ES2323098T3 - Moleculas de mhc recombinantes utiles para la manipulacion de celulas t especificas de antigeno. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido purificado que comprende, covalentemente unidos un primer y segundo dominios, en donde: el primer dominio es un dominio a1 de MHC de clase II de mamífero y el segundo dominio es un dominio {alpha} 1 de MHC de clase II de mamífero; y en donde el extremo amino del segundo dominio está covalentemente unido al extremo carboxi del primer dominio.

Description

Moléculas de MHC recombinantes útiles para la manipulación de células T específicas de antígeno.

Reivindicación de prioridad

Esta solicitud reivindica prioridad de las solicitudes provisionales de patente de EE.UU. en tramitación junto a esta con los números de serie 60/064552 y 60/064555, presentadas el 16 de septiembre de 1997 y el 10 de octubre de 1997, respectivamente, que se incorporan aquí mediante referencia.

Antecedentes de la invención

El inicio de una respuesta inmune contra un antígeno específico en mamíferos se produce por la presentación de ese antígeno a las células T. Un antígeno se presenta a las células T en el contexto de un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Los complejos MHC se localizan en la superficie de las células presentadoras de antígeno (CPA); la estructura tridimensional de los MHC incluye un surco o hendidura en la que encaja el antígeno presentado. Cuando un receptor apropiado en una célula T interacciona con el complejo MHC/antígeno en una CPA en presencia de las señales coestimuladoras necesarias, la célula T se estimula, desencadenando varios aspectos de la bien caracterizada cascada de sucesos de activación del sistema inmune, incluyendo la inducción de la función de células T citotóxicas, inducción de la función de células B y estimulación de la producción de citoquinas.

Existen dos clases básicas de moléculas de MHC en mamíferos, MHC de clase I y MHC II. Ambas clases son grandes complejos de proteínas formados mediante la asociación de dos proteínas separadas. Cada clase incluye dominios transmembrana que anclan el complejo en la membrana celular. Las moléculas de MHC de clase I se forman a partir de dos proteínas asociadas de forma no covalente, la cadena \alpha y la microglobulina \beta2. La cadena \alpha comprende tres dominios distintos, \alpha1, \alpha2 y \alpha3. La estructura tridimensional de los dominios \alpha1 y \alpha2 forma el surco en el que encajan los antígenos para la presentación a las células T. El dominio \alpha3 es un dominio transmembrana similar al plegamiento Ig que ancla la cadena \alpha a la membrana celular de la CPA. Los complejos de MHC de clase I, cuando se asocian con el antígeno (y en presencia de señales coestimuladoras apropiadas) estimulan células T CD8 citotóxicas, que funcionan para aniquilar cualquier célula que reconozcan específicamente.

Las dos proteínas que se asocian de forma no covalente para formar las moléculas de MHC de clase II se denominan cadenas \alpha y \beta. La cadena \alpha comprende dominios \alpha1 y \alpha2, y la cadena \beta comprende dominios \beta1 y \beta2. La hendidura en la que encaja el antígeno se forma mediante la interacción de los dominios \alpha1 y \beta1. Los dominios \alpha2 y \beta2 son dominios transmembrana similares a plegamiento Ig que anclan las cadenas \alpha y \beta a la membrana celular de la CPA. Los complejos de MHC de clase II, cuando se asocian con un antígeno (y en presencia de las señales coestimuladoras apropiadas) estimulan células T CD4. Las funciones primarias de las células T CD4 son iniciar la respuesta inflamatoria y regular otras células en el sistema inmune.

Los genes que codifican las diversas proteínas que constituyen los complejos MHC se han estudiado extensamente en seres humanos y otros mamíferos. En seres humanos, las moléculas de MHC (con la excepción de la microglobulina \beta2 de clase I) están codificadas en la región HLA, que está localizada en el cromosoma 6 y constituye más de 100 genes. Hay 3 loci de proteína \alpha de MHC de clase I, denominados HLA-A, -B y -C. También hay 3 pares de loci de cadenas \alpha y \beta de MHC de clase II, denominados HLA-DR(A y B), HLA-DP(A y B), y HLA-DQ(A y B). En ratas, el gen \alpha de clase I se denomina RT1.A, mientras que los genes de clase II se denominan RT1.B\alpha y RT1.B\beta. Se puede encontrar información más detallada de los antecedentes sobre la estructura, función y genética de los complejos de MHC en Immunobiology: The Immune System in Health and Disease por Janeway y Travers, Current Biology Ltd./Garland Publishing, Inc. (1997) (ISBN 0-8153-2818-4), y en Bodmer et al. (1994) "Nomenclature for factors of the HLA system" Tissue Antigens vol. 44, páginas 1-18 (con actualizaciones periódicas).

El papel principal que desempeñan los complejos de MHC en desencadenar el reconocimiento inmune ha llevado al desarrollo de métodos por los que se usan estos complejos para modular la respuesta inmune. Por ejemplo, se sabe que las células T activadas que reconocen antígenos "propios" (autoantígenos) desempeñan un papel principal en enfermedades autoinmunes (tal como artritis reumatoide y esclerosis múltiple). Basado en la observación de que las moléculas de MHC de clase II aisladas (cargadas con el antígeno apropiado) pueden sustituir a las CPA que llevan los complejos MHC de clase II y se pueden unir a células T específicas de antígeno, un número de investigadores han propuesto que los complejos MHC/antígeno aislados se pueden usar para tratar trastornos autoinmunes. De esta manera las patentes de EE.UU. Nos. 5194425 (Sharma et al.) y 5284935 (Clark et al.) divulgan el uso de complejos de MHC de clase II aislados cargados con un autoantígeno especificado y conjugados a una toxina para eliminar células T que son específicamente inmunoreactivas con autoantígenos. En otro contexto, se ha mostrado que la interacción de complejos aislados MHC/antígeno con células T, en ausencia de factores coestimuladores, induce un estado de no reactividad conocido como anergia. (Quill et al., J. Immunol., 138:3704-3712 (1987)). Siguiendo esta observación, Sharma et al., (patentes de EE.UU. Nos. 5468481 y 5130297) y Clarke et al., (patente de EE.UU. No. 5260422) han sugerido que tales complejos MHC/antígeno aislados se pueden administrar terapéuticamente para anergizar líneas de células T que responden específicamente a péptidos autoantigénicos particulares.

Se han estudiado métodos para usar complejos de MHC aislados en la detección, cuantificación y purificación de células T que reconocen antígenos particulares para su uso en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. A modo de ejemplo, la detección temprana de células T específicas para un autoantígeno particular facilitaría la selección temprana de las pautas de tratamiento apropiadas. La capacidad de purificar células T específicas de antígeno también sería de gran valor en la inmunoterapia adoptiva. La inmunoterapia adoptiva implica la extracción de células T de un paciente de cáncer, la expansión de las células T in vitro y después la reintroducción de las células en el paciente (ver la patente de EE.UU. No. 4690915; Rosenberg et al. New Engl. J. Med. 319:1676-1680 (1988)). El aislamiento y expansión de células T específicas de cáncer con propiedades inflamatorias aumentaría la especificidad y eficacia de tal planteamiento.

Hasta la fecha, sin embargo, los intentos de detectar, cuantificar o purificar células T específicas de antígeno usando complejos MHC/antígeno aislados no han tenido gran éxito debido, entre otras razones, a que la unión entre las células T y tales complejos aislados es transitoria y por lo tanto el complejo célula T/MHC/antígeno es inestable. En un intento de abordar estos problemas, Altman et al., (Science 274, 94-96 (1996) y patente de EE.UU No. 5635363) han propuesto el uso de grandes estructuras multiméricas covalentemente unidas de complejos MHC/antígeno para estabilizar esta interacción mediante unión simultánea a múltiples receptores de células T en un célula T diana.

Aunque el concepto de usar complejos MHC/antígeno aislados en aplicaciones terapéuticas y diagnósticas tiene una gran promesa, un inconveniente principal a los diversos métodos descritos hasta la fecha es que los complejos son grandes y por lo tanto difíciles de producir y trabajar con ellos. Mientras que los complejos se pueden aislar de linfocitos mediante extracción con detergente, tales procedimientos son ineficaces y producen sólo pequeñas cantidades de proteína. La clonación de los genes que codifican las diferentes subunidades del complejo MHC ha facilitado la producción de grandes cantidades de subunidades individuales mediante expresión en células procariotas, pero el ensamblaje de las subunidades individuales en complejos MHC que tengan la estructura conformacional adecuada se ha demostrado difícil.

Esta invención se basa en el descubrimiento de que la función del MHC de mamíferos se puede mimetizar mediante el uso de polipéptidos recombinantes que incluyen sólo aquellos dominios de moléculas de MHC que definen la hendidura de unión al antígeno. Estas moléculas son útiles para detectar, cuantificar y purificar células T específicas de antígeno. Las moléculas que se proporcionan aquí también se pueden usar en aplicaciones clínicas y de laboratorio para detectar, cuantificar y purificar células T específicas de antígeno, inducir anergia en células T, así como para estimular células T, y para tratar enfermedades mediadas por células T específicas de antígeno.

A modo de ejemplo, mientras Altman et al., (Patente de EE.UU. No. 5635363) contemplan el uso de multímeros de complejos de MHC de clase II que comprenden dominios \alpha1, \alpha2, \beta1 y \beta2 y antígenos peptídicos asociados, para unirse a y purificar células T específicas de antígeno de una mezcla, los inventores presentes han descubierto que tal unión de células T específicas de antígeno se puede realizar con una molécula monomérica mucho más sencilla que comprende, en el caso de moléculas de MHC de clase II, sólo los dominios \alpha1 y \beta1 en unión covalente (y en asociación con un determinante antigénico). Por conveniencia, tales polipéptidos de MHC de clase II se denominan de aquí en adelante como "\beta1\alpha1". También se divulgan aquí moléculas equivalentes derivadas de moléculas de MHC de clase I. Tales moléculas comprenden los dominios \alpha1 y \alpha2 de las moléculas de clase I en unión covalente y en asociación con un determinante antigénico. Tales polipéptidos de MHC de clase I se denominan como "\alpha1\alpha2". Estas moléculas de dos dominios se pueden producir fácilmente mediante expresión recombinante en células procariotas o eucariotas, y purificar fácilmente en grandes cantidades. Además, estas moléculas se pueden cargar fácilmente con cualquier antígeno peptídico deseado, haciendo la producción de un repertorio de moléculas de MHC con diferentes especificidades de células T una tarea sencilla.

Se muestra que, a pesar de carecer de los dominios transmembrana de plegamiento Ig que son parte de la molécula de MHC intacta, estas moléculas de MHC de dos dominios se repliegan de una manera que es estructuralmente análoga a las moléculas de MHC "completas", y se unen a antígenos peptídicos para formar complejos MHC/antígeno estables. Además, estos complejos MHC de dos dominios/epítopo se unen a células T de una forma específica de epítopo, e inhiben la proliferación de células T específica de epítopo in vitro. Además, se muestra que la administración de moléculas \beta1\alpha1 cargadas con el epítopo de la proteína básica de mielina (MBP) que comprende los aminoácidos 69-89 de MBP a ratas tanto suprime el inicio de como trata la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratas. De esta manera, las moléculas de MHC de dos dominios muestran efectos poderosos y específicos de epítopo sobre la activación de células T tanto in vitro como in vivo. Como resultado, las moléculas de MHC divulgadas son útiles en un amplio rango de aplicaciones tanto in vivo como in vitro.

La invención proporciona varias formulaciones de la molécula de dominios. En su forma más básica, las moléculas de MHC de clase II de dos dominios comprenden dominios \alpha1 y \beta1 de una molécula de MHC de clase II de mamífero en donde el extremo amino del dominio \alpha1 está covalentemente unido al extremo carboxi del dominio \beta1 y en donde el polipéptido no incluye los dominios \alpha2 o \beta2. Las moléculas de MHC de clase I de dos dominios divulgadas aquí comprenden dominios \alpha1 y \alpha2 de una molécula de clase I de mamíferos, en donde el extremo amino del dominio \alpha2 está covalentemente unido al extremo carboxi del dominio \alpha1, y en donde el polipéptido no incluye un dominio \alpha3 de MHC de clase I. Para la mayoría de las aplicaciones, estas moléculas están asociadas, mediante interacción covalente o no covalente, con un determinante antigénico, tal como un antígeno peptídico. En ciertas formas de realización, el antígeno peptídico está covalentemente unido al extremo amino del dominio \beta1 de las moléculas de clase II, o del dominio \alpha1 de las moléculas de clase I. Las moléculas de dos dominios también pueden comprender un marcador detectable, tal como un marcador fluorescente o un grupo tóxico, tal como ricina A.

La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican la molécula de MHC de dominio de la invención, así como vectores de expresión que se pueden usar de forma conveniente para expresar tal molécula. En formas de realización particulares, las moléculas de ácido nucleico incluyen secuencias que codifican el péptido antigénico así como la molécula de MHC de dos dominios. Por ejemplo, una de tales moléculas de ácido nucleico puede estar representada por la fórmula Pr-P-B-A, en donde Pr es una secuencia promotora operativamente unida a P (una secuencia que codifica el antígeno peptídico), B es el dominio \beta1 de clase II, y A es el dominio \alpha1 de clase II. En estas moléculas de ácido nucleico, P, B y A comprenden un único marco abierto de lectura, de modo que el péptido y los dos dominios de MHC se expresan como una única cadena polipeptídica.

In vitro, las moléculas de dominios de MHC de la invención se pueden usar para detectar y cuantificar células T, y regular la función de las células T. De esta manera, se pueden usar tales moléculas cargadas con un antígeno seleccionado para detectar, seguir y cuantificar la población de células T que son específicas para ese antígeno. La capacidad de hacer esto es beneficiosa en un número de marcos clínicos, tal como seguir el número de células T específicas de antígeno tumoral en sangre extraída de un paciente de cáncer, o el número de células T específicas de autoantígeno en sangre extraída de un paciente que padece un enfermedad autoinmune. En estos contextos, las moléculas divulgadas son herramientas poderosas para seguir la evolución de una terapia particular. Además del seguimiento y cuantificación de células T específicas de antígeno, las moléculas divulgadas también se pueden usar para purificar tales células para inmunoterapia adoptiva. De esta manera, se pueden usar las moléculas de MHC divulgadas cargadas con un antígeno tumoral para purificar células T específicas de antígeno tumoral de un paciente de cáncer. Estas células se pueden expandir después in vitro antes de ser devueltas al paciente como parte de un tratamiento contra el cáncer. Cuando se conjuga con un grupo tóxico, la molécula de dominios de la invención se puede usar para aniquilar células T que tienen una especificidad antigénica particular. De forma alternativa, las moléculas de la invención también se pueden usar para inducir anergia en tales células T.

Las moléculas de dominios de la invención también se pueden usar in vivo para dirigirse a células T específicas de antígeno especificado. A modo de ejemplo, se puede usar una molécula \beta1\alpha1 cargada con una parte de la proteína básica de mielina (MBP) y administrar a pacientes que padecen esclerosis múltiple para inducir anergia en células T específicas de MBP, aliviando de esta manera los síntomas de la enfermedad. De forma alternativa, tales moléculas se pueden conjugar con un grupo tóxico para aniquilar más directamente las células T causantes de la enfermedad.

Estos y otros aspectos de la invención se describen en más detalle en las secciones siguientes.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1A muestra las secuencias del casete \beta1\alpha1 prototípico sin una región codificante de antígeno. Los sitios de restricción únicos NcoI, PstI y XhoI están en negrita. Se indican el final del dominio \beta1 y el principio del dominio \alpha1. La Fig. 1B muestra la secuencia de una secuencia de inserción péptido antigénico/enlazador en el mismo marco de lectura que se puede incorporar al casete de expresión en el sitio de inserción mostrado (\ding{116}) en la Fig. 1A. Esta secuencia incluye el antígeno MBP 72-89 de rata, un enlazador flexible con un sitio de corte de trombina embebido, y un sitio de restricción único SpeI que se puede usar para el intercambio fácil de la región que codifica el antígeno. El ejemplo 2 más adelante discute el uso del péptido equivalente de cobaya, que tiene una serina en lugar del residuo de treonina en la secuencia MBP 72-89. Las Figs. 1C y 1D muestran fragmentos NcoI/SpeI de ejemplo que se pueden insertar en el casete de expresión en lugar de la región codificante del antígeno MBP 72-89. La Fig. 1C incluye el antígeno MBP 55-69, la Fig. 1D incluye el antígeno CM-2.

Las Figs. 2A y B muestran el diseño basado en la estructura de la molécula \beta1\alpha1. A. RT1.B de clase II de rata, cargada con el péptido encefalolitogénico MBP-69-89. B. La molécula \beta1\alpha1 de cadena única, cargada con MBP-69-89.

Las Figs. 3 A y B muestran la detección directa de moléculas \beta1\alpha1/polipéptido específicas de antígeno que se unen a células T de rata. Se incubaron el hibridoma de células T A1 (BV8S2 TCR+) y la línea celular CM-2 (BV8S2 TCR-) 17 horas a 4ºC con varias construcciones \beta1\alpha1, se lavaron, se tiñeron durante 15 minutos con OX6-PE (\alpha-RT1.B) o un control de isotipo-PE y después se analizaron mediante FACS. Se bloqueó la expresión de fondo de I-A en la línea CM-2 con OX-6 no marcado. A. Histograma que muestra la tinción del hibridoma A1. B. Histograma que muestra la tinción de la línea celular CM-2.

La Fig. 4 es un gráfico que muestra la unión de A488 conjugado con moléculas \beta1\alpha1/polipéptido a BV8S2 TCR de rata. Las moléculas \beta1\alpha1 se conjugaron con el colorante Alexa-488, se cargaron con MBP-69-89, se incubaron con los hibridomas de células T A1 (BV8S2 TCR+) durante 3 horas a 4ºC y después se analizaron mediante FACS. A488-\beta1\alpha1(vacío) y A488-\beta1\alpha1/MBP-69-89, según se indica.

La Fig. 5 es un gráfico de barras que muestra que el complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89 bloquea la proliferación específica de antígeno en una manera reversible por IL-2. Las líneas de células T seleccionadas a corto plazo con el péptido MBP-69-89 de células de ganglios linfáticos de ratas inmunizadas 12 días antes con Gp-MBP/ACF se pretrataron durante 24 horas con construcciones \beta1\alpha1, se lavaron, y después se usaron en ensayos de proliferación en los que se cultivaron células con o sin 20 unidades/ml de IL-2. Las células se incubaron durante tres días, las últimas 18 horas en presencia de [^{3}H]timidina (0,5 \muCi/10 \mul/pocillo). Los valores indicados son las CPM media \pm EEM. El fondo fue de 210 CPM. Columna a. Ensayo control de proliferación sin IL-2. Columna b. Pretratamiento con \beta1\alpha1/MBP-69-89 20 \muM. Columna c. Pretratamiento con \beta1\alpha1/MBP-69-89 10 nM. Columna d. \beta1\alpha1/MBP-69-89 10 nM más IL-2 durante el ensayo de proliferación. Se muestra un único ensayo representativo; el experimento se hizo dos veces. *indica inhibición significativa (p<0,001) con \beta1\alpha1/MBP-69-89 frente a cultivos control.

Las Figs. 6A-D son gráficos que muestran la protección clínica de encefalomielitis autoinmune experimental con el complejo de \beta1\alpha1/MBP-69-89. Se inyectaron grupos de ratas Lewis (n=6) con 25 \mug de Gp-MBP/ACF para inducir EAE clínica. En los días 3, 7, 9, 11, y 14 después de la inducción de la enfermedad a las ratas se les dio el complejo \beta1\alpha1/péptido, péptido solo, o se dejaron sin tratar, según se indica. A. Sin tratamiento, ó 2 \mug de péptido MBP-69-89 solo, según se indica. B. 300 \mug de complejo \beta1\alpha1/(vacío) en solución salina. C. 300 \mug de complejo \beta1\alpha1/CM-2 en solución salina. D. 30 \mug de complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89 en solución salina. Se representa el peso corporal diario (gramos, parte derecha, eje y) para los tratamientos de 300 \mug de complejo \beta1\alpha1/péptido. Se muestra un experimento único representativo; el experimento se hizo tres veces. Los valores indican la puntuación clínica media \pm EEM en cada día de la enfermedad clínica. 30 \mug de complejo es equivalente a 2 \mug de péptido libre.

La Fig. 7 es un gráfico que muestra el tratamiento de EAE establecida con complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89. Se inyectaron grupos de ratas Lewis (n=6) con 25 \mug de Gp-MBP/ACF para inducir EAE clínica. El día del inicio de los signos clínicos (día 11), el día 13 y el día 15 a las ratas se les dio 300 \mug de complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89 (indicado por flechas) o se dejaron sin tratar. Se muestra un experimento representativo individual; el experimento se hizo dos veces. Los valores indican la puntuación clínica media \pm EEM en cada día de la enfermedad clínica.

Las Figs. 8A y B son gráficos que muestran que el complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89 específicamente inhibe la respuesta a DTH a MBP 69-89. A. Cambio en el espesor de la oreja 24 horas después de provocación con PPD. B. Cambio en el espesor de la oreja 24 horas después de la provocación con MBP-69-89. Los valores indican puntuación media \pm EEM. *Indica diferencia significativa entre control y tratado (p=0,01). Se muestra un experimento representativo individual; el experimento se hizo dos veces.

La Fig. 9 es un gráfico que muestra que las respuestas de células T a MBP-69-89 se inhibieron en ratas Lewis tratadas con 300 \mug de complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89. Se recogieron células de los ganglios linfáticos de ratas control y tratadas tras la recuperación de controles de EAE (día 17) y se estimularon con concentraciones óptimas de Gp-MBP, péptido Gp-MBP-69-89, o PPD. *Indica diferencia significativa entre control y tratado (*p<0,05; **p<0,001). Nótese la inhibición con Gp MBP y el péptido MBP 69-89 pero no en ratas tratadas con PPD.

La Fig. 10A-C muestra las secuencias de aminoácidos de los dominios \beta1 y \alpha1 ejemplares (A) humanos (DRA y DRB1 0101), (B) ratón (I-EK) y (C) rata (RT1.B) (las secuencias de la metionina y glicina iniciales en la secuencia de rata se incluyeron en una construcción por razones de inicio de traducción).

La Fig. 11 muestra las secuencias de aminoácidos de los dominios \alpha1 y \alpha2 ejemplares derivados de MHC de clase I humano B*5301.

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Lista de secuencias

La lista de secuencias adjunta a esto incluye las secuencias siguientes:

Seq. I.D. No. 1: el ácido nucleico de un casete de expresión de \beta1\alpha1 de cadena única.

Seq. I.D. No. 2: la secuencia de aminoácidos codificada por la construcción mostrada en Seq. I.D. No. 1.

Seq. I.D. No. 3: la secuencia de ácido nucleico de un inserto antígeno/enlazador adecuado para la inserción en el casete de expresión mostrado en Seq. I.D. No. 1.

Seq. I.D. No. 4: la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia mostrada en Seq. I.D. No. 3.

Seq. I.D. Nos. 5 y 7: secuencias codificantes de antígenos alternativas para el casete de expresión y Seq. I.D. Nos. 6 y 8, las secuencias de antígeno codificadas por las secuencias mostradas en Seq. I.D. Nos. 5 y 7, respectivamente.

Seq. I.D. Nos. 9-20 y 28-29 muestran los cebadores de PCR usados para amplificar los componentes del casete de expresión \beta1\alpha1.

Seq. I.D. No. 21 muestra los dominios \alpha1 y \alpha2 ejemplares representados en la figura 11.

Seq. I.D. Nos. 22-24 muestran los dominios \beta1 y \alpha1 ejemplares representados en la figura 10.

Seq. I.D. Nos. 25-27, y 30 muestran secuencias de péptidos usadas en varios aspectos de la invención.

Descripción detallada de la invención 1. Definiciones

Para facilitar la revisión de varias formas de realización de la invención, se proporcionan las siguientes definiciones de términos y explicaciones de abreviaturas.

Aislado: Un ácido nucleico "aislado" se ha separado o purificado sustancialmente de otras secuencias de ácido nucleico en la célula del organismo en el que el ácido nucleico se da de forma natural, es decir, otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos. El término "aislado" de esta manera abarca ácidos nucleicos purificados mediante métodos de purificación estándar de ácidos nucleicos. El término también abarca ácidos nucleicos preparados mediante expresión recombinante en una célula huésped así como ácidos nucleicos químicamente sintetizados.

ADNc (ADN complementario): un trozo de ADN que carece de segmentos internos, no codificantes (intrones) y secuencias reguladoras que determinan la transcripción. El ADNc se sintetiza en el laboratorio mediante transcripción inversa del ARN mensajero extraído de las células.

ORF (marco abierto de lectura): una serie de tripletes de nucleótidos (codones) que codifican aminoácidos sin codones de terminación. Estas secuencias son normalmente traducibles en un polipéptido.

marcador detectable o molécula indicadora. Los marcadores típicos incluyen isótopos radioactivos, ligandos, agentes quimioluminiscentes, y enzimas. Los métodos para el marcaje y las directrices en la elección de marcadores apropiados para varios propósitos se discuten, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989) y Ausubel et al. (1987).

Los cebadores son ácidos nucleicos cortos, preferiblemente oligonucleótidos de ADN de 15 nucleótidos o más de longitud. Los cebadores se pueden alinear a una hebra de ADN complementario diana mediante hibridación de ácidos nucleicos para formar un híbrido entre el cebador y la hebra diana de ADN, y después extender a lo largo de la hebra diana de ADN mediante una enzima ADN polimerasa. Se pueden usar pares de cebadores para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros métodos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos en la técnica.

Los métodos para preparar y usar sondas y cebadores se describen, por ejemplo en Sambrook et al. (1989), Ausubel et al. (1987), e Innis et al., (1990). Los pares de cebadores de PCR pueden derivar de una secuencia conocida, por ejemplo usando programas de ordenador para tal fin tal como Primer (Versión 0.5, © 1991, Instituto Whitehead para Investigación Biomédica, Cambridge, MA).

Purificado: el término purificado no requiere pureza absoluta; más bien, se pretende como un término relativo. De esta manera, por ejemplo, una preparación de proteína de MHC recombinante purificada es una en la que la proteína de MHC recombinante está más pura que la proteína en su medio de origen dentro de una célula. Una preparación de una proteína de MHC recombinante está típicamente purificada de modo que la proteína de MHC recombinante representa al menos el 50% del contenido total de proteína de la preparación. Sin embargo, se pueden requerir preparaciones más altamente purificadas para ciertas aplicaciones. Por ejemplo, para tales aplicaciones, se pueden emplear preparaciones en las que la proteína de MHC comprende al menos el 75% o al menos el 90% del contenido total de proteína.

Operativamente unido: Una primera secuencia de ácido nucleico está operativamente unida con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico está colocada en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido a una secuencia codificante si el promotor efectúa la transcripción o expresión de la secuencia codificante. Generalmente, las secuencias de ADN operativamente unidas son contiguas y, donde es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, los marcos abiertos de lectura están alineados.

Recombinante: Un ácido nucleico o polipéptido recombinante es uno que tiene una secuencia que no es natural o tiene una secuencia que se hace mediante una combinación artificial de dos o más segmentos de secuencia en otro caso separados. Esta combinación artificial se realiza con frecuencia mediante síntesis química o, más comúnmente, mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética.

Mamífero: Este término incluye tanto mamíferos humanos como no humanos. De forma similar, el término "paciente" incluye tanto sujetos humanos como veterinarios.

Polipéptido \beta1\alpha1: un polipéptido recombinante que comprende los dominios \alpha1 y \beta1 de una molécula de MHC de clase II en unión covalente. Para asegurar la conformación apropiada, la orientación de tal polipéptido es tal que el extremo carboxi del dominio \beta1 está covalentemente unido al extremo amino del dominio \alpha1.

Gen \beta1\alpha1: una secuencia recombinante de ácido nucleico que incluye una región promotora unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido \beta1\alpha1.

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Polipéptido \alpha1\alpha2: un polipéptido que comprende los dominios \alpha1 y \alpha2 de una molécula de MHC de clase I en unión covalente. La orientación de tal polipéptido es tal que el extremo carboxi del dominio \alpha1 está covalentemente unido al extremo amino del dominio \alpha2. Un polipéptido \alpha1\alpha2 comprende menos que la cadena \alpha completa de clase I, y normalmente suprime la mayoría o todo el dominio \alpha3 de la cadena \alpha.

Gen \alpha1\alpha2: una secuencia recombinante de ácido nucleico que incluye una región promotora unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido \alpha1\alpha2.

Dominio: un dominio de un polipéptido o proteína es una parte discreta de una secuencia de aminoácidos que se puede equiparar con una función particular. Por ejemplo, se reconoce que cada uno de los polipéptidos \alpha y \beta que constituyen la molécula de MHC de clase II tienen dos dominios \alpha1, \alpha2 y \beta1, \beta2, respectivamente. De forma similar, se reconoce que la cadena \alpha de las moléculas de MHC de clase I tiene tres dominios, \alpha1, \alpha2 y \alpha3. Los diferentes dominios en cada una de estas moléculas están típicamente unidos por secuencias enlazadoras de aminoácidos. Cuando se selecciona la secuencia de un dominio particular para su inclusión en una molécula recombinante, es preferible incluir el dominio entero; para asegurar que esto se hace, se puede extender la secuencia del dominio para incluir parte del enlazador, o incluso parte del dominio adyacente. Por ejemplo, cuando se selecciona el dominio \alpha1 de HLA-DR A, la secuencia seleccionada generalmente se extenderá desde el residuo de aminoácido número 1 de la cadena \alpha, a través del dominio \alpha1 entero e incluirá toda o parte de la secuencia enlazadora localizada en aproximadamente los residuos de aminoácidos 76-90 (en el extremo carboxi del dominio \alpha1, entre los dominios \alpha1 y \alpha2). Sin embargo, el número preciso de aminoácidos en los diferentes dominios de las moléculas de MHC varía dependiendo de la especie de mamífero, así como entre clases de genes dentro de una especie. Más que una definición estructural precisa basada en el número de aminoácidos, es el mantenimiento de la función del dominio lo que es importante cuando se selecciona la secuencia de aminoácidos de un dominio particular. Además, el experto en la materia apreciará que también se puede mantener la función del dominio si de alguna manera se utiliza menos de la secuencia entera de aminoácidos del dominio seleccionado. Por ejemplo, se pueden omitir un número de aminoácidos en los extremos amino o carboxi del dominio \alpha1 sin afectar a la función del dominio. Típicamente sin embargo, el número de aminoácidos omitidos de cualquiera de los extremos de la secuencia del dominio no será mayor de 10, y más típicamente no mayor de 5. La actividad funcional de un dominio particular seleccionado se puede evaluar en el contexto de los polipéptidos de MHC de dos dominios proporcionados por esta invención (es decir, los polipéptidos \beta1\alpha1 de clase II ó \alpha1\alpha2 de clase I) usando el ensayo de proliferación de células T específicas de antígeno como se describe en detalle más adelante. Por ejemplo, para probar un dominio \beta1 particular, se unirá a un dominio \alpha1 funcional de modo que se produzca una molécula \beta1\alpha1 y después se ensayará en el ensayo descrito. Un polipéptido \beta1\alpha1 ó \alpha1\alpha2 biológicamente activo inhibirá la proliferación de células T específicas de antígeno en al menos alrededor del 50%, indicando de esta manera que los dominios componentes son funcionales. Típicamente, tales polipéptidos inhibirán la proliferación de células T en este sistema de ensayo en al menos el 75% y algunas veces en más de alrededor del 90%.

Identidad de secuencia: la similitud entre secuencias de aminoácidos se expresa en términos de la similitud entre las secuencias, denominada de otra manera como identidad de secuencia. La identidad de secuencia se mide con frecuencia en términos de porcentaje de identidad (o similitud u homología); cuanto más alto sea el porcentaje, más similares son las dos secuencias. Las variantes de los polipéptidos dominios de MHC poseerán un grado relativamente alto de identidad de secuencia cuando se alinean usando métodos estándar. (Un "polipéptido dominio de MHC" se refiere a un dominio \alpha1 o \beta1 de un polipéptido de MHC de clase II o a un dominio \alpha1 o \alpha2 de un polipéptido de MHC de clase I).

Los métodos de alineamiento de secuencias para su comparación son bien conocidos en la técnica. Altschul et al. (1994) presenta un consideración detallada de métodos de alineamiento de secuencias y cálculos de homología. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., 1990) está disponible de varias fuentes, incluyendo el Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI, Bethesda, MD) y en la Internet, para su uso en relación con los programas de análisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Se puede acceder en \underbar{htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/}. Una descripción de cómo determinar la identidad de secuencia usando este programa está disponible en \underbar{http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast help.html}.

Las variantes de los polipéptidos dominios de MHC típicamente se caracterizan por la posesión de al menos el 50% de identidad de secuencia contada sobre el alineamiento de longitud completa con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido dominio de MHC nativo usando Blast 2.0 de NCBI, blastp con huecos fijado con los parámetros por defecto. Las proteínas con incluso mayor similitud a las secuencias de referencia mostrarán porcentajes de identidades crecientes cuando se evalúan mediante este método, tal como al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos75%, al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 95% de identidad de secuencia. Cuando se compara menos de la secuencia entera para la identidad de secuencia, las variantes típicamente poseerán al menos el 75% de identidad de secuencia sobre intervalos pequeños de 10-20 aminoácidos, y pueden poseer identidades de secuencia de al menos el 85% o al menos el 90% o el 95% dependiendo de su similitud a la secuencia de referencia. Se describen los métodos para determinar la identidad de secuencia en tales intervalos cortos en \underbar{http://www.nebi.nlm.nih.gov/BLAST/blast\_FAQs.html}. Las variantes de los polipéptidos dominios de MHC también mantienen la actividad biológica del polipéptido nativo. Para el propósito de esta invención, esa actividad se evalúa de forma conveniente mediante la incorporación del dominio variante en el polipéptido \beta1\alpha1 ó \alpha1\alpha2 apropiado y la determinación de la capacidad de polipéptido resultante de inhibir la proliferación de células T específicas de antígeno in vitro, como se describe en detalle posteriormente.

Secuencia enlazadora: una secuencia enlazadora es una secuencia de aminoácidos que une covalentemente dos dominios polipeptídicos. Las secuencias enlazadoras pueden estar incluidas en los polipéptidos de MHC recombinantes de la presente invención para proporcionar libertad rotacional a los dominios polipeptídicos unidos y de esta manera fomentar el plegamiento adecuado del dominio y los enlaces inter- e intra-dominio. A modo de ejemplo, en un polipéptido recombinante que comprende Ag-\beta1-\alpha1 (donde Ag = antígeno) se pueden proporcionar secuencias enlazadoras tanto entre los dominios Ag y \beta1 como entre los dominios \beta1 y \alpha1. Las secuencias enlazadoras, que en general tienen entre 2 y 25 aminoácidos de longitud, son bien conocidas en la técnica e incluyen el espaciador glicina(4)-serina (GGGGS x3) descrito por Chaudhary et al. (1989).

Los polipéptidos recombinantes \alpha1\alpha2 de MHC de clase I según la presente invención incluyen una unión covalente uniendo el extremo carboxi del dominio \alpha1 al extremo amino del dominio \alpha2. Los dominios \alpha1 y \alpha2 de las cadenas \alpha de MHC de clase I nativas están típicamente covalentemente unidas en esta orientación por una secuencias enlazadora de aminoácidos. Esta secuencia enlazadora nativa se puede mantener en las construcciones recombinantes; de forma alternativa, se puede introducir una secuencia enlazadora recombinante entre los dominios \alpha1 y \alpha2 (en lugar de o además de la secuencia enlazadora nativa).

Se pueden encontrar definiciones adicionales de términos normalmente usados en genética molecular en Benjamin Lewin, Genes V publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al., (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Las secciones siguientes proporcionan directrices detalladas para el diseño, expresión y usos de las moléculas de MHC recombinantes de la invención. A menos que se especifique de otra manera, se usan métodos estándar de biología molecular, bioquímica e inmunología en la presente invención a menos que se describa de otra manera. Tales métodos estándar se describen en Sambrook et al. (1989), Ausubel et al (1987), Innis et al. (1990) y Harlow y Lane (1988). Las siguientes patentes de EE.UU. que se refieren a formulaciones convencionales de moléculas de MHC y sus usos se incorporan aquí mediante referencia para proporcionar antecedentes adicionales e información técnica relevante para la presente invención: 5130297; 5194425; 5260422; 5284935; 5468481; 5595881; 5635363; 5734023.

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2. Diseño de moléculas recombinantes \beta1\alpha1 de MHC de clase II

Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de las cadenas \alpha y \beta de MHC de clase II de mamíferos, así como los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas, son bien conocidas en la técnica y están disponibles de numerosas fuentes incluyendo GenBank. Se proporcionan secuencias ejemplares en Auffray et al. (1984) (HLA DQ \alpha humana); Larhammar et al. (1983) (HLA DQ \beta humana); Das et al. (1983) (HLA DR \alpha humana); Tonnelle et al. (1985) (HLA DR \beta humana); Lawrance et al. (1985) (HLA DP \alpha humana); Kelly et al. (1985) (HLA DP \beta humana); Syha et al. (1989) (RT1.B \alpha de rata); Syha-Jedelhauser et al. (1991) (RT1.B \beta de rata); Benoist et al. (1983) (I-A \alpha de ratón); Estess et al. (1986) (I-A \beta de ratón).

Las moléculas recombinantes de MHC de clase II de la presente invención comprenden el dominio \beta1 de la cadena \beta de MHC de clase II unido covalentemente al dominio \alpha1 de la cadena \alpha de MHC de clase II. Los dominios \beta1 y \alpha1 están bien definidos en proteínas de MHC de clase II de mamíferos. Típicamente, se considera que el dominio \alpha1 comprende aproximadamente los residuos 1-90 de la cadena \alpha madura. La región enlazadora peptídica nativa entre los dominios \alpha1 y \alpha2 de la proteína de MHC de clase II se extiende desde alrededor del aminoácido 76 hasta alrededor del aminoácido 93 de la cadena \alpha, dependiendo de la cadena \alpha particular que se considere. De esta manera, un dominio \alpha1 puede incluir aproximadamente los residuos de aminoácidos 1-90 de la cadena \alpha, pero el experto en la materia reconocerá que el corte C-terminal de este dominio no está necesariamente definido con precisión, y, por ejemplo, podría darse en cualquier punto entre los residuos de aminoácidos 70-100 de la cadena \alpha. La composición del dominio \alpha1 también puede variar fuera de estos parámetros dependiendo de la especie de mamífero y de la cadena \alpha particular en cuestión. El experto en la materia apreciará que los parámetros numéricos precisos de la secuencia de aminoácidos son mucho menos importantes que el mantenimiento de la función del dominio.

De forma similar, el dominio \beta1 se considera típicamente que comprende aproximadamente los residuos 1-90 de la cadena \beta madura. La región enlazadora entre los dominios \beta1 y \beta2 de la proteína de MHC de clase II se expande desde alrededor del aminoácido 85 hasta alrededor del aminoácido 100 de la cadena \beta, dependiendo de la cadena \beta particular que se considere. De esta manera, la proteína \beta1 puede incluir aproximadamente los residuos de aminoácidos 1-100, pero el experto en la materia reconocerá de nuevo que el corte C-terminal de este dominio no está necesariamente definido con precisión, y, por ejemplo, podría suceder en cualquier punto entre los residuos de aminoácidos 75-105 de la cadena \beta. La composición del dominio \beta1 también puede variar fuera de estos parámetros dependiendo de la especie de mamífero y de la cadena \beta en cuestión. De nuevo, el experto en la materia apreciará que los parámetros numéricos precisos de la secuencia de aminoácidos son mucho menos importantes que el mantenimiento de la función del dominio. Moléculas \beta1\alpha1 ejemplares de seres humanos, rata y ratón se representan en la Fig. 10.

Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican estos dominios se pueden producir por medios estándares, tal como amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se pueden emplear aproximaciones estándar para diseñar los cebadores para amplificar los marcos abiertos de lectura que codifican estos dominios. Las genotecas adecuadas para la amplificación de estos dominios incluyen, por ejemplo, genotecas de ADNc preparadas de las especies de mamíferos en cuestión; tales genotecas están comercialmente disponibles, o se pueden preparar mediante métodos estándar. De esta manera, por ejemplo, se pueden producir construcciones que codifican los polipéptidos \beta1 y \alpha1 mediante PCR usando cuatro cebadores: cebadores B1 y B2 correspondientes a los extremos 5' y 3' de la región codificante de \beta1, y los cebadores A1 y A2 correspondientes a los extremos 5' y 3' de la región codificante de \alpha1. Tras la amplificación por PCR de las regiones codificantes de los dominios \alpha1 y \beta1, estas moléculas de ácidos nucleico amplificadas se puede clonar cada una en vectores de clonación estándar, o las moléculas se pueden ligar y después clonar en un vector adecuado. Para facilitar la clonación conveniente de las dos regiones codificantes, se pueden diseñar sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción en los cebadores de PCR. Por ejemplo, los cebadores B2 y A1 pueden incluir cada uno un sitio adecuado de modo que los fragmentos amplificados se liguen fácilmente tras la amplificación y digestión con la enzima de restricción seleccionada. Además, los cebadores B1 y A2 pueden incluir cada uno sitios de restricción para facilitar la clonación en el sitio de multiclonación del vector seleccionado. La ligación de las regiones codificante de los dos dominios se realiza de modo que las regiones codificantes estén operativamente unidas, es decir, para mantener el marco abierto de lectura. Donde las regiones codificantes amplificadas se clonan separadamente, los fragmentos se pueden liberar posteriormente del vector de clonación y purificar en gel, preparatorio para la ligación.

En ciertas formas de realización, se proporciona un enlazador peptídico entre los dominios \beta1 y \alpha1. Típicamente, este enlazador tiene entre 2 y 25 aminoácidos de longitud, y sirve para proporcionar flexibilidad entre los dominios de modo que cada dominio sea libre para plegarse en su conformación nativa. La secuencia enlazadora se puede proporcionar convenientemente diseñando los cebadores de PCR para que codifiquen la secuencia enlazadora. De esta manera, en el ejemplo descrito anteriormente, la secuencia enlazadora puede estar codificada por uno de los cebadores B2 o A1, o una combinación de cada uno de estos cebadores.

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3. Diseño de moléculas recombinantes \alpha1\alpha2 de MHC de clase I

Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de la cadena \alpha de MHC de clase I de mamíferos, así como los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas, son bien conocidos en la técnica y están disponibles de numerosas fuentes incluyendo GenBank. Se proporcionan secuencias ejemplares en Browning et al. (1995) (HLA-A humana); Kato et al. (1993) (HLA-B humana); Steinle et al. (1992) (HLA-C humana); Walter et al. (1995) (Ia de rata); Walter et al. (1994) (Ib de rata); Kress et al. (1983) (H-2-K de ratón); Schepart et al. (1986) (H-2-D de ratón); y Moore et al. (1982) (H-2-I de ratón).

Las moléculas recombinantes de MHC de clase I de la presente invención comprenden el dominio \alpha1 de la cadena \alpha de MHC de clase I unido covalentemente al dominio \alpha2 de la cadena \alpha de MHC de clase I. Estos dos dominios están bien definidos en las proteínas de MHC de clase I de mamíferos. Típicamente, se considera que el dominio \alpha1 comprende aproximadamente los residuos 1-90 de la cadena \alpha madura y que la cadena \alpha2 comprende aproximadamente los residuos de aminoácidos 90-180, aunque de nuevo, los puntos de corte no están definidos con precisión y variarán entre diferentes moléculas de MHC de clase I. Los límites entre los dominios \alpha2 y \alpha3 de la proteína de MHC de clase I típicamente se produce en la región de aminoácidos 179-183 de la cadena \alpha madura. La composición de los dominios \alpha1 y \alpha2 también puede variar fuera de estos parámetros dependiendo de la especie de mamífero y de la cadena \alpha particular en discusión. El experto en la materia apreciará que los parámetros numéricos precisos de la secuencia de aminoácidos son mucho menos importantes que el mantenimiento de la función del dominio. Se representa una molécula \alpha1\alpha2 ejemplar en la Fig. 11.

La construcción \alpha1\alpha2 se puede construir de forma más conveniente amplificando el marco de lectura que codifica la región del dominio dual (\alpha1 y \alpha2) entre los aminoácidos número 1 y los aminoácidos 179-183, aunque el experto en la materia apreciará que es posible alguna variación en estos puntos finales. Tal molécula incluye la región enlazadora nativa entre los dominios \alpha1 y \alpha2, pero si se desea esa región enlazadora se puede eliminar y cambiar con un péptido enlazador sintético. Las consideraciones generales para la amplificación y clonación de los dominios \alpha1 y \alpha2 de MHC de clase I se aplican como se ha discutido anteriormente en el contexto de los dominios \beta1 y \alpha1 de la clase II.

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4. Unión genética de un péptido antigénico a moléculas \beta1\alpha1 y \alpha1\alpha2

Las \beta1\alpha1 de clase II de la invención generalmente se usan junto con un péptido antigénico. Se puede usar para este fin cualquier péptido antigénico que se asocie convencionalmente con moléculas de MHC de clase II y que sea reconocido por una célula T. Se han caracterizado en detalle péptidos antigénicos de un número de fuentes, incluyendo péptidos antigénicos de alérgenos de veneno de abeja melífera, alérgenos de ácaros del polvo, toxinas producidas por bacterias (tal como la toxina del tétano) y antígenos de tejidos humanos implicados en enfermedades autoinmunes. Se presentan discusiones detalladas de tales péptidos en las patentes de EE.UU. Nos. 5595881, 5468481 y 5284935. Los péptidos ejemplares incluyen aquellos identificados en la patogénesis de la artritis reumatoide (colágeno de tipo II), miastenia grave (receptor de acetil colina) y esclerosis múltiple (proteína básica de mielina).

Como es bien sabido en la técnica (ver por ejemplo la patente de EE.UU. No. 5468481) la presentación de antígeno en complejos de MHC en la superficie de las CPA generalmente no implica un péptido antigénico completo. Más bien, un péptido localizado en el surco entre los dominios \beta1 y \alpha1 (en el caso de MHC II) o los dominios \alpha1 y \alpha2 (en el caso de MHC I) es típicamente un fragmento pequeño del péptido antigénico completo. Como se discute en Janeway & Travers (1997), los péptidos localizados en el surco peptídico de las moléculas de MHC de clase I están constreñidos por el tamaño del bolsillo de unión y típicamente tienen de 8-15 aminoácidos de longitud, más típicamente de 8-10 aminoácidos de longitud (pero ver Collins et al., 1994 para posibles excepciones). Por el contrario, los péptidos localizados en el surco peptídico de las moléculas de clase II no están constreñidos de esta manera y con frecuencia son más largos, típicamente al menos de 13 aminoácidos de longitud. Los fragmentos peptídicos para cargar en moléculas de MHC se pueden preparar por medios estándar, tal como el uso de máquinas de síntesis de péptidos sintéticos.

La molécula \beta1\alpha1 de la presente invención se puede "cargar" con antígeno peptídico en varias maneras, incluyendo por unión covalente del péptido a la molécula de MHC. Esto se puede realizar de forma conveniente uniendo operativamente una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido seleccionado al extremo 5' de la construcción que codifica la proteína de MHC de modo que, en el péptido expresado, el dominio de péptido antigénico está unido al N-terminal de \beta1 en el caso de moléculas \beta1\alpha1 y de \alpha1 en el caso de moléculas \alpha1\alpha2. Una manera conveniente de obtener este resultado es incorporar una secuencia que codifique el antígeno en los cebadores de PCR usados para amplificar las regiones codificantes de MHC. Típicamente, se incluirá una secuencia que codifica una secuencia de péptido enlazador entre las moléculas que codifican el péptido antigénico y el polipéptido MHC. Como se ha discutido anteriormente, el propósito de tales péptidos enlazadores es proporcionar flexibilidad y permitir el plegamiento conformacional adecuado de los péptidos. Para unir antígenos al polipéptido MHC, el enlazador debe ser suficientemente largo para permitir que el antígeno encaje en el surco peptídico del polipéptido MHC. De nuevo, este enlazador se puede incorporar de forma conveniente en los cebadores de PCR. Sin embargo, como se discute en el ejemplo 1 posteriormente, no es necesario que el péptido antigénico se ligue exactamente en el extremo 5' de la región codificante de MHC. Por ejemplo, la región codificante antigénica se puede insertar en los primeros pocos (típicamente en los primeros 10) codones del extremo 5' de la secuencia codificante de MHC.

Este sistema genético para la unión del péptido antigénico a la molécula de MHC es particularmente útil en el caso que se vayan a producir un número de moléculas de MHC con diferentes péptidos antigénicos. El sistema descrito permite la construcción de un vector de expresión en el que se incluye un sitio de restricción único en el extremo 5' de la región codificante de MHC (es decir, en el extremo 5' de \beta1 en el caso de construcciones que codifican \beta1\alpha1 y en el extremo 5' de \alpha1 en el caso de construcciones que codifican \alpha1\alpha2). Junto con tal construcción, se hace una genoteca de secuencias que codifican péptidos antigénicos, con cada región codificante de antígeno flanqueada por sitios para la enzima de restricción seleccionada. La inclusión de un antígeno particular en las moléculas de MHC se realiza después simplemente mediante (a) liberación de la región codificante del antígeno con la enzima de restricción seleccionada, (b) corte de la construcción de MHC con la misma enzima de restricción, y (c) ligación de la región codificante del antígeno en la construcción de MHC. De esta manera, se pueden hacer y expresar un gran número de construcciones MHC-polipéptido en un periodo de tiempo corto.

En la Fig. 1 se muestra un diseño de ejemplo de un casete de expresión que permite el intercambio sencillo de péptidos antigénicos en el contexto de una molécula \beta1\alpha1. La Fig. 1A muestra la secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula \beta1\alpha1 prototípica derivada de RT1.B de MHC de clase II de rata, sin la presencia del péptido antigénico. La posición del sitio de inserción para el péptido y el enlazador entre los residuos 5 y 6 (serina y prolina) del dominio \beta1 se indica mediante un símbolo \ding{116}. Para integrar la región codificante del antígeno, se emplea un cebador de PCR que comprende la secuencia mostrada en la Fig. 1B unido con bases adicionales de la construcción de la Fig. 1A 3' del sitio de inserción junto con un cebador de PCR que lee desde el extremo 3' de la construcción mostrada en la Fig. 1A. La amplificación da un producto que incluye la secuencia mostrada en la Fig. 1B integrada en la construcción \beta1\alpha1 (es decir, con las secuencias del péptido antigénico y el enlazador situadas entre los codones que codifican los residuos de aminoácidos 5 y 6 de la secuencia \beta1\alpha1). En el caso ilustrado, el péptido antigénico es el antígeno MBP-72-89.

Notablemente, la secuencia codificante de MBP-72-89 está flanqueado por sitios únicos de enzimas de restricción NcoI y SpeI. Se pueden usar estas enzimas para liberar la secuencia codificante de MBP-72-89 y cambiarla con regiones codificantes para otros antígenos, por ejemplo los ilustrados en las Figs. 1C y 1D.

La estructura del polipéptido \beta1\alpha1 expresado con el antígeno covalentemente unido se ilustra en la Fig. 2B; la Fig. 2A muestra la estructura secundaria de la molécula RT1B completa (incluyendo los dominios \alpha1, \alpha2, \beta1 y \beta2).

Los vectores de expresión de ácido nucleico que incluyen casetes de expresión diseñados como se ha explicado anteriormente serán particularmente útiles para fines de investigación. Tales vectores típicamente incluirán secuencias que codifican el polipéptido MHC de dominio dual (\beta1\alpha1 o \alpha1\alpha2) con un sitio de restricción único proporcionado hacia el extremo 5' de la región codificante de MHC, de modo que la región que codifica un polipéptido antigénico se pueda unir convenientemente. Tales vectores también incluirán típicamente un promotor operativamente unido al extremo 5' de la región codificante de MHC para proporcionar un nivel alto de expresión de las secuencias.

Las moléculas \beta1\alpha1 y \alpha1\alpha2 también se pueden expresar y purificar sin péptido unido (como se describe en la sección 5 a continuación), en cuyo caso se denominan como "vacías". Las moléculas de MHC vacías se pueden cargar después con el péptido seleccionado como se describe en la sección 6, posteriormente.

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5. Expresión y purificación de moléculas recombinantes \beta1\alpha1 y \alpha1\alpha2

En su forma más básica, los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos MHC de la invención comprenden regiones primera y segunda, que tienen una estructura A-B, en donde para las moléculas de clase II, A codifica el dominio \beta1 de clase II y B codifica el dominio \alpha1 de clase II. Donde se incluye una secuencia enlazadora, el ácido nucleico se puede representar como B-L2-A, en donde L2 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido enlazador. Donde un péptido antigénico está covalentemente unido al polipéptido MHC, la molécula de ácido nucleico que codifica este complejo se puede representar como P-B-A. Se puede proporcionar una segunda secuencia enlazadora entre la proteína antigénica y la región B del polipéptido, de modo que la secuencia codificante se representa como P-L2-B-L1-A. En todos los casos, las diferentes secuencias de ácido nucleico que comprende el polipéptido MHC (es decir, L1, L2, B, A y P) están operativamente unidas de modo que los elementos están situados en un marco de lectura único.

Las construcciones de ácido nucleico que expresan estos polipéptidos MHC también pueden incluir elementos reguladores tal como promotores (Pr), potenciadores y regiones reguladoras en 3', la selección de los cuales se determinará basada en el tipo de célula en la que se va a expresar la proteína. Cuando una secuencia promotora está operablemente unida al marco abierto de lectura, la secuencia se puede representar como Pr-B-A, o (si se incluye una región codificante de antígeno) Pr-P-B-A, en donde Pr representa la secuencia promotora. La secuencia promotora está operativamente unida a los componentes P ó B de estas secuencias, y las secuencias B-A o P-B-A comprenden un marco abierto de lectura único. Las construcciones se incluyen en un vector adecuado para expresar el polipéptido MHC en el tipo de célula seleccionada.

Se conocen numerosos sistemas procariotas y eucariotas para la expresión y purificación de polipéptidos. Por ejemplo, se pueden producir polipéptidos heterólogos en células procariotas colocando un promotor fuerte, regulado y un sitio de unión a ribosomas eficaz en 5' de la construcción que codifica el péptido. Las secuencias promotoras adecuadas incluyen los promotores de beta-lactamasa, triptófano (trp), fago T7 y lambda P_{L}. Los métodos y vectores plasmídicos para producir proteínas heterólogas en bacterias se describen en Sambrook et al. (1989). Las células procariotas adecuadas para la expresión de grandes cantidades de proteínas de fusión \beta_{2}m incluyen Escherichia coli y Bacillus subtilis. Con frecuencia, las proteínas expresadas a altos niveles se encuentran en cuerpos de inclusión insolubles; los métodos para extraer las proteínas de estos agregados se describen en Sambrook et al. (1989) (cap. 17). La expresión recombinante de polipéptido MHC en células procariotas se puede obtener de forma alternativa usando convenientemente sistemas comerciales diseñados para la expresión y purificación óptimas de proteínas de fusión. Tales proteínas de fusión típicamente incluyen una etiqueta proteica que facilita la purificación. Ejemplos de tales sistemas incluyen: el sistema de fusión y purificación de la proteína pMAL (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA); el sistema de fusión del gen GST (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ); y el sistema del vector de expresión pTrcHis (Invitrogen, Carlsbad, CA). Por ejemplo, el sistema de expresión pMAL utiliza un vector que añade una proteína de unión a maltosa a la proteína expresada. La proteína de fusión se expresa en E. coli y la proteína de fusión se purifica de un extracto celular crudo usando una columna de amilosa. Si es necesario, el dominio de la proteína de unión a maltosa se puede cortar de la proteína de fusión mediante tratamiento con una proteasa adecuada, tal como Factor Xa. El fragmento de unión a maltosa se puede eliminar después de la preparación pasando sobre una segunda columna de amilosa.

Los polipéptidos MHC también se pueden expresar en sistemas de expresión eucariotas, incluyendo Pichia pastoris, Drosophila, sistemas de expresión en baculovirus y Sindbis producidos por Invitrogen (Carlsbad, CA). También se pueden usar células eucariotas tales como de ovario de hámster chino (CHO), de riñón de mono (COS), HeLa, Spodoptera frugiperda, y Saccharomyces cerevisiae para expresar los polipéptidos MHC. Las regiones reguladoras adecuadas para su uso en estas células incluyen, para células de mamífero, promotores víricos tales como los de CMV, adenovirus y SV40, y para células de levadura, el promotor para la 3-fosfoglicerato quinasa y alcohol deshidrogenasa.

La transferencia de ADN a células eucariotas, en particular a células humanas o de otros mamíferos, es ahora una técnica convencional. Los vectores se introducen en las células receptoras como ADN puro (transfección) mediante, por ejemplo, precipitación con fosfato de calcio o fosfato de estroncio, electroporación, lipofección, DEAE dextrano, microinyección, fusión de protoplastos, o armas microproyectiles. De forma alternativa, las moléculas de ácido nucleico se pueden introducir mediante infección con vectores víricos. Se desarrollan sistemas que usan, por ejemplo, retrovirus, adenovirus o virus del herpes.

Se puede extraer un polipéptido MHC producido en células de mamífero tras la liberación de la proteína en el sobrenadante y se puede purificar usando una columna de inmunoafinidad preparada usando anticuerpos anti-MHC. De forma alternativa, el polipéptido MHC se puede expresar como una proteína quimérica con, por ejemplo, b-globina. Posteriormente se usa un anticuerpo contra la b-globina para purificar la proteína quimérica. Se usan después sitios de corte correspondientes a proteasas manipulados entre el gen de la b-globina y la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido MHC para separar los dos fragmentos polipeptídicos entre si después de la traducción. Un vector de expresión útil para generar proteínas quiméricas de b-globina es pSG5 (Stratagene, La Jolla, CA).

La expresión de los polipéptidos MHC en células procariotas producirá polipéptidos que no están glicosilados. La glicosilación de los polipéptidos en los sitios diana de glicosilación naturales se puede alcanzar mediante la expresión en sistemas de expresión eucariotas adecuados, tal como células mamífero.

La purificación de la proteína expresada generalmente se realiza en una solución básica (típicamente alrededor de pH 10) que contiene urea 6 M. El plegamiento de la proteína purificada se alcanza mediante diálisis frente a una solución tamponada a pH neutro (típicamente solución salina tamponada con fosfato (PBS) a alrededor de pH 7,4).

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6. Carga de antígeno de moléculas \beta1\alpha1 y \alpha1\alpha2 vacías

Donde las moléculas \beta1\alpha1 y \alpha1\alpha2 se expresan y purifican en una forma vacía (es decir, sin péptido antigénico unido), el péptido antigénico se puede cargar en las moléculas usando métodos estándar. Los métodos para cargar péptidos antigénicos en moléculas de MHC se describe en, por ejemplo, patente de EE.UU. No. 5468481. Tales métodos incluyen la simple co-incubación de la molécula de MHC purificada con una preparación purificada del antígeno.

A modo de ejemplo, se pueden cargar moléculas \beta1\alpha1 vacías (1 mg/ml; 40 uM) mediante incubación con un exceso molar de 10 veces de péptido (1 mg/ml; 400 uM) a temperatura ambiente, durante 24 horas. Después de eso, se puede eliminar el exceso de péptido no unido mediante diálisis frente a PBS a 4ºC durante 24 horas. Como se sabe en la técnica, se puede cuantificar la unión de péptido a \beta1\alpha1 mediante cromatografía de capa fina (TLC) en gel de sílice usando péptido radiomarcado. Basado en tal cuantificación, se puede modificar la carga (por ejemplo, cambiando el exceso molar de péptido o el tiempo de incubación) para obtener el resultado deseado.

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7. Otras consideraciones a. Variantes de secuencia

Mientras que la discusión anterior usa como ejemplos moléculas de MHC de clase I y clase II naturales y los diferentes dominios de estas moléculas, el experto en la materia apreciará que se pueden hacer y utilizar variantes de estas moléculas y dominios de la misma manera que se describe. De esta manera, la referencia aquí a un dominio de un polipéptido o molécula de MHC (por ejemplo, un dominio \beta1 de MHC de clase II) incluye tanto las formas naturales de la molécula referenciada, así como las moléculas que se basan en la secuencia de aminoácidos de la forma natural, pero que incluyen una o más variaciones de la secuencia de aminoácidos. Tales polipéptidos variantes también se pueden definir en el grado de identidad de la secuencia de aminoácidos que comparten con la molécula natural. Típicamente, las variantes de los dominios MHC compartirán al menos el 80% de identidad de secuencia con la secuencia del dominio de MHC natural. Las variantes más altamente conservadas compartirán al menos el 90% o al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia natural. Las variantes de los polipéptidos de dominios de MHC también retienen la actividad biológica del polipéptido natural. Para los fines de esta invención, esa actividad se evalúa de forma conveniente incorporando el dominio variante en el polipéptido \beta1\alpha1 o \alpha1\alpha2 apropiado y determinando la capacidad del polipéptido resultante de inhibir la proliferación in vitro de células T específicas de antígeno, como se describe en detalle posteriormente.

Los polipéptidos variantes del dominio MHC incluyen proteínas que se diferencian en la secuencia de aminoácidos de las secuencia de polipéptidos de MHC naturales pero que retienen la actividad biológica especificada. Tales proteínas se pueden producir manipulando la secuencia de nucleótidos de la molécula que codifica el dominio, por ejemplos por mutagénesis dirigida o la reacción en cadena de la polimerasa. Las modificaciones más sencillas implican la sustitución de uno o más aminoácidos por aminoácidos que tienen propiedades bioquímicas similares. Estas sustituciones denominadas conservadoras es más probable que tengan un impacto mínimo sobre la actividad de la proteína resultante. La Tabla 1 muestra aminoácidos que se pueden sustituir por un aminoácido original en una proteína y que se consideran como sustituciones conservadoras.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

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Se pueden obtener cambios más sustanciales en la función biológica u otras características seleccionando sustituciones que son menos conservadoras que las de la Tabla 1, es decir, seleccionando residuos que se diferencian más significativamente en su efecto en mantener (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo como una conformación en lámina o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que en general se espera que produzcan los mayores cambios en las propiedades de la proteína serán aquellos en las que (a) un residuo hidrofílico, por ejemplo, seril o treonil, se sustituye por (o mediante) un residuo hidrofóbico, por ejemplo, leucil, isoleucil, fenilalanil, valil o alanil; (b) una cisteína o prolina se sustituye por (o mediante) cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisil, arginil, o histadil, se sustituye por (o mediante) un residuo electronegativo, por ejemplo glutamil o aspartil, o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye por (o mediante) uno que no tiene cadena lateral, por ejemplo, glicina. Los efectos de estas sustituciones o deleciones o adiciones de aminoácidos se pueden evaluar por medio del uso del ensayo de proliferación de células T
descrito.

A nivel de ácido nucleico, el experto en la materia apreciará que se pueden emplear las secuencias naturales de ácido nucleico que codifican los dominios de MHC de clase I y clase II en vectores de expresión, pero que la invención no está limitada a tales secuencias. Se puede emplear cualquier secuencia que codifica un dominio MHC funcional, y se puede adaptar la secuencia de ácido nucleico para ajustarse con la utilización de codón propenso del organismo en el que se va a expresar la secuencia.

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b. Incorporación de marcadores detectables

Para ciertas aplicaciones in vivo e in vitro, las moléculas de MHC de la presente invención se pueden conjugar con un marcador detectable. Se conocen un amplio espectro de marcadores detectables, incluyendo radionúclidos (por ejemplo, fuentes emisoras de gamma tal como indio-111), isótopos paramagnéticos, marcadores fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína), enzimas (tal como fosfatasa alcalina), cofactores, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes. La unión de tales marcadores a los polipéptidos de MHC se puede alcanzar usando métodos estándar. La patente de EE.UU. No. 5734023 contiene una discusión extensa del marcaje derivados de polipéptidos de MHC usando tales marcadores. En el caso de que el marcador detectable se una covalentemente a la molécula de MHC en una manera dirigida (es decir, más que estar unida al azar) generalmente se unirá al extremo C de la molécula para minimizar la interferencia con un antígeno peptídico unido al extremo N.

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c. Conjugación de grupos tóxicos

Para ciertos usos de los polipéptidos de MHC divulgados, particularmente aplicaciones terapéuticas in vivo cuyo fin es eliminar ciertas poblaciones de células T, los polipéptidos se pueden conjugar con un grupo tóxico. Se conocen numerosos grupos tóxicos adecuados para interrumpir la función de la célula T, incluyendo toxinas proteicas, agentes quimioterapéuticos, anticuerpos contra moléculas de superficie de célula T citotóxica, lipasas, y radioisótopos que emiten radiación "dura" por ejemplo, beta. Los ejemplos de tales toxinas y métodos de conjugar toxinas a moléculas de MHC se describen en la patente de EE.UU. No. 5284935. Las toxinas proteicas incluyen ricina, toxina de la difteria y de Pseudomonas. Los agentes quimioterapéuticos incluyen doxorubicina, daunorubicina, metotrexato, citotoxina, y ARN antisentido. También se pueden usar radioisótopos tales como itrio-90, fósforo-32, plomo-212, yodo-131 o paladio-109. En el caso de que el grupo tóxico se vaya a unir covalentemente a la molécula de MHC de una manera dirigida (es decir, más que estar unida al azar) generalmente se unirá al extremo C de la molécula para minimizar la interferencia con un antígeno peptídico unido al extremo N.

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d. Formulaciones farmacéuticas

Para la administración a animales, los polipéptidos MHC de la presente invención generalmente se combinan con un soporte farmacéuticamente aceptable. En general, la naturaleza del soporte dependerá del modo particular de administración que se emplea. Por ejemplo, las formulaciones parenterales normalmente comprenden líquidos inyectables que incluyen líquidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tal como agua, solución salina fisiológica, soluciones equilibradas de sales, dextrosa acuosa, glicerol o similar como vehículos. Para composiciones sólidas (por ejemplo, formas en polvo, píldora, comprimido o cápsula), los soportes sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, o estearato de magnesio. Además de los soportes biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas a ser administradas pueden contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares no tóxicas, tal como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes, y agentes amortiguadores del pH y similares, por ejemplo acetato de sodio o monolaurato de sorbitano.

Como se sabe en la técnica, los productos farmacéuticos basados en proteínas pueden ser distribuidos sólo ineficazmente mediante ingestión. Sin embargo, las formas basadas en píldoras de proteínas farmacéuticas se pueden administrar alternativamente por vía subcutánea, particularmente si se formulan en una composición de liberación lenta. Las formulaciones de liberación lenta se pueden producir combinando la proteína diana con una matriz biocompatible, tal como colesterol. Otro método posible de administración productos farmacéuticos proteicos es mediante el uso de minibombas osmóticas. Como se ha establecido anteriormente también se usaría un soporte biocompatible junto con este método de distribución. Posibles métodos adicionales de distribución incluyen distribución pulmonar profunda mediante inhalación (Edwards et al., 1997; Service, 1997) y distribución transdérmica (Mitragotri et al., 1996).

También se contempla que los polipéptidos de MHC de la presente invención se podrían distribuir en forma de ácido nucleico y posteriormente traducir por célula huésped. Esto se podría hacer, por ejemplo, mediante el uso de vectores víricos o liposomas. Los liposomas también se podrían usar para la administración directa de los polipéptidos.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar por cualquier medio que alcance su fin deseado. Las cantidades y pautas para la administración de los polipéptidos de MHC seleccionados las determinará el médico. Las dosis eficaces para la aplicación terapéutica variarán dependiendo de la naturaleza y gravedad de la afección a ser tratada, el polipéptido de MHC particular seleccionado, la edad y estado del paciente y otros factores clínicos. Típicamente, el intervalo de dosis será desde alrededor de 0,1 ug/kg de peso corporal hasta alrededor de 100 mg/kg de peso corporal. Otros intervalos adecuados incluyen dosis desde alrededor de 100 ug/kg a 1 mg/kg de peso corporal. El programa de dosis puede variar desde una vez a la semana a diario dependiendo de un número de factores clínicos, tal como la sensibilidad del sujeto a la proteína. Ejemplos de programas de dosis son 3 ug/kg administrados dos veces por semana, tres veces por semana o a diario; una dosis de 7 ug/kg dos veces por semana, tres veces por semana o a diario; una dosis de 10 ug/kg dos veces por semana, tres veces por semana o a diario; o una dosis de 30 ug/kg dos veces por semana, tres veces por semana o a diario.

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8. Aplicaciones ejemplares de moléculas \beta1\alpha1 y \alpha1\alpha2 recombinantes

Los polipéptidos \beta1\alpha1 de clase II de la presente invención son útiles para un amplio rango de aplicaciones in vitro e in vivo. En efecto, como resultado de las actividades biológicas de estos polipéptidos, se pueden usar en numerosas aplicaciones en lugar de moléculas de MHC purificadas o de células presentadoras de antígeno que expresan moléculas de MHC.

Las aplicaciones in vitro de los polipéptidos divulgados incluyen la detección, cuantificación y purificación de células T específicas de antígeno. Los métodos para usar varias formas de complejos derivados de MHC para estos fines son bien conocidos y se describen en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos. 5635363 y 5595881. Para tales aplicaciones, los polipéptidos divulgados pueden estar libres en solución o pueden estar unidos a un soporte sólido tal como la superficie de una placa de plástico, una placa de microtitulación, una membrana o bolas. Típicamente, tales superficies son plástico, nailon o nitrocelulosa. Los polipéptidos en solución libre son útiles para aplicaciones tales como separación celular activada por fluorescencia (FACS). Para la detección o cuantificación de células T específicas de antígeno, los polipéptidos se marcan preferiblemente con un marcador detectable, tal como un marcador de fluorescencia.

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Las células T a ser detectadas, cuantificadas o manipuladas de otra manera generalmente están presentes en una muestra biológica tomada de un paciente. La muestra biológica típicamente es sangre o linfa, pero también pueden ser muestras de tejidos tal como ganglios linfáticos, tumores, articulaciones, etc. Se apreciará que los detalles precisos del método usado para manipular las células T en la muestra dependerán del tipo de manipulación a ser realizada y la forma física tanto de la muestra biológica como de las moléculas de MHC. Sin embargo, en términos generales, se añade el complejo \beta1\alpha1/péptido a la muestra biológica, y la mezcla se incuba tiempo suficiente (por ejemplo, desde alrededor de 5 minutos hasta varias horas) para permitir la unión. La detección y cuantificación de células T unidas al complejo MHC/péptido se puede realizar mediante un número de métodos incluyendo, en el caso de que el MHC/péptido incluya un marcador fluorescente, microscopia de fluorescencia y FACS. También se pueden usar inmunoensayos estándar tal como ELISA y RIA para cuantificar los complejos células T-MHC/péptido donde los complejos MHC/péptido están unidos a un soporte sólido. La cuantificación de las poblaciones de células T específicas de antígeno será especialmente útil en el seguimiento del curso de una enfermedad. Por ejemplo, en un paciente de esclerosis múltiple, se puede seguir la eficacia de una terapia administrada para reducir el número de células T que reaccionan con MBP usando complejos MHC/antígeno MBP para cuantificar el número de tales células T presentes en el paciente. De forma similar, se puede cuantificar y seguir el número de células T antitumorales en un paciente de cáncer durante el curso de una terapia usando complejos MHC/antígeno tumoral.

También se puede usar FACS para separar complejos células T-MHC/péptido de la muestra biológica, que puede ser particularmente útil en el caso de que se vaya a eliminar una población especificada de células T específicas de antígeno de la muestra, tal como para fines de enriquecimiento. Donde el complejo MHC/péptido está unido a bolas magnéticas, la población de células T que se une se puede purificar como se describe en Miltenyi et al. (1990). A modo de ejemplo, se pueden purificar células T antitumorales en la sangre de un paciente de cáncer usando estos métodos, expandir in vitro y devolver al paciente como parte de un tratamiento de inmunoterapia adoptiva.

Se puede anergizar una población especificada de células T específicas de antígeno en la muestra biológica mediante incubación de la muestra con complejos MHC/péptido que contienen el péptido reconocido por las células T diana. De esta manera, cuando estos complejos se unen al TCR en ausencia de otras moléculas coestimuladoras, se induce un estado de anergia en la célula T. Tal planteamiento es útil en situaciones donde la población de células T diana reconoce un autoantígeno, tal como en varias enfermedades autoinmunes. De forma alternativa, la población de células T diana puede ser aniquilada directamente mediante incubación de la muestra biológica con un complejo MHC/péptido conjugado con un grupo tóxico.

Las células T también se pueden activar de manera específica de antígeno por los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, los polipéptidos de MHC divulgados cargados con un antígeno especificado se pueden adherir a alta densidad a una superficie sólida, tal como una placa de plástico o una bola magnética. La exposición de las células T a los polipéptidos sobre la superficie sólida puede estimular y activar las células T en una manera específica de antígeno, a pesar de la ausencia de moléculas coestimuladoras. Esto es probablemente atribuible a números suficientes de TCR en una célula T que se une a los complejos MHC/péptido de modo que la coestimulación es innecesaria para la activación.

Las aplicaciones in vivo de los polipéptidos divulgados incluyen la mejora de afecciones mediadas por células T específicas de antígeno. Tales afecciones incluyen alergias, rechazo a trasplante y enfermedades autoinmunes incluyendo esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico y diabetes melitus dependiente de insulina. Otros investigadores han descrito varias formas de polipéptidos de MHC que se pueden usar para tratar estas afecciones y los métodos usados en esos sistemas son igualmente útiles con los polipéptidos de MHC de la presente invención. Las metodologías ejemplares se describen en las patentes de EE.UU. Nos. 5130297, 5284935, 5468481, 5734023 y 5194425. A modo de ejemplo, los complejos MHC/péptido se pueden administrar a pacientes para inducir anergia en poblaciones de células T auto-reactivas, o estas poblaciones de células T se pueden tratar mediante administración de complejos MHC/péptido conjugados con un grupo tóxico. Las moléculas divulgadas también se pueden usar para reforzar respuestas inmunes en ciertas afecciones tales como cáncer y enfermedades infecciosas.

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran ciertos aspectos de la invención.

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Ejemplo 1 Clonación, expresión y plegamiento in vitro de moléculas \beta1\alpha1

Se produjo una construcción de ácido nucleico prototipo que codificaba una cadena polipeptídica única con el extremo amino del dominio \alpha1 de MHC de clase II genéticamente unido al extremo carboxi del dominio \beta1 de MHC de clase II. La secuencia de esta construcción prototípica, hecha a partir de los ADNc de las cadenas \alpha y \beta de RT1B de rata se muestra en la Fig. 1A (Seq. I.D. No. 1).

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Los ADNc que codifican los dominios \alpha1 y \beta1 de RT1B se prepararon mediante amplificación por PCR de las secuencias codificantes clonadas de los ADNc de las cadenas \alpha y \beta de RT1B (\alpha6 y \beta118, respectivamente) obtenidas del Dr. Konrad Reske, Maguncia, RFA (Syha et al., 1989; Syha-Jedelhauser et al., 1991). Los cebadores usados para generar \beta1 fueron 5'-AATTCCTCGAGATGGCTCTGCAGACCCC-3' (cebador XhoI 5') (Seq. I.D. No. 9); 5'-TCTTGACCTCCAAGCCGCCGCAGGGAGGTG-3' (cebador de ligación 3') (Seq. I.D. No. 10). Los cebadores usados para generar \alpha1 fueron 5'-CGGCGGCTTGGAGGTCAAGACGACATTGAGG-3' (cebador de ligación 5') (Seq. I.D. No. 11); 5'-GCCTCGGTACCTTAGTTGACAGCTTGGGTTGAATTTG-3' (cebador KpnI 3') (Seq. I.D. No. 12). Los cebadores adicionales usados fueron 5'-CAGGGACCATGGGCAGAGACTCCCCA-3' (cebador NcoI 5') (Seq. I.D. No. 13); y 5'-GCCTCCTCGAGTTAGTTGACAGCTTGGGTT-3' (cebador XhoI 3') (Seq. I.D. No. 14). El paso uno implicó la producción de los ADNc que codifican los dominios \beta1 y \alpha1. La PCR se realizó con Taq polimerasa (Promega, Madison, WI) durante 28 ciclos de desnaturalización a 94,5ºC durante 20 segundos, alineamiento a 55ºC durante 1,5 minutos y extensión a 72ºC durante 1,5 minutos, usando \beta118 como molde y el cebador XhoI 5' y el cebador de ligación 3' como cebadores y el ADNc \alpha6 como molde y el cebador de ligación 5' y el cebador KpnI 3'. Los productos de PCR se aislaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se purificaron usando Gene-Clean (Bio 101, Inc., La Jolla, CA).

En el paso dos, estos productos se mezclaron sin cebadores adicionales y se desnaturalizaron por calor a 94,5ºC durante 5 minutos seguido por 2 ciclos de desnaturalización a 94,5ºC durante 1 minuto, alineamiento a 60ºC durante 2 minutos y extensión a 72ºC durante 5 minutos. En el paso tres, el producto alineado, extendido se desnaturalizó por calor a 94,5ºC durante 5 minutos y se sometió a 26 ciclos de desnaturalización a 94,5ºC durante 20 segundos, alineamiento a 60ºC durante 1 minuto y extensión a 72ºC durante 1 minuto, en presencia del cebador XhoI 5' y del cebador KpnI 3'. El producto final de PCR se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa y Gene-Clean. Esto produjo un ADNc de 656 pares de base que codifica la molécula \beta1\alpha1. El ADNc que codifica la molécula \beta1\alpha1 se trasladó al vector de clonación pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando el kit de Invitrogen TA Cloning®. El ADNc en pCR2.1 se usó como molde y se realizó una PCR durante 28 ciclos desnaturalización a 94,5ºC durante 20 segundos, alineamiento a 55ºC durante 1,5 minutos y extensión a 72ºC durante 1,5 minutos, usando el cebador NcoI 5' y el cebador XhoI 3'. Los productos de PCR se cortaron con las enzimas de restricción relevantes y se clonaron direccionalmente en pET21d+ (Novagen, Madison, WI; Studier et al., 1990). Las construcciones se confirmaron mediante secuenciación de ADN. La molécula \beta1\alpha1 usada en estos estudios se diferencia del salvaje en que contiene una sustitución de aminoácidos Q12R en el dominio beta-1.

Para la inserción del módulo péptido/enlazador (mostrado en la Fig. 1A), se usó el siguiente planteamiento. Se amplificó el módulo péptido/enlazador de 210 bp usando el cebador XhoI 5' y un cebador de secuencia 5'-GAAATCCCGCGGGGAGCCTCCACCTCCA-GAGCCTCGGGGCACTAGTGAGCCTCCACCTCCGAAGTGCA
CCACTGGGTTCTCATCCTGAGTCCTCTGGCTCTTCTGTGGGGAGTCTCTGCCCTCAGTCC-3' (cebador de ligación 3'-MBP-72-89/enlazador) (Seq. I.D. No. 15) y el ADNc de longitud completa original \beta118 como molde. Se generó un ADNc de 559 bp con un sobresaliente en 5' para el alineamiento al módulo péptido/enlazador usando un cebador: 5'-GCTCCCCGCGGGATTTCGTGTACCAGTTCAA-3' (cebador de ligación péptido/enlazador 5') (Seq. I.D. No. 16); y el cavador KpnI 3' y el ADNc de 656 bp de \beta1\alpha1 como molde de amplificación. El alineamiento y extensión de los dos ADNc produjo la construcción de 750 bp \beta1\alpha1 de longitud completa/MBP-72-89. Se hicieron modificaciones en los extremos 5' y 3' de los ADNc \beta1\alpha1 y \beta1\alpha1/MBP-72-89 para la subclonación en pET21d+ (Novagen, Madison, WI; Studier et al., 1990) usando el cebador NcoI 5' y XhoI 3'. Los cebadores usados para generar el módulo MBP-55-69/enlazador fueron 5'-TATTACCATGGGCAGAGACTCCTCCGGCAAGGATTCGCAT
CATGCGGCGCGGACGACCCACTACGGTGGAGGTGGAGGCTCACTAGTGCCCC-3' (cebador MBP-55-69 5') (Seq. I.D. No. 17) y 5'-GGGGCACTAGTGAGCCTCCACCTCCACCGTAGTGGGT CGTCCGCGCCGCATGATGC
GAATCCTTGCCGGAGGAGTCTCTGCCCATGGTAATA-3' (cebador MBP-55-69 3') (Seq. I.D. No. 18). Estos se purificaron por gel, se alinearon y después se cortaron con NcoI y XhoI para la ligación en \beta1\alpha1/MBP-72-89 digerido con NcoI y XhoI, para producir un plásmido que codifica la construcción covalente \beta1\alpha1/MBP-55-69. Los cebadores usados para generar un módulo MBP-72-89 de cobaya/enlazador fueron 5'-TATTACCATGGGCAGAGACTCCCCA
CAGAAGAGCCAGAGGTCTCAGGATGAGAACCCAGTGGTGCACTTCGGAGGTGGAGGCTCACTAGTGCCC
C-3' (cebador Gp-MBP-72-89 5') (Seq. I.D. No. 28) y 5'-GGGGCACTAGTGAGCCTCCACCTCCGAAGTGCAC
CACTGGGTTCTCATCCTGAGACCTCTGGCTCTTCTGTGGGGAGTCTCTGCCCATGGTAAT-3' (cebador Gp-
MBP-72-89 3') (Seq. I.D. No. 29). Estos se purificaron por gel, se alinearon y después se cortaron con NcoI y XhoI para la ligación en \beta1\alpha1/MBP-72-89 digerido con NcoI y XhoI, para producir un plásmido que codifica la construcción covalente \beta1\alpha1/Gp-MBP-72-89. Los cebadores usados para generar el módulo CM-2/enlazador fueron 5'-TATTAC
CATGGGCAGAGACTCCAAACTGGAACTGCAGTCCGCTCTGGAAGAAGCTGAAGCTTCCCTGGAACACGG
AGGTGGAGGCTCACTAGTGCCCC-3' (cebador CM-2 5') (Seq. I.D. No. 19) y 5'-GGGGCACTAGTGAGCCTC
CACCTCCGTGTTCCAGGGAAGCTTCAGCTTCTTCCAGAGCGGACTGCAGTTCCAGTTTGGAGTCTCTGCC
CATGGTAATA-3' (cebador CM-2 3') (Seq. I.D. No. 20). Estos se purificaron por gel, se alinearon y después se cortaron con NcoI y XhoI para la ligación en \beta1\alpha1/MBP-72-89 digerido con NcoI y XhoI, para producir un plásmido que codifica la construcción covalente \beta1\alpha1/CM-2.

Se ensayó la expresión de proteína en un número de cepas diferentes de E. coli, incluyendo un mutante de tiorredoxina reductasa que permite la formación de puentes disulfuro en el citoplasma (Derman et al., 1993). Con tal molécula tan pequeña, se hizo evidente que el mayor rendimiento de material se podría obtener fácilmente de los cuerpos de inclusión, replegando la proteína tras la solubilización y purificación en tampones que contenían urea 6 M. Según esto, se transformaron células de la cepa BL21(DE3) de E. coli con la construcción pET21d+ que contenía la secuencia codificante de \beta1\alpha1. Se hicieron crecer las bacterias en cultivos de un litro hasta la fase semi-logarítmica (DO_{600} = 0,6-0,8) en medio Luria-Bertani (LB) que contenía carbenicilina (50 \mug/ml) a 37ºC. Se indujo la producción de la proteína recombinante mediante adición de isopropil-\beta-D-tiogalactósido (ITPG) 0,5 mM. Después de incubar durante 3 horas, las células se centrifugaron y se almacenaron a -80ºC antes del procesamiento. Todas las manipulaciones posteriores de las células fueron a 4ºC. Los precipitados celulares se resuspendieron en PBS helado, pH 7,4, y se sonicaron durante 4 x 20 segundos con la suspensión celular enfriada en un baño de sal/hielo/agua. La suspensión celular se centrifugó después, la fracción del sobrenadante se descartó, el pellet celular se resuspendió y se lavó tres veces en PBS y después se resuspendió en etanolamina 20 mM/urea 6 M, pH 10, durante cuatro horas. Después de la centrifugación, el sobrenadante que contenía la proteína recombinante solubilizada de interés se recogió y almacenó a 4ºC hasta la purificación. La construcción recombinante \beta1\alpha1 se purificó y concentró mediante cromatografía de intercambio iónico de FPLC usando el medio de intercambio aniónico Source 30Q (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) en una columna XK26/20 (Pharmacia Biotech), usando un gradiente en pasos con etanolamina 20 mM/urea 6 M/NaCl 1 M, pH 10. Se recogió el pico homogéneo del tamaño apropiado, se dializó extensamente frente a PBS a 4ºC, pH 7,4, y se concentró mediante ultrafiltración por centrifugación con membranas Centricon-10 (Amicon, Beverly, MA). El paso de diálisis, que eliminó la urea de la preparación de proteína y redujo el pH final, produjo replegamiento espontáneo de la proteína expresada. Para la purificación a homogeneidad, un paso de finalización usó cromatografía de exclusión en medio Superdex 75 (Pharmacia Biotech) en una columna HR16/50 (Pharmacia Biotech). El rendimiento final de proteína purificada varió entre 15 y 30 mg/L de cultivo bacteriano.

Se demostró la integridad conformacional de las moléculas mediante la presencia de un puente disulfuro entre las cisteínas \beta15 y \beta79 detectado en un ensayo de desplazamiento en gel, y la autenticidad de la proteína purificada se verificó usando el anticuerpo monoclonal OX-6 específico para RT1B mediante inmunotransferencia (datos no mostrados). El dicroísmo circular (DC) revela que las moléculas \beta1\alpha1 tienen estructuras secundarias muy ordenadas. La molécula \beta1\alpha1 vacía contiene aproximadamente un 30% de hélice alfa, un 15% de lámina beta, un 26% de giro beta, y un 29% de estructuras helicoidales aleatorias. La comparación con las estructuras secundarias de las moléculas de clase II determinada mediante cristalografía de rayos X proporciona evidencia fuerte que las moléculas \beta1\alpha1 comparten la estructura secundaria plataforma de lámina beta/hélice alfa antiparalela común a todos los dominios de unión a antígeno de clase II. Además, la desnaturalización térmica reveló un alto grado de cooperatividad y estabilidad de las moléculas (datos no mostrados).

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Ejemplo 2 Las moléculas \beta1\alpha1 se unen a linfocitos T de forma específica de antígeno

La molécula \beta1\alpha1 producida como se ha descrito anteriormente se ensayó para la eficacia (especificidad de unión a células T) usando el sistema de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). EAE es una enfermedad paralizante, inflamatoria, y algunas veces desmielinizante mediada por células T CD4+ específicas para componentes de mielina del sistema nervioso central incluyendo la proteína básica de mielina (MBP). EAE comparte anormalidades inmunológicas similares con la enfermedad desmielinizante humana EM (Paterson, 1981) y ha sido un modelo útil para ensayar terapias preclínicas para la enfermedad humana (Weiner et al. 1993; Vandenbark et al., 1989; Howell et al., 1989; Oksenberg et al., 1993; Yednock et al, 1992; Jameson et al., 1994; Vandenbark et al., 1994). En ratas Lewis, el epítopo encefalitogénico dominante de MBP reside en el péptido 72-89 (Bourdette et al., 1991). El inicio de los signos clínicos de EAE sucede en el día 10-11, y la enfermedad dura de cuatro a ocho días. La mayoría de los linfocitos T invasores se localizan en el SNC durante este periodo.

Materiales y métodos

Se sintetizaron péptidos de prueba y control para cargar en la molécula \beta1\alpha1 purificada como sigue: se prepararon péptido Gp-MBP-69-89 (GSLPQKSQRSQDENPVVHF) (Seq. I.D. No. 25), péptido MBP-69-89 de rata (GSLPQKSQRTQDENPVVHF) (Seq. I.D. No. 30), péptido Gp-MBP-55-69 (SGKDSHHAARTTHYG) (Seq. I.D. No. 26), y péptido de miosina cardiaca CM-2 (KLELQSALEEAEASLEH) (Seq. I.D. No. 27) (Wegmann et al., 1994) mediante técnicas de fase sólida (Hashim et al., 1986). Los péptidos Gp-MBP se numeran según la secuencia de MBP bovina (Vandenbark et al., 1994; Martenson, 1984). Los péptidos se cargaron en \beta1\alpha1 a un relación molar 1:10 proteína:péptido, mezclando a temperatura ambiente durante 24 horas, después de lo cual todas las manipulaciones posteriores se realizaron a 4ºC. Se eliminó el péptido libre mediante diálisis o ultrafiltración por centrifugación con membranas Centricon-10, haciendo diluciones en serie y concentrando la solución hasta que la concentración del péptido libre fue menor de 2 \muM.

Se prepararon las líneas de células T y el hibridoma A1 como sigue: Se seleccionaron líneas de linfocitos T a corto plazo con péptido MBP-69-89 de células de ganglios linfáticos de ratas no sometidas a experimentación o de ratas inmunizadas 12 días antes con Gp-MBP/ACF como se describe en Vandenbark et al., (1985). El hibridoma de células T de rata V\beta8.2+ C14/BW12-12A1 (A1) usado en este estudio se ha descrito previamente por Burrows et al., 1996. Brevemente, el hibridoma A1 se creó fusionando un clon de células T encefalitogénico LEW(RT1^{1}) específico para Gp-BP-72-89 (White et al., 1989; Gold et al, 1991) con un timoma negativo para TCR (\alpha/\beta), BW5147 (Golding et al., 1985). Los pocillos positivos para el crecimiento celular se ensayaron para la producción de IL-2 tras la estimulación con antígeno en presencia de CPA (timocitos de rata Lewis irradiadas) y después se subclonaron a dilución limitante. El hibridoma A1 secreta IL-2 cuando se estimula en presencia de APC con Gp-BP entero o péptido Gp-BP-69-89, que contiene el epítopo mínimo, MBP-72-89.

Se realizó un análisis de inmunofluorescencia de dos colores en un instrumento FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA), usando el software CellQuest^{TM}. Se definieron cuadrantes usando isotipos no relevantes que coincidían con los anticuerpos controles. Se incubaron moléculas \beta1\alpha1 con y sin péptido cargado con el hibridoma A1 (\beta1\alpha1/péptido 10 \muM) durante 17 horas, a 4ºC, se lavaron tres veces, se tiñeron con anticuerpos conjugados con el fluorocromo (FITC o PE) específicos para clase II de rata (OX-6-PE), y TCR V\beta8.2 (PharMingen, San Diego, CA) durante 15 minutos a temperatura ambiente, y se analizaron mediante citometría de flujo. La línea celular CM-2 se bloqueó durante una hora con OX6 no conjugado, se lavó y después se trató como el hibridoma A1. El medio de tinción fue PBS, suero bovino fetal al 2%, azida al 0,01%.

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Resultados

Se evaluó la unión específica de epítopo cargando la molécula \beta1\alpha1 con varios péptidos e incubando los complejos \beta1\alpha1/péptido con el hibridoma A1 que reconoce el péptido MBP-72-89 (Burrows et al., 1997), o con la línea celular específica de miosina cardiaca CM-2. Como se muestra en la Fig. 3A, la construcción \beta1\alpha1 cargada con el péptido MBP-69-89 (\beta1\alpha1/MBP-69-89) se unió específicamente al hibridoma A1, con una intensidad media de fluorescencia (IMF) de 0,8 x 10^{3} unidades, mientras que la construcción \beta1\alpha1 cargada con el péptido CM-2 (\beta1\alpha1/CM-2) no tiñó el hibridoma. Por el contrario, \beta1\alpha1/CM-2 se unió específicamente a la línea CM-2, con una IMF de 1,8 x 10^{3} unidades, mientras que el complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89 no tiñó la línea CM-2 (Fig. 3B). La construcción \beta1\alpha1 sin péptido exógenamente cargado no se une ni al hibridoma A1 (Fig. 3A) ni a la línea CM-2 (datos no mostrados). De esta manera, el epítopo unido dirigió la unión específica del complejo \beta1\alpha1/péptido.

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Ejemplo 3 Moléculas \beta1\alpha1 conjugadas con un marcador fluorescente

Para evitar el uso de un anticuerpo secundario para visualizar la interacción de moléculas \beta1\alpha1/péptido con TCR (tal como OX-6, usado anteriormente), se produjo una molécula \beta1\alpha1 directamente conjugada con un cromóforo. El colorante Alexa-488^{TM} (A488; Molecular Probes, Eugene, OR) tiene un espectro similar a fluoresceína, pero produce conjugados proteicos que son más brillantes y más fotoestables que los conjugados de fluoresceína. Como se muestra en la Fig. 4, \beta1\alpha1 conjugada con A488 (relación molar colorante/proteína = 1), cuando se cargó con MBP-69-89, se unió al hibridoma A1 (MCI = 300 unidades), mientras que la \beta1\alpha1 vacía no lo hizo.

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Ejemplo 4 Las moléculas \beta1\alpha1 inhiben la proliferación de células T específicas de epítopo in vitro

Se realizaron ensayos de proliferación de células T para evaluar el efecto de las construcciones sobre la activación de células T.

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Materiales y métodos

Los ensayos de proliferación se realizaron en placas de 96 pocillos como se ha descrito previamente (Vandenbark et al., 1985). Brevemente, se incubaron 4 x 10^{5} células en 200 \mul/pocillo (para el ensayo de estimulación de órgano) o 2 x 10^{4} células T y 1 x 10^{6} APC irradiadas (para líneas de células T a corto plazo) en RPMI y suero de rata al 1% en pocillos triplicados sólo con medio de estimulación, Con A, o antígeno con o sin IL-2 suplementaria (20 unidades/ml) a 37ºC en CO_{2} al 7%. Los cultivos se incubaron durante tres días, las últimas 18 horas en presencia de [^{3}H]timidina (0,5 \muCi/10 \mul/pocillo). Las células se recogieron en filtros de fibra de vidrio y se evaluó la captación de [^{3}H]timidina mediante centelleo líquido. En algunos experimentos, las células T se pretrataron con construcciones \beta1\alpha1 (con y sin péptidos cargados), se lavaron y después se usaron en los ensayos de proliferación con y sin IL-2, como antes. Se calcularon las cuentas medias por minuto \pm DE de pocillos triplicados y se determinó la diferencia entre grupos mediante la prueba t de Student.

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Resultados

Se preincubaron un rango de concentraciones (10 nM a 20 \muM) de complejos \beta1\alpha1 cargados con péptido con una línea de células T específicas de MBP-69-89 antes de la estimulación con el péptido MBP-69-89 + CPA (célula presentadora de antígeno). Como se muestra en la Fig. 5, el pretratamiento de células T específicas de MBP-69-89 con complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89 10 nM inhibió significativamente la proliferación (>90%), mientras que la preincubación con el complejo \beta1\alpha1/MBP-55-69 20 \muM produjo una inhibición nominal (27%) pero insignificante. De importancia mecanística, la respuesta inhibida por el complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89 se pudo restablecer completamente incluyendo 20 unidades/ml de IL-2 durante la estimulación de la línea de células T (Fig. 5) sugiriendo que las células T se habían vuelto anérgicas por la exposición al complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89.

Ejemplo 5 Las moléculas \beta1\alpha1 cargadas con antígeno suprimen y tratan EAE

Se evaluó la capacidad del complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89 para suprimir la inducción, así como para tratar signos existentes de EAE en ratas Lewis.

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Materiales y métodos

Se usaron ratas Lewis hembra (Harlan Sprague-Dawley, Inc., Indianapolis, Indiana), de 8-12 semanas de edad, para los experimentos clínicos en este estudio. Las ratas se enjaularon en condiciones estériles en el Animalario del Centro Médico Veteran Affairs, Portland, Oregón, según las directrices institucionales. Se indujo EAE activa en las ratas mediante inyección subcutánea de 25 \mug de proteína básica de mielina de cobaya (GP-MBP) o 200 \mug de péptido GP-MBP-69-89 en adyuvante completo de Freund suplementado con 100 o 400 \mug de cepa H37Ra de Mycobacterium tuberculosis (Difco, Detroit, MI), respectivamente. El curso de la enfermedad clínica inducido por las dos emulsiones fue esencialmente idéntico, con el mismo día de inicio, duración, gravedad máxima, e índice acumulativo de la enfermedad. Las ratas se evaluaron diariamente para cambios en signos clínicos según la siguiente escala de clasificación clínica: 0, sin signos; 1, cola flácida; 2, debilidad de pata trasera, ataxia; 3, paraplejia; y 4, paraplejia con debilidad de las extremidades anteriores, estado moribundo. Se obtuvo una puntuación acumulativa de la enfermedad sumando las puntuaciones diarias de discapacidad durante el curso de la EAE para cada rata afectada, y se calculó un índice de enfermedad acumulativa (IEA) medio para cada grupo experimental.

Se aislaron las células mononucleares de la médula espinal mediante la técnica del gradiente discontinuo de percol y se contaron como se ha descrito previamente (Bourdette et al., 1991). Las células se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromo (FITC o PE) específicos para CD4, CD8, CD11b, CD45ra, TCR V\beta8.2 y CD134 de rata (Pharmingen, San Diego, CA) durante 15 minutos a temperatura ambiente y se analizaron mediante citometría de flujo. Se calculó el número de células teñidas positivas por médula espinal multiplicando el porcentaje de tinción por el número total de células por médula espinal. Se sacrificaron ratas controles y protegidas con \beta1\alpha1/MBP-69-89 en el máximo y la recuperación de la enfermedad clínica, se disecaron las médulas espinales y se fijaron en formalina tamponada al 10%. Las médulas espinales se embebieron en parafina y las secciones se tiñeron para microscopía óptica con luxol fast blue-ácido periódico-Schiff-hematoxilina.

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Resultados

La inyección intravenosa (i.v.) de 300 \mug del complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89 en solución salina los días 3, 7, 9, 11, y 14 después de la inyección de MBP o péptido MBP-69-89 en ACF suprimió la inducción de signos clínicos (Fig. 6 y Tabla 3) e histológicos (no mostrado) de EAE. La inyección de tan poco como 30 \mug del complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89 siguiendo la misma evolución temporal también fue eficaz, suprimiendo completamente EAE en 4 de 6 ratas, con sólo signos ligeros en los otros 2 animales. Todos los animales controles que no se trataron, que recibieron 2 \mug de péptido MBP-69-89 solo (la dosis del péptido libre contenida en 30 \mug del complejo), o que recibieron 300 \mug de la construcción \beta1\alpha1 vacía desarrollaron un grado comparable de EAE paralizante (Tabla 2). De forma interesante, la inyección de 300 \mug de un complejo \beta1\alpha1/péptido CM-2 control produjo una supresión ligera (alrededor del 30%) de EAE (Fig. 6 y Tabla 2). En paralelo con el curso de la enfermedad, los animales mostraron una dramática pérdida de peso (Fig. 6), mientras que los animales tratados con el complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89 no mostraron pérdida significativa de peso corporal a lo largo del curso del experimento.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Efecto de los complejos \beta1\alpha1/MBP-69-89 sobre EAE en ratas Lewis

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TABLA 3 Caracterización de células de médula espinal infiltrantes en el máximo de EAE en ratas control y protegidas con \beta1\alpha1/MBP-69-89

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Para evaluar el efecto de la construcción en la enfermedad establecida, se trataron ratas Lewis con 300 \mug del complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89 en el primer día del inicio de la enfermedad, con inyecciones de seguimiento 48 y 96 horas después. La EAE en las ratas control evolucionó a parálisis completa de las extremidades anteriores, mientras que no se produjo evolución de la enfermedad en ninguno de los animales tratados (Fig. 7). El curso ligero de la EAE (índice acumulativo medio, IAM = 3 \pm 0,13) en el grupo tratado fue significativamente menor que el curso grave de EAE en el grupo control (IAM = 11,2 \pm 2,7, p = 0,013), aunque la duración de la enfermedad (6 días) fue la misma en ambos grupos.

Consistente con la falta competa de lesiones inflamatorias en secciones histológicas de la médula espinal (no mostrado), la supresión de EAE con el complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89 esencialmente eliminó la infiltración de células inflamatorias activadas en el SNC. Se aislaron células mononucleares de las médulas espinales de animales control y protegidos en el máximo y la recuperación de la enfermedad clínica y se examinaron mediante análisis de FACS. El número total de células mononucleares aisladas de las médulas espinales de animales control en el máximo de la enfermedad clínica (14 días) fue 40 veces mayor que el de los animales protegidos evaluados en el mismo punto temporal (Tabla 3). Además, los animales protegidos tenían un 72% menos de células T activadas (OX40+), V\beta8.2+ en la médula espinal cuando se compararon con animales control (Tabla 3). Los números de células T CD4+ y CD8+, macrófagos y células B también estaban significativamente reducidos en animales protegidos (no mostrado). El número de células mononucleares aisladas después de la recuperación de EAE estaba reducido 4,5 veces en animales protegidos (0,64 x 10^{5} células/médula espinal) comparados con animales controles (2,9 x 10^{5} células/médula espinal). Los animales protegidos también tenían 10 veces menos células T activadas (OX40+), V\beta8.2+ en la médula espinal que los animales control tras la recuperación de la enfermedad.

El tratamiento con complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89 específicamente inhibió la respuesta de hipersensibilidad de tipo retardada (DHT) a MBP-69-89. Como se muestra en la Fig. 8A, los cambios en el espesor de la oreja 24 horas después de la provocación con PPD no estuvieron afectados en animales tratados con \beta1\alpha1 o con \beta1\alpha1 cargado con péptidos. Sin embargo, como se muestra en la Fig. 8B, mientras que los animales tratados con \beta1\alpha1 solo o en complejo con CM-2 no tuvieron efecto en la respuesta DHT, los animales tratados con el complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89 mostraron una inhibición dramática de la respuesta DHT a MBP-69-89.

El tratamiento de EAE con el complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89 también produjo inhibición de respuestas de células T de ganglios linfáticos (GL). Como se muestra en la Fig. 9, las células de los GL de ratas tratadas con el protocolo de supresión (Fig. 6) se inhibieron 2-4 veces en respuesta a MBP o el péptido MBP-69-89 comparados con ratas control. Esta inhibición era específica de antígeno, ya que las respuestas de células T de GL a PPD (estimuladas mediante inyección de ACF) eran las mismas en los grupos tratados y control. Las repuestas de células T ensayadas en ratas tratadas después del inicio de la enfermedad (Fig. 7) también se inhibieron, de una manera reversible por IL-2. Las respuestas de células de GL a MBP y el péptido MBP-69-89 fueron óptimas (S.I. = 4-5X) a bajas concentraciones de antígeno (Ag) (4 \mug/ml), y se podían aumentar 2 veces con IL-2 adicional. Por el contrario, las respuestas se inhibieron en ratas tratadas, con las respuestas óptimas de las células de GL (\pm3X) requiriendo mayores concentraciones de Ag (20-50 \mug/ml). Sin embargo, en presencia de IL-2, se pudieron restablecer las respuestas a un nivel comparable a ratas control (S.I. = 6-11X) sin aumentar las concentraciones de Ag.

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Discusión

Los siguientes ejemplos ilustran la eficacia de las moléculas de MHC de dos dominios. Mientras que los detalles experimentales se refieren a los polipéptidos \beta1\alpha1 de MHC de clase II, se apreciará que estos datos apoyan completamente la aplicación a los polipéptidos \alpha1\alpha2 de MHC de clase I.

En los ejemplos presentados, se describen polipéptidos que comprenden los dominios \beta1 y \alpha1 de MHC de clase II. Estas moléculas carecen del dominio \alpha2, del dominio \beta2 que se sabe se une a CD4, y de las secuencias transmembrana e intracitoplásmica. El tamaño y complejidad reducidos de la construcción \beta1\alpha1 permite la expresión y purificación de las moléculas de cuerpos de inclusión bacterianos con alto rendimiento. Se muestra que las moléculas \beta1\alpha1 se repliegan en una manera que permite la unión de epítopos peptídicos específicos de alelo y que tienen excelente solubilidad en tampones acuosos. Cuando están en complejos con antígenos peptídicos, la detección directa de los complejos \beta1\alpha1/péptidos en las células T se puede visualizar mediante FACS, estando determinada la especificidad de unión por el antígeno peptídico. El complejo \beta1\alpha1/69-89 ejerció efectos inhibidores poderosos y selectivos sobre la activación de células T in vitro e in vivo. Debido a su simplicidad, estabilidad bioquímica, propiedades biológicas, y similitud estructural con los homólogos humanos de clase II, la construcción \beta1\alpha1 representa un molde para la producción de una nueva clase de ligando de TCR.

Los estudios de unión directa del hibridoma A1 específico para MBP-72-89 mostraron diferente tinción con \beta1\alpha1/MBP-69-89, con un aumento de 10 veces en IMF sobre el fondo, y no se tiñó con \beta1\alpha1/CM-2 ni con \beta1\alpha1 "vacío". De manera recíproca, los estudios de unión usando una línea celular específica de CM-2 mostraron una fuerte tinción con \beta1\alpha1/CM-2 y ninguna tinción con \beta1\alpha1/MBP-69-89. De esta manera, el epítopo unido dirigió la interacción específica de los complejos \beta1\alpha1/péptidos. La identificación de las células T específicas de antígeno ha sido posible en unos pocos sistemas (McHeyzer et al., 1995; MacDonald et al., 1993; Walker et al., 1995; Reiner et al., 1993), usando anticuerpos anti-idiotípicos marcados contra el receptor de la células T como marcadores específicos, pero el planteamiento general de teñir células T especificas de antígeno con sus ligandos ha fracasado debido a que los complejos péptido-MHC solubles tienen una velocidad de disociación inherentemente rápida del receptor del antígeno de la célula T (Corr et al., 1995; Matsui et al., 1994; Sylkev et al., 1994). Se han usado complejos multiméricos péptido-MHC que contienen moléculas de MHC de cuatro dominios solubles para teñir linfocitos T específicos de antígeno (Altman et al., 1996), con la capacidad de unir más de un receptor de célula T (TCR) en una única célula T presumiblemente dando a las moléculas multiméricas una velocidad de disociación correspondientemente más lenta. La tinción con los complejos \beta1\alpha1/péptidos, al tiempo que es específica, llevó un periodo de incubación de aproximadamente 10 horas para saturarse (datos no mostrados). El patrón de tinción extraordinariamente brillante del hibridoma A1 con el complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89, y de la línea CM-2 con \beta1\alpha1/CM-2, acoplada al intervalo de tiempo que se necesita para alcanzar la saturación de unión, sugiere que esta molécula puede tener una velocidad de disociación muy lenta una vez unida al TCR. Estos complejos y versiones modificadas de ellos serían inusualmente muy adecuados para marcar directamente células T específicas de antígeno para fines de cuantificación y recuperación.

El complejo \beta1\alpha1/péptido fue muy específico en su capacidad de unirse a e inhibir la función de células T. La proliferación in vitro de células T específicas de MBP se inhibió >90% con el complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89, e in vivo hubo una inhibición casi completa de EAE clínica e histológica.

La actividad biológica más profunda demostrada para \beta1\alpha1/MBP-69-89 fue su capacidad para eliminar casi completamente la capacidad encefalitogénica de células T específicas de MBP-69-89 in vivo. La inyección de este complejo tras la iniciación de EAE suprimió casi completamente los signos clínicos e histológicos de EAE, aparentemente mediante inhibición directa de la activación sistémica de células T específicas de MBP-69-89, y prevención del reclutamiento de células inflamatorias al SNC. Además, la inyección de \beta1\alpha1/MBP-69-89 después del inicio de los signos clínicos detuvo la evolución de la enfermedad, demostrando el potencial terapéutico de esta construcción molecular. De forma interesante, el efecto del complejo en células T ya activadas no fue sólo inhibir la estimulación, sino también reducir la sensibilidad al antígeno, requiriendo la activación óptima después del tratamiento un aumento de 10 veces en la concentración de antígeno.

Desde una perspectiva de manipulación y diseño de fármacos esta molécula prototípica representa un avance fundamental. La eficacia biológica demostrada del complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89 en EAE plantea la posibilidad de usar esta construcción como molde para manipular homólogos humanos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes tal como esclerosis múltiple, que probablemente implica células T inflamatorias dirigidas a proteínas del SNC. Una molécula candidata sería HLA-DR2/MBP-84-102, que incluye tanto el alelo de clase II asociado a la enfermedad como un epítopo inmunodominante conocido que se ha descrito que es reconocido con más frecuencia en pacientes de EM que en controles. Sin embargo, debido a la complejidad de la respuesta de células T a múltiples proteínas de SNC y sus epítopos componentes, es posible que una terapia más general pueda requerir una mezcla de varios complejos MHC/Ag. La precisión de la inhibición inducida por el nuevo complejo \beta1\alpha1/MBP-69-89 descrita aquí representa un primer paso importante en el desarrollo de reactivos terapéuticos potentes y selectivos para seres humanos. Con esta nueva clase de reactivos, puede ser posible cuantificar directamente la frecuencia y la prevalencia de células T específicas para presuntos autoantígenos diana, y después eliminarlos selectivamente en pacientes afectados. Mediante este proceso de detección y terapia, puede ser posible por primera vez establecer firmemente la contribución patogénica de cada presunta especificidad de célula T.

Habiendo ilustrado y descrito los principios de síntesis de moléculas de dos dominios \beta1\alpha1 de clase II y \alpha1\alpha2 de clase I y los métodos de uso de tales moléculas, será aparente para el experto en la materia que la invención se puede modificar en orden y detalle sin separarse de tales principios. Se reivindican todas las modificaciones que estén dentro del espíritu y ámbito de las reivindicaciones presentadas aquí.

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<110> Burrows et al.

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<120> Moléculas recombinantes de MHC útiles para la manipulación de células T específicas de antígeno.

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<130> 50963

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<140>

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<141>

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<150> 60/064552

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<151> 16-09-1997

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<150> 60/064555

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<151> 10-10-1997

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<130> 30

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<170> PatentIn ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 566

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<212> ADN

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<213> Rattus sp.

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<220>

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<221> CDS

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<222> (3)...(560)

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<400> 1

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5

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<210> 2

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<211> 185

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<212> PRT

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<213> Rattus sp.

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<400> 2

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6

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<210> 3

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<211> 113

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221> CDS

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<222> (3)...(113)

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: inserto antígeno/enlazador

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<400> 3

7

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<210> 4

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<211> 37

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 4

8

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<210> 5

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<211> 83

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221> CDS

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<222> (3)...(83)

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencias codificantes alternativas del antígeno para el casete de expresión

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<400> 5

9

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<210> 6

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<211> 27

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 6

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10

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<210> 7

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<211> 89

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221> CDS

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<222> (3)...(89)

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencias codificantes alternativas del antígeno para el casete de expresión

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<400> 7

11

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<210> 8

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<211> 29

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 8

12

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<210> 9

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR

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<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

aattcctcga gatggctctg cagacccc

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28

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<210> 10

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR

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<400> 10

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tcttgacctc caagccgccg cagggaggtg

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30

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<210> 11

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR

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<400> 11

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cggcggcttg gaggtcaaga cgacattgag g

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31

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<210> 12

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<211> 37

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR

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<400> 12

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gcctcggtac cttagttgac agcttgggtt gaatttg

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37

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR

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<400> 13

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cagggaccat gggcagagac tcccca

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26

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<210> 14

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcctcctcga gttagttgac agcttgggtt

\hfill

30

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR

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<400> 15

13

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<210> 16

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR

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<400> 16

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\hskip-.1em\dddseqskip

gctccccgcg ggatttcgtg taccagttca a

\hfill

31

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

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<211> 92

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR

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<400> 17

14

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<210> 18

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<211> 92

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR

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<400> 18

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15

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<210> 19

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<211> 98

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR

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<400> 19

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16

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

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<211> 98

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR

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<400> 20

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17

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<210> 21

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<211> 184

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 21

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18

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<210> 22

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<211> 174

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 22

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19

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Mus sp.

\newpage

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<400> 23

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20

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

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<211> 180

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<212> PRT

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<213> Rattus sp.

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<400> 24

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21

22

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<210> 25

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido artificial

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<400> 25

23

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<210> 26

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\hskip1cm

24

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<210> 27

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido artificial

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<400> 27

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25

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<210> 28

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<211> 95

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR

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<400> 28

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26

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<210> 29

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<211> 94

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR

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<400> 29

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27

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<210> 30

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

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28

Claims (23)

1. Un polipéptido purificado que comprende, covalentemente unidos un primer y segundo dominios, en donde:

el primer dominio es un dominio \beta1 de MHC de clase II de mamífero y el segundo dominio es un dominio \alpha1 de MHC de clase II de mamífero;

y en donde el extremo amino del segundo dominio está covalentemente unido al extremo carboxi del primer dominio.

2. El polipéptido de la reivindicación 1 en donde el polipéptido comprende además, covalentemente unido al extremo amino del primer dominio, un tercer dominio que comprende un determinante antigénico.

3. El polipéptido de la reivindicación 1 ó 2 en donde la unión covalente entre los dominios primero y segundo o primero y tercero se proporciona mediante una secuencia enlazadora peptídica.

4. El polipéptido de la reivindicación 1 que comprende además un determinante antigénico asociado con el polipéptido mediante interacción no covalente.

5. El polipéptido de la reivindicación 2 ó 4 en donde el determinante antigénico es un antígeno peptídico.

6. El péptido de la reivindicación 1 en donde el primer dominio es un dominio \beta1 de MHC de clase II de mamífero y el segundo dominio es un dominio \alpha1 de MHC de clase II de mamífero.

7. Un polipéptido recombinante según la reivindicación 1 que comprende dominios \alpha1 y \beta1 de una molécula de mamífero en donde el extremo amino del dominio \alpha1 está covalentemente unido al extremo carboxi del dominio
\beta1.

8. El polipéptido según la reivindicación 7, en donde el polipéptido comprende además un determinante antigénico asociado con el polipéptido mediante interacción covalente o no covalente.

9. El polipéptido según la reivindicación 8 en donde el determinante antigénico está covalentemente unido al extremo amino del dominio \alpha1.

10. El polipéptido recombinante según la reivindicación 1 ó 7 en donde el polipéptido comprende además un marcador detectable o un grupo tóxico.

11. El polipéptido recombinante según la reivindicación 8 en donde el determinante antigénico está covalentemente unido al extremo amino del dominio \beta1.

12. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido según la reivindicación 1.

13. Una célula transgénica que incluye una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 12.

14. Un vector de expresión de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 12.

15. Una molécula recombinante de ácido nucleico, que comprende regiones primera, segunda y tercera representadas por la fórmula Pr-B-A, en donde:

Pr es una secuencia promotora;

B es una secuencia codificante que codifica un dominio \beta1 de una molécula de MHC de clase II de mamífero; y

A es una secuencia codificante que codifica un dominio \alpha1 de una molécula de MHC de clase II de mamífero;

en donde Pr está operativamente unido a B, y B y A comprenden un marco abierto de lectura único.

16. Una molécula recombinante de ácido nucleico, que comprende regiones primera, segunda, tercera y cuarta representadas por la fórmula Pr-P-B-A, en donde:

Pr es una secuencia promotora;

P es una secuencia codificante que codifica un antígeno peptídico;

B es una secuencia codificante que codifica un dominio \beta1 de una molécula de MHC de clase II de mamífero; y

A es una secuencia codificante que codifica un dominio \alpha1 de una molécula de MHC de clase II de mamífero;

en donde Pr está operativamente unido a P, y P, B y A comprenden un marco abierto de lectura único.

17. Un método para detectar o cuantificar en una muestra biológica la presencia de células T que tienen un receptor específico para un antígeno especificado, que comprende:

combinar la muestra biológica con un polipéptido recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en donde el extremo carboxi del dominio \beta1 está covalentemente unido al extremo amino del dominio \alpha1, y que comprende además el antígeno especificado unido en un surco de unión a péptido formado por dichos dominios \alpha1 y \beta1; y

detectar o cuantificar la presencia de unión específica del polipéptido recombinante con dichas células T.

18. Un método de separar células T que tienen un receptor específico para un antígeno especificado de una mezcla de células, que comprende:

combinar la mezcla de células con un polipéptido recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en donde el extremo carboxi del dominio \beta1 está covalentemente unido al extremo amino del dominio \alpha1, y que comprende además el antígeno especificado unido en un surco de unión a péptido formado por dichos dominios \alpha1 y \beta1; y

separar aquellas células unidas al polipéptido recombinante de las células no unidas.

19. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido según la reivindicación 1 y soporte farmacéuticamente aceptable.

20. Un método de inhibir la actividad de células T llevado a cabo ex vivo, que comprende poner en contacto células T con un polipéptido según la reivindicación 2.

21. Una composición que comprende un polipéptido según la reivindicación 2 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad causada por células T específicas de antígeno.

22. Un método de activación de células T llevado a cabo ex vivo, que comprende poner en contacto células T con un polipéptido según la reivindicación 2.

23. El uso del polipéptido de la reivindicación 2 para la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una enfermedad causada por células T específicas de antígeno.