KR930002835B1 - 자기면역 개선에 유용한 mhc-중재 독성 포합체 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

자기면역 개선에 유용한 MHC-중재 독성 포합체
[도면의 간단한 설명]
제 1 도는 본 발명의 전형적 복합체의 다이아그램이다.
제 2 도는 사람 HLA-A2 항원(클래스 I)의 삼차원 구조를 도시한다.
제 3 도는 변형된 클래스II MHC-코드화된 당단백질의 활성부분의 다이아그램 표시를 도시한다.
제 4 도는 바람직한 제 2 세대 MHC단백질 고안을 도시한다.
제 5 도는 항원제공세포의 표면을 모방한, MHC 당단백질을 포함하는 평면막 이중층의 다이아그램이다.
제 6 도는 아세틸콜린 수용체 단백질의 알파 하위단위에 대한 아미노산 서열 및 코드화 mRNA를 도시한다.
제 7 도는 미엘린 염기성 단백질의 아미노산 서열을 도시한다.
제 8 도는 I-Ab-알파사슬을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
제 9 도는 I-Ab-베타사슬을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
제10도는 사람에 있어서의 DQ/DR 하플로타입(단순형)의 목록 및 그들의 자기면역질병과의 연관성을 제시한다.
제11도는 자기면역 질병의 진단 및/또는 치료에 본 발명의 복합체를 이용하기에 적합한 프로토콜을 도시한다.
제12도는 NP-40 가용성 막 추출물을 함유하는 I-Ak의 제조 개략도를 도시한다.
제13a도는 10-2.16 단일클론성 항체의 친화성 정제 및 그것의 CNBr 활성화 세파로스 4B에의 커플링에 대한 개략도이다.
제13b도는 제13a도의 개략도에 따라 정제된 10-2.16 단일 클론성 항체의 순도를 보여주는 겔의 사진이다.
제14도는 I-Ak의 정제를 위한 개략도를 도시한다.
제15도는 제14도의 개략도에 의해 정제된 I-AR의 순도를 보여주는 폴리아크릴아미드 겔이다.
제16도는 I-Ak(IAk로도 호칭됨) 및 MBP(1-13)을 함유하는 복합체에 의한 증식 억제에 관한 8가지 연구결과를 보여주는 막대그래프이다.
제17도는 MBP(1-13)에 의한 면역화에 감작으로부터 유발하는 마우스에 있어어 EAE의 전개를 보여주는 그래프이다.
제18도는 MBP(1-11)로 면역시킨 후 마우스의 B10A(4R)계통으로부터 얻은, T세포클론 4R3.4에 의한 EAE의 양자이입을 보여주는 그래프이다.
[발명의 상세한 설명]
[기술분야]
본 발명은 자기면역질병의 치료 및 그런 질병의 치료 및 진단에 유용한 물질 및 방법에 관한 것이다.
본 발명은 특히, 자기면역에 관련된 항원의 부분을 나타내는 펩티드를 갖고있는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 당단백질 복합체를 사용하여 헬퍼 T세포를 표적으로 삼는 복합체에 관한 것이다.
이들 복합체는 더욱이 진단목적을 위해 방사성 동위원소나 기타 표지물과 포합되거나, 또는 복합체를 치료적으로 유용하게 할 수 있는 독소 또는 기타 물질에 포합될 수 있다.
[배경기술]
30종 이상의 자기면역질병이 현재 알려져 있다.
이중에는 중증근무력증(MG)과 다발성경화증(MS)를 비롯하여 일반관심을 많이 받는 여러병이 포함된다. 이들 질병의 특징은 면역시스템에 의한 환자의 조직에의 공격인데, 이들 조직항원은 비환자에 있어서는 면역시스템이 "자체"로 인식하기 때문에 내성이 된다.
자기 면역질병에 있어서는 이 인식이 일어나지 않는것 같으며, 환자의 조직은 침입자로 취급된다. 즉, 면역시스템은 이 추정되는 외래 표적을 파괴하고자 한다.
자기면역질병을 치료하는 대강의 방법은 물론 일반적인 면역억제법이다. 이 방법은 이환자가 진짜 외래물질에 반응하여 면역반응을 행할 필요가 있는경우, 그 반응할 능력을 손상시키는 명백한 결점을 갖고 있다.
단지 약간 더 정교한 방법은 표적조직을 포함하여 항체 또는 면역 복합체를 제거하는 것에 의존한다.
이 방법도 나쁜 부작용이 있고 성공시키기가 곤란하다.
다음에 상술하는 본 발명에 의한 방법은 "클론형(clonotypic)"약제에 의존한다. 즉 자기항원에 반응하는 면역시스템의 세포만을 공격하는 약제를 사용한다.
오늘날 면역반응을 나타내는 것으로 생각되는 일반적 기본이론에 의하면, 1959년 버어넷(Burnet)이 처음으로 제안한 것처럼, 제공된 특정항원은 클론팽창을 일으킨다. 이 이론에 의하면, 특정 피검체는 각각 상이한 항원결정기와 결합하는 수용체를 갖고 있는 수십만의 T 및 B세포를 가질 것이다. 항원에 노출되면 항원은, 다른 것은 무시하고, 그것이 함유하고 있는 항원결정기에 대한 적합한 수용체를 갖고 있는 세포에 선택적으로 결합된다.
이 결합으로 각각 수용체가 같은 것이 특징인 클로닝된 수천의 딸세포가 생긴다. 클론형 약제는 관심하의 항원에 적합한 T 및 B세포의 하위세트에만 영향을 미친다.
본 발명의 조성물의 경우에는, 항원결정기는 통상 자기면역질병에 연관된 것이다.
본 발명의 클론형 약제 조성물은 자기면역질병에 감염된 조직의 항원결정기(들)에 특이적인 클론을 나타내는 T헬퍼세포를 표적으로 삼도록 특정적으로 설계된 것이다. T헬퍼세포는 단지 MHC 단백질과 연합하여서만 결정기를 인식하며, 따라서 본 발명의 복합체는 MHC 단백질의 유효부분을 함유한다.
근년에 있어 특정 항원에 대한 면역반응을 저지하고자 한 몇가지 관련방법이 알려졌다. 예컨대 자기항원 티로글로불린을 리신 A와 포합시켰는데, 그 포합체는 보통은 그 항원에 반응하는 림프구의 시험관내 항체반응을 특이적으로 억제함이 발견되었다.
그런 면역독소는 자기항체-분비 림프구 클론을 특이적으로 삭제할 것이라는 제안이 있었다(Rennie, D.P., et al., Lancet(Dec. 10, 1983)1338-1339) 디이너등(Diener, E., et al.,Science(1986)231: 148-150)은 감산성(acid-sensitive)스페이서를 사용하여 다우노마이신을 합텐(이 경우에는 오브알부민의)에 포합시킴으로써, 림프구 기능을 항원 특이적으로 억제시키는 화합물의 합성을 제안하였다.
이 포합체는 시험관내 및 생체내에서 B림프구에 의한 항체분비가 합텐특이적으로 억제되게 했다. 다우노마이신(감산성 스페이서를 가진)의 T세포에 특이적인 단일 클론성 항체와의 포합체도 또한 T림프구에 의한 콘카나발린 A에의 반응을 제거하였다.
스티르즈등(Steerz,.K.M., et al.,J Immunol(1985)134: 841-846)은 독소 포합체에 있어 독성원소로서 방사선을 이용했다.
전기 물고기에서 얻은 방사선 표지 정제 수용체를 쥐들에게 투여한 뒤 저온 수용체를 주사했다. 수용체주사는 실험적으로 자기면역 중증근무력증(EAMG)을 유발하는 표준절차다.
저온 수용체나 또는 방사표시 알부민중 어느 하나만을 미리 주사맞은 대조쥐들은, 병유발을 위해 수용체를 투여하기 전에의 증상을 나타냈다. 그런데, 방사적으로 표지된 수용체로 미리 처치된 쥐들은 증상이 약하였다.
표지된, 따라서 파괴적인 수용체가 면역성의 세포를 선택적으로 제거한 것으로 추측되었다. 사전처치를 위해 리신/수용체 포합체를 이용하는 유사한 연구가 킬렌등(Killen, J.A., et al.,J Immunol(1984)133: 2549-2553)에 의해 보고되었다.
전반적으로 T세포 파괴를 일으키는 덜 특정적인 방법은 힉손(Hixson, J.R.,Medical Tribune(Jan. 28. 1987)4-5)이 보고한 바와같은 IL-2/독소 포합체로 처리하는 것이다. 역으로, 그러나 관련된 접근법이 리우등에 의해 보고된 바(Liu, M.A., et al.,Science(1988)239: 395-397), 그 방법은 세포독성 T-세포 특이성에 관계없이 소정 표적으로 세포 독성 T-세포를 연결하는 것에 관한 것이다.
이 방법에서는 일반적 세포독성 T림프구 수용체 CD3에 특이적인 항체를 표적 종양세포위의 표면 수용체에 특이적인 호르몬과 포합시켰다. 포합체는 세포독성 T림프구를 활성화시켜 흑혈구 자극호르몬이 사용된 호르몬인 경우 사람 흑종세포를 파괴할 수 있었다.
현재의 면역 모델은, 항원이, 주요 조직적합성 복합체(MHC)의 유전자에 의해 코드화된 클래스II 당단백질을 그 표면에 갖고 있는 항원제공세포(APC)에 의해 섭취됨으로써 면역반응을 적어도 부분적으로는 활성화한다고 가정하고 있다.
그런뒤 항원은 표면결합된 MHC 당단백질의 배경내에 있는 특정 T헬퍼세포에 주어지고, 항원특이 T세포 수용체가 이 항원 당단백질 복합체와 상호 반응함으로써, T헬퍼 세포는 자극되어 세포독성 T세포기능의 유발, B세포기능의 유발을 포함하는 항원 특이적 면역반응을 중재하고 이 반응을 보조, 촉진하는 다수의 인자의 분비를 중재한다.
MHC 클래스II 단백질이 자기면역질병에 관여하는 것은 동물모델에서 밝혀졌다.
MHC 클래스II 단백질 자체에 대한 항체 또는 MHC클래스 유전자의 발현을 일으키는 약제에 대해 항체를 투여하는 것은 이들 모델계에 있어 자기면역상태의 전개에 방해가 된다. 헬퍼 T세포의 역할은 또한 이들 모델에 있어 항-CD4 단일 클론성 항체를 사용하는 자동 면역시스템에 역작동을 하는 것으로 증명되었다. 그런데 CD4는 특징적인 헬퍼 T세포 수용체이다(Shizuru, J.A. et al.,Science(1988)240; 659-662).
[본발명의 개시]
본 발명은 바람직하지 않은 자기면역의 원인이 되는 면역시스템의 그러한 양상들을 확인하여 파괴하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물 및 방법은 MHC에 의해 코드화된 당단백질과 관련된 특정 항원을 인식하는 헬퍼 T세포를 표적으로 삼고저 하는 것이다.
본 발명의 복합체는 T림프구 및 항원에 대한 면역시스템의 기타 세포와의 상호작용을 유발하여 효과적으로 항원제공 세포를 대신한다. 단리된 MHC 클래스II 항원은 그 자체로 또한 단독으로 T-헬퍼림프구에 대한 항원에피토프를 제공하여 효과적으로 항원제공세포를 대신할 수 있다(Watts, T. H., et al.,Proc Natl Acad Sci USA(1984)81: 7564-7568). 그러나 항원 제공 세포(APC) 표면에 대해 독소와 같은 이펙터(effector) 기능을 대치시킴으로써, 항원을 그렇지 않으면 발생할 면역반응을 오히려 파괴하는데 효과적이게 할 수 있다.
APC 표면 대신 표지를 대치함으로써 항원이 상호 작용하는 면역시스템의 부분을 항원이 확인하게 할 수 있다.
본 발명은 자기면역반응을 일으키는 자기항원에 의해 일어나는 것과 유사하지만, 예컨대 면역시스템의 관련부분을 확인할 수 있게 하는 기능, 그리고 더욱 중요한 것으로, 면역시스템이 바람직하지 않은 방식으로 반응하는 능력을 파괴하는 기능과 같은 추가기능을 제공할 수 있도록 변형하여, 면역시스템과 상호 작용하는 자기항원형을 제공하는 것이다.
한 구체예에 있어서, 본 발명의 조성물은
(1)MHC-코드화된 항원 제공 당단백질의 유효부분 ;
(2)항원의 유효부분 ; 및 (3) 이펙터의 3성분 복합체이다.
공유 또는 비공유 결합으로 결합될 수 있는 앞의 두성분은 다시 가장 일반적으로 독소 또는 표지인 세번째의 이펙터 성분에 포합된다. 이펙터 성분은 APC표면을 대신하고, 면역시스템 표적에 관한 복합체의 효과를 변경시킨다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 조성물은 (1)MHC 코드화된 항원 제공당단백질의 유효부분 및 (2)항원의 유효부분의 정제된 2성분 복합체이다. 이들 두 성분은 공유결합적으로 또는 비공유 결합에 의해 결합될 수 있다.
그리하여 한 양상에 있어서, 본 발명은 상술한 복합체인 물질의 조성물에 관한 것이다. 다른 양상에 있어서, 본 발명은 본 발명의 복합체를 활성성분으로 하는 약학조성물에 관한 것이고, 또한 본 발명의 복합체 및 약학조성물을 사용하여, 특정 항원 특히 자기 항원에 대해 면역시스템을 감쇄 조정하는 방법 및 특정항원과의 반응성을 가진 면역시스템의 부분을 확인(동정)하는 방법에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 한 양상은 다음식의 복합체이다.
X1_MHC2_펩티드 (1) 또는
MHC2펩티드1_X (2)
상기식에서,
X는 독소와 표지군으로부터 선태된 기능부를 표시하며, MHC는 MHC당단백질의 유효부분을 표시하는데, 이 당단백질은 당단백질이 통상 존재하는 세포표면으로부터 분리되고, "펩티드"는 자기항원과 관련된 에피토프 함유 항원성 펩티드를 표시하며, 1은 공유결합, 또는 공유결합에 의해 식(1)에 있어서는 X와 MHC에 결합되고 식(2)에 있어서는 X와 펩티드에 결합된 2가 링커를 표시하며, 2는 공유결합, 비공유연결 또는 MHC와 펩티드에 공유적으로 결합된 또는 연결된 링커를 표시한다.
본 발명의 다른 양상은 치료를 필요로 하는 척추동물에 X가 독소인 복합체 또는 복합체가 활성성분인 약학조성물을 투여하는 것으로 되어 있는 척추동물환자에 있어 자기면역질병을 치료하는 방법이다.
본 발명의 또다른 양상은 치료를 요하는 척추동물에 X가 표지인 복합체 또는 복합체가 활성성분인 약학조성물을 투여하는 것으로 되어 있는 척추동물 환자에 있어 자기면역질병을 모니터하는 방법이다.
본 발명의 또다른 양상은 MHC-II함유 세포로부터 MHC-II 당단백질을 단리하는 단계, 상기 MHC를 펩티드와 함께 배양하는 단계 ; 그리고 투석에 의해 과잉의 펩티드를 제거하는 단계로 되어 있는 다음식의 조성물을 제조하는 방법이다.
MHC2_펩티드
상기식에 있어 MHC, 2, 및 펩티드는 청구범위 제 1 항에 정의된 바와같다.
[발명을 수행하기 위한 형태]
본 발명의 복합체는 면역시스템에 관련영향을 가진 자기항원 또는 기타 항원서열을 나타내는 펩티드, 항원제공에 관여하는 MHC코드화된 당단백질의 유효부분, 및 일반적으로 독소 또는 표지인 이펙터 성분의 3성분을 포함하고 있다. 일반적으로 이펙터 부분은 MHC코드화 당단백질, 또는 어떤 경우에는, 항원에 공유적으로 포합되어 있으며, 펩티드 항원과 MHC 단백질 사이의 연결은 공유결합 또는 비공유결합일 수 있다. 시스템의 각 성분을 다음에 따로따로 설명한다. 그다음에 이들 복합 체를 제조, 평가 및 사용하는 방법이 기술될 것이다.
[MHC-유도성분]
MHC에 의해 코드화된 당단백질은 사람 및 쥐시스템에 있어 광범위하게 연구되었다. 일반적으로 이 당단백질은 모든 세포의 표면에서 발견되고 주로 세포독성 T세포에 의해 인지되는 클래스 I 당단백질, 및 마이크로파지와 같은 부세포를 비롯한 수종의 세포의 표면에서 발견되고 헬퍼 T세포에 항원으로 제공하는데 관여하는 클래스II 단배질로 분류되었다. 수종의 조직접합성 단백질이 단리되고 특성 결정되었다.
쥐I-A(클래스II)조직적합성 단백질을 정제하는 방법이 터어케위츠등(Turkewitz, A.P., et al.,Molecular Immunology(1983) 20 : 1139-1147)에 의해 공개되었다.
I-A 및 I-E 하위영역에 의해 코드화된 단리된 항원은 32-38kd의 알파사슬과 26-29kd의 베타사슬의 두 비공유결합펩티드 사슬로 구성된 것이 밝혀졌다. 세번째의 불변의 31kd펩티드는 이들 두 펩티드와 비공유적으로 연결되어 있으나, 그것은 폴리모르프성이 아니고 세포 표면상의 항원의 성분이 아닌것 같다(Sekaly, R. P.,J Exp Med(1986)164: 1490-1504). I-A 영역의 7종의 대립형질 변종의 알파 및 베타사슬은 클로닝되고 서열 결정되었다(Estess, "T-cell Clones", 3-19)
사람 클래스I 단백질도 연구되었다. 염색체 6상의 사람 MHC(HLA)는 세개의 유전자좌 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C를 갖고 있는데 처음의 둘은 동종항원을 코드화하는 다수의 대립형질을 갖고 있다.
이들은 모든 항원성 특이성에 공통인 44kd 하위단위 및 12kd의 베타 2-마이크로글로불린 하위단위를 구성하는 것으로 밝혀졌다.
이들 계면활성제-가용성 HLA항원의 단리는 Springer, T.A.등에 의해Proc Natl Acad Sci USA(1976) 73 : 2481-2485에; Clementson, K.J등에 의해 "Membrane Proteins"(Azzi, A., 편집 ; Bjorkman, P., Ph. D. Thesis Harvard (1984)에 기재되어 있다.
추가의 연구로 클래스I 사람항원인 HLA-A2의 3-D구조의 특징을 상세하게 알게되었다(Bjorkman, P.J., et al.,Nature(1987)329: 506-512, 512-518). 이 특징중 중쇄의 베타2-마이크로글로불린 단백질과 알파 3 절편은 연결되어 있고; 중쇄의 알파1 및 알파2 영역은 항원-결합포켓의 기저를 형성하는 것으로 여겨진다(Science(1987) 238 : 613-614; Bjorkman, P. J., et al.,Nature(상기동일)).
가용성 HLA-A2는 터너등에 의해 (Turner, M.J., et al.,J Biol Chem(1975)250: 4512-4519) ; 파르암등에 의해 (Parham P., et al.,J Biol Chem(1977)252: 7555-7567)기재된 바와같이, 동형접합성 사람 림프아구종 셀라인 J-Y로부터 원형질 막을 파파인으로 소화시킨 후에 정제될 수 있다. 파파인은 트란스멤브레인 영역에 가까운 44kd 사슬을 절단하여 알파1, 알파2, 알파3 및 베타2 마이크로글로불린으로 구성된 분자를 산출한다. 클래스I HLA-A2 항원의 추론된 3차원 구조를 제 2 도에 나타낸다.
클레스II MHC 항원의 3차원구조가 그렇게 상세히 공지되어 있지는 않지만, 클래스II 당단백질은 클래스I과 유사한 도메인 구조를 가질 것으로 생각된다. 그것은 막 이중층으로부터 연장된 2개의 클래스II 사슬의 N-말단 도멘인 부분으로부터 형성된다.
한사슬의 N-말단부분은 MHC클래스 I 항원 서열의 알파1 및 알파2 영역과 동종성인 2개의 도메인을 갖는다. 반대쪽의 사슬은 베타1 및 베타2로 표시된 2개의 도메인을 함유한다.
이들 클래스II 항원 유전자의 클로닝(Estess에 의해 기재된 바와같이(상기참조))은 예컨대 후술되는 바와같이, 클래스II MHC결합 도메인의 조작을 허용한다.
그러면 본 발명 복합체의 MHC 당단백질 부분은 림프구로부터 단리에 의해 얻어질수 있고, 원하는 펩티드 항원을 결합하는 능력에 대해 스크린될수 있다.
림프구는 복합체로 처리될 개체 종들로부터의 림프구이다.
예를들면, 그것들은 본분야 공지의 기술들을 이용하여 복제결핍 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스로 형질전환시킴으로써 불멸화된 표적화된 자기면역질병에 걸린 개체로부터의 사람 B세포로부터 단리 될수있다.
MHC 당단백질은 파파인으로 처리, 3M KCl로 처리, 및 세제로 처리함에 의한 용해화를 포함하는 각종 기술들을 사용하여 다수의 세포들로부터 단리되었다.
바람직한 방법에서는 림프구로부터 클래스II 단백질의 세제 추출에 이어서 친화성정제가 사용된다.
다음에, 세제는 투성 또는 선택결합비이드, 예를들면, 바이오 비이드에 의해 제거될수 있다.
또 다르게는 많은 클래스II 단백질의 아미노산서열이 공지되어 있고, 유전자가 클론되었으며 따라서 단백질이 재조합법을 사용하여 만들어질수 있다.
제 1 대 합성 MHC 단백질에서, 카르복시 말단을 절단하여 소수성 도메인을 삭제하여 중(알파)쇄와 경(베타)쇄가 합성되고, 카르복시말단은 독소 또는 표지물의 포합을 용이하게 하기 위해 임의적으로 선택될수 있다.
예를들면, 제 3 도에 나타내 MHC 단백질에서는 라인신잔기가 도입된다.
그외에, 사슬의 이황화 결합을 형성하는 수단을 제공하기 위해 카르복시말단 근처에 시스테인 잔기가 포함되며, 발현벡터내의 삽입과 유사체를 코드화하기 위한 유전자 서열의 조작에 도움을 주기 위한 제한 부위를 또한 포함할 수 있다.
다음에 알파쇄와 베타쇄가 적합한 숙주, 예를들면, 대장균, 효모, 또는 다른 적합한 세포에서 따로따로 발현된 발현 벡터들에 삽입되며 얻은 재조합 단백질들은 펩티드 항원의 존재하에 재조합된다.
유전자의 유용성은 서열의 조작을 쉽게 허용하기 때문에, 제 2 대의 바람직한 제조는 제 4 도에 예시된 바와같이 혼성 클래스 I과 클래스II의 특징을 포함하는데, 여기서 클래스II MHC의 알파1과 베타1도메인은 에지-데-에지(edge-to-edge) 베타 시이트 접촉을 가져오는 이들 도멘인들간의 분자내 2량화를 허용하는 가요성 부분을 통해 연결된다. 그때 베타1절편은 복합체를 안정화하기 위해 공동 발현된 베타2마이크로글로불린과 함께 클래스I의 알파2도메인에 융합된다. 클래스I 유전자의 트란스멤브레인 및 세포내 도메인도 또한 포함될 수 있으나 복합체를 운반하기 위해 리포좀이 사용되지 않는다면 그렇게 하는 것이 의미가 없을수도 있다. 더 간단한 변형은 독소 포함을 위한 C-말단 라이신을 가진 알파1및 베타1도메인만을 포함한다(제 4 도).
발현벡터의 제조와 적당한 DNA 서열로부터의 재조합 제조는 그 자체는 공지인 방법들에 의해 수행된다. 발현은 원핵세포 시스템 또는 진핵세포시스템에서 있을 수 있다. 원핵세포는 가장 빈번하게는 대장균의 각종 균주들을 말한다. 그러나, 간균속, 예를들면 고초균, 슈도모나스속의 여러가지종, 또는 다른 세균성균주와 같은 다른 미생물균주들이 또한 사용될 수 있다. 이러한 원핵시스템에서, 숙주와 적합성인 종으로부터 유도된 복제 부위와 제어서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 사용된다. 예를들면, 대장균은 전형적으로 볼리바르(Bolivar et al.,Gene(1977)2: 95)에 의해 대장균 종으로 부터 유도된 플라스미드인 pBR 322의 유도체를 사용하여 형질 전환된다. 임의적으로 작동유전자를 가지며 러보소옴 결합부위 서열과 함께 전사개시를 위한 프로모터를 포함하는 것으로 여기서 정의되는 통상 사용되는 원핵세포 조절 서열은 베타 락타마제(페니실리나제)와 락토스(lac) 촉진유전자 시스템(Change et al.,Nature(1977)198: 1056)과 트립토판(trp) 촉진유전자 시스템(Goeddel et al.,Nucleic Acids Res(1980)8: 4057) 그리고 람다-유도된 PL촉진유전자 및 N-유전자 리보소옴 결합부위(Shimatake et al.,Nature(1981)292: 128)와 같은 통상 사용되는 촉진 유전자를 포함한다. 원핵세포와 적합하면 어떤 유용한 촉진유전자 시스템도 사용될 수 있다.
상기와 다음에서, 본원에 인용되는 모든 문헌들은 여기서 참고로 포함된다. 진핵세포숙주에서 유용한 발현 시스템은 적당한 진핵세포 유전자로 부터 유도된 촉진유전자로 이루어진다. 효모에서 유용한 촉진유전자류는 예컨대 3-포스포 글리세레이트 키나제를 위한 촉진유전자(Hitzeman, et al.,J Biol Chem(1980)255: 2073)들을 포함하여 당분해 효소의 합성을 위한 촉진 유전자들을 포함한다. 다른 촉진유전자들은 엔올라제 유전자(Holland, M.J., et al.,J Biol Chem(1981)256: 1385) 또는 YEp13으로부터 얻은 Leu2유전자(Broach, J., et al.,Gene(1978)8: 121)로 부터의 촉진 유전자들을 포함한다.
적합한 포유동물 촉진유전자들은 SV 40으로부터의 초기 및 후기의 촉진 유전자들(Fiers, et al.,Nature(1978)273: 113) 또는 폴리오마, 아데노 바이러스II, 소 파필로마 바이러스 또는 조류 육종 바이러스로부터 유도된 것들과 같은 다른 바이러스 촉진유전자를 포함한다. 적합한 바이러스 및 포유동물 인핸서들이 위에 인용되어있다. 발현시스템은 본분야에서 잘 이해되는 표준 결찰 및 제한 기술을 사용하는 표준방법을 사용하여, MHC서열에 작동적으로 연결되는 전술한 제어요소로부터 제조된다. 단리된 플라스미드, DNA 서열 또는 합성된 올리고뉴클레오티드는 원하는 형태로 절단, 재단 및 재결찰된다. 부위 특이적 DNA 절단은 본분야에서 일반적으로 이해되는 조건들하에 적합한 제한효소(또는 효소들)로 처리함으로써 수행되고 그것들의 구체적인 것은 제조업자에 의해 명시되거나 또는 이들 시중 구입되는 제한 효소들이다. 예를들면, 뉴잉글랜드 바이오랩 제품 카탈로그(New England Biolabs, Product Catalog.)참조. 일반적으로 약 1㎍의 플라스미드 또는 DNA 서열은 약 20㎍의 완충액 용액에서 1단위의 효소에 의해 절단되며, 여기 실시예들에서는 전형적으로 DNA 기질의 완전소화를 보증하기 위해 과량의 제한효소가 사용된다. 약 37℃에서 약 1시간 내지 2시간의 인큐베이션시간이 효과적이나 변동이 허용될 수 있다. 각 인큐베이션후, 단백질은 페놀/클로로포름으로 추출에 의해 제거되고 이어서 에테르 추출을 할 수 있고, 에탄올로 침전시키고 이어서 세파덱스 G-50 스핀 컬럼을 통과시킴으로써 수성 분획으로 부터 핵산을 회수한다.
원한다면, 표준 기술을 사용하여 폴리아크릴아미드겔 또는 아가로오스겔 전기영동에 의해 절단된 단편의 크기 분리가 수행될 수 있다. 크기분리의 일반적인 설명은Methods in Enzymology(1980)65: 499-560에서 발견된다. 제한 절단된 단편은 50mM 트리스 pH 7.6, 50mM NaCl, 6mM MgCl2, 6mM DTT 및 5-10μM dNTP에서 20 내지 25℃에서 약 15 내지 25분의 배양시간을 사용하여 4개의 데옥시 뉴클레오티드 3인산염(dNTP)의 존재하에, 대장균 DNA 폴리머라제 I의 큰 단편(Klenow)으로 처리함으로써 블런트 끝으로 될 수 있다. 클레노우 단편은 5' 스티키끝을 채우고 4개의 dNTP가 존재한다 하더라도, 돌출한 3' 단일 스트랜드를 절단한다. 원한다면, 선택적 수복이 스티커끝의 성질에 의해 명령된 제한내에 단지 하나의 또는 선택된 dNTP를 공급함으로써 수행될 수 있다. 클레노우로 처리후, 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올 침전시킨다음 세파덱스 G-50스핀 컬럼을 통과시킨다. 합성 올리고 뉴클레오티드는 시중 구입되는 자동화된 올리고 뉴클레오티드 합성기를 사용하여 제조된다. 아닐링에 앞서 또는 표지화를 위한 단일 스트랜드의 활성화는 50mM 트리스, pH 7.6, 10mM MgCl2, 5mM 디티오트레이톨, 1-2mM ATP, 1.7pmoles32P-ATP(2.9mCi/mmol), 0.1mM 스퍼미딘, 0.1mM EDTA의 존재하에 0.1nmole기질에 과량, 예를들면 대략 10단위의 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 달성된다.
결찰은 다음의 표준상태 및 온도하에 15-30μl 부피에서 수행된다 : 20mM 트리스-HCl pH 7.5, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 33㎍/ml BSA, 10mM-50mM NaCl, 그리고 40μM ATP 및 0℃에서 0.01-0.02(Weiss)단위 T4 DNA 리가제("접착말단" 연결)와 1mM ATP 및 14℃에서 0.3-0.6(Weiss) 단위 T4 DNA 리가제("단면말단" 연결)중 어느 한가지 분자간 "접착말단" 연결을 보통 33-100㎍/ml 총 DNA 농도(5-100nM 총 끝농도)에서 수행된다. 분자간 단면말단연결(보통 10-30 배몰 과량의 링커를 사용함)은 1μM 총 단부농도에서 수행된다. "벡터단편"을 사용하는 벡터제조에서, 벡터단편은 보통 5' 인산염을 제거하고 벡터의 재결찰을 방지하기 위해 박테리아 알칼리성 포스파타제(BAP)로 통상처리된다. BAP 분해는 60℃에서 약 1시간동안 벡터 ㎍당 약 1단위의 BAP를 사용하여 Na+와 Mg+2의 존재하에 대략 150mM 트리스에서 pH8에서 행해진다. 헥산 단편을 회수하기 위해, 제제를 페놀/클로로포름으로 추출하고, 에탄올 침전시키고, 세파덱스 G-50 스핀 컬럼에 적용함으로써 탈염시킨다. 또 다르게는 재결찰은 원하지 않는 단편의 추가의 제한효소소화에 의해 이중 소화된 벡터들에서 방지할 수 있다. 서열 수정을 요하는CDNA 또는 게놈 DNA로부터 유도된 벡터의 부분들에 대해, 부위 특이적 프라이머 의존성 돌연변이 생성이 사용될 수 있다. 이것은 원하는 돌연변이를 나타내는 제한된 잘못 짝짓기를 제외하고 돌연변이될 단일 스트랜드의 파지 DNA에 상보하는 프라이머 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 행해진다. 간단히는 합성올리고 뉴클레오티드가 파지에 상보하는 스트랜드 합성을 행하도록 하는 프라이머로서 사용되고 결과되는 이중 스트랜드 DNA는 파지 지지숙주 박테리아로 형질 전환된다. 형질전환된 박테리아의 배양액을 톱 아가에 놓으면 파지를 은닉하는 단일 세포로부터 플라크형성이 허용된다.
이론상, 50%의 새로운 플라크가 단일 스트랜드로서 변이된 형태를 갖는 파지를 함유할 것이며, 50%는 원래의 서열을 가질 것이다. 결과된 플라크는 정확한 맞춤의 혼성체형성을 허용하는 온도에서 활성처리된 합성 프라이머로 혼성체 형성되지만, 그 온도에서 원래 스트랜드와의 잘못맞춤은 혼성체 형성을 방지하기에 충분하다. 그 다음 프로브와 혼성체 형성하는 플라크를 골라 배양하고 DNA를 회수한다. 그러나, 본 발명의 단백질에서 합성 유전자가 편리하게 사용된다. 유전자 설계는 이들 코드화 유사체로 코딩 서열 부분들을 대치하기 위한 용이한 유전자 조작을 허용하는 제한 부위를 포함할 수 있다. 플라스미드 제조를 위한 정확한 결찰은 대장균 제네틱 스톡센터(E.coliGenetic Stock Center), CGSC #6135로부터 얻은 대장균 균주 MM294, 또는 다른 적합한 숙주를 결찰혼합물로 1차 형질전환 시킴으로써 확인될 수 있다. 성공적인 형질전환체는 본분야에서 이해되는 바와같이 암피실린, 테트라사이클린 또는 다른 항생제 내성에 의해 또는 플라스미드 제조의 방식에 따라 다른 마아커의 사용에 의해 선택된다. 형질전환체로부터의 플라스미드는 다음에 클레웰(Clewell, D.B., et al.,Proc Natl Acad Sci USA(1969)62: 1159의 방법과, 임의적으로 이어서 클로르암페니콜 증폭(Clewell, D.B.,J Bacteriol(1972)110: 667)에 따라 제조된다. 단리된 DNA는 제한에 의해서 분석되거나 및/또는 상거(Sanger, F., et al.,Proc Natl Acad Sci USA(1977)74: 5463)의 디데옥시 방법과 메싱(Messing, et al.,Nucleic Acids Res(1981)9: 309)에 의해 더 기술된 바에 의해 또는 맥삼(Maxam, et al.,Methods in Enzymology(1980)65: 499)의 방법에 의해 서열화된다.
제조된 벡터는 그 다음 단백질의 제조를 위한 적합한 숙주로 형질전환된다. 사용된 숙주세포에 따라 이러한 세포에 적당한 표준 기술을 사용하여 형질전환이 행해진다. 코헨(Cohen, S.N.,Proc Natl Acad Sci USA(1972)69: 2110)에 의해 기술된 바와 같이 염화칼슘을 사용하는 칼슘처리, 또는 마니아티스(Maniatis, et al.,Molecular Cloning : A Laboratory Manual(1982) Cold Spring Harbor Press, P. 254)에 기술된 RbCl 법이 실질적인 세포벽장벽을 함유하는 원핵세포 또는 다른 세포들에 대해 사용된다. 이러한 세포벽이 없는 포유동물 세포에 대해서는 그래함과 반데르에브(Graham and van der Eb,Virology(1978)52: 546)의 인산칼슘침전법 또는 전기영동이 바람직하다. 효모로의 형질전환은 반 솔린겐(Van Solingen, P., et al.,J. Bacter(1977)130: 946)과 시아오(Hsiao, C.L., et al.,Proc Natl Acad Sci USA(1979)76: 3829)의 방법에 따라 수행된다. 다음에 형질전환된 세포를 MHC 서열의 발현에 유리한 조건하에 배양하고 배양액으로부터 재조합 제조된 단백질을 회수한다.
[항원성 펩티드]
많은 자기면역 질병에 대한 항원성 단백질 또는 조직들이 공지되어 있다. 예를들면, 실험적으로 유도된 자기면역질병, 병인론에 포함된 항원들이 특징지어졌다. 즉, 쥐와 마우스에서의 관절염에서 천연형-II 콜라겐이 콜라겐 유발된 관절염에서 확인되고, 미코 박테리아열 쇼크 단백질이 아주벤트 관절염에서 확인되고(Stuart et al., (1984), Ann.Rev, Immunol.2: 199-218 ; van Eden et al., (1988), Nature331: 171-173), 티로글로불린이 마우스의 실험적 알레르기성 갑상선염(EAT)에서 확인되었으며(Maron et al., (1988), J.Exp.Med.152; 1115-1120) ; 실험적 알레르기성 중증근무력증(EAMG)에서 아세틸 콜린 수용체(AChR)가 확인되었고(Lindstrom et al., (1988), Adv.Immunol.42: 233-284), 미엘린 염기성 단백질(MBP)과 프로테오리피드 단백질(PLP)이 마우스와 쥐에서 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE)에서 확인되었다(Acha-Orbea et al., 상기 참조).
게다가, 예를들면, 표적 항원이 사람에게서 확인되었고, 타입-II 콜라겐이 사람 류마티스성 관절염에서 확인되며(Holoshitz et al., (1986), Lancet ii : 305-309), 중증 근무력증에서 아세틸콜린 수용체가 확인된다(Lindstrom et al., (1988), 상동). 항원 제공세포(APC)의 표면상의 MHC 당단백질에 의한 항원의 제공은 항원성 단백질의 작은 펩티드 단위들로의 가수분해에 이어서 일어나는 것으로 여겨진다. 항원성 단백질내의 이들 더작은 절편들의 위치는 실험적으로 결정된다. 이들 절편은 8-15 단위의 길이인 것으로 추측되며 T-헬퍼세포에 의해 인지된 아그리토프(agretope)와 에피토프 둘다를 함유한다. 에피토프 자체는 T-헬퍼세포의 항원 특이적 수용체를 인식하는 5-6개 아미노산의 연속적 또는 비연속적 서열이며, 아그리토프는 MHC 당단백질과 펩티드의 결합에 책임이 있는 연속적 또는 비연속적 서열이다. 관련 8-15 아미노산 하위단위를 측정하는 실험적 방법은 골격근의 아세틸콜린 수용체의 알파 하위단위를 사용하여 예시된다. 중증 근무력증(MG)에서, 자기면역 반응은 이 하위단위의 영역에 관련이 있다. 신경근 연결부의 시냅스 후막상의 아세틸콜린 수용체의 소실은 MG 징후를 유발한다. MG에서, 아세틸콜린 수용체(AChR)의 알파 하위단위에 대한 자기 항체는 AChR에서 특정된 자기면역 반응과 관련이 있다. 85퍼센트의 MG 환자가 알파 하위단위와 반응하는 자기항체를 가지고 있다. 이들중 60%가 잔기 60과 80사이에 위치한, 주 면역원성 영역(MIR)으로 불리는 알파 하위단위의 펩티드 절편에 결합하는 항체를 갖는다(Tzartos 및 Lindstrom,Proc Natl Acad Sci USA(1980)77: 755). 자기 반응성 사람 T-세포에 의해 인지된 펩티드 절편은 또한 알파 하위단위상에 위치한다(Hohfield et al.,Proc Natl Acad Sci USA(1987)). 이들 T-세포에 의해 인지된 에피토프는 잔기 1-30, 125-147, 169-181, 257-271 및 351-368사이에 존재한다.
또한, 사람에서 AChR 펩티드 195-212와 257-269는, 각각 HLA-DR5 및 HLA-DR3, DQw 2 MHC 하프로타입의 중증 근무력증 환자에서 에피토프로서 부분적으로 특성확인되어있다(Acha-Orbea (1989), 상기동일, 참조). 이 수용체의 알파 하위단위와 결합된 에피토프의 제공을 허용하는 아그리토프를 운반하는 펩티드는 다음과 같이 측정한다. 토르페도 캘리포르니쿠스의 AChR로 면역될때, 사람의 중증 근무력증의 많은 특징을 가지는 질병을 전개하는 마우스계통들은, 모델로서 사용된다. MHC 클래스II 당단백질은 렉틴 및 단일클론성 항체 친화성 지지체를 사용하여, 상기와 같은 계통의 마우스 비장 세포로부터 단리된다. 정제된 MHC 클래스II 단백질은 세제 투석에 의하여 인지질 소포로 혼입된다. 그 결과의 소포는 그런다음, 제 5 도에 도시된 바와같이 MHC 분자를 함유한 평평한 지질 이중층 각각의 위에 형성하기 위하여 깨끗한 유리커버 슬립에 융합된다(Brian과 McConnell,Proc Natl Acad Sci USA(1984)81: 6159).
점착성의 평평한 지질막에 삽입된 MHC 클래스II분자를 함유하고 있는 커버 슬립 하나를 여러 24-웰 배양 플레이트의 각 웰에 넣는다. 알파 하위단위 서열에 해당하고, 하나 또는 그 이상의 방사성표지 아미노산 잔기(후술하는 바와같이 제조됨)를 함유하고 있는 대략 40의 중첩 20-잔기 합성 펩티드의 각각 하나를 커버 슬립 및 PBS와 함께 웰에 넣고 수일동안 인큐베이션한다. MHC 클래스II 당단백질 "포켓"에서 펩티드의 결합 정도는 커버 슬립상의 MHC 클래스II-평평한 지질막에 통합된 방사능의 양 대 평평한 지질 막 단독에 통합된 방사능의 양에 의해 측정된다. 방사능의 특이적인 통합은 결합된 펩티드가, 평평한 지질 막에 존재하는 MHC 클래스II 분자의 여러가지 종류중 하나의 아그리토프(MHC 클래스II 펩티드 결합 부위)를 함유함을 의미한다. 이런 방법으로, AChR에 대한 알파 하위단위의 아그리토프세트는 AChR 또는 정제된 알파 하위단위로의 면역감작시에 MG의 징후를 나타내는 마우스 계통에 대해 규정된다.
다음에, 아그리토프를 함유하는 알파 하위단위 합성 펩티드 절편의 각각은 커버슬립상의 평평한 지질막에 삽입된 단리된 MHC 클래스II 단백질의 결합 "포켓"에 다시 통합된다. 커버슬립 하나가 24-웰 배양 플레이트의 각 웰에 첨가되며, AChR에 대하여 면역된 마우스로부터(및 점착성 MHC 클래스II 단백질이 단리되는 그런 계통으로부터) 비장세포가 각 웰에 첨가된다. DNA로의 3중 수소화 티미딘 흡수에 의해 측정되는 바와같이, T세포 증식은, MHC 클래스II 단백질-결합 펩티드가 T-세포에의 결합을 위하여 아그리토프와 에피토프 2가지를 모두 함유하는 것을 의미한다. 급속 다중 펩티드 합성(RAMPS)을 위한 듀폰사의 장치 및 기법이 중첩하는(10 잔기 중첩), 20-잔기 펩티드 세트의 것들을 토르페도 켈리포르니쿠스 AChR의 알파 하위단위로부터 합성하기 위해 사용된다. 이 펩티드의 서열은 공지이며 제 6 도에 제시된다. 하나 또는 그 이상의 방사성 아미노산이 각 합성 펩티드에 통합된다. 측사슬이 보호된 FMOC 아미노산의 펜타플루오로페닐 활성에스테르들이, 표준 단계별 고상 펩티드 합성법과, 이어서 표준 측쇄 탈보호 및 고체 지지체로부터의 펩티드 아미드의 동시 방출을 사용하여 펩티드를 합성하기 위해 사용된다.
또는 달리 아세틸콜린 수용체 단백질과 같이, 항원성 단백질의 8-15 아미노산의 추정되는 절편을 포함하는 중첩서열들은 게이센등의 방법(Geysen, H.M., et al.,J Immun Meth(1987)102: 259-274)에 따라 합성될 수 있다. 합성된 방사선 표지 펩티드는 그것들을 개별적으로 상기와 같이 지질막 이중층안으로 제형된 정제된 MHC 단백질과 플레이트상에서 각각 인큐베이션함으로써 시험된다. 중추 신경계의 미엘린 피포파괴를 유발하는 다발성 경화증(MS)에서, 미엘린의 주요 단백질 성분인 미엘린 염기성 단백질(MBP)은 기본적인 자기 항원이다. MBP 단백질의 적절한 절편 또한 실험적으로, 소의 미엘린 염기성 단백질로 면역될때 실험상의 알레르기성 뇌척수염(EAG)을 나타내는 마우스 계통을 사용하여 측정된다. MBP의 서열을 제 7 도에 제시한다.
전신성 홍반성 낭창(SLE)은 복합적인 체계를 가지지만, 적혈구에 대한 자기면역 반응으로부터 유발된다. 이 질병의 항원성 이펙터인 펩티드는 적혈구의 표면상의 단백질에서 발견된다.
류머티스성 관절염(RA)은 활액에서 발견되는 단백질에 대한 면역반응으로부터 유발되는 만성 염증성 질병이다.
인슐린-의존 진성 당뇨병(IDDM)은 인슐린의 분비를 담당하는 랑게르 한스섬내의 베타세포에 대한 자기면역 공격으로부터 유발된다. 삼세포표면 항원에 대한 및 인슐린에 대한 순환항체는 IDDM에 선행하는 것으로 알려져 있다. IDDM에서 면역 반응을 유도하는데 중요한 펩티드는 인슐린 서열 및 섬의 표면 단백질의 일부인 것으로 여겨진다.
상대적으로 짧기 때문에, 관련 항원성 펩티드 하위단위들은 펩티드 합성을 위한 표준 자동 방법을 사용하여 쉽게 합성될 수 있다. 또는 그것들은 단리된 또는 합성 DNA 서열을 사용하여 재조합적으로 만들어질 수 있다 ; 물론 이 방법은 이 길이의 펩티드에 대하여 가장 효과적인 접근법이 아닐 수 있다.
그러므로, 요약하자면, 표지된 시험 펩티드 세트가 제조되며, MHC 단백질을 함유하는 평평한 지질막중의 MHC에 결합하는 것들이 아그리토프를 함유하는 것으로 보인다.
그런다음 확인된 펩티드가 종래의 고상 합성법에 의하여 제조되고, 질병-유도 헬퍼 T-세포 클론에 대한 에피토프를 함유하는 하위 세트를, 후보 펩티드를 쥐과의 항원-제공세포(APC)(또는 단리된 MHC 복합체)와 함께 및 전체 길이의 단백질로 면역된 마우스로부터의 비장 또는 림프절 T-세포와 함께 배양함으로써 측정된다. 성공적인 후보가 이 시스템에서 T-세포 증식을 자극할 것이다. 이 2번째의 보다 작은 하위세트는 적당한 펩티드 성분을 나타낸다.
[이펙터 성분]
한 구체예에서, 본 발명의 복합체는 의문의 대상이 되는 펩티드에 대한 면역 반응을 파괴하기 위하여 고안된다. 이런 경우에, 분자의 이펙터 부분은 예컨대, 독소, 화학치료제, 세포독성 T-세포 표면 분자에 대한 항체, 리파제, 또는 "하드(hard)" 예컨대 베타 방사선을 방출하는 방사성 동위원소일 것이다. 예를들어 리신, 디프테리아, 겔로닌, 슈도모나스 독소, 및 아브린을 포함하여 많은 단백질독소가 당해 기술분야에 공지이다. 화학치료제로서는 예컨대 독소루비신, 다우노루비신, 메토트렉세이트, 세포독소, 및 항-센스 RNA가 있다. 항생제 또한 사용될 수 있다. 세포독성 T-세포 표면분자에 대해 항체가 단리되어 있고, 따라서 이들은 독소로서 작용할 수 있다. 또한, 이트륨-90, 인-32, 납-212, 요오드-131, 또는 팔라듐-109 같은 방사성 동위원소가 사용될 수 있다. 방출된 방사선은 표적 T-세포의 파괴를 실제화한다.
어떤 경우에, 이펙터 성분의 활성부분은 리포좀 또는 덱스트란 담체같은 전달 시스템에 포함된다 ; 이런 경우에 활성성분 또는 담체는 복합체에 결합될 수 있다.
만약 이펙터 분자가 표지로 의도된다면, 테크네튬-99 또는 인듐-11 같은 감마선-방출 방사성 동위원소가 사용될 수 있다. 또한, 예컨대 플루오레신에 의한 형광 표지화같은 다른 종류의 표지화도 사용될 수 있다.
이펙터 성분은 제 2 도에 도시된 바와 같이, MHC 당단백질에 부착될 수 있으며, 또는 그의 성질이 적당하다면, 펩티드 부분에 부착될 수 있다. 예를들면, 요오드 131 또는 다른 방사성 표지가 때로 펩티드 결정기 서열에 포함될 수 있다.
[복합체의 형성]
복합체의 요소들은 당해 기술분야에 공지된 표준 수단에 의해 결합될 수 있다. 예를들어, 단백질 독소는 카보디이미드를 사용하는 표준 탈수반응에 의해 이종 이중 가능성 링커에 의해 MHC-유도 단백질에 포합될 수 있다. 항원성 펩티드는 MHC단백질의 포켓(pocket) 부분과 비공유적으로 결합될 수 있고, 또는 그것들은 공유 결합될 수도 있다.
복합체의 제조순서는 각 경우의 구성성분에 좌우된다. 예를들어, 특정 프로토콜에 있어서, 펩티드 부분과 MHC 부분은 혼합에 의해 비공유적 결합되고, 그런 다음 필요로 한다면 SPDP(Pierce Chemicals제품) 같은 시중구입할 수 있는 링커를 사용하여 이펙터가 MHC에 공유 결합된다. 또는 달리, 이펙터와 MHC가 먼저 탈수반응에 의해 포합되고 그 포합체가 펩티드 성분과 복합체를 형성한다.
만약 이펙터가 그 자체로서 단백질이라면, 전체 복합체는 재조합 방법을 사용하여 적절한 코드화 DNA로부터 직접 만들어질 수 있다. 예를들어, 사람 및 마우스에서 MG의 에피토프로서 특성이 확인된 AChR 펩티드 195-215는 MG와 관련된 MHC 항원으로부터 유도된 폴리펩티드의 N-말단 끝에 연결될 수 있다. 1문자 아미노산 코드로 표시한 AChR 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같다 :
DTPYLDITYHFIMQRIPLYFV
펩티드를 코드화하는 올리고뉴클레오티드는 아미노산에 대하여 공지된 코돈, 바람직하게는 발현을 위해 사용될 유기체에서 올리고뉴클레오티드를 고안하기 위해 사용된 바람직한 활용성을 가진 그런 코돈을 사용하여 합성된다. 다양한 유기체 및 여러 종류의 세포에 바람직한 코돈 활용은 당해 기술분야에 공지이다. 만약, 예를들어 발현이 대장균에서 소망된다면, AChR 195-215를 코드화하는 적당한 올리고뉴클레이티드 서열은 다음과 같을 수 있다 :
5' GAC ACC CCG TAC CTG GAC ATC ACC TAC CAC TTC
ATC ATG CAG CGT ATC CCG CTG TAC TTC CTG 3'
그런 다음 이 서열은 당해기술 분야에 공지된 기법을 활용하여, MHC 항원으로부터 유도된 펩티드를 코드화하는 서열에 통합될 수 있다. 통합 부위는, 분자가 발현되고 접혀질 때, AChR 펩티드 항원이 표적 T세포에 대한 에피토프로서 활용가능하게 될 그런 곳이 될 것이다.
한 프로토콜에서, AChR 195-215 펩티드는 적절한 MHC 분자의 N-말단끝에 부착된다. 만약 재조합 복합체가 쥐에서 사용될 예정이라면, 예를들어 AChR 펩티드는 I-Ab-알파 또는 I-Ab-베타 사슬의 어느하나를 코드화하는 서열에 통합될 것이다. 이들 사슬을 코드화하는 서열들은 공지이며, 제 8 도(알파 사슬), 및 제 9 도(베타 사슬)에 도시되고 ; 또한 그 도면들에는 제한 효소 부위 및 사슬의 중요한 도메인에 도시되어 있다. 만약 AChR 펩티드가 베타 사슬에 통합될 예정이라면, 예컨대 올리고뉴클레오티드 리더 펩티드의 대치물로서 삽입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 내에서의 서열 대치방법은 당해 기술분야에 공지이며, 그 실례들은 플라스미드 제조에 관한 단원에 기재된다.
유사한 프로토콜이 적절한 사람 HLA 항원으로부터 유도된 펩티드를 코드화하는 서열로 AChR 펩티드를 통합시키기 위해 사용될 수 있다. 예를들어, 사람에게는 하플로타입 DR2Dw2가 MG와 관련된다. 그러므로, AChR 펩티드는, 예컨대 DR2 대립유전자의 베타 사슬을 코드화하는 서열에 통합될 수 있다. 많은 DR 하플로타입으로부터의 HLA-DR-베타 사슬을 코드화하는 서열에 있는 것과 같이, DR1-9의 주요 혈청학적 특이성에 대한 DR 하위영역의 구조상의 기본원리는 공지이다. 예컨대 벨(Bell)등의 Proc.Natl.Acad.Sci.USA84: 6234-6238(1987) 참조.
상술한 바와 같이, 자기면역 항원 펩티드와 MHC 성분은 펩티드 연쇄를 경유하여 결합될 수 있다. 그러나 다른 형태의 연쇄 또한 당해 기술분야에 숙련된 사람들에게 분명하며, 예컨대 알파 및/또는 베타/사슬의 탄수화물 부분을 포함하며, 당단백질 상의 탄수화물 기를 경유한 부착을 포함할 수 있다.
[복합체의 평가]
본 발명의 복합체는 생체외 시스템을 사용하여 또는 생체내 모델을 사용하여 측정될 수 있다. 생체외 시스템에서, 복합체는 복합체의 펩티드와 관련된 상태의 원인이 되는 단백질 또는 항원으로 면역된 대상(subject)으로부터의 말초혈 T-세포와 함께 배양된다. 성공적인 복합체는 추가의 항원으로 자극되었을 때에라도, 항원 특이적 T-세포의 추가의 증식을 방지할 것이다.
생체내 시스템에서, 단리된 에피토프에 반응하여 또는 APC의 존재하에 전체 길이의 항원에 반응하여 증식하는 T-세포가 클론된다. 그 클론은 자기면역 질병을 유도하기 위해 면역되지 않은 조직적 합성 동물에 주사된다. 그러면 그 질병에 관련된 증상들이 나타날 것이다. 관련 복합체의 투여는 질병의 증상을 개선 또는 제거해야 한다.
복합체의 여러 타입 중 어느 하나, 즉, 이펙터 성분이 있는 것이든 없는 것이든 어느 것이라도 사용될 수 있다. 바람직한 형태에서 치료는 2배 효과를 낸다. 개체는 면역 시스템을 하향 조절하기 위해 항원의 유효부분을 함유하는, MHC-코드화된 항원-제공 당단백질의 복합체로 치료된다. 추가의 하향 조절은 MHC-코드화된 항원-제공 당단백질, 치료하고자 하는 자기 면역 질병에 특이적인 항원의 유효 부분, 및 이펙터 성분을 포함하는 3가지 성분의 복합체로 치료함으로써 이루어진다. 또한, 복합체 패널이 치료에 사용될 수 있다. 예를들어, 만약 항원의 하나 이상의 펩티드가 자기면역 반응에 포함되는 것으로 추정된다면, 및/또는 하나 이상의 항원이 포함되는 것으로 추정된다면, 그 개체는 적절한 MHC-코드화된 항원-제공 폴리펩티드, 및 항원의 유효 부분을 함유하는 패널로부터 선택된 여러가지 복합체로 치료될 수 있다 ; 이들은 이펙터 성분을 가질 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다.
표지된 복합체의 투여는 질병 및 진단용 적용에 포함된 면역 시스템의 그런 부분들의 확인을 허용한다.
[치료 및/또는 진단을 위한 MHC 복합체의 선택]
자기면역 질병에 대하여 개체의 진단 또는 치료에 사용하고자 하는 본 발명의 MHC 복합체를 선택하기 위하여, 자기 항원의 제공에 포함되는 MHC 항원의 타입이 확인된다.
특이한 자기면역 기능장애는 특이적 MHC 타입과 상호관련이 있다. 사람의 DQ/DR 하플로타입의 목록 및 자기면역 질병과의 관련을 제10도에 제시한다. 어느 대립유전자, 계속해서, 어느 MHC 코드화된 폴리펩티드가 자기면역 질병과 관련되는지를 확인하는 방법은 당해 기술분야에 공지이다. EP 286447에 기재된 한 방법이 적당하다. 이 방법에서 여러가지 단계는 다음과 같다. 첫째, MHC 항원과 자기면역 질병사이의 관련이 유전학적 연구를 토대로 하여 측정된다. 이들 연구를 수행하는 방법은 당해 기술분야에 숙련된 사람들에게 공지이며, 사람에서 관련된 모든 공지된 HLA 질병에 대한 정보를 코펜하겐 소재의 HLA 및 디시즈 레지스트리(Diseaes Registry)에 보관된다. 질병과 관련된 폴리펩티드를 코드화하는 유전자 좌는 질병과 가장 강력한 관계를 포함하는 것이다(제10도 참조).
둘째, 질병 관련 MHC 항원/폴리펩티드를 코드화하는 특이적인 대립유전자가 확인된다. 대립 유전자의 확인에 있어서, 민감한 대립유전자가 지배적인 것으로 여겨진다. 대립유전자의 확인은 질병과의 특이적 서브타입의 강력한 양성 결합을 측정함으로써 이루어진다. 이것은 많은 방법으로 이루어지며, 그런 방법들은 모두 당해 기술분야에 숙련된 사람들에게 공지이다. 예를들어, 하위 단계 분류는 혼합된 림프구 반응(MLR) 분류에 의해, 및 감작된 림프구 시험(PLT)에 의해 이루어질 수 있다. 2가지 방법은 Weir와 Blackwell 편집의 실험 면역학 편람(Handbook of Experimental Immunology)에 기재되어 있다. 그것은 또한 조사하고자 하는 MHC 유전자 좌에 특이적인 DNA 프로브를 사용하여 DNA 제한 단편 길이 다형 현상(RFLP)을 분석함으로써 이루어질 수 있다. 예컨대, Nepom(1986), Annals N.Y.Acad.Sci.475, 1, 참조. MHC 유전자 좌에 대한 프로브의 제조방법은 당해 기술분야에 숙련된 사람들에게 공지이다. 예컨대 Gregersen et al.(1986), Proc.Natl.Acad.Sci.USA79: 5966 : Weissman et al.in Medicine in Transition : the Centennial of the University of Illinois College of Medicine(E.P.Cohen, ed.1981) 참조.
질병 감수성을 부여하는 서브타입의 가장 완전한 확인은 유전자 좌의 게놈 DNA, 또는 유전자 좌내에 코드화된 mRNA에 대한 cDNA를 서열화함으로써 이루어진다. 서열화되는 DNA는 MHC 코드화된 폴리펩티드의 초기가변성 영역을 코드화하는 절편(section)을 포함한다. 특이적으로 소망되는 DNA를 프로브로 확인하는 기법, 소정영역의 증폭기법은 당해 기술분야에 공지이며, 예컨대 중합 효소 사슬반응(PCR) 기법을 포함한다.
일단 특이적 자기면역 질병에 대하여 감수성을 부여하는 대립유전자가 확인이 되면, 그 대립유전자 내에 코드화된 폴리펩티드도 또한 확인된다. 즉, 폴리펩티드 서열은 그것을 코드화하는 대립 유전자내의 DNA 서열로부터 추론될 수 있다. 진단 및/또는 치료를 위해 사용된 본 발명의 MHC 항원 복합체는 자기면역 질병 상태와 관련된 MHC 항원으로부터 및 동일한 질병상태와 관련된 자기면역 항원으로부터 유도된다.
실례로서, 90% 이상의 류머티스성 관절염 환자가 Dw4 또는 Dw14의 하플로타입을 갖는다(제10도 참조). 또한 사람 류머티스성 관절염의 표적 항원은 타입-II 콜라겐이라고 알려져 있다. 그러므로, 류머티스성 관절염에 걸린 개체의 치료 또는 진단을 위해 사용된 본 발명의 복합체는 타입-II 콜라겐의 유효 부분과 복합체를 형성한, 항원을 제공할 수 있는 Dw4 및/또는 Dw14로부터 유도된 폴리펩티드를 함유하는 것들을 포함할 것이다.
자기면역 질병의 진단 및/또는 치료를 위한 본 발명의 복합체의 활용에 적당할 수 있는 프로토콜을 제11도에 도시한다. 간단히 설명하면, 자기면역 질병을 가지고 있는(또는 그것에 민감한) 개체가 확인되고, 자기면역 기능 장애가 확인된다. 확인은 징후학 및/또는 가족의 병력 조사에 의해서 이루어질 수 있다. 개체의 MHC 타입은 예컨대, MLR, 혈청학적 측정법, 및 DNA 분석(RFLP 및 PCR 기법을 포함한다)에 의한 세포 분류를 포함하며, 당해 기술분야에 공지된 여러가지 방법중 하나 또는 그 이상에 의하여 측정된다. 개체 T세포는 자기반응성 T 세포에 의해 인지된 자기 펩티드(들)을 측정하기 위하여 생체외 조사된다 ; 이것은 상술된 식, X1MHC2펩티드(식중, X는 표지 부분이다.)의 본 발명의 표지된 복합체를 활용하여 이루어진다. 어떤 복합체가 T-세포를 표적으로 하는가가 측정된 후에, 개체는 특이적 자기 반응성 T-세포 복제를 억제할 수 있는 본 발명의 복합체 및/또는 자기반응성 T-세포를 죽이는 것들로 치료된다 ; 이들은 각각, 타입 MHC2펩티드, 및 X1MHC2펩티드(식중, X는 T-세포를 죽일 수 있는 부분이다.)의 복합체들이다. 치료(남아 있는 자기반응성 T-세포에 의해 측정되는 바)는 상술된 바와 같은 본 발명의 표지된 복합체를 사용하여 T-세포 결합 연구로 모니터된다.
본원에 사용된 바, 용어 "개체"는 모든 포유동물 및 아마도 기본적으로 동등한 MHC 시스템을 가지고 있는 모든 척추동물을 포함한다.
[생체내 시험을 위한 모델 시스템]
다음은 자기면역 질병에 대한 본 발명 복합체의 효과를 평가하기 위해 사용될 수 있는 자기면역 질병에 대한 모델 시스템이다.
[전신성 홍반성 낭창(SLE)]
자기면역 뉴질랜드 블랙(NZB) 마우스와 표현형질적으로 정상인 뉴질랜드 화이트(NZW) 마우스의, F1잡종은 부모세대의 NZB 계통에서 발견되는 것보다 훨씬 빨리 진행되는, 중증의 전신성 자기면역 질병을 나타낸다. 이들 마우스는 핵 항원에 대한 항체를 포함하여, 여러가지 면역 이상(abnormality)과, 계속해서 사람의 SLE와 현저하게 유사하며, 암컷에게서 더 우세하게 나타나는, 치명적인 면역 복합증-중재 사구체 신염의 발생을 명백하게 나타낸다. Knight, et al., J Exp Med(1978)147: 1653.
질병의 사람 및 쥐에서의 형태에 있어서, MHC 유전자 생성물과의 강력한 관련이 보고되어 있다. HLA-DR2및 HLA-DR3개체는 SLE 발생에 있어서 일반적인 집단보다 훨씬 더 위험성이 높으며(Reinertsen, et al.,N Engl J Med(1978)299: 515), 한편 NZB/W F1마우스(H-2d/u)에서는, NZW 부모로부터 유도된 h-2u하플로타입과 관련된 유전자가 낭창-계 신장염의 발생에 기여한다.
본 발명 복합체의 효과는 생존률에 의해, 및 단백뇨 및 항-DNA 항체의 출현과 같은 증상의 발생의 진전에 의해 측정될 수 있다.
단백뇨는 우리스틱스(Uristix ; Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN)의 사용에 의해 비색정량적으로 측정되며, 다음과 같은 단백뇨의 근사값을 제공한다 : 미량, 10㎎/dl ; 1+, 30㎎/dl ; 2+, 100㎎/dl ; 3+, 300㎎/dl ; 및 4+, 1000㎎/dl. 고수준의 단백뇨의 발생은 마우스를 복합체로 치료함으로써 상당히 지연된다.
NZB/W F1마우스에서 항-DAN 특이적 항체의 존재는 Zouali 및 Stollar에 의해 J Immunol Methods (1986)90: 105에 기재된 결합 면역흡착 측정법(ELISA)을 변용함으로써 측정된다.
[중증 근무력증(MG)]
중증 근무력증은 HLA-D와 관련된 여러가지 사람 자기면역 질병중 하나이다. Safenberg, et al.,Tissue Antigens(1978) 12 : 136 ; McDevitt, et al.,Arth Rheum(1977) 20 : 59. MG에서 아세틸콜린 수용체(AcChoR)에 대한 항체는, 시냅스 후막의 AcChoR의 소실을 중재함으로써 신경근 전달을 손상시킨다.
SJL/J 암컷 마우스는 사람 MG에 대한 모델 시스템이다. 이 동물에서, 실험적인 자기면역 중증ㆍ근무력증(EAMG)은, 마우스를 다른 종으로부터의 가용성 AcChoR 단백질로 면역시킴으로써 유도된다. EAMG에 대한 감수성은 부분적으로는 MHC와 관련되며 H-2내의 I 영역에 위치하고 있는 것으로 나타났다. Christadoss, et al.,J.Immunol.(1979)123: 2540.
AcChoR 단백질은 토르페도 캘리포르니카(Torpedo californica)로부터 정제되며, 왈도(Waldor)등에 의한 방법(Proc Natl Acad Sci(USA)(1983)80: 2713, 참고로 삽입됨)에 따라 측정한다. 완전 프로인트 보조액 중에 유화된 15㎍의 AcChoR을 등의 6군데, 뒷다리 끝 그리고 꼬리기부 중에 피내 주사한다. 그 동물은 이 동일한 방법으로 4주 후에 재면역된다.
평가는 항-AcChoR 항체의 측정에 의해 이루어질 수 있다. 항-AcChoR 항체 수준은 왈도등에 의해 기재된 바대로(상기 동일) 미세역가 ELISA 측정법에 의해 측정한다. 표준 시약 부피는 웰당 50μl이다. 시약은 보통 RT에서 2시간동안 웰중에서 인큐베이션한다. 중탄산염 완충액, pH9.6중에 희석된 AcChoR 5㎍을 각 웰에 첨가한다. AcChoR과의 인큐베이션 후, 플레이트를 0.05% 트윈 및 0.05% NaN3를 함유하고 있는 인산염-완충제 식염수로 이루어진 세척용액으로 4회 세정한다. 마우스 혈청을 0.01M PBS(pH7.2), 1.5mM MgCl2, 2.0mM 2-메르캅토에탄올, 0.5% 트윈 -80, 0.5% NaN3(P-트윈 완충제)에 희석하고 플레이트상에서 인큐베이션한다. 플레이트를 세척한 후, P-트윈 완충액에 희석된 베타-갈락토시다제-포합된 양 항-마우스 항체를 각 웰에 첨가한다. 최종 세척후에, 효소의 기질인 p-니트로페닐 갈락토 피라노시드를 플레이트에 첨가하고, 기질 촉매 반응의 정도를 1시간 후, 405㎚에서의 흡광도로부터 특정한다.
항-AcChoR 항체는 비면역 마우스와 비교할때, AcChoR로 면역된 마우스에서 나타날 것으로 기대된다. 복합체로의 치료는 면역된 마우스의 항-AcChoR 항체의 역가를 상당히 감소시킬 것으로 기대된다.
임상상의 EAMG에 미치는 복합체로의 치료의 효과를 또한 평가할 수 있다. 근무력증 징후는 머리와 목을 늘어뜨리는 특징적인 구부린 자세, 곱사등, 팔 또는 다리의 탈구, 비정상적인 걷는 자세, 및 직립의 어려움들을 포함한다. 가벼운 징후가 표준 스트레스 시험 후에 나타나며, 복합체의 투여에 의하여 개선되어야만 하였다.
류머티스성 관절염(RA)
사람에서, 류머티스성 관절염에 대한 감수성은 HLA D/DR과 관련이 있다. 천연 타입 II 콜라겐에 대한 마우스의 면역 반응은 사람 RA를 닮은 많은 조직학적 및 병리학적 특징을 가지고 있는 관절염에 대하여 실험 모델을 정립하기 위해 사용되어 왔다. 마우스에서 콜라겐-유도 관절염(CIA)에 대한 감수성은 H-2 I 영역, 특히 I-A하위영역에 위치하고 있는 것으로 나타났다.
Huse, et al.,Fed Proc(1984)43: 1820.
민감한 계통으로부터의 마우스, DBA-1을 우울리와 루스라에 의해 기재된 기법(Wooley 및 Luthra,J Immunol(1985)134: 2366, 참고로 삽입됨)을 사용하여, 천연 타입 II 콜라겐으로 마우스를 처리함으로써 CIA를 가지도록 유도한다.
또다른 모델에서, 쥐의 아주밴트 관절염은 사람 관절염에 대한 실험적인 모델이며, 표본적인 자기면역 관절염은 박테리아 항원에 의하여 유발된다. Holoschitz, et al.,Prospects of Immunology(CRC Press) (1986) ; Pearson Arthritis Rheum (1964)7: 80.
그 질병은 보조제(MT)에 대하여 반응성이었던 T-세포의 클론에 의한 그의 전달성에 의해 증거되는바, 세포-중재 면역 반응의 결과이다 ; 질병의 표적 자체-항원은, 동일한 클론된 세포를 이용한 연구를 토대로 하여, 연골의 프로테오글리칸 분자의 부분(들)인 것으로 여겨진다.
쥐의 아주밴트 질병은 피어슨(Pearson)에 의해 기재된 바와 같이(상기 동일); 즉, 바람직하게는 여러곳의 저장부위에 또는 꼬리의 기부 또는 발에 제공된 프로이트 보조제(죽은 혹 고초균 또는 그의 화학적 분획, 광유, 및 유화제)의 1회 주사에 의하여 생성된다. 보조제는 다른 항원의 부재하에 제공된다.
질병 표시의 복합체 치료효과가 모니터된다. 이런 표시는 조직병리학적이며, 관절 및 특별한 조직의 단핵침입이 지배적인 활액 라이닝 세포(lining cell)의 증식이 따르는 급성 및 아급성 활막염, 연결 조직 패누스(pannus)에 의한 뼈 및 관절성 연골의 침입, 및 특히 질병에 걸린 절간에 근접해 있는 골막성 새뼈의 형성을 포함한다. 중증 또는 만성의 경우에, 섬유상 또는 뼈같은 곳의 관절강직이 그렇듯이 파괴성 변화가 일어난다. 이들 조직병리학적 징후는 프로인트 보조제에 대한 면역감작 후 약 12일 후에, 대조동물에서 나타나는 것으로 기대된다.
[인슐린 의존 진성 당뇨병(IDDM)]
IDDM은 췌장의 랑게르한스섬 내의 인슐린-분비 세포의 선택적인 파괴의 결과로서 관찰된다. 이 질병에의 면역 시스템의 내포는 단핵 세포에 의해, 항-섬 세포 항체의 검출에 의해, IDDM 집단의 HLA-DR3 및-DR4 대립유전자의 고빈도에 의해, 및 IDDM과 다양한 자기면역 질병간의 임상상의 관련에 의해 랑게르한스 섬이 초기 침입되는 형태학적 증거에 의해 시사된다. 자생적인 IDDM 및 갑상선염에 대한 동물 모델이 BB 쥐에서 개발되었었다.
사람에서와 같이, 쥐의 질병은 부분적으로는 MHC항원을 코드화하는 유전자에 의해 제어되며, 랑게르한스섬 침입을 특징으로 하고, 항-섬 항체의 존재와 관련이 있다. I-E 동등 클래스 II MHC 항원은 BB 쥐에서 자기면역 질병의 표시에 포함되는 것으로 여겨진다.
Biotard, et al.,Proc Natl. Acad Sci(USA) (1985)82: 6627.
형태학적 평가에 있어서, 인슐린 이상에 의한 병은 랑게르한스섬 내의 단핵 염증성 세포의 존재를 특징으로 한다. 갑상선염은 최소한의 범주로서, 갑상선내의 병소의 간세포 림프구 침입을 특징으로 한다. 가장 중증의 경우는 광범성 확장성 림프구 침입, 선방의 파괴, 섬유증, 및 병소의 허틀세포(Hurthle cell)변화를 나타낸다. (Biotard et al., 상기 동일 참조).
본 발명 복합체로 BB 쥐를 치료하는 것은 IDDM 및 갑상선염과 관련된 임상상의 및 형태학상의 징후의 표시를 개선 또는 방지할 것으로 기대된다.
다른 모델에서, NOD 마우스 주(H-2KdDb)는 자기면역 IDDM에 대한 쥐 모델이다. 이 동물에서 질병은 항-섬 세포항체, 중증의 인슐린 이상으로 인한 병, 및 베타-세포의 자기면역 파괴에 대한 증거 등을 특징으로 한다.
Kanazawa, et al.,Diabetologia(1984)27: 113.
질병은 림프구로 수동 전파될 수 있고 시클로스포린-A를 이용한 처리에 의하여 방지될 수 있다(Ikehara, et al.,Proc Natl Acad Sci (USA)(1985)82: 7743 ; Mori, et al.,Diabetologia(1986)29: 244).
미처리 동물은 내성 및 케토시스에 있어서 많은 글루코스를 나타내며 질병이 나타난지 수주 내에 죽는다. 70 내지 90퍼센트의 암컷 및 20-30%의 수컷 동물이 그 살아있는 동안 처음 6개월 내에 당뇨증을 나타낸다. 혈통 연구는 적어도 2개의 유전자 좌가 질병 감수성에 원인이 되며, 그중 하나는 MHC에 위치하고 있다고 규정하였다. 혈청학적 및 분자수준에서 NOD클래스 II 항원의 특성확인은 모두 자기면역 질병에 대한 감수성이 I-AB에 연결되어 있음을 시사한다.
Acha-Orbea 및 McDevitt,Proc Natl Acad Sci(USA)(1987)84: 235.
복합체로 암컷 NOD 마우스를 치료하는 것은 당뇨증의 개시전 시간을 더 길게 하고 및/또는 그 질병을 개선 또는 방지할 것으로 기대된다.
[실험상의 알레르기성 뇌척수염(EAE)]
실험상의 알레르기성 뇌척수염(EAE)은 많은 점에서 사람의 다발성 경화증(MS)질병을 닮은 중추신경계의 유도성 자기면역 질병이다. 이 질병은 마우스 및 쥐를 포함하여 많은 종에서 유도될 수 있다. 이 질병은 마비의 급성 개시를 특징으로 한다. CNS에서 단핵 세포에 의한 맥관 주위의 침입은 마우스와 쥐에서 모두 관찰된다. 징후학뿐만 아니라, 질병의 유도방법은 아안슨에 의한 문헌(Aranson,The Autoimmune Disease, Rose 및 Mackay 편집, Academic Press, Inc. PP 399-427(1985)) 및 아카-오르베아 등에 의한 문헌(Acha-Orbea et al., Ann. Rev. Imm.7: 377-405(1989))에서 찾아볼 수 있다.
감수성을 중재하는 유전자 중 하나는 MHC 클래스II 영역에 위치한다(Moore et al., (1980), J. Immunol.124: 1815-1820).
가장 분석이 잘되어 있는 뇌염 유발성 단백질은 미엘린 염기성 단백질(MBP)이지만, 다른 뇌염유발성 항원이 뇌에서 발견된다. 면역원성 에피토프들은 지도화 되어 있다(Acha-Orbea et al., 상기 동일, 참조).
PL마우스 계통(H-2u)에서 MBP의 2개의 뇌염유발성 펩티드 : MBP 펩티드 p-35-47(MBP 35-47)과, 아세틸화된 MBP p1-9(MBP 1-9)가 특성확인되어 있다
EAE가 유도되어 있는 개체의 질병 징후를 개선하는 데 미치는 본 발명 복합체의 효과는, 생존율에 의해 및 징후 발생의 진전에 의해 측정될 수 있다.
[제형 및 투여]
MHC의 경피 영역이 포함되는 경우 본 발명의 복합체는 리포좀이나 미셸의 형태로 편리하게 투여된다. 그러나, 이러한 영역이 없으면, 복합체는 종래에 펩티드를 함유하는 약제에 대하여 사용되던 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 전신적이며, 주사에 의해, 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 실시되고, 그로써 투여의 주사경로에 적합한 제형을 사용할 수 있다.
적절한 제형은Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing, Philadelphia, PA)의 최신판에 개시되었다.
쥐과 동물의 환자에 대한 투여량 수준은 10-500㎍이 효과적이다 ; 따라서 약 0.5㎎/㎏ 내지 25㎎/㎏이 바람직하다.
다음의 실시예는 본 발명을 설명하는 것이며 제한하지는 않는다.
[실시예 1]
표지(I-131)된 MHC II-BMBP펩티드 복합체의 제조
FMOC-보호 아미노산에 대한 표준 고상 합성법을 사용하여, 소과 동물의 미엘린-염기성 단백질(BMBP)의 아미노산 1-13을 나타내는 요오드처리된 합성 펩티드를 합성하였다. 그 결과 합성된 펩티드의 서열은
Ac-Ala-Ser-Ala-Gin-Lys-Arg-Pro-Ser-Gln-Arg-Ser-Lys-(I-131)Tyr-NH2이다.
Turkewitz 등의 방법(상기 동일, 본원에 참고로 삽입됨)에 따라 PL/J 마우스 계통의 비장세포로부터 MHCII를 정제하였다. 세제 내에 있거나 또는 지질이중층(상기 참고)으로서의 정제된 MHCII를 고분자량분획 안으로의 방사성 표지의 흡수가 최적화될때까지 합성 펩티드와 함께 인큐베이션 하였다. 그 다음에는 괴잉 방사성 표지된 펩티드를 투석이나 겔 여과에 의해 제거하고 제조된 복합체를 지질의 존재하에서 투석하여 미셸을 형성시켰다.
[실시예 2]
독소로서의 MHC II-BMBP 131-I의 사용
BMBP의 N-말단 13개 아미노산 서열에 대하여 특이적인 클론된 T-헬퍼세포를 BMBP를 사용하여 면역된 PL/J계 마우스로부터 Steinman의 방법에 의해 얻었다. 단리한 클론된 T-헬퍼세포를 실시예 1에서 제조된 복합체와 함께 106개 세포/ml와 복합체 0.1-1.0㎍/ml의 농도에서 4-16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
세포를 세척하고 나서 세척된 세포에 대해 T-림프구의 세포생존률을 측정하였다. 배양액을 콘카나발린 A와 함께 인큐베이션하고 T-헬퍼세포의 생존 및 증식의 지표로서 삼중수소화 티미딘의 흡수를 평가하였다. 방사성 표지된 복합체로 처리한 후에 BMBP 및 자기 항원-제공 세포의 존재하의 세포생존률은, 미표지 복합체와 함께 인큐베이션된 또는 BMBP 없이 삼중수소화 티미딘의 존재하에서 인큐베이션된 세포 생존률의 50%미만이었다.
[실시예 3]
I-Ak마우스 및 쥐의 MBP펩티드와의 복합체를 사용한 생체외 T-세포의 하향-조절
사람의 다발성 경화증과 유사한 질병인 마우스의 실험적 알레르기성 뇌막심근염을 유도한다고 공지되어 있고, 미엘린 염기성 단백질(MBP)의 에피토프에 대항하는 T세포 클론내에서의 비반응성을 유도하는 MHC-펩티드 복합체 클라스 II의 효력을 이하 설명하기로 하겠다.
쥐의 MBP 펩티드(1-11)에 대하여 마우스를 면역시킴으로써 제조되고, 항원 특이성에 대한 특징이 있는 AJ1.2 및 4R 3.4T 세포 클론을 스탠포드대학의 팻 죤스 박사로부터 얻었다.
마우스의 정제된 I-Ak및 합성 쥐 MBP 펩티드(1-13)을 사용하여, 서열이 다음과 같이 공지(Zamvil et al(1986), Nature324: 258-260)된 쥐 MBP펩티드를 가지는 I-Ak복합체를 제조 하였다 :
Ac-ASQKRPSQRHGSK
Turkewitz 등(1983 ; 상기 참조)을 기초로한 변형 방법에 의해 마우스 I-Ak를 정제하였다. 기본적으로, NP-40을 사용하여 I-Ak가 함유된 세포의 가용성 막추출물을 제조하였다. 10-2.16 항체가 함유된 컬럼을 사용하여 친화크로마토그래피를 수행함으로써 추출물로부터 I-Ak를 정제하고, 이것을 CNBr 활성화 세파로오스 4b에 커플시켰다. 10-2.16Mab를 정제하여 CNBr 활성화 세파로오스 4B에 결합시키기 위해서, 그리고 I-Ak를 정제하기 위해서, NP-40가용성 막추출물의 제조개략도를 제12, 13a 및 14도에 각각 도시하였다. 제13b도는 정제된 10-2.16항체의 순도를 나타내는 폴리아크릴아미드 겔의 사본이다. 폴리아크릴아미드겔 분석에 의해 모니터링된 I-Ak의 순도를 제15도에 도시하였다.
I-Ak및 쥐의 MBP펩티드의 복합체를 제조하기 위해서, 30mM의 옥틸글루코시드를 함유하는 PBS중의 10㎍의 친화성 정제된 I-Ak와 HPLC로 정제한 MBP펩티드 50배 몰초과량을 총부피가 125μl로 되도록 혼합하였다. 샘플을 일정하게 진동시키면서 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션시키고 나서, 리포좀을 제조하기 위해 G-24 세파덱스 탈염법에 의해 펩티드로부터 분리하거나 또는 세포를 조사하기 위해서 PBS에 대하여 투석한 후, RPMI 배지에서 4℃로 36시간 동안 인큐베이션 하였다.
다음과 같이 I-Ak-MBP 펩티드 복합체를 리포좀 안으로 도입하였다. 콜레스테롤 : 디팔미토일포스파티딜 콜린(DPPC) : 디팔미토일포스파티딜 에탄올아민-플루오레신(DPPEF) 가 25 : 75 : 2로 구성된 지질용액을 30mM 옥틸글루코시드(OG)가 함유된 클로로포름 내에서 제조하였다. 진공하에서 지질을 건조시키고나서, 17mM OG가 함유된 PBS에서 수행된 I-Ak-펩티드 복합체를, 건조지질과 5 : 1의 비율(w/w)로 혼합하였다. 이 혼합물을 2-3분 동안 와동시키고 4℃로 냉각시켜 최종적으로 PBS로 투석시킨 후, RPM I 배지에 4℃에서 36시간 동안 인큐베이션시켰다. (125-I)로 표지된 I-Ak를 사용하는 실험에 있어서, 플루오레신화 지질이 지질 혼합물에 전혀 포함되지 않았고 리포좀 안으로의 I-Ak의 혼입을 신티그래피에 의해 측정하였다.
Watts 등(Proc. Natl. Acad. Sci., USA,82: 5480-5484, 1985)의 방법에 의해, 친화-정제된 I-Ak만을, 또는 정제된 I-Ak+MBP(1-13)을 함유하는 50-100μl의 리포좀을 사용하여 12㎜의 살균된 유리커버슬립상에서 평평한 지질막을 제조하였다.
형광 항-I-Ak항체를 사용하여 염색한 후에 형광현미경 법에 의해서 평판형 막상의 I-Ak의 존재를 확인하였다. 형광 항-I-Ad를 사용하여 염색할 때 바탕값 이상의 형광은 전혀 주지되지 않았다.
MBP 펩티드 자극의 6 내지 8일 후에 얻어진 AJ1.2 및 4R 3.4세포를 2회 세척하고나서 평판형 막에 4×105개의 세포를 첨가하였다. 5% CO2내에서 37℃에서 48-72시간 동안 플레이트를 인큐베이션한 다음 콜로니의 형성을 가시적으로 조사하였다. AJ1.2 또는 4R3.4세포 1×105개를 50-100μl의 정제된 I-Ak, 정제된 I-Ak와 MBP(1-13), 그리고 배지만을 사용하여 5% CO2내에서 37℃에서 5시간 동안 배양함으로써 세제-가용화 분자 클래스 II의 효과를 측정하였다. 이러한 인큐베이션 후에는 세포를 900μl가 되도록 희석하여, 증식분석에 있어서 세포가 항원-제공세포(APC) 및 항원[MBP(1-13)]에 반응하는 능력을 시험하였다.
3-(4,5-디메틸-티아졸-2, 7'-) -2, 5디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT)의 흡수력을 세포 증식의 지표로서 사용하였다. 보통3H-티미딘 흡수력에 의해 모니터되는 DNA합성, 및 MTT흡수력에 의해 측정되는 미토콘드리아의 활성은 상이한 세포작용이지만, 비장세포배양액의 자극 개시 3일 후에 모니터된 이 2가지 상이한 활성은 서로 매우 잘 추적된다는 것을 나타내었다(Molecular Device Application Bulletin Number 011-A, 1988. 2. 9.) 데이터는 배지만을 사용하여 배양된 세포에 비교하여 클래스 II+Ag를 사용하여 인큐베이션된 세포의 증식억제 %로서 제공되며 다음식을 사용하여 계산되었다 :
여기에서,
T 세포 a=I-Ak+MBP(1-13)복합체를 사용하여 예비 인큐베이션된 T 세포
T 세포 b=I-Ak만을 사용하여 예비 인큐베이션된 T 세포
T 세포 c=배지를 사용하여 예비 인큐베이션된 T 세포.
클라스 II MHC만의 존재하에서 배양된 세포의 증식은 대부분의 연구에 있어서 배지만을 사용하여 배양된 세포와 대개 같기 때문에 억제율 %를 얻는데에는 후자의 수를 사용한다. 3개의 웰에 대한 표준 편차는 실험의 대다수에서 10%미만이었다.
I-Ak+MBP(1-13)을 사용하여 예비 처리하면 I-Ak+MBP(1-13)을 함유하는 리포조옴으로부터 제조된 평판형 막에 대한 T세포 클론의 결합이 변화하는 가의 여부를 결정하기 위해 최초로 2가지 정성 분석을 실시하였다. AJ1.2세포는 MBP(1-13)만의 존재하에, 즉 항원 제공세포(APC) 없이 평판형 막에 특징적인 콜로니를 형성하기 때문에 이 분석에는 AJ1.2세포를 사용하였다.
I-Ak+MBP(1-13)를 사용하여 AJ1.2세포를 5시간 동안 예비 인큐베이션하면 I-Ak또는 배지만을 사용하여 인큐베이션 한 세포에 비해 평판형 막에 형성된 콜로니의 수를 억제하였다. 제 2의 실험에 있어서는, AJ1.2세포를 I-Ak+MBP(1-13)이 함유된 리포좀을 사용하여, 또는 I-Ak만을 사용하여 5시간 동안 인큐베이션한 다음 상기와 같이 제조된 평판형 막에 첨가하였다.
지금까지 세제-가용화 I-AkMBP(1-13)에 대하여 주지된 바와같이, I-Ak+MBP(1-13)이 함유된 리포좀을 사용하여 세포를 배양하면 I-Ak만을 함유한 리포좀을 사용하여 인큐베이션한 세포에 비해 콜로니의 수가 감소된다. 콜로니의 수를 정확하게 계수할 수는 없으나 수에 있어서 명백한 차이가 증명되었다.
이러한 분석으로는 T세포 클론에 대한 I-Ak+MBP(1-13)의 효과를 정량할 수 없기 때문에 본 발명자들은 APC 및 MBP(1-13)의 존재하에서 이 복합체를 사용하여 예비 인큐베이션 함으로써 4R3.4 또는 AJ1.2세포의 증식에 대한 효과를 시험하였다.
그러므로, I-Ak+MBP(1-13), I-Ak, 또는 배지만을 50-100μl 사용하여 37℃에서 5시간 동안 4R3.4 또는 AJ1.2세포를 예비 인큐베이션 하였다. 그 다음에는 세포를 적정 농도로 희석시켜서 APC에 부가하였다. 항원[MBP(1-13)]을 첨가하여 최종 농도가 13.3㎛ 내지 53.2㎛가 되도록 하였다.
이 분석에 사용된 APC는 A/J마우스 암컷이 비장으로부터 제조되었다. 즉, 비장을 떼어내서 살균 현미경 슬라이드의 광택없는 쪽에서 부드럽게 박리시킴으로써 단일세포 현탁액을 제조하였다. 저장액 쇼크에 의해서 붉은 세포를 용해시켰다. 잔류세포를 항생물질이 함유된 RPM I로 2회 세척하고 미토마이신-C 10㎍/ml와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이렇게 인큐베이션한 후에는 항생물질이 함유된 RPM I를 사용하여 비장세포를 5회 세척하고 계수하여 APC로서 사용하였다.
세포를 APC와 MBP(1-13)와 함께 72시간 동안 인큐베이션한 후에 MTT 흡수력을 이용하여 증식의 정도를 정량하였다. 이러한 연구의 결과를 제16도에 요약하였다. 연구 1,3 및 4에서는 4R3.4세포를 상기와 같이 인큐베이션하였다. 연구 2에서는 I-Ak+MBP(1-13)을 함유하거나 I-Ak만을 함유하는 리포좀과 함께 4R3.4세포를 예비 인큐베이션하였다. 그 다음에는 10% 피콜(Ficoll)용액을 통해 원심분리함으로써 미결합 리포좀으로부터 T세포를 분리하고 세척하여 증식분석에 사용하였다. 연구 5 내지 8은 클론 AJ1.2를 사용하여 수행하였다. I-Ak만을 사용하여 인큐베이션된 세포는 배지 내에서 배양된 세포와 동일한 정도로 증식되었다. 이러한 방법으로 예비 인큐베이션된 T세포 클론은 APC가 없는 상태에서는 증식하지 않았다.
상기와 같이 제공된 데이터에 의해, 클래스 II MHC+MBP(1-13) 복합체는 MBP(1-11)에 특이적인 T세포 클론 내에서 중대한 비반응성을 유도한다는 것이 증명되었다. 또한 이 데이터에 의해 이 복합체가 MBP-자극 T-세포 클론에 대하여 면역학적으로 반응하고 결합한다는 것이 밝혀졌다.
[실시예 4]
마우스에 있어서 EAE의 유도
MBP(1-13)을 사용하여 마우스를 면역시키는 것과 같이, T세포 클론 AJ1.2 및 4R3.4의 수용 전이는 마우스에 대하여 EAE의 발생을 야기한다. 무상 MBP를 사용하는 마우스의 EAE유도 방법을 사용함으로써 펩티드를 가지는 EAE가 유도되었다. 즉, 진한 유탁액을 형성하기 위해 MBP(1-13)을 PBS에 용해시키고 완전 프로인트 보조제와 함께 와동혼합하였다. A/J 마우스 암컷이 옆구리 4부위에 이 혼합물을 100㎍씩 주사하였다. 24시간 및 72시간 후에, 백일해 독소 400ng을 정맥 내에 주사하였다. EAE의 발생 및 사망에 대하여 2개체의 생쥐를 매일 관찰하였다.
제17도의 결과는 MBP(1-13)을 사용하여 면역시킴으로써 마우스 내에서 일어나는 EAE의 발생을 나타낸다. EAE의 수용 전이를 위해, MBP(1-11)을 사용하여 면역된 B10A(4R) 마우스로부터 얻은 T세포 클론 4R3.4이 사용되었다. B10.A(4R) 마우스의 전신에 350rad로 방사선 조사하고나서 백일해 독소 400ng을 정맥 내로 주사하였다. 2~3시간 후에, 3일전에 MBP(1-13)으로 자극한 4R3.4 세포 10×106개를 정맥 내로 주사하였다. EAE 징후 및 사망에 대하여 이 동물을 매일 2회씩 관찰하였다. 이 조사결과를 제18도에 요약하였다.
[실시예 5]
I-Ak-MBP(1-13) 복합체에 의한 EAE의 하향조절
EAE의 경로를 역행하기 위한 I-Ak-MBP(1-13) 복합체의 능력을 다음 방법에 따라 시험하였다.
완전한 프로인트 보조제와 함께 혼합된 MBP(1-13) 100㎍을 사용하여 A/J 마우스 암컷에 EAE를 유도하고 나서, 350rad로 방사선 조사되고 파상풍 유독소로 처리된 B10A(4R) 마우스 암컷에 파상풍 유독소 200-400ng을 투여하거나 4R3.4 T세포 1-10×106개를 수용전이시켰다. 면역시키고 나서 2내지 3일후 또는 EAE증상이 나타나자마자 동물에 복합체를 주사하였다. 투여량과 투여경로는 예비연구에서 결정되었고 명백히 무독성인 농도만을 사용하였다.
추가의 대조군으로서 복합체만을 또는 무관한 항원을 함유하는 복합체를 사용하여 마우스를 처리하였다.
상이한 2명의 관찰자에 의해 매일 2회씩 동물을 관찰하였다. 상술된 척도를 사용하여 모든 마우스 군의 EAE 정도를 평가하였다 : 여기에서 0=EAE 증상 없음 ; 1, 꼬리의 색조만이 퇴색 ; 2, 경중의 대부전마비 ; 3, 중간 정도의 대부전마비 ; 4, 완전한 대부전마비 ; 5, 빈사.
[실시예 6]
자기면역 기능장애를 가지고 있는 개체로부터의 B세포의 EBV형질전환
자기면역 기능장애 개체로부터의 말초혈 단핵세포(PBMNC)를, 살균인산 완충 식염수(PBS), pH7.2로 전체 혈액 또는 연막을 1 : 1로 희석하여, 그 현탁액을 피콜-하이파크 상에 놓아 층을 이룬 다음 탁상용 원심분리기로 1800-2000rpm에서 20분 동안 원심분리함으로써 단리하였다. 피콜-하이파크와 PBS-혈장의 계면에서 밴드로 존재하는 PBMNC를 피펫으로 수득하여 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 10% 우태아 혈청(FBS)함유 RPMI 1640에 ml당 5×106세포로 현탁하여 폴리스티렌 플라스크에 넣고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하여 단구를 제거하였다. 비-점착 세포를 수집하여 원심분리로 펠릿화하고, 15% FBS함유 Ca++-Mg++유리 둘베코 PBS에 ml당 10×106세포로 재현탁하였다. AET-SRBC(2% v/v)를 PBMC로 1 : 1 혼합하고, 그 혼합물을 20분동안 100×g에서 원심분리한 후 얼음상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 펠릿을 부드럽게 재현탁하고, 그 현탁액을 상술한 바와 같이 피콜-하이파크를 통하여 원심분리하였다. B세포와 잔류하는 단구를 함유하는 밴드를 수득하였다.
B세포의 형질전환은 B 95-8 셀 라인으로 하였다(Walls 및 Crawford,Lymphocytes : A Practical Approach(G.G.B.Klaus ed., IRL Press).
B95-8세포를 배지로 1 : 3으로 희석하고, 5일 동안, 37℃에서 배양한 후, 상징액을 수득하여 250×g에서 15분 동안 원심분리하고, 0.45미크론 밀리포아 필터를 통하여 여과하였다. 그런 다음 EBV를 10,000rpm에서 2시간 동안, 4℃에서 원심분리함으로써 농축하고, 바이러스 함유 펠릿을 원부피의 1%에서, 10% FBS함유 RPMI 1640에 현탁하였다.
B세포를 형질전환하기 위하여 바이러스 원액을 2×106세포 함유 배양 배지로 1 : 9로 희석하였다. 바이러스가 1-2시간 동안 4℃에서 세포에 흡착된 후, 세포를 250×g에서 원심분리하였다. 그 결과의 세포펠릿을 10% FBS함유 RPMI 1640에 ml당 대략 0.7×106내지 7.0×106세포로 현탁하였다. 형질전환된 세포를 표준 방법을 사용하여 클론하였다.
이 과정에 의하여 만들어진 형질전환된 B세포는 사람 MHC 당단백질의 단리에 적당하다.

Claims (10)

  1. 다음식 : MHC2_ 펩티드1_ X의 복합체. 상기 식에서, X는 독소 및 표지군으로부터 선택된 기능부를 나타내며; MHC는 MHC 당단백질의 유효 부분이고, 이때에 이 당단백질은 그것이 정상적으로 존재하고 있는 세포 표면으로부터 분리되며 ; "펩티드"는 자기항원과 관련된 에피토프-함유 항원성 펩티드를 나타내고 ;1는 공유결합, 또는 공유결합에 의하여 X와 펩티드에 결합된 2가의 링커를 나타내며 그리고2는 공유결합, 비공유 연결, 또는 MHC 및 펩티드에 공유 결합되었거나 연결된 링커를 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서, 펩티드는 중증 근무력증(MG) ; 다발성 경화증(MS) ; 전신성 홍반성 낭창(SLE) ; 류머티스성 관절염(RA) ; 및 인슐린 의존 진성 당뇨병(IDDM)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 자기면역 질병과 관련된 에피토프 항원을 함유하고 있는 8-15 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 복합체.
  3. 제 1 항에 있어서, MHC의 유효부분이 MHC-II의 N-말단 알파1, 알파2, 및 베타1및 베타2영역인 것을 특징으로 하는 복합체.
  4. 제 1 항에 있어서, MHC의 유효부분이 비장 세포로부터 단리되고 펩티드와의 결합 능력에 대하여 스크린되는 것을 특징으로 하는 복합체.
  5. 활성 성분으로서, 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합상태의 제 1 항의 복합체로 이루어지는, 자기면역 질병 치료에 유용한 약학조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 리포좀으로 구성되는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  7. MHC-II 당단백질을 MHC-II 함유 세포로부터 단리하는 단계 ; 상기 MHC를 펩티드와 배양하는 단계 ; 그리고 투석에 의하여 과잉 펩티드를 제거하는 단계로 이루어지는, 다음식 ; MHC2펩티드(상기 식에서, MHC2_ 및 펩티드는 제 1 항에서 정의된 바와 같다.)의 복합체를 제조하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 미셸 또는 리포좀을 형성하기 위하여 지질의 존재하에 MHC2_ 펩티드를 투석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7 항의 방법에 따라 제조된 식 MHC2_ 펩티드의 복합체.
  10. 제 8 항의 방법에 따라 제조된 식 MHC2_ 펩티드의 복합체.
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