ES2559409T3 - Moléculas de MHC recombinantes monoméricas útiles para la manipulación de células T específicas de antígenos - Google Patents

Abstract

Ligando de células T recombinante (RTL) modificado, aislado que tiene un potencial reducido para agregarse en disolución, que comprende: un componente de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en forma de un polipéptido monocatenario (sc) que comprende múltiples elementos de dominio de MHC unidos covalentemente que comprenden dominios a1 y b1 de un polipéptido de MHC de clase II, en el que el extremo amino terminal del dominio a1 está unido covalentemente al extremo carboxilo terminal del dominio b1, en el que el componente de MHC de clase II no incluye un dominio a2 o b2, y en el que el componente de MHC está modificado mediante la sustitución de uno o más aminoácidos hidrófobos dentro de la plataforma de lámina b de un polipéptido de MHC nativo o RTL que comprende el polipéptido de MHC nativo, mediante lo cual el RTL modificado muestra agregación reducida en disolución en comparación con la agregación mostrada por un RTL control, no modificado que tiene dicha estructura de componente de MHC pero que incorpora el polipéptido de MHC nativo que tiene una plataforma de lámina b no modificada.

Description

DESCRIPCION

Moleculas de MHC recombinantes monomericas utiles para la manipulacion de celulas T especlficas de antlgenos Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional estadounidense 5 numero 60/500.660, presentada por Burrows et al. el 5 de septiembre de 2003, que se incorpora al presente documento como referencia.

Declaracion respecto a la investigacion con patrocinio federal

Se respaldaron aspectos de este trabajo por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (A143960, ESI0554 y NS41965), la Sociedad Nacional de Esclerosis Multiple (RG3012A) y el Departamento de Asuntos de los 10 Veteranos. El gobierno de los Estados Unidos tiene determinados derechos sobre el contenido.

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a polipeptidos recombinantes que comprenden dominios moleculares del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) que median la union a antlgeno y el reconocimiento del receptor de celulas T (TCR) y a composiciones y metodos relacionados que incorporan estos polipeptidos recombinantes. Las 15 composiciones y los metodos de la invencion son utiles para la deteccion, cuantificacion y purification de celulas T especlficas de antlgeno, para modular la actividad de las celulas T y para tratar enfermedades mediadas por celulas T tales como trastornos autoinmunitarios.

Antecedentes de la invencion

El sistema inmunitario funciona normalmente para dirigir respuestas inmunitarias protectoras contra 20 microorganismos y otros materiales extranos nocivos. En el contexto de las enfermedades autoinmunitarias y el rechazo de trasplantes, sin embargo, estas respuestas inmunitarias normalmente beneficiosas pueden mediar efectos perjudiciales y a menudo mortales. En el caso de la autoinmunidad, los antlgenos presentes en los propios tejidos corporales se convierten en dianas para respuestas inmunitarias autorreactivas que producen destruction tisular y otros slntomas de enfermedad.

25 Las respuestas inmunitarias en mamlferos estan mediadas por una serie diversa de celulas sangulneas perifericas denominadas leucocitos. Los leucocitos se producen a partir de celulas madre hematopoyeticas que experimentan autorrenovacion y diferenciacion para dar dos linajes de precursores (las llneas mieloide y linfoide). Se produce diferenciacion adicional entre estos linajes para producir monocitos, eosinofilos, neutrofilos, basofilos, megacariocitos y celulas eritroides a partir de la llnea mieloide, y linfocitos T, linfocitos B y celulas NK a partir de la 30 llnea linfoide.

Los linfocitos T incluyen celulas T CD8+ (celulas T citotoxicas/supresoras), y celulas T CD4+ que se distinguen en parte por su expresion de moleculas de la superficie celular, CD8, y CD4, respectivamente, que funcionan para potenciar la avidez con la que las celulas T se unen a celulas portadoras de antlgeno o diana, y tambien pueden promover la interaction del TCR con el antlgeno relacionado. Bierer et al., Ann. Rev. Immunol. 7:579-99, 1989.

35 Las celulas T CD4+ desempenan un papel regulador clave con respecto a otros tipos de celulas del sistema inmunitario, actuando como celulas “T cooperadoras” o “T inductoras” cuando se activan. En virtud de este papel regulador principal, las celulas T CD4+ son agentes clave en la patogenesis de diversas enfermedades autoinmunitarias, incluyendo la esclerosis multiple (EM), artritis reumatoide (AR), diabetes, sarcoidosis, uveitis autoinmunitaria, beriliosis cronica, y tambien se considera que desempenan un papel causal en el rechazo de 40 trasplantes y en la enfermedad de injerto contra huesped (EICH) (Swanborg, J. Immunol 130:1503-05, 1983; Cush, Arthritis Rheum. 31: 1230-38, 1988; Caspi, J. Immunol 140:1490-95, 1988; Cobbold et al. Nature 312:54851, 1988; Steinman, Sci. Am. 269:106-14, 1993).

Las celulas T CD4+ median su papel en la enfermedad autoinmunitaria respondiendo de una manera especlfica de antlgeno a “autoantlgenos” asociados con celulas o tejidos diana. Las celulas T CD4+ patogenas migran o “se 45 dirigen” a tejidos diana que portan autoantlgeno y producen selectivamente citocinas de celulas T cooperadoras de tipo 1 (Th1), que desencadenan reclutamiento y activation de otros linfocitos y monocitos que pueden destruir tejidos diana y producir otras secuelas de enfermedad adversas (Weinberg, et al., J. Immunol 148:2109-17, 1992; Weinberg et al., J. Immunol 152:4712-5721,1994).

La activacion normal de los linfocitos T se produce cuando las celulas T interaccionan con celulas presentadoras de 50 antlgeno (APC) que portan el antlgeno relacionado (Ag) en el contexto de una protelna del complejo mayor de

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histocompatibilidad (MHC). La especificidad de las respuestas de celulas T la confiere un receptor de celulas T (TCR) especifico de antigeno, polimorfico. La activacion de celulas T esta mediada por el reconocimiento del TCR del Ag presentado sobre la superficie de la APC como un peptido procesado unido a la molecula de MHC.

En seres humanos y otros mamiferos se producen dos clases distintas de moleculas de MHC, denominadas MHC de clase I y MHC de clase II. Ambas clases de moleculas de MHC comprenden complejos formados por la asociacion de multiples cadenas de polipeptido, y cada una incluye una parte transmembrana que ancla el complejo a la membrana de la APC. Las moleculas de MHC de clase I estan compuestas por una cadena de polipeptido a asociada no covalentemente con una cadena de p2-microglobulina. La cadena a del MHC de clase I incluye tres dominios distintos, denominados dominios a1, 02 y a3. La estructura tridimensional de los dominios a1 y 02 de las moleculas de MHC I forma una acanaladura de union a peptido (denominada alternativamente en el presente documento hendidura o cavidad de union a peptido) que se une al Ag relacionado para su presentacion a las celulas T. El dominio 03 es un dominio de tipo plegamiento de Ig que incluye una secuencia transmembrana para anclar la cadena aen la membrana celular de la APC. Los complejos de MHC de clase I, cuando se asocian con el antigeno en presencia de senales coestimuladoras apropiadas, estimulan las celulas T citotoxicas CD8+ para destruir celulas diana de manera especifica de Ag.

Se han estudiado los genes que codifican para las diversas cadenas de polipeptido que se asocian para formar los complejos de MHC en mamiferos y se han descrito con mucho detalle. En seres humanos, las moleculas de MHC (con excepcion de la p2-microglobulina de clase I) se codifican en la region de HLA del genoma, ubicada en el cromosoma 6. Hay tres loci que codifican para la cadena adel MHC de clase I, denominados HLA-A, HLA-B y HLA- C. En el caso de las proteinas de MHC de clase II, hay tres pares de loci de cadenas ay p denominados HLA-DR(A y B), HLA-DP(A y B) y HLA-DQ(A y B). En ratas, el gen ade la clase I se designa RT1.A, mientras que los genes de la clase II se denominan RT1.B ay RT1.B p. Puede encontrarse una description mas detallada con respecto a la estructura, la funcion y la genetica de los complejos de MHC, por ejemplo, en Immunobiology: The Immune System in Health and Disease de Janeway y Travers, Current Biology Ltd./Garland Publishing, Inc. (1997), y en Bodmer et al. (1994) “Nomenclature for factors of the HLA system” Tissue Antigens vol. 44, paginas 1-18.

La especificidad de las respuestas de celulas T la confiere un receptor de celulas T (TCR) especifico de antigeno, polimorfico. Los TCR comprenden receptores heterodimericos a/p de multiples cadenas, que se activan de una manera especifica de Ag por el Ag procesado y presentado sobre la superficie de la APC como un peptido unido al complejo de MHC. Los datos cristalograficos de rayos X demuestran que los peptidos del antigeno procesado se unen a las proteinas de MHC II en una cavidad distal a la membrana formada por los dominios p1 y a1 (Matsui et al. Science 254:1788-91, 1991; Nag et al., J. Biol. Chem. 267:22624-29, 1992).

A la activacion de las celulas T CD4+ generalmente le sigue un ciclo de multiples etapas que incluye la ligation conjunta del TCR y CD4 por el complejo MHC de clase II/peptido presentado por la APC. Un acontecimiento de activacion separado denominado “coestimulacion” esta mediado por otras moleculas de la superficie de las celulas T, tales como CD28. En ausencia de la segunda senal coestimuladora, la estimulacion de las celulas T a traves del TCR por el complejo MHC de clase II/peptido, induce supuestamente un estado de falta de respuesta a la presentation de antigenos optima posterior, denominado comunmente “anergia”. (Quill, J. Immunol 138:3704-12, 1987; Schwartz, J. Exp. Med. 184:1-8, 1996). En otros estudios, se ha notificado que la ligacion del TCR en ausencia de una senal coestimuladora altera la activacion normal de celulas T, induciendo una variedad de respuestas desde anergia hasta apoptosis (Schwartz, J. Exp. Med. 184:1-8, 1996; Janeway, Cell 76:275-85, 1994; Burrows et al., J. Immunol 167:4386-95, 2001; Wang et al., The Journal of Immunology, 2003).

Se han investigado amplia y extensamente las interacciones de linfocitos T restringidas por el MHC. Las celulas del subconjunto de celulas T cooperadoras/inductoras generalmente reconocen el antigeno sobre la superficie de la APC unicamente en asociacion con productos genicos del MHC de clase II, lo que da como resultado la restriction genetica del reconocimiento de antigenos. Aunque se han descrito las reglas que gobiernan la activacion de las celulas T restringidas por el MHC, y particularmente de las celulas T restringidas por el MHC de clase II, todavia estan definiendose los mecanismos subyacentes.

Pese al gran numero de posibles especificidades de TCR de las celulas T, varios estudios han mostrado que la mayor parte de la respuesta de celulas T a antigenos proteicos puede estar dirigida por algunos epitopos “inmunodominantes” dentro de la proteina antigenica. En el contexto de las enfermedades autoinmunitarias, se ha demostrado que las respuestas de celulas T restringidas por el MHC de clase II, y en algunos casos las senales clinicas de enfermedad autoinmunitaria, estan asociadas con proteinas especificas y/o epitopos inmunodominantes de estas proteinas incluyendo, por ejemplo, colageno de tipo II (Rosloneic et al., J. Immunol. 160:2573-78, 1998; Andersson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:7574-79, 1998; y Fugger et al., Eur. J. Immunol. 26:928-33, 1996), y Ag gp39 de cartilago humano (Cope et al., Arthritis Rheum. 42:1497, 1999) asociado con artritis reumatoide (AR), acido glutamico decarboxilasa 65 (Patel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:8082-87,1997; Wicker et al., J. Clin. Invest. 98:2597, 1996) e insulina (Congia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3833-38, 1998) asociada con diabetes tipo 1 (diabetes mellitus insulinodependiente o DMID), y glicoproteina oligodendrocitica de mielina (MOG)

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(Forsthuber et al., J. Immunol. 167:7119, 2001) asociada con EM y un modelo de enfermedad animal para EM, encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE). Se han notificado hallazgos similares para respuestas de celulas T restringidas por el MHC de clase II asociadas con la protelna basica de mielina (MBP) (Madsen et al., Nat. Genet. 23:343, 1999), protelna proteolipldica (PLP) (Kawamura et al., J. Clin. Invest. 105:977, 2000),y MOG (Vandenbark et al., J. Immunol. 171:127-33, 2003).

Un enfoque para gestionar y tratar las enfermedades autoinmunitarias y otros trastornos inmunitarios mediados por celulas T es regular la actividad de las celulas T usando ligandos de TCR naturales o sinteticos, o farmacos moduladores de celulas T u otros compuestos, que son agonistas o antagonistas de TCR. Se han producido diversos analogos de ligandos de TCR naturales que comprenden dominios extracelulares de moleculas de MHC de clase II unidas a un Ag de peptido especlfico. Se ha purificado varios de tales constructos como extractos con detergente de membranas de linfocitos o se han producido como protelnas recombinantes (Sharma et al., PNAS. 88:11465-69, 1991), Kozono et al., Nature 369:151-54, 1994; Arimilli et al., J. Biol. Chem. 270:971-77, 1995; Nag, PNAS 90:1604-08, 1993; Nag et al., J. Biol. Chem. 271:10413-18, 1996; Rhode et al., J. Immunol. 157:4885-91, 1996; Fremont et al., Science 272:1001, 1996; Sharma et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11405, 1991; Nicolle et al., J. Clin. Invest. 93:1361, 1994; Spack et al., CNS Drug Rev. 4: 225, 1998).

Se ha notificado que estos complejos moleculares bicatenarios de cuatro dominios cargados con, o unidos covalentemente a, el Ag de peptido, interaccionan con las celulas T y modulan la actividad de las celulas T de una manera especlfica de Ag (Matsui et al., Science 254:1788-91, 1991; Nag et al., J. Biol. Chem. 267:22624-29, 1992; Nag, J. Biol. Chem. 268:14360-14366, 1993; Nag, PNAS 90:1604-08, 1993; Nicolle et al., J. Clin. Invest. 93:13611369, 1994; Spack et al. J. Autoimmun. 8:787-807, 1995). Se han presentado diversos modelos sobre como pueden ser utiles estos complejos para modular respuestas inmunitarias en el contexto de la enfermedad autoinmunitaria. Por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.194.425 (Sharma et al.) y 5.284.935 (Clark et al.) notifican el uso de complejos MHC de clase II/peptido aislados conjugados con una toxina para eliminar las celulas T autorreactivas. Otros han notificado el uso de complejos MHC II/antlgeno, en ausencia de factores coestimuladores, para inducir un estado de falta de respuesta en celulas T especlficas de Ag conocido como “anergia” (Quill et al., J. Immunol., 138:3704-3712 (1987). Tras esta observacion, Sharma et al. (patentes estadounidenses n.os 5.468.481 y 5.130.297) y Clarke et al. (patente estadounidense n.° 5.260.422) sugieren que pueden administrarse terapeuticamente complejos MHC II/antlgeno solubles para anergizar llneas de celulas T que responden especlficamente a peptidos autoantigenicos. Estudios adicionales notifican que los complejos MHC II/antlgeno solubles pueden inhibir la activacion de celulas T, inducir anergia de celulas T y/o aliviar slntomas mediados por celulas T de enfermedad autoinmunitaria (Sharma et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11405, 1991; Spack et al., CNS Drub Rev. 4: 225, 1998; Steward et al., J. Allerg. Clin. Immun. 2:S117, 1997). En algunos casos, en ausencia de coestimulacion, se ha notificado que los complejos MHC de clase I I/peptido intactos modulan la actividad de las celulas T induciendo apoptosis especlfica de antlgeno en lugar de anergia (Nag et al. J. Biol. Chem. 271:10413-18, 1996).

Aunque el concepto de usar complejos MHC/antlgeno aislados en aplicaciones terapeuticas y de diagnostico resulta muy prometedor, un inconveniente principal a los diversos metodos notificados hasta la fecha es que los complejos son grandes y por consiguiente diflciles de producir y trabajar con ellos. Aunque estos complejos de cuatro dominios pueden aislarse de linfocitos mediante extraccion con detergente, tales procedimientos son ineficaces y producen solo pequenas cantidades de protelna. Aunque la clonacion de genes que codifican para subunidades del complejo de MHC ha facilitado la produccion de grandes cantidades de subunidades individuales a traves de la expresion en celulas procariotas, la union de subunidades individuales para dar complejos de MHC que tienen estructura conformacional apropiada ha resultado ser diflcil. Otra caracterlstica importante de estos complejos MHC II/antlgeno descritos anteriormente que no solo se unen al TCR, sino tambien a la molecula de CD4 en la superficie de las celulas T a traves del dominio fJ2 del MHC (Brogdon et al., J. Immunol. 161:5472, 1998). Esta interaccion adicional durante la presentacion de peptidos y el acoplamiento del TCR complica la utilidad de los complejos MHC II/antlgeno anteriores para determinadas aplicaciones de diagnostico y terapeuticas. Ademas, debido a su tamano y estructura compleja, los complejos de MHC de clase II anteriores presentan un reto de plegamiento in vitro intrlnsecamente diflcil.

Para superar estos obstaculos y proporcionar ventajas adicionales, los inventores en la solicitud actual desarrollaron anteriormente ligandos de TCR o “RTL” recombinantes, novedosos para su uso en la modulacion de la actividad de las celulas T. Estos RTL incorporan componentes estructurales seleccionados de una protelna de MHC de clase II nativa, que comprende normalmente los dominios o1 y (b del MHC de clase II (o partes de los dominios o1 y (b necesarias para formar una superficie de contacto de cavidad de union a Ag/TCR minima). Estos RTL pueden excluir todo o parte del dominio fJ2 de la proteina de MHC de clase II, normalmente al menos la parte de union a CD4 del dominio b2. Asimismo, los RTL para su uso dentro de la invencion pueden excluir el dominio 02 de la proteina de MHC de clase II (vease, por ejemplo, Burrows et al., Prot Eng. 12:771, 1999). Se han producido diversos RTL que tienen estas caracteristicas estructurales generales en E. coli, con y sin extensiones amino terminales que comprenden Ag de peptido unido covalentemente.

Se ha demostrado que estos tipos de constructos de RTL son agentes eficaces para aliviar sintomas de enfermedad autoinmunitaria mediada por celulas T CD4+ de una manera especlfica de MHC, especlfica de Ag (Burrows et al., J.

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Immunol 167:4386-95, 2001; Vandenbark et al., Journal of Immunology, 2003). Por ejemplo, se han sometido a prueba constructos de RTL y se ha mostrado que previenen y/o tratan EAE inducida por MBP en ratas Lewis (Burrows et al., J. Immunol. 161:5987, 1998; Burrows et al., J. Immunol. 164:6366, 2000) y que inhiben la activacion e inducen la secrecion de IL-10 en clones de celulas T restringidos por DR2 humanos especlficos para el peptido MBP-85-95 o BCR-ABL b3a2 (CABL) (Burrows et al., J. Immunol. 167:4386, 2001; Chang et al., J. Biol. Chem. 276:24170, 2001). Otro constructo de RTL disenado por los inventores en la solicitud actual es un constructo MOG- 35-55/DR2 (VG312) que inhibe potencialmente respuestas autoinmunitarias y provoca tolerancia inmunologica al peptido MOG-35-55 encefalitogenico, y alivia o invierte signos cllnicos e histologicos de EAE (Vandenbark et al., J. Immunol. 171:127-33, 2003). Los actuales inventores han desarrollado numerosos constructos de RTL adicionales utiles para modular respuestas inmunitarias de celulas T, que pueden emplearse eficazmente dentro de las composiciones y los metodos de la presente invencion (vease, por ejemplo, Huan et al., J. Immunol. 172:4556-4566, 2004).

En estudios de RTL de modificacion por ingenierla genetica de protelnas descritos recientemente, los solicitantes descubrieron que las moleculas de RTL derivadas del MHC de clase II pueden formar agregados indeseables en disolucion. En el caso de un constructo de RTL derivado de HLA-DR2 (DrB1*1501/DRA*0101)), el RTL purificado produjo aproximadamente el 10% de las moleculas en forma de dlmeros estables, encontrandose el porcentaje restante de las moleculas en forma de estructuras de orden superior por encima de 300.000 Daltons (Chang et al., J. Biol. Chem. 276:24170-76, 2001).

Aunque los agregados de RTL conservan la actividad biologica (Burrows et al., J. Immunol 167:4386-95, 2001; Vandenbark et al., Journal of Immunology 171:127-133, 2003), la conversion de RTL multimericos en reactivos monodispersos en disolucion sigue siendo un objetivo importante no cumplido para facilitar el uso de RTL como agentes terapeuticos humanos, por ejemplo para tratar la esclerosis multiple y otros estados autoinmunitarios.

Por consiguiente, sigue habiendo una necesidad no satisfecha en la tecnica de proporcionar ligados de TCR (RTL) recombinantes que conserven la capacidad para unirse a peptidos Ag e interconectar funcionalmente con un TCR para modular la actividad de las celulas T de una manera especlfica de Ag, que tengan utilidad de diagnostico y/o terapeutica, y que muestren un potencial reducido para agregarse en disolucion o tras la administracion a un sujeto mamlfero. El documento WO2003/007978 se refiere al tratamiento y la prevencion de cancer de mama, y otros canceres, proporcionando un peptido de ocho a veinte aminoacidos de longitud que comprende un analogo hidrofilo de un peptido de alfa-fetoprotelna.

Sumario de la invencion

La presente invencion satisface esta necesidad y cumple objetos y ventajas adicionales proporcionando ligandos de receptores de celulas T (RTL) recombinantes, modificados, que se han modificado estructuralmente para mostrar una propension disminuida a la autoagregacion. Los RTL modificados de la invencion normalmente tienen una o mas caracterlsticas estructurales de superficie redisenadas introducidas en una secuencia de polipeptido de MHC por lo demas nativa. Por ejemplo, los RTL modificados pueden disenarse o modificarse por ingenierla genetica de manera racional para introducir uno o mas cambios de aminoacido en un sitio diana expuesto a disolvente para la modificacion ubicada dentro de, o que define, una superficie de contacto de autounion (o autoasociacion) encontrada en el polipeptido de MHC nativo.

Dentro de realizaciones a modo de ejemplo de la invencion, el RTL modificado incluye una estructura de multiples dominios que comprende multiples dominios de MHC de clase I o MHC de clase II, o partes de los mismos necesarias para formar una superficie de contacto de TCR minima necesaria para mediar la union a Ag y el reconocimiento del TCR.

En el caso de RTL modificados derivados de moleculas de MHC de clase II humanas, los RTL normalmente comprenden dominios de polipeptido de MHC o1 y (b (o partes de los mismos suficientes para proporcionar una superficie de contacto de TCR minima) de una proteina de MHC de clase II. Estos dominios o subpartes de los mismos pueden unirse covalentemente para formar un polipeptido monocatenario (sc) de MHC de clase II. El componente de MHC resultante puede ser util como RTL “vacio”, o puede asociarse con un Ag de peptido.

Las moleculas de RTL modificado de la invencion muestran caracterlsticas mejoradas de monodispersion en disoluciones acuosas, mientras que conservan su capacidad para unirse a Ag de peptido, para seleccionar como diana y para modular la actividad de las celulas T especlficas de antlgeno, y para tratar, entre otras, enfermedades autoinmunitarias y otros estados mediados por celulas T especlficas de antigeno in vivo.

Los RTL modificados de la invencion carecen de determinadas caracterlsticas estructurales encontradas en moleculas de MHC nativas, intactas (por ejemplo, dominios de plegamiento de Ig transmembrana), pero no obstante pueden replegarse de una manera que es estructuralmente analoga a la de las moleculas de MHC completas nativas. Los RTL modificados pueden asimismo unirse a Ag de peptido para formar complejos MHC:antigeno

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estables. Ademas, estos RTL modificados, cuando se asocian con un Ag de peptido relacionado, se unen a celulas T de una manera especifica de epitopo y regulan la actividad de las celulas T (por ejemplo, proliferacion) de una manera especifica de Ag, tanto in vitro e in vivo. Como resultado, las moleculas de MHC dadas a conocer son utiles en una amplia variedad de aplicaciones tanto in vivo como in vitro.

La invencion proporciona diversas formulaciones de RTL modificados, monodispersos. En realizaciones a modo de ejemplo, un RTL modificado comprende una componente de MHC de clase II de dos dominios que comprende los dominios a1 y p1 de una molecula de MHC de clase II de mamifero. En realizaciones mas detalladas, estos RTL modificados se caracterizan adicionalmente por tener el extremo amino terminal del dominio a1 unido covalentemente al extremo carboxilo terminal del dominio pi. En otras realizaciones detalladas, el componente de MHC del RTL no incluye los dominios 02 o p2 encontrados en una molecula de MHC de clase II intacta. Normalmente, el componente de MHC del RTL esta asociado, mediante interaccion covalente o no covalente, con un determinante antigenico, tal como un epitopo de celulas T de una proteina autoantigenica. Por ejemplo, un antigeno de peptido puede unirse covalentemente al extremo amino terminal del dominio pi de un componente de MHC de clase II. Las moleculas de dos dominios tambien pueden comprender un marcador detectable, tal como un marcador fluorescente, o un resto toxico (por ejemplo, ricina A).

La descripcion tambien proporciona moleculas de acido nucleico que codifican para los RTL no agregantes, inventivos, asi como vectores de expresion que pueden usarse para expresar estas moleculas en celulas de mamifero. En particular, las moleculas de acido nucleico incluyen secuencias que codifican para el componente de MHC asi como un peptido antigenico. Por ejemplo, una molecula de acido nucleico de este tipo puede representarse por la formula Pr-P-B-A, en la que Pr es una secuencia promotora unida operativamente a P (una secuencia que codifica para el antigeno de peptido), B es el dominio pi de clase II, y A es el dominio al de clase II. En estas moleculas de acido nucleico, P, B y A comprenden un unico marco de lectura abierto, de manera que el peptido y los dos dominios de MHC se expresen como una unica cadena de polipeptido.

Los RTL modificados de la invencion pueden usarse in vivo para detectar y cuantificar celulas T, y/o para regular la funcion de las celulas T. Especificamente, tales moleculas cargadas con un antigeno seleccionado pueden usarse para detectar, monitorizar y cuantificar la poblacion de celulas T especificas de antigeno, proporcionando utilidad, entre otras cosas, en varios entornos clinicos, tales como monitorizacion del numero de celulas T especificas de antigeno tumoral en sangre extraida de un paciente con cancer, o el numero de celulas T especificas de autoantigeno en sangre extraida de un paciente que padece una enfermedad autoinmunitaria. En estos contextos, las moleculas dadas a conocer son herramientas poderosas para monitorizar el progreso de una terapia particular.

Ademas de monitorizar y cuantificar las celulas T especificas de antigeno, las moleculas de RTL modificado de la invencion tienen utilidad para purificar celulas T para inmunoterapia adoptiva. Por ejemplo, los RTL modificados cargados con un antigeno tumoral pueden usarse para purificar celulas T especificas de antigeno tumoral de un paciente con cancer. Estas celulas pueden expandirse entonces in vitro antes de devolverse al paciente como parte de un tratamiento contra el cancer inmunoterapico adoptivo.

Las moleculas de RTL modificado de la invencion pueden usarse para alterar la actividad, el fenotipo, el estado de diferenciacion y/o el potencial patogeno de las celulas T de una manera especifica de Ag. Dentro de aspectos alternativos de la invencion, estos reactivos novedosos pueden usarse para inducir una variedad de procesos de traduccion de celulas T, para modular funciones efectoras de celulas T (incluyendo citocina y respuestas de proliferacion), para inducir anergia, o en cualquier caso para alterar el potencial patogeno de las celulas T de una manera especifica de Ag. A este respecto, los RTL modificados de la invencion muestran efectos poderosos y especificos de epitopo sobre la activacion de las celulas T resultante, tal como se ejemplifica por su capacidad para estimular la secrecion de citocinas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-10). Cuando se conjugan con un resto toxico, los RTL modificados de la invencion tambien pueden usarse para destruir celulas T que tienen una especificidad de Ag particular. Por consiguiente, las moleculas de RTL dadas a conocer son utiles en una amplia variedad de aplicaciones tanto in vivo como in vitro

Las moleculas de RTL modificado de la invencion pueden producirse facilmente mediante expresion recombinante en celulas procariotas y eucariotas, y pueden purificarse en grandes cantidades. Ademas, estas moleculas pueden cargarse facilmente con cualquier antigeno de peptido deseado, haciendo que la produccion de un repertorio de moleculas de MHC con diferentes especificidades de celulas T sea una tarea sencilla. Estos y otros aspectos de la invencion se describen en mas detalle a continuacion en el presente documento.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 muestra HLA-DR2, RTL302, y la superficie accesible a disolvente de la plataforma de lamina p del RTL. El panel izquierdo (A) muestra un modelo a escala de una molecula de MHC de clase II sobre la superficie de una APC. El panel derecho (B) muestra RTL302, una molecula monocatenaria soluble derivada del dominio de union a antigeno/reconocimiento de celulas T. El panel inferior derecho (C) muestra los residuos hidrofobos de la plataforma

de lamina beta de RTL302.

La figura 2 muestra cromatografla de exclusion molecular de RTL modificados. Se analizaron mediante cromatografla de exclusion molecular (SEC) RTL purificados y replegados. El panel superior (A) muestra SEC de RTL302 (triangulo), RTL302(5S) (clrculo) y RTL302(5D) (cuadrado). Estos RTL no contienen peptidos Ag fijados 5 covalentemente. El panel inferior (B) muestra SEC de RTL derivados del HLA-DR2 de tipo natural que contienen el peptido Ag MBP-85-99 (RTL303, triangulo) o MOG-35-55 (RTL312, clrculo) fijado covalentemente.

La figura 3 muestra espectros de dicrolsmo circular (DC) de RTL derivados de DR2 modificados. El panel superior (A) muestra espectros de DC de RTL302 (triangulo), RTL302(5S) (clrculo) y RTL302(5D) (cuadrado) “vaclos”. El panel central (B) muestra espectros de DC de RTL que contienen el peptido Ag MBP-85-99 fijado covalentemente. 10 RTL303, (triangulo), RTL320 (cuadrado) y RTL340 (rombo). El panel inferior (C) muestra curvas de

desnaturalizacion termica para RTL303, RTL320 y RTL340 que revelan un alto grado de cooperatividad y estabilidad.

La figura 4 muestra la medicion directa de la union de peptido a RTL derivados de HLA-DR2. Union de MOG biotinilada a RTL302 (clrculos abiertos), RTL302(5S) (rombos abiertos) y RTL302(5D) (cuadrados abiertos). El panel 15 izquierdo (A) muestra saturacion como funcion de la concentracion de MOG biotinilada (la parte insertada muestra el analisis de Scatchard de la union a peptido). El panel derecho (B) muestra la union del peptido MOG biotinilado (0,15 mM) a RTL como funcion del tiempo para comparar la tasa de union inicial.

La figura 5 muestra que RTL342 monomerico, disperso fue tan eficaz como RTL312 en el tratamiento de EAE en animales transgenicos DR*1501. Puntuaciones cllnicas medias de ratones transgenicos para HLA-DR2 20 (DRB1*1501/DRA*0101) tratados con 33 mg de RTL312 (v), RTL342 (A) o vehlculo solo (Tris, pH 8,5) (•). Se

inmunizo a todos los ratones por via s.c. con 200 mg de MOG-35-55 y 400 mg de CFA conjuntamente con 100 ng de Ptx por via i.v. en el dla 0 y 266 ng de Ptx 2 dlas despues de la inmunizacion. En el dla 14 se distribuyo a todos los ratones en 6 grupos segun su similitud en la enfermedad y el sexo. Se inyecto diariamente a los ratones por via i.v. RTL312, RTL342 o vehlculo. (n = 4 por grupo, excepto para el grupo con vehlculo donde n = 3; las flechas indican 25 tratamiento).

La figura 6 muestra la superficie de interaction entre el dominio a\p1 de union a peptido/reconocimiento de celulas T y los dominios de plegamiento de Ig d2[52 de HLA-DR2. Se modelo y refino la superficie de interaccion entre el dominio db1 de union a peptido/reconocimiento de celulas T y los dominios de plegamiento de Ig d2fi2 usando la estructura 1BX2 de DR2 de clase II humana de alta resolution (Smith et al., J. Exp. Med. 188:1511-20, 1998). Los 30 dominios transmembrana se muestran esquematicamente como cilindros de 0,5 nm. Los extremos amino y carboxilo terminales del MHC de clase II se marcan en N, C, respectivamente. Las cistelnas se interpretan como bola y varilla, al igual que los cinco residuos V102, I104, A106, F108, LllO (numeration 1BX2). La superficie de interaccion (superficie de contacto de 4 angstroms) entre los dominios de plegamiento de Ig y el dominio de union a peptido/reconocimiento de celulas T se colorea por el potencial lipofilo (LP). Las moleculas de agua dentro de esta 35 superficie de contacto en la estructura cristalina 1BX2 se muestran como esferas.

Definiciones

El termino “MHC” se refiere al complejo mayor de histocompatibilidad.

El termino “RTL”, en singular o plural, se refiere ligandos de receptores de celulas T recombinantes humanos.

“Ag” se refiere a antlgeno.

40 “APC” se refiere a celula presentadora de antlgeno.

“bME” se refiere a bmercaptoetanol.

“DC” se refiere a dicrolsmo circular.

“CFA” se refiere a adyuvante completo de Freund.

“DLS” se refiere a dispersion de luz dinamica.

45 “EAE” se refiere a encefalomielitis autoinmunitaria experimental.

“ELISA” se refiere a ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.

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“HLA” se refiere a antlgeno leucocitario humano.

“hu-” se refiere a ser humano.

“MBP” se refiere a protelna basica de mielina.

“MHC” se refiere a complejo mayor de histocompatibilidad.

“MOG” se refiere a glicoprotelna oligodendrocltica de mielina, (secuencia murina).

“EM” se refiere a esclerosis multiple.

“LDP” se refiere a leche desnatada en polvo.

“PBMC” se refiere a celulas mononucleares en sangre periferica.

“PBS” se refiere a solucion salina tamponada con fosfato.

“PCR” se refiere a reaccion en cadena de la polimerasa.

“Ptx” se refiere una toxina pertusica.

“RPMI” se refiere a medios de crecimiento para celulas desarrolladas en el Rosweli Park Memorial Institute.

“TA” se refiere a temperatura ambiente.

“RTL” se refiere a ligando de receptor de celulas T recombinante (por ejemplo, RTL de G. G. Burrows, patente estadounidense n.° 6.270.772).

“S.C.” se refiere a por via subcutanea.

“SEC” se refiere a cromatografla de exclusion molecular.

“STR-HRP” se refiere a conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rabano.

“TCR” se refiere a receptor de celulas T.

“Tg” se refiere a transgenico.

“Identidad de secuencia” se refiere a la similitud entre secuencias de aminoacidos. La identidad de secuencia se mide frecuentemente en terminos de la identidad (o similitud u homologla) en porcentaje; cuanto mayor es el porcentaje, mas similares son las dos secuencias. Las variantes de los polipeptidos de dominio de MHC inventivos poseeran un alto grado de identidad de secuencia cuando se alineen usando metodos convencionales.

“Polipeptido de dominio de MHC” se refiere a un dominio molecular de MHC diferenciado, por ejemplo un dominio ai o pi de una molecula de MHC de clase II.

Description detallada de realizaciones a modo de ejemplo de la invention

Los RTL modificados de la invencion comprenden un componente de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) que incorpora una o mas caracterlsticas estructurales de superficie redisenadas que se han introducido de manera recombinante en una secuencia de polipeptido de MHC por lo demas nativa. Normalmente, los RTL modificados de la invencion se disenan o se construyen de manera racional para introducir uno o mas cambios de aminoacido en un sitio diana expuesto a disolvente ubicado dentro de, o que define, una superficie de contacto de autounion encontrada en el polipeptido de MHC nativo.

La superficie de contacto de autounion que se altera en el RTL modificado normalmente comprende uno o mas residuo(s) de aminoacido que media(n) la autoagregacion de un polipeptido de MHC nativo, o de un RTL “no modificado” que incorpora el polipeptido de MHC nativo. Aunque la superficie de contacto de autounion esta correlacionada con la estructura primaria del polipeptido de MHC nativo, esta superficie de contacto solo puede aparecer como una caracterlstica de superficie que promueve la agregacion cuando el polipeptido nativo se alsla del complejo de MHC intacto y se incorpora en el contexto de un RTL “no modificado”.

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Por tanto, en determinadas realizaciones, la superficie de contacto de autounion solo pueden funcionar como un residuo o motivo expuesto a disolvente de un RTL no modificado una vez que el polipeptido nativo se alsla de uno o mas elemento(s) estructural(es) encontrados en una protelna de MHC intacta. En el caso de los RTL de MHC de clase II a modo de ejemplo descritos en el presente documento (por ejemplo, que comprende los dominios p1 y o1 unidos), la estructura de pioi nativa solo muestra determinados residuos o motivos de autounion expuestos a disolvente tras la elimination de los dominios de tipo plegamiento de Ig, p2 y 02 encontrados en el complejo de MHC II intacto. Estos mismos residuos o motivos que median la agregacion de RTL piol no modificados estan “enterrados” presumiblemente en una conformation inaccesible a disolvente o “enmascarados” de otro modo (es decir, se evita que medien en la autoasociacion) en el complejo de MHC II nativo o progenitor (probablemente a traves de la asociacion con los dominios de tipo plegamiento de Ig, p2 y 02).

Determinados RTL modificados de la invention incluyen una estructura de multiples dominios que comprende dominios de MHC de clase I o MHC de clase II seleccionados, o partes de multiples dominios de MHC que son necesarios para formar una superficie de contacto de TCR/reconocimiento de Ag minima (es decir, que pueda mediar union a Ag y reconocimiento de TCR). En determinadas realizaciones, el RTL modificado comprende una “superficie de contacto de TCR minima”, lo que significa un subconjunto minimo de residuos de dominio de MHC de clase I o MHC de clase II necesarios y suficientes para mediar la union a peptido funcional y el reconocimiento de TCR. El reconocimiento de TCR requiere que el RTL modificado pueda interaccionar con el TCR de una manera especifica de Ag para provocar una o mas respuestas de celulas T mediadas por TCR, tal como se describe en el presente documento.

En el caso de los RTL modificados derivados de moleculas de MHC de clase II humanas, los RTL comprenderan habitualmente dominios de polipeptido de MHC O y pi de una proteina de MHC de clase II, o partes de los mismos suficientes para proporcionar una superficie de contacto de TCR minima. Estos dominios o subpartes de los mismos pueden unirse covalentemente para formar un polipeptido monocatenario (sc) de MHC de clase II. Tales polipeptidos de RTL se denominan a continuation en el presente documento polipeptidos de MHC de clase II sc “oipi”. Pueden modelarse constructos de MHC sc equivalente a partir de proteinas de MHC de clase I humanas, por ejemplo para formar RTL que comprenden dominios o1 y 02 (o partes de los mismos suficientes para proporcionar una superficie de contacto de TCR minima) de una proteina de MHC de clase I, en los que el RTL esta opcionalmente “vacio” o asociado con un Ag que comprende un epitopo de celulas T CD8+.

Se ha mostrado que los constructos de RTL que comprenden componentes de MHC sc son ampliamente utiles para aplicaciones tales como prevenir y tratar respuestas de enfermedad autoinmunitaria inducida por Ag en sujetos modelo de mamiferos predictivos de actividad terapeutica de enfermedad autoinmunitaria en seres humanos (Burrows et al., J. Immunol. 161:5987, 1998; Burrows et al., J. Immunol. 164:6366, 2000). En otros aspectos, se ha demostrado que estos tipos de RTL inhiben la activation de celulas T e inducen la secretion de citocina antiinflamatoria (por ejemplo, IL-10) en clones de celulas T restringidos por DR2 humanos especificos para el peptido MBP- 85-95 o BCR-ABL b3a2 (CABL) (Burrows et al., J. Immunol. 167:4386, 2001; Chang et al., J. Biol. Chem. 276:24170, 2001).

Los inventores de la presente solicitud han disenado y han sometido a prueba constructos de RTL adicionales, que incluyen un constructo MOG-35-55/DR2 (VG312) que se ha mostrado que inhibe de manera potente las respuestas autoinmunitarias y conduce a tolerancia inmunologica al peptido MOG-35-55 encefalitogenico y signos de clinicos e histologicos de inversion de EAE (Vandenbark et al., J. Immunol. 171:127-33, 2003). Numerosos constructos de RTL adicionales que son utiles para modular respuestas inmunitarias de celulas T y que pueden emplearse dentro de la invencion, estan disponibles para su uso dentro de los metodos y composiciones de la invencion (vease, por

ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.270.772, expedida el 7 de agosto de 2001; la solicitud de patente

provisional estadounidense n.° 60/064.552, presentada el 16 de septiembre de 1997; la solicitud de patente

provisional estadounidense n.° 60/064.555, presentada el 16 de septiembre de 1997; la solicitud de patente

provisional estadounidense n.° 60/200.942, presentada el 1 de mayo de 2000; la solicitud de patente provisional estadounidense titulada MONOMERIC RECOMBINANT MHC MOLECULES USEFUL FOR MANIPULATION OF ANTIGEN-SPECIFIC T-CELLS, presentada por Burrows et al. el 5 de septiembre de 2003 e identificada por el expediente del apoderado n.° 49321-98; la solicitud de patente estadounidense n.° 09/153.586; presentada el 1 de mayo de 2001; la solicitud de patente estadounidense n.° 09/847.172; presentada el 1 de mayo de 2001; y la solicitud de patente estadounidense n.° 09/858.580; presentada el 15 de mayo de 2001, incorporadas cada una al presente documento como referencia).

Para evaluar la funcion biologica y los mecanismos de action de los RTL modificados de la invencion, se han usado celulas T especificas de antigeno que portan TCR relacionados como celulas T diana para diversos ensayos (vease, por ejemplo, Burrows et al., J. Immunol. 167:4386, 2001). Mas recientemente, los inventores de la presente solicitud han proporcionado hibridomas de celulas T novedosos que estan adaptados unicamente para su uso en examenes y ensayos para identificar y caracterizar la estructura y la funcion de RTL (vease, por ejemplo, la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 60/586.433, presentada el 7 de julio; y Chou et al., J. Neurosci. Res. 77: 670-680, 2004). Para poner en practica estos aspectos de la invencion, se construyen y se seleccionan hibridos de celulas T

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que muestran una respuesta proliferativa mediada por TCR especlfica de Ag tras el contacto del hlbrido con una APC y Ag relacionados. Esta respuesta proliferativa de hlbridos de T puede inhibirse o estimularse a su vez de manera detectable poniendo en contacto el hlbrido de celulas T con un RTL modificado de interes, lo que produce una respuesta de proliferacion mediada por TCR, especlfica de Ag, modificada del hlbrido. La respuesta de proliferacion modificada de la celula hlbrida indica de manera exacta y reproducible una presencia, cantidad y/o nivel de actividad del RTL modificado en contacto con el hlbrido de celulas T.

El componente de MHC del RTL puede proporcionarse como un RTL “vacio”, o puede asociarse mediante union no covalente o enlace covalente con un Ag de peptido seleccionado. Normalmente, el Ag de peptido comprende uno o mas determinante(s) antigenico(s) de una protelna autoantigenica, por ejemplo uno o mas epltopo(s) inmunodominante(s) de celulas T CD4+ asociado(s) con una enfermedad autoinmunitaria seleccionada (por ejemplo, un epltopo inmunodominante de protelna basica de mielina (MBP) o protelna oligodendrocltica de mielina (MOG) implicada en EM).

Dentro de determinadas realizaciones de la invention, un RTL recombinante modificado, aislado que tiene un potencial reducido para agregarse en disolucion, comprende un “componente de MHC” en forma de un polipeptido monocatenario (sc) que incluye multiples elementos de dominio de MHC unidos covalentemente. Estos elementos de dominio normalmente se seleccionan de a) dominios a1 y p1 de un polipeptido de MHC de clase II, o partes de los mismos, que comprende una superficie de contacto de cavidad de union a Ag/receptor de celulas T (TCR); o b) dominios a1 y 02 de un polipeptido de MHC de clase I, o partes de los mismos, que comprenden una superficie de contacto de cavidad de union a Ag/TCR. El componente de MHC del RTL esta modificado por una o mas sustituciones, adiciones, deleciones o transposiciones de aminoacido en un sitio diana correspondiente a una “superficie de contacto de autounion” identificada en un componente de polipeptido de MHC nativo de un RTL no modificado. El RTL modificado muestra una propension marcadamente reducida para agregarse en disolucion en comparacion con la agregacion mostrada por un RTL control, no modificado que tiene la misma estructura fundamental de componente de MHC, pero que incorpora el polipeptido de MHC nativo que define la superficie de contacto de autounion.

Tal como se usa en el presente documento, “polipeptido de MHC nativo” se refiere a polipeptidos de MHC que se producen de manera natural, intactos, as! como a fragmentos, dominios, conjugados u otros derivados de polipeptidos de MHC modificados por ingenierla genetica o sinteticos que tienen una secuencia de aminoacidos identica o altamente conservada en comparacion con una secuencia alineada en el polipeptido de MHC que se produce de manera natural (por ejemplo, marcado por una identidad de aminoacidos del 85%, el 90%, el 95% o mayor a lo largo de un tramo alineado de residuos correspondientes). El “polipeptido de MHC nativo” que tiene la superficie de contacto de autoasociacion sera a menudo un dominio de polipeptido de MHC incorporado dentro de un RTL no modificado, y la superficie de contacto de autoasociacion puede estar presente solo en tal contexto, en contraposition a cuando el polipeptido de MHC nativo esta presente en una protelna de MHC nativa, completamente intacta (por ejemplo, en un complejo de protelna heterodimerica de MHC de clase II).

Por tanto, en el caso de RTL de MHC de clase II, la elimination de los dominios p2 y 02 para crear una estructura de dominio mas pequena, mas util (por ejemplo, pial) para el RTL (que comprende una superficie de contacto de TCR minima) da como resultado el “desenmascaramiento” (es decir, hacer que queden expuestos a disolvente) de determinados residuos o motivos de autounion que comprenden sitios diana para modification de RTL segun la invencion. Estos residuos o motivos desenmascarados pueden alterarse facilmente, por ejemplo mediante mutagenesis dirigida al sitio, para reducir o eliminar la agregacion y hacer que el RTL sea un reactivo mas altamente monodisperso en disolucion acuosa.

Para evaluar el grado de monodispersion de estos RTL modificados, puede emplearse un RTL no modificado o “control” que tiene la misma construction de polipeptido basica que el RTL modificado, pero caracteristicas de la secuencia de polipeptido de MHC nativo (que tiene uno o mas residuos de aminoacido o motivos que comprenden la superficie de contacto de autounion y que definen el sitio diana expuesto a disolvente para la modificacion cuando el polipeptido nativo se incorpora en el rTl).

Los RTL modificados de la invencion producen un porcentaje aumentado de moleculas monodispersas en disolucion en comparacion con un RTL no modificado correspondiente (es decir, que comprende el polipeptido de MHC nativo y que portan la superficie de contacto de autounion, no modificada). En determinadas realizaciones, el porcentaje de RTL no modificado presente como especie monodispersa en disolucion acuosa puede ser de tan solo el 1%, mas normalmente el 5-10% o menos de la proteina RTL total, encontrandose el equilibro del RTL no modificado en forma de agregados de orden superior. En cambio, los RTL modificados de la presente invencion produciran al menos el 10%-20% de especies monodispersas en disolucion. En otras realizaciones, el porcentaje de especies monomericas en disolucion oscilara entre el 25%-40%, a menudo el 50%-75%, hasta el 85%, el 90%, el 95% o mayor del RTL total presente, con una reduccion proporcional en el porcentaje de especies de RTL agregadas en comparacion con las cantidades observadas para los RTL no modificados correspondientes en condiciones comparables.

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La superficie de contacto de autounion que se altera en el polipeptido de MHC para formar el RTL modificado puede comprender residuos de aminoacido individuales o multiples, o una region, dominio o motivo definido del polipeptido de MHC, que se caracteriza por una capacidad para mediar la autounion o autoasociacion del polipeptido de MHC y/o RTL. Tal como se usa en el presente documento, “autounion” y “autoasociacion” se refieren a cualquier union o asociacion intermolecular que promueve la del polipeptido de MHC o RTL en una disolucion fisiologicamente compatible, tal como agua, solucion salina o suero.

Tal como se observo anteriormente, las moleculas de MHC de clase II comprenden cadenas de polipeptido a y pasociadas no covalentemente. La cadena acomprende dos dominios distintos denominados a1 y 02. La cadena fb tambien comprende dos dominios, p1 y p2. La cavidad de union a peptido del MHC de clase II esta formada por la interaccion de los dominios a1 y p1. Los peptidos del antlgeno procesado se unen a moleculas de MHC en la cavidad distal a la membrana formada por los dominios pi y a1 (Brown et al., 1993; Stem et al., 1994). El analisis estructural de los complejos MHC de clase II/peptido (Brown et al., Nature 364:33-39, 1993; Stem et al., Nature 368:215, 1994) demuestra que las cadenas laterales del peptido unido interaccionan con “cavidades” que estan compuestas por residuos polimorficos dentro de la cavidad de union de clase II. Los peptidos unidos tienen motivos especlficos de alelo de clase II, caracterizados por fuertes preferencias por aminoacidos especlficos en posiciones que anclan el peptido a la cavidad de union y una amplia tolerancia para una variedad de diferentes aminoacidos en otras posiciones (Stem et al., Nature 368:215, 1994; Rammensee et al., Immunogenetics 41: 178, 1995). Basandose en estas propiedades, las poblaciones naturales de moleculas de MHC de clase II son altamente heterogeneas. Un alelo dado de moleculas de clase II sobre la superficie de una celula tiene capacidad para unirse a y presentar mas de 2000 peptidos diferentes. Ademas, los peptidos unidos se disocian de las moleculas de clase II con constantes de velocidad muy lentas. Por tanto, ha sido diflcil generar u obtener poblaciones homogeneas de moleculas de clase II unidas a peptidos antigenicos especlficos.

Los dominios 02 y p2 de moleculas de MHC de clase II comprenden distintos dominios de plegamiento de Ig transmembrana que anclan las cadenas ay pen la membrana de la APC. Ademas, se notifica que el dominio 02 contribuye a la oligomerizacion ordenada durante la activacion de las celulas T (Konig et al., J. Exp. Med. 182:778787, 1995), mientras que se notifica que el dominio p2 contiene un sitio de union de CD4 que se une conjuntamente a CD4 cuando el complejo MHC-antlgeno interacciona con el heterodlmero ap de TCR (Fleury et al., Cell 66:10371049, 1991; Cammarota et al., Nature 356:799-801, 1992; Konig et al., Nature 356:796-798, 1992; Huang et al., J. Immunol. 158:216-225, 1997).

Los RTL modelados segun moleculas de MHC de clase II para su uso dentro de la invencion normalmente comprenden moleculas pequenas (por ejemplo, de aproximadamente 200 residuos de aminoacido) que comprenden todos o parte de los dominios a1 y p1 de moleculas humanas y no humanas de MHC de clase II, que normalmente se unen geneticamente a una unica cadena de polipeptido (con y sin peptido antigenico acoplado covalentemente). A modo de ejemplo, las moleculas “P1a1” derivadas de MHC de clase II conservan las propiedades bioqulmicas requeridas para la union a peptido y el acoplamiento de TCR (incluyendo union de TCR y/o activacion de TCR parcial o completa). Esto proporciona la produccion facil de grandes cantidades de RTL modificados por ingenierla genetica para la caracterizacion estructural y aplicaciones inmunoterapicas. El componente de MHC de RTL de MHC de clase II comprende una superficie de contacto de union a Ag/reconocimiento de celulas T minima, que puede comprender todos o parte de los dominios a1 y p1 del MHC de clase II de una molecula de MHC de clase II seleccionada. Estos RTL se disenan usando el esqueleto estructural de las moleculas de MHC de clase II como molde. La caracterizacion estructural de los RTL usando dicrolsmo circular indica que estas moleculas conservan una plataforma de lamina pantiparalela y helices aantiparalelas observadas en el heterodlmero de MHC de clase II nativo (es decir, secuencia de tipo natural) correspondiente. Estos RTL tambien muestran una transicion de plegamiento-desplegamiento termica de dos estados cooperativos. Cuando el RTL se une covalentemente con el peptido Ag a menudo muestran estabilidad aumentada a desplegamiento termico en relacion con moleculas de RTL vaclas.

En realizaciones a modo de ejemplo de la invencion, el diseno de RTL se basa de manera racional en coordenadas cristalograficas de protelnas HLA-DR, HLA-DQ y/o HLA-DP humanas, o de una protelna de MHC de clase II no humana (por ejemplo, murina o de rata). En este contexto, se han disenado RTL a modo de ejemplo basandose en datos cristalograficos para HLA DR1 (codigo de acceso de PDB, 1AQD), cuyos parametros de diseno ya se han aclarado, por ejemplo, mediante alineacion de secuencias con otras moleculas de MHC de clase II de especies de rata, ser humano y raton. El programa Sybilo (Tripos Associates, St Louis, MO) es una herramienta de diseno a modo de ejemplo que puede usarse para generar imagenes graficas usando, por ejemplo, una estacion de trabajo O2 (Silicon Graphics, Mountain View, CA) y coordenadas obtenidas para moleculas de HLA-DR, HLA-DQ y/o HLA- DP. Se proporcionan amplias caracterizaciones cristalograficas para estas y otras protelnas de MHC de clase II depositadas en el banco de datos de protelnas de Brookhaven (Brookhaven National Laboratories, Upton, NY).

Una descripcion detallada de las estructuras cristalinas de HLA-DR para su uso en el diseno y la construction de RTL modificados de la invencion se proporciona, por ejemplo, en Ghosh et al., Nature 378:457, 1995; Stem et al., Nature 368:215, 1994; Murthy et al., Structure 5:1385, 1997; Bolin et al., J. Med. Chem. 43:2135, 2000; Li et al., J.

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Mol. Biol. 304:177, 2000; Hennecke et al., Embo J. 19:5611, 2000; Li et al., Immunity 14:93,2001; Lang et al., Nat. Immunol. 3:940, 2002; Sundberg et al., J. Mol. Biol. 319:449, 2002; Zavala-Ruiz et al., J. Biol. Chem. 278:44904, 2003; Sundberg et al., Structure 11:1151, 2003. Una descripcion detallada de las estructuras cristalinas de HLA-DQ se proporciona, por ejemplo, en Sundberg et al., Nat. Struct. Biol. 6:123, 1999; Li et al., Nat. Immunol. 2:501, 2001; y Siebold et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101:1999, 2004. Una descripcion detallada de una molecula de MHC I-AU murina se proporciona, por ejemplo, en He et al., Immunity 17:83,2002. Una descripcion detallada de una molecula de MHC de clase II I-Ad murina se proporciona, por ejemplo, en Scott et al., Immunity 8 :319, 1998. Una descripcion detallada de una molecula de MHC de clase II I-Ak murina se proporciona, por ejemplo, en Reinherz et al., Science 286:1913, 1999, y Miley et al., J. Immunol. 166:3345, 2001. Una descripcion detallada de un alelo I-A(G7) de MHC murino se proporciona, por ejemplo, en Corper et al., Science 288:501, 2000. Una descripcion detallada de una molecula de MHC de clase II H2-M murina se proporciona, por ejemplo, en Fremont et al., Immunity 9:385, 1998. Una descripcion detallada de una molecula de MHC de clase II H2-Iep murina se proporciona, por ejemplo, en Krosgaard et al., Mol. Cell 12:1367, 2003. Una descripcion detallada de una molecula de MHC de clase II I-Ab murina se proporciona, por ejemplo, en Zhu et al., J. Mol. Biol. 326:1157,2003. HLA-DP Lawrance et al., Nuclei Acids Res. 25 de octubre de 1985; 13(20): 7515-7528.

El modelado por homologla basado en la estructura se basa en coordenadas cristalograficas refinadas de una o mas moleculas de MHC de clase I o clase II, por ejemplo, una molecula de DR humana y una molecula de I-Ek murina. En un estudio a modo de ejemplo realizado por Burrows y colegas (Protein Engineering 12:771-778, 1999), se alinearon las secuencias primarias de MHC de clase II de rata, ser humano y raton, a partir de lo cual se determino que 76 de los 256 aminoacidos de la cadena oeran identicos (el 30%), y que 93 de los 265 aminoacidos de la cadena p eran identicos (el 35%). De particular interes, se conservo la ubicacion en la secuencia primaria de cistelnas de union de disulfuro en las tres especies y restos del esqueleto de las estructuras resueltas que mostraron fuerte homologla cuando se superponlan, lo que implicaba un motivo estructural conservado evolutivamente, con sustituciones de cadena lateral disenadas para permitir la union a peptido antigenico diferencial en la hendidura de union a peptido.

El analisis adicional de moleculas de MHC de clase I y clase II para construir los RTL modificados de la invencion se centra en la superficie “expuesta” (es decir, accesible a disolvente) de la plataforma de lamina p/helice oantiparalela que comprende el/los dominio(s) implicado(s) en la union a peptido y el reconocimiento de celulas T. En el caso de las moleculas de MHC de clase II, los dominios o1 y p1 muestran una amplia red de enlaces de hidrogeno y un nucleo hidrofobo estrechamente empaquetado y “enterrado” (es decir, inaccesible a disolvente). Esta estructura terciaria es similar a las caracterlsticas moleculares que confieren integridad estructural y estabilidad termodinamica a la caracterlstica de soporte de helice ct/lamina p de las toxinas de escorpion, que por tanto presentan indicios estructurales todavla adicionales para guiar el diseno racional de los RTL modificados en el presente documento (vease, por ejemplo, Zhao et al., J. Mol. Biol. 227:239, 1992; Housset, J. Mol. Biol. 238:88-91, 1994; Zinn-Justin et al., Biochemistry 35:8535-8543, 1996).

A partir de estas y otras fuentes de datos comparativos, se ha encontrado que los cristales de moleculas de MHC de clase II nativas contienen varias moleculas de agua entre una superficie proximal a la membrana de la plataforma de lamina by una superficie distal a la membrana de los dominios de plegamiento de Ig 02 y p2. Los calculos respecto al area superficial de interaccion entre dominios pueden cuantificarse creando una superficie molecular, por ejemplo para los dominios de plegamiento de Ig p1o1 y o2.p2 de una molecula de MHC II, usando un algoritmo tal como el descrito por Connolly (Biopolymers 25:1229-1247, 1986) y usando coordenadas cristalograficas (por ejemplo, tal como se proporciona para diversas moleculas de MHC de clase II en la base de datos de protelnas de Brookhaven.

Para una molecula de MHC de clase II DR1 humana a modo de ejemplo (numeros de acceso de PDB 1 SEB, 1AQD), se calcularon independientemente las areas superficiales de los dominios de plegamiento de Ig p1o1 y o!2p2, definidas por la accesibilidad a una sonda de radio 0,14 nm, aproximadamente el tamano de una molecula de agua (Burrows et al., Protein Engineering 12:771-778, 1999). El area superficial del heterodlmero de MHC de clase II op fue de 156 nm2, mientras que la del constructo p1o1 fue de 81 mm2 y la de los dominios de plegamiento de Ig 02p2 fue de 90 nm2. Se encontro que aproximadamente 15 mm2 (el 18,5%) de la superficie de p1o1 estaban enterrados por la superficie de contacto con los dominios de plegamiento de Ig en el heterodlmero de MHC de clase II op. Se analizaron las interacciones de cadenas laterales entre los dominios de union a peptido p1o1 y de plegamiento de Ig (02 y p2) y se mostro que estaban dominadas por interacciones polares, sirviendo las interacciones hidrofobas potencialmente como “lubricante” en una superficie de contacto de tipo “esfera y cavidad” altamente flexible.

Estos estudios de modelado y otros relacionados sugieren que el dominio de union a antlgeno de las moleculas de MHC de clase II permanece estable en ausencia de los dominios de plegamiento de Ig 02 y p2, y esta produccion se ha confirmado por la produccion de numerosos RTL, a modo de ejemplo, que comprenden una arquitectura de MHC de clase II “o1p1”. Burrows et al. (J. Immunol. 161:5987-5996, 1998) describieron hallazgos relacionados para un RTL p1o1 “vaclo” y cuatro constructos de RTL o1p1 con peptidos antigenicos de rata y cobaya acoplados covalentemente: p1 1-Rt-MBP-72-89, p1 1-Gp-MBP-72-89, p1 1-Gp-MBP-55-69 y p1 1-Rt-CM-2. Para cada uno de

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estos constructos, se demostro la presencia de enlaces disulfuro nativos entre cistelnas (B 15 y b9) mediante ensayo de desplazamiento en gel con o sin el agente reductor bmercaptoetanol (b-ME). En ausencia de b-ME, los enlaces disulfuro se conservan y las protelnas de RTL normalmente se mueven a traves de geles de acrilamida mas rapido debido a su estructura mas compacta. Estos datos, junto con hallazgos inmunologicos usando anticuerpos monoclonales especlficos frente a MHC de clase II para marcar epltopos conservados en los RTL, generalmente afirman la integridad conformacional de las moleculas de RTL en comparacion con sus homologos de MHC II nativos (Burrows et al., 1998, citado anteriormente; Chang et al., J. Biol. Chem. 276:24170-14176, 2001; Vandenbark et al., J. Immunol. 171:127-133, 2003). De manera similar, estudios de dicrolsmo circular (DC) de RTL derivados de MHC de clase II revelan que las moleculas de p1o(\ tienen estructuras secundarias altamente ordenadas. Normalmente, los RTL de esta construccion general compartlan la estructura secundaria de plataforma de lamina b/helice a antiparalela comun a todos los dominios de union a antlgeno de clase II. En este contexto, se ha encontrado que las moleculas b1o1 contienen, por ejemplo, aproximadamente el 30% de helices o, el 15% de cadenas b el 26% de giros by el 29% de estructurales helicoidales al azar. Los RTL unidos covalentemente al peptido Ag (por ejemplo, MBP-72-89, y CM-2) muestran caracterlsticas estructurales secundarias similares, aunque no identicas. Estudios de desnaturalizacion termica revelan un alto grado de cooperatividad y estabilidad de las moleculas de RTL, y se ha demostrado la integridad biologica de estas moleculas en numerosos contextos, incluyendo mediante la capacidad de RTL seleccionados para detectar e inhibir celulas T encefalitogenicas de rata y para tratar la encefalomielitis autoinmunitaria experimental.

Segun estos hallazgos y otros relacionados proporcionados en el presente documento (o descritos en la referencias citadas que se incorporan colectivamente en el presente documento para todos los fines de descripcion), los constructos de RTL de la invencion, con o sin un peptido antigenico asociado, conservan la integridad estructural y conformacional que concuerda con la de las moleculas de MHC nativas replegadas. Este hallazgo general se ejemplifica mediante los resultados para moleculas de RTL monocatenarias solubles derivadas de la superficie de contacto de union a antlgeno/TCR compuestas por todos o partes de los dominios de MHC de clase II b1 y o1. En realizaciones mas detalladas, estos RTL de MHC de clase II, a modo de ejemplo, carecen del dominio 02 y el dominio b2 de la protelna de MHC de clase II nativa correspondiente, y normalmente tambien excluyen las secuencias transmembrana e intracitoplasmaticas encontradas en la protelna de MHC II nativa. El tamano reducido y la complejidad de estos constructos de RTL, ejemplificados por los constructos de RTL del MHC II “b1o1”, proporcionan una expresion y purificacion de las moleculas de RTL facil y predecible a partir de cuerpos de inclusion bacterianos con alto rendimiento (por ejemplo, hasta 15-30 mg/l de cultivo celular o rendimiento mayor).

En las moleculas de MHC de clase II nativas, el dominio de union a peptido/reconocimiento de celulas T esta formado por partes bien definidas de los dominios a1 y b1 de los polipeptidos ay b que se pliegan juntos para formar una estructura terciaria, descrita de la manera mas sencilla como una plataforma de lamina bsobre la que dos segmentos helicoidales antiparalelos interaccionan para formar una hendidura de union a antlgeno. Se forma una estructura similar mediante un unico exon que codifica para los dominios o1 y 02 de moleculas de MHC de clase I, con la excepcion de que la hendidura de union a peptido del MHC de clase II tiene los extremos abiertos, permitiendo la modificacion por ingenierla genetica de constructos de un unico exon que codifican para el dominio de union a peptido/reconocimiento de celulas T y un ligando de peptido antigenico.

Tal como se ejemplifica en el presente documento para las protelnas de MHC de clase II, los estudios de modelado destacaron importantes caracterlsticas respecto a la superficie de contacto entre los dominios de plegamiento de Ig b1o1 y 02b2 que han demostrado ser crlticos para disenar los RTL monodispersos, modificados de la invencion. Los dominios o1 y b1 muestran una amplia red de enlaces de hidrogeno y un nucleo hidrofobo estrechamente empaquetado y “enterrado” (es decir, inaccesible a disolvente). La parte b1o1 de las protelnas de MHC de clase II puede tener la capacidad para moverse como una unica entidad independiente de la “plataforma” de plegamiento de Ig 02b Ademas de la evidencia de un alto grado de movilidad en las cadenas laterales que constituyen las regiones de ligador entre estos dos dominios, los cristales de MHC de clase II I-Ek contenlan varias moleculas de agua dentro de esta superficie de contacto (Jardetzky et al., Nature 368: 711-715, 1994; Fremont et al., Science 272:1001-1004, 1996; Murthy et al., Structure 5:1385, 1997). La superficie de contacto entre los dominios de plegamiento de Ig b1 o1 y 02b parece estar dominada por interacciones polares, con residuos hidrofobos que sirven probablemente como “lubricante”en una superficie de contacto de tipo “bola y cavidad” altamente flexible. Puede requerirse flexibilidad en esta superficie de contacto para la libertad de movimiento dentro de los dominios o1 y b1 para la union/intercambio de antlgeno de peptido. Alternativamente o en combination, esta superficie de interaction puede desempenar un papel en comunicar information sobre la interaccion molecular MHC de clase II-peptido con tCr de vuelta a la APC.

Siguiendo estas directrices y parametros de diseno racional, los presentes inventores han modificado satisfactoriamente por ingenierla genetica derivados monodispersos de RTL humanos unicatenarios que comprenden partes de union a peptido/reconocimiento de TCR de moleculas de MHC de clase II humanas (por ejemplo, tal como se ejemplifica, mediante HLA-DR2b (DRA*0101/DRB1*1501). Los RTL no modificados construidos a partir de los dominios o1 y b1 de esta molecula de MHC de clase II, a modo de ejemplo, conservaban la actividad biologica, pero se formaban agregados de orden de orden superior, no deseados, en disolucion.

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Para resolver el problema de la agregacion en este RTL no modificado a modo de ejemplo, se dirigio mutagenesis dirigida al sitio hacia la sustitucion de residuos hidrofobos por residuos polares (por ejemplo, serina) o cargados (por ejemplo, acido aspartico) para modificar la plataforma de lamina p de los RTL derivados de DR2. Segun este procedimiento de diseno racional, se obtuvieron variantes de RTL novedosas que se determino que eran predominantemente monomericas en disolucion. La cromatografla de exclusion molecular y la dispersion de luz dinamica demostraron que los RTL modificados novedosos eran monomericos en disolucion, y la caracterizacion estructural usando dicrolsmo circular demostro una estructura secundaria altamente ordenada de los RTL.

Se cuantifico la union de peptidos a estos RTL modificados “vaclos” usando peptidos biotinilados, y estudios funcionales mostraron que los RTL modificados que contienen peptidos fijados covalentemente podlan inhibir la proliferacion especlfica de antlgeno de celulas T in vitro, as! como suprimir la encefalomielitis autoinmunitaria experimental in vivo. Estos estudios demostraron que los RTL que codifican para el dominio de union a Ag/reconocimiento de TCR de moleculas de MHC de clase II son de manera innata estructuras muy robustas. Pese a la modificacion de los RTL tal como se describe en el presente documento, que comprende mutaciones dirigidas al sitio que modifican la plataforma de lamina pdel RTL, estas moleculas conservaban una actividad biologica potente de manera separada de los dominios de plegamiento de Ig de la estructura de clase II progenitora, y mostraban una reduccion novedosa y sorprendente en la agregacion en disoluciones acuosas. Los RTL modificados que tenlan estas y otras caracterlsticas de superficie redisenadas y caracterlsticas monodispersas, conservaban la capacidad de unirse a peptidos Ag, inhibir la proliferacion de celulas T de una manera especlfica de Ag, y tratar, entre otras, la enfermedad autoinmunitaria in vivo.

Pueden introducirse modificaciones adicionales aparte de las modificaciones de caracterlstica de superficie anteriores en los RTL modificados de la invencion, incluyendo particularmente modificaciones minoritarias en la(s) secuencia(s) de aminoacidos del componente de MHC del rTl que es probable que produzcan poco o ningun cambio en la actividad de la molecula de RTL derivada o “variante”. Las variantes preferidas de polipeptidos de dominio de MHC no agregantes que comprenden RTL modificados se caracterizan normalmente por poseer una identidad de secuencia de al menos el 50% calculada a lo largo de la alineacion de longitud completa con la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de dominio de MHC no agregante particular, usando Gapped BLASTP, Blast 2.0 del NCBI, configurado para parametros por defecto. Las protelnas con incluso mayor similitud con las secuencias de referencia mostraran identidades en porcentaje crecientes cuando se evaluen mediante este metodo, tal como una identidad de secuencia de al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 95%. Cuando se compara menos de la secuencia completa para determinar la identidad de secuencia, las variantes normalmente poseeran una identidad de secuencia de al menos el 75% a lo largo de intervalos cortos de 10-20 aminoacidos, y pueden poseer identidades de secuencia de al menos el 85% o al menos el 90% o el 95% dependiendo de su similitud con la secuencia de referencia. Se conocen en la tecnica metodos para determinar la identidad de secuencia a lo largo de tales intervalos cortos tal como se describio anteriormente. Las variantes de RTL modificados que comprenden polipeptidos de dominio de MHC no agregantes tambien conservan la actividad biologica del RTL modificado no variante. Para los fines de esta invencion, esa actividad puede someterse a ensayo convenientemente incorporando la variacion en el componente de MHC apropiado de un RTL modificado (por ejemplo, un componente de MHC p1a1) y determinando la capacidad del complejo RTL/Ag resultante para inhibir la proliferacion especlfica de Ag de celulas T in vitro, tal como se describe en el presente documento.

Mutaciones disenadas racionalmente convirtieron complejos de ligandos de receptores de celulas T recombinantes humanos en monomeros que conservan la actividad biologica

Los solicitantes en el presente documento demuestran y dan a conocer que la actividad biologica potente de RTL particulares (Burrows et al., J. Immunol. 167:4386-95; 2001; Wang et al., The Journal of Immunology, 2003; Vandenbark et al., Journal of Immunology, 2003) se conservaba cuando se produclan en forma monomerica, con la capacidad para inhibir la proliferacion de celulas T in vitro. Es extremadamente importante desde un punto de vista cllnico que la forma monomerica pueda invertir los signos cllnicos de EAE e inducir tolerancia de celulas T a largo plazo contra el peptido MOG-35-55 encefalitogenico, restringido por DR2, en ratones Tg que expresan unicamente este alelo HLA-DR2 asociado con esclerosis multiple.

Estudios anteriores de los solicitantes hablan demostrado que la inmunizacion de ratones Tg-DR2 con el peptido MOG-35-55 inducla fuertes respuestas de celulas T, lesiones de medula espinal perivascular con desmielinizacion, y signos cronicos graves de EAE, as! como anticuerpos anti-MOG que aparentemente no estaban implicados ni en la enfermedad ni en la induction a tolerancia (Vandenbark et al., Journal of Immunology, 2003).

Tal como se da a conocer en el presente documento, el tratamiento de los ratones Tg-DR2 tras el comienzo de EAE cllnica con un ciclo de 8 dlas de inyecciones i.v. diarias de 33 mg de RTL342 invirtio la progresion de la enfermedad hasta niveles iniciales y mantuvo la actividad cllnica reducida incluso tras el cese de inyecciones adicionales. El tratamiento con RTL303 control que contenla MBP-87-99 fijado covalentemente no inhibio la EAE ni afecto a las respuestas de celulas T al peptido MOG-35-55, demostrando especificidad de antlgeno.

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De manera significativa, las ensenanzas de los solicitantes son las primeras en documentar que los RTL monomericos tienen tal actividad clmica potente y que las moleculas son adecuadas para la evaluation para su uso en ensayos clinicos con seres humanos para el tratamiento de la esclerosis multiple.

El dominio de union a peptido/reconocimiento de TCR del MHC de clase II del que se derivan los RTL contiene una mezcla compleja de estructura secundaria de helice alfa y lamina beta, asi como una modification postraducional altamente conservada, un enlace disulfuro entre cisteinas en la position 16 y 80 (numeration de RTL302). Estas moleculas son lo suficientemente pequenas como para examinarlas sistematicamente con la tecnologia disponible actualmente, aunque lo suficientemente complejas como para que la modificacion por ingenieria genetica satisfactoria de otras moleculas y derivados de MHC, abarcando las moleculas y derivados de HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP, requiera la aplicacion de los hallazgos y conceptos de ingenieria genetica de proteinas novedosos dados a conocer en el presente documento.

Las moleculas de MHC de clase II tienen (al menos) tres “funciones” bioquimicas claramente definidas que pueden usarse para evaluar y cuantificar la conservation de un plegamiento tridimensional especifico derivado de la secuencia primaria: union a peptido Ag, union a TCR y union a CD4. Sin querer restringirse a la teoria, los solicitantes plantearon la hipotesis de que estas funciones se han codificado y estan superpuestas sobre la secuencia primaria del MHC de clase II, y que algunas de estas funciones pueden separarse experimentalmente para su evaluacion usando modificacion genetica de proteinas (Burrows et al., Protein Engineering 12:771-78, 1999; Chang et al., J. Biol. Chem. 276:24170-76, 2001).

Para los fines de la presente invention, es deseable conservar dos funciones bioquimicas clave: la capacidad para unirse especificamente a peptidos Ag; y la capacidad para unirse a las cadenas heterodimericas ap del TCR. La conservacion de estas caracieristicas clave permite la distincion de la superficie de contacto de interaction minima con la celula T que todavia inicia una senal de information de rendimiento (Wang et al., The Journal of Immunology, 2003), permitiendo la modificacion por ingenieria genetica de un sistema molecular para controlar las celulas T CD4+ de una manera especifica de Ag.

Aunque los RTL derivados de HLA-DR2 con la secuencia de tipo natural conservaban estas dos actividades biologicas clave (Vandenbark et al., Journal of Immunology, 2003), tendian a formar estructuras de orden superior (Burrows et al., J. Immunol 167: 4386-95, 2001) que no podian eliminarse completamente manipulando las condiciones de disolvente. Por ejemplo, se obtuvo un rendimiento optimo de RTL302 monomerico monodisperso de casi el 20% disminuyendo la concentration de proteina RTL302 purificada hasta 0,1 mg/ml para la etapa de plegamiento final, y cambiando los tampones de solucion salina tamponada con fosfato a Tris. Sin embargo, la concentracion del monomero de RTL302 purificado por encima de 0,2 mg/ml hizo que las moleculas volvieran a repartirse en una mezcla de monomero y agregado, un equilibrio que era dependiente de la concentracion. Segun la presente invencion, la agregacion de RTL derivados de HLA-DR2 es especifica de determinadas partes de la secuencia de RTL derivado de DR2.

Una estructura cristalina con 2,6 angstroms de resolution de HLA-DR2 con peptido Ag MBP-85-99 unido (acceso de PDB 1BX2; (Smith et al., J. Exp. Med. 188:1511-20, 1998)), proporciono datos suficientes para permitir el analisis en el presente documento de la superficie proximal a la membrana de la plataforma de lamina p y las superficies distales a la membrana de los dominios de plegamiento de Ig 02 y p2, identificando especificamente las caracteristicas que contribuyen a estructuras o agregacion de orden superior cuando los dominios de MHC II objeto se incorporan en un RTL no modificado. Especificamente, segun la presente invencion, la plataforma de lamina p enterrada en la molecula de HLA-DR2 progenitora define la parte inferior de los RTL, y contiene varios residuos hidrofobos que normalmente se encuentran enterrados dentro de una estructura de proteina en lugar de exponerse a disolvente.

Se ha investigado intensamente la propension de diferentes residuos de aminoacido a estar presentes en estructuras de lamina p (Minor et al., Nature 367:660-63, 1994; Pokkuluri et al., Protein Science 11:1687-94, 2002; Street et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9074-76; 1999; Chou et al., Biochemistry 13:211-22, 1973; Smith et al., Biochemistry 33:5510-17, 1994; Finkelstein, Protein Engineering 8:207-09, 1995), como parte de un objetivo global de comprender las reglas que rigen la estabilidad y formacion de la estructura secundaria. Los trabajos disponibles han definido la preferencia marcadamente alta de laminas Ppara los aminoacidos ramificados en pisoleucina, valina y treonina, asi como para los residuos de aminoacido aromaticos fenilalanina y tirosina.

Segun la presente invencion, la modificacion de superficie deseada de un RTL que comprende un componente de MHC de clase II para producir una forma mucho menos propensa a la agregacion puede lograrse, por ejemplo, mediante la sustitucion de uno o mas residuos hidrofobos identificados en la plataforma de lamina pdel componente de MHC por residuos no hidrofobos, por ejemplo residuos polares o cargados. Se construyeron constructos de RTL modificados que ejemplifican este aspecto de la invencion sustituyendo uno o mas residuos hidrofobos diana identificados en la plataforma de lamina pde un componente HLA-DR2 de RTL 302 por uno o mas residuos polares a modo de ejemplo (por ejemplo, serina) y, alternativamente residuos cargados a modo de ejemplo (por ejemplo,

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aspartato). La figura 1 representa los residuos de plataforma de lamina p seleccionados como diana para la modificacion. Inicialmente, se selecciono como diana una parte de nucleo central de la plataforma de lamina Ppara la modificacion, que comprendla V102, 1104, A106, F108 y L110 (mostrado de arriba abajo en la figura 1C). Se cambiaron estos residuos mediante mutagenesis dirigida al sitio, individualmente, o en diversas combinaciones de multiples residuos por un(os) residuo(s) de o bien serina o bien aspartato.

Los cambios individuales de estos residuos hidrofobos por un residuo diferente, polar o cargado, generalmente produjeron reducciones detectables en la agregacion del RTL modificado. Cuanto mas hidrofobos eran los residuos que se cambiaron, por un residuo o bien polar o bien cargado, mayor era la reduccion esperada en el potencial de agregacion. Cuando se cambiaron los cinco residuos diana de la plataforma de lamina p de nucleo indicados, se observo una conversion sustancial de los RTL por una forma mas monodispersa. Cuando se cambiaron los cinco residuos diana de nucleo por un residuo de serina, aproximadamente el 15% de los RTL modificados se volvieron monomericos en disolucion. Cuando se cambiaron los cinco residuos diana de nucleo (que comprendlan un “motivo” de autounion a modo de ejemplo de la molecula de DR) por residuos de aspartato, se observaron sustancialmente todos los RTL modificados en una forma monodispersa en disolucion (vease a continuacion). Tal como se ilustra en la figura 1C, estan disponibles residuos diana hidrofobos adicionales para la modificacion para alterar las caracterlsticas de autounion de la parte de plataforma de lamina pde moleculas de DR2 incorporadas en los RTL. En referencia a la figura 1C, el brazo izquierdo de la plataforma de lamina p representada incluye un “motivo” separado” de tres residuos hidrofobos observados (de arriba abajo), L141, V138 y A133 que serviran como dianas utiles para la modificacion individual o colectiva (por ejemplo, mediante delecion o sustitucion de aminoacido dirigida al sitio) para eliminar el/los residuo(s) hidrofobo(s) o para alterar el/los residuo(s) diana para dar un residuo no hidrofobo (por ejemplo, polar o cargado). Tambien en referencia a la figura 1C, varios residuos hidrofobos diana estan marcados a la derecha del motivo de lamina p de nucleo, incluyendo L9, F19, L28, F32, V45 y V51, que pueden considerarse como uno o mas “motivos” diana adicionales de autounion o autoasociacion para la modificacion de RTL. Puede seleccionarse como diana cualquiera o una combinacion de estos residuos para su modificacion para eliminar el/los residuo(s) hidrofobo(s) o para altera el/los residuo(s) diana para dar un residuo no hidrofobo, esperandose que se produzcan beneficios adicionales con respecto a disminuir el potencial de agregacion del RTL modificado.

La modificacion de RTL normalmente implica sustitucion o delecion de aminoacidos en sitios diana para mutagenesis que comprenden una superficie de contacto de autounion (compuesta por uno o mas residuos de aminoacido, o un motivo de autounion formado por varios residuos diana). Dentro de realizaciones a modo de ejemplo dirigidas hacia la produccion de RTL modificados que comprenden componentes de RTL de MHC de clase II, los residuos seleccionados como diana para la modificacion normalmente comprenden residuos o motivos hidrofobos, por ejemplo valina, leucina, isoleucina, alanina, fenilalanina, tirosina y triptofano. Estos y otros residuos diana ventajosamente pueden delecionarse, o alternativamente pueden sustituirse por cualquier aminoacido no hidrofobo. Los aminoacidos sustituyentes adecuados para generar modificaciones de RTL deseadas pueden incluir aminoacidos que tienen cadenas laterales alifaticas-de hidroxilo, tales como serina y treonina; aminoacidos que tienen cadenas laterales que contienen amida, tales como asparagina y glutamina; aminoacidos que tienen cadenas laterales aromaticas, tales como fenilalanina, tirosina y triptofano; y aminoacidos que tienen cadenas laterales basicas, tales como lisina, arginina e histidina.

Los hallazgos presentados en el presente documento validan el enfoque de diseno racional de la presente invencion para modificar una serie diversa de RTL que comprenden diversos componentes de MHC, incluyendo componentes de MHC de clase I y de MHC de clase II, para disminuir la propension del RTL modificado para agregarse en disolucion. Estos conceptos son claramente aplicables a todos los tipos de moleculas de MHC de clase II, que muestran un alto grado de conservation de estructura de orden superior, incluyendo particularmente en la parte de plataforma de lamina pde la molecula que se expone a disolvente a traves de la produccion de RTL (por ejemplo, que comprende el polipeptido de MHC de clase II sc p1a1). La cadena beta del componente HLA-DR2 modificado satisfactoriamente en los RTL a modo de ejemplo en el presente documento define una cadena central, extendida dentro de la molecula de HLA-DR2 progenitora (figura 6). La estructura cristalina con 2,6 angstroms de resolution de HLA-DR2 con peptido Ag MBP-85-99 unido (acceso de PDB 1BX2; (Smith et al, J. Exp. Med. 188:1511-20, 1998)), permitio el analisis en el presente documento de la superficie proximal a la membrana de la plataforma de lamina py las superficies distales a la membrana de los dominios de plegamiento de Ig ct2 y p2, identificando especlficamente las caracterlsticas que contribuyeron a estructuras o agregacion de orden superior. Especlficamente, segun la presente invencion, la plataforma de lamina beta enterrada en la molecula de HLA-DR2 progenitora define la parte inferior de los RTL, y contiene diversos residuos hidrofobos que normalmente se encuentran enterrados dentro de una estructura de protelna en lugar de exponerse a disolvente.

Todas las moleculas de HLA-DR humanas seguiran estrechamente las reglas de modificacion y las expectativas para el diseno racional dado a conocer en el presente documento. Asimismo, se describen y caracterizan suficientemente moleculas de HLA-DQ y HLA-DP de clase II humanas, y diversas moleculas de mHc de clase II murinas, de rata y otros mamlferos (veanse las referencias citadas anteriormente, que se incorporan en el presente documento) para aplicar las reglas anallticas de estructura-funcion de la invencion relacionadas con la identification

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y modificacion de residuos y motivos de superficie de contacto de autounion de RTL a estos sujetos relacionados dentro de los metodos y las composiciones de la invencion.

En el caso de RTL derivados de DR2 modificados a modo de ejemplo, el mayor exito en lo que se refiere a producir derivados de RTL monodispersos se obtuvo mediante la sustitucion de los cinco residuos hidrofobos de nucleo de la plataforma de lamina bpor un residuo cargado a modo de ejemplo, aspartato. El aspartato esta significativamente poco representado en las regiones de lamina fide las protelnas, y la introduccion en el presente documento de o bien cinco residuos de serina, o bien cinco residuos de aspartato sobre la cara externa de una cadena interior de la plataforma de lamina fide los RTL solo tuvo un efecto discreto sobre la estructura secundaria tal como se cuantifico mediante dicrolsmo circular (figura 3). Este efecto moderado se interpreto como un aumento de aproximadamente el 10% de estructura de 3 cadenas antiparalelas sobre la deconvolucion de los espectros (tabla III).

Una explicacion probable de por que estos RTL modificados a modo de ejemplo mantienen las mismas caracterlsticas biologicas y de plegamiento basicas que sus RTL no modificados homologos que portan los componentes de MHC nativos y residuos/motivos de autounion, procede del analisis de la lamina ben el contexto de su papel funcional como plataforma “abierta” en la estructura terciaria global del dominio de union a Ag/reconocimiento de TCR de la molecula de HLA-DR2 progenitora, en lugar de una superficie cerrada como un plegamiento de Ig. Se ha investigado intensamente la propension de diferentes residuos de aminoacido a estar presentes en estructuras de lamina b (Minor et al., Nature 367:660-63, 1994; Pokkuluri et al., Protein Science 11:1687-94, 2002; Street et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9074-76; 1999; Chou et al., Biochemistry 13:211-22, 1973; Smith et al., Biochemistry 33:5510-17, 1994; Finkelstein, Protein Engineering 8:207-09, 1995), como parte de un objetivo global de comprender las reglas que rigen la estabilidad y formacion de la estructura secundaria. Los trabajos disponibles han definido la preferencia marcadamente alta de laminas b para los aminoacidos ramificados en bisoleucina, valina y treonina, as! como para los residuos de aminoacido aromaticos fenilalanina y tirosina.

Para ilustrar la amplia aplicabilidad de los principios y metodos de diseno racional de la invencion para construir TRL monodispersos modificados a partir de una serie diversa de componentes de MHC, se presenta la siguiente alineacion que documenta motivos de autounion homologos identificados dentro de RTL a modo de ejemplo diferentes construidos con componentes de MHC homologos a partir de moleculas de MHC de clase II hLA-DR, HLA-DP y HLA-DQ.

1 --------+---------+---------+---------+--------+---------+ 60

302 MGDTRPRFLWQPKRECHFFNGTERVRFLDRYFYNQEESVRFDSDVGEFRAVTELGRPDAE

600 MGOTPENYLFQGRQECYAFNGTQR- -FLERYIYNREEFVRFDSDVGEFRAVTELGRPDEE

800 WRDSPEDFVYQFKGMOYFTNGTERVRLVSRSIYNREEIVRFDSDVGEFRAVTLLGLPAAE

61 — — — — — — — —H----------f-----------1--------■— -i ------. — — — — — — — — — — + 120

302 YWNSQKDILEQARAAVDTYiCRHNYGWESFTVQRRVIKEEHVIIQAEFYLNPDQSGEFMF

600 ywnsqkdileeeravpdrmcEhnyelggpmtlqrrvikadhvstyaafvqthrptgefmf

800 ywnsqkdilerkraavdrvcrhnyqlelrttlqrrvedivadhvasygvnlyqsygpsgq

121 --------+--------+---------+---------+--------+---------+ 180

302 dfdgdeifhvdmakketvwrleefgrfasfeaqgalaniavdkanleimtkrsnytpitn

600 efdedemfyvdldkketvwhleefgqafs feaqgglani ai lnnnlntli qrsnhtqatn

800 ythefdgdeqfyvdlgrketvwclpvlrqfrgfdpqfaltniavlkhnlnslikrsnstaatn

Alineacion de secuencias de aminoacidos primarias de RTL humanos.

Se derivo RTL302 de DR2 (DRB1*15011/DRA*0101) (31). Se derivo RTL600 de DP2 (DPA1*0103/DPB1*0201). Se derivo RTL800 de DQ2 (dQa1*05/DQB1*02) (**La cursiva indica residuos de aminoacido no nativos.) Tambien se muestran los huecos en las secuencias para la alineacion optima (-) y la union beta 1 //alfa 1 (|). Las cistelnas conservadas que forman un enlace disulfuro estan sombreadas de amarillo.

La alineacion anterior mapea un motivo de autounion homologo identificado y modificado en el presente documento para un componente HLA-DR2 a modo de ejemplo en RTL302 en alineacion con residuos diana homologos que comprenden motivos de autounion en RTL adicionales construidos por los presentes inventores, incluyendo RTL600, que comprende un componente de MHC DP2, y RTL800, que comprende un componente de MHC dQ2. De acuerdo con la divulgacion y las ensenanzas en el presente documento, ya se distinguen facilmente numerosos residuos diana de RTL600 y RTL800 a modo de ejemplo (por ejemplo, correspondientes con residuos DR2 diana marcados mediante subrayado en la alineacion) para la modificacion de estas especies de MHC de clase II DQ y DP adicionales para producir RTL modificados segun la invencion.

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Con respecto al diseno de RTL modificados que contienen un componente de MHC de clase II, la figura 6 muestra la superficie de interaction entre el dominio dp1 de union a peptido/reconocimiento de celulas T y los dominios d2p2 de plegamiento de Ig de HLA-DR2. Se moldeo y refino la superficie de interaccion entre el dominio dp1 de union a peptido/reconocimiento de celulas T y los dominios de plegamiento de IgdpP usando la estructura 1BX2 de DR2 de clase II humana de alta resolution (Smith et al., J. Exp. Med. 188:1511-20, 1998). Los dominios transmembrana se muestran esquematicamente como cilindros de 0,5 nm. Los extremos amino y carboxilo terminales del MHC de clase II se marcan en N, C, respectivamente. Las cistelnas se interpretan como bola y varilla, al igual que los cinco residuos V102, I104, A106, F108, L110 (numeration 1B22). La superficie de interaccion (superficie de contacto de 4 angstroms) entre los dominios de plegamiento de Ig y el dominio de union a peptido/reconocimiento de celulas T se colorea por el potencial lipofilo (LP). Las moleculas de agua dentro de esta superficie de contacto en la estructura cristalina 1BX2 se muestran como esferas rojas.

Dentro de determinadas realizaciones de la invention, la sustitucion de uno o mas residuo(s) hidrofobo(s) diana por uno o mas residuo(s) cargado(s) (ejemplificados en el presente documento mediante aspartato) proporciona el objetivo adicional de restringir la molecula de RTL modificado para permanecer extendida o “estirada” fuera a lo largo de su cadena p interior mediante repulsion de tipo carga-carga, en lugar de permitir que la estructura se colapse sobre si misma en ausencia de los dominios de plegamiento de Ig que estan presentes en la molecula de HLA-DR2 progenitora. Esta conclusion concuerda con los datos en el presente documento, y esta apoyada adicionalmente por informes de que la propension de la lamina p por un residuo de aminoacido surge de interacciones estericas locales de la cadena lateral de aminoacidos con el esqueleto local (Minor et al.. Nature 367:660-63, 1994).

Los presentes resultados demuestran que los RTL que codifican para el dominio de union a Ag/reconocimiento de TCR de moleculas de MHC de clase II son de manera innata estructuras muy robustas, que pueden conservar la actividad de manera separada de los dominios de plegamiento de Ig de la estructura de clase II progenitora, e incluso tras modification bastante agresiva para obtener las moleculas monomericas y monodispersas. Aplicando los metodos y las herramientas de la invencion, se logra facilmente la solubilidad aumentada y la prevention de agregacion de RTL modificados mediante la modificacion de un motivo o residuo(s) de superficie de contacto de autounion, ejemplificados mediante una superficie expuesta de una estructura de MHC de clase II nativa que originalmente estaba enterrada en la estructura de protelna progenitora. Al permanecer dentro de las limitaciones termodinamicas que restringen la estructura plegada final de la protelna y al no interferir con el proceso mediante el cual el dominio de protelna logra este plegamiento final, se ha superado un obstaculo clave para el diseno recombinante de RTL monodispersos, lo cual es el requisito para dejar intacto dentro de la secuencia primaria el “codigo” que dirige el plegamiento hacia la estructura unica final que conserva la capacidad para unir peptidos y unir el TCR de una manera especlfica de peptido Ag, conservando una actividad biologica potente.

Las siguientes secciones proporcionan directrices detalladas sobre el diseno, la expresion y los usos de las moleculas de MHC recombinantes de la invencion. A menos que se establezca de otro modo, se usan metodos de biologla molecular, bioqulmica e inmunologla. Tales metodos convencionales se describen en Sambrook et al. (1989), Ausubel et al (1987), Innis et al. (1990) y Harlow y Lane (1988). Las siguientes patentes estadounidenses y patentes y publicaciones adicionales citadas en otra parte en el presente documento se refieren al diseno, la construction y la formulation de moleculas de MHC y sus usos, y se incorporan en el presente documento como referencia para proporcionar information tecnica y de antecedentes adicional relevante para la presente invencion: patentes estadounidenses n.os 5.130.297; 5.194.425; 5.260.422; 5.284.935; 5.468.481; 5.595.881; 5.635.363; 5.734.023.

Diseno de moleculas de MHC de clase II recombinantes p1d

Las secuencias de aminoacidos de protelnas de cadena oy pde MHC de clase II de mamlfero, as! como acidos nucleicos que codifican para estas protelnas, se conocen bien en la tecnica y estan disponibles a partir de numerosas fuentes, incluyendo las referencias citadas e incorporadas al presente documento, y GenBank. Dentro de realizaciones a modo de ejemplo de la invencion, los RTL modificados pueden comprender un componente de MHC estructuralmente reducido o minimizado que excluye toda o parte de una protelna de MHC nativa, por ejemplo todo o parte de un dominio p2 de MHC de clase II, o al menos una parte de union a CD4 del dominio p2. Tambien hay un dominio d2 de la protelna de MHC de clase II normalmente excluido del RTL modificado. Los RTL de esta construccion pueden estar “vaclos” (es decir, libres de Ag de peptido), o unidos no covalentemente o unidos covalentemente al Ag de peptido. En aspectos mas detallados de la invencion, los dominios d y p1 de MHC de clase II que comprenden el RTL modificado pueden unirse entre si para formar un polipeptido monocatenario (sc) (Burrows et al., Protein Engineering 12:771-78; 1999; Chang et al., J. Biol. Chem. 276:24170-76, 2001).

Entre los RTL modificados proporcionados dentro de la invencion hay constructos a modo de ejemplo que comprenden moleculas de MHC de clase II recombinantes, que en realizaciones a modo de ejemplo incluyen el dominio p1 de la cadena p del MHC de clase II unido covalentemente al dominio d de la cadena adel MHC de clase II. Los dominios p1 y d estan bien definidos en las protelnas de MHC de clase II de mamlfero. Normalmente,

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se considera que el dominio a1 comprende aproximadamente 1-90 residuos de la cadena amadura. La region de ligador de peptido nativa entre los dominios a1 y 02 de la protelna de MHC de clase II abarcan desde aproximadamente el aminoacido 76 hasta aproximadamente el aminoacido 93 de la cadena a, dependiendo de la cadena a particular que este considerandose. Por tanto, un dominio a1 puede incluir aproximadamente 1-90 residuos de aminoacido de la cadena a, pero un experto en la tecnica reconocera que el punto de corte del extremo C-terminal de este dominio no esta definido necesariamente de manera precisa, y, por ejemplo, podrla producirse en cualquier punto entre los residuos de aminoacido 70-100 de la cadena a. La composition del dominio a1 tambien puede variar fuera de estos parametros dependiendo de la especie de mamlfero y de la cadena a particular en cuestion. Un experto en la tecnica apreciara que los parametros numericos precisos de la secuencia de aminoacidos son mucho menos importantes que el mantenimiento de la funcion del dominio.

De manera similar, normalmente se considera que el dominio b comprende aproximadamente 1-90 residuos de la cadena bmadura. La region de ligador entre los dominios b y b2 de la protelna de MHC de clase II abarca desde aproximadamente el aminoacido 85 hasta aproximadamente el aminoacido 100 de la cadena b dependiendo de la cadena particular en consideration. Por tanto, la protelna b puede incluir aproximadamente 1-100 residuos de aminoacido, pero un experto en la tecnica reconocera de nuevo que el punto de corte del extremo C-terminal de este dominio no esta definido necesariamente de manera precisa, y, por ejemplo, podrla producirse en cualquier punto entre los residuos de aminoacido 75-105 de la cadena b La composicion del dominio b tambien puede variar fuera de estos parametros dependiendo de la especie de mamlfero y de la b particular en cuestion. De nuevo, un experto en la tecnica apreciara que los parametros numericos precisos de la secuencia de aminoacidos son mucho menos importantes que el mantenimiento de la funcion del dominio.

Las moleculas de acido nucleico que codifican para estos dominios pueden producirse mediante medios convencionales, tales como amplification mediante la reaction en cadena de la polimerasa (PCR). Pueden emplearse enfoques convencionales para disenar cebadores para amplificar marcos de lectura abiertos que codifican para estos dominios. Las bibliotecas adecuadas para la amplificacion de estos dominios incluyen, por ejemplo, bibliotecas de ADNc preparadas a partir de la especie de mamlfero en cuestion; tales librerlas estan disponibles comercialmente, o pueden prepararse mediante metodos convencionales. Por tanto, por ejemplo, pueden producirse constructos que codifican para los polipeptidos b y a1 mediante PCR usando cuatro cebadores: los cebadores B1 y B2 correspondientes a los extremos 5' y 3' de la region codificante de b, y los cebadores A1 y A2 correspondientes a los extremos 5' y 3' de la region codificante de a1. Tras la amplificacion por PCR de las regiones codificantes de los dominios a1 y b, estas moleculas de acido nucleico amplificadas pueden clonarse cada una en vectores de donation convencionales, o las moleculas pueden ligarse entre si y luego clonarse en un vector adecuado. Para facilitar la clonacion conveniente de las dos regiones codificantes, pueden disenarse sitios de reconocimiento de endonucleasa de restriction en los cebadores de PCR. Por ejemplo, los cebadores B2 y A1 pueden incluir cada uno un sitio adecuado de manera que los fragmentos amplificados pueden ligarse facilmente entre si tras la amplificacion y digestion con la enzima de restriccion seleccionada. Ademas, los cebadores B1 y A2 pueden incluir cada uno sitios de restriccion para facilitar la clonacion en el sitio de poliligador del vector seleccionado. La ligacion de las dos regiones codificantes de dominio se realiza de manera que las regiones codificantes se unan operativamente, es decir, mantengan el marco de lectura abierto. Cuando las regiones amplificadas se clonan por separado, los fragmentos pueden liberarse posteriormente del vector de clonacion y purificarse en gel preparandose para la ligacion.

En realizaciones particulares, se proporciona un ligador de peptido entre los dominios b y a1. Normalmente, este ligador tiene entre 2 y 25 aminoacidos de longitud, y sirve para proporcionar flexibilidad entre los dominios de manera que cada dominio es libre de plegarse para dar su conformation nativa. La secuencia de ligador puede proporcionarse convenientemente disenando los cebadores de PCR que codifican para la secuencia de ligador. Por tanto, en el ejemplo descrito anteriormente, la secuencia de ligador puede codificarse mediante uno de los cebadores B2 o A1, o una combinacion de cada uno de esos cebadores.

Los vectores de expresion de acido nucleico, incluyendo casetes de expresion, seran particularmente utiles para fines de investigation. Tales vectores incluiran normalmente secuencias que codifican para el polipeptido de MHC de dominio dual (b a1) con un unico sitio de restriccion proporcionado hacia el extremo 5' terminal de la region codificante del MHC, de manera que puede unirse convenientemente una secuencia que codifica para un polipeptido antigenico. Tales vectores tambien incluiran normalmente un promotor unido operativamente al extremo 5' terminal de la region codificante del MHC para proporcionar una expresion de alto nivel de las secuencias.

En realizaciones particulares, las moleculas b a1 tambien pueden expresarse y purificarse sin un peptido unido, en cuyo caso pueden denominarse “vaclas”. Las moleculas de MHC vaclas pueden cargarse entonces con el peptido seleccionado tal como se describe a continuation.

Variantes de secuencia. Un experto en la tecnica apreciara que puede obtenerse y utilizarse las variantes de las moleculas y dominios inventivos dados a conocer de la misma manera que se ha descrito. Por tanto, la referencia en

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el presente documento a un dominio de un polipeptido o molecula de MHC (por ejemplo, un dominio pi de MHC de clase II) incluye tanto formas preferidas de la molecula a la que se hace referencia, as! como moleculas que se basan en la secuencia de aminoacidos de la misma, pero que incluyen una o mas variaciones de secuencia de aminoacidos. Tales polipeptidos variantes tambien pueden definirse por el grado de identidad de secuencia de aminoacidos que comparten con la molecula preferida dada a conocer. Normalmente, las variantes de dominio de MHC compartiran una identidad de secuencia de al menos el 80% con la secuencia de los dominios de MHC preferidos dados a conocer en el presente documento. Las variantes mas altamente conservadas compartiran una identidad de secuencia de al menos el 90% o al menos el 95% con los dominios de MHC preferidos dados a conocer en el presente documento. Las variantes de polipeptidos de dominio de MHC tambien conservan la actividad biologica de los dominios de MHC preferidos dados a conocer en el presente documento. Para los fines de esta invention, esa actividad se evalua convenientemente incorporando el dominio variante en el polipeptido pii apropiado y determinando la capacidad del polipeptido resultante para inhibir proliferation de celulas T especlfica de antlgeno in vitro, tal como se describe en detalle a continuation en el presente documento.

Los polipeptidos de dominio de MHC variantes incluyen protelnas que difieren en la secuencia de aminoacidos de los dominios de MHC preferidos dados a conocer en el presente documento, pero que conservan la actividad biologica y no agregante especificada. Tales protelnas pueden producirse manipulando la secuencia de nucleotidos de la molecula que codifica para el dominio, por ejemplo mediante mutagenesis dirigida al sitio o la reaction en cadena de la polimerasa. Las modificaciones mas sencillas implican la sustitucion de uno o mas aminoacidos por aminoacidos que tienen propiedades bioqulmicas similares. Es probable que estas sustituciones denominadas conservativas tengan un efecto mlnimo sobre la actividad de la protelna resultante. La tabla I muestra los aminoacidos que pueden sustituirse por un aminoacido original en una protelna y que se consideran sustituciones conservativas, que se conocen bien en la tecnica.

Pueden obtenerse cambios mas sustanciales en la funcion biologica u otras caracterlsticas seleccionando sustituciones que son menos conservativas, es decir, seleccionando residuos que difieren mas significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto polipeptldico en la zona de la sustitucion, por ejemplo, como una conformation de lamina o helicoidal, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molecula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que se espera en general que produzcan los mayores cambios en las propiedades de la protelna seran aquellas en que (a) un residuo hidrofilo, por ejemplo, serilo o treonilo, se sustituye por un residuo hidrofobo, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cistelna o prolina se sustituye por cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo o histadilo, se sustituye por un residuo electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye por uno que no tiene una cadena lateral, por ejemplo, glicina. Los efectos de estas sustituciones o deleciones o adiciones de aminoacido pueden evaluarse a traves del uso del ensayo de proliferacion de celulas T descrito.

A nivel de acido nucleico, un experto en la tecnica apreciara que las secuencias de acido nucleico que se producen de manera natural que codifican para los dominios de MHC de clase I y II pueden emplearse en los vectores de expresion, pero que la invencion no se limita a tales secuencias. Puede emplearse cualquier secuencia que codifica para un dominio de MHC funcional, y la secuencia de acido nucleico puede adaptarse para ajustarse con la desviacion del uso del codon del organismo en que va a expresarse la secuencia.

Los RTL modificados de la invencion muestran una capacidad reducida para autoagregarse en comparacion con un RTL no modificado correspondiente (es decir, un RTL que comprende solo secuencias de aminoacidos de MHC nativas). Por tanto, el diseno racional de modificaciones de superficie de RTL descritas en el presente documento produce un porcentaje aumentado de moleculas de RTL presentes como monomeros en disolucion en comparacion con una fraction monodispersa de RTL no modificados en disolucion.

Pese a los cambios estructurales de superficie introducidos en los RTL modificados, estos constructos de RTL novedosos conservan la capacidad para unir especlficamente peptidos Ag y para interaccionar funcionalmente con un TCR en una celula T diana. Las funciones a modo de ejemplo de los RTL modificados incluyen una capacidad para modular la actividad de las celulas T de una manera especlfica de Ag para reducir un potencial patogeno o para reducir un fenotipo patogeno de la celula T (por ejemplo, para inhibir la proliferacion de celulas T, reducir la production de citocinas inflamatoria por la celula T, o aumentar la production de citocinas antiinflamatorias por la celula T). Como tales, los RTL modificados tienen utilidad para tratar enfermedades autoinmunitarias y otras condiciones mediadas por celulas T especlficas de antlgeno in vivo.

Dentro de otros aspectos de la invencion, se proporcionan RTL modificados que carecen de los dominios de plegamiento de Ig transmembrana encontrados en una molecula de MHC intacta, en los que los RTL modificados no son agregantes o muestran agregacion reducida en comparacion con los RTL no modificados. Los RTL modificados poseen actividad reguladora de celulas T tal como se describe en el presente documento, pese a carecer de determinadas caracterlsticas estructurales presentes en la molecula de MHC intacta correspondiente. Los componentes de MHC de los RTL modificados de la invencion vuelven a plegarse de una manera que es estructuralmente analoga a la de las moleculas de MHC completas nativas y los antlgenos de peptido de union para

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formar complejos MHC-antlgeno estables.

Las respuestas de celulas T deseadas que pueden provocarse, individualmente, en diversas combinaciones, o colectivamente, por los RTL modificados de la invencion normalmente comprenden uno o mas cambio(s) fenotlpico(s) que se correlaciona(n) con un estado alterado o “reprogramado” de una celula T asociada con potencial

0 actividad patogena reducida (por ejemplo, una capacidad reducida para mediar o potenciar la destruccion tisular autoinmunitaria u otro(s) slntoma(s) diagnostico(s) de una enfermedad autoinmunitaria seleccionada).

Las moleculas de RTL modificado de la invencion son utiles, por ejemplo, para detectar, cuantificar y purificar celulas T especlficas de Ag. En otras realizaciones, los RTL modificados son utiles en composiciones y metodos para modular el fenotipo, la actividad, el estado de diferenciacion, el comportamiento de migracion, la localizacion tisular y/o el destino celular de las celulas T. Dentro de estos aspectos de la invencion, se proporcionan composiciones y metodos para modular una o mas actividades de las celulas T seleccionadas de activacion, proliferation y/o expresion de celula T de una o mas citocina(s), factor(es) de crecimiento, quimiocinas, receptores de la superficie celular (por ejemplo, TCR) y/o moleculas de adhesion celular (CAM). Los RTL modificados, apropiadamente disenados, evaluados y administrados de la invencion sirven como agentes reguladores de celulas T potentes, in vitro o in vivo, para modular cuantitativamente o “cambiar” cualitativamente el fenotipo de las celulas T (particularmente con respecto al potencial patogeno de la celula T diana).

Al poner en contacto una celula T diana con un RTL modificado de la invencion (que porta antlgeno relacionado unido a la superficie de contacto de TCR en ausencia de factores coestimuladores (por ejemplo, APC y otras senales reguladoras conferidas por secuencias reguladoras 02 y fb. de MHC II nativas), las composiciones y metodos de la invencion pueden funcionar para “reprogramar” una celula T diana para alterar el estado de diferenciacion o destino de la celula T, por ejemplo a un fenotipo o estado no patogeno inducido caracterizado por potencial patogenico reducido. Por ejemplo, los RTL modificados de la invencion pueden emplearse para reprogramar una celula T desde una ruta de diferenciacion patogenica original hasta una que produce un fenotipo “T supresor”. En realizaciones adicionales, los RTL de la invencion pueden emplearse para reprogramar una celula T provocando un “cambio” en una o mas citocinas, o en un “perfil de expresion de citocina”, por ejemplo un cambio desde un perfil de expresion de citocina Th1 hasta uno Th2, que a su vez proporciona metodos para reprogramar celulas T para tratar o gestionar enfermedades autoinmunitarias y otros trastornos mediados por las celulas T. Una description adicional de estos aspectos y otros relacionados de la invencion, se proporciona en Huan et al., J. Immunol. 172:4556-4566, 2004 (incorporado al presente documento como referencia).

Usos adicionales para constructos de RTL modificado de la invencion incluyen, por ejemplo, evaluar la actividad y funcion de las celulas T, o la funcion y especificidad de union de TCR, en contextos anallticos y de diagnostico (vease, por ejemplo, Wang et al., J. Immunol.) En realizaciones mas especlficas, los RTL de la invencion pueden usarse para detection, cuantificacion y/o purification de celulas T que reconocen antlgenos particulares para producir materiales e information terapeutica y de diagnostico importante. A modo de ejemplo, la deteccion temprana de celulas T especlficas para un autoantlgeno particular usando, por ejemplo, un rTl marcado, facilitara la selection temprana de reglmenes de tratamiento apropiados. La capacidad para purificar celulas T especlficas de antlgeno tambien sera de gran valor en inmunoterapia adoptiva. La inmunoterapia adoptiva implica la elimination de celulas T, por ejemplo, de un paciente con cancer, la expansion de las celulas T in vitro y luego la reintroduccion de las celulas en el paciente (vease la patente estadounidense n.° 4.690.915; Rosenberg et al. New Engl. J. Med. 319:1676-1680 (1988)). El aislamiento y la expansion de celulas T especlficas de cancer con propiedades inflamatorias aumentaran la especificidad y la eficacia de la intervention inmunologica.

En aspectos detallados de la invencion, se usan RTL modificados que comprende un componente de MHC de clase

1 o clase II in vivo para seleccionar como diana y alterar una actividad o potencial patogena de las celulas T especlficas de Ag. A modo de ejemplo, puede usarse una molecula de fi1cO cargada con un Ag de celula T (por ejemplo, un epltopo, dominio, region, peptido antigenico, u otra parte, derivado o conjugado de una protelna antigenica de celulas T) y administrada a pacientes que padecen esclerosis multiple u otra enfermedad autoinmunitaria para modular la actividad de las celulas T (por ejemplo, para modular la proliferacion de celulas T, modular la expresion de celulas T de una o mas citocina(s), quimiocina(s), factor(es) de crecimiento y/o factor(es) de adhesion u otro(s) factor(es) de la migracion celular, o para inducir anergia y/o cambio(s) fenotlpicos en el destino, estado de diferenciacion, location, serialization inespeclfica o actividad de supresion y/o potencial patogeno de las celulas T) en celulas T especlficas de Ag, aliviando o impidiendo de ese modo slntomas de enfermedad asociados. Alternativamente, tales moleculas pueden conjugarse con un resto toxico para eliminar directamente las celulas T causantes de enfermedad.

Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos habituales en la tecnica una divulgation y descripcion mas detallada de la invencion objeto, y no se pretende que limiten el alcance de lo que se considera como la invencion. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precision con respecto a los numeros usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, concentraciones, etc.) pero deben tenerse en cuenta determinados errores experimentales y desviaciones.

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EJEMPLO 1

(Metodos)

Modelado por homologla. Gran parte del razonamiento para diseccionar las moleculas se ha descrito anteriormente (Burrows et al., Protein Engineering 12:771-78, 1999; Chang et al., J. Biol. Chem. 276:24170-76, 2001). La alineacion de secuencias de moleculas de MHC de clase II de especies de ser humano, rata y raton proporciono un punto de partida para los estudios y se generaron imagenes graficas con el programa Sybilo 6.9 (Tripos Associates, St. Louis, MO) en una estacion de trabajo O2 (IRIX 6.5, Silicon Graphics, Mountain View, CA) usando coordenadas depositadas en el banco de datos de protelnas de Brookhaven (Brookhaven National Laboratories, Upton, NY). El modelado por homologla basado en la estructura se baso en las coordenadas cristalograficas refinadas de HLA-DR2 humano (Smith et al., J. Exp. Med. 188:1511-20, 1998; Li et al., J. Mol. Biol. 304:177-88, 2000), as! como DR1 (Brown et al., Nature 364:33-39, 1993; Murthy et al., Structure 5:1385-96, 1997), moleculas de I-Ek murinas (Fremont et al., Science 272:1001-04, 1996) y toxinas de escorpion (Zhao et al., J. Mol. Biol. 227:239-52, 1992; Housset et al., J. Mol. Biol. 238:88-91, 1994; Zinn-Justin et al., Biochemistry 35:8535-43, 1996). Se usaron residuos de aminoacido en HLA-DR2 humano (codigo de acceso de PDB 1BX2). Se determino esta estructura mediante difraccion con longitud de onda simple y sustitucion molecular (paquete de refinamiento estructural de rayos X/RMN AmoRe, C.N.R.S., Francia) usando HLA-DR1 como estructura de partida (codigo de acceso de PDB 1DLH) (Stem et al., Nature 368:215, 1994). Los siguientes residuos o bien faltaban o bien tenlan atomos que faltaban en la estructura final: cadena A; K2, M36, K38, K39, E46, N78, R100, E101; cadena B: E22, E35, E52, E59, K65, E69, P108, R189, (numeration 1BX2) (Smith et al., J. Exp. Med. 188:1511-20, 1998). Para estos residuos, se insertaron las cadenas laterales correctas y se modelo el esqueleto del peptido como un cuerpo rlgido durante el refinamiento estructural usando minimization de energla local.

Modification estructural de RTL. La slntesis de novo de RTL derivados de HLA-DR2 humano se ha descrito previamente (Chang et al., J. Biol. Chem. 276:24170-76, 2001). Se uso mutagenesis dirigida al sitio para sustituir residuos hidrofobos sobre la superficie accesible a disolvente de la plataforma de lamina fide los RTL por residuos polares (serina) o cargados (acido aspartico). Se realizo la modificacion usando el metodo de mutagenesis dirigida al sitio QuickChange™ tal como se describe por Stratagene (La Jolla, CA). En resumen, se realizo la reaction de PCR con ADN polimerasa Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) usando RTL302 o RTL303 como molde y dos cebadores de oligonucleotido sinteticos que contenlan la(s) mutacion/mutaciones deseada(s). Por ejemplo, un par de cebadores de mutation para RTL320 fueron 1) cebador directo: 5'-GGC GAG TCA TCA AAG AAG AaC AtA GCA TCA GCC AGA GCG AGA GTT ATA GTA ATC CTG ACC AAT C-3'; 2) cebador inverso: 5'-GAT TGG TCA GGA TTA CTA TAA CTC TCG CTC TGG CTG ATG CTA TGT TCT TCT TTG AtG ACT C-3'; y un par de cebadores de mutacion para RTL340 fueron 1) cebador directo: 5'-GGC GAG TCA TCA AAG AAG AAC ATG ACA TCG ACC AGG ACG AGG ACT ATG ACA ATC CTG ACC AAT C-3'; 2) cebador inverso: 5'-GAT TGG TCA GGA TTG TCA TAG TCC TCG TCC TGG TCG ATG TCA TGT TCT TCT TTG aTg ACT C-3'. Se extendieron los cebadores de oligonucleotido, cada uno complementario a la cadena opuesta del molde, durante 19 ciclos de temperatura por medio de ADN polimerasa Pfu a una temperatura de hibridacion de 55°C. Tras la incorporation de los cebadores de oligonucleotido, se genero un plasmido mutado que contenla mellas escalonadas. Tras el ciclado de temperatura, se trato el producto de PCR con endonucleasa Dpnl para digerir el molde de ADN parental y para seleccionar mutantes que contenlan la secuencia de ADN de interes. Entonces se transformo el ADN de plasmido con mellas que incorporaba la(s) mutacion/mutaciones deseada(s) en E. coli BL21(DE3) como huesped de expresion (Novagen, Madison, WI). Se seleccionaron colonias y se usaron las celulas que contenlan el plasmido con la(s) mutacion/mutaciones deseada(s) para la purification del plasmido usando el kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN, Valencia, CA). Entonces se digirio el ADN de plasmido purificado con Ncol y Xhol para confirmar la eficacia de la mutacion. Finalmente, se secuenciaron los plasmidos deseados con los cebadores (T7) 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3' y (T7 terminal) 5'-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3' para confirmar las mutaciones de interes.

Expresion y replegamiento de moleculas de RTL solubles. La expresion, la purificacion y el replegamiento de RTL derivados de HLA-DR2 humano se describieron previamente (Chang et al., J. Biol. Chem 276:24170-76, 2001). Se han realizado varias modificaciones en el protocolo para racionalizar la production mientras que se mantenla o se aumentaba ligeramente el rendimiento de protelna. Se hicieron crecer bacterias en cultivos de un litro hasta fase semilogarltmica (DO600=0,6-0,7) en caldo Luria-Bertani (LB) que contenla carbenicilina (50 mg/ml) a 37°C. Se indujo la produccion de protelna recombinante mediante la adicion de bD-tiogalactosido de isopropilo (IPTG) 0,5 mM. Tras la incubation durante 4 horas, se recogieron las celulas mediante centrifugation y se almacenaron a 4°C (corto plazo) o -80°C (largo plazo) antes del procesamiento. Todas las manipulaciones de purificacion de protelnas posteriores se realizaron a 4°C. Se resuspendieron los sedimentos de celulas en tampon de lisis (Tris-Cl 50 mM, NaCl 0,1 M, EDTA 5 mM, pH 7,4). Se anadio lisozima (disolucion 10 mg/ml en tampon de lisis; 1 mg por gramo de sedimento de celulas) y se incubo la disolucion a temperatura ambiente durante 30 minutos, agitando suavemente cada 10 minutos. Entonces se sonico la suspension celular durante 6 x 5 segundos enfriandose la suspension celular en un bano de agua helada salada. Se centrifugo la suspension celular (20.000 g durante 10 minutos a 4°C, Beckman J2-21, JA-14 rotor), se elimino por vertido la fraction de sobrenadante, se resuspendio el sedimento de celulas y se lavo dos veces en 100 ml de tampon de lisis que contenla Triton X-100 al 1% y luego un lavado en tampon de lisis sin Triton X-100, y entonces se resuspendio en 100 ml de tampon A (etanolamina 20 mM, urea 6 M,

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pH 10), y se agito suavemente a 4°C durante la noche. Tras la centrifugacion (40.000 g durante 45 minutos a 4°C, rotor Beckman J2-21, JA-20), se filtro el sobrenadante que contenia la proteina recombinante solubilizada de interes (0,22 m Stericup, Millipore) y se almaceno a 4°C hasta la purificacion. Se purificaron las proteinas recombinantes de interes y se concentraron mediante cromatografia de intercambio ionico FPLC usando medios de intercambio anionico Source 30Q (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) en una columna XK26/20 (Pharmacia Biotech), usando un gradiente escalonado con tampon A y tampon B (etanolamina 20 mM/HCI, urea 6 M, NaCl 2 M, pH 10,0). Se reunieron las fracciones que contenian la proteina recombinante de interes y se concentraron para cromatografia de exclusion molecular (tampon de SEC, etanolamina 20 mM, urea 6 M, NaCl 0,2 M, pH 10,0; columna, Superdex 75, HRI6/60). Se reunieron las fracciones que contenian la proteina de interes y se diluyeron con tampon de SEC hasta DO28o de 0,1. Se dializaron las proteinas frente a Tris-Cl 20 mM a pH 8,5, que elimino la urea y permitio el replegamiento de la proteina recombinante. Tras la dialisis, se concentraron las proteinas mediante ultrafiltracion centrifuga con membranas Centricon10 (Amicon, Beverly, MA). Para la purificacion hasta homogeneidad se incluyo una etapa de termination usando cromatografia de exclusion molecular (Superdex 75, HRI6/60). El rendimiento final de la proteina purificada vario entre 15 y 30 mg/l de cultivo bacteriano.

Ensayo de desplazamiento en gel de SDS. Se desnaturalizaron alicuotas de muestra de proteina purificada mediante ebullition durante 5 min en tampon Laemmli con o sin el agente reductor ^-mercaptoetanol, y luego se analizaron mediante electroforesis (SDS-PAGE al 12%). Tras la electroforesis, se tineron los geles con azul brillante de Coomassie (Sigma, St. Louis, MO) y se elimino la tincion para la observation del desplazamiento segun el peso molecular.

Dispersion de luz dinamica. Se realizaron experimentos de dispersion de luz dinamica (DLS) con un instrumento DynaPro™ (Protein Solutions, Inc., Charlottesville, VA). Se filtraron las muestras de proteinas en tampon Tris-Cl 20 mM a pH 8,5 a traves de un filtro de membrana de 100 nm Anodisc (Whatman, Clifton, NJ) a una concentration de 1,0 mg/ml y se cargaron 20 ml de muestra filtrada en una cubeta de cuarzo y se analizaron a 488 Dm. Se recogieron cincuenta espectros a 4°C para obtener una estimation del coeficiente de difusion y la polidispersidad relativa de las proteinas en disolucion acuosa. Entonces se analizaron los datos mediante el software Dynamics version 5.25.44 (Protein Solutions, Charlottesville, VA) y se restaron los niveles iniciales con tampon. Los datos se expresaron como la media del radio hidrodinamico calculado. Se calcularon los pesos moleculares de los RTL suponiendo una forma hidratada globular para las moleculas usando el software Dynamics version 5.25.44 (Protein Solutions, Charlottesville, VA).

Analisis de dicroismo circular (DC) y desnaturalizacion termica. Se realizaron analisis de DC y estudios de desnaturalizacion termica tal como se describio anteriormente (Chang et al., J. Biol. Chem 276:24170-76, 2001). En resumen, se analizaron proteinas recombinantes en tampon Tris-Cl 20 mM pH 8,5 usando un espectrometro Aviv modelo 215 DC (Aviv Associates, Lakewood, NJ). Los espectros fueron el promedio de 4-5 barridos desde 260 hasta 180 nm, registrados a una velocidad de barrido de 5 nm/min con una constante de tiempo de 4 segundos. Se recogieron los datos a intervalos de 0,5 nm. Se obtuvieron los promedios de los espectros y se alisaron usando algoritmos integrados y se restaron los niveles iniciales con tampon. Se estimo la estructura secundaria usando un paquete de software de deconvolution (CDNN version 2.1, Aviv Associates, Lakewood, NJ) basandose en el metodo de selection de variables (Compton et al., Analytical Biochemistry 155: 155-67, 1986). Se registro el DC frente a la temperatura (curva de desnaturalizacion termica) a una longitud de onda fija de 208 nm. Se generaron gradientes de temperatura desde 60 hasta 95°C con un dispositivo termoelectrico controlado por software para generar etapas de elevation o disminucion de la temperatura. Las velocidades de calentamiento y enfriamiento fueron de entre 10- 12°C/h. Se normalizaron las curvas de transition hasta 0 mdeg a 60°C y se representaron graficamente como el cambio en la absorbancia (mdeg) en funcion de la temperatura.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (EL/SA). Se adquirieron el peptido MOG-35-55 biotinilado (Biot- MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK-OH), los peptidos MOG-35-55 y MBP-85-99 no biotilinados (ENPVVHFFKNIVTPR- OH) de New England Peptide, Inc., (Fitchburg, MA). Se verifico la pureza de los peptidos mediante HPLC de fase inversa y se realizo la identification de masa usando MALDI-TOF para verificar que la masa estaba dentro del 0,1% del peso molecular esperado. Se liofilizaron los peptidos y se almacenaron a -80°C hasta su uso. Se llevaron a cabo experimentos de ensayo de union directa con el fin de determinar determine la capacidad de los RTL para unirse al peptido y para determinar la concentracion del peptido biotinilado a la que todos los sitios de union especifica se saturaban en las condiciones usadas en los estudios. Se recubrieron placas de ELISA (Maxisorp, Nunc, Rochester, NY) con 50 ml de proteina a una concentracion de 1 mg/ml en Tris 20 mM, pH 8,5 (50 ng de proteina; es decir, 40 nM) durante la noche a 4°C, se lavaron 4 veces con disolucion de lavado (Tween 20 al 0,05%, PBS, pH 7,4), y se bloquearon con una disolucion de caseina (BioFX, Owing Mills, MD) durante 1,5 h a temperatura ambiente. Entonces se lavaron las placas 4X y se anadieron 50 ml de peptido biotinilado (diluciones en serie) a los pocillos, a TA, durante 1,5 h, y luego se lavaron 4X. Se anadieron 50 ml de un conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rabano (STR-HRP, 1:5000, DAKO, Glostrup, Dinamarca) en PBS a los pocillos y se incubaron a TA durante 1,5 h, luego se lavaron 4X para eliminar el conjugado no unido. Se anadieron 50 ml de sustrato de HRP (BioFX) durante 45 min, a TA. Se detuvieron las reacciones con disolucion de detention (BioFX) y se determino el peptido unido de manera indirecta leyendo la absorbancia a 405 nm en un lector de placas de ELISA (Applied Biosystems, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se uso una curva patron de concentracion de STR-HRP frente a DO405 para determinar la

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concentracion de peptido unido. Para controlar la union no especlfica, se recubrieron los pocillos con leche desnatada en polvo (LDP) al 3% en PBS y se trataron de la misma forma que los pocillos recubiertos con RTL. Para determinar el tiempo requerido para alcanzar la union en estado estacionario de los peptidos a las protelnas, se recubrieron placas de ELISA, se lavaron y se bloquearon igual que anteriormente y luego se anadio peptido biotinilado en PBS/EDTA 1 mM a pH 7,4 a 0,15 pM en diferentes tiempos (de 0 a 36 h).

Ensayo de clones de celulas T y proliferacion de celulas T. Se seleccionaron clones de celulas T especlficas de antlgeno de PBMC de un paciente con EM homocigoto para HLA-DRB1* 1501 tal como se describio anteriormente (Burrows et al., J. Immunol 167:4386-95, 2001). Se subclonaron los clones de celulas T especlficas de antlgeno seleccionados mediante el metodo de dilucion limitante y posteriormente se evaluaron para determinar la proliferacion especlfica de antlgeno (Burrows et al., J. Immunol 167:4386-95, 2001). Se selecciono el clon con el Indice de estimulacion (IE) mas alto y se cultivo de manera continua en medio RPMI complementado con suero humano al 1% e IL-2 5 ng/ml. Se determino la capacidad de clonacion de las celulas mediante RT-PCR con un clon definido como una poblacion de celulas T utilizando un unico gen Vpde TCR (Burrows et al., J. Immunol 167:438695, 2001). Se expandieron los clones de celulas T mediante estimulacion con peptido MOG-35-55 o MBP-85-99 1 pg/ml y 2 x 105 PBMC autologas irradiadas (2500 rad) por pocillo en una placa de 96 pocillos. Se mantuvieron las celulas T expandidas en RPMI con suero humano al 1% que contenla IL-2 5 ng/m. Se anadio IL-2 nueva dos veces a la semana y volvieron a estimularse los clones de celulas T con PBMC autologas irradiadas (2500 rad) cada tres semanas. Se realizo periodicamente la proliferacion de celulas T especlficas de antlgeno para verificar la calidad de las celulas. Para estos ensayos, se lavaron los clones de celulas T especlficas de antlgeno dos veces con medio RPMI y volvieron a sembrarse 5 x 104 celulas en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se incubaron por triplicado con 2 x 105 PBMC autologas recien aisladas e irradiadas (2500 rad) con 10 pg/ml del peptido deseado. Se incubaron las celulas durante 72 horas con [3H]-timidina anadida durante las ultimas 18 horas. Se recogieron las celulas mediante un colector 96 (Tomtec, Hamden, CT) y se midio la radioactividad incorporada en un contador de centelleo llquido 1205 BS (Wallac, Turku, Finlandia). Se calculo el Indice de estimulacion (IE) dividiendo las cpm medias de los pocillos a los que se habla anadido peptido entre las cpm medias de los pocillos control solo con medio. En los experimentos de tratamiento de RTL, se preincubaron 8 pM de los RTL deseados con los clones de celulas T durante 72 horas, seguido por dos lavados con medios RPMI antes de realizar el ensayo de proliferacion de celulas T.

Ratones. Se desarrollaron ratones HLA-DR2 Tg que portaban moleculas de MHC de clase II quimericas tal como se describio anteriormente (Woods et al., J. Exp. Med. 180:173-81, 1994). El dominio de union a peptido de MHC de clase II esta codificado por secuencias humanas mientras que la parte proximal a la membrana que inclula el dominio de union a CD4 esta codificada por secuencias de raton (DRa1*0101:I-Ea y DRp1*1501:I-Ep descrito anteriormente). Se obtuvo el constructo DRp1*1501:I-Ep3 esencialmente tal como se describe en Woods et al. (Woods et al., J. Exp. Med. 180:173-81, 1994), con los siguientes cambios: Se digirio parcialmente el vector pACYCI84 que contenla los exones 1 y 2 de DRB1*0401, y los exones 3-6 de Ep con BamHI y se trato con la polimerasa Klenow para eliminar un sitio BamHI en el vector. Posteriormente, se clono el exon 2 de DRB1*1501 en pACYC 184 que se habla digerido previamente con BamHI y EcoRI para eliminar el exon 2 de DRB1*0401. Se generaron ratones transgenicos mediante la microinyeccion de constructos quimericos de cadena ay pen huevos fertilizados de apareamientos (DBA/2xC57BL/6)F1. Se transfirieron los embriones viables a hembras pseudoprenadas para el desarrollo a termino. Se sometio a retrocruzamiento dos veces la descendencia transgenica con el raton deficiente en MHC de clase II, MHCIIA/A (Madsen et al, ProNatlAcad Sci USA 96:10338-43, 1999).

Induccion de EAE activa y tratamiento con RTL. Se inmunizaron por via subcutanea ratones Tg HLA-DR2 macho y hembra de entre 8 y 12 semanas de edad tal como se describe (Ito et al., J Immunol. 167, 2001) en cuatro sitios en los costados con 0,2 ml de una emulsion compuesta por 200 pg de peptido MOG-35-55 de raton con adyuvante completo de Freund (CFA) que contenla 400 pg de Mycobacterium tuberculosis H37RA (Difco, Detroit, MI). Ademas, se administro a los ratones toxina pertusica (Ptx, List Biological Laboratories, Campbell, CA) en el dla 0 y el dla 2 tras la inmunizacion (25 ng y 67 ng por raton, respectivamente). Se trataron los ratones por via i.v. diariamente durante 8 dlas, comenzando 2-4 dlas tras el comienzo de los signos cllnicos, con 100 pI de RTL312, RTL342 o vehlculo (Tris 20 mM, pH 8,5) que contenlan 33 pg del protelnas de RTL. Se evaluaron diariamente los ratones inmunizados de manera activa para determinar signos cllnicos de EAE segun la siguiente escala: 0 = normal; 1 = cola flacida o debilidad leve de las patas traseras; 2 = cola flacida y debilidad moderada de las patas traseras o ataxia leve; 3 = cola flacida y debilidad moderadamente grave de las patas traseras; 4 = cola flacida y debilidad grave de las patas traseras o debilidad leve de las patas delanteras o ataxia moderada; 5 = cola flacida y paraplejia con solo debilidad moderada de las patas delanteras; y 6 = cola flacida y paraplejia con debilidad grave de las patas delanteras o ataxia grave o estado moribundo. Se determino la puntuacion diaria promedio para cada raton sumando las puntuaciones cllnicas diarias y dividiendo entre el numero de dlas en que el raton mostraba signos cllnicos. Se calcularon las puntuaciones maxima media y diaria promedio mas menos la DE para los grupos control y experimental.

EJEMPLO 2

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(Mutaciones disenadas racionalmente convirtieron complejos de ligandos de receptores de celulas T recombinantes humanos en monomeros que conservaban la actividad biologica)

Se han descrito recientemente estudios de modificacion por ingenierla genetica de protelnas de ligando de TCR recombinantes (RTL) derivados de los dominios alfa-1 y beta-1 de HLA-DR2 (DRB1*1501/DRA*0101) (Chang et al., J. Biol. Chem. 276:24170-76, 2001). Estas moleculas formaron agregados bien definidos que eran altamente solubles en tampones acuosos, con conservation de la actividad biologica (Burrows et al., J. Immunol. 167:4386-95, 2001; Buenafe, JBC, 2003; Vandenbark et al., Journal of Immunology, 2003). Se analizo la superficie proximal a la membrana de la plataforma de lamina p que se empaquetaba sobre las superficies distales a la membrana de los dominios de plegamiento de Ig ct2 y p2, considerando especlficamente las caracterlsticas que podrlan contribuir a estructuras o agregacion de orden superior (figura 1).

La figura 1 muestra HLA-DR2, RTL302, y la superficie accesible a disolvente de la plataforma de lamina pde RTL. El panel izquierdo (A) muestra un modelo a escala de una molecula de MHC de clase II sobre la superficie de una APC. El panel derecho (B) muestra RTL302, una molecula monocatenaria soluble derivada de los dominios de union a antlgeno/reconocimiento de celulas T. La estructuras se basan en las coordenadas cristalograficas de HLA-DR2 (codigo de acceso de PDB 1BX2), y los dominios transmembrana se muestran esquematicamente como cilindros de 0,5 nm. Los extremos amino y carboxilo terminales de HLA-DR2 y RTL302 se marcan en N, C, respectivamente. Los enlaces disulfuro se presentan como modelos de bola y varilla. El panel inferior derecho (C) muestra los residuos hidrofobos de la plataforma de lamina beta de RTL302. Las cadenas de lamina beta se representan en forma de cinta y los residuos hidrofobos se agrupan basandose en su ubicacion dentro de la plataforma de lamina beta y en su nivel relativo de interaction con residuos de los dominios de plegamiento de Ig ct2 y p2. Los residuos del grupo I VI02, 1104, A106, F108, L110 comprendlan un nucleo central a lo largo de la cadena beta-1 del dominio alfa-1, y de manera periferica a este nucleo, L9 y M119. Los residuos del grupo II F19, L28, F32, V45, y V51 eran residuos de dominio beta-1 y los residuos del grupo III A133, V138 y L141 eran del dominio alfa-1.

Se agruparon estos residuos, basandose en su ubicacion dentro de la plataforma de lamina beta y en su nivel relativo de interaccion con residuos de los dominios de plegamiento de Ig ct2 y p2, y se construyo una serie de mutantes dirigidos al sitio, sustituyendo residuos individuales y luego multiples por residuos o bien de serina o bien de acido aspartico. El estudio se desarrollo en dos fases, centrandose la primera fase en obtener protelnas solubles que eran monodispersas, y centrandose la segunda en la caracterizacion bioflsica y bioqulmica de las moleculas modificadas. La mutagenesis dirigida al sitio reiterativa permitio generar dos RTL modificados que eran adecuados para la caracterizacion biologica adicional (tabla I).

TABLA I. Moleculas usadas en este estudio

Molecula

Description

RTL302

Dominios P1a1 de HLA DR2 humano (DRB1*150101/DRA*0101)

RTL302(5S)

RTL302 (V102S, I104S, A106S, F108S, L110S)a

RTL302(5D)

RTL302 (V102D, I104D, A106D, F108D, L110D)

RTL303

RTL302/MBP-85-99b

RTL312

RTL302/MOG-35-55c

RTL320

RTL303(5S)

RTL340

RTL303(5D)

RTL342

RTL312(5D)

aNumeracion de RTL302. Estos residuos corresponden a los residuos de cadena alfa de HLA-DR2 V6, I8, A10, F12 y L14. La numeration de residuos aumenta en las moleculas con Ag fijado para representar el peptido Ag (longitud variable) mas el ligador (15 residuos). bMBP-85-99, ENPWHFFKNIVTPR cMOG-35-55, MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK

RTL302 podrla convertirse en un monomero con sustituciones de o bien cinco serinas (5S) o bien cinco aspartatos (5D), RTL302(5S) y RTL302(5D), respectivamente, dentro de un grupo de residuos a lo largo de la cara externa de la primera cadena de una lamina pantiparalela derivada de la cadena alfa de la molecula progenitora de HLA-DR2. Estos se denominaron residuos de nucleo del grupo I (figura 1, panel izquierdo A). La comparacion de las moleculas modificadas con 5S o 5D con RTL302 mediante cromatografla de exclusion molecular (SEC) (figura 2, panel superior A) demostro que tanto RTL302(5S) como RTL302(5D) se comportaban como monomeros de aproximadamente 25 kD.

La figura 2 muestra la cromatografla de exclusion molecular de RTL modificados. Se analizaron mediante cromatografla de exclusion molecular (SEC) RTL purificados y replegados. El panel superior (A) muestra SEC de RTL302, RTL302(5S) y RTL302(5D). Estos RTL no contienen peptidos Ag fijados covalentemente. El panel inferior (B) muestra SEC de rTl derivados del HLA-DR2 de tipo natural que contienen el peptido Ag MBP-85-99 (RTL303) o MOG-35-55 (RTL312) fijado covalentemente. Tambien se presentan las variantes 5s y 5D de RTL303 (RTL320 y

RTL340, respectivamente) y la variante 5D de RTL312 (RTL342). Se calibro la columna de exclusion molecular Superdex 75 16/60 con un conjunto de proteinas de peso molecular conocido con volumenes de exclusion tal como se indica (*); mioglobina, 17,3 kD; ovoalbumina, 43 kD; albumina serica bovina 67 kD; catalasa 232 kD; tiroglobulina, 670 kD.

5 Se uso dispersion de luz dinamica (DLS) para medir las constantes de difusion y para calcular los radios hidrodinamicos para las moleculas (tabla II), y estos estudios demostraron de manera inequivoca que RTL302(5S) y RTL302(5D) eran monomericos. Cuando se fijaron covalentemente peptidos Ag al extremo amino terminal de las moleculas, sus propiedades variaron ligeramente dependiendo del peptido Ag usado, y lo que es mas importante, difirieron dependiendo de la presencia de las modificaciones 5S polar o 5D cargada. Comparando RTL320 10 (modification 5S, peptido MBP-85-99 fijado covalentemente) con rTl340 (modification 5D, peptido MBP-85-99 fijado covalentemente), RTL320 todavia tendia a agregarse, formandose la mayoria de las moleculas (85%) en multimeros de aproximadamente 5 moleculas. RTL340 era completamente monomerico y era mas robusto en lo que se refiere a poder adaptarse a diversos peptidos Ag unidos covalentemente tales como MBP-85-99 (RTL340) y MOG-35-55 (RTL342) sin alteration significativa en las propiedades en disolucion de los RTL (figura 2; tabla II).

15 Tabla II. Analisis hidrodinamico de RTL mediante dispersion de luz dinamica

Molecula

Radio (nm) PM estimado (kD) % de masa en tampon

RTL302 (pico I)a

17,6 2760 100

RTL302 (pico II)

2,5 27 100

RTL302(5S)

2,5 27 98

RTL302(5D)

2,3 25 100

RTL303

15,4 2030 100

RTL312 (pico I)

15,2 1970 31

RTL312 (pico II)

4,3 102 69

RTL320 (pico I)

13,5 1490 100

RTL320 (pico II)

4,8 131 100

RTL340

2,5 28 100

RTL342

2,6 31 100

Se analizo el estado hidrodinamico de RTL modificados mediante analisis de dispersion de luz usando un instrumento de dimensionamiento molecular DynaPro™ (Protein Solutions, Inc.). aAlgunas de las proteinas mostraron dos picos claramente definidos mediante SEC y estos se caracterizaron independientemente. El pico I se refiere al pico de agregado (mayor) y el pico II se refiere a la fraction de menor tamano, en la mayoria de los casos monomerica.

Los analisis bioquimicos adicionales demostraron que las moleculas modificadas con 5S y 5D conservaban su estructura nativa. Los RTL contienen un enlace disulfuro conservado nativo entre la cisteina 16 y 80 (numeration de aminoacidos de RTL302, correspondiente a los residuos 15 y 79 de la cadena beta de HLA-DR2). La oxidation al aire de estos residuos para reconstituir el enlace disulfuro nativo se demostro mediante un ensayo de 20 desplazamiento en gel en el que se sometieron a ebullition muestras identicas con o sin el agente reductor b mercaptoetanol (bME) durante 5 minutos antes de SDS-PAGE. En ausencia de bME, los enlaces disulfuro se conservan y las proteinas normalmente demuestran una movilidad superior durante la electroforesis a traves de geles de acrilamida debido a su estructura mas compacta. Todas las moleculas de RTL producidas mostraron este patron, indicando la presencia del enlace disulfuro conservado nativo. Estos datos representan una confirmation 25 primaria de la integridad conformacional de las moleculas.

El dicroismo circular (DC) demostro las estructuras secundarias altamente ordenadas de los constructos de RTL. Los RTL sin peptido Ag fijado covalentemente contenian el 20-25% de helice alfa, el 21-27% de cadena beta antiparalela y el 20-22% de estructuras de giros beta (figura 3A; tabla III).

Tabla III. Analisis de estructura secundaria de RTL

Molecula

Helice a Lamina p anti paralela Lamina p paralela Giro p Estructuras helicoidales al azar Total

RTL302 (pico I)

0,21 0,21 0,02 0,23 0,33 0,99

RTL302 (pico II)

0,20 0,27 0,00 0,20 0,32 0,99

RTL302(SS)

0,20 0,21 0,02 0,22 0,34 1,00

RTL302(5D)

0,20 0,27 0,00 0,20 0,20 1,00

RTL303

0,26 0,20 0,04 0,19 0,32 1,00

RTL312

0,18 0,24 0,07 0,17 0,31 0,96

RTL320 (pico I)

0,22 0,22 0,03 0,21 0,32 1,00

RTL320 (pico II)

0,19 0,19 0,03 0,23 0,35 1,00

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Molecula

Helice a Lamina b antiparalela Lamina b paralela Giro b Estructuras helicoidales al azar Total

RTL340

0,15 0,20 0,03 0,27 0,35 1,00

RTL342

0,19 0,22 0,05 0,18 0,30 0,93

Contenido en estructura secundaria derivado de los espectros deconvolucionados de los RTL presentados en la figura 3.____________________________________________________________________________________

La figura 3 muestra espectros de dicrolsmo circular (DC) de RTL derivados de DR2 modificados. El panel superior (A) muestra espectros de DC de RTL302, RTL302(5S) y RTL302(5D) “vaclos”. El panel central (B) muestra espectros de DC de RTL que contienen el peptido Ag MBP-85-99 fijado covalentemente. RTL303, RTL320 y RTL340. El panel inferior (C) muestra curvas de desnaturalizacion termica para RTL303, RTL320 y RTL340 mostrando un alto grado de cooperatividad y estabilidad. RTL340 era resistente a la desnaturalizacion y agregacion termica completa y es soluble incluso tras someterse a ebullicion durante 5 minutos. A menos que se indique otra cosa, las mediciones de DC se realizaron a 25°C en un instrumento Aviv-215 usando una celda de 0,1 mm desde 260 hasta 180 nM en muestras de protelnas en Tris-Cl 20 mM, pH 8,5. Se determino la concentracion de cada protelna mediante analisis de aminoacidos. Los datos se expresan como Delta-epsilon por mol por cm. El analisis de la estructura secundaria se realizo usando el metodo de seleccion de variables (Compton et al., Analytical Biochemistry 155:155-67, 1986).

Los RTL con peptidos Ag fijados covalentemente contenlan el 15-19% de helice alfa, el 19-22% de cadena beta antiparalela y el 18-23% de estructuras de giros beta (figura 3B; tabla III). Estas tres estructuras secundarias basicas de una cadena de polipeptido (helice, lamina, estructura helicoidal) muestran cada una un espectro de DC caracterlstico en el UV lejano, y una protelna que consiste en estos elementos presenta espectros que pueden deconvolucionarse en cada una de las contribuciones individuales. Aunque hay limitaciones inherentes en el metodo (tal como no considerar la(s) interaccion(es) de cromoforo dentro de diferentes regiones estructurales), el ajuste es bastante aceptable para lo que se esperarla para una evaluacion cualitativa del plegamiento de protelnas de RTL y concuerda con los datos previos recogidos para las versiones multimericas de los RTL (Chang et al., J. Biol. Chem 276:24170-76, 2001). Los RTL monomericos monodispersos conservan la estructura nativa del dominio de union a Ag/reconocimiento de TCR progenitor de HLA-DR2.

Tambien se uso DC para monitorizar la perdida de estructura tras la desnaturalizacion termica. Los RTL mostraron un alto grado de estabilidad termica y el analisis de mlnimos cuadrados no lineal indico que los RTL descritos en este estudio se pliegan de manera cooperativa (figura 3C). La temperatura (Tm) a la que se perdio la mitad de la estructura en Tris 20 mM, pH 8,5, fue diflcil de determinar debido a las altas temperaturas de fusion observadas. La extrapolacion de las curvas usando analisis no lineal produce una Tm de 92°C para RTL303, 87°C para RTL320 y 98°C para RTL340. Se notifico previamente una Tm para RTL303 de 78°C cuando la molecula se solubilizo en PBS (Chang et al., J. Biol. Chem. 276:24170-76, 2001) reflejando el efecto que tenia el disolvente sobre la estabilidad global de las moleculas.

Se uso un ensayo de ELISA de “captura de peptido” con MOG biotinilada para comparar la union de peptido Ag a RTL302, RTL302(5S) y RTL(5D). Se usa analisis de regresion no lineal usando un modelo de union de un sitio (hiperbola) para calcular Bmax y Kd para las moleculas (figura 4A).

La figura 4 muestra la medicion directa de la union de peptido a RTL derivados de HLA-DR2. Union de MOG biotinilada a RTL302 (clrculos abiertos), RTL302(5S) (rombos abiertos) y RTL302(5D) (cuadrados abiertos). El panel izquierdo (A) muestra la saturacion en funcion de la concentracion de MOG biotinilada (la parte insertada muestra el analisis de Scatchard de la union a peptido). El panel derecho (B) muestra la union del peptido MOG biotinilado (0,15 mM) a RTL en funcion del tiempo para comparar la tasa de union inicial.

Tal como se muestra en la figura 4B, la union del peptido MOG (0,15 mM) a RTL en funcion del tiempo fue extremadamente rapida. Usando analisis de regresion lineal, se calculo que la velocidad inicial de union de MOG era de 0,17+0,06 DDO/min para RTL302, 0,11+0,02 DDO/min para RTL302(5S) y 0,10+0,02 para RTL(5D).

Se caracterizo la actividad in vitro de los RTL en un ensayo disenado para cuantificar su capacidad para inducir la inhibicion especlfica por Ag de la proliferacion de celulas T (Burrows et al., J. Immunol. 167:4386-95, 2001; Wang et al., The Journal of Immunology, 2003; Vandenbark et al., Journal of Immunology, 2003). El clon de celulas T restringidos por DR2, 4-G1, es especlfico para el peptido MBP-85-99. Las celulas que no se pretrataron con RTL (control “sin tratar”) mostraron un Indice de estimulacion de 68X y las celulas pretratadas con RTL302 “vaclo” mostraron un Indice de estimulacion proximo a 90X, un aumento del 31% por encima del control “sin tratar”. La preincubacion con RTL303, RTL320 o RTL340 mostro una inhibicion de la proliferacion mayor del 90% en comparacion con el control “sin tratar” (tabla IV).

5

10

15

20

25

Tabla IV. Inhibicion de la proliferacion de celulas T especlfica de antlgeno mediante la preincubacion con RTL

Preincubacion

Clon EN4-G1

Sin tratar RTL302 RTL303 RTL320 RTL340

+APC solo

588,97 569,1 578,7 592,0 641,9

+APC/MBP85-99 (10 mg/ml)

40144,67 50841,1 2560,4 1847,7 1515,8

indice de estimulacion

68 89 4 3 2

Inhibition (%)

— +31,1 -93,5 -95,2 -96,5

Cada punto de datos representa el promedio de pocillos por triplicado de cada tratamiento.

Recientemente se ha descrito encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) inducida por MOG-35-55 en ratones transgenicos (Tg) DR2 (DRB1*1501) (Vandenbark et al., Journal of Immunology, 2003). Este modelo animal de esclerosis multiple (EM) se caracterizo como una enfermedad cronica moderadamente grave con una penetrancia del 100%. Las caracterlsticas de la enfermedad incluyen paralisis ascendente marcada por lesiones del SNC inflamatorias, desmelinizantes. Se indujo EAE con el peptido MOG-35-55/CFA en el dla 0 mas Ptx en los dlas 0 y 2, y pudo observarse que los slntomas iniciales de la enfermedad comenzaban aproximadamente 10 dlas tras la induction. Para evaluar el potencial cllnico del RTL342 monomerico, se trataron ratones Tg-DR2 con EAE inducida por MOG 2-4 dlas tras el comienzo de los signos cllnicos con RTL312, RTL342 o vehlculo solo (figura 5, y vease tambien la tabla V).

La figura 5 muestra que RTL342 monomerico, disperso fue tan eficaz como RTL312 en el tratamiento de EAE en animales transgenicos DR*1501. Puntuaciones cllnicas medias de ratones transgenicos para HLA DR2 (DRB1*1501/DRA*0101) tratados con 33 mg de RTL312 (v), RTL342 (D) o vehlculo solo (Tris, pH 8,5) (•). Se inmunizo a todos los ratones por via s.c. con 200 mg de MOG-35-55 y 400 mg de CF A conjuntamente con 100 ng de Ptx por via i.v. en el dla 0 y 266 ng de Ptx 2 dlas despues de la inmunizacion. En el dla 14, se distribuyo a todos los ratones en 6 grupos segun su similitud en la enfermedad y el sexo. Se inyecto diariamente a los ratones por via i.v. RTL312, RTL342 o vehlculo. (n = 4 por grupo, excepto para el grupo con vehlculo donde n = 3; las flechas indican tratamiento).

El tratamiento con RTL312 o RTL342 revirtio rapidamente los signos cllnicos establecidos de EAE (puntuacion de aproximadamente 2,5) hasta una puntuacion diaria promedio de <0,5 unidades hacia el final del periodo de tratamiento de ocho dlas. Este bajo grado de discapacidad se mantuvo sin inyecciones de RTL adicionales a lo largo del resto del periodo de observation, que en un experimento duro 5 semanas una vez detenido el tratamiento. En cambio, para la reversion de la EAE mediada por RTL312 o RTL342, los grupos control que recibieron vehlculo o inyeccion de 33 mg de RTL303 no especlfico de Ag (que contiene el peptido MBP-85-99) desarrollaron EAE cronica moderadamente grave (puntuacion >4).

Tabla V. Tratamiento con RTL de ratones transgenicos para DR2

Tratamiento

Incidencia Comienzo Pico Mortalidad

RTL312

4/4 9,5 ± 2,8 3 ± 1,8 0/4 29,8 ± 21,7*

RTL342

4/4 10,8 ± 2,2 2,6 ± 1,1 0/4 16 ± 10,9*

Vehlculo

3/3 12,3 ± 1,2 6 ± 0 0/4 133,7 ± 11,1

grupo experimental grupo (p = 0,000)

A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientlficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden los expertos habituales en la tecnica a la que pertenece esta invention.

Claims (16)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Ligando de celulas T recombinante (RTL) modificado, aislado que tiene un potencial reducido para agregarse en disolucion, que comprende:

   un componente de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en forma de un polipeptido monocatenario (sc) que comprende multiples elementos de dominio de MHC unidos covalentemente que comprenden dominios a1 y p1 de un polipeptido de MHC de clase II, en el que el extremo amino terminal del dominio a1 esta unido covalentemente al extremo carboxilo terminal del dominio p1, en el que el componente de MHC de clase II no incluye un dominio a2 o p2, y en el que el componente de MHC esta modificado mediante la sustitucion de uno o mas aminoacidos hidrofobos dentro de la plataforma de lamina p de un polipeptido de MHC nativo o RTL que comprende el polipeptido de MHC nativo, mediante lo cual el RTL modificado muestra agregacion reducida en disolucion en comparacion con la agregacion mostrada por un RTL control, no modificado que tiene dicha estructura de componente de MHC pero que incorpora el polipeptido de MHC nativo que tiene una plataforma de lamina p no modificada.
2. 2. RTL modificado, aislado segun la reivindicacion 1, en el que el componente de MHC de clase II comprende dominios a1 y p1 de una protelna HLA-DR, dominios a1 y p1 de una protelna HLA-DQ o dominios a1 y p1 de una protelna HLA-DP.
3. 3. RTL modificado, aislado segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que los dominios a1 y p1 estan acoplados mediante un ligador de peptido.
4. 4. RTL modificado, aislado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende ademas un determinante antigenico de celulas T unido al componente de MHC de clase II o unido covalentemente al componente de MHC de clase II.
5. 5. RTL modificado, aislado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, combinado con o acoplado a una toxina eficaz para mediar en la destruccion de celulas T.
6. 6. RTL modificado, aislado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dichos uno o mas aminoacidos dentro de la plataforma de lamina p se seleccionan de las posiciones de aminoacido V102, I104, A106, F108 y L110 de RTL302, en el que RTL302 consiste en la secuencia de aminoacidos

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7. 7. RTL modificado, aislado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dichos uno o mas aminoacidos estan modificados mediante la sustitucion por un aminoacido no hidrofobo.
8. 8. RTL modificado, aislado segun la reivindicacion 7, en el que dichos uno o mas aminoacidos estan modificados mediante la sustitucion por un aminoacido polar o cargado.
9. 9. RTL modificado, aislado segun la reivindicacion 7 o la reivindicacion 8, en el que dichos uno o mas aminoacidos estan modificados mediante la sustitucion por un residuo de serina o aspartato.
10. 10. RTL modificado, aislado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que cada una de las posiciones de aminoacido V102, I104, A106, F108 y L110 de RTL302 estan modificadas mediante la sustitucion por un aminoacido no hidrofobo, en el que RTL302 consiste en la secuencia de aminoacidos

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11. 11. RTL modificado, aislado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dichos uno o mas aminoacidos comprenden uno o cualquier combinacion de L9, F19, L28, F32, V45, V51, A133, V138 y L141 de RTL302, en el que RTL302 consiste en la secuencia de aminoacidos

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12. 12. RTL modificado segun la reivindicacion 4, en el que el RTL modificado unido al determinante antigenico es eficaz para inhibir la proliferacion de celulas T o la production de citocinas inflamatorias in vitro o in vivo o es eficaz para reducir una actividad patogena o potencial patogeno de una celula T asociada con una enfermedad

    5 autoinmunitaria en un sujeto o celula de mamlfero.
13. 13. Formulation farmaceutica para el tratamiento de una enfermedad o trastorno autoinmunitario en un sujeto mamlfero que comprende un ligando de receptor de celulas T (RTL) recombinante, modificado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. 14. Ligando de receptor de celulas T recombinante, modificado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 10 para su uso en el tratamiento de un trastorno autoinmunitario en un sujeto.
15. 15. Ligando de receptor de celulas T recombinante, modificado segun la reivindicacion 14, para su uso en el tratamiento del trastorno autoinmunitario esclerosis multiple.
16. 16. RTL modificado segun una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 15, en el que el determinante antigenico comprende protelna oligodendrocltica de mielina 35-55.

    15