CTL específicos para um HLA particular, numa linha celular alvo que portadora do HLA alvo. A linha celular alvo é marcada, por exemplo, com 51Cr. Estas células são combinadas num meio adequado e a libertação de marcador é determinada, como indicador do nível de citólise. O péptido pode ser adicionado ao mesmo tempo que as células são postas em contacto, pode ser incubado com os CTL, ou pode ser incubado com a célula alvo, para investigar o modo de acção do péptido.

Em vez de se utilizar um marcador exógeno, pode-se determinar a libertação da actividade de serina-esterase, combinando os CTL e as células alvo em conjunção com o péptido. A presença de actividade de serina-esterase pode ser relacionada com a libertação de grânulos.

Como anteriormente indicado, o péptido pode estar presente sozinho ou em combinação com um antigénio, proporcionando assim um diferente local determinante de interesse. Dependendo do facto de apenas estar incluído o péptido do invento, ou de o péptido estar em combinação com outros péptidos, pode-se obter activação ou inibição. Se se desejar uma inibição irreversível, o conjugado do péptido do invento com o antigénio pode ser ligado a um agente citotóxico, ligado a lipossomas contendo agentes citotóxicos, ou ligado a um anticorpo monoclonal específico ou a imunoglobulina, em que a ligação do conjugado ao CTL resultará na lise do CTL mediada pelo complemento. 14 85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ

Além disso, os péptidos específicos podem servir também para bloquear a diferenciação do CTL, bloqueio esse que pode ser específico ou não específico. Os péptidos do invento podem também ser utilizados para modular a actividade de CTL, em que a modulação inclui a inibição da actividade citolítica, podendo a inibição ser reversível ou irreversível. Nalguns casos, os péptidos do invento podem ser utilizados para determinar a presença de conjuntos ou subconjuntos particulares de CTL restritos ao MHC.

Os péptidos do invento também se ligam a pelo menos uma proteína celular de cerca de 27 kD. A proteína é expressa em células T CD8+ e parece ser uma proteína de membrana de superfície. A proteína pode ser obtida na forma substancialmente pura, por separação por electroforese em gel e identificação com um dos péptidos de acordo com o presente invento, por purificação numa coluna de cromatografia de afinidade, utilizando um péptido do invento ou semelhante. Pode-se obter uma pureza superior a 50% em peso ou mais, de acordo com métodos conhecidos. Quando os péptidos do invento são ligados a uma superfície de um poço, as células T ligam-se rapidamente às paredes do poço. A proteína ou seus fragmentos activos, podem ser utilizados para inverter o efeito dos péptidos do invento em processos celulares, podem ser utilizados para pesquisar péptidos activos e podem ser utilizados para produzir anticorpos para identificar as células que expressam a proteína. A proteína, ou seus fragmentos activos podem ser utilizados para modular a actividade de CTL, tal como inibição da activação, lise de outras células ou outras interacções com outras células, que resultam no estímulo ou inactivação de outras células.

Estas várias capacidades podem ser conseguidas combinando as composições celulares que compreendem os CTL com o péptido, em quantidade suficiente para proporcionar a propriedade desejada. Quando se pretende uma separação, podem-se utilizar colunas de afinidade, esferas conjugadas, e.g., esferas magnéticas ou outras técnicas, em que as células ligadas ao péptido podem ser separadas de outras células que, ou não estão ligadas, ou estão ligadas de forma não específica.

Os péptidos do invento, sozinhos ou na forma de conjugados, podem ser preparados como formulações em meios farmaceuticamente aceitáveis, por 15 85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ exemplo, solução salina, PBS e glucose, geralmente numa dose farmacologicamente eficaz, cuja concentração será determinada empiricamente de acordo com processos convencionais, para o fim particular. Os aditivos podem incluir agentes bactericidas, estabilizantes, tampões ou semelhantes. A quantidade administrada ao hospedeiro irá variar dependendo daquilo que se administra, da finalidade da administração, tal como profilaxia ou terapia, do facto de se desejar inibição ou inactivação, do estado do hospedeiro, do modo de administração e semelhantes. De modo a aumentar a semivida do péptido do invento ou de conjugados do péptido do invento, os péptidos podem ser encapsulados, introduzidos no lúmen de lipossomas, preparados como um colóide ou pode-se utilizar qualquer outra técnica convencional, que proporcione um tempo de vida alargado aos péptidos.

Os exemplos seguintes pretendem ser ilustrativos e não limitativos. EXEMPLOS

Exemplo 1

Preparação de péptidos derivados de HLA-A2

Prepararam-se quatro péptidos por métodos sintéticos convencionais, utilizando métodos padrão em fase sólida. Veia-se Erickson & Merrifield in: The proteins Vol. 2, 3a edição (eds. Neurath, H. & Hill, R.L.) p. 255-527 (Academic Press, N.Y. 1970), que é aqui incorporada para referência. Três dos péptidos tinham aminoácidos do domínio a2 e um dos péptidos tinha aminoácidos do domínio cc2 de um antigénio HLA-A2. Os quatro péptidos tinham as seguintes composições e designações:

A2.56-69 GPEYWDGETRKVKA A2.94-112TLQRMYGCDVGSDWRFLRG A2.98-113MYGCDVGSDWRFLRGY Aw.68-113MYGCDVGSDGRFLRGY

As designações indicam o antigénio do complexo principal de histocompatibilidade, a partir do qual o péptido é derivado e a posição dos aminoácidos no antigénio. 16 85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ

Exemplo 2

Inibição de CTL específico para HLA-A2 por péptidos derivados de HLA-A2.98-11 3 e HLA-A2.94-11 2

Os péptidos preparados como no exemplo 1, i.e. os que correspondem a HLA-A2.56-69, HLA-A2.94-11 2, HLA-A2.98-113 e HLA-Aw 68.98-113 foram pré-incubados durante 30 min com 1-3x103 CTL antes da adição de 103 CPM de células B alvo linfoblastóides marcadas com 51Cr. Realizou-se então o teste de citotoxicidade como descrito por Clayberger et a!., J. Exp Med (1984) 162:1709-1714; e Reiss et a!., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1980) 77:5432-5436, que são aqui incorporados para referência.

No primeiro estudo, a linha celular de CTL era AJY, uma linha de CTL CD8+ de longo termo específica para HLA-A2 e a célula alvo era a linha de células B linfoblastóides JY (HLA-A2, B7). No segundo estudo, o CTL era PWSB, uma cultura de massa com reactividade contra HLA-B17 e o alvo era FMB, que expressa HLA-A1, A32, B17. Em cada caso, determinou-se a percentagem de libertação específica obtida na ausência de péptido. A menor quantidade de libertação específica no segundo estudo tornou a citólise potencialmente mais sensível à inibição. As reservas de péptidos a 1 mg/ml em PBS foram diluídos, para se obterem as concentrações finais no teste como indicado na tabela 1. Como inibidor de controlo, utilizaram-se moléculas de anticorpo monoclonal PA2.6 que é dirigido contra o determinante monomórfico de HLA-A, B,6 (Reiss et a/., supra: McMichael, J. Exp Med (1980) 152:195s-203s). Os péptidos utilizados eram A2.98-113, A2.94-112,

Aw68.94-112 e A2.56-69. A tabela seguinte indica os resultados:

Tabela 1

Concentração .ug/ml % de lise específica A2.98-113 A2.94-1 12 Aw68.94-11 2 A2.56-69 Ensaio 1. 160 0 3 52 51 CTL - AJY 80 4 20 45 38 Alvo = JY 40 18 35 63 61 Ensaio 2. 160 27 35 28 20 CTL = PWSB 80 29 32 30 27 Alvo = FMB 40 30 34 35 31 85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ 17

No primeiro caso, a percentagem de libertação específica obtida na ausência de péptido era de cerca de 54, enquanto que no segundo caso era de cerca de 28.

Os resultados acima com CTL, que são restritos pelo antigénio HLA-A2, mostram inibição da citotoxicidade específica. Com os CTL não restritos pelo A2, ocorre a lise de células alvo ao acaso, aproximando-se os resultados da libertação específica padrão obtida na ausência de péptido. Estes resultados sugerem que o triptofano na posição 107 pode ser crítico. O péptido A2.98-113 e o péptido Aw68-113 são homólogos, excepto quanto à substituição de triptofano por glicina nesta posição; esta substituição resultou numa perda de inibição da citólise por CTL específico para HLA-A2.

Os resultados do tratamento do péptido A2.98-113 com diferentes proteases, i.e. tripsina ou quimiotripsina, permitem sugerir que a arginina 108 é importante, mas que os péptidos 109-113 não são críticos. Os locais principais de acção de tripsina e quimiotripsina são a Arg, Lys e Trp, Phe, Tyr, respectivamente. A clivagem quimiotríptica, mas não a tríptica, do péptido reduziu a actividade inibitória (resultados não apresentados).

Exemolo 3

Efeito da especificidade de CTL e das células alvo, na inibição da citólise provocada por péptidos derivados de HLA

Estudaram-se diversas linhas celulares de CTL, em que a especificidade das linhas celulares foi variada. Os resultados apresentados na Tabela 2 indicam que apenas quando os CTL e as células alvo partilham a especificidade para A2, é que os péptidos derivados de A2 proporcionam inibição.

85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ 18

Tabela 2

Especificidade dos testes de CTL para a inibição por péptidos CTL Especificidade Célula Molécula Inibição da lise pelo péptido do CTL alvo alvo A2.98- A2.94- Aw68.98- A2.56- 113 112 113 69 Linha AJY A2 JY A2 4- + - - Linha PJY A2 JY A2 + + - - Clone A20.1 A2 JY A2 T + - - Clone A1.10 A2 JY A2 + + - - Clone AI9.1 JY A2 4- + - - A2,Aw68,Aw 69 Linha PWSB A2,B1 7 JY A2 J- + - - Linha PWSB . A2,B17 FMB B17 - - - - Clone AL8.1 Aw68,Aw69 LB Aw68 " - - NR Clone A1 5.1 Aw69 IDF Aw69 - - - NR Linha CJY Dr6 Jy DR6 - NR - - Linha CJY Dr6 DAUDI Dr6 - NR - - A especificidade do CTL baseia-se na análise do padrão de morte num painel de linhas de célula B linfoblastóides e nos padrões de inibição com anticorpos monoclonais. NR indica não realizado. Os CTL utilizados eram de quatro dadores diferentes

Exemplo 4

Sequência peptfdica mínima necessária para inibição de CTL específico para HLA-A2 A sequência peptídica mínima necessária para inibição da citólise por CTL específico para HLA-A2 foi determinada avaliando o efeito do tamanho na inibição.

Sintetizou-se uma série de péptidos que começavam nas posições 98-104 e terminavam na posição 108 de HLA-A2 ou HLA-Aw68. Testou-se o efeito destes péptidos na citólise de células JY (HLA-A2, B7f DR4,6) por dezassete linhas ou clones específicos para HLA, diferentes. As linhas ou clones específicos para HLA-A2 foram produzidas como descrito em Clayberger et aL, supra. Pré-incubaram-se péptidos (200 mg/ml) com 1-3x103 CTL durante 30 minutos, antes da adição de 103 CPM de células alvo, marcadas com 51Cr. Os péptidos estavam presentes em todo o teste de citotoxicidade, que foi realizado

85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ 19 como descrito em Clayberger et a/., supra e em Krensky et aí. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:2365 (1982), que são aqui incorporados para referência. Os péptidos foram preparados como soluções de reserva a 1 mg/ml em solução salina tamponada com fosfato e diluídos em meio completo (MEN suplementado com 10% de soro de vitela), para se obter a concentração final utilizada.

Os resultados da inibição da citólise por CTL-A2 são apresentados na Fig. 1 A, sendo a inibição expressa como (1-[citólise específica na presença de péptido/citólise específica na ausência de péptido])x100.

Como se pode ver na figura, o péptido 104-108 não inibiu, os péptidos 102-108 e 103-108 originaram uma inibição fraca e os restantes péptidos originaram uma boa inibição da citólise. Assim, um octapéptido que - compreende os resíduos 101-108 foi suficiente para provocar o efeito inibitório. Ocorre um decréscimo principal no efeito inibitório, com a perda da cisteína na posição 101. Esta perda pode ser devida à perda de reticulação por ligações dissulfureto de duas moléculas de péptido, quando a cisteína 101 está ausente.

Exemplo 5

Locus de accão do péptido A2.98-113 O locus no qual o péptido A2.98-113 interage para originar um efeito inibitório na citólise mediada por CTL específico para HLA-A2, i.e. com o CTL e/ou com a célula alvo, foi determinado como se segue.

Incubou-se o CTL (1x106 CTL-A2) e/ou as células alvo (células alvo JY marcadas com 51Cr) com 100 pg de A2.98-113 durante 30 min a 37°C, ou alternativamente com o péptido de controlo, Aw68.98-113. As sequências destes péptidos são apresentadas no Exemplo 1. Como controlo adicional, incubaram-se as células com meio completo menos o péptido. Após a incubação, as células foram lavadas três vezes em meio completo e testadas num teste de libertação de 51 Cr (veja-se Exemplo 2).

Os resultados são apresentados na Fig. 2, em que se pode ver que a lise foi inibida quando o CTL, mas não as células alvo, foram pré-tratadas com A2.98-113. Não se observaram efeitos inibitórios quando o CTL, mas não as células alvo, foram pré-tratadas com A2.98-113. Não de observaram efeitos

85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ 20 inibitórios quando ο CTL ou as células alvo foram pré-tratadas com o péptido de controlo, Aw68.98-11 3.

Exemplo 6

Mecanismo de inibição de CTL por A2.98-113. Efeito na viabilidade de CTL A fim de determinar se os CTL eram inibidos devido à sua autólise induzida por A2.98-1 13, incubaram-se, ou células CTL-A2 marcadas com 51Cr, ou células CTL-A2 não marcadas com o péptido, durante 6 horas a 37°C em meio completo. Durante a incubação de 6 horas não se observou nenhum decréscimo detectável na viabilidade celular, tal como avaliado por exclusão com azul de tripano ou por libertação de 51Cr (resultados não apresentados)

Exemplo 7

Mecanismo de inibição de CTL por A2.98-113. Efeito na libertação de grânulos que contêm serina-esterase

Determinou-se o efeito de A2.98-113 na libertação dos grânulos que contêm serina-esterase, durante a citólise das células alvo por CTL, como se segue.

Determinou-se a especificidade da libertação incubando 3x105 CTL específicos para HLA-A2 com células JY (HLA-A2; B7; Dr4,6) ou células IBW4 (HLA-A3; B35; DR1) durante 2 horas em poços de microtítulo com fundo em V. As razões CTL:células alvo eram de 1:0,01, 1:0,05, 1:0,10, 1:0,5 e 1:1. Após a incubação, as placas foram giradas a 1000 rpm durante 2 minutos e o sobrenadante foi testado quanto à actividade de serina-esterase, essencialmente como descrito em Young et al. Cell 47:183 (1986), que é aqui incorporado para referência. As misturas reaccionais consistiam em 20 μΙ de sobrenadante mais 200 μΙ de substrato (éster tiobenzílico de N-benziloxicarbonil-L-lisina 2x10'4 M, ácido nitrobenzóico 2,2x10'4 M, Tris-HCI 0,1 M, pH 8,0). Após 30 min, a 37°C, determinou-se a absorvância a 410 nm. Determinou-se a actividade total de serina-esterase, substituindo células estimulantes por Triton X-100 a 0,01%. Os resultados, apresentados na Fig. 3A indicam que ocorreu libertação dos grânulos quando os CTL específicos para HLA-A2 foram incubados com células JY (círculos a cheio), mas não quando os CTL específicos para HLA-A2 foram incubados com células IBW4 (quadrados a cheio).

85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ 21 Ο efeito do péptido Α2.98-113 na libertação dos grânulos que continham serina-esterase foi determinado de um modo semelhante, excepto que os CTL específicos para HLA-A2 foram pré-incubados com 100 pg de péptido, quer A2.98-113, quer Aw68.98-113, ou apenas com meio completo, durante 30 minutos, a 37°C antes da adição de células alvo JY, em razões de CTL:células alvo de 1:0,01, 1:0,05, 1:0,1, 1:0,5 e 1:1.

Como se pode ver na Fig. 3B, observou-se a inibição completa da libertação de esterase com 100 μg/ml de A2.98-113 a uma razão de célula efectora para célula alvo de 1:0,1 (quadrados a cheio). O péptido de controlo, Aw68.98-113, não teve nenhum efeito na libertação de esterase (triângulos a cheio), uma vez que a libertação neste caso era igual à obtida com as células de controlo, pré-incubadas com meio completo (círculos a cheio).

Estes resultados, juntamente com os do Exemplo 5, indicam que o péptido A2.98-113 bloqueia os acontecimentos que ocorrem precocemente na activação de células T, por ligação directa ao CTL. Esta ligação pode ser ao receptor do antigénio.

Exemplo 8

Isolamento de CTL específico para o epítopo partilhado por HLA-A2 e HLA-B17, para HLA-B17 e para HLA-A2

Os CTL com as várias especificidades foram derivados a partir de linfócitos de sangue periférico de um dador normal (HLA-A3; B7; DR6), essencialmente como descrito por Clayberger et al. (1985), supra. Para o CTL específico para o epítopo partilhado entre o HLA-A2 e HLA-B17, as células foram estimuladas em cultura primária com a linha de célula B linfoblastóides, Mag (HLA-A26,33; B17,51) irradiada (10 000 R) e clonada utilizando a linha celular SB (HLA-A1,2; B17,44; DR2,6) como estimuladores. Os CTL específicos para B17 foram derivados a partir da mesma cultura primária, mas foram clonados utilizando a linha celular SH (HLA-A3, w33; B7,17 (w57)) como estimuladores. Os CTL específicos para HLA-A2 foram derivados a partir das células estimuladas na cultura primária com a linha celular JY e clonados utilizando a linha celular Herluff (HLA-A2; B12,35; DR4,7) como estimuladores. A especificidade fina destes clones de CTL foi determinada utilizando um painel de 11 alvos que expressam HLA-B17, 8 alvos que expressam HLA-A2 e 15 85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ 22

alvos com moléculas de HLA não relacionadas. Obtiveram-se clones múltiplos com as especificidades desejadas. Um clone individual que originou a citólise tanto das células alvo do tipo HLA-A2 como das células alvo do tipo HLA-B17, foi designado por clone A2/B17. A citólise de células alvo do clone A2/B17 foi inibida pelo anticorpo MA2.1. Um segundo clone, que lisou todas as células alvo HLA-B17, mas nenhumas outras, foi designado por B17. Um terceiro clone, que lisou todas as células alvo HLA-A2, mas nenhumas outras, foi designado por CTL-A2. A especificidade para o alvo do clone A2/B17 e a verificação de que a citólise por este clone era bloqueada pelo anticorpo monoclonal MA2.1 indica que as células do clone A2/B17 reconhecem o epítopo partilhado por HLA-A2 e HLA-B17.

Exemplo 9

Efeito de oéptidos de diferentes epítopos de HLA-A2 na citólise de células alvo por CTL com diferentes especificidades

Os exemplos 2-7, supra, envolveram os efeitos dos péptidos derivados a partir da região em torno do triptofano 107 no domínio a2. Este resíduo, que está numa dobra entre duas cadeias em folha pregueada β (Bjorkman et a/. (1987), supra) é crítico para um epítopo serológico principal de HLA-A2. Salter et a!., J. Exp. Med 166:283 (1987); Lavei et a/., J. Immunol. 138:2197 (1987).

Outro epítopo importante envolve os resíduos 62-65 da região de hélice α do domínio a1. Bjorkman et a!., supra. Este epítopo foi originalmente definido pelo anticorpo monoclonal MA2.1 (McMichael et aí., Hum. Immunol. 1:121 (1980)) e é partilhado por todos os subtipos conhecidos de HLA-A2 e HLA-B17 (Ways e Parham, Biochem. J.. 216:423 (1983)). Uma comparação da sequência de aminoácidos de HLA-A2 e HLA-B17 e oito outras proteínas HLA-A,B,C mostraram que apenas o resíduo glicina na posição 62 é único, sugerindo que este resíduo contribui para um determinante partilhado (Ways et aí., J^. Immunol 137:217 (1986)).

Os péptidos derivados a partir das duas regiões acima foram analisados quanto ao seu efeito inibitório na citólise das células alvo por CTL com

85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ 23 diferentes especificidades para HLA, i.e. os do clone A2/B17, clone CTL-A2 e clone B17 (veja-se Exemplo 8, supra). Os CTL foram incubados com os seguintes péptidos:A2.56-69, Aw68.56-69, A2.98-11 3 ou Aw68.98-11 3.

Os epítopos estudados e os péptidos utilizados no estudo são apresentados na Fig. 4, em que se apresentam as sequências da proteína nos três domínios extracelulares (α1, a2 e cc3) de oito moléculas de HLA-A,B, utilizando o código de aminoácidos de uma letra, convencional. A sequência de HLA-Bw58, subtipo de HLA-B17, é de Ways et al. J. Biol. Chem. 260:11924 (1985), a de HLA-A3.1 é de Strachen et aí., EMBO J. 3:887 (1984) e as restantes sequências da família HLA-A2/28 são de Holmes et a!., J. Immunol 139:936 (1987). Os péptidos A2.56-69 e Aw68.56-69 e A2.98-113 e Aw68.98-113, que são derivadas de a1 e a2, respectivamente, são indicadas por traços cruzados. Os dois resíduos que se verificou serem críticos para os epítopos partilhados pelos subtipos de HLA-A2 e HLA-B17 (glicina 62) e subtipos de HLA-A2 e HLA-Aw69 (triptofano 107) são indicados pelos pontos e pelas setas verticais. A sequência de consenso é derivada a partir de um total de 23 sequências de HLA-A,B,C.

Incubaram-se os CTL com péptidos a concentrações de 100 pg/ml, 200 pg/ml ou 300 pg/ml. As amostras de controlo foram incubadas na ausência de péptido. As concentrações molares finais de péptidos utilizadas no teste a 100 pg/ml eram de 4,9x10'5M para A2.98-113; 5,2x10'5M para Aw68.98-113; 5,9x10'5M para A2.56-69; e 5,9x10'5M para Aw68.56-69. As células CTL foram incubadas com os péptidos durante 20 min, antes da adição de 103 células T7529 marcadas com 51Cr (HLA-Aw33; B17 (W85); DR6) ou células JY (HLA-A2; B17; DR4,6). Em todos os casos, as razões célula efectora para célula alvo eram de 1:1.

Os resultados de citotoxicidade, tal como medidos pela libertação de 51crómio pelas células alvo, é apresentada na Fig. 5. As figuras 5A e 5B mostram os resultados dos efeitos dos péptidos nas células do clone A2/B17; a Fig. 5C mostra os efeitos nas células do clone B17 e a Fig. 5D em CTL-A2. Os péptidos são indicados como se segue: (círculos a branco) A2.56-69; (quadrados a branco) Aw68.56-69; (triângulos a branco) Aw98-113; e (quadrados a cheio) Aw68.98-1 13. O péptido A2.56-69, que inclui o epítopo serológico partilhado, inibiu especificamente a morte de ambas as células alvo 24 85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ que expressam HLA-A2 e HLA-B17 pelas células do clone A2/B17. Pelo contrário, este péptido não teve efeito na lise das células que expressam HLA-B17 pelas células do clone B17. As células do clone A2/B17 não foram inibidas por um péptido derivado dos resíduos 56-69 de HLA-Aw68.1, nem por uma série de péptidos não relacionados. 0 péptido A2.98-113 não teve efeito na lise dos alvos que expressam HLA-B17 pelas células do clone A2/B17, mas observou-se alguma inibição a concentrações elevadas, com alvos que expressam HLA-A2. Esta diferença indica que os epítopos de HLA-A2 e HLA-B1 7 reconhecidos pelas células do clone A2/B17 não eram exactamente os mesmos.

Estes resultados mostram que a capacidade dos péptidos inibirem os CTL alorreactivos não se restringe à região que envolve os resíduos 101-108 do domínio a2 e que podem ser derivados a partir de um segundo -epítopo de HLA-A2. A discrepância entre os resultados obtidos com o péptido A2.56-69 utilizando o clone A2/B17 e os obtidos com a linha celular PWSB (veja-se tabela 2), relativamente ao efeito inibitório deste péptido, pode ser explicada pela natureza policlonal das células PWSB. Isto é, a linha PWSB é provavelmente uma mistura de CTL, incluindo clones individuais específicos para HLA-A2 ou HLA-B17.

Exemplo 10

Sensibilização de células alvo para o CTL, provocada por um polipéptido derivado de HLA-2

Incubou-se o clone A2/B17 com o péptido A2.56-69 e células alvo marcadas com 51 Cr a uma razão de célula efectora para célula alvo de 5:1, durante 5 horas, após o que se mediu o 51 Cr libertado. As concentrações de péptido eram de 10, 30, 100 e 300 pg/ml. Os resultados do efeito do péptido na percentagem de lise específica das células alvo pelas células do clone A2/B17 são apresentadas na Fig. 6. As células alvo eram: (quadrado aberto), IBW4 (HLA-A3; B35; DR1); (triângulos a cheio), LB (HLA-Aw68.1; B40, DR6); (círculo fechado), Pally (HLA-Aw68.2,26; B14,38; DRI,4) ou (losango aberto), IDF (HLA-Aw69,26; B15,38, DR5).

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Na ausência de péptido, as células do clone A2/B17 não lisam alvos que expressam HLA-Aw69, HLA-Aw68.1 e HLA-Aw68.2 (dados não apresentados). A incapacidade das células do clone A2/B17 lisarem estes alvos é devida às diferenças entre os resíduos críticos em torno da posição 62 e os encontrados em HLA-A2 e HLA-B17. No entanto, quando o péptido A2.56-69 foi incluído no teste de citotoxicidade, ocorreu lise significativa dos alvos que expressam HLA-Aw69 pelas células A2/B17 (Fig. 5). Pelo contrário, os alvos que expressam HLA-Aw68.1, HLA-Aw68,2 ou a molécula HLA-A3 não relacionada, não foram lisados. A lise das células HLA-Aw69 pelas células do clone A2/B17, na presença do péptido A2.56-69 foi bloqueada pelo anticorpo monoclonal DR11-351, que apenas se liga ao HLA-Aw69 da célula alvo. Pelo contrário, o anticorpo monoclonal MA2.1 não inibiu a lise (resultados não apresentados). O MA.2 liga-se ao epítopo de HLA-A2 e HLA-B17 formado pelos resíduos 56-69, mas não se liga ao HLA-Aw69 ou ao péptido A2.56-69. Estes resultados demonstram o envolvimento da molécula de HLA-Aw69 na sensibilização pelo péptido A2.56-69. A adição do péptido A2.98-113 a linhas de células B que não expressam HLA-A2 não provocou a sensibilização à lise, quando se utilizaram células alvo que expressam uma variedade de moléculas de HLA. Isto verificou-se mesmo para uma gama alargada de concentrações de péptido (utilizaram-se 0,1 a 300 pg/ml).

Na ligação de A2.56-69, a molécula de HLA-Aw69 é capaz de apresentar um epítopo que mimetiza a estrutura nativa de HLA-A2. É de interesse que o HLA-Aw69, mas não outros membros da família HLA-A2/68, possam ser sensibilizados. O HAL-Aw69 é uma molécula recombinante com a1 derivado de HLA-Aw6B e a2 e a3 derivados de HLA-A2.1 (Holmes e Parham, EMBO J. 4:2849 (1985)). Assim, o HLA-2.1 e HLA-Aw69 diferem apenas em 6 aminoácidos, residindo todos no domínio a1 e estando três deles presentes no péptido A2.59-69.

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Exemplo 11

Locus da interaccão de péptidos na sensibilização A fim de determinar se a sensibilização resultou da interaccão de péptidos com CTL ou com o alvo, trataram-se previamente as células com A2.56-69, lavaram-se e testaram-se quanto à citólise. Mais especificamente, incubaram-se 1x106 células do clone A2/B17 ou IDF marcado com 0lCr (HLA-Aw69,26; B18,38; DR5) com 100 μ9 de péptido ou meio, durante 30 minutos, a 37°C, lavou-se três vezes e determinou-se a citotoxicidade pela libertação de 51crómio.

Como se pode ver pelos resultados apresentados na Fig. 7, as células alvo que expressam HLA-Aw69 foram lisadas quando os alvos, mas não os CTL, foram tratados previamente com A2.56-69.

Exemplo 1 2

Efeito do péptido A2.56-69 na libertação de grânulos que contêm serina-esterase. O efeito do péptido A2.56-69 na libertação de grânulos que contêm serina-esterase durante a co-cultura de células A2/B17 com células que expressam HLA-Aw69 pode ser realizada essencialmente como descrito no exemplo 7, supra, excepto que os CTL são do clone A2/B17, as células alvo são as que expressam HLA-Aw69 e as células são co-cultivadas na ausência ou na presença do péptido A2.56-69.

Exemplo 13

Efeito de uma variedade de péptidos HLA de aminoácidos 60-84 e HLA-B 2702/05.145-169 na lise

Estes péptidos foram sintetizados e tinham a seguinte sequência:

HLA-B2702.60-84 WDRETQICKAKAQTDRENLRIALRY HLA-B2705.60-84 WDRETQICKAKAQTDREDLRTLLRY HLABw46.60-84 WDRETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGY HLA-Bw62.60-84 WDRETQISKTNTQTYRESLRNLRGY HLA-A2.1.60-84 WDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGY HLA-B2702/05.145-169 RKWEAARVAEQLRAYLEGECVEWLR HLAB38.60-84 WDRNTQICKTNTQTYRENLRIALRY

85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ 27 Ο efeito das sequências acima descritas na lise de CTL de longo termo, específico para HLA-A2, -B2705, -Bw46, -Bw62 e -Cw4 foi determinado como descrito nos Exemplos 2 e 3 e incluía também CTL específico para HLA-B27 e o HLA-Cw4. Nenhum dos péptidos inibiu ou potenciou a lise, com excepção do péptido B2702.60-84. Este péptido bloqueou a lise por todos os CTL, independentemente da sua especificidade para HLA. Este efeito era devido à interacção com o CTL e não à célula alvo, como se mostra pelas experiências de pré-tratamento (como no Exemplo 5).

Estes péptidos foram testados quanto a efeitos na diferenciação de CTL, a partir de precursores de CTL, no teste da diluição limitante. Este procedimento foi modificado a partir de Skinner e Marbrook (J. Exp Med. 143:1562; 1976), como se segue: purificaram-se PBL a partir de dadores tipificados HLA normais, sobre Ficoll-Hypaque e fez-se a co-cultura em poços de microtítulo de fundo redondo, com linfoblastos B irradiados (10 000 R) transformados com EBV, que expressam o alelo de HLA de interesse. Adicionaram-se os PBL que respondem a 3000, 6000, 10000 e 30000 células por poço, enquanto se adicionaram os estimuladores a 6000 células por poço. Fizeram-se 20-4 réplicas para cada concentração de células que respondem, em meio RPMI-1640 suplementado com soro fetal de bovino a 10% mais L-glutamina. Incubaram-se as placas durante seis dias numa incubadora a 5% de C02/95% de ar humidificado, altura em que se misturaram os conteúdos de cada poço, pipetando cinco vezes com uma pipeta de múltiplos canais. Transferiram-se aiíquotas de cinquenta microlitros para poços de microtítulo de fundo em V, aos quais se adicionaram 1000 alvos marcados com 5,Cr de tipo HLA conhecido. A lise foi determinada num teste de citotoxicidade de quatro horas (Exemplo 2). Os poços foram designados positivos quando a lise específica era >10%. Determinou-se a frequência do precursor de CTL, por análise de regressão linear, utilizando um programa de computador.

Os péptidos B2702.60-84, Bw46.60-84 e Bw62.60-84 bloquearam todos a diferenciação de CTL, enquanto que os outros péptidos não tiveram efeito. 28 85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ

Efeito de péptidos que correspondem às regiões HLA na frequência do precursor de CTL, determinado por análise da diluição limitante Péptido 1 /Frequência do precursor de CTL B2705.60-84 164 245 B2702.60-84 3 349 990 B38.60-84 3 334 937 A2.160-84 164 245 Bio46.60-84 2 995 400 Bio62.60-84 2 995 400 B27.145-169 164 245

Fez-se a cultura de PBL de um dador normal (HLA-A3; B-7, 38; Cw4; DR4,6) com ty (HLA-A2; B7; DR4,6) ou H0M2 (HLA-A3; B27) na presença de 10-100 ,ug/ml de péptido. Após 6 dias, testou-se a lise em células CIR marcadas com 0lCr, que expressam, ou HLA-A2.5, ou HLA-B2705. São apresentados resultados para a lise específica para HLA-A2, mas obtiveram-se resultados semelhantes para a lise específica para HLA-B27. O efeito não era específico do alelo, uma vez que a diferenciação do CTL específico para várias moléculas de HLA diferentes foi inibida. Nenhum dos péptidos afectou as respostas restritas à classe II, incluindo respostas mistas de linfócitos e a proliferação induzida por mitogénios.

Fez-se a cultura de PBL de dadores normais a 5x105 células/poço de microtítulo de fundo redondo, em RPMI-1640 suplementado com soro fetal de bovino a 10% e L-glutamina. As culturas foram suplementadas, quer com 5x103 linfoblastos B irradiados (10 000 R) transformados com PBV, quer com 10 μg/ml de fito-hemaglutinina P (PHA-P). As células foram incubadas a 37°C durante 3 dias, para PHA-P e 5 dias para o aloantigénio, altura em que se adicionou 3H-timidina (2 μΙ/poço). Após 16 horas, os poços foram recolhidos e determinou-se a incorporação de 3H-timidina num contador de cintilações.

85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ 29

Exemplo 14

Efeito de sequências truncadas na lise e na diferenciação

Uma vez que os péptidos B2702.60-84 e B2705.60-84 diferiam em apenas 3 aminoácidos, prepararam-se péptidos adicionais para analisar o efeito destas diferenças. Sintetizaram-se três péptidos adicionais:

HLA-B2702.75-84 RENLRIALRY HLA-B2705.75-84 REDLRTLLRY HLA-B2702/05.60-69 WDRETQICKA

De acordo com os processos descritos no Exemplo 13, o péptido que corresponde aos resíduos 60-69 de HLA-B2702/05 não teve efeito nos testes acima descritos. O péptido que corresponde aos resíduos 75-84 de HLA-B2702 bloqueou todas as respostas de CTL específicas de Classe I, enquanto que o péptido correspondente à mesma região de HLA-B2705 não o fez.

Para determinar que resíduo(s) mediou(mediaram) os efeitos inibitórios, sintetizaram-se mais 3 péptidos, em que se introduziram alterações de um único aminoácido nos resíduos 77, 80 e 81, para converter a sequência B2702 na sequência B2705, nessa posição. Os péptidos B2702.75-84{D) e B2702.75-84(L) ainda bloquearam a lise pelo CTL existente e a diferenciação de pré-CTL, enquanto que o péptido B2702.75-84(T) não teve actividade inibitória. Assim, a isoleucina na posição 80 é necessária para a inibição.

HLA-B2702.75-84ÍD) ! REDLRIALRY HLA-B2703.75-84(T) | RENLRTALRY HLA-B2702.75-84(L) RENLRILLEY

Também se verificou, pelo teste seguinte, que ο B2702.60-84, o B38.60-84 e ο B2702.75-84, quando pré-ligados a plástico, provocaram a ligação das células. Nenhum dos outros péptidos mostrou ter este efeito. No entanto, quando o péptido B2702.60-84 foi conjugado com albumina de soro bovino, ou com esferas, através da cisteína no resíduo 67, perdeu-se o efeito bloqueador e a capacidade de ligar células a plástico. 30 85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ Ο processo de ligação ao plástico foi como se segue: dissolveu-se o péptido (100 μg/ml) em PBS e adicionaram-se 50 μΙ a poços de microtítulo de fundo redondo, ou a placas de Petri de 5-10 μΙ. Após 60 minutos a 37°C ou durante a noite a 4°C, a solução foi removida e as placas foram lavadas duas vezes em RPMI-1640 suplementado com soro fetal de bovino a 10%.

Adicionaram-se as células e incubaram-se a 4°C durante 30 minutos. A ligação a placas de Petri foi determinada inspeccionando as placas num microscópio, após agitação suave. A ligação aos poços de microtítulo foi determinada após centrifugação a 500 rpm durante 3 minutos. As células que não se ligaram, formaram uma pelete pequena no fundo do poço, enquanto que as células que se ligaram não formaram a pelete. A ligação ocorreu igualmente bem a 4°C, 25°C e 37°C e não era dependente' de catiões bivalentes adicionados exogenamente, uma vez que a ligação foi observada em meio contendo EDTA. No entanto, se as células forem pré-incubadas com NaN3 a 1 % ou fixadas com paraformaldeído, não se observa nenhuma ligação, indicando que são necessárias células viáveis e muito provavelmente a produção de ATP.

Exemplo 1 5

Efeito dos péptidos no prolongamento da sobrevivência do enxerto de coracão heterotópico de rato A fim de estudar o efeito dos péptidos, por si só ou com drogas imunoinibitórias, os ratos DA ou Lewis receberam um aloenxerto de coração heterotópico abdominal, de um dador PVG (porquinho-da-índia). Os receptores do enxerto (10 a 12 por grupo) ou não eram tratados (Grupo i), ou receberam diferentes regimes (Grupos ii a vi). A sobrevivência dos enxertos foi determinada por palpação do batimento do coração transplantado. Os animais do grupo ii foram injectados com 2-10 mg de B2702.75-84, I.V., 7-10 dias antes do transplante. Observou-se um prolongamento ligeiro, mas significativo, da sobrevivência dos enxertos nos animais tratados do grupo ii.

Os animais do grupo iii foram tratados com uma dose sub-terapêutica de ciclosporina A(CsA) (20 mg/kg, oralmente, diariamente aos dias 0-4). Estes animais rejeitaram os seus enxertos no dia 1 5 após o transplante. Os animais do grupo iv foram tratados com 10 mg por rato de B.2702-75-84, 7 dias e 1 31 85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ dia antes do transplante, receberam um aloenxerto de coração ao dia CTe em seguida foram tratados como no grupo iii, com CsA (20 mg/kg), aos dias 0-4. Observou-se um prolongamento bastante significativo da sobrevivência do enxerto, em que aproximadamente 40% destes animais mantiveram os seus enxertos durante mais de 100 dias.

Os animais do grupo v foram tratados com uma dose sub-terapêutica de globulina anti-timócito (ATG, 20 mg/kg I.V. aos dias -3 e -2) como no grupo v e 10 mg I.V. de B2702.75-84 aos dias -1 e 0 e receberam um enxerto de coração ao dia 0. Estes animais também apresentaram um prolongamento significativo do seu enxerto.

Além disso, mais de 60% dos ratos mantiveram os seus enxertos durante >100 dias quando tratados com o péptido B7.75-84 (R E S L R N L R G Y). Deve ter-se em conta que os péptidos utilizados são péptidos HLA humanos e não péptidos de rato. Apesar disso, estes péptidos apresentam uma actividade forte.

Na tabela seguinte apresentam-se os resultados.

Tabela

Prolongamento da sobrevivência do enxerto de coração heterotópico de rato por B.2702 DIA DE REJEIÇÃO MÉDIA (i) Sem tratamento 6,6,6,7,7,7,8,8,8,8,8,8 7,25 (ii) apenas B-2702 8,8,8,8,9,9,10,10,10,10,10,10, 9,17 (iii) apenas CsA 10,12,12,14,15,15,15,16,16,20 14,5 (iv) CsA+ B2.2702 22,22,23,24,25,25,25, > 100, > 100, > 100, > 100, > 100 NR (v) ATG 10,10,11,11,11,11,12,12,12,13 11,3 (vi)ATG + B.2702 12,12,13,13,18,18,20,20,20, > 100, > 100, > 100 NR

Tabela

Significância estatística das experiências de transplante de coração valor de P do teste valor de P do teste "Long-Rank" de Wilcoxon (ii) versus (i) 0,0001 0,0002 (iv) versus (iii) 0,0001 0,0001 (v) versus (iv) 0,0001 0,0001 !

ãJ 85 665 jgz EP 0 631 502/PT ^l§â®

32 fL

Exemplo 1 6

Ligação do péptido B.2702.75-84 a proteínas celulares

As células foram marcadas radioactivamente e os lisados foram ligados a poços de microtítulo revestidos com B.2 ou péptidos irrelevantes. Esgotaram-se 108 células T CD8+ das reservas internas de cisteína e metionina, fazendo a sua cultura prévia durante 4 h em RPMI-1640 isento de cisteína e metionina, suplementado com soro fetal de bovino a 10% dialisado e L-glutamina 1 mM. Adicionou-se 35S-metionina e cisteína (5 mCi) cada) e incubaram-se as células a 37°C durante mais 4 h. As células foram sedimentadas em peletes e ressuspensas em 1 ml de tampão de lise (CHAPS 10 mM, leupeptina 1 ag/, PMSF 0,2 mM, azida de sódio 0,03%, NaCI 150 mM, Tris-HCI 50 mM, pH 8,0). As células foram lisadas em dois ciclos de congelamento e descongelamento e os núcleos foram sedimentados em peletes por centrifugação a 20 OOOxg durante 20 min. Removeu-se o sobrenadante e adicionaram-se 100 μΙ a poços de microtítulo que tinham sido pré-revestidos com péptido ou anticorpo PA2.6 anti-MHC de classe I (50 pg/ml, 200 μΙ/poço, lavado e bloqueado com PBS/soro fetal de bovino a 2%). Fizeram-se seis réplicas dos poços, para cada péptido. A placa foi incubada num agitador rotativo a 4°C, durante a noite, removeu-se o sobrenadante e os poços foram, cada um, lavados duas vezes com PBS/soro fetal de bovino a 2% e uma vez com PBS suplementado com 0,5% Nonidet P-40, 0,1% de desoxicolato e 0,05% de dodecilsulfato de sódio (SDS). As proteínas ligadas foram eluídas com tampão contendo 2% de SDS e resolvidas por SDS-PAGE a 11%. Para visualização das proteínas marcadas, o gel foi impregnado com Enhance. Verificou-se que o péptido B.2702.75-84 se liga a uma molécula de 27 kD. Além disso, os mesmos resíduos que se verificou serem críticos para a inibição da citólise por CTL, também afectam a ligação da molécula de 27 kD.

Exemplo 17

Actividade peptídica na ligação e efeitos celulares

Seguindo os processos descritos anteriormente, estudaram-se vários péptidos diferentes quanto à sua actividade. Em particular, os péptidos dos antigénios raros HLA-E e G foram comparados com os péptidos dos antigénios HLA-A e B. A tabela seguinte mostra os resultados.

85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ 33

PÉPTIDO SEQUÊNCIA I II III IV V VI VII VIII CONS.75-84 RESLRTLRGY i B7.75-84 -----IM— ! + - - - - - - B2702.75-84 --N-IALR- + ! + + + -r + + ! + HLA-E.75-84 j -VN.....R- + ; + + + + + - NR A2.75-84 -VD-G..... : - - - - - - Bw46.140-1 55 j - + - 1 • i NR NR NR HLA-1.222-235 i | - + - 1 - NR NR HLA-G RMNLQTLRGY NR + J_-..1.1.] i_L_ NR NR

Testes: I = ligação de linfócitos a placas pré-revestidas com péptldo II = inibição da lise por CTL estabelecidos III = bloqueio da lise por CTL estabelecidos IV = bloqueio da lise por células NK frescas

V = inibição da proliferação estimulada por Con A VI = bloqueio da produção de IL-2

VII = precipitação da proteína de 27 kD VIII = bloqueio da elevação de Ca2' em Jurkat É evidente pelos resultados acima que os fragmentos das regiões polimórficas de antigénios de MHC de classe I podem encontrar aplicação na modulação da actividade de CTL e noutros fins associados à ligação dos antigénios de MHC de classe I e proteínas que se ligam a estes antigénios. As composições do presente invento podem ser utilizadas para a inibição da toxicidade de CTL contra um alvo, tal como no caso do transplante, em que esta actividade é indesejável. Alternativamente, as composições do invento podem ser utilizadas para direccionar moléculas para os CTL. Alternativamente, as composições do invento podem ser conjugadas com um antigénio de interesse para activar os CTL a lisar as células portadoras de antigénios diferentes dos que são reconhecidos pelo CTL, podendo assim induzir o CTL a lisar as células portadoras de antigénios crípticos para o hospedeiro, tal como em doenças parasíticas e neoplasia. Os compostos do invento podem ter utilidade em estudos virais, para determinar sequências de MHC associadas com a restrição de células T, no caso de infecção virai. Os péptidos podem também ser utilizados para identificar as células T que se ligam especificamente aos péptidos no contexto de um antigénio MHC particular. Assim, podem-se isolar subconjuntos de CTL, identificar a presença de CTL particulares, que podem ser úteis para prever o sucesso de um transplante alogénico ou se as medidas terapêuticas serão garantidas, ao investigar o aparecimento de tolerância ou falhas no repertório, e na detecção de doenças auto-imunes. 34 85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ A capacidade bloqueadora genérica dos compostos peptídicos permitirá a sua utilização geral com todos os tipos de HLA, particularmente com receptores de transplantes de órgãos. O efeito específico dos compostos peptídicos na produção de CTL, mas não na lise, por CTL existentes, permite respostas de memória fracas, bloqueando ao mesmo tempo o desenvolvimento de respostas específicas do dador.

Embora o presente invento tenha sido descrito com algum pormenor a título ilustrativo e de exemplo, para fins de clareza de compreensão, os peritos na arte reconhecerão facilmente, à luz dos ensinamentos do presente invento, que se podem efectuar algumas alterações e modificações, sem afastamento do âmbito das reivindicações em anexo.

Lisboa, _5_ ^ ^

Por THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JÚNIOR UNIVERSITY

ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. ind. Rua das Flores, 74-4.* leso LISBOA

Claims (12)

1. 85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um péptido para o fabrico de um medicamento para utilização num método de tratamento que compreende a modulação da actividade citotóxica de linfócitos T (CTL), em que o referido péptido é isolado e compreende pelo menos 10 aminoácidos dentro da sequência alargada: Q T aa74 R aa76 aa77 L aa79 aa80 aa81 aa82 aa83 Y; em que aa74 é D, Y ou H; aa76 é E, M ou V; aa77 é D, S, A, G ou N; aa79 é R, Q ou G; aa80 é T, I ou N; aa81 é A ou L; aa82 é R ou L; e aa83 é G ou R; sozinho, ou ligado a pelo menos a porção terminal de uma das seguintes sequências WDRETQICKAKA, WDRETQKYKRQA, ou WDRETQISKTNT.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido péptido compreende pelo menos 10 aminoácidos dentro da sequência alargada: Q T aa74 R aa76 aa77 L aa79 aa80 aa81 aa82 aa83 Y; em que: aa76 é E ou V; aa79 é R ou Q: pelo menos um de aa81aa82 é L.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que o referido péptido é ligado em pelo menos um terminal, a outra que não uma sequência do tipo selvagem do antigénio HLA natural, compreendendo a referida sequência e, quando não ligado, termina com a referida sequência alargada.

   85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ 2/3
4. 4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido composto peptídico está ligado de forma covalente a um composto capaz de proporcionar um sinal detectável.
5. 5. Utilização de um péptido para o fabrico de um medicamento para utilização num método de tratamento, que compreende a modulação da actividade de CTL, em que o referido péptido compreende a sequência: WDRETQICKAKAQTDRENLRIALRY, ou um seu fragmento, de pelo menos 10 aminoácidos, ou a referida sequência ligada em pelo menos um terminal a outra que não uma sequência do tipo selvagem do antigénio HLA natural compreendendo a referida sequência e, quando não ligado, termina com a referida sequência.
6. 6. Utilização de um composto peptídico isolado para o fabrico de um medicamento para utilização num método-de tratamento que compreende a modulação da actividade de CTL, em que o referido péptido compreende a sequência: WDRETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGY, ou um seu fragmento de pelo menos 10 aminoácidos, ou a referida sequência ligada em pelo menos um terminal a outra que não uma sequência do tipo selvagem do antigénio HLA natural compreendendo a referida sequência e, quando não ligado, termina com a referida sequência.
7. 7. Utilização de um péptido para o fabrico de um medicamento para utilização num método de tratamento que compreende a modulação da actividade de CTL, em que o referido péptido compreende a sequência: WDRETQISKTNTQTYRESLRNLRGY, ou um seu fragmento, de pelo menos 10 aminoácidos, ou a referida sequência ligada em pelo menos um terminal a outra que não uma sequência do tipo selvagem do antigénio HLA natural que compreende a referida sequência e, quando não ligado, termina com a referida sequência.
8. 8. Utilização de um péptido para o fabrico de um medicamento para utilização num método de tratamento que compreende a modulação da actividade de CTL, em que o referido péptido não tem mais que 30 aminoácidos e inclui a sequência: RENLRIALRY; RESLRNLRGY; RVNLRTLRRY; RMNLQTLRGY; 85 665 ΕΡ Ο 631 502/ΡΤ 3/3 REDLRTLLRY; ou WDRETQICKA.
9. 9. Método para a modulação da actividade citolítica de um CTL in vitro, em que o referido método compreende: combinação do CTL com um péptido, como definido na reivindicação 1, numa quantidade para modular a actividade citolítica.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o referido composto peptídico é ligado em pelo menos um terminal, a outra que não uma sequência do tipo selvagem do antigénio de HLA natural compreendendo a referida sequência e, quando não ligado, termina com a referida sequência. 1. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o referido composto peptídico tèm a sequência: WDRETQICKAKAQTDRENLRIALRY, WDRETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGY, WDRETQISKTNTQTYRESLRNLRGY, ou um seu fragmento, de pelo menos 10 aminoácidos ou a referida sequência ligada em pelo menos um terminal, a outra que não uma sequência do tipo selvagem do antigénio HLA natural compreendendo a referida sequência e, quando não ligado, termina com a referida sequência, em que a referida sequência inibe a actividade citotóxica de linfócitos.
11. 12. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o referido péptido compreende os aminoácidos 75-84 de um antigénio HLA-B.
12. 13. Método para bloquear a diferenciação de CTL in vitro, em que o referido método compreende: colocar em contacto o CTL com um péptido com a sequência definida na reivindicação 8, numa quantidade suficiente para bloquear a diferenciação. Lisboa, -5. OIZ. 2DG0 Por THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JÚNIOR UNIVERSITY - O AGENTE

    ENG.· ANTÓNIO JOÃÔ DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Ruo dos Flores, 74 - 4.· -leSQ LISBOA