JP2003231698A - 自己免疫性を改善せしめるうえで有用なｍｈｃコンジュゲート - Google Patents
自己免疫性を改善せしめるうえで有用なｍｈｃコンジュゲートInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 インビボでのアネルギーの誘発が可能である
か、又は自己免疫障害がこの状態で有効に処置されうる
かの明確な証拠を提供していない。 【解決手段】 本発明は、抗原性ペプチドと抗原結合部
位を有する単離ＭＨＣ成分とより本質的に構成され、こ
こでこの抗原性ペプチドがこの抗原結合部位と連結され
ている、実質的に純粋なＭＨＣ−ペプチド複合体を提供
する。本発明はまた、薬理学的に許容される担体及び上
記ＭＨＣ−ペプチド複合体を含んで成る薬理組成物を提
供する。
か、又は自己免疫障害がこの状態で有効に処置されうる
かの明確な証拠を提供していない。 【解決手段】 本発明は、抗原性ペプチドと抗原結合部
位を有する単離ＭＨＣ成分とより本質的に構成され、こ
こでこの抗原性ペプチドがこの抗原結合部位と連結され
ている、実質的に純粋なＭＨＣ−ペプチド複合体を提供
する。本発明はまた、薬理学的に許容される担体及び上
記ＭＨＣ−ペプチド複合体を含んで成る薬理組成物を提
供する。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、例えば自己免疫障
害、アレルギー応答、移植片拒絶及びその他の免疫学的
障害の処置におけるＴ細胞機能の調節のための方法及び
組成物に関する。詳しくは、主要組織適合性複合体（Ｍ
ＨＣ）糖タンパク質と、かかる障害に関連する抗原のフ
ラグメントに相当するペプチドとの複合体を利用するこ
とによる、ヘルパーＴ細胞を標的とする複合体に関す
る。 【０００２】 【従来の技術】これらの複合体は診断目的のためにラジ
オアイソトープもしくはその他のラベルに、又は該複合
体を治療的に有用にする毒素もしくはその他の物質に更
に複合化せしめることができる。 【０００３】望ましくないＴ細胞の活性化を包括する数
多くの病理学的応答が知られている。例えば、数多くの
アレルギー障害は特定のＭＨＣ対立遺伝子に関連してい
るか、又は自己免疫成分を有することが推測されてい
る。 【０００４】その他の有害なＴ細胞仲介応答には、同種
異系宿主に由来するグラフト又は移植片として故意に身
体に導入した外来細胞の破壊が含まれる。「同種異系移
植片拒絶」として知られるこのプロセスは宿主のＴ細胞
と外来ＭＨＣ分子との相互作用を包括している。しばし
ばよく、幅広い範囲のＭＨＣ対立遺伝子が、同種異系移
植片に対する宿主の応答に関与している。 【０００５】自己免疫障害は特に重要な有害な免疫応答
の種類である。自己免疫障害において、自己寛容は失わ
れてしまい、そして免疫系は「自己」の組織をあたかも
それが外来標的であるかのように攻撃する。これには、
重症筋無力症（ＭＧ）及び多発性硬化症（ＭＳ）を含
む、公衆の注目を浴びた数多くのものが含まれる。 【０００６】自己免疫障害及びその他の免疫病理を処理
する大雑把な手法は一般に免疫抑制である。これは免疫
応答を上昇せしめることを必要とする真の外来物質に対
する対象体の能力を失わせる明らかなる欠点を有する。
ほんのわずかに洗練された手法は、標的組織に関与する
抗体又は免疫複合体の排除を基礎とする。これも有害な
副作用を有し、そして成し遂げることが困難である。下
記に詳細する本発明の手法は、「クロノタイプ」試薬、
即ち、自己抗原に対して応答性である免疫系の細胞のみ
を攻撃する試薬を基礎とする。 【０００７】免疫応答を説明するのにここで考慮してい
る一般例において、紹介する特異的抗原は、１９５９年
にＢｕｒｎｅｔによって初めて提案されたクローン増殖
に由来する。このシナリオに従うと、特定の対象体は数
１０万のＴ及びＢ細胞を有し、それぞれは様々な抗原決
定基に結合するレセプターを保有しうる。抗原への暴露
により、この抗原はその他を無視して、それが含んでい
る抗原決定基に対する適当なレセプターを抱える細胞に
特異的に結合する。この結合は数千の娘細胞のクローン
集団（それぞれは同一のレセプターにより担われる）を
もたらす。クロノタイプ試薬は、対象の抗原にとって適
切であるＴ及びＢ細胞のサブセットのみに影響する。本
発明の組成物においては、この抗原決定基は通常自己免
疫障害に関連するものである。 【０００８】本発明のクロノタイプ試薬組成物はＴヘル
パー細胞を標的とするために特にデザインされており、
これは自己免疫障害により影響される組織の抗原決定基
に特異的なクローンを代表する。Ｔヘルパー細胞はＭＨ
Ｃタンパク質と一緒のときにのみ決定基を認識する；本
発明の複合体は従ってこのＭＨＣタンパク質の有効領域
を含んでいる。 【０００９】最近、特異的な抗原に対する免疫応答を妨
害することを試むいくつかの関連の手法がある。例え
ば、自己抗原チログロブリンがリシンＡとコンジュゲー
トされており、そしてこのコンジュゲートはこの抗原に
通常応答するリンパ球のインビトロ抗体応答を特異的に
抑制することが示されている。かかる免疫毒素は自己抗
体−分泌性リンパ球クローンを特異的に排除することが
推測されている（Ｒｅｎｎｉｅ，Ｄ．Ｐ．ら、Ｌａｎｃ
ｅｔ（１９８３年１２月１０日）１３３８−１３３
９）。Ｄｉｅｎｅｒ，Ｅ．らのＳｃｉｅｎｃｅ（１９８
６）２３）：１４８−１５０は、酸感受性スペーサーを
用いてダウノマイシンをハプテン（この場合はオバルブ
ミン）にコンジュゲートせしめることによる、リンパ球
機能の抗原特異性抑制を生じせしめる化合物の構築を提
唱している。このコンジュゲートはインビトロ及びイン
ビボでのＢリンパ球による抗体分泌のハプテン−特異的
阻害を生じせしめている。ダウノマイシンの、Ｔ細胞に
特異的なモノクローナル抗体とのコンジュゲート（酸感
受性スペーサーによる）はコンカナバリンＡに対するＴ
リンパ球による応答も排除した。Ｓｔｅｅｒｚ，Ｒ．
Ｋ．Ｍ．らＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８５）１３４：８
４１−８４６は毒素コンジュゲートにおける毒素因子と
して放射物を利用している。ラットに、コールドレセプ
ターを注射する前に、電気魚に由来する放射性ラベルし
た精製レセプターを投与している。このレセプターによ
る注射は実験的な自己免疫重症筋無力症（ＥＡＭＧ）を
誘発する標準的な手法である。障害を誘発せしめるレセ
プターの投与前に、コールドレセプター又は放射性ラベ
ルアルブミンのいずれかのみの事前注射を受けたコント
ロールラットはＥＡＭＧの症状を示した；放射性ラベル
レセプターで予備処置したものは軽い症状を示した。ラ
ベルされた、それ故破壊性のレセプターは免疫競合細胞
を特異的に排除することが予測された。予備処置のため
のリシン／レセプターコンジュゲートを利用する似たよ
うな研究がＫｉｌｌｅｎ，Ｊ．Ａ．らのＪ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ（１９８４）１３３：２５４９−２５５３に報告さ
れている。 【００１０】一般にＴ細胞の破壊をもたらす消極的な手
法は、Ｈｉｘｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｒ
ｉｂｕｎｅ（１９８８年１月２８日）４−５に報告され
ているＩＬ−２／毒素のコンジュゲートによる処置であ
る。反対に、しかし関連する手法として、Ｌｉｕ，Ｍ．
Ａ．らＳｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：３９５−３
９７は、細胞毒性Ｔ細胞特異性を無視して、所望の標的
と細胞毒性Ｔ細胞との「リンクアップ（連結）」法を報
告している。この手法において、使用するホルモンがメ
ラノサイト刺激ホルモンのとき、普遍性細胞毒性Ｔリン
パ球に特異的な抗体はヒト黒色腫細胞を破壊する。 【００１１】免疫性の現状のモデルは、抗原が、主要組
織適合性複合体（ＭＨＣ）における遺伝子によりコード
されるクラスＩＩの糖タンパク質を表層上に含んでいる
抗原表示細胞（ＡＰＣ）により摂取されることによっ
て、免疫応答を動員せしめることを少なくともある程度
は条件としている。この抗原は、次に表層結合型ＭＨＣ
糖タンパク質に関連して特異的なＴヘルパー細胞へと供
され、そして、この抗原特異性Ｔ細胞レセプターと抗原
−ＭＨＣ複合体との相互作用により、このＴヘルパー細
胞は、細胞毒素Ｔ細胞機能の誘発、Ｂ細胞機能の誘発、
並びにこの応答を補助する及び扇動する数多くの因子の
分泌を含む、抗原特異的免疫応答の仲介を刺激する。 【００１２】自己免疫障害におけるＭＨＣクラスＩＩタ
ンパク質の関与は動物モデルにおいて示されている。Ｍ
ＨＣクラスＩＩタンパク質自体に対する抗体、又はＭＨ
ＣクラスＩＩ遺伝子の発現を誘発する物質に対する抗体
の投与は、これらのモデル系における自己免疫症状の発
症をはばむ。ヘルパーＴ細胞の役割も、抗ＣＤ４モノク
ローナル抗体を用いてこの自己免疫系を妨げることによ
り、これらのモデルにおいて実証されている；ＣＤ４は
特徴的なヘルパーＴ細胞レセプターである（Ｓｈｉｚｕ
ｒｕ，Ｊ．Ａ．らＳｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０：
６５９−６６２）。 【００１３】最近の実験は、一定の環境のもとでは、ア
ネルギー又は非応答性が自己反応性リンパ球の中で誘発
されうることを示している（Ｓｃｈｗａｒｒｚ，Ｃｅｌ
１（１９８９）１０７３−１０８１を参照のこと；これ
は引用して本明細書に組入れる）。インビトロ実験は、
共刺激シグナルの非存在下において、ＭＨＣクラスＩＩ
分子による抗原表示は、繁殖的な非応答性状態を同系移
植細胞において誘発せしめることを示唆する（Ｑｕｉｌ
ｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８７）１３８：３７０
４−３７１２これは引用して本明細書に組入れる）。 【００１４】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の報告は、インビボでのアネルギーの誘発が可能である
か、又は自己免疫障害がこの状態で有効に処置されうる
かの明確な証拠を提供していない。 【００１５】 【課題を解決するための手段】１．本発明は、抗原性ペ
プチドと抗原結合部位を有する単離ＭＨＣ成分とより本
質的に構成され、ここでこの抗原性ペプチドがこの抗原
結合部位と連結されている、実質的に純粋なＭＨＣ−ペ
プチド複合体を提供する。 【００１６】２．１つの実施形態において、本発明は、
上記のペプチドが上記の抗原結合部位に非共有的に連結
している複合体を提供する。 【００１７】３．１つの実施形態において、本発明は、
上記ＭＨＣ成分が可溶性である複合体を提供する。 【００１８】４．１つの実施形態において、本発明は、
上記ペプチドが約８〜約１８個のアミノ酸である複合体
を提供する。 【００１９】５．１つの実施形態において、本発明は、
上記ペプチドが自己免疫障害に関連する自己抗原性ペプ
チドである複合体を提供する。 【００２０】６．１つの実施形態において、本発明は、
上記ペプチド上のエピトープが、多発性硬化症、リウマ
チ型関節炎又は重症筋無力症に関連する自己反応性Ｔ細
胞である複合体を提供する。 【００２１】７．１つの実施形態において、本発明は、
上記ペプチドが、ヒトＡｃｈＲαサブユニットのうちの
残基１３８〜１６７、ヒトＭＢＰのうちの残基８４〜１
０２、又はヒトＭＢＰのうちの残基１４８〜１６２を含
んで成る複合体を提供する。 【００２２】８．１つの実施形態において、本発明は、
上記ＭＨＣ成分がクラスＩＩ ＭＨＣである複合体を提
供する。 【００２３】９．１つの実施形態において、本発明は、
上記ＭＨＣ成分がヒトＢリンパ繊維芽細胞より単離され
たものである複合体を提供する。 【００２４】１０．本発明は、薬理学的に許容される担
体及び上記ＭＨＣ−ペプチド複合体を含んで成る薬理組
成物を提供する。 【００２５】１１．１つの実施形態において、本発明
は、上記複合体がリポソームの中に包埋されている薬理
組成物を提供する。 【００２６】１２．１つの実施形態において、本発明
は、上記複合体が炭水化物成分を実質的に有さない薬理
組成物を提供する。 【００２７】１３．１つの実施形態において、本発明
は、上記複合体の濃度が約０．０２重量％〜約１重量％
である薬理組成物を提供する。 【００２８】１４．１つの実施形態において、本発明
は、上記薬理学的に許容される担体がリン酸緩衝食塩水
である薬理組成物を提供する。 【００２９】１５．本発明は、哺乳類における標的Ｔ細
胞におけるアネルギーを誘発せしめる方法であって、哺
乳類に、抗原性ペプチドと抗原結合部位を有する単離Ｍ
ＨＣ成分とより本質的に構成され、ここでこの抗原性ペ
プチドがこの抗原結合部位に連結されている複合体を治
療的に有効な投与量で投与することを含んで成る方法を
提供する。 【００３０】１６．１つの実施形態において、本発明
は、上記ＭＨＣ成分がクラスＩＩ ＭＨＣである方法を
提供する。 【００３１】１７．１つの実施形態において、本発明
は、上記複合体が脂質膜の中に包埋されている方法を提
供する。 【００３２】１８．１つの実施形態において、本発明
は、上記標的Ｔ細胞が自己免疫障害に関連している方法
を提供する。 【００３３】１９．１つの実施形態において、本発明
は、上記自己免疫障害が多発性硬化症、リウマチ型関節
炎又は重症筋無力症である方法を提供する。 【００３４】２０．本発明は、哺乳類における自己免疫
障害を処置する方法であって、哺乳類に、薬理学的に許
容される担体、及び自己抗原性ペプチドと抗原結合部位
を有する単離ＭＨＣ成分とより本質的に構成され、ここ
でこの抗原性ペプチドがこの抗原結合部位に連結されて
いる純粋なＭＨＣ−ペプチド複合体を含んで成る薬理組
成物を治療的に有効な量で投与することを含んで成る方
法を提供する。 【００３５】２１．１つの実施形態において、本発明
は、上記薬理組成物を静脈内投与する方法を提供する。 【００３６】２２．１つの実施形態において、本発明
は、上記の有効投与量が、体重のｋｇ当り約０．０１５
μｇのＭＨＣ−ペプチド複合体〜体重のｋｇ当り約１５
μｇのＭＨＣ−ペプチド複合体である方法を提供する。 【００３７】２３．１つの実施形態において、本発明
は、上記の有効投与量が、体重のｋｇ当り約０．１５μ
ｇのＭＨＣ−ペプチド複合体〜体重のｋｇ当り約１０μ
ｇのＭＨＣ−ペプチド複合体である方法を提供する。 【００３８】２４．１つの実施形態において、本発明
は、自己免疫障害がリウマチ型関節炎又は多発性硬化症
である方法を提供する。 【００３９】２５．本発明は、抗原性ペプチドと抗原結
合部位を有する単離ＭＨＣ成分とより本質的に構成され
る複合体を製造するための方法であって：上記ＭＨＣ成
分を生産する細胞からこの成分を単離し；このＭＨＣ成
分をペプチドと接触させてこのペプチドがその抗原結合
部位と結合するようにさせ；そしてこの抗原結合部位に
結合していない過剰のペプチドを除去すること、を含ん
で成る方法を提供する。 【００４０】２６．１つの実施形態において、本発明
は、上記の過剰なペプチドを除去する段階を、限外濾過
で行う方法を提供する。 【００４１】２７．１つの実施形態において、本発明
は、上記の複合体を脂質の存在下で透析してリポソーム
を形成する段階を更に含んで成る方法を提供する。 【００４２】２８．１つの実施形態において、本発明
は、上記のペプチドが上記の抗原結合部位に非共有結合
している方法を提供する。 【００４３】２９．１つの実施形態において、本発明
は、上記のＭＨＣ成分が主要組織適合性複合体のクラス
ＩＩ糖タンパク質である方法を提供する。 【００４４】３０．１つの実施形態において、本発明
は、上記ペプチドがＭＢＰのうちのアミノ酸１〜１４を
含んで成る方法を提供する。 【００４５】 【発明の実施の形態】本発明はＴ細胞機能を調節するの
に利用できる複合体を提供する。例えば、該複合体は有
害なＴ細胞仲介型免疫応答、例えばアレルギー応答、同
種異系移植片拒絶及び自己免疫障害を阻止するのに利用
できる。更に、本発明の複合体は免疫応答を助長するた
めに利用でき、従ってワクチンとして利用できる。この
態様において、ＭＨＣ成分（クラスＩ又はクラスＩＩの
両方）は、典型的には共刺激性シグナルに関与するリガ
ンドを抱える競合抗原表示細胞への連結が可能となるよ
うに改質される。他方、この複合体をＴ細胞増殖を誘発
する単離化共刺激性リガンドに連結させてよい。従っ
て、Ｔ細胞はこの複合体により表示される抗原性ペプチ
ドに応答し、そして免疫応答が触発されるであろう。 【００４６】本発明の複合体は少なくとも２種の成分を
含む：自己抗原を表示するペプチド又は免疫系に関連の
影響を及ぼす効果を有するその他の抗原性配列、及び抗
原表示に関与するＭＨＣコード化糖タンパク質の有効領
域。ＭＨＣ糖タンパク質の有効領域は、抗原結合性部位
及び適当なＴ細胞レセプターによりこのＭＨＣペプチド
複合体が認識されるために必要な配列を含んで成る。こ
のＭＨＣ成分はクラスＩ又はクラスＩＩ分子のいづれで
もよい。ペプチド抗原とＭＨＣタンパク質の抗原結合部
位との連結は共有又は非共有結合でよい。 【００４７】他の態様において、該複合体は一般に毒素
又はラベルであるエフェクター成分を含んでよい。この
エフェクター領域はＭＨＣコード化糖タンパク質又は自
己抗原性ペプチドのいづれかにコンジュゲートされてい
てよい。エフェクター成分を含む複合体は同時係属出願
Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／３６７，７５１号（１９８９年
７月２１日出願、前掲）に開示され、請求の範囲となっ
ている。 【００４８】この系の成分それぞれは下記にそれぞれ説
明する；それに、これらの複合を製造する、評価する及
び利用する方法の説明が続く。 【００４９】ＭＨＣ誘導化成分ＭＨＣによりコードされ
る糖タンパク質はヒト及びネズミの系の両方でかなり研
究されている。一般にそれらは、全ての細胞の表層上で
見い出され、且つ、主として細胞毒性Ｔ細胞により認識
されるクラスＩ糖タンパク質；及びマクロファージのよ
うなアクセサリー細胞を含むいくつかの細胞の表層上に
見い出され、且つ、ヘルパーＴ細胞への抗原の表示に関
与するクラスＩＩとして分類されている。組織適合性タ
ンパク質のうちのいくつかは単離、且つ、特性化されて
いる。ＭＨＣ糖タンパク質の構造及び機能の一般的な報
告については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ，第２版，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編，Ｒａｖｅｎｓ
Ｐｒｅｓｓ Ｎ．Ｙ．１９８９を参照のこと（これは引
用して本明細書に組入れる）。本明細書で用いる「単離
ＭＨＣ成分」とは、ＭＨＣ糖タンパク質、又はＭＨＣ糖
タンパク質の有効領域（即ち、抗原結合性部位、又は適
当なＴ細胞レセプターにより認識されるために必要な部
位及び配列を含んで成るもの）を意味し、これはその天
然状態以外の状態、例えばＭＨＣを通常発現する細胞の
細胞膜と結合していない状態にある。下記に詳細する通
り、該ＭＨＣ成分は組換的に生産でき、適当な細胞起源
から可溶化されるか、又はリポソームと結合していてよ
い。ヒトＭＨＣ分子のためには、ヒトリンパ芽球症細胞
が特に好ましい。 【００５０】ネズミＩ−Ａ（クラスＩＩ）組織適合性タ
ンパク質を精製するための方法はＴｕｒｋｅｗｉｔｚ
Ａ．Ｐ．らＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
（１９８３）２０：１１３９−１１４７（引用すること
で本明細書に組入れる）に開示されている。クラスＩ分
子にとっても適切であるこれらの方法は、非イオン性清
浄剤、例えばＮＰ−４０、ツイーン８０等を用いての、
所望のＭＨＣ分子を含む細胞からの可溶性膜抽出物の調
製を包含する。次にＭＨＣ分子を、所望のＭＨＣ分子に
対して発生せしめた抗体を含むカラムを用いるアフィニ
ティークロマトグラフィーにより精製する。溶離バッフ
ァーの中に０．０２％のツイーン８０を利用することは
精製分子の凝集を排除するのに役立つ。 【００５１】Ｉ−Ａ及びＩ−Ｅサブ領域によりコードさ
れる単離抗原は２つの非共有結合ペプチド鎖、即ち、３
２〜３８ｋｄのアルファー鎖と２６〜２９ｋＤのべータ
ー鎖より成ることが示されている。第３の不変の３１ｋ
ｄのペプチドがこの２つのペプチドに非共有的に結合し
ているが、しかしそれは多形態ではなく，そして細胞表
層上の抗原の成分であることが認められていない（Ｓｅ
ｋａｌｙ，Ｒ．Ｐ．のＪ．Ｅｙｐ．Ｍｅｄ．（１９８
６）１６４：１４９０−１５０４〔引用することで本明
細書に組入れる〕）。Ｉ−Ａ領域の７つの対立遺伝子変
種のアルファー及びベーター鎖がクローンされ、且つ、
配列化されている（Ｅｓｔｅｅｎ，「Ｔｃｅｌｌ Ｃｌ
ｏｎｅｓ」３−１９）。 【００５２】ヒトクラスＩタンパク質も研究されてい
る。染色体６上のヒトのＭＨＣ（ＨＬＡ）は３つの遺伝
子座、ＨＬＡ−，ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃを有し、そ
の最初の２つは同種異系抗原をコードする大量の対立遺
伝子を有する。これらは４４ｋｄのサブユニット及び１
２ｋｄのべーター２−マイクログロブリンサブユニット
より成ることが見い出され、これは全ての抗原特異性に
共通している。これらの清浄剤可溶性ＨＬＡ抗原の単離
は、全て引用することで本明細書に組入れる、Ｓｐｒｉ
ｎｇｅｒ，Ｔ．Ａ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７６）７３：２４８１−２４８
５；Ｃｌｅｍｅｎｔｓｏｎ，Ｋ．Ｊ．ら「Ｍｅｍｂｒａ
ｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ａｚｚｉ，Ａ．編；Ｂｊｏｒ
ｋｍａｎ，Ｐ．，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ Ｈａｒｖａ
ｒｄ（１９８４）に記載されている。 【００５３】更なる研究が、クラスＩヒト抗原であるＨ
ＬＡ−Ａ２の３次元構造の詳細絵図によりもたらされて
いる（Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ（１
９８７）３２９：５０６−５１２，５１２−５１８；こ
れは引用することで本明細書に組入れる）。この絵図に
おいて、β２−マイクログロブリンと重鎖のアルファー
３セグメントが結合している；重鎖のアルファー１及び
アルファー２領域はペプチドが結合する抗原結合性部位
を形成しているものと認められる（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１
９８７）２３８：６１３−６１４；引用することで本明
細書に組入れる；Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．ＪらＮａｔｕ
ｒｅ（前掲））。可溶性ＨＬＡ−Ａ２は、引用すること
で全てを本明細書に組入れるＴｕｒｎｅｒ，Ｍ．Ｊ．ら
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｎ．（１９７７）２５２：７５５
５−７５６７に記載の通り、ホモ接合ヒトリンパ芽球症
細胞系Ｊ−Ｙからの原形質膜のパパイン消化の後に精製
できる。パパインはトランスメンブラン領域付近の４４
ｋｄの鎖を切断して、アルファー１、アルファー２、ア
ルファー３及びβ２マイクログロブリンを含んで成る分
子をもたらす。クラスＩＨＬＡ−Ａ２抗原の推定三次元
構造の代表を図２に示す。 【００５４】クラスＩＩＭＨＣ抗原の三次元構造は詳し
く知られていないが、クラスＩＩ糖タンパク質はクラス
ＩＩと似たように、抗原結合性部位を含むドメイン構造
を有すると考えられている。これは膜二重層から伸び
た、２本のクラスＩＩ鎖のＮ−末端ドメイン領域より成
る。一方の鎖のＮ−末端領域は、ＭＨＣクラスＩ抗原の
アルファー１及びアルファー２の領域と相同性の２つの
ドメインを有する。クラスＩＩ遺伝子のクローニング
（Ｅｓｔｅｅｓ前掲に記載）は、下記に記載のようなク
ラスＩＩＭＨＣ結合性ドメインの取扱いを可能とする。 【００５５】本発明の複合体のＭＨＣ糖タンパク質領域
は、リンパ球からの単離により獲得でき、そして所望の
ペプチド抗原に結合する能力についてスクリーンされう
る。これらのリンパ球は該複合体で処置すべき個体の種
に由来する。例えば、それらは標的自己免疫障害に苦し
む個体に由来するヒトＢ細胞から単離でき、当業界に知
られる技法を利用して、複製欠陥エプステイン−バ−ウ
ィルスによる形質転換によって不死化せしめる。 【００５６】ＭＨＣ糖タンパク質は、パパインによる処
理、３ＭのＫＣｌによる処理及び清浄剤による処理での
可溶化を含む様々な技法を用いて多数の細胞から単離さ
れる。好ましい方法においては、リンパ球からのクラス
ＩＩタンパク質の清浄剤抽出、それに続くアフィニティ
ー精製が利用される。次に清浄剤は透析により、又は選
択結合性ビーズ、例えばＢｉｏ Ｂｅａｄｓによって除
去できる。 【００５７】他方、多数のクラスＩＩタンパク質のそれ
ぞれのアミノ酸配列が知られ、そしてその遺伝子がクロ
ーンされており、従って組換法によってタンパク質を作
ることができる。第１世代合成ＭＨＣタンパク質におい
て、重（アルファー）及び軽（ベーター）鎖は、疎水性
ドメインの欠落を及ぼすカルボキシ末端切除を利用して
合成され、そしてこのカルボキシ末端は毒素又はラベル
のコンジュゲーションを助長するために任意的に選択で
きる。例えば、図３に示すＭＨＣタンパク質において
は、リジン残基が導入されている。更に、この鎖のジス
ルフィド結合を形成せしめる手段を担うためにカルボキ
シ末端付近にシステイン残基が含まされている。この合
成遺伝子は発現ベクターの中への挿入及び類似体をコー
ドするための遺伝子配列の操作に役立つ制限部位を含ま
せることもできる。次にこのアルファー及びベーター鎖
を発現ベクターの中に挿入し、適当な宿主例えばＥ．コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はその他の適切な細胞の中で個別
に発現させ、次いで獲得できた組換タンパク質をペプチ
ド抗原の存在下で組換える。 【００５８】遺伝子の多様性は配列の容易な操作を可能
とするため、好ましい構築体の第２世代は図４に示すよ
うにハイブリドなクラスＩとクラスＩＩの特徴を含み、
ここでクラスＩＩＭＨＣのアルファー１とベーター１の
ドメインは柔軟性領域を通じて連結され、これはこれら
のドメイン間での分子内二量化を可能とし、端から端に
わたるベーターシート接触をもたらしめる。次にこのベ
ーター１セグメントをクラスＩのアルファー２ドメイン
と融合させ、ここでこの複合体を安定化せしめるために
べーター２マイクログロブリンは共発現される。クラス
Ｉ遺伝子のトランスメンブラン及び細胞内ドメインも誘
発させることができるが、しかしながら該複合体を輸送
するためにリポソームを利用しない限り、それを行う意
味はないであろう。より簡単なバージョンはアルファー
１及びベーター１ドメインと、毒素コンジュゲーション
のためのＣ末端リシンとを有する（図４）。 【００５９】適当なＤＮＡ配列からの発現ベクターの構
築及び組換体の製造は本質的に当業界に知られる方法に
よって実施される。発現は原核系又は真核系の中で行う
ことができる。原核系はたいていＥ．コリの様々な株で
代表される。しかしながら、その他の微生物株、例えば
バチルス属（ｂａｃｉｌｌｉ）、例えばバチルス スブ
チリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｉｔｉｌｓ）、シュ
ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｓａｓ）の様々な種、又
はその他の細菌株を利用することもできる。かかる原核
系において、宿主と適合する種に由来する複製起点及び
コントロール配列を含むプラスミドが利用される。例え
ば、Ｅ．コリは一般に、Ｅ．コリの種に由来するプラス
ミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換され
る（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ（１９７７）２：９
５）。一般に利用され、本明細書で規定する原核コント
ロール配列には、転写開始のためのプロモーター、任意
的にオペレーターを、リボソーム結合部位配列と一緒に
含み、それには、一般に用いられているプロモーター、
例えばベーターラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラ
クトース（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇｅら、
Ｎａｔｕｔｅ（１９７７）１９８：１０５６）及びトリ
プトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ
ら、Ｎａｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８
０）８：４０５７）、並びにラムダー誘導Ｐｒプロモー
ター及びＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔ
ａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）
が含まれる。上記又は下記の全ての文献は引用すること
で本明細書に組入れる。 【００６０】真核系宿主において有用な発現系は適当な
原核系遺伝子に由来するプロモーターを含んで成る。例
えば酵母において有用なプロモーターのクラスには、３
−ホスホグリセラートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：２０７
３）についてのプロモーターを含む、解糖酵素の合成の
ためのプロモーターが含まれる。その他のプロモーター
には、エノラーゼ遺伝子（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｍ．Ｊ．
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，（１９８１）２５６：１
３８５）又はＹＥｐ１３から獲得したＬｅｕ２遺伝子
（Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．らＧｅｎｅ（１９７８）８：１２
１）に由来するものが挙げられる。 【００６１】適切な哺乳類系プロモーターにはＳＶ４０
由来の初期及び後期プロモーター（Ｅｉｅｒｓら、Ｎａ
ｔｕｒｅ（１９７８）２７３：１１３）、又はポリオー
マ、アデノウィルスＩＩ、ウシパピロマウィルスもしく
は鳥類サルコマウィルスに由来するようなその他のウィ
ルス性プロモーターが含まれる。適当なウィルス及び哺
乳類系エンハンサーは上記に記載されている。 【００６２】発現系は、当業界によく知られている標準
のリゲーション及び制限技法を採用する標準方法によ
り、ＭＨＣ配列に作動連結すべき上記のコントロール因
子から構築される。単離したプラスミド、ＤＮＡ配列又
は合成オリゴヌクレオチドを切断し、仕立て、そして所
望の形態に再リゲートさせる。 【００６３】部位特異的ＤＮＡ切断は、適当な制限酵素
で、当業界によく知られ、且つ、これらの市販の制限酵
素の製造業者により特定された条件のもとで処理するこ
とにより実施される。別えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓの製品カタログを参照のこと。一般に
は、約１μｇのプラスミド又はＤＮＡ配列を約２０μｌ
のバッファー溶液の中で一単位の酵素で切断せしめる；
本明細書の実施例においては、典型的には、ＤＮＡ基質
の完全な消化を確実とするために過剰の制限酵素を用い
ている。約３７℃で約１ｈｒ〜２ｈｒのインキュベーシ
ョン時間が有用であるが、その変更は寛容される。各イ
ンキュベーションの後、タンパク質をフェノール／クロ
ロホルム抽出によって除去し、次いでエーテル抽出を続
けてよく、そして核酸は水性画分から、エタノールによ
る沈殿、それに続いてセファデックスＧ−５０スピンカ
ラムに付することによって回収できる。所望するなら
ば、切断フラグメントのサイズ分離を標準の技術を用い
てポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲル電気泳動
により実施してよい。サイズ分離の一般的な詳細はＭｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｄｏｇｙ（１９８０）６
５：４９９−５６０に見い出せる。 【００６４】制限切断フラグメントは、Ｅ．コリＤＮＡ
ポリメラーゼＩの大きなフラグメント（クレノウ）によ
り、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）
の存在下において、約１５〜２５分のインキュベーショ
ン時間を利用し、２０〜２５℃で、５０ｍＭのトリスｐ
Ｈ７．６，５０ｍＭのＮａＣｌ，６ｍＭのＭｇＣｌ２，
６ｍＭのＤＴＴ及び５〜１０μＭのｄＮＴＰの中で処理
することによってブラント末端化してよい、このクレノ
ウフラグメントは５’接着末端を補完するが、しかしな
がら突出し３’一本鎖を、たとえ４種のｄＮＴＰが存在
していたとしても傷つけてしまう。所望するなら、接着
末端の性質により示される制限内で、１種のみの、又は
特定のｄＮＴＰを供給することによって選択修復を行っ
てよい。クレノウによる処理の後、その混合物をフェノ
ール／クロロホルム及びエタノールで抽出し、続いてセ
ファデックスＧ−５０スピンカラムに付する。 【００６５】合成オリゴヌクレオチドは市販の自動オリ
ゴヌクレオチド合成装置を用いて調製される。アニーリ
ング前又はラベリングのための一本鎖のリン酸化は、過
剰の、例えば約１０単位のポリヌクレオチドキナーゼを
０．１ｎｍｄｅの基質に対して、５０ｍＭのトリス、ｐ
Ｈ７．６，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，５ｍＭのジチオスレ
イトール、１〜２ｍＭのＡＴＰ，１．７ｐｍｏｌｅの
３２Ｐ−ＡＴＰ（２．９ｍＣｉ／ｍｍｏｌｅ），０．１
ｍＭのスペルジミン、０．１ｍＭのＥＤＴＡの存在下で
用いることによって達せられる。 【００６６】リゲーションは１５〜３０μｌの容量の中
で、下記の標準条件及び温度のもとで行った：２０ｍＭ
のトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭのＭｇＣ
ｌ２，１０ｍＭのＤＴＴ，３３μｇ／ｍｌのＢＳＡ，１
０ｍＭ〜５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０℃で４０μＭのＡ
ＴＰ，０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（「接着末端」リゲーションのため）又は
１４℃で１ｍＭのＡＴＰ，０．３〜０．６（Ｗｅｉｓ
ｓ）単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（「ブラント末端」リゲ
ーションのため）。分子内「接着末端」リゲーションは
通常３３〜１００μｇ／ｍｌの総ＤＮＡ濃度（５〜１０
０μＭの最終濃度）で行った。分子内「ブラント末端」
リゲーション（通常、１０〜３０倍の過剰量のリンカー
を利用する）は１μＭの総最終濃度で行う。 【００６７】「ベクターフラグメント」を利用するベク
ターの構築において、ベクターフラグメントは通常５’
リン酸を除くため及びベクターの再リゲーションを防ぐ
ために細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理
する。ＢＡＰ消化はｐＨ８にて約１５０ｍＭのトリスの
中で、Ｎａ＋及びＭｇ２＋の存在下において、ベクター
のμｇ当り約１単位のＢＡＰを用いて、６０℃で約１ｈ
ｒ行う。核酸フラグメントを回収するため、その調製品
をフェノール／クロロホルム及びエタノール沈殿で抽出
し、そしてセファデックＧ−５０スピンカラムヘの適用
によって脱塩する。他方、再リゲーションは、不要のフ
ラグメントの追加の制限酵素消化により二重消化せしめ
たベクターにおいては防がれうる。 【００６８】配列改質を必要とするｃＤＮＡ又はゲノム
ＤＮＡ由来のベクターの領域に関して、部位特異的プラ
イマー誘発化突然変異誘発が利用できる。これは所望の
突然変異を提供する、一定の誤対合を除いて突然変異す
べき一本鎖ファージＤＮＡに相補性であるプライマー合
成オリゴヌクレオチドを用いることによって行われる。
簡単に述べると、ファージに相補性な鎖の合成を誘導す
るプライマーとして合成オリゴヌクレオチドを用い、そ
して得られる二本鎖ＤＮＡをファージ保持宿主細菌へと
形質転換させる。形質転換細菌の培養物をトップアガー
においてプレートして、ファージが抱える単一細胞から
プラークを形成させる。 【００６９】理論的には、新しいプラークの５０％が、
一本鎖として突然変異形態を有するファージを含み；５
０％はもとの配列を有するであろう。得られるプラーク
をリン酸化合成プライマーと、ある温度であって正しい
対合を可能とするが、ただしもとの鎖との誤対合はハイ
ブリダイゼーションを妨げるのに十分であるような温度
でハイブリダイズさせる。次にプーブとハイブリダイズ
するプラークを拾い、培養し、次いでＤＮＡを回収す
る。 【００７０】しかしながら、本発明のタンパク質におい
て、合成遺伝子を好適に利用できる。遺伝子のデザイン
は制限部位を含んでよく、これはコード配列領域を、類
似体をコードするこれらで置き換える遺伝子の容易な操
作を可能とする。 【００７１】プラスミドの構築のための正しいリゲーシ
ョンは、Ｅ．コリＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋ Ｃｅｎｔ
ｅｒ，ＣＧＳＣ ＃６１３５より獲得できるＥ．コリ株
ＭＭ２９４又はその他の適当な宿主をこのリゲーション
混合物でまず形質転換することによって確認できる。有
効な形質転換体は、アンピシリン、テトラサイクリンも
しくはその他の抗生物質耐性により、又は当業界に知ら
れるプラスミド構築の手法に応じたその他のマーカーを
用いて選ばれうる。この形質転換体に由来するプラスミ
ドを次にＣｌｅｗｅｌｌ，Ｄ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６９）６２：１
１５９、の方法、任意的にクロラムフェニコール増幅
（Ｃｌｅｗｅｌｌ，Ｄ．Ｂ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
（１９７２）１１０：６６７）を続けて用意する。この
単離ＤＮＡを制限により分析するか、及び／又はＳａｎ
ｇｅｒ，Ｆ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（１９７７）７４：５４６３、更にはＭｅｓ
ｓｉｎｇらＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９
８１）９：３０９のジデオキシ法、又はＭａｘａｍらＭ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｄｏｇｙ（１９８０）
６５：４９９の方法により配列化する。 【００７２】構築したベクターを次にタンパク質の製造
のために適当な宿主の中に導入する。用いる宿主細胞に
応じて、形質転換はかかる細胞に適する標準技術を用い
て行う。Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７２）６９：２１１０
に記載の塩化カルシウムを用いるカルシウム処理、又は
ＭａｎｉａｔｉｓらＭｏｌｅｃａｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８
２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓ
ｓ，頁２５４に記載のＲｂＣｌ法が、原核系又は実質的
な細胞壁バリヤーを含むその他の細胞にとって利用され
る。かかる細胞壁を有さない哺乳動物細胞にとっては、
Ｇｒａｈａｍとｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ．のＶｉｒｏｌｏ
ｇｙ（１９７８）５２：５４６のリン酸カルシウム沈殿
法又はエレクトロポレーションが好ましい。酵母への形
質転換はＶａｎ Ｓｏｌｉｎｇｎｅｎ，Ｐ．らＪ．Ｂａ
ｃｔｅｒ．（１９７７）１３０：９４６及びＨｓｉａ
ｏ，Ｃ．Ｌ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３８２９の方法に従って
実施する。 【００７３】次にこの形質転換細胞を、ＭＨＣ配列の発
現にとって好ましい条件で培養し、次いで組換生産タン
パク質をこの培養物から回収する。 【００７４】抗原性ペプチド 数多くの自己免疫障害に関する自己抗原性タンパク質又
は組織が知られている。例えば、実験的誘発型自己免疫
障害において、病理に関与する抗原が特性化されてい
る：ラット及びマウスの関節炎において、天然のＩＩ型
コラーゲンがコラーゲン誘発型関節炎において同定さ
れ、そしてミコバクテリア−ヒートショックタンパク質
がアジュバント関節炎において同定されている（Ｓｔｕ
ａｒｔら（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．２：１９９−２１８；ｖａｎ Ｅｄｅｎら（１９８
８）Ｎａｔｕｒｅ ３３１：１７１−１７３。）；チロ
グロブリンがマウスにおける実験的アレルギー性甲状腺
炎（ＥＡＴ）において同定されている（Ｍａｒｏｎら
（１９８８），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：１１１５
−１１２０）；実験的アレルギー性重症筋無力症（ＥＡ
ＭＧ）においてはアセチルコリンレセプター（ＡＣｈ
Ｒ）（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍら（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．４２：２３３−２８４）；そしてマウス及
びラットにおける実験的アレルギー性起脳炎（ＥＡＥ）
においてはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）（Ａｃ
ｈａ−Ｏｒｂｅａら、前掲を参照のこと）。更に、例え
ば標的抗原がヒトにおいて同定されている：ヒトリウマ
チ型関節炎におけるＩＩ型コラーゲン（Ｈｏｌｏｓｈｉ
ｔｚら（１９８６）Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ：３０５−３０
９）；及び重症筋無力症におけるアセチルコリンレセプ
ター（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍら（１９８８）前掲）。上記
の全ての文献は引用することで本明細書に組入れる。 【００７５】抗原表示細胞（ＡＰＣｓ）の表層上のＭＨ
Ｃ糖タンパク質による抗原の表示は、抗原性タンパク質
の小さなペプチド単位への加水分解に続いて起こると信
じられている。抗原性タンパク質におけるこれら小さめ
のセグメントの位置は実験的に決定できる。これらのセ
グメントは長さにおいて１８残基数であり、そしてアグ
レトープ（ＭＨＣ分子により認識）及びエピトープ（Ｔ
ヘルパー細胞上のＴ細胞レセプターにより認識）の両方
を含むと考えられている。このエピトープ自体は５〜６
個のアミノ酸の連続又は非連続配列であり、これはＴヘ
ルパー細胞の抗原特異的レセプターを認識する。アグレ
トープは、ペプチドとＭＨＣ糖タンパク質との結合にと
って重要な連続又は非連続配列である。 【００７６】関連の８〜１８個のアミノ酸のサブユニッ
トの決定の実験プロセスは、骨格筋のアセチルコリンレ
セプターのアルファーサブユニットを利用して例示して
いる。重症筋無力症（ＭＧ）において、自己免疫応答は
このサブユニットの領域に向けられている。神経筋接合
部のシナプス後部膜上でのアセチルコリンレセプターの
欠失はＭＧ症状の原因となる。 【００７７】ＭＧにおいて、アセチルコリンレセプター
（ＡＣｈＲ）のアルファーサブユニットに対する自己抗
体は、ＡＣｈＲに向けられた自己免疫応答に関連する。
ＭＧ患者のうちの８５％がアルファーサブユニットに反
応性な自己抗体を有する。これらのうち、６０％が残基
６０及び８０の間に位置している主免疫原領域（ＭＩ
Ｒ）と呼ばれるアルファーサブユニットのペプチドセグ
メントに結合する抗体を有する（ＴｚａｒｔｏｓとＬｉ
ｎｄｓｔｒｏｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７：７５５）。自己反応性ヒ
トＴ細胞により認識されるペプチドセグメントはアルフ
ァーサブユニット上にも位置している（Ｈｏｈｆｉｅｌ
ｄらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
（１９８７））。これらのＴ細胞により認識されるエピ
トープは残基１−３０，１２５−１４７，１６９−１８
１，２５７−２７１及び３５１−３６８にある。更に、
ヒトにおいてＡＣｈＲぺプチド１９５−２１２及び２５
７−２６９が、ＨＬＡ−ＤＲ５及びＨＬＡ−ＤＲ３のＤ
Ｑｗ２ ＭＨＣハプロタイプの重症筋無力症患者のそれ
ぞれにおけるエプトープとして一部特性化されている
（Ａｃｈａ−Ｏｒｂｅａ（１９８９）前掲を参照のこ
と）。 【００７８】このレセプターのアルファーサブユニット
に関連するエピトープの表示が可能である、アグレトー
プを抱えるペプチドは容易に決定される。例えば、マウ
スのモデルにおける適切なペプチドの決定は以下の通り
に実施される。 【００７９】トルペドカリホルニカス（Ｔｏｒｐｅｄｏ
ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ）ＡＣｈＲで免疫したとき
にヒト重症筋無力症の数多くの特徴を有する障害を発症
するマウスの株をモデルとして用いた。ＭＨＣクラスＩ
Ｉ糖タンパク質をレクチン及びモノクローナル抗体アフ
ィニティー支持体を用いてこの株のマウスの脾臓細胞が
単離した。この精製ＭＨＣクラスＩＩタンパク質を清浄
剤透析によってリン脂質小胞の中に含ませた。得られる
小胞を次に清浄なガラスカバースリップに融合させて、
図５に示すようなそれぞれの上にＭＨＣ分子を含む平ら
な脂質二重層を作った（Ｂｒｉａｎ ａｎｄ ＭｃＣｏ
ｎｎｅｌｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ（１９８４）８１：６１５９、これは引用するこ
とで本明細書に組入れる）。 【００８０】付着平面脂質膜の中に包埋されたＭＨＣク
ラスＩＩ分子を含む一枚のカバースリップを数枚の２４
穴培養プレートの各ウエルの中に入れた。アルファーサ
ブユニット配列に相当し、且つ、１又は複数の放射性ラ
ベル化アミノ酸残基（下記の通りに調製）を含む約４０
種の重複２０残基合成ペプチドのそれぞれをカバースリ
ップ及びＰＢＳと一緒にウェルの中に入れ、そして数日
インキュベートした。ＭＨＣクラスＩＩ糖タンパク質抗
原結合部位におけるペプチドの結合の程度は、カバース
リップ上のＭＨＣクラスＩＩ−平面脂質膜、対、平面脂
質膜のみ、の中に一体化された放射活性の値により決定
した。放射活性の特異的な一体化は、結合ペプチドが、
平面脂質膜の中に存在している複数の種のＭＨＣクラス
ＩＩ分子のうちの一つのアグレトープ（ＭＨＣクラスＩ
Ｉペプチド結合部位）を含むことを示唆する。これによ
り、ＡＣｈＲのアルファーサブユニットのための一連の
アグレトープを、ＡＣｈＲ又は精製アルファーサブユニ
ットによる免疫に基づいてＭＧ症状を示すマウス株につ
いて規定する。 【００８１】次に、アグレトープを含む各アルファーサ
ブユニット合成ペプチドセグメントを再びカバースリッ
プ上の平面脂質膜に包埋されている単離ＭＨＣクラスＩ
Ｉタンパク質の抗原結合部位の中に含ませる。一枚のカ
バースリップを２４穴培養プレートの各ウェルに加え、
次いでこの各ウェルにＡＣｈＲに対して免疫されたマウ
ス（及び付着性ＭＨＣクラスＩＩタンパク質が単離され
た株）に由来する脾臓細胞を加えた。ＤＮＡへのトリチ
ウム化チミジンの取込みにより決定されるＴ細胞ハイブ
リドーマ増殖は、Ｔ細胞への結合のためのアグレトープ
及びエピトープの両者をＭＨＣクラスＩＩタンパク質結
合ペプチドが含むことを示唆する。Ｔ細胞クローンの活
性化はＩＬ−３生産を測定することによって決定される
（Ｑｕｉｌｌら、前掲を参照のこと）。 【００８２】ペドカリホルニカスＡＣｈＲのアルファー
サブユニット由来の重複（１０残基が重複）２０残基ペ
プチドのセットの構成員を合成するよう、迅速多重ペプ
チド合成（ＲＡＭＰＳ）のためのＤｕｐｏｎの装置及び
技術を利用した。このペプチドの配列は知られ、そして
図６に示す。１又は複数の放射活性アミノ酸が各合成ペ
プチドの中に一体化されている。ペプチドを合成するた
めに側鎖保護型ＦＭＯＣアミノ酸のペンタフルオロフェ
ニル活性エステルを利用し、標準の逐次固相ペプチド合
成法、それに続く標準の側鎖脱保護及び固相支持体から
のペプチドの同時遊離を利用した。 【００８３】他方、抗原性タンパク質、例えばアセチル
コリンレセプタータンパク質の８〜１８個のアミノ酸の
推定セグメントを含む重複配列が、Ｇｅｙｓｅｎ Ｈ．
Ｍ．らＪ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．（１９８７）１０
２：２７４（引用することで本明細書に組入れる）の方
法で合成できる。合成した放射性ラベル化ペプチドを、
それぞれ（プレート上で）、前記の通り脂質膜の中へと
配合せしめた精製ＭＨＣタンパク質とインキュベートす
ることにより試験した。 【００８４】中枢神経系におけるミエリン鞘の破壊をも
たらす多発性硬化症（ＭＳ）においては、ミエリンの主
要タンパク質成分が主な自己抗原である。ＭＢＰタンパ
ク質の適切なセグメントは、ウシミエリン塩基性タンパ
ク質で免疫したときに実験的アレルギー性起脳炎（ＥＡ
Ｇ）を発症するマウスの株を用いて実験的に決定するこ
ともでき、ＭＢＰの配列は図７に示す。 【００８５】全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は複雑
な症候であるが、しかしこれは赤血球に対する自己免疫
応答に由来する。この障害の抗原性エフェクターである
ペプチドは赤血球の表層上のタンパク質の中に認められ
る。 【００８６】リウマチ型関節炎（ＲＡ）は、滑液の中で
見い出せるタンパク質に対する免疫応答に由来する慢性
炎症障害である。 【００８７】インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）
は、インスリンの分泌にとって重要なランゲルハンス島
内のべーター細胞の自己免疫攻撃に由来する。島細胞表
層抗原及びインスリンに対する循環抗体はＩＤＤＭに先
行することが知られている。ＩＤＤＭにおける免疫応答
を排除するうえで重要なペプチドはインスリン配列及び
ベーター細胞膜表層タンパク質の一部であると信じられ
ている。 【００８８】関連の抗原性ペプチドサブユニットはそれ
らが比較的短いため、ペプチド合成にとっての標準の自
動化方法を用いて容易に合成できる。他方、それらは単
離又は合成ＤＮＡを用いて組換的に作製されうるが、こ
れはこの長さのペプチドにとっての最も効率的な手法で
はない。 【００８９】従って、まとめると、一連のラベル化試験
ペプチドを用意し、そしてＭＨＣタンパク質を含む平面
脂質膜の中のＭＨＣと結合するものがアグレトープを含
んでいることが示される。 【００９０】同定したペプチドを次に常用の固相合成で
調製し、そして障害誘発性ヘルパーＴ細胞クローンにつ
いてのエピトープを含むサブセットを、ネズミ抗原表示
細胞（ＡＰＣ）を有する（又は単離ＭＨＣ複合体を有す
る）候補のペプチドと、全長タンパク質で免疫したマウ
スに由来する脾臓又はリンパ腺のＴ細胞とのインキュベ
ーションによって決定した。有用な候補はこの系におい
てＴ細胞の増殖を刺激するであろう。この第２の小さな
サブセットは適当なペプチド成分を代表する。 【００９１】複合体の形成 該複合体の因子は当業界に知られる標準の手段により連
結させることができる。この抗原性ペプチドは、ＭＨＣ
タンパク質のポケット領域に、例えばこの二成分を混合
することによって非共有的に連結させることができる。
過剰のペプチドは数多くの標準的な手順のいづれか、例
えば限外濾過又は透析によって除去できる。このペプチ
ドは標準の手順を用いて、例えば光アフィニティーラベ
ル化によって共有結合させることができる（例えばＨａ
ｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４：５７０２−
５７１１（１９８５）を参照のこと、これは引用するこ
とで本明細書に組入れる）。 【００９２】例えば、ＡＣｈＲペプチド１９５−２１５
（これはヒト及びマウスにおけるＭＧのエピトープとし
て特性化されている）は、ＭＧに関連するＭＨＣ抗原に
由来のポリペプチドのＮ末端抗原結合部位に連結させる
ことができる。一文字アミノ酸コードにおけるＡＣｈｒ
ペプチドのアミノ酸配列はＤＴＰＹＬＤＩＴＹＨＦＩＭ
ＱＲＩＰＬＹＦＶである。該ペプチドをコードするオリ
ゴヌクレオチドはアミノ酸にとっての既知のコドンを利
用して合成され、好ましくは発現のために利用する生物
において好ましく利用されるコドンをオリゴヌクレオチ
ドのデザインにおいて利用する。例えばもしＥ．コリで
発現させるなら、ＡＣｈＲ１９５−２１５をコードする
適切なオリゴヌクレオチドは ５’ＧＡＣ ＡＣＣ ＣＣＧ ＴＡＣ ＣＴＧ ＧＡＣ
ＡＴＣ ＡＣＣ ＴＡＣ ＣＡＣ ＴＴＣ ＡＴＣ
ＡＴＧ ＣＡＧ ＣＧＴ ＡＴＣ ＣＣＧ ＣＴＧ Ｔ
ＡＣ ＴＴＣ ＣＴＧ ３’ でありうる。 【００９３】次にこの配列を当業界に知られる技法を利
用してＭＨＣ抗原に由来するペプチドをコードする配列
に一体化せしめる。この一体化部位は、この分子が発現
されて折りたたまれたとき、このＡＣｈＲペプチド抗原
が標的Ｔ細胞にとってのエピトープとして有用となるで
あろうようになる。 【００９４】あるプロトコールにおいて、ＡＣｈＲ１９
５−２１５ペプチドを適当なＭＨＣ分子のＮ−末端に連
結させる。もし組換複合体をマウスにおいて用いるな
ら、例えば、このＡＣｈＲペプチドをＩ−Ａｂ−アルフ
ァー又はＩ−Ａｂ−ベーター鎖のいづれかをコードする
配列の中に一体化せしめてよい。これらの鎖をコードす
る配列は知られており、そして図８（アルファー鎖）及
び図９（ベーター鎖）に示し；更に、この鎖の制限酵素
部位及び有意義なドメインをこの図に示す。もしＡＣｈ
Ｒペプチドをベーター鎖の中に一体化させるなら、例え
ばオリゴヌクレオチドをリーダーペプチドの代替物とし
て挿入してよい。ポリオリゴヌクレオチド内で配列を置
き換える方法は当業界に知られ、その例はプラスミドの
構築の章に説明してある。 【００９５】ＡＣｈＲペプチドの、適当なヒトＨＬＡ抗
原に由来するペプチドをコードする配列への一体化のた
めに類似のプロトコールが利用できる。例えば、ヒトに
おいて、ハプロタイプＤＲ２Ｗ２がＭＧに関与する。そ
れ故、ＡＣｈＲペプチドを例えばＤＲ２対立遺伝子のベ
ーター鎖をコードする配列の中に一体化させることがで
きる。数多くのＤＲハプロタイプに由来するＨＬＡ−Ｄ
Ｒ−ベーター鎖をコードする配列と同様に、主要血清学
特異性ＤＲ１−９にとってのＤＲサブ領域における構造
ベースが知られている。例えばＢｅｌｌら（１９８７）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
４：６２３４−６２３８を参照のこと（これは引用する
ことで本明細書に組入れる）。 【００９６】前述した通り、自己免疫抗原ペプチドとＭ
ＨＣ成分とはペプチド結合を介して連結させてよい。し
かしながら、連結のその他の態様が当業者に自明であ
り、そして例えばアルファー及び／又はベーター鎖の炭
水化物成分等を含む糖タンパク質上の炭水化物基を介す
る連結が含まれうる。 【００９７】複合体の評価 本発明の複合体はインビトロ系を用いて、又はインビボ
モデルを用いてアッセイできる。インビトロ系において
は、該複合体を、該複合体のペプチドに関与する症状の
原因であるタンパク質又は抗原によって免疫された、又
はそれらに対する免疫性を示す対象体由来の末梢血液Ｔ
細胞とインキュベートする。この有用な複合体は同系Ｔ
細胞においてアネルギーを誘発し、そして追加の抗原に
よる刺激によってさえもＴ細胞の増殖を防ぐ。 【００９８】インビボ系においては、ＡＰＣの存在下に
おいて、単離エピトープ又は全長抗原に対する応答で増
殖するＴ細胞をクローンする。これらのクローンは、自
己免疫障害を誘発させるために免疫化していない組織適
合性動物に注射した。関連の複合体に関連する症状は軽
減されるか、又はこの障害の症状は消えるであろう。 【００９９】いづれかのタイプの複合体、即ち、エフェ
クター成分を有するもの又は有さないものが利用でき
る。ある態様において、その処置は２重である。個体
を、抗原の有効領域を含むＭＨＣ−コード化抗原表示糖
タンパク質の複合体で処理して免疫系を下降制御する。
更なる下降制御は、ＭＨＣコード化抗原表示糖タンパク
質、処置すべき自己免疫障害に特異的な抗原の有効領域
及びエフェクター成分を含む三成分複合体による処理に
よって達せられる。更に、複合体のパネルを処置のため
に利用できうる。例えば、複数の抗原のペプチドが自己
免疫応答に関与することが予測されるとき、及び／又は
複数の抗原が関与することが予測されるとき、個体を、
適当なＭＨＣコード化抗原表示ポリペプチド及び抗原の
有効領域を含むパネルから選ばれた複数の複合体で処置
してよい；これらはエフェクター成分を有しても有して
いなくてもよい。 【０１００】ラベル化複合体の投与は診断用途におい
て、障害に関与する免疫系のかかる領域の同定を可能に
する。 【０１０１】治療及び／又は診断のためのＭＨＣ複合体
の選択 自己免疫障についての個体の診断又は処置において用い
るべき本発明のＭＨＣ複合体を選ぶため、自己抗原の表
示に関与するタイプのＭＨＣ抗原を同定する。 【０１０２】特異的な自己免疫機能不全は特定のＭＨＣ
のタイプに関連する。ヒトにおけるＤＱ／ＤＲハプロタ
イプ及び関連の自己免疫障害のリストを図１０に示す。
どの対立遺伝子、従ってどのＭＨＣコード化ポリペプチ
ドが自己免疫障害に結びついているかを同定する方法は
当業界に知られている。ＥＰ２８６４４７に記載の方法
が適切である。本法において、いくつかの工程を行っ
た。まず、ＭＨＣ抗原と自己免疫障害との関連を遺伝的
研究を基礎として決定する。この研究を実施するための
方法は当業者に周知であり、そしてヒトに関連する全て
の既知のＨＬＡ障害についての情報はコペンハーゲンの
ＨＬＡ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｇｉｓｔｒｙに
保存されている。この障害に関連するポリペプチドをコ
ードする遺伝子座がこの障害との最大の関連性を有する
ものである（図１０参照）。 【０１０３】第二に、障害関連ＭＨＣ抗原／ポリペプチ
ドをコードする特定の対立遺伝子を同定する。この対立
遺伝子の同定において、影響を受け易い対立遺伝子が有
力であると仮定される。対立遺伝子の同定は特定のサブ
タイプと障害との強力な陽性関係を決定することによっ
て達成される。これは数多くの方法で達成されることが
でき、全て当業者に知られている。例えば、サブダイピ
ングは複合型リンパ球応答（ＭＬＲ）タイピング及びプ
ライム化リンパ球試験（ＰＬ７）によって達成されう
る。両方の方法はＷｅｉｒとＢｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｈ
ａｎｄｂｏｏｋｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ（引用して本明細書に組入れる）に記
載されている。これは、検査すべきＭＨＣ遺伝子座に特
異的なプローブを用いてＤＮＡ制限フラグメント長多形
態（ＲＦＬＰ）を分析することによって達成されうる。
例えば、Ｎｅｐｏｍ（１９８６）Ａｎｎａｌｓ Ｎ．
Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４７５，１。ＭＨＣ遺伝子座に
ついてのプローブを用意する方法は当業者に知られてい
る。例えば、Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎら（１９８６）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５９
６６；Ｗｅｉｓｓｍａｎら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｉｎ
Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ：ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ
ｏｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉ
ｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｅ．
Ｐ．Ｃｏｈｅｎ編、１９８１）を参照のこと（これらは
引用して本明細書に組入れる）。 【０１０４】障害感受性を授けるサブタイプの最も完璧
な同定は、遺伝子座のゲノムＤＮＡ又はこの遺伝子座内
でコードされるｍＲＮＡに至るｃＤＮＡのシーケンシン
グによって達せられる。所望の領域を増幅するための、
プローブによる特に所望されるＤＮＡを同定するため技
術は当業界に知られ、そして例えばポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）技術が含まれる。 【０１０５】特定の自己免疫障害に対する感受性を授け
る対立遺伝子が同定されたら、この対立遺伝子内でコー
ドされるポリペプチドも同定できる。即ち、ポリペプチ
ド配列はそれをコードする対立遺伝子内のＤＮＡの配列
より推定できる。診断及び／又は治療のために用いる本
発明のＭＨＣ抗原複合体は自己免疫障害症状に関連する
ＭＨＣ抗原の有効領域及び同じ障害症状に関連する自己
免疫抗原に由来する。 【０１０６】例えば、リウマチ型関節炎患者のうちの９
０％以上がＤＲ４（Ｄｗ４），ＤＲ４（Ｄｗ１４）又は
ＤＲ１のハプロタイプを有する（図１０参照）。ヒトリ
ウマチ型関節炎における標的抗原はＩＩ型コラーゲンで
あることも知られている。それ故、リウマチ型関節炎を
有する個体の処置又は診断のために用いる本発明の複合
体には、ＩＩ型コラーゲンの有効領域と複合した、障害
誘発に関する抗原表示の可能な、又は障害抑制に関する
抗原表示の可能でないＤＲ４（Ｄｗ４），ＤＲ１及び／
又はＤＲ４（Ｄｗ１４）に由来のポリペプチドを含むも
のが挙げられる。 【０１０７】自己免疫障害の診断及び／又は処置のため
の本発明の複合体の利用に適しうるプロトコールを図１
１に示す。簡潔すると、自己免疫障害を有する（又はそ
れに感受性である）個体を同定し、そして自己免疫機能
不全を同定する。同定は症候学的に、及び／又は家族履
歴の調査によることができる。個体のＭＨＣタイプは当
業界に知られる１又は複数の方法、例えばＭＬＲ、血清
学アッセイ及びＤＮＡ分析（ＲＦＬＰ及びＰＣＲ技法を
含む）による細胞ダイピングを含む方法により決定され
る。個体のＴ細胞はインビトロで、自己反応性Ｔ細胞に
より認識される自己ペプチドを決定するために検査され
る；これは先に説明した本発明のラベル化複合体を利用
することで達せられ、これは式Ｘ’−ＭＨＣ２−ペプチ
ド（ここでＸはラベル成分である）で表わされる。どの
複合体がＴ細胞を標的とするかを決定した後、個体を、
特異的な自己反応性Ｔ細胞複製を抑制することのできる
本発明の複合体、及び／又は自己反応性Ｔ細胞を殺すこ
とのできるもので処置する。これらはそれぞれ、タイプ
ＭＨＣ２−ペプチド、及びＸ’−ＭＨＣ２−ペプチド
（ここでＸはＴ細胞を殺すことのできる成分である）の
複合体である。治療（残留自己反応性Ｔ細胞により決
定）は、前述した本発明のラベル化複合体を用いるＴ細
胞結合研究によりモニターされる。 【０１０８】本明細書で用いている語「個体」は、基本
的に同等なＭＨＣ系を保有する全ての哺乳類及び全ての
脊椎動物を包括する。 【０１０９】インビボ試験のためのモデル系 下記は自己免疫障害に関するモデル系であり、これらは
かかる症状に対する本発明の効果を評価するために利用
できる。 【０１１０】全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ） 自己免疫ニュージーランドブラック（ＮＺＢ）マウス及
び表現型が正常なニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）
マウス株のＦ１ハイブリドは、親のＮＺＢ株よりもより
急性に重症な全身性自己免疫障害を発症した。これらの
マウスは、ヒトにおけるＳＬＥとめざましく類似な核抗
原に対する抗体及びそれに続く雌に優性な致死的免疫複
合仲介型糸球体腎炎の発症を含むいくつかの異常を示し
た。引用することで本明細書に組入れるＫｎｉｇｈｔ
ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４７：１６５
３。 【０１１１】ヒト及びネズミの障害の形態の両方におい
て、ＭＨＣ遺伝子生産物との強い関連性が報告されてい
る。ＨＬＡ−ＤＲ２とＨＬＡ−ＤＲ３の個体はＳＬＥを
発症する一般の集団よりも高い危険性にあり（Ｒｅｉｎ
ｅｒｔｓｅｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ（１９７
０）２９９：５１５）、他方、ＮＺＢ／Ｗ Ｆ１マウス
（Ｈ−２ｄ／ｕ）においては、ＮＺＷの親に由来するｈ
−２ｕハプロタイプに連結した遺伝子が狼瘡様腎炎の発
症に寄与する。 【０１１２】本発明の効果は生存率、並びに尿タンパク
質及び抗ＤＮＡ抗体の出現のような徴候の発症の進行に
より決定できる。 【０１１３】尿タンパク質はＵｒｉｓｔｉｘ（Ｍｉｌｅ
ｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｋｈａ
ｒｔ，ＩＮ）の利用によりカロリー計算的に決定でき、
下記のおよその尿タンパク質が表示される：微量、１０
ｍｇ／ｄｌ；１＋，３０ｍｇ／ｄｌ；３＋，３００ｍｇ
／ｄｌ；そして４＋，１０００ｍｇ／ｄｌ。高い度合い
の尿タンパク質は複合体によるマウスの処置によって顕
著に遅延する。 【０１１４】ＮＺＢ／Ｗ Ｆ１マウスにおける抗−ＤＮ
Ａ特異的抗体の存在は、ＺｏｕａｌｉとＳｔｏｌｌｅｒ
のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８６）９
０：１０５（引用することで本明細書に組入れる）に記
載の結合化免疫収着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の改良型を
利用して決定される。 【０１１５】重症筋無力症（ＭＧ） 重症筋無力症はＨＬＡ−Ｄに結びついているいくつかの
ヒト自己免疫障害の一つである。Ｓａｆｅｎｂｅｒｇ
ら、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９７８）１
２：１３６；ＭｃＤｅｖｉｔｔら、Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕ
ｍ．（１９７７）２０：５９（これらは引用することで
本明細書に組入れる）。ＭＧにおいて、アセチルコリン
レセプター（ＡｃＣｈｏＲ）に対する抗体が、シナプス
後方膜におけるＡｃＣｈｏＲの仲介損失によって筋神経
伝達を損傷せしめる。 【０１１６】ＳＪＬ／Ｊ雌マウスはヒトＭＧにとっての
モデル系である。これらの動物において、実験的自己免
疫重症筋無力症（ＥＡＭＧ）は、マウスを他の種に由来
する可溶性ＡｃＣｈｏＲタンパク質で免疫することによ
って誘発される。ＥＡＭＧに対する感受性はＭＨＣにあ
る程度結びついており、そしてＨ−２内の領域まで地図
化されている。Ｃｈｒｉｓｔａｄｏｓｓら、Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．（１９７９）１２３：２５４０。 【０１１７】ＡｃＣｈｏＲタンパク質を、引用するＷａ
ｌｄｏｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
（ＵＳＡ）（１９８３）８０：２７１３の方法に従って
トルペド カリホルニカより精製し、そしてアッセイし
た。完全フロインドアジュバント中の乳濁ＡｃＣｈｏＲ
１５μｇを背中、後足及び尾の根もとの６箇所にわたっ
て皮内注射した。動物を同じ方法で４週間後に再び免疫
した。 【０１１８】評価は抗ＡｃＣｈｏＲ抗体の測定によって
なされることができ、抗ＡｃＣｈｏＲ抗体のレベルはＷ
ａｌｄｏｒら、前掲に記載のマイクロリッターＥＬＩＳ
Ａによって測定される。この標準の試薬容量はウェル当
り５０μｌである。試薬は通常ウェルの中でＲＴで２ｈ
ｒインキュベートする。炭酸水素バッファーｐＨ９．６
で希釈した５μｇのＡｃＣｈｏＲを各ウェルに加える。
ＡｃＣｈｏＲとインキュベートした後、これらのプレー
トを、０．０５％のツイーン及び０．０５％のＮａＮ３
を含むリン酸緩衝食塩水より成る洗浄液で４回すすぐ。
マウス血清を０．０１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．２）、１．
５ｍｆｒのＭｇＣｌ２，２．０ｍＭ の２−メルカプト
エタノール、０．０５％のツイーン８０、０．０５％の
ＮａＮ３（Ｐ−ツイーンバッファー）に希釈し、そして
プレート上でインキュベートした。このプレートを洗っ
た後、Ｐ−ツイーンバッファーに希釈したベーターガラ
クトシダーゼコンジュゲート化ヒツジ抗マウス抗体を各
ウェルに加えた。最終洗浄の後、酵素基質ｐ−ニトロフ
ェニルガラクトピラノシドをプレートに加え、そして基
質触媒の程度を１ｈｒ後の ４０５ｎｍでの吸収により
決定した。 【０１１９】非免疫化マウスと比べて、抗−ＡｃＣｈｏ
ＯＲ抗体がＡｃＣｈｏＲで免疫したマウスの中に存在し
ていることが予測される。複合体による処置は免疫化マ
ウスにおける抗ＡｃＣｈｏＲ抗体の力価を有意義に低下
せしめるものと予測される。 【０１２０】臨床ＥＡＭＧに対する複合体による処置の
効果を評価できる。重症筋無力症は、頭及び首のうなだ
れを伴う丸い姿勢、背中の過大な弓なり、ゆがんだ（ｓ
ｐｌａｙｅｄ）手足、異常な歩行及び筆記の困難さの特
徴を含む。複合体の投与により、抗体力価が低下した後
の期間の後に軽い症状が標準試験の後に見られ、従って
改善されたのであろう。 【０１２１】リウマチ型関節炎（ＲＡ） ヒトにおいて、リウマチ型関節炎に対する感受性はＨＬ
Ａ Ｄ／ＤＲに関連する。マウスにおける天然ＩＩ型コ
ラーゲンに対する免疫応答は、ヒトＲＡを擬態する数多
くの組織学的及び病理学的特徴を有する関節炎について
の実験モデルを確立するために利用されている。マウス
におけるコラーゲン誘発型関節炎（ＣＩＡ）に対する感
受性はＨ−２Ｉ領域、特にＩ−Ａサブ領域に地図化され
ている。Ｈｕｓｅら、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．（１９８４）
４３：１８２０。 【０１２２】感受性株ＤＢＡ−１由来のマウスは、Ｗｏ
ｏｌｅｙとＬｕｔｈｒａのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９
８５）１３４：２３６６（引用することで本明細書に組
入れる）に記載の技術を利用してマウスを天然ＩＩ型コ
ラーゲンで処置することによってＣＩＡを有すようにさ
せる。 【０１２３】別のモデルにおいて、ラットにおけるアジ
ュバント関節炎がヒト関節炎及び細菌抗原により誘発さ
れる自己免疫応答のプロトタイプにとっての実験モデル
となるＨｏｌｏｓｃｈｉｔｚら、Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ
ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｇｙ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）（１
９８６）；Ｐｅａｒｓｏｎ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈ
ｅｕｍ．（１９６４）７：８０。この障害は細胞仲介型
免疫応答の結果であり、これはアジュバント（ＭＴ）に
対して反応性であるＴ細胞のクローンによるその伝達性
によって証明される；同じクローン化細胞による研究に
基づき、この障害における標的自己抗原は軟骨のプロテ
オグリカン分子の一部であることが認められた。 【０１２４】ラットにおけるアジュバント障害は、Ｐｅ
ａｒｓｏｎ、前掲に記載の通り、即ち、複数の貯蔵部
位、好ましくは皮内的に、又は足にもしくは尾の根もと
に付与するフロインドアジュバント（殺菌した結核菌又
はその化学画分、鉱物油及び乳化剤）の単一注射により
発生する。このアジュバントは他の抗原なしで付与す
る。 【０１２５】障害の出現の複合体処置の効果をモニター
した。この出現は組織学的であり、そして、滑膜被覆細
胞の増殖を伴う急性及び半急性滑膜炎、接続組織パンヌ
スによる骨及び関節軟骨の浸潤、並びに特に冒された接
合部の近くでの骨膜新骨形成が含まれる。重症又は慢性
の場合、骨性硬直と同じような崩壊的変化が生ずる。こ
れらの組織学的症候はフロインドアジュバントに対する
感化の約１２日後にコントロール動物において認められ
るものと予測される。 【０１２６】インスリン依存性真正糖尿病（ＩＤＤＭ） ＩＤＤＭは、膵臓のランゲルハンス島のインスリン分泌
細胞の選択的破壊の結果として観察される。この病気に
おける免疫系の関与は、単核細胞によるランゲルハンス
島の早期浸潤の形態学的証拠、抗ランゲルハンス島細胞
抗体の検出、ＩＤＤＭ母集団における対立遺伝子ＨＬＡ
−ＤＲ３および−ＤＲ４の高頻度およびＩＤＤＭと各種
の自己免疫病との間の臨床的関連によって示唆される。
自発性ＩＤＤＭと甲状腺炎の動物モデルはＢＢラットで
発現した。ヒトと同様に、ラットの病気はＭＨＣ抗原を
コードする遺伝子によって部分的にコントロールし、島
の浸潤を特徴とし、抗島抗体の存在と関連する。Ｉ−Ｅ
と等価のクラスＩＩ ＭＨＣ抗原は、ＢＢラットにおけ
る自己免疫病の発現に関与するものと思われる。ビオタ
ードら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳ
Ａ），（１９８５），８２，６６２７。 【０１２７】形態学的評価では、インスリン炎は、島内
に単核炎症細胞が存在することを特徴とする。甲状腺炎
は、最低基準として甲状腺内における病巣の間質リンパ
球浸潤液を特徴とする。最も重症の場合は、散在性の多
量なリンパ球浸潤液、小胞の破壊、線維症、および病巣
のヒュルトレ細胞の変化を示す。ビオタードら、同上を
参照されたい。 【０１２８】ＢＢラットの本発明の複合体での治療は、
ＩＤＤＭおよび甲状腺炎に関連した臨床的および形態学
的症状の発現を改善しまたは防止することが期待され
る。 【０１２９】もう一つのモデルでは、ＮＯＤマウス種
（Ｈ−２ＫｄＤｂ）は、自己免疫ＩＤＤＭのネズミでの
モデルである。これらの動物における病気は、抗島細胞
抗体、重症リンスリン炎、β細胞の自己免疫破壊の証拠
を特徴とする。カナザワら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉ
ａ，（１９８４），２７，１１３。この病気は、リンパ
球によって受動的に転位し、サイクロスポリン−Ａで処
理することによって防止することができる（イケハラ
ら、Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，
（１９８５），８２，７７４３；モリら、Ｄｉａｂｅｔ
ｏｌｏｇｉａ（１９８６），２９，２４４。未処理の動
物は、深いグルコース不耐性およびケトン症を発現し、
および病気の徴候から数週間以内に死亡する。雌性動物
の９０％および雄性動物の２０〜３０％が、誕生から６
か月以内に糖尿病を発現する。飼育の研究は、罹病率に
関する少なくとも２個の遺伝的配座を定義し、その内の
一つはＭＨＣに配置されている。血清学的および分子の
水準でのＮＯＤクラスＩＩ抗原の特徴決定は、自己免疫
病の罹病率はＩ−Ａに関連することを示している。アチ
ャ−オーベアおよびマックデビット、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ
ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，（１９８７），８４，
２３５。 【０１３０】雌ＮＯＤマウスを複合体で処理すると、糖
尿病の徴候を示す以前の時間が長くなりおよび／または
この病気を改善または防止することが期待される。 【０１３１】実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ） 実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多くの点で
多発性硬化症（ＭＳ）のヒトの病気に類似している中枢
神経系の誘発された自己免疫症である。この病気は、マ
ウスおよびラットのような多くの種で誘発させることが
できる。 【０１３２】この病気は麻痺が急に起こることを特徴と
する。ＣＮＳにおける単核細胞による脈管周囲の浸潤
が、マウスとラットのいずれにも観察される。この病気
を誘発する方法と症状学は、アランソン（１９８５）Ｔ
ｈｅ ＡｕｔｏｉｍｍｕｎｅＤｉｓｅａｓｅｓ（ローゼ
およびマッカイ監修、アカデミックプレス・インコーポ
レーテド）３９９〜４２７頁およびアチャ−オーベア
ら、（１９８９），Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍ，７，３７
７〜４０５。 【０１３３】遺伝子が媒介する罹病性の一つは、ＭＨＣ
クラスＩＩ領域に配置されている（ムーアら（１９８
０）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２４，１８１５〜１８２
０）。最も良好に解析された脳脊髄炎発症タン白質はミ
エリン塩基性タン白質（ＭＢＰ）であるが、他の脳脊髄
炎発症抗原が脳に見出されている。免疫原性エピトープ
が配置されている（アチャ−オーベアら、同上）。ＰＬ
マウス種（Ｈ−２ｕ）では、ＭＢＰ中における２個の脳
脊髄炎発症ペプチドである、ＭＢＰペプチドｐ３５〜４
７（ＭＢＰ３５〜４７）およびアセチル化ＭＢＰ ｐ１
〜９（ＭＢＰ１〜９）が特性決定された。 【０１３４】ＥＡＥが誘発された個体における病状の改
善に対する本発明の複合体の効果は、生存率、および症
状の発現の新工場鏡によって測定することができる。 【０１３５】処方及び投与 もしＭＨＣサブユニットのトランメンブラン領域を含ま
せるなら、本発明の複合体は脂質単層又は二重層に含ま
せた後に投与することが好ましい。典型的には、この目
的のためにリポソームが利用されるが、しかしながらあ
らゆる形態の脂質膜、例えば平面脂質膜又は細胞（例え
ば赤血球細胞）の細胞膜が利用されうる。下記の実施例
に示すデーターは、二量体ＭＨＣ分子を含んで成るＭＨ
Ｃ−ペプチド複合体が主として凝集体として存在してい
ることを示す。 【０１３６】リポソームは下記の標準方法に従って調製
できる。しかしながら、もしトランスメンブラン領域を
削除したら、この複合体はペプチド含有薬品にとって常
用に利用されている手法で投与されうる。 【０１３７】投与は全身的とし、そして注射、好ましく
は静脈内により行われ、従って投与の注射ルートに適合
する製剤が利用できる。適切な処方はＲｅｍｉｎｇｔｏ
ｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎ
ｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，第１７版（１９
８５）（引用することで本明細書に組入れる）に見い出
せる。本発明の複合体及び薬理学的に有効な担体を含ん
で成る様々な薬理組成物が調製できる。該薬理組成物は
様々な薬剤デリバリーシステムに適切である。薬剤デリ
バリーの現在の方法の簡単な参考については、Ｌａｎｇ
ｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３
（１９９０）（引用することで本明細書に組入れる）を
参照のこと。 【０１３８】本発明の薬理組成物を調製するうえで、そ
の薬物速度論及び生体分布性について変えるために本発
明の複合体を改質することがしばしば所望される。薬物
速度論の一般的詳細については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’
ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ、前掲、第３７〜３９章を参照のこと。薬物速度論及
び生体分布性を変える数多くの方法が当業者に知られて
いる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ前掲を参照のこと）。例え
ば、複合体の血清半減期を上昇させるのに適切な方法に
は、血流からの複合体の排除に関与する炭水化物の除去
の処理が含まれる。好ましくは、実質的に全ての炭水化
物がこの処理により除去される。炭水化物成分の少なく
とも７５％、好ましくは約９０％、そして最も好ましく
は約９９％が除去されたら、実質的に全ての炭水化物が
除去されたといえる。可溶性巨大分子、例えばタンパク
質、多糖類又は合成ポリマー、例えばポリエチレングリ
コールヘのコンジュゲーションも有効である。その他の
方法には、タンパク質、脂質（例えばリポソーム）、炭
水化物又は合成ポリマーのような物質より成る小胞の中
での該複合体の保護が含まれる。 【０１３９】本発明のリポソームは典型的には、この複
合体がＴ細胞レセプターと相互作用しうるような状態で
リポソームの上に位置しているＭＨＣ−ペプチド複合体
を含む。そのトランスメンブラン領域は通常は、膜の形
成時に膜の中にまず一体化せしめる。このリポソームは
特定の自己反応性Ｔ細胞を薬剤（例えば毒素又は化学治
療薬）が標的とするために利用できる。他方、リポソー
ムの中に包埋された複合体を標的細胞におけるアネルギ
ーの誘発のために利用できる。 【０１４０】リポソームの電荷は血液からのリポソーム
の排除において重要な決定要素であり、負荷電リポソー
ムは網内細胞系によってより迅速に取り込まれ（Ｊｕｌ
ｉａｎｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．
Ｃｏｍｍｕｎ．６３：６５１（１９７５））、従って血
流の中で短めの半減期を有する。長い循環半減期を有す
るリポソームが治療及び診断用途のために一般に所望さ
れる。例えば、血流の中で８，１０，１２又は２４時間
まで維持されうるリポソームが好ましい。 【０１４１】典型的には、リポソームは約５〜１５モル
％の負荷電リン脂質、例えばホスファチジルグリセロー
ル、ホスファチジルセリン又はホスファチジルイノシト
ールによって調製する。加えた負荷電リン脂質、例えば
ホスファチジルグリセロールは、自発性リポソーム凝集
を防ぐにも働き、それ故所望されないリポソーム凝集形
成の危険性を小さくする。少なくとも約５０モル％の濃
度での膜硬化剤、例えばスフィンゴミエリン又は飽和中
性リン脂質及び５〜１５モル％のモノシアリルガングリ
オシドが、血流におけるリポソーム調製物の循環を高め
るのに担う（これは、引用することで本明細書に組入れ
る米国特許第４，８３７，０２８号に記載されてい
る）。 【０１４２】更に、リポソーム懸濁物は、脂質をフリー
ラジカル及び保存に基づく脂質−過酸化的損傷から守る
脂質保護剤を含みうる。親油性フリーラジカルクエンチ
ャー、例えばα−トコフェロール及び水溶性鉄特異的キ
レート剤、例えばフェリオキシアニンが好ましい。 【０１４３】例えばＳｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８
０）、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０
１，７２８号及び第４，８３７，０２８号（全て引用す
ることで本明細書に組入れる）に記載の通り、様々な方
法がリポソームを調製するのに有用である。一方法は不
均質なサイズの多重板状小胞をもたらす。この方法にお
いては、小胞形成脂質を適当な有機溶媒又は溶媒系の中
に溶かし，次いで真空又は不活性ガスのもとで乾かして
薄い脂質フィルムを形成せしめている。所望するなら、
フィルムを適当な溶媒、例えば第三ブタノールの中に再
溶解させ、次いで凍結乾燥させて、より容易に水和され
る粉末状形態にあるより均質な脂質混合物を形成せしめ
る。このフィルムを標的化薬剤及び標的用成分の水性溶
液で覆って、典型的には攪拌しながら１５〜６０分にわ
たって水和させる。得られる多重板状小胞のサイズ分布
は、より強い攪拌条件のもとでの脂質の水和により、又
は清浄剤、例えばデオキシコレートの添加により小さめ
のサイズにシフトさせることができる。 【０１４４】水和媒質は標的化薬剤を、最終リポソーム
懸濁物中のリポソームの内部容量の中で所望される濃度
で含む。典型的な薬剤溶液は緩衝食塩水溶液の中に１０
〜１００ｍｇ／ｍｌの複合体を含む。 【０１４５】リポソームの調製に続いて、所望のサイズ
範囲及び比較的狭いリポソームサイズの分布を得るため
にリポソームはサイズ分別されうる。ある好ましいサイ
ズ範囲は約０．２〜０．４ミクロンであり、これは典型
的には０．２２ミクロンのフィルターである常用のフィ
ルターでの濾過によってリポソーム懸濁物を減菌するこ
とを可能とする。このフィルター濾過法は、もしリポソ
ームが約０．２〜０．４ミクロンまでにサイズ分別され
たなら、高仕組ベースで実施できる。 【０１４６】リポソームを所望のサイズヘとサイズ分別
するのにいくつかの技法が有用である。あるサイズ分別
法は引用することで本明細書に組入れる米国特許第４，
７３７，３２３号に記載されている。リポソーム懸濁物
をバス又はプローブ音波処理のいづれかにより音波処理
することは、サイズが約０．５ミクロン以下である小さ
な単板小胞に至る多大なサイズ縮小をもたらす。ホモジ
ネーションは大きなリポソームを小さめのものへと砕断
するためにエネルギーを与えることを基礎とする別の方
法である。典型的なホモジネーション手順において、多
重板状小胞を標準のエマルションホモジナイザーを介し
て特定のリポソームサイズ、典型的には約０．１〜０．
５ミクロンのサイズが認められるまで再循環させる。両
方の方法において、粒径分布は常用のレーザービーム粒
径識別によりモニターできる。 【０１４７】小孔ポリカーボネート膜又は非対称性セラ
ミック膜を介するリポソームの押出しも、リポソームの
サイズを比較的よく規定されたサイズ分布へと小さくす
る有効な方法である。典型的には、懸濁物を、所望のリ
ポソームサイズ分布が得られるまで１又は数回にわたっ
て膜を介して循環させる。リポソームサイズにおける段
階的縮小を得るためにリポソームを順次小さめの多孔膜
を介して押出してよい。 【０１４８】最も効率的な封入法のもとでさえも、最初
にサイズ分けしたリポソーム懸濁物は遊離（封入されて
いない）形態における複合体を５０％以上含みうる。 【０１４９】リポソーム懸濁物から捕促されていない化
合物を除くためのいくつかの方法が有用である。一方法
において、懸濁物を高速遠心によりペレット化して、上
清液の中に遊離化合物及び非常に小さなリポソームを残
させる。別の方法は、懸濁物を限外濾過により濃縮し、
次いで交換媒質の中にこの濃縮リポソームを再懸濁させ
ることを包括する。他方、溶質分子から大きめのリポソ
ーム粒子を分けるためにゲル濾過が利用されうる。 【０１５０】上記の処理に続いて、リポソーム懸濁物を
静脈内投与において有用な所望濃度にする。これは、例
えば遠心もしくは限外濾過によってリポソームが濃縮さ
れた場合はリポソームを適当な容量の注射媒質に再懸濁
する、又は薬剤除去工程が全懸濁物容量を増加させた場
合はこの懸濁物を濃縮することを包括しうる。次にこの
懸濁物を前記の通りに濾過により減菌する。ＭＨＣ−ペ
プチド複合体を含んで成るリポソームは、投与の手法、
導入すべき薬剤、処置すべき特定の障害、等に従って変
わる投与量において、非経口的又は局所的に投与されう
る。 【０１５１】ミセルは非極性領域を有する分子の溶解度
を高めるために当業界において一般に利用されている。
従って当業者はミセルが本発明の組成物において有用で
あることを認識するであろう。本発明の複合体を含んで
成るミセルは当業界によく知られる方法に従って調製で
きる（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前掲、第２０章を
参照のこと）。本発明の複合体を含んで成るミセルは標
準の界面活性剤又は清浄剤を用いて一般に調製される。 【０１５２】ミセルは水性溶液中で界面活性剤（疎水性
領域と、１又は複数のイオン性、又はそうでなければ強
力な親水性基とを含む分子）により形成される。固形界
面活性剤の濃度が増えるにつれ、大気／水又はガラス／
水の界面に収着した単層は、更なる占拠がこの２枚の単
層の中に既にある界面活性剤分子の多大な圧縮を必要に
せしめるほどに密に充填される。この濃度を超えるよう
な溶解界面活性における量の更なる増分は、ミセルヘと
凝集する新たな分子の量に相当する。この過程はいわゆ
る「臨界ミセル濃度」と呼ばれる特徴的な濃度で始ま
る。 【０１５３】希薄な界面活性剤溶液の中で形成されるミ
セルの形はほぼ球形である。界面活性剤分子の極性頭部
基は外部球形殻に並んでおり、ここでその炭化水素鎖は
中心に向って配向して、ミセルにとっての球形中核を形
成している。この炭化水素鎖はランダムコイルとなり、
且つ、からみ合っており、そしてミセルの内部は非極性
の液状特性を有している。ポリオキシエチル化非イオン
性清浄剤のミセルにおいては、このポリオキシエチレン
成分は外を向いており、そして水により浸入される。こ
の配備はエネルギー的に好ましく、なぜなら親水性頭部
基水と接触し、そして炭化水素成分は水性媒質から除か
れており、且つ、極性頭部基によって水との接触が遮蔽
されているからである。ミセルの内部に位置する界面活
性剤分子の炭化水素尾部は弱いファンデルワールスカに
よって互いと相互作用している。 【０１５４】ミセルのサイズ又はその凝集体の数は幾何
学的要因により大いに支配されている。炭化水素中核の
半径は界面活性剤分子の伸びきった炭化水素鎖の長さを
超えることはできない。従って、鎖長を長くすること、
又は同族列を増やすことは球形ミセルの凝集数を増や
す。炭化水素領域が単独の通常のアルキル鎖である界面
活性剤にとっては、球形を構成する最大凝集数はＣ８，
Ｃ１０，Ｃ１２，Ｃ１４及びＣ１６のそれぞれにとって
約２７，３９，５４，７２及び９２である。もし界面活
性剤の濃度を数％上げる、そしてもし電解質を加える
（イオン性界面活性剤のケース）又は温度を高めたら
（非イオン界面活性剤のケース）、ミセルのサイズは大
きくなる。このような条件のもとでは、ミセルは球形を
維持するのに大きくなりすぎてしまい、形が楕円形、円
筒形又は最終的に板状となってしまう。 【０１５５】一般の界面活性剤は当業者によく知られ、
そして本発明のミセルに利用できる。適当な界面活性剤
にはラウリン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラ
ウリル硫酸ナトリウム、オクタオキシエチレングリコー
ルモノドデシルエーテル、オクトキシノール９及びＰＬ
ＵＲＯＮＩＣ Ｆ−１２７°（ＷｙａｎｄｏｔｔｅＣｈ
ｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．）が含まれる。好ましい界
面活性剤はＩＶ注射に適合する非イオン系ポリオキシエ
チレン及びポリオキシプロピレン清浄剤であり、例えば
ＴＷＥＥＮ−８０°，ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−６８°，
ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド等である。更
に、リポソームの調製において用いるのに説明したリン
脂質もミセル形成に利用できる。 【０１５６】本発明のＭＨＣサブユニットは親油性トラ
ンスメンブラン領域及び比較的親水性な細外胞ドメイン
を含んで成るため、一般の界面活性剤又はリン脂質及び
このサブユニットの存在下において複合ミセルが形成さ
れる。本発明の複合ミセルはサブユニット、リン脂質及
び／又は界面活性剤の任意の組合せを含んで成りうる。
従って、該ミセルはサブユニットと清浄剤、リン脂質及
び清浄剤の両方と組合せたサブユニット、又はサブユニ
ットとリン脂質を含んで成りうる。 【０１５７】本発明の複合体を含んで成る薬理組成物に
関して、その投与量は例えば特定の複合体、投与の方
法、処置すべき特定の障害及びその重症度、患者の総合
的な健康状態及び症状、並びにかかりつけの医師の判断
に応じて変わりうる。ネズミ対象体にとっての投与量レ
ベルは一般に約１０μｇ〜約５００μｇである。約５０
μｇ〜約３００μｇの総投与量が好ましい。例えば、障
害の経過にわたって施す処置において、２５μｇ又は１
００μｇの３回の投与が有効である。総投与量は約０．
０１５〜約１５μｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１５〜約
１０μｇ／ｋｇに範囲する。 【０１５８】薬理組成物は予防的及び／又は治療的処置
のため、非経口的、局所的、経口的又は局部的（例えば
エロゾールによる）又は経皮的投与を目的とする。この
薬理組成物は投与の方法に応じて様々な単位投与形態で
投与されうる。例えば、経口投与に適する単位投与形態
には粉末、錠剤、ピル及びカプセルが含まれる。 【０１５９】好ましくは、該薬理組成物は静脈内投与さ
れる。従って、本発明は、許容される担体、好ましくは
水性担体に溶解又は懸濁された複合体の溶液を含んで成
る静脈内投与のための組成物を提供する。様々な水性担
体、例えば水、緩衝水、０．４％の食塩水等が利用され
うる。例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が本発明の
可溶性複合体の投与のために特に適切である。好ましい
製剤は０．０２％のツイーン−８０を含むＰＢＳであ
る。この組成物は常用のよく知られている滅菌技法によ
り滅菌するか、又は滅菌濾過してよい。得られる水性溶
液は使用されるために包装されるか、又は凍結乾燥され
てよく、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌水性溶液と合わ
せられる。この組成物は、適当な生理学的条件のために
必要な薬理学的に許容される補助物質、例えばｐＨ調節
及び緩衝剤、等張性調節剤、湿潤剤等例えば酢酸ナトリ
ウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリ
エタノールアミンオレエート、他を含むことがてきる。 【０１６０】該複合体の濃度は広範囲にわたり、即ち、
約０．０５重量％以下、通常は少なくとも約１重量％か
ら、１０〜３０重量％ほどに変えることができ、そして
選ばれた投与の特定態様に従って、主として流体容量、
粘度等によって選ばれるであろう。静脈内投与のために
好ましい濃度はＰＢＳ中で約０．０２％〜約０．１％又
はそれ以上である。 【０１６１】固形組成物に関しては、常用の非毒性固形
担体が利用でき、これには例えば薬理級のマンニトー
ル、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウ
ム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グ
ルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等が含まれ
る。経口投与のためには、薬理学的に許容される非毒性
組成物は、通常利用されている賦形剤、例えば既に挙げ
たような担体のいづれかを含ませることにより作られる
ことができ、そして一般には活性成分の１０〜９５％に
する。 【０１６２】エロゾール投与のためには、該複合体は界
面活性剤及び噴射剤と一緒に、微細分割形態において供
せられるのが好ましい。この界面活性剤はむろん無毒で
なくてはならず、そして噴射剤に可溶性であることが好
ましい。代表的なかかる試薬は、６〜２２個の炭素原子
を含む脂肪酸のエステル又は半エステル、例えばカプロ
ン酸、オクタノン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステ
アリン酸、リノール酸、リノレニン酸、オレステアリン
酸及びオレイン酸と、脂肪多価アルコール又はその環状
無水物、例えばエチレングリコール、グリセロール、エ
リスリトール、アラビトール、マンニトール、ソルビト
ール、ソルビトールに由来するヘキシトール無水物、と
のエステル、並びにこれらのエステルのポリオキシエチ
レン及びポリオキシプロピレン誘導体である。複合エス
テル、例えば複合又は天然グリセリドが利用できる。こ
の界面活性剤は該組成物の０．１〜２０重量％、好まし
くは０．２５〜５重量％を構成しうる。この組成物の残
りは通常噴射剤である。液化噴射剤は一般に周囲条件で
ガスであり、そして加圧のもとで凝縮する。適当な液化
噴射剤は、５個まで炭素を含む低級アルカン、例えばブ
タン及びプロパンであり、そして好ましくはフッ素化又
はフルオロ塩素化アルカンである。前記した混合物も利
用できる。エロゾールの製造において、適当なバルブの
付いた容器に、微細に分割した化合物及び界面活性剤を
含む適当な噴射剤を充填する。この成分は従ってバルブ
の作動により放出されるまで高い圧力に維持される。 【０１６３】該複合体を含む組成物は治療的、予防的又
は診断的用途のために投与できる。治療的用途において
は、組成物を、前記した障害に既に苦しんでいる患者
に、この障害の症状及びその合併症を治癒又は少なくと
も部分的に軽減するのに十分な量で投与する。これを成
し遂げるのに適切な量を「治療的に有効な投与量」と定
義する。これに有効な量は障害の重症度並びに患者の体
重及び一般的状態に依存するであろう。前述した通り、
これは典型的には約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋ
ｇ、好ましくは約３〜約１５ｍｇ／ｋｇであろう。 【０１６４】予防的用途においては、本発明の複合体を
含む組成物を、特定の障害に対して感受性である、又は
その危険性を有する患者に投与する。かかる量は「予防
的に有効な投与量」と定義する。この用途において、そ
の正確な量はここでも患者の健康状態及び体重に依存す
る。その投与量は一般に前記した範囲であろう。 【０１６５】診断用途において、適切な複合体又はその
カクテルを含む組成物を、自己免疫障害症状を有すると
予測される患者に投与して、この障害に関連する自己反
応性Ｔ細胞の存在を決定する。他方、特定の処置の効力
をモニターすることができる。これを成し遂げるのに十
分な量は「診断的に有効な投与量」と定義する、この用
途において、その正確な量は患者の健康状態等に依存す
るが、一般には投与当り０．０１〜１０００ｍｇ、特に
患者当り約１０〜約１００ｍｇの範囲であろう。 【０１６６】治療的又は診断的用途のためのキットを供
することもできる。従って、本発明の課題の組成物は通
常容器中の凍結乾燥状態で供される。ラベルもしくは毒
素にコンジュゲートされた、又はコンジュゲートしてい
ない複合体をキットの中に、バッファー、例えば、トリ
ス、リン酸塩、炭酸塩等、安定剤、殺生物剤、不活性タ
ンパク質、例えば血清アルブミン等、更には使用のため
の仕様書のセットと一緒に含ませてよい。一般に、これ
らの材料は複合体の量に基づいて約５重量％以下、そし
て通常はタンパク質濃度に基づいて少なくとも０．００
１重量％の量で存在するであろう。しばしば、活性成分
を希釈する不活性増量剤又は賦形剤を含ませることが所
望され、この賦形剤は全組成物の約１〜９９重量％にお
いて存在しうる。アッセイにおいてこの複合体に結合す
ることのできる抗体を使用するとき、これは別個々のバ
イヤルの中に通常存在するであろう。この抗体は当業界
に知られる技術に従ってラベルにコンジュゲートされ、
そして処方されるのが典型的である。 【０１６７】本発明は、自己免疫性のような所望されな
い自己応答の原因である免疫系の状況を同定、且つ、阻
止するのに利用できる方法及び組成物に向けられてい
る。本発明の組成物及び方法は、ＭＨＣによりコードさ
れる糖タンパク質と一緒に特定の抗原を認識するヘルパ
ーＴ細胞を標的とするようにデザインされている。本発
明の複合体はＴ細胞レセプターに結合し、そして標的リ
ンパ球及びその他の細胞において免疫系の非応答性をも
たらす。 【０１６８】本発明は、免疫反応を起こさせるように抗
原自体により触発される相互作用と類似の状況で免疫系
と相互作用する抗原の形態を提供する。本発明の組成物
は、（１）ＭＨＣコード化抗原表示糖タンパク質の有効
領域；及び（２）抗原の有効領域；の精製化＝成分複合
体である。これらの二成分は共有又は非共有連結によっ
て結合している。インビトロ及びインビボ実験の両者に
由来する証拠は、かかる複合体が同系移植Ｔ細胞におけ
る慢性アネルギーを誘発せしめることを確立する。 【０１６９】その他の観点において、本発明は薬理学的
組成物に向けられ、ここで本発明の複合体が活性成分で
ある。この組成物は自己免疫障害のような免疫応答に関
連する特定の抗原との免疫系反応の一部を下降制御する
のに用いることができる。 【０１７０】 【実施例】下記の実施例によって本発明を例示するが、
本発明を限定するものではない。 【０１７１】実施例１ マウスＩ−Ａｋ 及びラットＭＢＰペプチドの複合体に
よるインビトロでのＴ細胞の下降制御 ヒト多発性硬化症を擬態する障害モデルであるマウスに
おける実験的アレルギー性起脳炎を誘発することで知ら
れるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に対して向け
られたＴ細胞クローンにおける非応答性又はアネルギー
の誘発におけるクラスＩＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体の
効果を下記に示す。 【０１７２】スタンフォード大学のＰａｔ Ｊｏｎｅｓ
博士から、ラットＭＢＰペプチド（１−１１）に対する
マウスの免疫によって調製し、そして抗原特異性につい
て特性化されたＴ細胞クローンＡＪ１．２及び４Ｒ３．
４を獲得した。 【０１７３】ラットＮＳＦペプチドを有するＩ−Ａｋ複
合体を、精製マウスＩ−Ａｋ及び合成ラットＭＢＰペプ
チド（１−１３）を利用して作り、このペプチドの配列
は周知であり（Ｚａｍｖｉｌら（１９８６）Ｎａｔｕｒ
ｅ ３２４：２５８２６０）、そして Ａｃ−ＡＳＱＫＲＰＳＱＲＨＧＳＫ である。 【０１７４】マウスＩ−ＡｋをＴｕｒｋｅｗｉｔｚら、
前掲に基づく改良方法により精製した。基本的には、Ｉ
−Ａｋを含む細胞の可溶性膜抽出物を、１０−２．１６
抗体（これはプロテインＡでのアフィニティークロマト
グラフィーにより精製され、且つ、ＣＮＢｒ活性化セフ
ァロース４ｂに結合されている）を含むカラムを用いる
アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。Ｎ
Ｐ−４０可溶性膜抽出物、１０．２１６ＭＡｂの精製及
びそのＣｎＢｒ活性化セファロース４Ｂへの結合、並び
にＩ−Ａｋの精製の調製計画をそれぞれ図１２，１３ａ
並びに１４に示す。図１３ｂは精製した１０−２．１６
抗体の純度を示すポリアクリルアミドゲルのコピーであ
る。Ｉ−Ａｋの純度（これはポリアクリルアミドゲル分
析によりモニター）を図１５に示す。 【０１７５】Ｉ−ＡｋとラットＭＢＰペプチドの複合体
を作るため、３０ｍＭのオクチルグルコシドを含むＰＢ
Ｓ中の１０μｇのアフィニティー精製Ｉ−Ａｋ と５０
倍過剰量のＨＰＬＣ精製ＭＢＰペプチドとを１２５μｌ
の全容量で混ぜ合わせた。サンプルを３７℃で１６時
間、定常に攪拌しながらインキュベートし、次いでリポ
ソームの準備のためにＧ−２４セファデックス脱塩によ
りペプチドから分離させるか、又は細胞研究のためにＰ
ＢＳ、続いてＲＰＭＩ培地に対して４℃で３６時間透析
した。 【０１７６】リポソームヘのＩ−Ａｋ−ＭＢＰペプチド
複合体の導入は下記の通りである。２５：７５：２のモ
ル比でコレステロール：ジパルミトイルホスファチジル
コリン（ＤＰＰＣ）：ジパルミトイルホスファチジルエ
タノールアミン−フルオレセイン（ＤＰＰＥＦ）より成
る脂質溶液を３０ｍＭのオクチルグルコシド（ＯＧ）を
含むクロロホルム中で調製した。脂質を真空のもとで乾
かし、そして１７ｍＭのＯＧを含む予め作っておいたＰ
ＢＳ中のＩ−Ａｋペプチド複合体を乾燥脂質と５：１
（ｗ／ｗ）の比で混ぜ合わせた。この混合物を２−３分
間ボルテックスに付し、４℃に冷やし、そして最後にＰ
ＢＳ、続いてＲＰＭＩ倍地に対して４℃で３６時間透析
した。（１２５−Ｉ）−ラベル化Ｉ−Ａｋを用いる実験
においては、脂質混合物の中に蛍光化脂質は含ませず、
そしてリポソームの中へのＩ−Ａｋの一体化をシンチグ
ラフィーにより決定した。 【０１７７】平面脂質膜を滅菌１２ｍｍガラスカバース
リップの上に、アフィニティー精製Ｉ−Ａｋ単独又は精
製Ｉ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−１３）を含むリポソーム５０
〜１００μｌを用いて、Ｗａｔｔｓらの（１９８５）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：
５４８０−５４８４（引用することで本明細書に組入れ
る）の方法によって準備した。平面膜におけるＩ−Ａｋ
の存在は、蛍光抗Ｉ−Ａｋ抗体による染色の後での蛍光
顕微鏡により確認した。バックグランド以上の蛍光は、
蛍光抗Ｉ−Ａｋにより染色に基づいて認められなかっ
た。 【０１７８】ＭＢＰペプチド刺激の６〜８日後に獲得し
たＡＪ１．２及び４Ｒ３．４細胞を２回洗い、そして４
×１０５の細胞を平面膜に付加した。このプレートを３
７℃で５％のＣＯ２の中で４８〜７２時間インキュベー
トし、次いでコロニーの形成について目視検査した。 【０１７９】清浄剤可溶化クラスＩＩ分子の効果を、１
×１０５のＡＪ１．２又は４Ｒ３．４を、５０〜１００
μｌの精製Ｉ−Ａｋ単独、精製Ｉ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−
１３）、及び倍地単独と、３７℃で５％のＣＯ２の中で
５時間培養することにより調べた。このインキュベーシ
ョンの後、これらの細胞を９００μｌに希釈し、そして
増殖アッセイにおける抗原表示細胞（ＡＰＣ）及び抗原
〔ＭＢＰ（１−１３）〕に対するそれらの応答能力につ
いて試験した。細胞増殖の表示として３−（４．５−ジ
メチル−チアゾール−２−７’）−２．５−ジフェニル
テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の取込みを利用し
た。通常は３Ｈ−チミジン取込みによってモニターされ
るＤＮＡ合成と、ＭＴＴ取込みにより測定されるミトコ
ンドリアの活性は別々の細胞機能であるが、脾臓細胞培
養の刺激の開始から３日後にモニターしたこれら２通り
の活性は互いと非常によく似ていた（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＤｅｖｉｃｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅ
ｔｉｎ Ｎｕｍｂｅｒ ０１１−Ａ，１９８８年２月９
日）。 【０１８０】データーは、倍地のみで培養した細胞に比
してのクラスＩ＋Ａｇとインキュベートした細胞増殖の
％抑制として示し、そして次式により計算した： （式中、 Ｔ細胞ａ＝Ｉ−Ａｋ−ＭＢＰ（１−１３）複合体と予備
インキュベートしたＴ細胞 Ｔ細胞ｂ＝Ｉ−Ａｋ−ＭＢＰ（１−１３）のみと予備イ
ンキュベートしたＴ細胞 Ｔ細胞ｃ＝倍地と予備インキュベートしたＴ細胞であ
る）。 【０１８１】クラスＩＩ ＭＨＣのみの存在下で培養し
た細胞の増殖は、ほとんどの研究において倍地のみで培
養した細胞と一般に等しいため、この後者の数を％抑制
を得るうえで利用した。トリプリケートウェルの標準偏
差は大半の実験で＜１０％であった。 【０１８２】まず２通りの定量的研究を、Ｉ−Ａｋ＋Ｍ
ＢＰ（１−１３）を含むリポソームから調製した平面膜
へのＴ細胞クローンの結合を、Ｉ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−
１３）での予備処置が変更するであろうかを決定するた
めに行った。ＡＪ１．２細胞をこれらの研究のために用
い、なぜならこれらはＭＢＰ（１−１３）のみの存在下
において、即ち、抗原表示細胞（ＡＰＣ）なしで平面膜
上に特徴的なコロニーを形成するからである。ＡＪ１．
２細胞とＩ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−１３）との５時間にわ
たるインキュベーションは、Ｉ−Ａｋ又は倍地単独とイ
ンキュベートした細胞に比して、平面膜上に形成される
コロニーの数を阻害した。第２の実験において、ＡＪ
１．２細胞をＩ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−１３）を含むリポ
ソームと、又はＩ−Ａｋのみと５時間にわたってインキ
ュベートし、そして平面膜を前記の通りに調製した。清
浄剤可溶化Ｉ−ＡｋＭＢＰ（１−１３）について前述し
た通り、細胞をＩ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−１３）を含むリ
ポソームと一緒に培養することは、Ｉ−Ａｋのみを含む
リポソームとインキュベートした細胞に比して、コロニ
ーの数を減少させた。コロニーは正確に測定できなかっ
たが、その数におけるはっきりとした差が認められた。 【０１８３】これらの研究はＴ細胞クローンの機能に対
するＩ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−１３）の効果の定量を可能
としなかったため、我々はＡＰＣ及びＭＢＰ（１−１
３）の存在下における４Ｒ３．４又はＡＪ１．２細胞の
増殖に対するこの複合体の予備インキュベーションの効
果を調べた。従って、４Ｒ３．４又はＡＪ．１細胞を５
０〜１００μｌのＩ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−１３）、Ｉ−
Ａｋ、又は倍地のみと３７℃で５時間にわたり予備イン
キュベーションした。これらの細胞を適当な濃度へと希
釈し、そしてＡＰＣに加えた。抗原〔ＭＢＰ（１−１
３）〕を１３．３μｍ〜５３．２μｍに範囲する最終濃
度となるように加えた。 【０１８４】本研究において用いたＡＰＣは雌のＡ／Ｊ
マウスの脾臓から調製した。簡潔すると、脾臓を取出
し、そして個別の細胞懸濁物を、滅菌顕微鏡スライドの
急冷先端の間で緩やかに裂くことによって用意した。赤
血球を低張ショックで溶解させた。残留細胞を抗生物質
を含むＲＰＭＩで２回洗い、そして１０μｇ／ｍｌのミ
トマイシンＣと３７℃で１時間インキュベートした。こ
のインキュベーションに続いて、脾臓細胞を抗生物質を
含むＲＰＭＩで５回洗い、計測し、そしてＡＰＣとして
用いた。細胞とＡＰＣ及びＭＢＰ（１−１３）の７２時
間インキュベーションの後、増殖の程度をＭＴＴ取込み
を用いて定量した。研究１，３及び４においては、４Ｒ
３．４細胞を上記の通りにインキュベートした。研究２
においては、４Ｒ３．４細胞を、Ｉ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１
−１３）又はＩ−Ａｋのみを含むリポソームと予備イン
キュベートした。次にＴ細胞を１０％のフィコール溶液
を通じて遠心により未結合リポソームから分け、洗い、
そして増殖アッセイに利用した。研究５〜８はクローン
ＡＪ１．２なしで実施した。Ｉ−Ａｋのみとインキュベ
ートさせた細胞は倍地中で培養した細胞と同程度に増殖
した。この方法で予備インキュベートさせたＴ細胞クロ
ーンはＡＰＣの非存在下で増殖しなかった。 【０１８５】上記で示すデーターは、クラスＩＩ ＭＨ
Ｃ＋ＭＢＰ（１−１３）の複合体か、ＭＢＰ（１−１
１）に特異的なＴ細胞クローンにおける劇的な非応答性
を誘発することを示した。更に、このデーターが示すに
は、この複合体はＭＢＰ−刺激型Ｔ細胞クローンと免疫
学的に反応性であり、それ故それに結合する。 【０１８６】ヒトＨＬＡ−ＤＲ２−ＭＢＰ複合体の調製
及び安定性 ＨＬＡ−ＤＲ２に対するヒトＭＢＰ（８３−１０２）ペ
プチドの最大結合のための最適ｐＨはｐＨ７と決定され
た。ホモ接合リンパ球芽球症細胞由来のアフィニティー
精製ＤＲ２を１０倍過剰量の放射性ヨウ素化ＭＢＰ（８
３−１０２）ペプチドと３７℃で４８時間にわたり、様
々なｐＨでインキュベートせしめた。未結合のペプチド
を透析により除去し、次いで結合ペプチドの量をシリカ
ゲルＴＬＣアッセイから計算した。サンプルを還元及び
非還元ポリアクリルアミドゲルで分析もした。バンドを
切り出し、計測し、そして結合ペプチドの量を比活性よ
り計算した。 【０１８７】ヒトＤＲ２−ＭＢＰ（８３−１０２）複合
体の安定性も４℃で調べた。ＤＲ２と１２５１−ＭＢＰ
（８３−１０２）との複合体を前記の通りに調製し、そ
して４℃で保存した。毎週、１μｌのアリコートをトリ
プリケートでシリカゲルＴＬＣプレート上に適用した。
プレートを流し、展開し、そして％解離を計算した。４
２日間にわたり、この複合体の有意な解離は認められな
かった。 【０１８８】実施例２ 自己免疫機能不全を有する個体からのＢ細胞のＥＢＶ形
質転換 自己免疫機能不全を有する個体由来の末梢血液単核細胞
（ＰＢＭＮＣ）を、全血又はバッフィーを滅菌リン酸緩
衝食塩水（ＰＢＳ），ｐＨ７．２で１：１に希釈し、こ
の懸濁物をフィコールーヒパックの上に載せ、次いで卓
上型遠心器で１８００〜２０００ＲＰＭにて２０分間遠
心することにより単離した。フィコールーヒパックとＰ
ＢＳ−血漿の界面のバンドにあるＰＢＭＮＣをピペット
で回収し、そしてＰＢＳで２回洗った。細胞を１０％の
胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０の中で５×
１０６細胞／ｍｌに再懸濁し、ポリスチレンフラスコの
中でプレートし、そして３７℃で１時間インキュベート
して単球を除去した。非付着細胞を集め、遠心でペレッ
ト化し、そしてＣａ＋＋−Ｍｇ＋＋を含まず、１５％の
ＦＢＳを含むダルベッコＰＢＳの中で１０×１０６細胞
／ｍｌで再懸濁させた。ＡＥＴ−ＳＲＢＣ（２％ｖ／
ｖ）をＰＢＭＣと１：１で混合し、この混合物を１００
×ｇで２０分間遠心し、次いで氷上で１時間インキュベ
ートした。このペレットを緩やかに再懸濁し、そしてこ
の懸濁物を先に記載の通りフィコールーヒパックを介し
て遠心した。Ｂ細胞及び残留単球を含むバンドを回収し
た。 【０１８９】Ｂ細胞の形質転換はＢ９５−８細胞系（Ｗ
ａｌｌｓとＣｒｏｗｆｏｒｄのＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ
ｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｇ．
Ｃ．Ｂ．Ｋｌｕａｓ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）で行っ
た。Ｂ９５−８細胞を倍地の中に１：３で希釈し、そし
て３７℃で５日間培養した。この上清液を集め、２５０
×ｇで１５分間遠心し、そして０．４５ミクロンのミリ
ポアフィルターで濾過した。次にＥＢＶを１０，０００
ＲＰＭで２時間、４℃で遠心により濃縮し、そしてウィ
ルスを含むペレットを１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １
６４０の中にもとの容量１％で懸濁した。 【０１９０】Ｂ細胞を形質転換させるため、このウィル
スストックを２×１０６の細胞を含む培養倍地で１：９
に希釈した。４℃で１〜２時間ウィルスを細胞に吸収さ
せた後、この細胞を２５０×ｇで遠心した。得られる細
胞ペレットを約０．７×１０ ６〜７．０×１０６細胞／
ｍｌで、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０に懸
濁した。形質転換細胞を標準方法によりクローンした。 【０１９１】この手順で作った形質転換Ｂ細胞はヒトＭ
ＨＣ糖タンパク質の単離のために適切である。 【０１９２】実施例３ マウスにおけるＥＡＥの誘発 Ｔ細胞クローンＡＪ１．２及び４Ｒ３．４の養子移入並
びにＭＢＰ（１−１３）によるマウスの免疫化はマウス
がＥＡＥを発症する原因となる。 【０１９３】ＥＡＥを、完全ＭＢＰによるマウスにおけ
るＥＡＥの誘発に関する方法を利用してペプチドで誘発
させた。簡潔すると、ＭＢＰ（１−１３）をＰＢＳの中
に溶かし、次いで完全フロインドアジュバントと強く混
合して厚みのある乳濁物を形成せしめた。雌のＡ／Ｊマ
ウスに１００μｇのこの混合物をわき腹に４箇所で注射
した。２４及び７２時間後、４００ｎｇの百日咳毒素を
静脈内注射した。ＥＡＥの発症及び死亡率について２種
の個体によりマウスを毎日観察した。図１７における結
果は、ＭＢＰ（１−１３）による免疫化に由来するマウ
スにおけるＥＡＥの発症を示す。 【０１９４】ＥＡＥの養子移入のため、ＭＢＰ（１−１
１）による免疫後のマウスＢ１０Ａ（４Ｒ）株から獲得
したＴ細胞クローン４Ｒ３．４を用いた。Ｂ１０Ａ（４
Ｒ）マウスに３５０ｒａｄの全身放射量を付し、次いで
４００ｎｇの百日咳毒素を静脈内注射した。２〜３時間
後、３日前にＭＢＰ（１−１３）で刺激せしめた１０×
１０６の４Ｒ３．４細胞を静脈内注射した。ＥＡＥの候
症及び死亡率についてこれらの動物を１日２回観察し
た。この研究の結果を図１８にまとめた。 【０１９５】実施例４ Ｉ−Ａｓ−ＭＢＰ（９１−１０３）複合体によるＥＡＥ
の下降制御 本実施例は、本発明の複合体によるインビボ治療が受動
誘発型ＥＡＥの予防をもたらすことを実証する。更に、
この治療は処置動物の死亡率及び病的状態を有意に下げ
る。 【０１９６】Ｉ−Ａｓ／ＭＢＰ（９１−１０３）による
処置がＴ細胞の活性化に従うＥＡＥの発症を防ぐであろ
うことを実証するため、ＳＪＬマウスにインビボでＭＢ
Ｐ（９１−１０３）反応性Ｔ細胞ブラストを注射した。
簡潔すると、生後１０〜１２週目のＳＪＬマウスに完全
フロインドアジュバント中の４００μｇのＭＢＰ（９１
−１０３）（Ａｃ−ＦＦＫＮＩＶＴＰＲＰＰＰ−アミ
ド、純度＞９５％）を背中で免疫した。１０〜１２日
後、局所的漏出リンパ腺細胞を集め、そして２４穴プレ
ート（Ｆａｌｃｏｎ）の中で、１０％の胎児中血清、１
％のペニシリン／ストレプトマイシン及び５０μｇ／ｍ
ｌのＭＢＰを含む１．５ｍｌのＲＰＭＩ １６４０倍地
中で６×１０６細胞／ウェルの濃度で培養した。４日間
のインビトロ刺激に続いて、ＭＢＰ（９１−１０３）反
応性Ｔ細胞ブラストをフィコールーヒパック勾配（Ｈｙ
ｐａｑｕｅ １０７７，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を介して集
め、そして標準技法に従ってＰＢＳで２回洗った。約
１．３〜１．５×１０７の細胞を各マウスに注射した。 【０１９７】起脳炎ＭＢＰ（９１−１０３）反応性Ｔ細
胞を受容したマウスに、次に１００μｌのＰＢＳ中の１
００μｇの可溶性Ｉ−Ａｓ／ＭＢＰ（９１−１０３）複
合体、１００μｌのＰＢＳ中の１００μｇのＩ−Ａｓ／
ＭＢＰ（１−１４）（ＳＪＬマウスにおいて起脳炎性で
ないペプチド）、又はＰＢＳのみのいづれかを、０，３
及び７日目にて受容させた（全投与量は３００μｇ）。
ＥＡＥの臨床的徴候について動物を毎日観察して等級付
けした：１級、尾の色調の欠失；２級、後足の弱体化；
３級、後足の麻痺；４級、ひん死状態；５級、死亡。動
物取扱い協会の規則に従い、自分自身で食事を取ること
のできないマウスは殺した。 【０１９８】Ｉ−Ａｓ／ＭＢＰ（９１−１０３）複合体
を受容した７匹のマウスのうちの１匹のみが１６日目に
臨床的ＥＡＥを発症した（図１９）。他方、Ｉ−Ａｓ／
ＭＢＰ １−１４を受容した４匹の動物全て及びＰＢＳ
を受容した７匹の動物のうちの６匹に麻痺が生じた。前
者のグループにおいて、障害の発生の平均は９．７日目
であり、そして後者のグループにおいては９．０日目で
あり、平均重症度（ｍｅａｎ ｓｅｖｅｒｉｔｙ）はそ
れぞれ２．３及び２．７であった。 【０１９９】Ｉ−Ａｓ対立遺伝子により表示されるその
他の自己抗原が障害誘発を阻止できないことも実証す
る。ＳＪＬマウスを、完全フロインドアジュバント中の
プロテオリポタンパク質（ＰＬＰ）のペプチド１３９−
１５１で免疫してＥＡＥを誘発せしめた。ＳＪＬマウス
は、ＰＢＳに溶かし、次いで４ｍｇ／ｍｌのミオバクテ
リア チューバキュロシス（Ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒａを含む完全フ
ロインドアジュバントと１：１の比で混合したペプチド
で免疫した。動物に１５２μｇのペプチドを両わき腹に
おいて皮下注射し、この投与量は１００％の動物にＥＡ
Ｅを誘発せしめることが見い出されている量である。同
じ日及び４８時間後に、全ての動物に４００μｇの百日
咳毒素を静脈内的に付与した。マウスを前述の通りに免
疫後１，４及び７日目にＰＢＳ，１５μｇのＩ−Ａｓの
み、又は１５μｇのＩ−Ａｓ＋ＰＬＰ（１３９−１５
１）で処置した。 【０２００】表１に示す通り、適当なＩ−Ａｓ／ＰＬＰ
（１３９−１５１）ペプチド複合体を受容した動物は、
アジュバント中のペプチドでの免疫により誘発される重
症な急性麻痺障害から守られていた。Ｉ−Ａｓ／ＰＬＰ
ペプチド処置グループにおいて死亡は認められなかっ
た。６匹の動物に麻痺が生じたが、麻痺した動物の平均
重症度は２．２であり、そして発症日は１０．６であっ
た。他方、Ｉ−Ａｓ複合体のみを受容した６匹の動物全
ては死亡し、発症の平均日は８．２日であった。５匹の
動物が１１日目に死亡し、そして１匹の動物が２１日目
に死亡した。食塩水を受容した、又は処置されていない
動物は８７％の死亡率であり、そして発症の平均日は
９．７（ｐ＜０．０００１ Ｉ−Ａｓ／ＰＬＰ（１３９
−１５１））であった。 【０２０１】 【表１】 我々の観察が示唆するには、Ｉ−Ａｓ／ＭＢＰ（９１−
１０３）複合体（３００μｇ）によるインビボ治療は受
動誘発型ＥＡＥの予防をもたらす。更に、４５μｇのＩ
−Ａｓ／ＰＬＰ（１３９−１５１）による治療は、この
治療を受けた動物の死亡率及び病的状態を有意に下げ
た。 【０２０２】本発明の複合体を、マウスにおけるＥＡＥ
の再発を防止する能力についても試験した。これらの実
験において、ＳＪＬマウスは０日目にて１．２×１０７
ｐ９１−１０３反応性Ｔ細胞を腹腔内的に受容した。
８〜１２日目の間に初期麻痺徴候が発症し、そして全て
の動物は２２日目まで少なくとも２級の臨床級にまで回
復した。マウスは２７，３７及び４７日目に５０μｇの
ＭＨＣ複合体（同系のペプチドを有する及び有さな
い）、又はＰＢＳを静脈内的に受容した。実験１におい
ては、マウスを１０２日間にわたって観察し、そして実
験２においては、それらを１１２日間にわたって観察し
た。結果は、同系ペプチドを有する複合体は再発を防ぐ
うえでコントロールよりも有意により有効であることを
示唆した。 【０２０３】実施例５ ＭＨＣ ＩＩ−ＨＳＰ（１８０−１８８）複合体による
ＲＡの下降制御 ルイスラットは、不完全フロインドアジュバント中に乳
濁せしめたミオバクテリア チューバキュロシスの皮下
注射に応答して、関節炎、通称アジュバント関節炎の状
態を発症する。この関節炎のモデルは、リウマチ型関節
炎の処置のために開発される薬剤の薬効を評価するのに
必要な数多くの評価を可能とする。組織の病理性、並び
に単球及びリンパ球細胞の浸潤は強力なＴ細胞仲介応答
を示唆する。ここで説明する実験は、ペプチド−ＭＨＣ
クラスＩＩ複合体を認識し、且つ、結合するペプチド−
特異的Ｔ細胞をアネルギー化する技術を利用する。この
研究は、この障害の誘発のすぐ後での可溶性ＭＨＣクラ
スＩＩ−ペプチド複合体によるインビボ処置を包括す
る。この結果は、食塩水処置を受けたグループに比して
の、ＭＨＣクラスＩＩ−ペプチド処置ラットにおける骨
退化の有意な低下を示した。 【０２０４】ルイスラットＭＨＣクラスＩＩ ＲＴ１Ｂ
及びＲＴ１Ｄ分子を、セファロース４Ｂカラムに結合さ
せたＯＸ−６及びＯＸ−１７モノクローナル抗体によ
り、脾臓細胞膜のＮＰ−４０抽出物からアフィニティー
精製した。ＲＴ１Ｂ、対、ＲＴ１Ｄの相対収率は１：２
であった。ＭＨＣクラスＩＩ分子にこのペプチドを、５
６μｇのＲＴ１Ｂ及び１１３μｇのＲＴ１Ｄ分子を５０
倍モル過剰量のヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）ペ
プチド、ｐ（１８０−１８８）を３７℃で４８時間にわ
たり、１％のオクチルグルコシドを含む全容量１ｍｌの
リン酸バッファーｐＨ７．５の中で混合することによっ
て負荷せしめた。未結合ペプチドを、４℃でＰＢＳバッ
ファーに対してこのサンプルを長い間透析することによ
って除去した。この最終複合体濃度は１７０μｇ／ｍｌ
であり、そしてＷｈｉｔｔａｋｅｒＢｉｏｐｒｏｄｕｃ
ｔ，Ｉｎｃ．により記載のリムルス アメボサイト（Ｌ
ｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ）リゼート手順によ
り試験した通り、エンドトキシンを有さなかった。 【０２０５】６匹の雄のルイスラット（生後７７日目）
に、関節炎を誘発するために両後足に、不完全フロイン
ドアジュバント中の１ｍｇのミコバクテリア チューバ
キュロシスを注射した。３匹のラットは、障害の誘発か
ら１，４及び７日後にＭＨＣクラスＩＩ＋ＨＳＰ１８０
−１８８複合体を静脈内的に処置した。他の３匹のラッ
トには上記の通りに食塩水を与えた。関節炎指数を全体
外観により決定し、そして以下の基準に従った：０）変
化なし；１）指の接合部に若干の変化；２）若干から軽
い足の水腫又は２本以上の指の膨らみ；３）若干のかさ
ぶたを伴う足の膨らみ、足の指及び爪の軽い硬化；４）
足のひどい膨らみ、著しいかさぶた、及び著しい足の指
及び爪の硬化。 【０２０６】ＭＨＣクラスＩＩぺプチド又は食塩水で処
置したラットは２０日目にそれらのほとんどの足に、４
の関節炎指数の膨らみを有していた。何匹かのラットの
足において見られる膨らみの相違は注射したＭＴの量に
反映するようである。しかしながら、障害の誘発から３
５日後に足のラジオグラフを得たとき、ＭＨＣクラスＩ
Ｉペプチド処置と食塩水処置グループとの間に有意な差
は認められなかった。 【０２０７】第２の実験において、１８匹の動物を５週
間にわたって障害の進行中に処置した。表２に示す通
り、本発明のＭＨＣ−ペプチドで処置した動物は大いに
低められた関節炎指数及び有意に低められた接合部の膨
らみを、食塩水処置グループに比して有していた。動物
は４，８及び１２日目に２５μｇのＭＨＣペプチドを受
容した。 【０２０８】 【表２】３５日目に、全ての動物の足根骨接合物をノギスを用い
て測定した。測定値は両後足の厚みの合計を示す。 【０２０９】実施例６ 複合体の血清半減期の上昇 本実施例は該複合体の様々な改質が血清半減期の上昇を
もたらすというデーターを示す。 【０２１０】これらの研究のためのプロトコールは一般
に下記の通りである：アフィニティー精製した可溶性Ｍ
ＨＣ分子をヨードビーズ法（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により
１２５Ｉでラベルした。過剰の１ ２５Ｉは０．１％の中
性清浄剤を含むＰＢＳに対する透析により除去した。ラ
ベル化タンパク質の性状を薄層クロマトグラフィー、セ
ルロースアセテート電気泳動及びポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により評価した。マウスにＭＨＣ糖タンパク
質を尾静脈注射により投与し、このマウスは注射の少な
くとも一日前に飲料水中のルゴール溶液を付してある。
様々な時点で血液サンプルを採血した。注目の器官を得
るためにこれらの動物を殺した。血液及び器官のサンプ
ルにおける放射活性を標準技術に従ってガンマーウェル
カウンターで検出した。 【０２１１】Ａ．血清半減期に対するアンアロレツイン
の効果 ＩＡｋをラベルし、そして前記の通りにマウスに投与し
た。 【０２１２】これらのマウスを３通りのセットに分け
た：（１）Ｉ−Ａｋ（１０μｇ静脈内）；（２）Ｉ−Ａ
ｋ（１０μｇ静脈内）＋アシアノレツイン（１０ｍｇ静
脈内）＋アンアロレツイン（１００ｍｇ腹腔内）；及び
（３）Ｉ−Ａｋ（１０μｇ静脈内）＋アシアロレツイン
（１０ｍｇ腹腔内）。血流を様々な時点で抜き取り、そ
して血液中に保持された注射投与量の％を計算した。 【０２１３】３通りのセットの平均血清半減期は下記の
通りであった： セット１−３分。 【０２１４】セット２−４０分。 【０２１５】セット３−３５分。 【０２１６】Ｂ．血清半減期に対するリポソームの効果 Ｉ−Ａｓを前記の通りラベルした。このラベル化Ｉ−Ａ
ｓ分子を標準の技術によってリポソームの内側に捕促さ
せた（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、前掲を参照のこ
と）。前述の通りに１０匹のマウスに１０μｇのＩ−Ａ
ｓを注射し、そして４通りのセットに分けた；（１）Ｉ
−Ａｓのみ；（２）リポソームＩ−Ａｓ；（３）ブラン
クリポソームを一緒に注射するリポソームＩ−Ａｓ；及
び（４）ブランクリポソーム＋、１０分後にブランクリ
ポソームと一緒に注射するリポソームＩ−Ａｓ。注射後
様々な時点で血液サンプルを採取し、そして血液中に保
持されたＩ−Ａｓの注射投与量の％を計算した。 【０２１７】３通りのセットの血清平均半減期は下記の
通りであった： セット１−２分。 【０２１８】セット２−７分。 【０２１９】セット３−１０分。 【０２２０】セット４−６０分。 【０２２１】Ｃ．血清半減期に対する過ヨウ素酸／シア
ノボロハイドライド処理の効果 ３ｍＭのタウロデオキシコレートを含むリン酸バッファ
ー，ｐＨ７．５中のＩ−Ａｋを前述の通りにラベルし
た。このラベル化分子を過ヨウ素酸及びシアノボロハイ
ドライド還元に４℃で５又は２１時間、０．１Ｍの酢酸
バッファー，ｐＨ５．５中での２０ｍＭの過ヨウ素酸ナ
トリウム及び４０ｍＭのシアノボロハイドライド（最終
濃度）を用いて処理した。この反応をエチレングリコー
ル（最終濃度０．７％）の添加により止めた。処理した
Ｉ−Ａｋを透析により精製し、次いで前述の通りにマウ
スに投与した（１０μｇ静脈内）。９匹のマウスを３通
りのセットに分けた：（１）Ｉ−Ａｋ（未処理）；
（２）Ｉ−Ａｋ（５ｈｒ．処理）；及び（３）Ｉ−Ａｋ
（２１ｈｒ．処理）。様々な時点で血液サンプルを獲得
し、そして血液中に保持された注射投与量の％を計算し
た。 【０２２２】３通りのセットの血清半減期は下記の通り
であった： セット１−４分。 【０２２３】セット２−７分。 【０２２４】セット３−７０分。 【０２２５】実施例７ 以下に紹介する結果は、本発明のＭＨＣペプチド複合体
が清浄剤なしでは凝集体として主に存在していることを
示している。 【０２２６】１２５ＩでラベルされたＩＡｋ−Ｐ複合体
を前述の通りに調製した。この複合体（１．５ｍｇ／ｍ
ｌ）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して長く透析し
て清浄剤を除去し、そして６ｍｌｂ．ｖ．のセファデッ
クス−Ｇ２００カラムに載せた（分画サイズ５０００〜
６００，０００）。図２０に示す結果は、凝集した複合
体がカラムをボイドボリュームにて通過することを示
し、従ってこれは６００，０００より大きい分子量を有
することになる。 【０２２７】同様に透析したＩＡｋ複合体（１．５ｍｇ
／ｍｌ）も遠心し、そしてそのペレットを計測した。こ
れを行うため、２００ｍｌの複合体（３００μｇ）を５
ｍｌのＰＢＳに希釈し、そして固定角度ローターで１０
０，０００×ｇで６０分間遠心した。この結果を下記の
表３に示す。 【０２２８】 【表３】 クロマトグラフィー及び遠心実験の両方の結果は、ＭＨ
Ｃ−ペプチド複合体が凝集又はミセル状でほとんど存在
していることを示す。これらの結果は、本発明の単一サ
ブユニット複合体も、清浄剤なしでは凝集又はミセル状
にあることを強く示唆している。 【０２２９】実施例８ 本実施例は、可溶化ＭＨＣクラスＩＩ−ＡｃｈＲのαペ
プチド１００−１１６複合体の投与がＡｃｈＲ−反応性
Ｔ細胞の機能を変更し、そしてこのことにより、ＥＡＭ
Ｇ、すなわち、抗体に仲介されるがＴ細胞依存性の自己
免疫疾患の経過を調節する。 【０２３０】ＡｃｈＲ及びＡｃｈＲペプチド トルペド カリホルニカ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｍａ
ｒｉｎｅ））由来のエレクトロプラクス組織をホモナイ
ズし、そしてその膜分画を界面活性剤（２％のＴｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００，１００ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭの
ＭＯＰＳ，０．１ｍＭのＥＤＴＡ，０．０２％のＮａＮ
３）により可溶化した。抗−ＡｃｈＲモノクロナール抗
体ｍＡｂ３５を用いたアフィニティー・クロマトグラフ
ィーによりこの可溶化膜からＡｃｈＲを単離し、そして
１．０％ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（Ｏ
Ｇ）／ＰＢＳに対し透析した。 【０２３１】トルペドＡｃｈＲサブユニット・ペプチド
１００−１１６（ＹＡＩＶＨＭＴＫＬＬＬＤＹＰＧＫ
Ｉ）を、標準的な手順を使用して、固相９−フルオレニ
ルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）手順により合成し
た。このペプチドを、逆相ＨＰＬＣにより精製し、そし
てＨＰＬＣ及び質量分析法により特徴付けした。 【０２３２】ラットＭＨＣ ＩＩの精製及びペプチド装
填 ラットのクラスＩＩ ＲＴ１．Ｂ及びＲＴ１．Ｄ分子
を、均一化した脾臓から、界面活性剤（０．５％のＮＰ
−４０，１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．３，１
ｍＭのＰＭＳＦ，０．０２％のＮａＮ３）により可溶化
し、そしてモノクロナール抗体ＯＸ６及びＯＸ７を用い
たアフィニー・クロマトグラフィーにより精製した。こ
のＲＴ１．Ｂ／Ｄ混合物を、３７℃で、２４時間、５０
倍のモル数過剰のペプチドＡｃｈＲα １００−１１６
と共にインキュベートし、次に、未結合のペプチドを除
去するために、０．１％のＯＧ／ＰＢＳに対し、４℃で
の透析を２４時間行った。ニトロセルロース・フィルタ
ー結合及びＴＬＣによる分析（Ｂ．Ｎａｇら（１９９
１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１４２：１０５）
により、ＲＴ１．Ｂの７０〜８０％及びＲＴ１．Ｄの９
０〜１００％がペプチドＡｃｈＲα １００−１１６に
結合したことが明らかとなった。この複合体は、４℃
で、少なくとも８週間安定であった。 【０２３３】ＥＡＭＧの誘発及び可溶化ＭＨＣ ＩＩ：
ＡｃｈＲα １００−１１６による治療 雄のＬｅｗｉｓラット（生後８〜１２週間）に、完全ｆ
ｒｅｕｎｄのアジュバント中で乳化したＴｃ ＡｃｈＲ
を、両方の後ろ足に、そして腹膜中に６００ｎｇの百日
咳毒を注射した。病気（臨床段階１〜３）のラットを、
湿った食べ物で飼養し、そして歯を、一週間おきに切り
取った。 【０２３４】ＡｃｈＲ免疫化後、１，４及び７日目に、
個々のラットに、生理食塩水、２５μｇのＭＨＣ ＩＩ
単独（ＭＨＣ ＩＩ：０）、又は２５μｇのＴ．ｃ．Ａ
ｃｈＲαペプチド１００−１１６と複合体化したＭＨＣ
ＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ：ＡｃｈＲα １００−１１６）
を、静脈中に投与した。Ｔ細胞を、ＡｃｈＲ免疫化後９
日目に、膝窩のリンパ節から精製し、そして抗原のパネ
ルに対する増殖についてテストした。 【０２３５】Ｔ細胞増殖検定 末梢リンパ節由来のＴ細胞を、ナイロン・ウール・クロ
マトグラフィーにより単離した。２×１０５のＴ細胞及
び３×１０５の照射された同系の脾臓細胞を、０．２ｍ
ｌの培養培地（ＲＰＭＩ １６４０，１０％のＦＢＳ，
１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，５×１０−５Ｍの２−ＭＥ，１
００Ｕ／ｍのペニシリン、１００Ｕ／ｍのストレプトマ
イシン）中で、ペプチド又は全抗原と共に、３日間３７
℃，５％ＣＯ２の下で、インキュベートし、１μＣｉの
３Ｈ−チミジンにより１８時間、パルス照射し、そして
カウントした。 【０２３６】ＬｅｗｉｓラットにおけるＥＡＭＧの時間
経過 Ｔ．ｃ．ＡｃｈＲによるＬｅｗｉｓラットの免疫化は、
予め予期できる時間経過を伴って体重の減少及び筋肉の
弱体化の進行を引き起こす抗−ＡｃｈＲ抗体を誘導す
る。免疫化後一週間内の体重の減少は、単核細胞による
神経筋接合への浸潤が原因の「急性期」と同時に起こ
る。第二の、持続性の体重減少は、３３〜４０日目に始
まり、これは、ヒト患者におけるＭＧに似た臨床的症状
を伴った「慢性期」である。個々のラットの体重の変化
を、病気の始まり、進行、そして死期の範囲（横座標と
の交差により示される）を説明するために示す。 【０２３７】未処理のラットにおいては、進行性ＥＡＭ
Ｇは、３段階に分類できる。段階１においては、抗−Ａ
ｃｈＲ抗体は、ＡｃｈＲのエンドサイトーシスを引き起
こす。神経筋接合での閾値以下のレベルのＡｃｈＲは、
特に後方の筋肉において、筋肉の収縮を減少させる。弱
い背中及び後ろ足の筋肉は、特徴的なネコ背を引き起こ
す。段階２においては、首の筋肉における弱さにより頭
が支えられない状態での頻繁な休眠期間を引き起こす進
行した弱さを特徴とする。段階３においては、横隔膜及
び肋間の筋肉が弱り、苦しみながらの呼吸を引き起こ
す。下顎骨の筋肉の衰退は、過大な歯の成長を導く。 【０２３８】可溶化ＭＨＣ Ｉ：ＡｃｈＲα １００−
１１６の治療的効果をテストするために、臨床的な症状
が上記の慢性期において現れた後に、ラットを治療し
た。 【０２３９】可溶化ＭＨＣ ＩＩ：ＡｃｈＲα １００
−１１６により誘発される抗原特異的な非応答性 生理食塩水処理ラットにおいて、Ｔ細胞のＡｃｈＲαペ
プチド１００−１１６に対する応答は、ＡｃｈＲ（α２
βγδ）（図２１）に対する応答の３０％に等しく、１
００−１１６がＡｃｈＲに応答性のＴ細胞内の主要なエ
ピトープであるという文献報告を確信させるものであ
る。ＭＨＣ：０処理ラット由来のＴ細胞は、生理食塩水
処理ラット由来のＴ細胞同じようなレベルで、それぞれ
の抗原に対し応答する。 【０２４０】ＭＨＣ ＩＩ：ＡｃｈＲα １００−１１
６処理ラットの全Ｔｃ ＡｃｈＲ及びＡｃｈＲα１００
−１１６に対するＴ細胞応答は、生理食塩水処理ラット
のＴ細胞増殖レベル（図２１）のそれぞれ、２２％及び
２０％であった。百日咳毒に対しての、ＭＨＣ ＩＩ：
ＡｃｈＲα １００−１１６処理ラット由来のＴ細胞の
増殖は、生理食塩水及びＭＨＣ ＩＩ：０処理ラット由
来のＴ細胞と同じであり、このことは、Ｔ細胞の不活性
化が抗原特異的であるということを示している（図２
１）。 【０２４１】可溶化ＭＨＣ ＩＩ：ＡｃｈＲα １００
−１１６の治療効果 臨床段階１のＥＡＭＧ（接種後約４２〜５６日目）のラ
ットのランダム群に、静脈中に、５週間間隔で、生理食
塩水、２５μｇのＭＨＣ ＩＩ：ＨＳＰ １８０−１８
８（無関係のヒートショックペプチドを含むＭＨＣ Ｉ
Ｉ）、２５μｇのＭＨＣ ＩＩ単独（ＭＨＣ ＩＩ：
０）、又は５μｇのＡｃｈＲα １００−１１６単独
（０：ＡｃｈＲα １００−１１６）を、注射した。体
重及び臨床的な症状を観察した。 【０２４２】ＭＨＣ ＩＩ：ＡｃｈＲα １００−１１
６による臨床段階１のＥＡＭＧのラットの治療は、誘発
後、１４０日目に６７％の生存率を生じさせた。これに
反し、その対照群内の最大生存率は、２０％（１６．７
％の生理食塩水、０％のＴｃＡｃｈＲ α １００−１
１６単独、２０％のＭＨＣ ＩＩ単独、２０％のＭＨＣ
ＩＩ：ＨＳＰ１８０−１８８）であった。それぞれの
治療群における代表ラットについてのＥＡＭＧの時間経
過を、表４に示す。 【０２４３】４匹の生存ＭＨＣ ＩＩ：ＡｃｈＲα １
００−１１６処理ラットは、比較的重症のＥＡＭＧ（最
大値２．０，２．５，２．５及び３．０）を、その後
の、最初の治療的注射後約３週間目の緩解傾向を示し
た。 【０２４４】 【表４】 それぞれの処理群からの代表ラットを、ＡｃｈＲ免疫化
によるＥＡＭＧ誘発後６１，１２３及び２２４日目につ
いて示す。それぞれのラットの臨床段階を示す。１２３
日目までに、上記のＭＨＣ ＩＩ：ＡｃｈＲα １００
−１１６処理ラットは、ＭＨＣ ＩＩ：ＨＳＰ １８０
−１８８により治療された上記の長く生存したラットに
比べ、回復した動作及び姿勢を示している。 【０２４５】これらの結果は、ＥＡＭＧ誘発の初期に注
射された可溶化ＭＨＣ ＩＩ：ＡｃｈＲα １００−１
１６複合体がＡｃｈＲαペプチド１００−１１６にそし
て全ＡｃｈＲに対し応答するＴ細胞を有意に減少させる
ことを示している。可溶化ＭＨＣ ＩＩ：ＡｃｈＲα
１００−１１６複合体の効果は、抗原特異的である、な
ぜなら、この複合体は、無関係の抗原である百日咳毒に
対するＴ細胞に影響を与えないからである。ＥＡＭＧの
慢性期の間の可溶化ＭＨＣ ＩＩ：ＡｃｈＲα１００−
１１６複合体による治療は、この病気の死亡率及び臨床
的な症状を減少させる。 【０２４６】実施例９ 本実施例は、本発明の複合体が重症筋無力症（ＭＧ）に
関連するヒトＴ細胞におけるアネルギーを誘導する能力
を示す。 【０２４７】本実験におけるＴ細胞は、若い初期ＭＧ患
者の胸腺由来のものであった。それらは、残基１３８−
１６７のＡｃｈＲαサブユニットを認識し、そしてＤＲ
４Ｄｗ４により制限される。本実験においては、２×１
０４のＴ細胞を、各種の時間の間、複合体（ＤＲ４：ｐ
１３８−１６７）、ＤＲ４単独、又はペプチド単独のい
ずれかと共に、予めインキュベートした。異なった抗原
によりパルス照射された抗原表示細胞（ＡＰＣ）を次に
添加し、そしてそのＴ細胞の増殖を先に記載したように
トリチウム含有チミジンを使用して測定した。上記の刺
激性抗原は、ｐ１３８−１６７及びｒ３７−１８１と名
付けられた組み換えにより製造されたＡｃｈＲαサブユ
ニット・ポリペプチドを含み、これは、Ｂｅｅｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ９：２１０１−２１０６
（１９９０）及びＢｅｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１７：２１９−２２０
（１９８９）（これらの両方が引用により本明細書中に
取む込まれる）の中に記載されているように調製され
た。 【０２４８】Ｔ細胞と１０μｇｍ／ｍｌの複合体との一
夜の前インキュベーションは、次に抗原を存在させたと
きに、このＴ細胞において非応答性を導く。低濃度での
且つより短い時間でのインキュベーションは、アネルギ
ーを誘導するときには、効果的でなかった。 【０２４９】アネルギー化細胞の生育能力を、トリパン
ブルーによりテストした。Ｔ細胞を、培地、又は５μｇ
／ｍｌの複合体、及び各種時間にカウントするために取
り出された部分と共にインキュベートした。細胞を、生
きているもの又は死んでいるもののどちらかとして、生
存細胞におけるトリパンブルー排除に基づきカウントし
た。結果を図２２Ａ及び２２Ｂ中に表す。培地とインキ
ュベートした細胞においては、細胞の全数は徐々に増加
したが、一方、死細胞の数は同じに残存した。複合体と
インキュベートした細胞においては、細胞の全数は最初
の６時間の間は急激にそしてその後はよりゆっくりと減
少した。死細胞の全数は、徐々に増加したので、インキ
ュベーション数日後には、細胞のほとんど９０％が死滅
した。これらの結果は、細胞の死がＴ細胞におけるアネ
ルギー誘導の結果として起こる。 【０２５０】上記複合体とＴ細胞との相互作用の特異性
をテストするために、Ｔ細胞（１×１０４）を、各種形
態の複合体と共にインキュベートした。これらは、関連
複合体ＤＲ４：ｐ１３８−１６７，ＤＲ４単独、等モル
（比例）量であるが一緒に結合しない「可溶化ＤＲ４及
び見せ掛けの（ｓｈａｍ）」ｐ１３８−１６７、並びに
ＤＲ４：ＭＢＰ ｐ１−１４複合体であった。見せ掛け
のペプチドを、可溶化ｐ１３８−１６７単独が上記複合
体と同じ効果があることを示した先の実験のように使用
した。見せ掛けのｐ１３８−１６７は、透析、そしてそ
れ故に上記複合体から放出されることができるいくつか
の可溶化ペプチドの効果について制御することを含むよ
うな上記複合体としての調製に供されたｐ１３８−１６
７のサンプルであった。一夜の前インキュベート後、照
射ＰＢＬ（２×１０５）及び刺激性抗原を添加した。 【０２５１】無関係の複合体とペプチドとの等価な濃度
は、アネルギーを誘導体しなかった。培地との一夜のイ
ンキュベーション及びその後のｒｅｃ α３７−１８１
による刺激は、良好な増殖応答を生じさせた。ＤＲ４：
ｐ１３８−１６７との前インキュベーションは、実質的
に次の増殖を減少させた。しかしながら、他の物質のい
ずれかとの前インキュベーションは、培地との前インキ
ュベーションに比べて、増殖に対して全く効果を及ぼさ
なかった。 【０２５２】各種の複合体との前インキュベーションの
効果に加えて、各種抗体を細胞表面マーカーに添加する
効果、又はＩＬ２ ０．５％をＤＲ４：ｐ１３８−１６
７との前インキュベーション時に添加する効果を研究し
た。抗−ＴＣＲ Ａｂ（抗−ＴＡＣ−７８６）の添加
は、上記複合体により引き起こされたバックグランド刺
激を抑制し、いかなる抗原誘導応答をも抑制し、そして
前インキュベーション後のＩＬ２による刺激に対する応
答をも部分的に抑制した。抗−ＤＲ Ａｂ（Ｌ１２３）
は、複合体との前インキュベーションにより誘導体され
た抗原誘導応答に対して全く効果を及ぼさなかった。抗
−ＴＡＣと抗−ＤＲとの組合せは、バックグランド増殖
を減少させたが、抗原誘導増殖はＩＬ２−誘導増殖に対
して全く効果を及ぼさなかった。上記Ｔ細胞の０．５％
のＩＬ２の存在中での複合体との前インキュベーション
は、その複合体の抑制効果を減少させなかった。 【０２５３】同様に、上記複合体の、非−ＤＲ４、非−
ＡｃｈＲ Ｔ細胞系に対する非特異的効果を同定するた
めに実験を計画した。ＫＬＨ又は破傷風毒素に対して作
られた系由来の細胞（２×１０４）を、上記複合体と共
に一夜、前インキュベートした。次にそれらを、照射Ｐ
ＢＬ（２×１０５）及び抗原により刺激を与えられた。
上記複合体との前インキュベーションは、特異的抗原に
対するバックグランド増殖応答に対するどんな効果もも
っていなかった。従って、この複合体は、無関係の細胞
系に対する、どんな非特異的な刺激性の又は抑制的な効
果ももっていないようである。 【０２５４】最後に、図２３Ａ及び２３Ｂは、アネルギ
ーを誘導するのに必要な複合体のモル濃度がペプチド単
独のものよりもはるかに低いことを示している。図から
分かる通り、１．７×１０−８を超える濃度でのｐ１３
８−１６７とのＴ細胞の前インキュベーションは、組み
換えに対する応答において減少をもたらした。低濃度で
の前インキュベーションは、培地との予備インキュベー
ション（はるか左）に比べて、背景増殖における増加を
引き起こした。１．７×１０−５の濃度に達するまで
は、増殖応答は、背景レベルまで低下しなかった。 【０２５５】１．７×１０−１１より高い濃度でのＤＲ
４：ｐ１３８−１６７とのＴ細胞の前インキュベーショ
ンは、抗原誘導増殖応答を抑制した。１．７×１０−８
を超える濃度では、この抗原誘導増殖は、バックグラン
ドレベルまで低下した。使用された複合体の最も低い濃
度、１．７×１０−１１は、抗原誘導増殖における増加
を、背景増殖における増加を、そしてＩＬ２に対する増
殖応答における増加をもたらした。 【０２５６】このように、複合体及びｐ１３８−１６７
単独の両方が、幾つかの刺激を引き起こす。より高い濃
度において、両者は、抗原特異的応答を抑制する。しか
しながら、相対的な抑制（すなわち、バックグランド刺
激のレベルに対する）のために必要なｐ１３８−１６７
の量は、ＤＲ４：ｐ１３８−１６７のものの約１０００
倍（モル数）であった。 【０２５７】先の例中に記載した結果は、本発明の複合
体がインビボにおける自己免疫疾患を治療する能力を示
している。これらのデータは、アネルギーの誘導を示す
インビトロにおけるデータと一緒になって、請求する複
合体の効果を確立している。本発明は、明確さと理解の
目的のために上記の例中で幾分詳細に記載されたが、添
付した請求項の範囲内で、特定の変更及び修正をするこ
とができることは言うまでもない。 【０２５８】 【発明の効果】インビトロ及びインビボ実験の両者に由
来する証拠は、かかる複合体が同系移植Ｔ細胞における
慢性アネルギーを誘発せしめることを確立する。 【０２５９】その他の観点において、本発明は薬理学的
組成物に向けられ、ここで本発明の複合体が活性成分で
ある。この組成物は自己免疫障害のような免疫応答に関
連する特定の抗原との免疫系反応の一部を下降制御する
のに用いることができる。
害、アレルギー応答、移植片拒絶及びその他の免疫学的
障害の処置におけるＴ細胞機能の調節のための方法及び
組成物に関する。詳しくは、主要組織適合性複合体（Ｍ
ＨＣ）糖タンパク質と、かかる障害に関連する抗原のフ
ラグメントに相当するペプチドとの複合体を利用するこ
とによる、ヘルパーＴ細胞を標的とする複合体に関す
る。 【０００２】 【従来の技術】これらの複合体は診断目的のためにラジ
オアイソトープもしくはその他のラベルに、又は該複合
体を治療的に有用にする毒素もしくはその他の物質に更
に複合化せしめることができる。 【０００３】望ましくないＴ細胞の活性化を包括する数
多くの病理学的応答が知られている。例えば、数多くの
アレルギー障害は特定のＭＨＣ対立遺伝子に関連してい
るか、又は自己免疫成分を有することが推測されてい
る。 【０００４】その他の有害なＴ細胞仲介応答には、同種
異系宿主に由来するグラフト又は移植片として故意に身
体に導入した外来細胞の破壊が含まれる。「同種異系移
植片拒絶」として知られるこのプロセスは宿主のＴ細胞
と外来ＭＨＣ分子との相互作用を包括している。しばし
ばよく、幅広い範囲のＭＨＣ対立遺伝子が、同種異系移
植片に対する宿主の応答に関与している。 【０００５】自己免疫障害は特に重要な有害な免疫応答
の種類である。自己免疫障害において、自己寛容は失わ
れてしまい、そして免疫系は「自己」の組織をあたかも
それが外来標的であるかのように攻撃する。これには、
重症筋無力症（ＭＧ）及び多発性硬化症（ＭＳ）を含
む、公衆の注目を浴びた数多くのものが含まれる。 【０００６】自己免疫障害及びその他の免疫病理を処理
する大雑把な手法は一般に免疫抑制である。これは免疫
応答を上昇せしめることを必要とする真の外来物質に対
する対象体の能力を失わせる明らかなる欠点を有する。
ほんのわずかに洗練された手法は、標的組織に関与する
抗体又は免疫複合体の排除を基礎とする。これも有害な
副作用を有し、そして成し遂げることが困難である。下
記に詳細する本発明の手法は、「クロノタイプ」試薬、
即ち、自己抗原に対して応答性である免疫系の細胞のみ
を攻撃する試薬を基礎とする。 【０００７】免疫応答を説明するのにここで考慮してい
る一般例において、紹介する特異的抗原は、１９５９年
にＢｕｒｎｅｔによって初めて提案されたクローン増殖
に由来する。このシナリオに従うと、特定の対象体は数
１０万のＴ及びＢ細胞を有し、それぞれは様々な抗原決
定基に結合するレセプターを保有しうる。抗原への暴露
により、この抗原はその他を無視して、それが含んでい
る抗原決定基に対する適当なレセプターを抱える細胞に
特異的に結合する。この結合は数千の娘細胞のクローン
集団（それぞれは同一のレセプターにより担われる）を
もたらす。クロノタイプ試薬は、対象の抗原にとって適
切であるＴ及びＢ細胞のサブセットのみに影響する。本
発明の組成物においては、この抗原決定基は通常自己免
疫障害に関連するものである。 【０００８】本発明のクロノタイプ試薬組成物はＴヘル
パー細胞を標的とするために特にデザインされており、
これは自己免疫障害により影響される組織の抗原決定基
に特異的なクローンを代表する。Ｔヘルパー細胞はＭＨ
Ｃタンパク質と一緒のときにのみ決定基を認識する；本
発明の複合体は従ってこのＭＨＣタンパク質の有効領域
を含んでいる。 【０００９】最近、特異的な抗原に対する免疫応答を妨
害することを試むいくつかの関連の手法がある。例え
ば、自己抗原チログロブリンがリシンＡとコンジュゲー
トされており、そしてこのコンジュゲートはこの抗原に
通常応答するリンパ球のインビトロ抗体応答を特異的に
抑制することが示されている。かかる免疫毒素は自己抗
体−分泌性リンパ球クローンを特異的に排除することが
推測されている（Ｒｅｎｎｉｅ，Ｄ．Ｐ．ら、Ｌａｎｃ
ｅｔ（１９８３年１２月１０日）１３３８−１３３
９）。Ｄｉｅｎｅｒ，Ｅ．らのＳｃｉｅｎｃｅ（１９８
６）２３）：１４８−１５０は、酸感受性スペーサーを
用いてダウノマイシンをハプテン（この場合はオバルブ
ミン）にコンジュゲートせしめることによる、リンパ球
機能の抗原特異性抑制を生じせしめる化合物の構築を提
唱している。このコンジュゲートはインビトロ及びイン
ビボでのＢリンパ球による抗体分泌のハプテン−特異的
阻害を生じせしめている。ダウノマイシンの、Ｔ細胞に
特異的なモノクローナル抗体とのコンジュゲート（酸感
受性スペーサーによる）はコンカナバリンＡに対するＴ
リンパ球による応答も排除した。Ｓｔｅｅｒｚ，Ｒ．
Ｋ．Ｍ．らＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８５）１３４：８
４１−８４６は毒素コンジュゲートにおける毒素因子と
して放射物を利用している。ラットに、コールドレセプ
ターを注射する前に、電気魚に由来する放射性ラベルし
た精製レセプターを投与している。このレセプターによ
る注射は実験的な自己免疫重症筋無力症（ＥＡＭＧ）を
誘発する標準的な手法である。障害を誘発せしめるレセ
プターの投与前に、コールドレセプター又は放射性ラベ
ルアルブミンのいずれかのみの事前注射を受けたコント
ロールラットはＥＡＭＧの症状を示した；放射性ラベル
レセプターで予備処置したものは軽い症状を示した。ラ
ベルされた、それ故破壊性のレセプターは免疫競合細胞
を特異的に排除することが予測された。予備処置のため
のリシン／レセプターコンジュゲートを利用する似たよ
うな研究がＫｉｌｌｅｎ，Ｊ．Ａ．らのＪ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ（１９８４）１３３：２５４９−２５５３に報告さ
れている。 【００１０】一般にＴ細胞の破壊をもたらす消極的な手
法は、Ｈｉｘｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｒ
ｉｂｕｎｅ（１９８８年１月２８日）４−５に報告され
ているＩＬ−２／毒素のコンジュゲートによる処置であ
る。反対に、しかし関連する手法として、Ｌｉｕ，Ｍ．
Ａ．らＳｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：３９５−３
９７は、細胞毒性Ｔ細胞特異性を無視して、所望の標的
と細胞毒性Ｔ細胞との「リンクアップ（連結）」法を報
告している。この手法において、使用するホルモンがメ
ラノサイト刺激ホルモンのとき、普遍性細胞毒性Ｔリン
パ球に特異的な抗体はヒト黒色腫細胞を破壊する。 【００１１】免疫性の現状のモデルは、抗原が、主要組
織適合性複合体（ＭＨＣ）における遺伝子によりコード
されるクラスＩＩの糖タンパク質を表層上に含んでいる
抗原表示細胞（ＡＰＣ）により摂取されることによっ
て、免疫応答を動員せしめることを少なくともある程度
は条件としている。この抗原は、次に表層結合型ＭＨＣ
糖タンパク質に関連して特異的なＴヘルパー細胞へと供
され、そして、この抗原特異性Ｔ細胞レセプターと抗原
−ＭＨＣ複合体との相互作用により、このＴヘルパー細
胞は、細胞毒素Ｔ細胞機能の誘発、Ｂ細胞機能の誘発、
並びにこの応答を補助する及び扇動する数多くの因子の
分泌を含む、抗原特異的免疫応答の仲介を刺激する。 【００１２】自己免疫障害におけるＭＨＣクラスＩＩタ
ンパク質の関与は動物モデルにおいて示されている。Ｍ
ＨＣクラスＩＩタンパク質自体に対する抗体、又はＭＨ
ＣクラスＩＩ遺伝子の発現を誘発する物質に対する抗体
の投与は、これらのモデル系における自己免疫症状の発
症をはばむ。ヘルパーＴ細胞の役割も、抗ＣＤ４モノク
ローナル抗体を用いてこの自己免疫系を妨げることによ
り、これらのモデルにおいて実証されている；ＣＤ４は
特徴的なヘルパーＴ細胞レセプターである（Ｓｈｉｚｕ
ｒｕ，Ｊ．Ａ．らＳｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０：
６５９−６６２）。 【００１３】最近の実験は、一定の環境のもとでは、ア
ネルギー又は非応答性が自己反応性リンパ球の中で誘発
されうることを示している（Ｓｃｈｗａｒｒｚ，Ｃｅｌ
１（１９８９）１０７３−１０８１を参照のこと；これ
は引用して本明細書に組入れる）。インビトロ実験は、
共刺激シグナルの非存在下において、ＭＨＣクラスＩＩ
分子による抗原表示は、繁殖的な非応答性状態を同系移
植細胞において誘発せしめることを示唆する（Ｑｕｉｌ
ｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８７）１３８：３７０
４−３７１２これは引用して本明細書に組入れる）。 【００１４】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の報告は、インビボでのアネルギーの誘発が可能である
か、又は自己免疫障害がこの状態で有効に処置されうる
かの明確な証拠を提供していない。 【００１５】 【課題を解決するための手段】１．本発明は、抗原性ペ
プチドと抗原結合部位を有する単離ＭＨＣ成分とより本
質的に構成され、ここでこの抗原性ペプチドがこの抗原
結合部位と連結されている、実質的に純粋なＭＨＣ−ペ
プチド複合体を提供する。 【００１６】２．１つの実施形態において、本発明は、
上記のペプチドが上記の抗原結合部位に非共有的に連結
している複合体を提供する。 【００１７】３．１つの実施形態において、本発明は、
上記ＭＨＣ成分が可溶性である複合体を提供する。 【００１８】４．１つの実施形態において、本発明は、
上記ペプチドが約８〜約１８個のアミノ酸である複合体
を提供する。 【００１９】５．１つの実施形態において、本発明は、
上記ペプチドが自己免疫障害に関連する自己抗原性ペプ
チドである複合体を提供する。 【００２０】６．１つの実施形態において、本発明は、
上記ペプチド上のエピトープが、多発性硬化症、リウマ
チ型関節炎又は重症筋無力症に関連する自己反応性Ｔ細
胞である複合体を提供する。 【００２１】７．１つの実施形態において、本発明は、
上記ペプチドが、ヒトＡｃｈＲαサブユニットのうちの
残基１３８〜１６７、ヒトＭＢＰのうちの残基８４〜１
０２、又はヒトＭＢＰのうちの残基１４８〜１６２を含
んで成る複合体を提供する。 【００２２】８．１つの実施形態において、本発明は、
上記ＭＨＣ成分がクラスＩＩ ＭＨＣである複合体を提
供する。 【００２３】９．１つの実施形態において、本発明は、
上記ＭＨＣ成分がヒトＢリンパ繊維芽細胞より単離され
たものである複合体を提供する。 【００２４】１０．本発明は、薬理学的に許容される担
体及び上記ＭＨＣ−ペプチド複合体を含んで成る薬理組
成物を提供する。 【００２５】１１．１つの実施形態において、本発明
は、上記複合体がリポソームの中に包埋されている薬理
組成物を提供する。 【００２６】１２．１つの実施形態において、本発明
は、上記複合体が炭水化物成分を実質的に有さない薬理
組成物を提供する。 【００２７】１３．１つの実施形態において、本発明
は、上記複合体の濃度が約０．０２重量％〜約１重量％
である薬理組成物を提供する。 【００２８】１４．１つの実施形態において、本発明
は、上記薬理学的に許容される担体がリン酸緩衝食塩水
である薬理組成物を提供する。 【００２９】１５．本発明は、哺乳類における標的Ｔ細
胞におけるアネルギーを誘発せしめる方法であって、哺
乳類に、抗原性ペプチドと抗原結合部位を有する単離Ｍ
ＨＣ成分とより本質的に構成され、ここでこの抗原性ペ
プチドがこの抗原結合部位に連結されている複合体を治
療的に有効な投与量で投与することを含んで成る方法を
提供する。 【００３０】１６．１つの実施形態において、本発明
は、上記ＭＨＣ成分がクラスＩＩ ＭＨＣである方法を
提供する。 【００３１】１７．１つの実施形態において、本発明
は、上記複合体が脂質膜の中に包埋されている方法を提
供する。 【００３２】１８．１つの実施形態において、本発明
は、上記標的Ｔ細胞が自己免疫障害に関連している方法
を提供する。 【００３３】１９．１つの実施形態において、本発明
は、上記自己免疫障害が多発性硬化症、リウマチ型関節
炎又は重症筋無力症である方法を提供する。 【００３４】２０．本発明は、哺乳類における自己免疫
障害を処置する方法であって、哺乳類に、薬理学的に許
容される担体、及び自己抗原性ペプチドと抗原結合部位
を有する単離ＭＨＣ成分とより本質的に構成され、ここ
でこの抗原性ペプチドがこの抗原結合部位に連結されて
いる純粋なＭＨＣ−ペプチド複合体を含んで成る薬理組
成物を治療的に有効な量で投与することを含んで成る方
法を提供する。 【００３５】２１．１つの実施形態において、本発明
は、上記薬理組成物を静脈内投与する方法を提供する。 【００３６】２２．１つの実施形態において、本発明
は、上記の有効投与量が、体重のｋｇ当り約０．０１５
μｇのＭＨＣ−ペプチド複合体〜体重のｋｇ当り約１５
μｇのＭＨＣ−ペプチド複合体である方法を提供する。 【００３７】２３．１つの実施形態において、本発明
は、上記の有効投与量が、体重のｋｇ当り約０．１５μ
ｇのＭＨＣ−ペプチド複合体〜体重のｋｇ当り約１０μ
ｇのＭＨＣ−ペプチド複合体である方法を提供する。 【００３８】２４．１つの実施形態において、本発明
は、自己免疫障害がリウマチ型関節炎又は多発性硬化症
である方法を提供する。 【００３９】２５．本発明は、抗原性ペプチドと抗原結
合部位を有する単離ＭＨＣ成分とより本質的に構成され
る複合体を製造するための方法であって：上記ＭＨＣ成
分を生産する細胞からこの成分を単離し；このＭＨＣ成
分をペプチドと接触させてこのペプチドがその抗原結合
部位と結合するようにさせ；そしてこの抗原結合部位に
結合していない過剰のペプチドを除去すること、を含ん
で成る方法を提供する。 【００４０】２６．１つの実施形態において、本発明
は、上記の過剰なペプチドを除去する段階を、限外濾過
で行う方法を提供する。 【００４１】２７．１つの実施形態において、本発明
は、上記の複合体を脂質の存在下で透析してリポソーム
を形成する段階を更に含んで成る方法を提供する。 【００４２】２８．１つの実施形態において、本発明
は、上記のペプチドが上記の抗原結合部位に非共有結合
している方法を提供する。 【００４３】２９．１つの実施形態において、本発明
は、上記のＭＨＣ成分が主要組織適合性複合体のクラス
ＩＩ糖タンパク質である方法を提供する。 【００４４】３０．１つの実施形態において、本発明
は、上記ペプチドがＭＢＰのうちのアミノ酸１〜１４を
含んで成る方法を提供する。 【００４５】 【発明の実施の形態】本発明はＴ細胞機能を調節するの
に利用できる複合体を提供する。例えば、該複合体は有
害なＴ細胞仲介型免疫応答、例えばアレルギー応答、同
種異系移植片拒絶及び自己免疫障害を阻止するのに利用
できる。更に、本発明の複合体は免疫応答を助長するた
めに利用でき、従ってワクチンとして利用できる。この
態様において、ＭＨＣ成分（クラスＩ又はクラスＩＩの
両方）は、典型的には共刺激性シグナルに関与するリガ
ンドを抱える競合抗原表示細胞への連結が可能となるよ
うに改質される。他方、この複合体をＴ細胞増殖を誘発
する単離化共刺激性リガンドに連結させてよい。従っ
て、Ｔ細胞はこの複合体により表示される抗原性ペプチ
ドに応答し、そして免疫応答が触発されるであろう。 【００４６】本発明の複合体は少なくとも２種の成分を
含む：自己抗原を表示するペプチド又は免疫系に関連の
影響を及ぼす効果を有するその他の抗原性配列、及び抗
原表示に関与するＭＨＣコード化糖タンパク質の有効領
域。ＭＨＣ糖タンパク質の有効領域は、抗原結合性部位
及び適当なＴ細胞レセプターによりこのＭＨＣペプチド
複合体が認識されるために必要な配列を含んで成る。こ
のＭＨＣ成分はクラスＩ又はクラスＩＩ分子のいづれで
もよい。ペプチド抗原とＭＨＣタンパク質の抗原結合部
位との連結は共有又は非共有結合でよい。 【００４７】他の態様において、該複合体は一般に毒素
又はラベルであるエフェクター成分を含んでよい。この
エフェクター領域はＭＨＣコード化糖タンパク質又は自
己抗原性ペプチドのいづれかにコンジュゲートされてい
てよい。エフェクター成分を含む複合体は同時係属出願
Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／３６７，７５１号（１９８９年
７月２１日出願、前掲）に開示され、請求の範囲となっ
ている。 【００４８】この系の成分それぞれは下記にそれぞれ説
明する；それに、これらの複合を製造する、評価する及
び利用する方法の説明が続く。 【００４９】ＭＨＣ誘導化成分ＭＨＣによりコードされ
る糖タンパク質はヒト及びネズミの系の両方でかなり研
究されている。一般にそれらは、全ての細胞の表層上で
見い出され、且つ、主として細胞毒性Ｔ細胞により認識
されるクラスＩ糖タンパク質；及びマクロファージのよ
うなアクセサリー細胞を含むいくつかの細胞の表層上に
見い出され、且つ、ヘルパーＴ細胞への抗原の表示に関
与するクラスＩＩとして分類されている。組織適合性タ
ンパク質のうちのいくつかは単離、且つ、特性化されて
いる。ＭＨＣ糖タンパク質の構造及び機能の一般的な報
告については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ，第２版，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編，Ｒａｖｅｎｓ
Ｐｒｅｓｓ Ｎ．Ｙ．１９８９を参照のこと（これは引
用して本明細書に組入れる）。本明細書で用いる「単離
ＭＨＣ成分」とは、ＭＨＣ糖タンパク質、又はＭＨＣ糖
タンパク質の有効領域（即ち、抗原結合性部位、又は適
当なＴ細胞レセプターにより認識されるために必要な部
位及び配列を含んで成るもの）を意味し、これはその天
然状態以外の状態、例えばＭＨＣを通常発現する細胞の
細胞膜と結合していない状態にある。下記に詳細する通
り、該ＭＨＣ成分は組換的に生産でき、適当な細胞起源
から可溶化されるか、又はリポソームと結合していてよ
い。ヒトＭＨＣ分子のためには、ヒトリンパ芽球症細胞
が特に好ましい。 【００５０】ネズミＩ−Ａ（クラスＩＩ）組織適合性タ
ンパク質を精製するための方法はＴｕｒｋｅｗｉｔｚ
Ａ．Ｐ．らＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
（１９８３）２０：１１３９−１１４７（引用すること
で本明細書に組入れる）に開示されている。クラスＩ分
子にとっても適切であるこれらの方法は、非イオン性清
浄剤、例えばＮＰ−４０、ツイーン８０等を用いての、
所望のＭＨＣ分子を含む細胞からの可溶性膜抽出物の調
製を包含する。次にＭＨＣ分子を、所望のＭＨＣ分子に
対して発生せしめた抗体を含むカラムを用いるアフィニ
ティークロマトグラフィーにより精製する。溶離バッフ
ァーの中に０．０２％のツイーン８０を利用することは
精製分子の凝集を排除するのに役立つ。 【００５１】Ｉ−Ａ及びＩ−Ｅサブ領域によりコードさ
れる単離抗原は２つの非共有結合ペプチド鎖、即ち、３
２〜３８ｋｄのアルファー鎖と２６〜２９ｋＤのべータ
ー鎖より成ることが示されている。第３の不変の３１ｋ
ｄのペプチドがこの２つのペプチドに非共有的に結合し
ているが、しかしそれは多形態ではなく，そして細胞表
層上の抗原の成分であることが認められていない（Ｓｅ
ｋａｌｙ，Ｒ．Ｐ．のＪ．Ｅｙｐ．Ｍｅｄ．（１９８
６）１６４：１４９０−１５０４〔引用することで本明
細書に組入れる〕）。Ｉ−Ａ領域の７つの対立遺伝子変
種のアルファー及びベーター鎖がクローンされ、且つ、
配列化されている（Ｅｓｔｅｅｎ，「Ｔｃｅｌｌ Ｃｌ
ｏｎｅｓ」３−１９）。 【００５２】ヒトクラスＩタンパク質も研究されてい
る。染色体６上のヒトのＭＨＣ（ＨＬＡ）は３つの遺伝
子座、ＨＬＡ−，ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃを有し、そ
の最初の２つは同種異系抗原をコードする大量の対立遺
伝子を有する。これらは４４ｋｄのサブユニット及び１
２ｋｄのべーター２−マイクログロブリンサブユニット
より成ることが見い出され、これは全ての抗原特異性に
共通している。これらの清浄剤可溶性ＨＬＡ抗原の単離
は、全て引用することで本明細書に組入れる、Ｓｐｒｉ
ｎｇｅｒ，Ｔ．Ａ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７６）７３：２４８１−２４８
５；Ｃｌｅｍｅｎｔｓｏｎ，Ｋ．Ｊ．ら「Ｍｅｍｂｒａ
ｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ａｚｚｉ，Ａ．編；Ｂｊｏｒ
ｋｍａｎ，Ｐ．，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ Ｈａｒｖａ
ｒｄ（１９８４）に記載されている。 【００５３】更なる研究が、クラスＩヒト抗原であるＨ
ＬＡ−Ａ２の３次元構造の詳細絵図によりもたらされて
いる（Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ（１
９８７）３２９：５０６−５１２，５１２−５１８；こ
れは引用することで本明細書に組入れる）。この絵図に
おいて、β２−マイクログロブリンと重鎖のアルファー
３セグメントが結合している；重鎖のアルファー１及び
アルファー２領域はペプチドが結合する抗原結合性部位
を形成しているものと認められる（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１
９８７）２３８：６１３−６１４；引用することで本明
細書に組入れる；Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．ＪらＮａｔｕ
ｒｅ（前掲））。可溶性ＨＬＡ−Ａ２は、引用すること
で全てを本明細書に組入れるＴｕｒｎｅｒ，Ｍ．Ｊ．ら
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｎ．（１９７７）２５２：７５５
５−７５６７に記載の通り、ホモ接合ヒトリンパ芽球症
細胞系Ｊ−Ｙからの原形質膜のパパイン消化の後に精製
できる。パパインはトランスメンブラン領域付近の４４
ｋｄの鎖を切断して、アルファー１、アルファー２、ア
ルファー３及びβ２マイクログロブリンを含んで成る分
子をもたらす。クラスＩＨＬＡ−Ａ２抗原の推定三次元
構造の代表を図２に示す。 【００５４】クラスＩＩＭＨＣ抗原の三次元構造は詳し
く知られていないが、クラスＩＩ糖タンパク質はクラス
ＩＩと似たように、抗原結合性部位を含むドメイン構造
を有すると考えられている。これは膜二重層から伸び
た、２本のクラスＩＩ鎖のＮ−末端ドメイン領域より成
る。一方の鎖のＮ−末端領域は、ＭＨＣクラスＩ抗原の
アルファー１及びアルファー２の領域と相同性の２つの
ドメインを有する。クラスＩＩ遺伝子のクローニング
（Ｅｓｔｅｅｓ前掲に記載）は、下記に記載のようなク
ラスＩＩＭＨＣ結合性ドメインの取扱いを可能とする。 【００５５】本発明の複合体のＭＨＣ糖タンパク質領域
は、リンパ球からの単離により獲得でき、そして所望の
ペプチド抗原に結合する能力についてスクリーンされう
る。これらのリンパ球は該複合体で処置すべき個体の種
に由来する。例えば、それらは標的自己免疫障害に苦し
む個体に由来するヒトＢ細胞から単離でき、当業界に知
られる技法を利用して、複製欠陥エプステイン−バ−ウ
ィルスによる形質転換によって不死化せしめる。 【００５６】ＭＨＣ糖タンパク質は、パパインによる処
理、３ＭのＫＣｌによる処理及び清浄剤による処理での
可溶化を含む様々な技法を用いて多数の細胞から単離さ
れる。好ましい方法においては、リンパ球からのクラス
ＩＩタンパク質の清浄剤抽出、それに続くアフィニティ
ー精製が利用される。次に清浄剤は透析により、又は選
択結合性ビーズ、例えばＢｉｏ Ｂｅａｄｓによって除
去できる。 【００５７】他方、多数のクラスＩＩタンパク質のそれ
ぞれのアミノ酸配列が知られ、そしてその遺伝子がクロ
ーンされており、従って組換法によってタンパク質を作
ることができる。第１世代合成ＭＨＣタンパク質におい
て、重（アルファー）及び軽（ベーター）鎖は、疎水性
ドメインの欠落を及ぼすカルボキシ末端切除を利用して
合成され、そしてこのカルボキシ末端は毒素又はラベル
のコンジュゲーションを助長するために任意的に選択で
きる。例えば、図３に示すＭＨＣタンパク質において
は、リジン残基が導入されている。更に、この鎖のジス
ルフィド結合を形成せしめる手段を担うためにカルボキ
シ末端付近にシステイン残基が含まされている。この合
成遺伝子は発現ベクターの中への挿入及び類似体をコー
ドするための遺伝子配列の操作に役立つ制限部位を含ま
せることもできる。次にこのアルファー及びベーター鎖
を発現ベクターの中に挿入し、適当な宿主例えばＥ．コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はその他の適切な細胞の中で個別
に発現させ、次いで獲得できた組換タンパク質をペプチ
ド抗原の存在下で組換える。 【００５８】遺伝子の多様性は配列の容易な操作を可能
とするため、好ましい構築体の第２世代は図４に示すよ
うにハイブリドなクラスＩとクラスＩＩの特徴を含み、
ここでクラスＩＩＭＨＣのアルファー１とベーター１の
ドメインは柔軟性領域を通じて連結され、これはこれら
のドメイン間での分子内二量化を可能とし、端から端に
わたるベーターシート接触をもたらしめる。次にこのベ
ーター１セグメントをクラスＩのアルファー２ドメイン
と融合させ、ここでこの複合体を安定化せしめるために
べーター２マイクログロブリンは共発現される。クラス
Ｉ遺伝子のトランスメンブラン及び細胞内ドメインも誘
発させることができるが、しかしながら該複合体を輸送
するためにリポソームを利用しない限り、それを行う意
味はないであろう。より簡単なバージョンはアルファー
１及びベーター１ドメインと、毒素コンジュゲーション
のためのＣ末端リシンとを有する（図４）。 【００５９】適当なＤＮＡ配列からの発現ベクターの構
築及び組換体の製造は本質的に当業界に知られる方法に
よって実施される。発現は原核系又は真核系の中で行う
ことができる。原核系はたいていＥ．コリの様々な株で
代表される。しかしながら、その他の微生物株、例えば
バチルス属（ｂａｃｉｌｌｉ）、例えばバチルス スブ
チリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｉｔｉｌｓ）、シュ
ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｓａｓ）の様々な種、又
はその他の細菌株を利用することもできる。かかる原核
系において、宿主と適合する種に由来する複製起点及び
コントロール配列を含むプラスミドが利用される。例え
ば、Ｅ．コリは一般に、Ｅ．コリの種に由来するプラス
ミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換され
る（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ（１９７７）２：９
５）。一般に利用され、本明細書で規定する原核コント
ロール配列には、転写開始のためのプロモーター、任意
的にオペレーターを、リボソーム結合部位配列と一緒に
含み、それには、一般に用いられているプロモーター、
例えばベーターラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラ
クトース（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇｅら、
Ｎａｔｕｔｅ（１９７７）１９８：１０５６）及びトリ
プトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ
ら、Ｎａｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８
０）８：４０５７）、並びにラムダー誘導Ｐｒプロモー
ター及びＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔ
ａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）
が含まれる。上記又は下記の全ての文献は引用すること
で本明細書に組入れる。 【００６０】真核系宿主において有用な発現系は適当な
原核系遺伝子に由来するプロモーターを含んで成る。例
えば酵母において有用なプロモーターのクラスには、３
−ホスホグリセラートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：２０７
３）についてのプロモーターを含む、解糖酵素の合成の
ためのプロモーターが含まれる。その他のプロモーター
には、エノラーゼ遺伝子（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｍ．Ｊ．
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，（１９８１）２５６：１
３８５）又はＹＥｐ１３から獲得したＬｅｕ２遺伝子
（Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．らＧｅｎｅ（１９７８）８：１２
１）に由来するものが挙げられる。 【００６１】適切な哺乳類系プロモーターにはＳＶ４０
由来の初期及び後期プロモーター（Ｅｉｅｒｓら、Ｎａ
ｔｕｒｅ（１９７８）２７３：１１３）、又はポリオー
マ、アデノウィルスＩＩ、ウシパピロマウィルスもしく
は鳥類サルコマウィルスに由来するようなその他のウィ
ルス性プロモーターが含まれる。適当なウィルス及び哺
乳類系エンハンサーは上記に記載されている。 【００６２】発現系は、当業界によく知られている標準
のリゲーション及び制限技法を採用する標準方法によ
り、ＭＨＣ配列に作動連結すべき上記のコントロール因
子から構築される。単離したプラスミド、ＤＮＡ配列又
は合成オリゴヌクレオチドを切断し、仕立て、そして所
望の形態に再リゲートさせる。 【００６３】部位特異的ＤＮＡ切断は、適当な制限酵素
で、当業界によく知られ、且つ、これらの市販の制限酵
素の製造業者により特定された条件のもとで処理するこ
とにより実施される。別えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓの製品カタログを参照のこと。一般に
は、約１μｇのプラスミド又はＤＮＡ配列を約２０μｌ
のバッファー溶液の中で一単位の酵素で切断せしめる；
本明細書の実施例においては、典型的には、ＤＮＡ基質
の完全な消化を確実とするために過剰の制限酵素を用い
ている。約３７℃で約１ｈｒ〜２ｈｒのインキュベーシ
ョン時間が有用であるが、その変更は寛容される。各イ
ンキュベーションの後、タンパク質をフェノール／クロ
ロホルム抽出によって除去し、次いでエーテル抽出を続
けてよく、そして核酸は水性画分から、エタノールによ
る沈殿、それに続いてセファデックスＧ−５０スピンカ
ラムに付することによって回収できる。所望するなら
ば、切断フラグメントのサイズ分離を標準の技術を用い
てポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲル電気泳動
により実施してよい。サイズ分離の一般的な詳細はＭｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｄｏｇｙ（１９８０）６
５：４９９−５６０に見い出せる。 【００６４】制限切断フラグメントは、Ｅ．コリＤＮＡ
ポリメラーゼＩの大きなフラグメント（クレノウ）によ
り、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）
の存在下において、約１５〜２５分のインキュベーショ
ン時間を利用し、２０〜２５℃で、５０ｍＭのトリスｐ
Ｈ７．６，５０ｍＭのＮａＣｌ，６ｍＭのＭｇＣｌ２，
６ｍＭのＤＴＴ及び５〜１０μＭのｄＮＴＰの中で処理
することによってブラント末端化してよい、このクレノ
ウフラグメントは５’接着末端を補完するが、しかしな
がら突出し３’一本鎖を、たとえ４種のｄＮＴＰが存在
していたとしても傷つけてしまう。所望するなら、接着
末端の性質により示される制限内で、１種のみの、又は
特定のｄＮＴＰを供給することによって選択修復を行っ
てよい。クレノウによる処理の後、その混合物をフェノ
ール／クロロホルム及びエタノールで抽出し、続いてセ
ファデックスＧ−５０スピンカラムに付する。 【００６５】合成オリゴヌクレオチドは市販の自動オリ
ゴヌクレオチド合成装置を用いて調製される。アニーリ
ング前又はラベリングのための一本鎖のリン酸化は、過
剰の、例えば約１０単位のポリヌクレオチドキナーゼを
０．１ｎｍｄｅの基質に対して、５０ｍＭのトリス、ｐ
Ｈ７．６，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，５ｍＭのジチオスレ
イトール、１〜２ｍＭのＡＴＰ，１．７ｐｍｏｌｅの
３２Ｐ−ＡＴＰ（２．９ｍＣｉ／ｍｍｏｌｅ），０．１
ｍＭのスペルジミン、０．１ｍＭのＥＤＴＡの存在下で
用いることによって達せられる。 【００６６】リゲーションは１５〜３０μｌの容量の中
で、下記の標準条件及び温度のもとで行った：２０ｍＭ
のトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭのＭｇＣ
ｌ２，１０ｍＭのＤＴＴ，３３μｇ／ｍｌのＢＳＡ，１
０ｍＭ〜５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０℃で４０μＭのＡ
ＴＰ，０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（「接着末端」リゲーションのため）又は
１４℃で１ｍＭのＡＴＰ，０．３〜０．６（Ｗｅｉｓ
ｓ）単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（「ブラント末端」リゲ
ーションのため）。分子内「接着末端」リゲーションは
通常３３〜１００μｇ／ｍｌの総ＤＮＡ濃度（５〜１０
０μＭの最終濃度）で行った。分子内「ブラント末端」
リゲーション（通常、１０〜３０倍の過剰量のリンカー
を利用する）は１μＭの総最終濃度で行う。 【００６７】「ベクターフラグメント」を利用するベク
ターの構築において、ベクターフラグメントは通常５’
リン酸を除くため及びベクターの再リゲーションを防ぐ
ために細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理
する。ＢＡＰ消化はｐＨ８にて約１５０ｍＭのトリスの
中で、Ｎａ＋及びＭｇ２＋の存在下において、ベクター
のμｇ当り約１単位のＢＡＰを用いて、６０℃で約１ｈ
ｒ行う。核酸フラグメントを回収するため、その調製品
をフェノール／クロロホルム及びエタノール沈殿で抽出
し、そしてセファデックＧ−５０スピンカラムヘの適用
によって脱塩する。他方、再リゲーションは、不要のフ
ラグメントの追加の制限酵素消化により二重消化せしめ
たベクターにおいては防がれうる。 【００６８】配列改質を必要とするｃＤＮＡ又はゲノム
ＤＮＡ由来のベクターの領域に関して、部位特異的プラ
イマー誘発化突然変異誘発が利用できる。これは所望の
突然変異を提供する、一定の誤対合を除いて突然変異す
べき一本鎖ファージＤＮＡに相補性であるプライマー合
成オリゴヌクレオチドを用いることによって行われる。
簡単に述べると、ファージに相補性な鎖の合成を誘導す
るプライマーとして合成オリゴヌクレオチドを用い、そ
して得られる二本鎖ＤＮＡをファージ保持宿主細菌へと
形質転換させる。形質転換細菌の培養物をトップアガー
においてプレートして、ファージが抱える単一細胞から
プラークを形成させる。 【００６９】理論的には、新しいプラークの５０％が、
一本鎖として突然変異形態を有するファージを含み；５
０％はもとの配列を有するであろう。得られるプラーク
をリン酸化合成プライマーと、ある温度であって正しい
対合を可能とするが、ただしもとの鎖との誤対合はハイ
ブリダイゼーションを妨げるのに十分であるような温度
でハイブリダイズさせる。次にプーブとハイブリダイズ
するプラークを拾い、培養し、次いでＤＮＡを回収す
る。 【００７０】しかしながら、本発明のタンパク質におい
て、合成遺伝子を好適に利用できる。遺伝子のデザイン
は制限部位を含んでよく、これはコード配列領域を、類
似体をコードするこれらで置き換える遺伝子の容易な操
作を可能とする。 【００７１】プラスミドの構築のための正しいリゲーシ
ョンは、Ｅ．コリＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋ Ｃｅｎｔ
ｅｒ，ＣＧＳＣ ＃６１３５より獲得できるＥ．コリ株
ＭＭ２９４又はその他の適当な宿主をこのリゲーション
混合物でまず形質転換することによって確認できる。有
効な形質転換体は、アンピシリン、テトラサイクリンも
しくはその他の抗生物質耐性により、又は当業界に知ら
れるプラスミド構築の手法に応じたその他のマーカーを
用いて選ばれうる。この形質転換体に由来するプラスミ
ドを次にＣｌｅｗｅｌｌ，Ｄ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６９）６２：１
１５９、の方法、任意的にクロラムフェニコール増幅
（Ｃｌｅｗｅｌｌ，Ｄ．Ｂ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
（１９７２）１１０：６６７）を続けて用意する。この
単離ＤＮＡを制限により分析するか、及び／又はＳａｎ
ｇｅｒ，Ｆ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（１９７７）７４：５４６３、更にはＭｅｓ
ｓｉｎｇらＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９
８１）９：３０９のジデオキシ法、又はＭａｘａｍらＭ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｄｏｇｙ（１９８０）
６５：４９９の方法により配列化する。 【００７２】構築したベクターを次にタンパク質の製造
のために適当な宿主の中に導入する。用いる宿主細胞に
応じて、形質転換はかかる細胞に適する標準技術を用い
て行う。Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７２）６９：２１１０
に記載の塩化カルシウムを用いるカルシウム処理、又は
ＭａｎｉａｔｉｓらＭｏｌｅｃａｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８
２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓ
ｓ，頁２５４に記載のＲｂＣｌ法が、原核系又は実質的
な細胞壁バリヤーを含むその他の細胞にとって利用され
る。かかる細胞壁を有さない哺乳動物細胞にとっては、
Ｇｒａｈａｍとｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ．のＶｉｒｏｌｏ
ｇｙ（１９７８）５２：５４６のリン酸カルシウム沈殿
法又はエレクトロポレーションが好ましい。酵母への形
質転換はＶａｎ Ｓｏｌｉｎｇｎｅｎ，Ｐ．らＪ．Ｂａ
ｃｔｅｒ．（１９７７）１３０：９４６及びＨｓｉａ
ｏ，Ｃ．Ｌ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３８２９の方法に従って
実施する。 【００７３】次にこの形質転換細胞を、ＭＨＣ配列の発
現にとって好ましい条件で培養し、次いで組換生産タン
パク質をこの培養物から回収する。 【００７４】抗原性ペプチド 数多くの自己免疫障害に関する自己抗原性タンパク質又
は組織が知られている。例えば、実験的誘発型自己免疫
障害において、病理に関与する抗原が特性化されてい
る：ラット及びマウスの関節炎において、天然のＩＩ型
コラーゲンがコラーゲン誘発型関節炎において同定さ
れ、そしてミコバクテリア−ヒートショックタンパク質
がアジュバント関節炎において同定されている（Ｓｔｕ
ａｒｔら（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．２：１９９−２１８；ｖａｎ Ｅｄｅｎら（１９８
８）Ｎａｔｕｒｅ ３３１：１７１−１７３。）；チロ
グロブリンがマウスにおける実験的アレルギー性甲状腺
炎（ＥＡＴ）において同定されている（Ｍａｒｏｎら
（１９８８），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：１１１５
−１１２０）；実験的アレルギー性重症筋無力症（ＥＡ
ＭＧ）においてはアセチルコリンレセプター（ＡＣｈ
Ｒ）（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍら（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．４２：２３３−２８４）；そしてマウス及
びラットにおける実験的アレルギー性起脳炎（ＥＡＥ）
においてはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）（Ａｃ
ｈａ−Ｏｒｂｅａら、前掲を参照のこと）。更に、例え
ば標的抗原がヒトにおいて同定されている：ヒトリウマ
チ型関節炎におけるＩＩ型コラーゲン（Ｈｏｌｏｓｈｉ
ｔｚら（１９８６）Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ：３０５−３０
９）；及び重症筋無力症におけるアセチルコリンレセプ
ター（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍら（１９８８）前掲）。上記
の全ての文献は引用することで本明細書に組入れる。 【００７５】抗原表示細胞（ＡＰＣｓ）の表層上のＭＨ
Ｃ糖タンパク質による抗原の表示は、抗原性タンパク質
の小さなペプチド単位への加水分解に続いて起こると信
じられている。抗原性タンパク質におけるこれら小さめ
のセグメントの位置は実験的に決定できる。これらのセ
グメントは長さにおいて１８残基数であり、そしてアグ
レトープ（ＭＨＣ分子により認識）及びエピトープ（Ｔ
ヘルパー細胞上のＴ細胞レセプターにより認識）の両方
を含むと考えられている。このエピトープ自体は５〜６
個のアミノ酸の連続又は非連続配列であり、これはＴヘ
ルパー細胞の抗原特異的レセプターを認識する。アグレ
トープは、ペプチドとＭＨＣ糖タンパク質との結合にと
って重要な連続又は非連続配列である。 【００７６】関連の８〜１８個のアミノ酸のサブユニッ
トの決定の実験プロセスは、骨格筋のアセチルコリンレ
セプターのアルファーサブユニットを利用して例示して
いる。重症筋無力症（ＭＧ）において、自己免疫応答は
このサブユニットの領域に向けられている。神経筋接合
部のシナプス後部膜上でのアセチルコリンレセプターの
欠失はＭＧ症状の原因となる。 【００７７】ＭＧにおいて、アセチルコリンレセプター
（ＡＣｈＲ）のアルファーサブユニットに対する自己抗
体は、ＡＣｈＲに向けられた自己免疫応答に関連する。
ＭＧ患者のうちの８５％がアルファーサブユニットに反
応性な自己抗体を有する。これらのうち、６０％が残基
６０及び８０の間に位置している主免疫原領域（ＭＩ
Ｒ）と呼ばれるアルファーサブユニットのペプチドセグ
メントに結合する抗体を有する（ＴｚａｒｔｏｓとＬｉ
ｎｄｓｔｒｏｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７：７５５）。自己反応性ヒ
トＴ細胞により認識されるペプチドセグメントはアルフ
ァーサブユニット上にも位置している（Ｈｏｈｆｉｅｌ
ｄらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
（１９８７））。これらのＴ細胞により認識されるエピ
トープは残基１−３０，１２５−１４７，１６９−１８
１，２５７−２７１及び３５１−３６８にある。更に、
ヒトにおいてＡＣｈＲぺプチド１９５−２１２及び２５
７−２６９が、ＨＬＡ−ＤＲ５及びＨＬＡ−ＤＲ３のＤ
Ｑｗ２ ＭＨＣハプロタイプの重症筋無力症患者のそれ
ぞれにおけるエプトープとして一部特性化されている
（Ａｃｈａ−Ｏｒｂｅａ（１９８９）前掲を参照のこ
と）。 【００７８】このレセプターのアルファーサブユニット
に関連するエピトープの表示が可能である、アグレトー
プを抱えるペプチドは容易に決定される。例えば、マウ
スのモデルにおける適切なペプチドの決定は以下の通り
に実施される。 【００７９】トルペドカリホルニカス（Ｔｏｒｐｅｄｏ
ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ）ＡＣｈＲで免疫したとき
にヒト重症筋無力症の数多くの特徴を有する障害を発症
するマウスの株をモデルとして用いた。ＭＨＣクラスＩ
Ｉ糖タンパク質をレクチン及びモノクローナル抗体アフ
ィニティー支持体を用いてこの株のマウスの脾臓細胞が
単離した。この精製ＭＨＣクラスＩＩタンパク質を清浄
剤透析によってリン脂質小胞の中に含ませた。得られる
小胞を次に清浄なガラスカバースリップに融合させて、
図５に示すようなそれぞれの上にＭＨＣ分子を含む平ら
な脂質二重層を作った（Ｂｒｉａｎ ａｎｄ ＭｃＣｏ
ｎｎｅｌｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ（１９８４）８１：６１５９、これは引用するこ
とで本明細書に組入れる）。 【００８０】付着平面脂質膜の中に包埋されたＭＨＣク
ラスＩＩ分子を含む一枚のカバースリップを数枚の２４
穴培養プレートの各ウエルの中に入れた。アルファーサ
ブユニット配列に相当し、且つ、１又は複数の放射性ラ
ベル化アミノ酸残基（下記の通りに調製）を含む約４０
種の重複２０残基合成ペプチドのそれぞれをカバースリ
ップ及びＰＢＳと一緒にウェルの中に入れ、そして数日
インキュベートした。ＭＨＣクラスＩＩ糖タンパク質抗
原結合部位におけるペプチドの結合の程度は、カバース
リップ上のＭＨＣクラスＩＩ−平面脂質膜、対、平面脂
質膜のみ、の中に一体化された放射活性の値により決定
した。放射活性の特異的な一体化は、結合ペプチドが、
平面脂質膜の中に存在している複数の種のＭＨＣクラス
ＩＩ分子のうちの一つのアグレトープ（ＭＨＣクラスＩ
Ｉペプチド結合部位）を含むことを示唆する。これによ
り、ＡＣｈＲのアルファーサブユニットのための一連の
アグレトープを、ＡＣｈＲ又は精製アルファーサブユニ
ットによる免疫に基づいてＭＧ症状を示すマウス株につ
いて規定する。 【００８１】次に、アグレトープを含む各アルファーサ
ブユニット合成ペプチドセグメントを再びカバースリッ
プ上の平面脂質膜に包埋されている単離ＭＨＣクラスＩ
Ｉタンパク質の抗原結合部位の中に含ませる。一枚のカ
バースリップを２４穴培養プレートの各ウェルに加え、
次いでこの各ウェルにＡＣｈＲに対して免疫されたマウ
ス（及び付着性ＭＨＣクラスＩＩタンパク質が単離され
た株）に由来する脾臓細胞を加えた。ＤＮＡへのトリチ
ウム化チミジンの取込みにより決定されるＴ細胞ハイブ
リドーマ増殖は、Ｔ細胞への結合のためのアグレトープ
及びエピトープの両者をＭＨＣクラスＩＩタンパク質結
合ペプチドが含むことを示唆する。Ｔ細胞クローンの活
性化はＩＬ−３生産を測定することによって決定される
（Ｑｕｉｌｌら、前掲を参照のこと）。 【００８２】ペドカリホルニカスＡＣｈＲのアルファー
サブユニット由来の重複（１０残基が重複）２０残基ペ
プチドのセットの構成員を合成するよう、迅速多重ペプ
チド合成（ＲＡＭＰＳ）のためのＤｕｐｏｎの装置及び
技術を利用した。このペプチドの配列は知られ、そして
図６に示す。１又は複数の放射活性アミノ酸が各合成ペ
プチドの中に一体化されている。ペプチドを合成するた
めに側鎖保護型ＦＭＯＣアミノ酸のペンタフルオロフェ
ニル活性エステルを利用し、標準の逐次固相ペプチド合
成法、それに続く標準の側鎖脱保護及び固相支持体から
のペプチドの同時遊離を利用した。 【００８３】他方、抗原性タンパク質、例えばアセチル
コリンレセプタータンパク質の８〜１８個のアミノ酸の
推定セグメントを含む重複配列が、Ｇｅｙｓｅｎ Ｈ．
Ｍ．らＪ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．（１９８７）１０
２：２７４（引用することで本明細書に組入れる）の方
法で合成できる。合成した放射性ラベル化ペプチドを、
それぞれ（プレート上で）、前記の通り脂質膜の中へと
配合せしめた精製ＭＨＣタンパク質とインキュベートす
ることにより試験した。 【００８４】中枢神経系におけるミエリン鞘の破壊をも
たらす多発性硬化症（ＭＳ）においては、ミエリンの主
要タンパク質成分が主な自己抗原である。ＭＢＰタンパ
ク質の適切なセグメントは、ウシミエリン塩基性タンパ
ク質で免疫したときに実験的アレルギー性起脳炎（ＥＡ
Ｇ）を発症するマウスの株を用いて実験的に決定するこ
ともでき、ＭＢＰの配列は図７に示す。 【００８５】全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は複雑
な症候であるが、しかしこれは赤血球に対する自己免疫
応答に由来する。この障害の抗原性エフェクターである
ペプチドは赤血球の表層上のタンパク質の中に認められ
る。 【００８６】リウマチ型関節炎（ＲＡ）は、滑液の中で
見い出せるタンパク質に対する免疫応答に由来する慢性
炎症障害である。 【００８７】インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）
は、インスリンの分泌にとって重要なランゲルハンス島
内のべーター細胞の自己免疫攻撃に由来する。島細胞表
層抗原及びインスリンに対する循環抗体はＩＤＤＭに先
行することが知られている。ＩＤＤＭにおける免疫応答
を排除するうえで重要なペプチドはインスリン配列及び
ベーター細胞膜表層タンパク質の一部であると信じられ
ている。 【００８８】関連の抗原性ペプチドサブユニットはそれ
らが比較的短いため、ペプチド合成にとっての標準の自
動化方法を用いて容易に合成できる。他方、それらは単
離又は合成ＤＮＡを用いて組換的に作製されうるが、こ
れはこの長さのペプチドにとっての最も効率的な手法で
はない。 【００８９】従って、まとめると、一連のラベル化試験
ペプチドを用意し、そしてＭＨＣタンパク質を含む平面
脂質膜の中のＭＨＣと結合するものがアグレトープを含
んでいることが示される。 【００９０】同定したペプチドを次に常用の固相合成で
調製し、そして障害誘発性ヘルパーＴ細胞クローンにつ
いてのエピトープを含むサブセットを、ネズミ抗原表示
細胞（ＡＰＣ）を有する（又は単離ＭＨＣ複合体を有す
る）候補のペプチドと、全長タンパク質で免疫したマウ
スに由来する脾臓又はリンパ腺のＴ細胞とのインキュベ
ーションによって決定した。有用な候補はこの系におい
てＴ細胞の増殖を刺激するであろう。この第２の小さな
サブセットは適当なペプチド成分を代表する。 【００９１】複合体の形成 該複合体の因子は当業界に知られる標準の手段により連
結させることができる。この抗原性ペプチドは、ＭＨＣ
タンパク質のポケット領域に、例えばこの二成分を混合
することによって非共有的に連結させることができる。
過剰のペプチドは数多くの標準的な手順のいづれか、例
えば限外濾過又は透析によって除去できる。このペプチ
ドは標準の手順を用いて、例えば光アフィニティーラベ
ル化によって共有結合させることができる（例えばＨａ
ｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４：５７０２−
５７１１（１９８５）を参照のこと、これは引用するこ
とで本明細書に組入れる）。 【００９２】例えば、ＡＣｈＲペプチド１９５−２１５
（これはヒト及びマウスにおけるＭＧのエピトープとし
て特性化されている）は、ＭＧに関連するＭＨＣ抗原に
由来のポリペプチドのＮ末端抗原結合部位に連結させる
ことができる。一文字アミノ酸コードにおけるＡＣｈｒ
ペプチドのアミノ酸配列はＤＴＰＹＬＤＩＴＹＨＦＩＭ
ＱＲＩＰＬＹＦＶである。該ペプチドをコードするオリ
ゴヌクレオチドはアミノ酸にとっての既知のコドンを利
用して合成され、好ましくは発現のために利用する生物
において好ましく利用されるコドンをオリゴヌクレオチ
ドのデザインにおいて利用する。例えばもしＥ．コリで
発現させるなら、ＡＣｈＲ１９５−２１５をコードする
適切なオリゴヌクレオチドは ５’ＧＡＣ ＡＣＣ ＣＣＧ ＴＡＣ ＣＴＧ ＧＡＣ
ＡＴＣ ＡＣＣ ＴＡＣ ＣＡＣ ＴＴＣ ＡＴＣ
ＡＴＧ ＣＡＧ ＣＧＴ ＡＴＣ ＣＣＧ ＣＴＧ Ｔ
ＡＣ ＴＴＣ ＣＴＧ ３’ でありうる。 【００９３】次にこの配列を当業界に知られる技法を利
用してＭＨＣ抗原に由来するペプチドをコードする配列
に一体化せしめる。この一体化部位は、この分子が発現
されて折りたたまれたとき、このＡＣｈＲペプチド抗原
が標的Ｔ細胞にとってのエピトープとして有用となるで
あろうようになる。 【００９４】あるプロトコールにおいて、ＡＣｈＲ１９
５−２１５ペプチドを適当なＭＨＣ分子のＮ−末端に連
結させる。もし組換複合体をマウスにおいて用いるな
ら、例えば、このＡＣｈＲペプチドをＩ−Ａｂ−アルフ
ァー又はＩ−Ａｂ−ベーター鎖のいづれかをコードする
配列の中に一体化せしめてよい。これらの鎖をコードす
る配列は知られており、そして図８（アルファー鎖）及
び図９（ベーター鎖）に示し；更に、この鎖の制限酵素
部位及び有意義なドメインをこの図に示す。もしＡＣｈ
Ｒペプチドをベーター鎖の中に一体化させるなら、例え
ばオリゴヌクレオチドをリーダーペプチドの代替物とし
て挿入してよい。ポリオリゴヌクレオチド内で配列を置
き換える方法は当業界に知られ、その例はプラスミドの
構築の章に説明してある。 【００９５】ＡＣｈＲペプチドの、適当なヒトＨＬＡ抗
原に由来するペプチドをコードする配列への一体化のた
めに類似のプロトコールが利用できる。例えば、ヒトに
おいて、ハプロタイプＤＲ２Ｗ２がＭＧに関与する。そ
れ故、ＡＣｈＲペプチドを例えばＤＲ２対立遺伝子のベ
ーター鎖をコードする配列の中に一体化させることがで
きる。数多くのＤＲハプロタイプに由来するＨＬＡ−Ｄ
Ｒ−ベーター鎖をコードする配列と同様に、主要血清学
特異性ＤＲ１−９にとってのＤＲサブ領域における構造
ベースが知られている。例えばＢｅｌｌら（１９８７）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
４：６２３４−６２３８を参照のこと（これは引用する
ことで本明細書に組入れる）。 【００９６】前述した通り、自己免疫抗原ペプチドとＭ
ＨＣ成分とはペプチド結合を介して連結させてよい。し
かしながら、連結のその他の態様が当業者に自明であ
り、そして例えばアルファー及び／又はベーター鎖の炭
水化物成分等を含む糖タンパク質上の炭水化物基を介す
る連結が含まれうる。 【００９７】複合体の評価 本発明の複合体はインビトロ系を用いて、又はインビボ
モデルを用いてアッセイできる。インビトロ系において
は、該複合体を、該複合体のペプチドに関与する症状の
原因であるタンパク質又は抗原によって免疫された、又
はそれらに対する免疫性を示す対象体由来の末梢血液Ｔ
細胞とインキュベートする。この有用な複合体は同系Ｔ
細胞においてアネルギーを誘発し、そして追加の抗原に
よる刺激によってさえもＴ細胞の増殖を防ぐ。 【００９８】インビボ系においては、ＡＰＣの存在下に
おいて、単離エピトープ又は全長抗原に対する応答で増
殖するＴ細胞をクローンする。これらのクローンは、自
己免疫障害を誘発させるために免疫化していない組織適
合性動物に注射した。関連の複合体に関連する症状は軽
減されるか、又はこの障害の症状は消えるであろう。 【００９９】いづれかのタイプの複合体、即ち、エフェ
クター成分を有するもの又は有さないものが利用でき
る。ある態様において、その処置は２重である。個体
を、抗原の有効領域を含むＭＨＣ−コード化抗原表示糖
タンパク質の複合体で処理して免疫系を下降制御する。
更なる下降制御は、ＭＨＣコード化抗原表示糖タンパク
質、処置すべき自己免疫障害に特異的な抗原の有効領域
及びエフェクター成分を含む三成分複合体による処理に
よって達せられる。更に、複合体のパネルを処置のため
に利用できうる。例えば、複数の抗原のペプチドが自己
免疫応答に関与することが予測されるとき、及び／又は
複数の抗原が関与することが予測されるとき、個体を、
適当なＭＨＣコード化抗原表示ポリペプチド及び抗原の
有効領域を含むパネルから選ばれた複数の複合体で処置
してよい；これらはエフェクター成分を有しても有して
いなくてもよい。 【０１００】ラベル化複合体の投与は診断用途におい
て、障害に関与する免疫系のかかる領域の同定を可能に
する。 【０１０１】治療及び／又は診断のためのＭＨＣ複合体
の選択 自己免疫障についての個体の診断又は処置において用い
るべき本発明のＭＨＣ複合体を選ぶため、自己抗原の表
示に関与するタイプのＭＨＣ抗原を同定する。 【０１０２】特異的な自己免疫機能不全は特定のＭＨＣ
のタイプに関連する。ヒトにおけるＤＱ／ＤＲハプロタ
イプ及び関連の自己免疫障害のリストを図１０に示す。
どの対立遺伝子、従ってどのＭＨＣコード化ポリペプチ
ドが自己免疫障害に結びついているかを同定する方法は
当業界に知られている。ＥＰ２８６４４７に記載の方法
が適切である。本法において、いくつかの工程を行っ
た。まず、ＭＨＣ抗原と自己免疫障害との関連を遺伝的
研究を基礎として決定する。この研究を実施するための
方法は当業者に周知であり、そしてヒトに関連する全て
の既知のＨＬＡ障害についての情報はコペンハーゲンの
ＨＬＡ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｇｉｓｔｒｙに
保存されている。この障害に関連するポリペプチドをコ
ードする遺伝子座がこの障害との最大の関連性を有する
ものである（図１０参照）。 【０１０３】第二に、障害関連ＭＨＣ抗原／ポリペプチ
ドをコードする特定の対立遺伝子を同定する。この対立
遺伝子の同定において、影響を受け易い対立遺伝子が有
力であると仮定される。対立遺伝子の同定は特定のサブ
タイプと障害との強力な陽性関係を決定することによっ
て達成される。これは数多くの方法で達成されることが
でき、全て当業者に知られている。例えば、サブダイピ
ングは複合型リンパ球応答（ＭＬＲ）タイピング及びプ
ライム化リンパ球試験（ＰＬ７）によって達成されう
る。両方の方法はＷｅｉｒとＢｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｈ
ａｎｄｂｏｏｋｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ（引用して本明細書に組入れる）に記
載されている。これは、検査すべきＭＨＣ遺伝子座に特
異的なプローブを用いてＤＮＡ制限フラグメント長多形
態（ＲＦＬＰ）を分析することによって達成されうる。
例えば、Ｎｅｐｏｍ（１９８６）Ａｎｎａｌｓ Ｎ．
Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４７５，１。ＭＨＣ遺伝子座に
ついてのプローブを用意する方法は当業者に知られてい
る。例えば、Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎら（１９８６）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５９
６６；Ｗｅｉｓｓｍａｎら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｉｎ
Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ：ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ
ｏｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉ
ｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｅ．
Ｐ．Ｃｏｈｅｎ編、１９８１）を参照のこと（これらは
引用して本明細書に組入れる）。 【０１０４】障害感受性を授けるサブタイプの最も完璧
な同定は、遺伝子座のゲノムＤＮＡ又はこの遺伝子座内
でコードされるｍＲＮＡに至るｃＤＮＡのシーケンシン
グによって達せられる。所望の領域を増幅するための、
プローブによる特に所望されるＤＮＡを同定するため技
術は当業界に知られ、そして例えばポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）技術が含まれる。 【０１０５】特定の自己免疫障害に対する感受性を授け
る対立遺伝子が同定されたら、この対立遺伝子内でコー
ドされるポリペプチドも同定できる。即ち、ポリペプチ
ド配列はそれをコードする対立遺伝子内のＤＮＡの配列
より推定できる。診断及び／又は治療のために用いる本
発明のＭＨＣ抗原複合体は自己免疫障害症状に関連する
ＭＨＣ抗原の有効領域及び同じ障害症状に関連する自己
免疫抗原に由来する。 【０１０６】例えば、リウマチ型関節炎患者のうちの９
０％以上がＤＲ４（Ｄｗ４），ＤＲ４（Ｄｗ１４）又は
ＤＲ１のハプロタイプを有する（図１０参照）。ヒトリ
ウマチ型関節炎における標的抗原はＩＩ型コラーゲンで
あることも知られている。それ故、リウマチ型関節炎を
有する個体の処置又は診断のために用いる本発明の複合
体には、ＩＩ型コラーゲンの有効領域と複合した、障害
誘発に関する抗原表示の可能な、又は障害抑制に関する
抗原表示の可能でないＤＲ４（Ｄｗ４），ＤＲ１及び／
又はＤＲ４（Ｄｗ１４）に由来のポリペプチドを含むも
のが挙げられる。 【０１０７】自己免疫障害の診断及び／又は処置のため
の本発明の複合体の利用に適しうるプロトコールを図１
１に示す。簡潔すると、自己免疫障害を有する（又はそ
れに感受性である）個体を同定し、そして自己免疫機能
不全を同定する。同定は症候学的に、及び／又は家族履
歴の調査によることができる。個体のＭＨＣタイプは当
業界に知られる１又は複数の方法、例えばＭＬＲ、血清
学アッセイ及びＤＮＡ分析（ＲＦＬＰ及びＰＣＲ技法を
含む）による細胞ダイピングを含む方法により決定され
る。個体のＴ細胞はインビトロで、自己反応性Ｔ細胞に
より認識される自己ペプチドを決定するために検査され
る；これは先に説明した本発明のラベル化複合体を利用
することで達せられ、これは式Ｘ’−ＭＨＣ２−ペプチ
ド（ここでＸはラベル成分である）で表わされる。どの
複合体がＴ細胞を標的とするかを決定した後、個体を、
特異的な自己反応性Ｔ細胞複製を抑制することのできる
本発明の複合体、及び／又は自己反応性Ｔ細胞を殺すこ
とのできるもので処置する。これらはそれぞれ、タイプ
ＭＨＣ２−ペプチド、及びＸ’−ＭＨＣ２−ペプチド
（ここでＸはＴ細胞を殺すことのできる成分である）の
複合体である。治療（残留自己反応性Ｔ細胞により決
定）は、前述した本発明のラベル化複合体を用いるＴ細
胞結合研究によりモニターされる。 【０１０８】本明細書で用いている語「個体」は、基本
的に同等なＭＨＣ系を保有する全ての哺乳類及び全ての
脊椎動物を包括する。 【０１０９】インビボ試験のためのモデル系 下記は自己免疫障害に関するモデル系であり、これらは
かかる症状に対する本発明の効果を評価するために利用
できる。 【０１１０】全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ） 自己免疫ニュージーランドブラック（ＮＺＢ）マウス及
び表現型が正常なニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）
マウス株のＦ１ハイブリドは、親のＮＺＢ株よりもより
急性に重症な全身性自己免疫障害を発症した。これらの
マウスは、ヒトにおけるＳＬＥとめざましく類似な核抗
原に対する抗体及びそれに続く雌に優性な致死的免疫複
合仲介型糸球体腎炎の発症を含むいくつかの異常を示し
た。引用することで本明細書に組入れるＫｎｉｇｈｔ
ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４７：１６５
３。 【０１１１】ヒト及びネズミの障害の形態の両方におい
て、ＭＨＣ遺伝子生産物との強い関連性が報告されてい
る。ＨＬＡ−ＤＲ２とＨＬＡ−ＤＲ３の個体はＳＬＥを
発症する一般の集団よりも高い危険性にあり（Ｒｅｉｎ
ｅｒｔｓｅｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ（１９７
０）２９９：５１５）、他方、ＮＺＢ／Ｗ Ｆ１マウス
（Ｈ−２ｄ／ｕ）においては、ＮＺＷの親に由来するｈ
−２ｕハプロタイプに連結した遺伝子が狼瘡様腎炎の発
症に寄与する。 【０１１２】本発明の効果は生存率、並びに尿タンパク
質及び抗ＤＮＡ抗体の出現のような徴候の発症の進行に
より決定できる。 【０１１３】尿タンパク質はＵｒｉｓｔｉｘ（Ｍｉｌｅ
ｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｋｈａ
ｒｔ，ＩＮ）の利用によりカロリー計算的に決定でき、
下記のおよその尿タンパク質が表示される：微量、１０
ｍｇ／ｄｌ；１＋，３０ｍｇ／ｄｌ；３＋，３００ｍｇ
／ｄｌ；そして４＋，１０００ｍｇ／ｄｌ。高い度合い
の尿タンパク質は複合体によるマウスの処置によって顕
著に遅延する。 【０１１４】ＮＺＢ／Ｗ Ｆ１マウスにおける抗−ＤＮ
Ａ特異的抗体の存在は、ＺｏｕａｌｉとＳｔｏｌｌｅｒ
のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８６）９
０：１０５（引用することで本明細書に組入れる）に記
載の結合化免疫収着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の改良型を
利用して決定される。 【０１１５】重症筋無力症（ＭＧ） 重症筋無力症はＨＬＡ−Ｄに結びついているいくつかの
ヒト自己免疫障害の一つである。Ｓａｆｅｎｂｅｒｇ
ら、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９７８）１
２：１３６；ＭｃＤｅｖｉｔｔら、Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕ
ｍ．（１９７７）２０：５９（これらは引用することで
本明細書に組入れる）。ＭＧにおいて、アセチルコリン
レセプター（ＡｃＣｈｏＲ）に対する抗体が、シナプス
後方膜におけるＡｃＣｈｏＲの仲介損失によって筋神経
伝達を損傷せしめる。 【０１１６】ＳＪＬ／Ｊ雌マウスはヒトＭＧにとっての
モデル系である。これらの動物において、実験的自己免
疫重症筋無力症（ＥＡＭＧ）は、マウスを他の種に由来
する可溶性ＡｃＣｈｏＲタンパク質で免疫することによ
って誘発される。ＥＡＭＧに対する感受性はＭＨＣにあ
る程度結びついており、そしてＨ−２内の領域まで地図
化されている。Ｃｈｒｉｓｔａｄｏｓｓら、Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．（１９７９）１２３：２５４０。 【０１１７】ＡｃＣｈｏＲタンパク質を、引用するＷａ
ｌｄｏｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
（ＵＳＡ）（１９８３）８０：２７１３の方法に従って
トルペド カリホルニカより精製し、そしてアッセイし
た。完全フロインドアジュバント中の乳濁ＡｃＣｈｏＲ
１５μｇを背中、後足及び尾の根もとの６箇所にわたっ
て皮内注射した。動物を同じ方法で４週間後に再び免疫
した。 【０１１８】評価は抗ＡｃＣｈｏＲ抗体の測定によって
なされることができ、抗ＡｃＣｈｏＲ抗体のレベルはＷ
ａｌｄｏｒら、前掲に記載のマイクロリッターＥＬＩＳ
Ａによって測定される。この標準の試薬容量はウェル当
り５０μｌである。試薬は通常ウェルの中でＲＴで２ｈ
ｒインキュベートする。炭酸水素バッファーｐＨ９．６
で希釈した５μｇのＡｃＣｈｏＲを各ウェルに加える。
ＡｃＣｈｏＲとインキュベートした後、これらのプレー
トを、０．０５％のツイーン及び０．０５％のＮａＮ３
を含むリン酸緩衝食塩水より成る洗浄液で４回すすぐ。
マウス血清を０．０１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．２）、１．
５ｍｆｒのＭｇＣｌ２，２．０ｍＭ の２−メルカプト
エタノール、０．０５％のツイーン８０、０．０５％の
ＮａＮ３（Ｐ−ツイーンバッファー）に希釈し、そして
プレート上でインキュベートした。このプレートを洗っ
た後、Ｐ−ツイーンバッファーに希釈したベーターガラ
クトシダーゼコンジュゲート化ヒツジ抗マウス抗体を各
ウェルに加えた。最終洗浄の後、酵素基質ｐ−ニトロフ
ェニルガラクトピラノシドをプレートに加え、そして基
質触媒の程度を１ｈｒ後の ４０５ｎｍでの吸収により
決定した。 【０１１９】非免疫化マウスと比べて、抗−ＡｃＣｈｏ
ＯＲ抗体がＡｃＣｈｏＲで免疫したマウスの中に存在し
ていることが予測される。複合体による処置は免疫化マ
ウスにおける抗ＡｃＣｈｏＲ抗体の力価を有意義に低下
せしめるものと予測される。 【０１２０】臨床ＥＡＭＧに対する複合体による処置の
効果を評価できる。重症筋無力症は、頭及び首のうなだ
れを伴う丸い姿勢、背中の過大な弓なり、ゆがんだ（ｓ
ｐｌａｙｅｄ）手足、異常な歩行及び筆記の困難さの特
徴を含む。複合体の投与により、抗体力価が低下した後
の期間の後に軽い症状が標準試験の後に見られ、従って
改善されたのであろう。 【０１２１】リウマチ型関節炎（ＲＡ） ヒトにおいて、リウマチ型関節炎に対する感受性はＨＬ
Ａ Ｄ／ＤＲに関連する。マウスにおける天然ＩＩ型コ
ラーゲンに対する免疫応答は、ヒトＲＡを擬態する数多
くの組織学的及び病理学的特徴を有する関節炎について
の実験モデルを確立するために利用されている。マウス
におけるコラーゲン誘発型関節炎（ＣＩＡ）に対する感
受性はＨ−２Ｉ領域、特にＩ−Ａサブ領域に地図化され
ている。Ｈｕｓｅら、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．（１９８４）
４３：１８２０。 【０１２２】感受性株ＤＢＡ−１由来のマウスは、Ｗｏ
ｏｌｅｙとＬｕｔｈｒａのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９
８５）１３４：２３６６（引用することで本明細書に組
入れる）に記載の技術を利用してマウスを天然ＩＩ型コ
ラーゲンで処置することによってＣＩＡを有すようにさ
せる。 【０１２３】別のモデルにおいて、ラットにおけるアジ
ュバント関節炎がヒト関節炎及び細菌抗原により誘発さ
れる自己免疫応答のプロトタイプにとっての実験モデル
となるＨｏｌｏｓｃｈｉｔｚら、Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ
ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｇｙ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）（１
９８６）；Ｐｅａｒｓｏｎ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈ
ｅｕｍ．（１９６４）７：８０。この障害は細胞仲介型
免疫応答の結果であり、これはアジュバント（ＭＴ）に
対して反応性であるＴ細胞のクローンによるその伝達性
によって証明される；同じクローン化細胞による研究に
基づき、この障害における標的自己抗原は軟骨のプロテ
オグリカン分子の一部であることが認められた。 【０１２４】ラットにおけるアジュバント障害は、Ｐｅ
ａｒｓｏｎ、前掲に記載の通り、即ち、複数の貯蔵部
位、好ましくは皮内的に、又は足にもしくは尾の根もと
に付与するフロインドアジュバント（殺菌した結核菌又
はその化学画分、鉱物油及び乳化剤）の単一注射により
発生する。このアジュバントは他の抗原なしで付与す
る。 【０１２５】障害の出現の複合体処置の効果をモニター
した。この出現は組織学的であり、そして、滑膜被覆細
胞の増殖を伴う急性及び半急性滑膜炎、接続組織パンヌ
スによる骨及び関節軟骨の浸潤、並びに特に冒された接
合部の近くでの骨膜新骨形成が含まれる。重症又は慢性
の場合、骨性硬直と同じような崩壊的変化が生ずる。こ
れらの組織学的症候はフロインドアジュバントに対する
感化の約１２日後にコントロール動物において認められ
るものと予測される。 【０１２６】インスリン依存性真正糖尿病（ＩＤＤＭ） ＩＤＤＭは、膵臓のランゲルハンス島のインスリン分泌
細胞の選択的破壊の結果として観察される。この病気に
おける免疫系の関与は、単核細胞によるランゲルハンス
島の早期浸潤の形態学的証拠、抗ランゲルハンス島細胞
抗体の検出、ＩＤＤＭ母集団における対立遺伝子ＨＬＡ
−ＤＲ３および−ＤＲ４の高頻度およびＩＤＤＭと各種
の自己免疫病との間の臨床的関連によって示唆される。
自発性ＩＤＤＭと甲状腺炎の動物モデルはＢＢラットで
発現した。ヒトと同様に、ラットの病気はＭＨＣ抗原を
コードする遺伝子によって部分的にコントロールし、島
の浸潤を特徴とし、抗島抗体の存在と関連する。Ｉ−Ｅ
と等価のクラスＩＩ ＭＨＣ抗原は、ＢＢラットにおけ
る自己免疫病の発現に関与するものと思われる。ビオタ
ードら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳ
Ａ），（１９８５），８２，６６２７。 【０１２７】形態学的評価では、インスリン炎は、島内
に単核炎症細胞が存在することを特徴とする。甲状腺炎
は、最低基準として甲状腺内における病巣の間質リンパ
球浸潤液を特徴とする。最も重症の場合は、散在性の多
量なリンパ球浸潤液、小胞の破壊、線維症、および病巣
のヒュルトレ細胞の変化を示す。ビオタードら、同上を
参照されたい。 【０１２８】ＢＢラットの本発明の複合体での治療は、
ＩＤＤＭおよび甲状腺炎に関連した臨床的および形態学
的症状の発現を改善しまたは防止することが期待され
る。 【０１２９】もう一つのモデルでは、ＮＯＤマウス種
（Ｈ−２ＫｄＤｂ）は、自己免疫ＩＤＤＭのネズミでの
モデルである。これらの動物における病気は、抗島細胞
抗体、重症リンスリン炎、β細胞の自己免疫破壊の証拠
を特徴とする。カナザワら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉ
ａ，（１９８４），２７，１１３。この病気は、リンパ
球によって受動的に転位し、サイクロスポリン−Ａで処
理することによって防止することができる（イケハラ
ら、Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，
（１９８５），８２，７７４３；モリら、Ｄｉａｂｅｔ
ｏｌｏｇｉａ（１９８６），２９，２４４。未処理の動
物は、深いグルコース不耐性およびケトン症を発現し、
および病気の徴候から数週間以内に死亡する。雌性動物
の９０％および雄性動物の２０〜３０％が、誕生から６
か月以内に糖尿病を発現する。飼育の研究は、罹病率に
関する少なくとも２個の遺伝的配座を定義し、その内の
一つはＭＨＣに配置されている。血清学的および分子の
水準でのＮＯＤクラスＩＩ抗原の特徴決定は、自己免疫
病の罹病率はＩ−Ａに関連することを示している。アチ
ャ−オーベアおよびマックデビット、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ
ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，（１９８７），８４，
２３５。 【０１３０】雌ＮＯＤマウスを複合体で処理すると、糖
尿病の徴候を示す以前の時間が長くなりおよび／または
この病気を改善または防止することが期待される。 【０１３１】実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ） 実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多くの点で
多発性硬化症（ＭＳ）のヒトの病気に類似している中枢
神経系の誘発された自己免疫症である。この病気は、マ
ウスおよびラットのような多くの種で誘発させることが
できる。 【０１３２】この病気は麻痺が急に起こることを特徴と
する。ＣＮＳにおける単核細胞による脈管周囲の浸潤
が、マウスとラットのいずれにも観察される。この病気
を誘発する方法と症状学は、アランソン（１９８５）Ｔ
ｈｅ ＡｕｔｏｉｍｍｕｎｅＤｉｓｅａｓｅｓ（ローゼ
およびマッカイ監修、アカデミックプレス・インコーポ
レーテド）３９９〜４２７頁およびアチャ−オーベア
ら、（１９８９），Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍ，７，３７
７〜４０５。 【０１３３】遺伝子が媒介する罹病性の一つは、ＭＨＣ
クラスＩＩ領域に配置されている（ムーアら（１９８
０）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２４，１８１５〜１８２
０）。最も良好に解析された脳脊髄炎発症タン白質はミ
エリン塩基性タン白質（ＭＢＰ）であるが、他の脳脊髄
炎発症抗原が脳に見出されている。免疫原性エピトープ
が配置されている（アチャ−オーベアら、同上）。ＰＬ
マウス種（Ｈ−２ｕ）では、ＭＢＰ中における２個の脳
脊髄炎発症ペプチドである、ＭＢＰペプチドｐ３５〜４
７（ＭＢＰ３５〜４７）およびアセチル化ＭＢＰ ｐ１
〜９（ＭＢＰ１〜９）が特性決定された。 【０１３４】ＥＡＥが誘発された個体における病状の改
善に対する本発明の複合体の効果は、生存率、および症
状の発現の新工場鏡によって測定することができる。 【０１３５】処方及び投与 もしＭＨＣサブユニットのトランメンブラン領域を含ま
せるなら、本発明の複合体は脂質単層又は二重層に含ま
せた後に投与することが好ましい。典型的には、この目
的のためにリポソームが利用されるが、しかしながらあ
らゆる形態の脂質膜、例えば平面脂質膜又は細胞（例え
ば赤血球細胞）の細胞膜が利用されうる。下記の実施例
に示すデーターは、二量体ＭＨＣ分子を含んで成るＭＨ
Ｃ−ペプチド複合体が主として凝集体として存在してい
ることを示す。 【０１３６】リポソームは下記の標準方法に従って調製
できる。しかしながら、もしトランスメンブラン領域を
削除したら、この複合体はペプチド含有薬品にとって常
用に利用されている手法で投与されうる。 【０１３７】投与は全身的とし、そして注射、好ましく
は静脈内により行われ、従って投与の注射ルートに適合
する製剤が利用できる。適切な処方はＲｅｍｉｎｇｔｏ
ｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎ
ｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，第１７版（１９
８５）（引用することで本明細書に組入れる）に見い出
せる。本発明の複合体及び薬理学的に有効な担体を含ん
で成る様々な薬理組成物が調製できる。該薬理組成物は
様々な薬剤デリバリーシステムに適切である。薬剤デリ
バリーの現在の方法の簡単な参考については、Ｌａｎｇ
ｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３
（１９９０）（引用することで本明細書に組入れる）を
参照のこと。 【０１３８】本発明の薬理組成物を調製するうえで、そ
の薬物速度論及び生体分布性について変えるために本発
明の複合体を改質することがしばしば所望される。薬物
速度論の一般的詳細については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’
ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ、前掲、第３７〜３９章を参照のこと。薬物速度論及
び生体分布性を変える数多くの方法が当業者に知られて
いる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ前掲を参照のこと）。例え
ば、複合体の血清半減期を上昇させるのに適切な方法に
は、血流からの複合体の排除に関与する炭水化物の除去
の処理が含まれる。好ましくは、実質的に全ての炭水化
物がこの処理により除去される。炭水化物成分の少なく
とも７５％、好ましくは約９０％、そして最も好ましく
は約９９％が除去されたら、実質的に全ての炭水化物が
除去されたといえる。可溶性巨大分子、例えばタンパク
質、多糖類又は合成ポリマー、例えばポリエチレングリ
コールヘのコンジュゲーションも有効である。その他の
方法には、タンパク質、脂質（例えばリポソーム）、炭
水化物又は合成ポリマーのような物質より成る小胞の中
での該複合体の保護が含まれる。 【０１３９】本発明のリポソームは典型的には、この複
合体がＴ細胞レセプターと相互作用しうるような状態で
リポソームの上に位置しているＭＨＣ−ペプチド複合体
を含む。そのトランスメンブラン領域は通常は、膜の形
成時に膜の中にまず一体化せしめる。このリポソームは
特定の自己反応性Ｔ細胞を薬剤（例えば毒素又は化学治
療薬）が標的とするために利用できる。他方、リポソー
ムの中に包埋された複合体を標的細胞におけるアネルギ
ーの誘発のために利用できる。 【０１４０】リポソームの電荷は血液からのリポソーム
の排除において重要な決定要素であり、負荷電リポソー
ムは網内細胞系によってより迅速に取り込まれ（Ｊｕｌ
ｉａｎｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．
Ｃｏｍｍｕｎ．６３：６５１（１９７５））、従って血
流の中で短めの半減期を有する。長い循環半減期を有す
るリポソームが治療及び診断用途のために一般に所望さ
れる。例えば、血流の中で８，１０，１２又は２４時間
まで維持されうるリポソームが好ましい。 【０１４１】典型的には、リポソームは約５〜１５モル
％の負荷電リン脂質、例えばホスファチジルグリセロー
ル、ホスファチジルセリン又はホスファチジルイノシト
ールによって調製する。加えた負荷電リン脂質、例えば
ホスファチジルグリセロールは、自発性リポソーム凝集
を防ぐにも働き、それ故所望されないリポソーム凝集形
成の危険性を小さくする。少なくとも約５０モル％の濃
度での膜硬化剤、例えばスフィンゴミエリン又は飽和中
性リン脂質及び５〜１５モル％のモノシアリルガングリ
オシドが、血流におけるリポソーム調製物の循環を高め
るのに担う（これは、引用することで本明細書に組入れ
る米国特許第４，８３７，０２８号に記載されてい
る）。 【０１４２】更に、リポソーム懸濁物は、脂質をフリー
ラジカル及び保存に基づく脂質−過酸化的損傷から守る
脂質保護剤を含みうる。親油性フリーラジカルクエンチ
ャー、例えばα−トコフェロール及び水溶性鉄特異的キ
レート剤、例えばフェリオキシアニンが好ましい。 【０１４３】例えばＳｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８
０）、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０
１，７２８号及び第４，８３７，０２８号（全て引用す
ることで本明細書に組入れる）に記載の通り、様々な方
法がリポソームを調製するのに有用である。一方法は不
均質なサイズの多重板状小胞をもたらす。この方法にお
いては、小胞形成脂質を適当な有機溶媒又は溶媒系の中
に溶かし，次いで真空又は不活性ガスのもとで乾かして
薄い脂質フィルムを形成せしめている。所望するなら、
フィルムを適当な溶媒、例えば第三ブタノールの中に再
溶解させ、次いで凍結乾燥させて、より容易に水和され
る粉末状形態にあるより均質な脂質混合物を形成せしめ
る。このフィルムを標的化薬剤及び標的用成分の水性溶
液で覆って、典型的には攪拌しながら１５〜６０分にわ
たって水和させる。得られる多重板状小胞のサイズ分布
は、より強い攪拌条件のもとでの脂質の水和により、又
は清浄剤、例えばデオキシコレートの添加により小さめ
のサイズにシフトさせることができる。 【０１４４】水和媒質は標的化薬剤を、最終リポソーム
懸濁物中のリポソームの内部容量の中で所望される濃度
で含む。典型的な薬剤溶液は緩衝食塩水溶液の中に１０
〜１００ｍｇ／ｍｌの複合体を含む。 【０１４５】リポソームの調製に続いて、所望のサイズ
範囲及び比較的狭いリポソームサイズの分布を得るため
にリポソームはサイズ分別されうる。ある好ましいサイ
ズ範囲は約０．２〜０．４ミクロンであり、これは典型
的には０．２２ミクロンのフィルターである常用のフィ
ルターでの濾過によってリポソーム懸濁物を減菌するこ
とを可能とする。このフィルター濾過法は、もしリポソ
ームが約０．２〜０．４ミクロンまでにサイズ分別され
たなら、高仕組ベースで実施できる。 【０１４６】リポソームを所望のサイズヘとサイズ分別
するのにいくつかの技法が有用である。あるサイズ分別
法は引用することで本明細書に組入れる米国特許第４，
７３７，３２３号に記載されている。リポソーム懸濁物
をバス又はプローブ音波処理のいづれかにより音波処理
することは、サイズが約０．５ミクロン以下である小さ
な単板小胞に至る多大なサイズ縮小をもたらす。ホモジ
ネーションは大きなリポソームを小さめのものへと砕断
するためにエネルギーを与えることを基礎とする別の方
法である。典型的なホモジネーション手順において、多
重板状小胞を標準のエマルションホモジナイザーを介し
て特定のリポソームサイズ、典型的には約０．１〜０．
５ミクロンのサイズが認められるまで再循環させる。両
方の方法において、粒径分布は常用のレーザービーム粒
径識別によりモニターできる。 【０１４７】小孔ポリカーボネート膜又は非対称性セラ
ミック膜を介するリポソームの押出しも、リポソームの
サイズを比較的よく規定されたサイズ分布へと小さくす
る有効な方法である。典型的には、懸濁物を、所望のリ
ポソームサイズ分布が得られるまで１又は数回にわたっ
て膜を介して循環させる。リポソームサイズにおける段
階的縮小を得るためにリポソームを順次小さめの多孔膜
を介して押出してよい。 【０１４８】最も効率的な封入法のもとでさえも、最初
にサイズ分けしたリポソーム懸濁物は遊離（封入されて
いない）形態における複合体を５０％以上含みうる。 【０１４９】リポソーム懸濁物から捕促されていない化
合物を除くためのいくつかの方法が有用である。一方法
において、懸濁物を高速遠心によりペレット化して、上
清液の中に遊離化合物及び非常に小さなリポソームを残
させる。別の方法は、懸濁物を限外濾過により濃縮し、
次いで交換媒質の中にこの濃縮リポソームを再懸濁させ
ることを包括する。他方、溶質分子から大きめのリポソ
ーム粒子を分けるためにゲル濾過が利用されうる。 【０１５０】上記の処理に続いて、リポソーム懸濁物を
静脈内投与において有用な所望濃度にする。これは、例
えば遠心もしくは限外濾過によってリポソームが濃縮さ
れた場合はリポソームを適当な容量の注射媒質に再懸濁
する、又は薬剤除去工程が全懸濁物容量を増加させた場
合はこの懸濁物を濃縮することを包括しうる。次にこの
懸濁物を前記の通りに濾過により減菌する。ＭＨＣ−ペ
プチド複合体を含んで成るリポソームは、投与の手法、
導入すべき薬剤、処置すべき特定の障害、等に従って変
わる投与量において、非経口的又は局所的に投与されう
る。 【０１５１】ミセルは非極性領域を有する分子の溶解度
を高めるために当業界において一般に利用されている。
従って当業者はミセルが本発明の組成物において有用で
あることを認識するであろう。本発明の複合体を含んで
成るミセルは当業界によく知られる方法に従って調製で
きる（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前掲、第２０章を
参照のこと）。本発明の複合体を含んで成るミセルは標
準の界面活性剤又は清浄剤を用いて一般に調製される。 【０１５２】ミセルは水性溶液中で界面活性剤（疎水性
領域と、１又は複数のイオン性、又はそうでなければ強
力な親水性基とを含む分子）により形成される。固形界
面活性剤の濃度が増えるにつれ、大気／水又はガラス／
水の界面に収着した単層は、更なる占拠がこの２枚の単
層の中に既にある界面活性剤分子の多大な圧縮を必要に
せしめるほどに密に充填される。この濃度を超えるよう
な溶解界面活性における量の更なる増分は、ミセルヘと
凝集する新たな分子の量に相当する。この過程はいわゆ
る「臨界ミセル濃度」と呼ばれる特徴的な濃度で始ま
る。 【０１５３】希薄な界面活性剤溶液の中で形成されるミ
セルの形はほぼ球形である。界面活性剤分子の極性頭部
基は外部球形殻に並んでおり、ここでその炭化水素鎖は
中心に向って配向して、ミセルにとっての球形中核を形
成している。この炭化水素鎖はランダムコイルとなり、
且つ、からみ合っており、そしてミセルの内部は非極性
の液状特性を有している。ポリオキシエチル化非イオン
性清浄剤のミセルにおいては、このポリオキシエチレン
成分は外を向いており、そして水により浸入される。こ
の配備はエネルギー的に好ましく、なぜなら親水性頭部
基水と接触し、そして炭化水素成分は水性媒質から除か
れており、且つ、極性頭部基によって水との接触が遮蔽
されているからである。ミセルの内部に位置する界面活
性剤分子の炭化水素尾部は弱いファンデルワールスカに
よって互いと相互作用している。 【０１５４】ミセルのサイズ又はその凝集体の数は幾何
学的要因により大いに支配されている。炭化水素中核の
半径は界面活性剤分子の伸びきった炭化水素鎖の長さを
超えることはできない。従って、鎖長を長くすること、
又は同族列を増やすことは球形ミセルの凝集数を増や
す。炭化水素領域が単独の通常のアルキル鎖である界面
活性剤にとっては、球形を構成する最大凝集数はＣ８，
Ｃ１０，Ｃ１２，Ｃ１４及びＣ１６のそれぞれにとって
約２７，３９，５４，７２及び９２である。もし界面活
性剤の濃度を数％上げる、そしてもし電解質を加える
（イオン性界面活性剤のケース）又は温度を高めたら
（非イオン界面活性剤のケース）、ミセルのサイズは大
きくなる。このような条件のもとでは、ミセルは球形を
維持するのに大きくなりすぎてしまい、形が楕円形、円
筒形又は最終的に板状となってしまう。 【０１５５】一般の界面活性剤は当業者によく知られ、
そして本発明のミセルに利用できる。適当な界面活性剤
にはラウリン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラ
ウリル硫酸ナトリウム、オクタオキシエチレングリコー
ルモノドデシルエーテル、オクトキシノール９及びＰＬ
ＵＲＯＮＩＣ Ｆ−１２７°（ＷｙａｎｄｏｔｔｅＣｈ
ｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．）が含まれる。好ましい界
面活性剤はＩＶ注射に適合する非イオン系ポリオキシエ
チレン及びポリオキシプロピレン清浄剤であり、例えば
ＴＷＥＥＮ−８０°，ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−６８°，
ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド等である。更
に、リポソームの調製において用いるのに説明したリン
脂質もミセル形成に利用できる。 【０１５６】本発明のＭＨＣサブユニットは親油性トラ
ンスメンブラン領域及び比較的親水性な細外胞ドメイン
を含んで成るため、一般の界面活性剤又はリン脂質及び
このサブユニットの存在下において複合ミセルが形成さ
れる。本発明の複合ミセルはサブユニット、リン脂質及
び／又は界面活性剤の任意の組合せを含んで成りうる。
従って、該ミセルはサブユニットと清浄剤、リン脂質及
び清浄剤の両方と組合せたサブユニット、又はサブユニ
ットとリン脂質を含んで成りうる。 【０１５７】本発明の複合体を含んで成る薬理組成物に
関して、その投与量は例えば特定の複合体、投与の方
法、処置すべき特定の障害及びその重症度、患者の総合
的な健康状態及び症状、並びにかかりつけの医師の判断
に応じて変わりうる。ネズミ対象体にとっての投与量レ
ベルは一般に約１０μｇ〜約５００μｇである。約５０
μｇ〜約３００μｇの総投与量が好ましい。例えば、障
害の経過にわたって施す処置において、２５μｇ又は１
００μｇの３回の投与が有効である。総投与量は約０．
０１５〜約１５μｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１５〜約
１０μｇ／ｋｇに範囲する。 【０１５８】薬理組成物は予防的及び／又は治療的処置
のため、非経口的、局所的、経口的又は局部的（例えば
エロゾールによる）又は経皮的投与を目的とする。この
薬理組成物は投与の方法に応じて様々な単位投与形態で
投与されうる。例えば、経口投与に適する単位投与形態
には粉末、錠剤、ピル及びカプセルが含まれる。 【０１５９】好ましくは、該薬理組成物は静脈内投与さ
れる。従って、本発明は、許容される担体、好ましくは
水性担体に溶解又は懸濁された複合体の溶液を含んで成
る静脈内投与のための組成物を提供する。様々な水性担
体、例えば水、緩衝水、０．４％の食塩水等が利用され
うる。例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が本発明の
可溶性複合体の投与のために特に適切である。好ましい
製剤は０．０２％のツイーン−８０を含むＰＢＳであ
る。この組成物は常用のよく知られている滅菌技法によ
り滅菌するか、又は滅菌濾過してよい。得られる水性溶
液は使用されるために包装されるか、又は凍結乾燥され
てよく、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌水性溶液と合わ
せられる。この組成物は、適当な生理学的条件のために
必要な薬理学的に許容される補助物質、例えばｐＨ調節
及び緩衝剤、等張性調節剤、湿潤剤等例えば酢酸ナトリ
ウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリ
エタノールアミンオレエート、他を含むことがてきる。 【０１６０】該複合体の濃度は広範囲にわたり、即ち、
約０．０５重量％以下、通常は少なくとも約１重量％か
ら、１０〜３０重量％ほどに変えることができ、そして
選ばれた投与の特定態様に従って、主として流体容量、
粘度等によって選ばれるであろう。静脈内投与のために
好ましい濃度はＰＢＳ中で約０．０２％〜約０．１％又
はそれ以上である。 【０１６１】固形組成物に関しては、常用の非毒性固形
担体が利用でき、これには例えば薬理級のマンニトー
ル、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウ
ム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グ
ルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等が含まれ
る。経口投与のためには、薬理学的に許容される非毒性
組成物は、通常利用されている賦形剤、例えば既に挙げ
たような担体のいづれかを含ませることにより作られる
ことができ、そして一般には活性成分の１０〜９５％に
する。 【０１６２】エロゾール投与のためには、該複合体は界
面活性剤及び噴射剤と一緒に、微細分割形態において供
せられるのが好ましい。この界面活性剤はむろん無毒で
なくてはならず、そして噴射剤に可溶性であることが好
ましい。代表的なかかる試薬は、６〜２２個の炭素原子
を含む脂肪酸のエステル又は半エステル、例えばカプロ
ン酸、オクタノン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステ
アリン酸、リノール酸、リノレニン酸、オレステアリン
酸及びオレイン酸と、脂肪多価アルコール又はその環状
無水物、例えばエチレングリコール、グリセロール、エ
リスリトール、アラビトール、マンニトール、ソルビト
ール、ソルビトールに由来するヘキシトール無水物、と
のエステル、並びにこれらのエステルのポリオキシエチ
レン及びポリオキシプロピレン誘導体である。複合エス
テル、例えば複合又は天然グリセリドが利用できる。こ
の界面活性剤は該組成物の０．１〜２０重量％、好まし
くは０．２５〜５重量％を構成しうる。この組成物の残
りは通常噴射剤である。液化噴射剤は一般に周囲条件で
ガスであり、そして加圧のもとで凝縮する。適当な液化
噴射剤は、５個まで炭素を含む低級アルカン、例えばブ
タン及びプロパンであり、そして好ましくはフッ素化又
はフルオロ塩素化アルカンである。前記した混合物も利
用できる。エロゾールの製造において、適当なバルブの
付いた容器に、微細に分割した化合物及び界面活性剤を
含む適当な噴射剤を充填する。この成分は従ってバルブ
の作動により放出されるまで高い圧力に維持される。 【０１６３】該複合体を含む組成物は治療的、予防的又
は診断的用途のために投与できる。治療的用途において
は、組成物を、前記した障害に既に苦しんでいる患者
に、この障害の症状及びその合併症を治癒又は少なくと
も部分的に軽減するのに十分な量で投与する。これを成
し遂げるのに適切な量を「治療的に有効な投与量」と定
義する。これに有効な量は障害の重症度並びに患者の体
重及び一般的状態に依存するであろう。前述した通り、
これは典型的には約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋ
ｇ、好ましくは約３〜約１５ｍｇ／ｋｇであろう。 【０１６４】予防的用途においては、本発明の複合体を
含む組成物を、特定の障害に対して感受性である、又は
その危険性を有する患者に投与する。かかる量は「予防
的に有効な投与量」と定義する。この用途において、そ
の正確な量はここでも患者の健康状態及び体重に依存す
る。その投与量は一般に前記した範囲であろう。 【０１６５】診断用途において、適切な複合体又はその
カクテルを含む組成物を、自己免疫障害症状を有すると
予測される患者に投与して、この障害に関連する自己反
応性Ｔ細胞の存在を決定する。他方、特定の処置の効力
をモニターすることができる。これを成し遂げるのに十
分な量は「診断的に有効な投与量」と定義する、この用
途において、その正確な量は患者の健康状態等に依存す
るが、一般には投与当り０．０１〜１０００ｍｇ、特に
患者当り約１０〜約１００ｍｇの範囲であろう。 【０１６６】治療的又は診断的用途のためのキットを供
することもできる。従って、本発明の課題の組成物は通
常容器中の凍結乾燥状態で供される。ラベルもしくは毒
素にコンジュゲートされた、又はコンジュゲートしてい
ない複合体をキットの中に、バッファー、例えば、トリ
ス、リン酸塩、炭酸塩等、安定剤、殺生物剤、不活性タ
ンパク質、例えば血清アルブミン等、更には使用のため
の仕様書のセットと一緒に含ませてよい。一般に、これ
らの材料は複合体の量に基づいて約５重量％以下、そし
て通常はタンパク質濃度に基づいて少なくとも０．００
１重量％の量で存在するであろう。しばしば、活性成分
を希釈する不活性増量剤又は賦形剤を含ませることが所
望され、この賦形剤は全組成物の約１〜９９重量％にお
いて存在しうる。アッセイにおいてこの複合体に結合す
ることのできる抗体を使用するとき、これは別個々のバ
イヤルの中に通常存在するであろう。この抗体は当業界
に知られる技術に従ってラベルにコンジュゲートされ、
そして処方されるのが典型的である。 【０１６７】本発明は、自己免疫性のような所望されな
い自己応答の原因である免疫系の状況を同定、且つ、阻
止するのに利用できる方法及び組成物に向けられてい
る。本発明の組成物及び方法は、ＭＨＣによりコードさ
れる糖タンパク質と一緒に特定の抗原を認識するヘルパ
ーＴ細胞を標的とするようにデザインされている。本発
明の複合体はＴ細胞レセプターに結合し、そして標的リ
ンパ球及びその他の細胞において免疫系の非応答性をも
たらす。 【０１６８】本発明は、免疫反応を起こさせるように抗
原自体により触発される相互作用と類似の状況で免疫系
と相互作用する抗原の形態を提供する。本発明の組成物
は、（１）ＭＨＣコード化抗原表示糖タンパク質の有効
領域；及び（２）抗原の有効領域；の精製化＝成分複合
体である。これらの二成分は共有又は非共有連結によっ
て結合している。インビトロ及びインビボ実験の両者に
由来する証拠は、かかる複合体が同系移植Ｔ細胞におけ
る慢性アネルギーを誘発せしめることを確立する。 【０１６９】その他の観点において、本発明は薬理学的
組成物に向けられ、ここで本発明の複合体が活性成分で
ある。この組成物は自己免疫障害のような免疫応答に関
連する特定の抗原との免疫系反応の一部を下降制御する
のに用いることができる。 【０１７０】 【実施例】下記の実施例によって本発明を例示するが、
本発明を限定するものではない。 【０１７１】実施例１ マウスＩ−Ａｋ 及びラットＭＢＰペプチドの複合体に
よるインビトロでのＴ細胞の下降制御 ヒト多発性硬化症を擬態する障害モデルであるマウスに
おける実験的アレルギー性起脳炎を誘発することで知ら
れるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に対して向け
られたＴ細胞クローンにおける非応答性又はアネルギー
の誘発におけるクラスＩＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体の
効果を下記に示す。 【０１７２】スタンフォード大学のＰａｔ Ｊｏｎｅｓ
博士から、ラットＭＢＰペプチド（１−１１）に対する
マウスの免疫によって調製し、そして抗原特異性につい
て特性化されたＴ細胞クローンＡＪ１．２及び４Ｒ３．
４を獲得した。 【０１７３】ラットＮＳＦペプチドを有するＩ−Ａｋ複
合体を、精製マウスＩ−Ａｋ及び合成ラットＭＢＰペプ
チド（１−１３）を利用して作り、このペプチドの配列
は周知であり（Ｚａｍｖｉｌら（１９８６）Ｎａｔｕｒ
ｅ ３２４：２５８２６０）、そして Ａｃ−ＡＳＱＫＲＰＳＱＲＨＧＳＫ である。 【０１７４】マウスＩ−ＡｋをＴｕｒｋｅｗｉｔｚら、
前掲に基づく改良方法により精製した。基本的には、Ｉ
−Ａｋを含む細胞の可溶性膜抽出物を、１０−２．１６
抗体（これはプロテインＡでのアフィニティークロマト
グラフィーにより精製され、且つ、ＣＮＢｒ活性化セフ
ァロース４ｂに結合されている）を含むカラムを用いる
アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。Ｎ
Ｐ−４０可溶性膜抽出物、１０．２１６ＭＡｂの精製及
びそのＣｎＢｒ活性化セファロース４Ｂへの結合、並び
にＩ−Ａｋの精製の調製計画をそれぞれ図１２，１３ａ
並びに１４に示す。図１３ｂは精製した１０−２．１６
抗体の純度を示すポリアクリルアミドゲルのコピーであ
る。Ｉ−Ａｋの純度（これはポリアクリルアミドゲル分
析によりモニター）を図１５に示す。 【０１７５】Ｉ−ＡｋとラットＭＢＰペプチドの複合体
を作るため、３０ｍＭのオクチルグルコシドを含むＰＢ
Ｓ中の１０μｇのアフィニティー精製Ｉ−Ａｋ と５０
倍過剰量のＨＰＬＣ精製ＭＢＰペプチドとを１２５μｌ
の全容量で混ぜ合わせた。サンプルを３７℃で１６時
間、定常に攪拌しながらインキュベートし、次いでリポ
ソームの準備のためにＧ−２４セファデックス脱塩によ
りペプチドから分離させるか、又は細胞研究のためにＰ
ＢＳ、続いてＲＰＭＩ培地に対して４℃で３６時間透析
した。 【０１７６】リポソームヘのＩ−Ａｋ−ＭＢＰペプチド
複合体の導入は下記の通りである。２５：７５：２のモ
ル比でコレステロール：ジパルミトイルホスファチジル
コリン（ＤＰＰＣ）：ジパルミトイルホスファチジルエ
タノールアミン−フルオレセイン（ＤＰＰＥＦ）より成
る脂質溶液を３０ｍＭのオクチルグルコシド（ＯＧ）を
含むクロロホルム中で調製した。脂質を真空のもとで乾
かし、そして１７ｍＭのＯＧを含む予め作っておいたＰ
ＢＳ中のＩ−Ａｋペプチド複合体を乾燥脂質と５：１
（ｗ／ｗ）の比で混ぜ合わせた。この混合物を２−３分
間ボルテックスに付し、４℃に冷やし、そして最後にＰ
ＢＳ、続いてＲＰＭＩ倍地に対して４℃で３６時間透析
した。（１２５−Ｉ）−ラベル化Ｉ−Ａｋを用いる実験
においては、脂質混合物の中に蛍光化脂質は含ませず、
そしてリポソームの中へのＩ−Ａｋの一体化をシンチグ
ラフィーにより決定した。 【０１７７】平面脂質膜を滅菌１２ｍｍガラスカバース
リップの上に、アフィニティー精製Ｉ−Ａｋ単独又は精
製Ｉ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−１３）を含むリポソーム５０
〜１００μｌを用いて、Ｗａｔｔｓらの（１９８５）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：
５４８０−５４８４（引用することで本明細書に組入れ
る）の方法によって準備した。平面膜におけるＩ−Ａｋ
の存在は、蛍光抗Ｉ−Ａｋ抗体による染色の後での蛍光
顕微鏡により確認した。バックグランド以上の蛍光は、
蛍光抗Ｉ−Ａｋにより染色に基づいて認められなかっ
た。 【０１７８】ＭＢＰペプチド刺激の６〜８日後に獲得し
たＡＪ１．２及び４Ｒ３．４細胞を２回洗い、そして４
×１０５の細胞を平面膜に付加した。このプレートを３
７℃で５％のＣＯ２の中で４８〜７２時間インキュベー
トし、次いでコロニーの形成について目視検査した。 【０１７９】清浄剤可溶化クラスＩＩ分子の効果を、１
×１０５のＡＪ１．２又は４Ｒ３．４を、５０〜１００
μｌの精製Ｉ−Ａｋ単独、精製Ｉ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−
１３）、及び倍地単独と、３７℃で５％のＣＯ２の中で
５時間培養することにより調べた。このインキュベーシ
ョンの後、これらの細胞を９００μｌに希釈し、そして
増殖アッセイにおける抗原表示細胞（ＡＰＣ）及び抗原
〔ＭＢＰ（１−１３）〕に対するそれらの応答能力につ
いて試験した。細胞増殖の表示として３−（４．５−ジ
メチル−チアゾール−２−７’）−２．５−ジフェニル
テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の取込みを利用し
た。通常は３Ｈ−チミジン取込みによってモニターされ
るＤＮＡ合成と、ＭＴＴ取込みにより測定されるミトコ
ンドリアの活性は別々の細胞機能であるが、脾臓細胞培
養の刺激の開始から３日後にモニターしたこれら２通り
の活性は互いと非常によく似ていた（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＤｅｖｉｃｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅ
ｔｉｎ Ｎｕｍｂｅｒ ０１１−Ａ，１９８８年２月９
日）。 【０１８０】データーは、倍地のみで培養した細胞に比
してのクラスＩ＋Ａｇとインキュベートした細胞増殖の
％抑制として示し、そして次式により計算した： （式中、 Ｔ細胞ａ＝Ｉ−Ａｋ−ＭＢＰ（１−１３）複合体と予備
インキュベートしたＴ細胞 Ｔ細胞ｂ＝Ｉ−Ａｋ−ＭＢＰ（１−１３）のみと予備イ
ンキュベートしたＴ細胞 Ｔ細胞ｃ＝倍地と予備インキュベートしたＴ細胞であ
る）。 【０１８１】クラスＩＩ ＭＨＣのみの存在下で培養し
た細胞の増殖は、ほとんどの研究において倍地のみで培
養した細胞と一般に等しいため、この後者の数を％抑制
を得るうえで利用した。トリプリケートウェルの標準偏
差は大半の実験で＜１０％であった。 【０１８２】まず２通りの定量的研究を、Ｉ−Ａｋ＋Ｍ
ＢＰ（１−１３）を含むリポソームから調製した平面膜
へのＴ細胞クローンの結合を、Ｉ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−
１３）での予備処置が変更するであろうかを決定するた
めに行った。ＡＪ１．２細胞をこれらの研究のために用
い、なぜならこれらはＭＢＰ（１−１３）のみの存在下
において、即ち、抗原表示細胞（ＡＰＣ）なしで平面膜
上に特徴的なコロニーを形成するからである。ＡＪ１．
２細胞とＩ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−１３）との５時間にわ
たるインキュベーションは、Ｉ−Ａｋ又は倍地単独とイ
ンキュベートした細胞に比して、平面膜上に形成される
コロニーの数を阻害した。第２の実験において、ＡＪ
１．２細胞をＩ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−１３）を含むリポ
ソームと、又はＩ−Ａｋのみと５時間にわたってインキ
ュベートし、そして平面膜を前記の通りに調製した。清
浄剤可溶化Ｉ−ＡｋＭＢＰ（１−１３）について前述し
た通り、細胞をＩ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−１３）を含むリ
ポソームと一緒に培養することは、Ｉ−Ａｋのみを含む
リポソームとインキュベートした細胞に比して、コロニ
ーの数を減少させた。コロニーは正確に測定できなかっ
たが、その数におけるはっきりとした差が認められた。 【０１８３】これらの研究はＴ細胞クローンの機能に対
するＩ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−１３）の効果の定量を可能
としなかったため、我々はＡＰＣ及びＭＢＰ（１−１
３）の存在下における４Ｒ３．４又はＡＪ１．２細胞の
増殖に対するこの複合体の予備インキュベーションの効
果を調べた。従って、４Ｒ３．４又はＡＪ．１細胞を５
０〜１００μｌのＩ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−１３）、Ｉ−
Ａｋ、又は倍地のみと３７℃で５時間にわたり予備イン
キュベーションした。これらの細胞を適当な濃度へと希
釈し、そしてＡＰＣに加えた。抗原〔ＭＢＰ（１−１
３）〕を１３．３μｍ〜５３．２μｍに範囲する最終濃
度となるように加えた。 【０１８４】本研究において用いたＡＰＣは雌のＡ／Ｊ
マウスの脾臓から調製した。簡潔すると、脾臓を取出
し、そして個別の細胞懸濁物を、滅菌顕微鏡スライドの
急冷先端の間で緩やかに裂くことによって用意した。赤
血球を低張ショックで溶解させた。残留細胞を抗生物質
を含むＲＰＭＩで２回洗い、そして１０μｇ／ｍｌのミ
トマイシンＣと３７℃で１時間インキュベートした。こ
のインキュベーションに続いて、脾臓細胞を抗生物質を
含むＲＰＭＩで５回洗い、計測し、そしてＡＰＣとして
用いた。細胞とＡＰＣ及びＭＢＰ（１−１３）の７２時
間インキュベーションの後、増殖の程度をＭＴＴ取込み
を用いて定量した。研究１，３及び４においては、４Ｒ
３．４細胞を上記の通りにインキュベートした。研究２
においては、４Ｒ３．４細胞を、Ｉ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１
−１３）又はＩ−Ａｋのみを含むリポソームと予備イン
キュベートした。次にＴ細胞を１０％のフィコール溶液
を通じて遠心により未結合リポソームから分け、洗い、
そして増殖アッセイに利用した。研究５〜８はクローン
ＡＪ１．２なしで実施した。Ｉ−Ａｋのみとインキュベ
ートさせた細胞は倍地中で培養した細胞と同程度に増殖
した。この方法で予備インキュベートさせたＴ細胞クロ
ーンはＡＰＣの非存在下で増殖しなかった。 【０１８５】上記で示すデーターは、クラスＩＩ ＭＨ
Ｃ＋ＭＢＰ（１−１３）の複合体か、ＭＢＰ（１−１
１）に特異的なＴ細胞クローンにおける劇的な非応答性
を誘発することを示した。更に、このデーターが示すに
は、この複合体はＭＢＰ−刺激型Ｔ細胞クローンと免疫
学的に反応性であり、それ故それに結合する。 【０１８６】ヒトＨＬＡ−ＤＲ２−ＭＢＰ複合体の調製
及び安定性 ＨＬＡ−ＤＲ２に対するヒトＭＢＰ（８３−１０２）ペ
プチドの最大結合のための最適ｐＨはｐＨ７と決定され
た。ホモ接合リンパ球芽球症細胞由来のアフィニティー
精製ＤＲ２を１０倍過剰量の放射性ヨウ素化ＭＢＰ（８
３−１０２）ペプチドと３７℃で４８時間にわたり、様
々なｐＨでインキュベートせしめた。未結合のペプチド
を透析により除去し、次いで結合ペプチドの量をシリカ
ゲルＴＬＣアッセイから計算した。サンプルを還元及び
非還元ポリアクリルアミドゲルで分析もした。バンドを
切り出し、計測し、そして結合ペプチドの量を比活性よ
り計算した。 【０１８７】ヒトＤＲ２−ＭＢＰ（８３−１０２）複合
体の安定性も４℃で調べた。ＤＲ２と１２５１−ＭＢＰ
（８３−１０２）との複合体を前記の通りに調製し、そ
して４℃で保存した。毎週、１μｌのアリコートをトリ
プリケートでシリカゲルＴＬＣプレート上に適用した。
プレートを流し、展開し、そして％解離を計算した。４
２日間にわたり、この複合体の有意な解離は認められな
かった。 【０１８８】実施例２ 自己免疫機能不全を有する個体からのＢ細胞のＥＢＶ形
質転換 自己免疫機能不全を有する個体由来の末梢血液単核細胞
（ＰＢＭＮＣ）を、全血又はバッフィーを滅菌リン酸緩
衝食塩水（ＰＢＳ），ｐＨ７．２で１：１に希釈し、こ
の懸濁物をフィコールーヒパックの上に載せ、次いで卓
上型遠心器で１８００〜２０００ＲＰＭにて２０分間遠
心することにより単離した。フィコールーヒパックとＰ
ＢＳ−血漿の界面のバンドにあるＰＢＭＮＣをピペット
で回収し、そしてＰＢＳで２回洗った。細胞を１０％の
胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０の中で５×
１０６細胞／ｍｌに再懸濁し、ポリスチレンフラスコの
中でプレートし、そして３７℃で１時間インキュベート
して単球を除去した。非付着細胞を集め、遠心でペレッ
ト化し、そしてＣａ＋＋−Ｍｇ＋＋を含まず、１５％の
ＦＢＳを含むダルベッコＰＢＳの中で１０×１０６細胞
／ｍｌで再懸濁させた。ＡＥＴ−ＳＲＢＣ（２％ｖ／
ｖ）をＰＢＭＣと１：１で混合し、この混合物を１００
×ｇで２０分間遠心し、次いで氷上で１時間インキュベ
ートした。このペレットを緩やかに再懸濁し、そしてこ
の懸濁物を先に記載の通りフィコールーヒパックを介し
て遠心した。Ｂ細胞及び残留単球を含むバンドを回収し
た。 【０１８９】Ｂ細胞の形質転換はＢ９５−８細胞系（Ｗ
ａｌｌｓとＣｒｏｗｆｏｒｄのＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ
ｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｇ．
Ｃ．Ｂ．Ｋｌｕａｓ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）で行っ
た。Ｂ９５−８細胞を倍地の中に１：３で希釈し、そし
て３７℃で５日間培養した。この上清液を集め、２５０
×ｇで１５分間遠心し、そして０．４５ミクロンのミリ
ポアフィルターで濾過した。次にＥＢＶを１０，０００
ＲＰＭで２時間、４℃で遠心により濃縮し、そしてウィ
ルスを含むペレットを１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １
６４０の中にもとの容量１％で懸濁した。 【０１９０】Ｂ細胞を形質転換させるため、このウィル
スストックを２×１０６の細胞を含む培養倍地で１：９
に希釈した。４℃で１〜２時間ウィルスを細胞に吸収さ
せた後、この細胞を２５０×ｇで遠心した。得られる細
胞ペレットを約０．７×１０ ６〜７．０×１０６細胞／
ｍｌで、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０に懸
濁した。形質転換細胞を標準方法によりクローンした。 【０１９１】この手順で作った形質転換Ｂ細胞はヒトＭ
ＨＣ糖タンパク質の単離のために適切である。 【０１９２】実施例３ マウスにおけるＥＡＥの誘発 Ｔ細胞クローンＡＪ１．２及び４Ｒ３．４の養子移入並
びにＭＢＰ（１−１３）によるマウスの免疫化はマウス
がＥＡＥを発症する原因となる。 【０１９３】ＥＡＥを、完全ＭＢＰによるマウスにおけ
るＥＡＥの誘発に関する方法を利用してペプチドで誘発
させた。簡潔すると、ＭＢＰ（１−１３）をＰＢＳの中
に溶かし、次いで完全フロインドアジュバントと強く混
合して厚みのある乳濁物を形成せしめた。雌のＡ／Ｊマ
ウスに１００μｇのこの混合物をわき腹に４箇所で注射
した。２４及び７２時間後、４００ｎｇの百日咳毒素を
静脈内注射した。ＥＡＥの発症及び死亡率について２種
の個体によりマウスを毎日観察した。図１７における結
果は、ＭＢＰ（１−１３）による免疫化に由来するマウ
スにおけるＥＡＥの発症を示す。 【０１９４】ＥＡＥの養子移入のため、ＭＢＰ（１−１
１）による免疫後のマウスＢ１０Ａ（４Ｒ）株から獲得
したＴ細胞クローン４Ｒ３．４を用いた。Ｂ１０Ａ（４
Ｒ）マウスに３５０ｒａｄの全身放射量を付し、次いで
４００ｎｇの百日咳毒素を静脈内注射した。２〜３時間
後、３日前にＭＢＰ（１−１３）で刺激せしめた１０×
１０６の４Ｒ３．４細胞を静脈内注射した。ＥＡＥの候
症及び死亡率についてこれらの動物を１日２回観察し
た。この研究の結果を図１８にまとめた。 【０１９５】実施例４ Ｉ−Ａｓ−ＭＢＰ（９１−１０３）複合体によるＥＡＥ
の下降制御 本実施例は、本発明の複合体によるインビボ治療が受動
誘発型ＥＡＥの予防をもたらすことを実証する。更に、
この治療は処置動物の死亡率及び病的状態を有意に下げ
る。 【０１９６】Ｉ−Ａｓ／ＭＢＰ（９１−１０３）による
処置がＴ細胞の活性化に従うＥＡＥの発症を防ぐであろ
うことを実証するため、ＳＪＬマウスにインビボでＭＢ
Ｐ（９１−１０３）反応性Ｔ細胞ブラストを注射した。
簡潔すると、生後１０〜１２週目のＳＪＬマウスに完全
フロインドアジュバント中の４００μｇのＭＢＰ（９１
−１０３）（Ａｃ−ＦＦＫＮＩＶＴＰＲＰＰＰ−アミ
ド、純度＞９５％）を背中で免疫した。１０〜１２日
後、局所的漏出リンパ腺細胞を集め、そして２４穴プレ
ート（Ｆａｌｃｏｎ）の中で、１０％の胎児中血清、１
％のペニシリン／ストレプトマイシン及び５０μｇ／ｍ
ｌのＭＢＰを含む１．５ｍｌのＲＰＭＩ １６４０倍地
中で６×１０６細胞／ウェルの濃度で培養した。４日間
のインビトロ刺激に続いて、ＭＢＰ（９１−１０３）反
応性Ｔ細胞ブラストをフィコールーヒパック勾配（Ｈｙ
ｐａｑｕｅ １０７７，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を介して集
め、そして標準技法に従ってＰＢＳで２回洗った。約
１．３〜１．５×１０７の細胞を各マウスに注射した。 【０１９７】起脳炎ＭＢＰ（９１−１０３）反応性Ｔ細
胞を受容したマウスに、次に１００μｌのＰＢＳ中の１
００μｇの可溶性Ｉ−Ａｓ／ＭＢＰ（９１−１０３）複
合体、１００μｌのＰＢＳ中の１００μｇのＩ−Ａｓ／
ＭＢＰ（１−１４）（ＳＪＬマウスにおいて起脳炎性で
ないペプチド）、又はＰＢＳのみのいづれかを、０，３
及び７日目にて受容させた（全投与量は３００μｇ）。
ＥＡＥの臨床的徴候について動物を毎日観察して等級付
けした：１級、尾の色調の欠失；２級、後足の弱体化；
３級、後足の麻痺；４級、ひん死状態；５級、死亡。動
物取扱い協会の規則に従い、自分自身で食事を取ること
のできないマウスは殺した。 【０１９８】Ｉ−Ａｓ／ＭＢＰ（９１−１０３）複合体
を受容した７匹のマウスのうちの１匹のみが１６日目に
臨床的ＥＡＥを発症した（図１９）。他方、Ｉ−Ａｓ／
ＭＢＰ １−１４を受容した４匹の動物全て及びＰＢＳ
を受容した７匹の動物のうちの６匹に麻痺が生じた。前
者のグループにおいて、障害の発生の平均は９．７日目
であり、そして後者のグループにおいては９．０日目で
あり、平均重症度（ｍｅａｎ ｓｅｖｅｒｉｔｙ）はそ
れぞれ２．３及び２．７であった。 【０１９９】Ｉ−Ａｓ対立遺伝子により表示されるその
他の自己抗原が障害誘発を阻止できないことも実証す
る。ＳＪＬマウスを、完全フロインドアジュバント中の
プロテオリポタンパク質（ＰＬＰ）のペプチド１３９−
１５１で免疫してＥＡＥを誘発せしめた。ＳＪＬマウス
は、ＰＢＳに溶かし、次いで４ｍｇ／ｍｌのミオバクテ
リア チューバキュロシス（Ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒａを含む完全フ
ロインドアジュバントと１：１の比で混合したペプチド
で免疫した。動物に１５２μｇのペプチドを両わき腹に
おいて皮下注射し、この投与量は１００％の動物にＥＡ
Ｅを誘発せしめることが見い出されている量である。同
じ日及び４８時間後に、全ての動物に４００μｇの百日
咳毒素を静脈内的に付与した。マウスを前述の通りに免
疫後１，４及び７日目にＰＢＳ，１５μｇのＩ−Ａｓの
み、又は１５μｇのＩ−Ａｓ＋ＰＬＰ（１３９−１５
１）で処置した。 【０２００】表１に示す通り、適当なＩ−Ａｓ／ＰＬＰ
（１３９−１５１）ペプチド複合体を受容した動物は、
アジュバント中のペプチドでの免疫により誘発される重
症な急性麻痺障害から守られていた。Ｉ−Ａｓ／ＰＬＰ
ペプチド処置グループにおいて死亡は認められなかっ
た。６匹の動物に麻痺が生じたが、麻痺した動物の平均
重症度は２．２であり、そして発症日は１０．６であっ
た。他方、Ｉ−Ａｓ複合体のみを受容した６匹の動物全
ては死亡し、発症の平均日は８．２日であった。５匹の
動物が１１日目に死亡し、そして１匹の動物が２１日目
に死亡した。食塩水を受容した、又は処置されていない
動物は８７％の死亡率であり、そして発症の平均日は
９．７（ｐ＜０．０００１ Ｉ−Ａｓ／ＰＬＰ（１３９
−１５１））であった。 【０２０１】 【表１】 我々の観察が示唆するには、Ｉ−Ａｓ／ＭＢＰ（９１−
１０３）複合体（３００μｇ）によるインビボ治療は受
動誘発型ＥＡＥの予防をもたらす。更に、４５μｇのＩ
−Ａｓ／ＰＬＰ（１３９−１５１）による治療は、この
治療を受けた動物の死亡率及び病的状態を有意に下げ
た。 【０２０２】本発明の複合体を、マウスにおけるＥＡＥ
の再発を防止する能力についても試験した。これらの実
験において、ＳＪＬマウスは０日目にて１．２×１０７
ｐ９１−１０３反応性Ｔ細胞を腹腔内的に受容した。
８〜１２日目の間に初期麻痺徴候が発症し、そして全て
の動物は２２日目まで少なくとも２級の臨床級にまで回
復した。マウスは２７，３７及び４７日目に５０μｇの
ＭＨＣ複合体（同系のペプチドを有する及び有さな
い）、又はＰＢＳを静脈内的に受容した。実験１におい
ては、マウスを１０２日間にわたって観察し、そして実
験２においては、それらを１１２日間にわたって観察し
た。結果は、同系ペプチドを有する複合体は再発を防ぐ
うえでコントロールよりも有意により有効であることを
示唆した。 【０２０３】実施例５ ＭＨＣ ＩＩ−ＨＳＰ（１８０−１８８）複合体による
ＲＡの下降制御 ルイスラットは、不完全フロインドアジュバント中に乳
濁せしめたミオバクテリア チューバキュロシスの皮下
注射に応答して、関節炎、通称アジュバント関節炎の状
態を発症する。この関節炎のモデルは、リウマチ型関節
炎の処置のために開発される薬剤の薬効を評価するのに
必要な数多くの評価を可能とする。組織の病理性、並び
に単球及びリンパ球細胞の浸潤は強力なＴ細胞仲介応答
を示唆する。ここで説明する実験は、ペプチド−ＭＨＣ
クラスＩＩ複合体を認識し、且つ、結合するペプチド−
特異的Ｔ細胞をアネルギー化する技術を利用する。この
研究は、この障害の誘発のすぐ後での可溶性ＭＨＣクラ
スＩＩ−ペプチド複合体によるインビボ処置を包括す
る。この結果は、食塩水処置を受けたグループに比して
の、ＭＨＣクラスＩＩ−ペプチド処置ラットにおける骨
退化の有意な低下を示した。 【０２０４】ルイスラットＭＨＣクラスＩＩ ＲＴ１Ｂ
及びＲＴ１Ｄ分子を、セファロース４Ｂカラムに結合さ
せたＯＸ−６及びＯＸ−１７モノクローナル抗体によ
り、脾臓細胞膜のＮＰ−４０抽出物からアフィニティー
精製した。ＲＴ１Ｂ、対、ＲＴ１Ｄの相対収率は１：２
であった。ＭＨＣクラスＩＩ分子にこのペプチドを、５
６μｇのＲＴ１Ｂ及び１１３μｇのＲＴ１Ｄ分子を５０
倍モル過剰量のヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）ペ
プチド、ｐ（１８０−１８８）を３７℃で４８時間にわ
たり、１％のオクチルグルコシドを含む全容量１ｍｌの
リン酸バッファーｐＨ７．５の中で混合することによっ
て負荷せしめた。未結合ペプチドを、４℃でＰＢＳバッ
ファーに対してこのサンプルを長い間透析することによ
って除去した。この最終複合体濃度は１７０μｇ／ｍｌ
であり、そしてＷｈｉｔｔａｋｅｒＢｉｏｐｒｏｄｕｃ
ｔ，Ｉｎｃ．により記載のリムルス アメボサイト（Ｌ
ｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ）リゼート手順によ
り試験した通り、エンドトキシンを有さなかった。 【０２０５】６匹の雄のルイスラット（生後７７日目）
に、関節炎を誘発するために両後足に、不完全フロイン
ドアジュバント中の１ｍｇのミコバクテリア チューバ
キュロシスを注射した。３匹のラットは、障害の誘発か
ら１，４及び７日後にＭＨＣクラスＩＩ＋ＨＳＰ１８０
−１８８複合体を静脈内的に処置した。他の３匹のラッ
トには上記の通りに食塩水を与えた。関節炎指数を全体
外観により決定し、そして以下の基準に従った：０）変
化なし；１）指の接合部に若干の変化；２）若干から軽
い足の水腫又は２本以上の指の膨らみ；３）若干のかさ
ぶたを伴う足の膨らみ、足の指及び爪の軽い硬化；４）
足のひどい膨らみ、著しいかさぶた、及び著しい足の指
及び爪の硬化。 【０２０６】ＭＨＣクラスＩＩぺプチド又は食塩水で処
置したラットは２０日目にそれらのほとんどの足に、４
の関節炎指数の膨らみを有していた。何匹かのラットの
足において見られる膨らみの相違は注射したＭＴの量に
反映するようである。しかしながら、障害の誘発から３
５日後に足のラジオグラフを得たとき、ＭＨＣクラスＩ
Ｉペプチド処置と食塩水処置グループとの間に有意な差
は認められなかった。 【０２０７】第２の実験において、１８匹の動物を５週
間にわたって障害の進行中に処置した。表２に示す通
り、本発明のＭＨＣ−ペプチドで処置した動物は大いに
低められた関節炎指数及び有意に低められた接合部の膨
らみを、食塩水処置グループに比して有していた。動物
は４，８及び１２日目に２５μｇのＭＨＣペプチドを受
容した。 【０２０８】 【表２】３５日目に、全ての動物の足根骨接合物をノギスを用い
て測定した。測定値は両後足の厚みの合計を示す。 【０２０９】実施例６ 複合体の血清半減期の上昇 本実施例は該複合体の様々な改質が血清半減期の上昇を
もたらすというデーターを示す。 【０２１０】これらの研究のためのプロトコールは一般
に下記の通りである：アフィニティー精製した可溶性Ｍ
ＨＣ分子をヨードビーズ法（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により
１２５Ｉでラベルした。過剰の１ ２５Ｉは０．１％の中
性清浄剤を含むＰＢＳに対する透析により除去した。ラ
ベル化タンパク質の性状を薄層クロマトグラフィー、セ
ルロースアセテート電気泳動及びポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により評価した。マウスにＭＨＣ糖タンパク
質を尾静脈注射により投与し、このマウスは注射の少な
くとも一日前に飲料水中のルゴール溶液を付してある。
様々な時点で血液サンプルを採血した。注目の器官を得
るためにこれらの動物を殺した。血液及び器官のサンプ
ルにおける放射活性を標準技術に従ってガンマーウェル
カウンターで検出した。 【０２１１】Ａ．血清半減期に対するアンアロレツイン
の効果 ＩＡｋをラベルし、そして前記の通りにマウスに投与し
た。 【０２１２】これらのマウスを３通りのセットに分け
た：（１）Ｉ−Ａｋ（１０μｇ静脈内）；（２）Ｉ−Ａ
ｋ（１０μｇ静脈内）＋アシアノレツイン（１０ｍｇ静
脈内）＋アンアロレツイン（１００ｍｇ腹腔内）；及び
（３）Ｉ−Ａｋ（１０μｇ静脈内）＋アシアロレツイン
（１０ｍｇ腹腔内）。血流を様々な時点で抜き取り、そ
して血液中に保持された注射投与量の％を計算した。 【０２１３】３通りのセットの平均血清半減期は下記の
通りであった： セット１−３分。 【０２１４】セット２−４０分。 【０２１５】セット３−３５分。 【０２１６】Ｂ．血清半減期に対するリポソームの効果 Ｉ−Ａｓを前記の通りラベルした。このラベル化Ｉ−Ａ
ｓ分子を標準の技術によってリポソームの内側に捕促さ
せた（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、前掲を参照のこ
と）。前述の通りに１０匹のマウスに１０μｇのＩ−Ａ
ｓを注射し、そして４通りのセットに分けた；（１）Ｉ
−Ａｓのみ；（２）リポソームＩ−Ａｓ；（３）ブラン
クリポソームを一緒に注射するリポソームＩ−Ａｓ；及
び（４）ブランクリポソーム＋、１０分後にブランクリ
ポソームと一緒に注射するリポソームＩ−Ａｓ。注射後
様々な時点で血液サンプルを採取し、そして血液中に保
持されたＩ−Ａｓの注射投与量の％を計算した。 【０２１７】３通りのセットの血清平均半減期は下記の
通りであった： セット１−２分。 【０２１８】セット２−７分。 【０２１９】セット３−１０分。 【０２２０】セット４−６０分。 【０２２１】Ｃ．血清半減期に対する過ヨウ素酸／シア
ノボロハイドライド処理の効果 ３ｍＭのタウロデオキシコレートを含むリン酸バッファ
ー，ｐＨ７．５中のＩ−Ａｋを前述の通りにラベルし
た。このラベル化分子を過ヨウ素酸及びシアノボロハイ
ドライド還元に４℃で５又は２１時間、０．１Ｍの酢酸
バッファー，ｐＨ５．５中での２０ｍＭの過ヨウ素酸ナ
トリウム及び４０ｍＭのシアノボロハイドライド（最終
濃度）を用いて処理した。この反応をエチレングリコー
ル（最終濃度０．７％）の添加により止めた。処理した
Ｉ−Ａｋを透析により精製し、次いで前述の通りにマウ
スに投与した（１０μｇ静脈内）。９匹のマウスを３通
りのセットに分けた：（１）Ｉ−Ａｋ（未処理）；
（２）Ｉ−Ａｋ（５ｈｒ．処理）；及び（３）Ｉ−Ａｋ
（２１ｈｒ．処理）。様々な時点で血液サンプルを獲得
し、そして血液中に保持された注射投与量の％を計算し
た。 【０２２２】３通りのセットの血清半減期は下記の通り
であった： セット１−４分。 【０２２３】セット２−７分。 【０２２４】セット３−７０分。 【０２２５】実施例７ 以下に紹介する結果は、本発明のＭＨＣペプチド複合体
が清浄剤なしでは凝集体として主に存在していることを
示している。 【０２２６】１２５ＩでラベルされたＩＡｋ−Ｐ複合体
を前述の通りに調製した。この複合体（１．５ｍｇ／ｍ
ｌ）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して長く透析し
て清浄剤を除去し、そして６ｍｌｂ．ｖ．のセファデッ
クス−Ｇ２００カラムに載せた（分画サイズ５０００〜
６００，０００）。図２０に示す結果は、凝集した複合
体がカラムをボイドボリュームにて通過することを示
し、従ってこれは６００，０００より大きい分子量を有
することになる。 【０２２７】同様に透析したＩＡｋ複合体（１．５ｍｇ
／ｍｌ）も遠心し、そしてそのペレットを計測した。こ
れを行うため、２００ｍｌの複合体（３００μｇ）を５
ｍｌのＰＢＳに希釈し、そして固定角度ローターで１０
０，０００×ｇで６０分間遠心した。この結果を下記の
表３に示す。 【０２２８】 【表３】 クロマトグラフィー及び遠心実験の両方の結果は、ＭＨ
Ｃ−ペプチド複合体が凝集又はミセル状でほとんど存在
していることを示す。これらの結果は、本発明の単一サ
ブユニット複合体も、清浄剤なしでは凝集又はミセル状
にあることを強く示唆している。 【０２２９】実施例８ 本実施例は、可溶化ＭＨＣクラスＩＩ−ＡｃｈＲのαペ
プチド１００−１１６複合体の投与がＡｃｈＲ−反応性
Ｔ細胞の機能を変更し、そしてこのことにより、ＥＡＭ
Ｇ、すなわち、抗体に仲介されるがＴ細胞依存性の自己
免疫疾患の経過を調節する。 【０２３０】ＡｃｈＲ及びＡｃｈＲペプチド トルペド カリホルニカ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｍａ
ｒｉｎｅ））由来のエレクトロプラクス組織をホモナイ
ズし、そしてその膜分画を界面活性剤（２％のＴｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００，１００ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭの
ＭＯＰＳ，０．１ｍＭのＥＤＴＡ，０．０２％のＮａＮ
３）により可溶化した。抗−ＡｃｈＲモノクロナール抗
体ｍＡｂ３５を用いたアフィニティー・クロマトグラフ
ィーによりこの可溶化膜からＡｃｈＲを単離し、そして
１．０％ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（Ｏ
Ｇ）／ＰＢＳに対し透析した。 【０２３１】トルペドＡｃｈＲサブユニット・ペプチド
１００−１１６（ＹＡＩＶＨＭＴＫＬＬＬＤＹＰＧＫ
Ｉ）を、標準的な手順を使用して、固相９−フルオレニ
ルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）手順により合成し
た。このペプチドを、逆相ＨＰＬＣにより精製し、そし
てＨＰＬＣ及び質量分析法により特徴付けした。 【０２３２】ラットＭＨＣ ＩＩの精製及びペプチド装
填 ラットのクラスＩＩ ＲＴ１．Ｂ及びＲＴ１．Ｄ分子
を、均一化した脾臓から、界面活性剤（０．５％のＮＰ
−４０，１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．３，１
ｍＭのＰＭＳＦ，０．０２％のＮａＮ３）により可溶化
し、そしてモノクロナール抗体ＯＸ６及びＯＸ７を用い
たアフィニー・クロマトグラフィーにより精製した。こ
のＲＴ１．Ｂ／Ｄ混合物を、３７℃で、２４時間、５０
倍のモル数過剰のペプチドＡｃｈＲα １００−１１６
と共にインキュベートし、次に、未結合のペプチドを除
去するために、０．１％のＯＧ／ＰＢＳに対し、４℃で
の透析を２４時間行った。ニトロセルロース・フィルタ
ー結合及びＴＬＣによる分析（Ｂ．Ｎａｇら（１９９
１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１４２：１０５）
により、ＲＴ１．Ｂの７０〜８０％及びＲＴ１．Ｄの９
０〜１００％がペプチドＡｃｈＲα １００−１１６に
結合したことが明らかとなった。この複合体は、４℃
で、少なくとも８週間安定であった。 【０２３３】ＥＡＭＧの誘発及び可溶化ＭＨＣ ＩＩ：
ＡｃｈＲα １００−１１６による治療 雄のＬｅｗｉｓラット（生後８〜１２週間）に、完全ｆ
ｒｅｕｎｄのアジュバント中で乳化したＴｃ ＡｃｈＲ
を、両方の後ろ足に、そして腹膜中に６００ｎｇの百日
咳毒を注射した。病気（臨床段階１〜３）のラットを、
湿った食べ物で飼養し、そして歯を、一週間おきに切り
取った。 【０２３４】ＡｃｈＲ免疫化後、１，４及び７日目に、
個々のラットに、生理食塩水、２５μｇのＭＨＣ ＩＩ
単独（ＭＨＣ ＩＩ：０）、又は２５μｇのＴ．ｃ．Ａ
ｃｈＲαペプチド１００−１１６と複合体化したＭＨＣ
ＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ：ＡｃｈＲα １００−１１６）
を、静脈中に投与した。Ｔ細胞を、ＡｃｈＲ免疫化後９
日目に、膝窩のリンパ節から精製し、そして抗原のパネ
ルに対する増殖についてテストした。 【０２３５】Ｔ細胞増殖検定 末梢リンパ節由来のＴ細胞を、ナイロン・ウール・クロ
マトグラフィーにより単離した。２×１０５のＴ細胞及
び３×１０５の照射された同系の脾臓細胞を、０．２ｍ
ｌの培養培地（ＲＰＭＩ １６４０，１０％のＦＢＳ，
１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，５×１０−５Ｍの２−ＭＥ，１
００Ｕ／ｍのペニシリン、１００Ｕ／ｍのストレプトマ
イシン）中で、ペプチド又は全抗原と共に、３日間３７
℃，５％ＣＯ２の下で、インキュベートし、１μＣｉの
３Ｈ−チミジンにより１８時間、パルス照射し、そして
カウントした。 【０２３６】ＬｅｗｉｓラットにおけるＥＡＭＧの時間
経過 Ｔ．ｃ．ＡｃｈＲによるＬｅｗｉｓラットの免疫化は、
予め予期できる時間経過を伴って体重の減少及び筋肉の
弱体化の進行を引き起こす抗−ＡｃｈＲ抗体を誘導す
る。免疫化後一週間内の体重の減少は、単核細胞による
神経筋接合への浸潤が原因の「急性期」と同時に起こ
る。第二の、持続性の体重減少は、３３〜４０日目に始
まり、これは、ヒト患者におけるＭＧに似た臨床的症状
を伴った「慢性期」である。個々のラットの体重の変化
を、病気の始まり、進行、そして死期の範囲（横座標と
の交差により示される）を説明するために示す。 【０２３７】未処理のラットにおいては、進行性ＥＡＭ
Ｇは、３段階に分類できる。段階１においては、抗−Ａ
ｃｈＲ抗体は、ＡｃｈＲのエンドサイトーシスを引き起
こす。神経筋接合での閾値以下のレベルのＡｃｈＲは、
特に後方の筋肉において、筋肉の収縮を減少させる。弱
い背中及び後ろ足の筋肉は、特徴的なネコ背を引き起こ
す。段階２においては、首の筋肉における弱さにより頭
が支えられない状態での頻繁な休眠期間を引き起こす進
行した弱さを特徴とする。段階３においては、横隔膜及
び肋間の筋肉が弱り、苦しみながらの呼吸を引き起こ
す。下顎骨の筋肉の衰退は、過大な歯の成長を導く。 【０２３８】可溶化ＭＨＣ Ｉ：ＡｃｈＲα １００−
１１６の治療的効果をテストするために、臨床的な症状
が上記の慢性期において現れた後に、ラットを治療し
た。 【０２３９】可溶化ＭＨＣ ＩＩ：ＡｃｈＲα １００
−１１６により誘発される抗原特異的な非応答性 生理食塩水処理ラットにおいて、Ｔ細胞のＡｃｈＲαペ
プチド１００−１１６に対する応答は、ＡｃｈＲ（α２
βγδ）（図２１）に対する応答の３０％に等しく、１
００−１１６がＡｃｈＲに応答性のＴ細胞内の主要なエ
ピトープであるという文献報告を確信させるものであ
る。ＭＨＣ：０処理ラット由来のＴ細胞は、生理食塩水
処理ラット由来のＴ細胞同じようなレベルで、それぞれ
の抗原に対し応答する。 【０２４０】ＭＨＣ ＩＩ：ＡｃｈＲα １００−１１
６処理ラットの全Ｔｃ ＡｃｈＲ及びＡｃｈＲα１００
−１１６に対するＴ細胞応答は、生理食塩水処理ラット
のＴ細胞増殖レベル（図２１）のそれぞれ、２２％及び
２０％であった。百日咳毒に対しての、ＭＨＣ ＩＩ：
ＡｃｈＲα １００−１１６処理ラット由来のＴ細胞の
増殖は、生理食塩水及びＭＨＣ ＩＩ：０処理ラット由
来のＴ細胞と同じであり、このことは、Ｔ細胞の不活性
化が抗原特異的であるということを示している（図２
１）。 【０２４１】可溶化ＭＨＣ ＩＩ：ＡｃｈＲα １００
−１１６の治療効果 臨床段階１のＥＡＭＧ（接種後約４２〜５６日目）のラ
ットのランダム群に、静脈中に、５週間間隔で、生理食
塩水、２５μｇのＭＨＣ ＩＩ：ＨＳＰ １８０−１８
８（無関係のヒートショックペプチドを含むＭＨＣ Ｉ
Ｉ）、２５μｇのＭＨＣ ＩＩ単独（ＭＨＣ ＩＩ：
０）、又は５μｇのＡｃｈＲα １００−１１６単独
（０：ＡｃｈＲα １００−１１６）を、注射した。体
重及び臨床的な症状を観察した。 【０２４２】ＭＨＣ ＩＩ：ＡｃｈＲα １００−１１
６による臨床段階１のＥＡＭＧのラットの治療は、誘発
後、１４０日目に６７％の生存率を生じさせた。これに
反し、その対照群内の最大生存率は、２０％（１６．７
％の生理食塩水、０％のＴｃＡｃｈＲ α １００−１
１６単独、２０％のＭＨＣ ＩＩ単独、２０％のＭＨＣ
ＩＩ：ＨＳＰ１８０−１８８）であった。それぞれの
治療群における代表ラットについてのＥＡＭＧの時間経
過を、表４に示す。 【０２４３】４匹の生存ＭＨＣ ＩＩ：ＡｃｈＲα １
００−１１６処理ラットは、比較的重症のＥＡＭＧ（最
大値２．０，２．５，２．５及び３．０）を、その後
の、最初の治療的注射後約３週間目の緩解傾向を示し
た。 【０２４４】 【表４】 それぞれの処理群からの代表ラットを、ＡｃｈＲ免疫化
によるＥＡＭＧ誘発後６１，１２３及び２２４日目につ
いて示す。それぞれのラットの臨床段階を示す。１２３
日目までに、上記のＭＨＣ ＩＩ：ＡｃｈＲα １００
−１１６処理ラットは、ＭＨＣ ＩＩ：ＨＳＰ １８０
−１８８により治療された上記の長く生存したラットに
比べ、回復した動作及び姿勢を示している。 【０２４５】これらの結果は、ＥＡＭＧ誘発の初期に注
射された可溶化ＭＨＣ ＩＩ：ＡｃｈＲα １００−１
１６複合体がＡｃｈＲαペプチド１００−１１６にそし
て全ＡｃｈＲに対し応答するＴ細胞を有意に減少させる
ことを示している。可溶化ＭＨＣ ＩＩ：ＡｃｈＲα
１００−１１６複合体の効果は、抗原特異的である、な
ぜなら、この複合体は、無関係の抗原である百日咳毒に
対するＴ細胞に影響を与えないからである。ＥＡＭＧの
慢性期の間の可溶化ＭＨＣ ＩＩ：ＡｃｈＲα１００−
１１６複合体による治療は、この病気の死亡率及び臨床
的な症状を減少させる。 【０２４６】実施例９ 本実施例は、本発明の複合体が重症筋無力症（ＭＧ）に
関連するヒトＴ細胞におけるアネルギーを誘導する能力
を示す。 【０２４７】本実験におけるＴ細胞は、若い初期ＭＧ患
者の胸腺由来のものであった。それらは、残基１３８−
１６７のＡｃｈＲαサブユニットを認識し、そしてＤＲ
４Ｄｗ４により制限される。本実験においては、２×１
０４のＴ細胞を、各種の時間の間、複合体（ＤＲ４：ｐ
１３８−１６７）、ＤＲ４単独、又はペプチド単独のい
ずれかと共に、予めインキュベートした。異なった抗原
によりパルス照射された抗原表示細胞（ＡＰＣ）を次に
添加し、そしてそのＴ細胞の増殖を先に記載したように
トリチウム含有チミジンを使用して測定した。上記の刺
激性抗原は、ｐ１３８−１６７及びｒ３７−１８１と名
付けられた組み換えにより製造されたＡｃｈＲαサブユ
ニット・ポリペプチドを含み、これは、Ｂｅｅｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ９：２１０１−２１０６
（１９９０）及びＢｅｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１７：２１９−２２０
（１９８９）（これらの両方が引用により本明細書中に
取む込まれる）の中に記載されているように調製され
た。 【０２４８】Ｔ細胞と１０μｇｍ／ｍｌの複合体との一
夜の前インキュベーションは、次に抗原を存在させたと
きに、このＴ細胞において非応答性を導く。低濃度での
且つより短い時間でのインキュベーションは、アネルギ
ーを誘導するときには、効果的でなかった。 【０２４９】アネルギー化細胞の生育能力を、トリパン
ブルーによりテストした。Ｔ細胞を、培地、又は５μｇ
／ｍｌの複合体、及び各種時間にカウントするために取
り出された部分と共にインキュベートした。細胞を、生
きているもの又は死んでいるもののどちらかとして、生
存細胞におけるトリパンブルー排除に基づきカウントし
た。結果を図２２Ａ及び２２Ｂ中に表す。培地とインキ
ュベートした細胞においては、細胞の全数は徐々に増加
したが、一方、死細胞の数は同じに残存した。複合体と
インキュベートした細胞においては、細胞の全数は最初
の６時間の間は急激にそしてその後はよりゆっくりと減
少した。死細胞の全数は、徐々に増加したので、インキ
ュベーション数日後には、細胞のほとんど９０％が死滅
した。これらの結果は、細胞の死がＴ細胞におけるアネ
ルギー誘導の結果として起こる。 【０２５０】上記複合体とＴ細胞との相互作用の特異性
をテストするために、Ｔ細胞（１×１０４）を、各種形
態の複合体と共にインキュベートした。これらは、関連
複合体ＤＲ４：ｐ１３８−１６７，ＤＲ４単独、等モル
（比例）量であるが一緒に結合しない「可溶化ＤＲ４及
び見せ掛けの（ｓｈａｍ）」ｐ１３８−１６７、並びに
ＤＲ４：ＭＢＰ ｐ１−１４複合体であった。見せ掛け
のペプチドを、可溶化ｐ１３８−１６７単独が上記複合
体と同じ効果があることを示した先の実験のように使用
した。見せ掛けのｐ１３８−１６７は、透析、そしてそ
れ故に上記複合体から放出されることができるいくつか
の可溶化ペプチドの効果について制御することを含むよ
うな上記複合体としての調製に供されたｐ１３８−１６
７のサンプルであった。一夜の前インキュベート後、照
射ＰＢＬ（２×１０５）及び刺激性抗原を添加した。 【０２５１】無関係の複合体とペプチドとの等価な濃度
は、アネルギーを誘導体しなかった。培地との一夜のイ
ンキュベーション及びその後のｒｅｃ α３７−１８１
による刺激は、良好な増殖応答を生じさせた。ＤＲ４：
ｐ１３８−１６７との前インキュベーションは、実質的
に次の増殖を減少させた。しかしながら、他の物質のい
ずれかとの前インキュベーションは、培地との前インキ
ュベーションに比べて、増殖に対して全く効果を及ぼさ
なかった。 【０２５２】各種の複合体との前インキュベーションの
効果に加えて、各種抗体を細胞表面マーカーに添加する
効果、又はＩＬ２ ０．５％をＤＲ４：ｐ１３８−１６
７との前インキュベーション時に添加する効果を研究し
た。抗−ＴＣＲ Ａｂ（抗−ＴＡＣ−７８６）の添加
は、上記複合体により引き起こされたバックグランド刺
激を抑制し、いかなる抗原誘導応答をも抑制し、そして
前インキュベーション後のＩＬ２による刺激に対する応
答をも部分的に抑制した。抗−ＤＲ Ａｂ（Ｌ１２３）
は、複合体との前インキュベーションにより誘導体され
た抗原誘導応答に対して全く効果を及ぼさなかった。抗
−ＴＡＣと抗−ＤＲとの組合せは、バックグランド増殖
を減少させたが、抗原誘導増殖はＩＬ２−誘導増殖に対
して全く効果を及ぼさなかった。上記Ｔ細胞の０．５％
のＩＬ２の存在中での複合体との前インキュベーション
は、その複合体の抑制効果を減少させなかった。 【０２５３】同様に、上記複合体の、非−ＤＲ４、非−
ＡｃｈＲ Ｔ細胞系に対する非特異的効果を同定するた
めに実験を計画した。ＫＬＨ又は破傷風毒素に対して作
られた系由来の細胞（２×１０４）を、上記複合体と共
に一夜、前インキュベートした。次にそれらを、照射Ｐ
ＢＬ（２×１０５）及び抗原により刺激を与えられた。
上記複合体との前インキュベーションは、特異的抗原に
対するバックグランド増殖応答に対するどんな効果もも
っていなかった。従って、この複合体は、無関係の細胞
系に対する、どんな非特異的な刺激性の又は抑制的な効
果ももっていないようである。 【０２５４】最後に、図２３Ａ及び２３Ｂは、アネルギ
ーを誘導するのに必要な複合体のモル濃度がペプチド単
独のものよりもはるかに低いことを示している。図から
分かる通り、１．７×１０−８を超える濃度でのｐ１３
８−１６７とのＴ細胞の前インキュベーションは、組み
換えに対する応答において減少をもたらした。低濃度で
の前インキュベーションは、培地との予備インキュベー
ション（はるか左）に比べて、背景増殖における増加を
引き起こした。１．７×１０−５の濃度に達するまで
は、増殖応答は、背景レベルまで低下しなかった。 【０２５５】１．７×１０−１１より高い濃度でのＤＲ
４：ｐ１３８−１６７とのＴ細胞の前インキュベーショ
ンは、抗原誘導増殖応答を抑制した。１．７×１０−８
を超える濃度では、この抗原誘導増殖は、バックグラン
ドレベルまで低下した。使用された複合体の最も低い濃
度、１．７×１０−１１は、抗原誘導増殖における増加
を、背景増殖における増加を、そしてＩＬ２に対する増
殖応答における増加をもたらした。 【０２５６】このように、複合体及びｐ１３８−１６７
単独の両方が、幾つかの刺激を引き起こす。より高い濃
度において、両者は、抗原特異的応答を抑制する。しか
しながら、相対的な抑制（すなわち、バックグランド刺
激のレベルに対する）のために必要なｐ１３８−１６７
の量は、ＤＲ４：ｐ１３８−１６７のものの約１０００
倍（モル数）であった。 【０２５７】先の例中に記載した結果は、本発明の複合
体がインビボにおける自己免疫疾患を治療する能力を示
している。これらのデータは、アネルギーの誘導を示す
インビトロにおけるデータと一緒になって、請求する複
合体の効果を確立している。本発明は、明確さと理解の
目的のために上記の例中で幾分詳細に記載されたが、添
付した請求項の範囲内で、特定の変更及び修正をするこ
とができることは言うまでもない。 【０２５８】 【発明の効果】インビトロ及びインビボ実験の両者に由
来する証拠は、かかる複合体が同系移植Ｔ細胞における
慢性アネルギーを誘発せしめることを確立する。 【０２５９】その他の観点において、本発明は薬理学的
組成物に向けられ、ここで本発明の複合体が活性成分で
ある。この組成物は自己免疫障害のような免疫応答に関
連する特定の抗原との免疫系反応の一部を下降制御する
のに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の典型的な複合体の図解であ
る。 【図２】図２は、ヒトＨＬＡ−Ａ２抗原（クラスＩ）の
三次元構造を示す。 【図３】図３は、改良クラスＩＩＭＨＣコード化糖タン
パク質の活性領域の図式である。 【図４】図４は、好ましい第二世代ＭＨＣタンパク質の
デザインを示す。 【図５】図５は、抗原表示細胞の表層を擬態した、ＭＨ
Ｃ糖タンパク質を含む平面膜二重層の図解である。 【図６】図６は、アセチルコリンレセプタータンパク質
のアルファーサブユニットに関するアミノ酸配列及びコ
ードＭＲＮＡを示す。 【図７】図７は、ミエリン塩基性タンパク質のアミノ酸
配列を示す。 【図８】図８は、Ｉ−Ａｂ−ベーター鎖をコードするヌ
クレオチド配列を示す。 【図９】図９は、Ｉ−Ａｂ−ベ−ター鎖をコードするヌ
クレオチド配列を示す。 【図１０】図１０は、ヒトにおけるＤＱ／ＤＲハプロタ
イプ及び関連の自己免疫障害のリストである。 【図１１】図１１は、自己免疫障害の診断及び／又は処
置のための本発明の複合体の利用に適するプロトコール
を示す。 【図１２】図１２は、ＮＤ−４０可溶性膜抽出物を含む
Ｉ−ＡＫの製造のための計画を示す。 【図１３Ａ】図１３Ａは、１０−２．１６モノクローナ
ル抗体のアフィニティー精製及びＣＮＢｒ活性化セファ
ロース４Ｂへのその結合についての計画である。 【図１３Ｂ】図１３Ｂは、図１３Ａにおける計画によっ
て精製した１０−２．１６モノクローナル抗体の純度を
示すゲルのコピーである。 【図１４】図１４は、Ｉ−ＡＫの精製のための方法を示
す。 【図１５】図１５は、図１４における計画により精製し
たＩ−ＡＫの純度を示すポリアクリルアミドゲルであ
る。 【図１６】図１６は、Ｉ−ＡＫ及びＭＢＰ（１−１３）
を含む複合体による増殖の阻止に基づく８種の試験結果
を示す棒グラフである。 【図１７】図１７は、ＭＢＰ（１−１３）での免疫に由
来するマウスにおけるＥＡＥの発症を示すグラフであ
る。 【図１８】図１８は、ＭＢＰ（１−１１）で免疫した後
のマウスのＢ１０Ａ（４Ｒ）株から獲得したＴ細胞クロ
ーン４Ｒ３．４によるＥＡＥの養子移入を示すグラフで
ある。 【図１９】図１９Ａ〜Ｃは、ＰＢＳのみ（１９ａ），Ｉ
−Ａｓ／ＭＢｐ１−１４（非起脳炎ペプチド）（１９
ｂ）及びＩ−Ａｓ／ＭＢｐ９１−１０３（１９Ｃ）を用
いたマウスにおける受動誘発型ＥＡＥの処置を示す。 【図２０】図２０は、本発明の複合体が凝集体として存
在していることを示し、なぜなら、それらはボイドボリ
ュームでカラムを通過し、従って６００，０００以上の
分子量を有するからである。 【図２１】図２１は、本発明の複合体（ＭＨＣ ＩＩ：
ＡＣｈＲα １００−１１６）がラットにおけるＭＧの
処置において有効であることを示す。 【図２２】図２２Ａ及び２２Ｂは、Ｔ細胞におけるアネ
ルギーの誘発に細胞死が追尾することを示しており、図
２３Ａ及び２３Ｂは、アネルギーを誘発するのに必要な
本発明の複合体のモル濃度が、ペプチドのみよりもはる
かに低いことを示す。
る。 【図２】図２は、ヒトＨＬＡ−Ａ２抗原（クラスＩ）の
三次元構造を示す。 【図３】図３は、改良クラスＩＩＭＨＣコード化糖タン
パク質の活性領域の図式である。 【図４】図４は、好ましい第二世代ＭＨＣタンパク質の
デザインを示す。 【図５】図５は、抗原表示細胞の表層を擬態した、ＭＨ
Ｃ糖タンパク質を含む平面膜二重層の図解である。 【図６】図６は、アセチルコリンレセプタータンパク質
のアルファーサブユニットに関するアミノ酸配列及びコ
ードＭＲＮＡを示す。 【図７】図７は、ミエリン塩基性タンパク質のアミノ酸
配列を示す。 【図８】図８は、Ｉ−Ａｂ−ベーター鎖をコードするヌ
クレオチド配列を示す。 【図９】図９は、Ｉ−Ａｂ−ベ−ター鎖をコードするヌ
クレオチド配列を示す。 【図１０】図１０は、ヒトにおけるＤＱ／ＤＲハプロタ
イプ及び関連の自己免疫障害のリストである。 【図１１】図１１は、自己免疫障害の診断及び／又は処
置のための本発明の複合体の利用に適するプロトコール
を示す。 【図１２】図１２は、ＮＤ−４０可溶性膜抽出物を含む
Ｉ−ＡＫの製造のための計画を示す。 【図１３Ａ】図１３Ａは、１０−２．１６モノクローナ
ル抗体のアフィニティー精製及びＣＮＢｒ活性化セファ
ロース４Ｂへのその結合についての計画である。 【図１３Ｂ】図１３Ｂは、図１３Ａにおける計画によっ
て精製した１０−２．１６モノクローナル抗体の純度を
示すゲルのコピーである。 【図１４】図１４は、Ｉ−ＡＫの精製のための方法を示
す。 【図１５】図１５は、図１４における計画により精製し
たＩ−ＡＫの純度を示すポリアクリルアミドゲルであ
る。 【図１６】図１６は、Ｉ−ＡＫ及びＭＢＰ（１−１３）
を含む複合体による増殖の阻止に基づく８種の試験結果
を示す棒グラフである。 【図１７】図１７は、ＭＢＰ（１−１３）での免疫に由
来するマウスにおけるＥＡＥの発症を示すグラフであ
る。 【図１８】図１８は、ＭＢＰ（１−１１）で免疫した後
のマウスのＢ１０Ａ（４Ｒ）株から獲得したＴ細胞クロ
ーン４Ｒ３．４によるＥＡＥの養子移入を示すグラフで
ある。 【図１９】図１９Ａ〜Ｃは、ＰＢＳのみ（１９ａ），Ｉ
−Ａｓ／ＭＢｐ１−１４（非起脳炎ペプチド）（１９
ｂ）及びＩ−Ａｓ／ＭＢｐ９１−１０３（１９Ｃ）を用
いたマウスにおける受動誘発型ＥＡＥの処置を示す。 【図２０】図２０は、本発明の複合体が凝集体として存
在していることを示し、なぜなら、それらはボイドボリ
ュームでカラムを通過し、従って６００，０００以上の
分子量を有するからである。 【図２１】図２１は、本発明の複合体（ＭＨＣ ＩＩ：
ＡＣｈＲα １００−１１６）がラットにおけるＭＧの
処置において有効であることを示す。 【図２２】図２２Ａ及び２２Ｂは、Ｔ細胞におけるアネ
ルギーの誘発に細胞死が追尾することを示しており、図
２３Ａ及び２３Ｂは、アネルギーを誘発するのに必要な
本発明の複合体のモル濃度が、ペプチドのみよりもはる
かに低いことを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 37/08 Ａ６１Ｐ 37/08
Ｃ０７Ｋ 14/74 Ｃ０７Ｋ 14/74
19/00 19/00
// Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ
39/00 37/02
(72)発明者 ソメシュ ディー． シャーマ
アメリカ合衆国，カリフォルニア 94022,
ロス アルトス，スチュアート コート
44
(72)発明者 バーナード エル． ラーチ
アメリカ合衆国，カリフォルニア 94303,
パロ アルト，コリナ ウェイ 3889
Ｆターム(参考） 4C084 AA01 AA03 BA41 ZA02 ZA94
ZB07 ZB08 ZB13
4C085 AA03 BB12 CC21
4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40
DA50 DA86 EA20
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 抗原性ペプチドと抗原結合部位を有する
単離ＭＨＣ成分とより本質的に構成され、ここでこの抗
原性ペプチドがこの抗原結合部位と連結されている、実
質的に純粋なＭＨＣ−ペプチド複合体。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US690,840 | 1991-04-23 | ||
| US07/690,840 US5260422A (en) | 1988-06-23 | 1991-04-23 | MHC conjugates useful in ameliorating autoimmunity |
| US07/869,293 | 1992-04-14 | ||
| US07/869,293 US5468481A (en) | 1988-06-23 | 1992-04-14 | MHC class II-peptide conjugates useful in ameliorating autoimmunity |
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ID=27104684
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| JP2013510836A (ja) * | 2009-11-11 | 2013-03-28 | キングス・カレッジ・ホスピタル・エヌエイチエス・ファウンデーション・トラスト | コンジュゲート分子 |
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| US10080808B2 (en) | 2012-10-11 | 2018-09-25 | Uti Limited Partnership | Methods and compositions for treating multiple sclerosis and related disorders |
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Families Citing this family (7)
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|---|---|---|---|---|
| EP2361930A3 (en) | 2007-03-26 | 2011-10-26 | Dako Denmark A/S | Multimers of MHC-peptide complexes and uses thereof in Borrelia infectious diseases |
| EP2167536A1 (en) | 2007-07-03 | 2010-03-31 | Dako Denmark A/S | Mhc multimers, methods for their generation, labeling and use |
| US10611818B2 (en) | 2007-09-27 | 2020-04-07 | Agilent Technologies, Inc. | MHC multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics |
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| WO2010009735A2 (en) | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Dako Denmark A/S | Combinatorial analysis and repair |
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Family Cites Families (3)
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| IL92629A0 (en) * | 1989-12-10 | 1990-08-31 | Yeda Res & Dev | Direct binding of t-cell epitopes to mhc gene products on intact living antigen presenting cells and the use thereof for identifying epitopes causing autoimmune diseases and pharmaceutical compositions for treating such diseases |
| WO1993009810A1 (en) * | 1991-11-19 | 1993-05-27 | Anergen, Inc. | Mhc subunit conjugates useful in ameliorating deleterious immune responses |
-
1992
- 1992-04-23 EP EP92911380A patent/EP0630255B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-23 DE DE69232875T patent/DE69232875T2/de not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-07-19 JP JP2002211742A patent/JP2003231698A/ja not_active Withdrawn
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| EP0630255A4 (en) | 1995-04-19 |
| DE69232875D1 (de) | 2003-01-30 |
| EP0630255A1 (en) | 1994-12-28 |
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| Date | Code | Title | Description |
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040113 |
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| A761 | Written withdrawal of application |
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