JPH07507541A - 糖尿病の治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 糖尿病の治療方法 発明の背景 発明の分野は糖尿病である。

真性糖尿病は、インツユリン欠乏により特徴付けられる流行性かつ変性性の疾病 であり、通常の血中グルコースレベルの調節を阻害し、高血糖症およびケトアン ドーンスに至る。

インツユリンは、グルコース利用、タンパク質合成、中性脂肪の生成および貯蔵 、ならびにある種の細胞の増殖を促進する。イン／ニリンは、膵臓のランゲルハ ンス島中のβ細胞により産生される。

糖尿病を有する個人のうちのある者は、外因性のイン／ニリンの投与に依存せず 、一方、他の個人は外因的に投与されるイン／ニリンに完全に依存する。イン７ ユリン依存性は、β島細胞（β１ｓｌｅｔ　ｃｅｌｌ）の破壊度に関連している 。インツユリン非依存性の糖尿病患者は、例えば、高血糖症の疾病のごとき症状 のいくつかを示す糖尿病であるか否か、およびイン／ニリンまたは膵島細胞（ｉ ｓｌｅｔ　ｃｅｌｌ）のいずれか一方もしくはその双方に対する抗体を有するか により診断できる。かかる患者は、治療しなければ完全なイン／ニリン依存性の 真性糖尿病へと進展しうる。

イン／ニリン依存性の真性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、Ｔ細胞依存性の自己免疫疾患 である。活性化Ｔ細胞が、インシュリン産生β細胞を選択的に標的とし、それら の破壊を仲介する。最も重度の糖尿病の形態においては、該自己免疫反応がβ細 胞の完全な破壊を起こし、該個人におけるイン／ニリン産生が絶対的に欠乏する 。

ヒト糖尿病の自己免疫におけるＴ細胞の重要性は、新しいＩＤＤＭ発病を軽減で きるサイクロスポリンＡの能力によって強調されている（スティラー（Ｓ　ｔｉ ｌｌｅｒ）ら、１９８４年、サイエンス（Ｓ　１ｅｎｃｅ）第２２３巻　１３６ ２頁）。しかしながら、サイクロスポリンＡ誘導性の軽減が恒久的であるとは立 証されてなく、軽減を維持するために必要な慢性的に投与されるサイクロスポリ ンＡの高用量は腎臓毒性と関連して（る。かくして、サイクロスポリンＡは、一 般的な臨床的候補ではないようである（ドラソンユ（Ｄｒａｓｈ）ら、１９９０ 年、ベディアトリック・クリエクス・オブ・ノース・アメリカ（Ｐｅｄｉａｔｒ ｉｃ　Ｃ１１ｎｉｃｓ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａ）：カレント・イン ユーズ・イン・ベディアトリック・アンド・アドルセント・エンドフライノロジ ー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｉ　５ｓｕｅｓ　ｉｎ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　ａｎｄ　Ａ ｄｏｌｅｓｃｅｎｔ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）第３７巻、６頁）。

非肥満糖尿病マウス（ＮＯＤ）における試験は、マウスにおける該疾病がヒトに おけるＩＤＤＭに順位していることを示している（マキノ（Ｍａｋｉｎｏ）ら、 １９８０年、エクスブ・アニム（Ｅｘｐ、　Ａｎｉｍ、　）第２９巻、１頁）。

抗−Ｔ細胞モノクローナル抗体（抗−Ｔｈｙｌ、２抗体または抗−ＣＤ４抗体） は、ＮＯＤマウスにおける疾病を予防しくハラダ（Ｈａｒａｄａ）およびマキノ （Ｍａｋｉｎｏ）、１９８６年、エクスブー７二ム（Ｅ　ｘｐ、　Ａ　ｎｉｍ、 　）第３５巻、５３９頁、ンズラ（Ｓ　ｈｉｚｕｒａ）ら、１９８８年、サイエ ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２１巻８７３頁頁）、抗−ＣＤ２５抗体はＮ０Ｄｖウ スにおけるインシュリン炎を予防することが示されていた（ケリー（Ｋｅｌｌｙ ）ら、１９８８年、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ　、　Ｉ　ｕ＋ｕｎｏ １．　）第１４０巻　５９頁）。しかしながら、抗−ＣＤ２５抗体の作用は、後 にＮＯＤマウスで産生される抗イデイオタイプ抗体により遮断されることが示さ れた（バンケビクツ（Ｐａｎｋｅｗｙｃｚ）ら、１９８８年、ジャーナル・オブ ・オートイミユニティ−（Ｊ　、　Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ）第１巻　１１９ 頁）。インシュリン炎の前糖尿病マウスの膵島細胞から得たＴ細胞クローンを前 糖尿病ＮＯＤマウスに移行すると糖尿病を促進する（パンケビクツ（Ｐ　ａｎｋ ｅｗｙｃｚ）ら、１９９１年、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー （Ｅ　ｕｒ、　Ｊ　、　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　）第２１巻８７３頁：ハスキンス （Ｈａｓｋｉｎｓ）ら、１９８９年、プロノーディング・オブ・ナショナル・ア カデミ−・オブ・サイエンシーズ・イン・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）第８６巻：　８０００頁）。

発明の概要 本発明は、インターロイキン−２またはその受容体結合部分に共有結合で融合さ せたサイトトキ／ンを含有するハイブリッド分子を患者に投与することを包含す る糖尿病を者の治療の方法を特徴とする。該分子は１．患者の疾病状態の原因と なり、カリ高親和性インターロイキン−２受容体を含有する細胞に結合できる。

さらに該分子は、好ましくは該細胞を死滅させることにより、該細胞の生存性を 減じることができる。

サイトドキノン分子は、好ましくは、酵素的に活性であるが、共通の真核生物受 容体結合活性を有しないペプチドトキシンの断片である。

好ましくは、ペプチドトキシンの断片は、ジフテリアトキシンのＡフラグメント および細胞膜に孔を形成するジフテリアトキシンのＢフラグメントの十分な部分 とし得る。

該ハイブリッド分子は、最も好ましくは、ＤＡＢ、５ａｌＬ−２またはＤＡ８３ ｔｅＩ　Ｌ−２である。

Ｆ糖尿病」なる語は、イン７ユリン依存性の患者、外因的なビシ／ニリン投与に は依存しないが糖尿病のいくつかの症状、例えば、高血糖症を呈する患者、およ び膵島細胞、イン７ュリンのいずれが一方またはその両方に対する抗体を有する 患者を包含する。インツユリン非依存性の患者は、疾病が進行するにつれて最終 的に依存性となる。従って、本発明は、前記に定義した各々の糖尿病レベルの両 者を治療する方法を特徴とする。

また、本発明は、ハイブリッド・プイトトキ／ンＩＬ−２分子およびサイクロス ポリンＡを投与して糖尿病患者を治療する方法をも特徴とする。サイクロスポリ ンＡは、該ハイブリッド分子と共に投与するが、もしくは該ハイブリッド分子で の治療の結果、該、患者の糖尿病症状が実質的に改善された後に投与するがのい ずれかで投与する。この治療方法において、サイクロスポリンＡは、有効レベル で、しかも該ハイブリッド分子を摂取していない患者を治療するのに必要なレベ ルに比してなお非毒性である投与量レベルで投与できる。

本発明の他の特徴および有利な点は、以下の詳細な説明および請求の範囲がら明 らかであろう。

詳細な説明 図面の説明を、最初に簡単に記載する。

内通 図１は、糖尿病にかがった被験体に対するＤＡ８４ａｓｒＬ−２およびＤＡ（１ ９７）Ｂ＜ｓｇＩ　Ｌ−２の効果を表したグラフである。前糖尿病ＮＯＤマウス を（１，０００ラドで）照射し、２Ｘ１０フの糖尿病ＮＯＤマウスからの単核膵 臓細胞を静脈注射した。ａ）マウスを担体緩衝液（ｖｅｈｉｃｌｅ　ｂｕｆｆｅ ｒＸ　ｎ　＝　８　）、１０μｇ（７）Ｄ、Ａ（１９７）Ｂ４ａａｌＬ−２（ｎ ＝８）または１０μｇのＤＡＢ４８６１　Ｌ−２（ド９）で養子移入後４週間毎 日注射した。ｂ）マウスを担体緩衝液（ｎ＝８）、または５μｇのＤＡ８４ａａ ｌＩ、−２（ｎ＝８）で養子移入後４週間毎日注射した。

図２は、糖尿病にかかった被験体に対するＤＡ８４ｓｓＩＬ−２の効果を表した グラフである。前糖尿病ＮＯＤマウスを（１，０００ラドで）照射し、２Ｘ］、 Ｏ’の糖尿病ＮＯＤマウスからの単核膵臓細胞で静脈注射した。マウスは担体緩 衝液（ＴＢＳ）、】Ｏ１５またはｌ、＃ｇ／日（７）ＤＡＩＬｓａｌＬ−２で処 理した。

標的剤としてのインターロイキン−２ インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはいずれのそのｆＬ−２受容体結合誘導 体も、サイトトキシンの標的剤として用いることができる。ＩＬ−２のＤＮＡ配 列およびアミノ酸配列は公知であり（クダッグ（Ｔａｄａｔｓｕｇｕ）ら、ネイ チャー（Ｎａｔｕｒｅ）第３０２巻３０５頁、１９８３年）、その構造もＸ線結 晶回折により予想されている（ブランヒユーバー（Ｂ　ｒａｄｈｕｂｅｒ）ら、 サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２３８巻：１７０７頁、１９８７年）。ＩＬ− ２の遺伝子工学的な変異体の分析がら、どの残基がＩＬ−２Ｒ結合（コリンズ（ Ｃｏｆｆｉｎｓ）ら、プロノーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ ・サイエンシーズ・イン・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ）第８５巻ニア７ｏ９頁、１９８８年）および生物活性（：）−ｘン（Ｃ ｏｈｅｎ）ら、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）第２３４巻＝３４９頁、１９８ ９年：コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら、前掲刊行物）に重要であるかに関するい くっがの情報が提供された。本発明に有用なＩＬ−２の変異体は、（ウィリアム ス（ＷｉｌＨａｍｓ）ら、ヌクレイツク・アンノズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）第１０巻：１０４５頁、１９８８年による番号付け で）残基７４および残基７９の間の領域中に１またはそれを超えるアミノ酸残基 を欠損した欠損ミュータント（ゲンバウフ（Ｇｅｎｂａｕｆｆｅ）ら、ユーエス エスエヌ（ＵＳＳＮ）第３８８巻、５５７頁、出典明示して本明細書の一部とみ なす）を包含する。これらのミュータントは、ＩＬ−２Ｒを担う細胞に対するト キシンを効果的に標的とする（ゲンバウフ（Ｇ　ｅｎｂａｕｆｆｅ）ら、前掲刊 行物）。

一般的にサイトトキシンを標的とする有用なＩＬ−２変異体は、効率的にＩ　Ｌ −２Ｒに結合し、エンドサイト−ノスにより取り込まれなければならない。種々 の変異体のＩ　Ｌ−２受容体に結合する能力は、以下に記載するＩＬ−２Ｒ結合 アッセイで試験できる。

ＩＬ−２受容体を担う細胞を標的とする分子の設計においては、他の受容体のよ うにＩＬ−２受容体はいくつかの形態を有し；それは１の形態を担う細胞を標的 とするのが望ましく、もう１の形態を担うものも標的とするのは望ましくながろ う、ということを認識しなければならない。ヒト・インターロイキン−２受容体 は、高親和性、中親和性および低親和性の形態を有する。該高親和性受容体は、 〜】Ｏ−１°Ｍの見掛けのＫｄを有し、２個のサブユニットｐ５５および（ｐ７ ０とも呼ばれる）ｐ７５から成る。該細胞表面に発現された場合に、該ｐ７５お よびｐ５５の双方のサブユニットがＩＬ−２に結合できる。該ｐ７５サブユニク トは中親和性受容体（Ｋｄ〜８．２　ｘ　１０−０−１Ｏに対応し、ｐ５５サブ ユニットは低親和性受容体（Ｋｄ〜１−３　Ｘ　１０−’Ｍ）に対応する。該ｐ ７５サブユニットは休止期のＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球／マクロファ ージおよびリンフ才力イン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞前駆体の表面に発現され 、一方、高親和性受容体は活性化Ｔｍ抱および活性化８Ｒ抱に発現される。

本発明の方法においては、高親和性受容体を担う細胞のみを標的とすることが望 ましいてあろう。これらの条件において、有用な分子は中親和性または低親和性 受容体を担う細胞が大きくは影響を受けないでいられる濃度にて、高親和性■Ｌ −２受容体を担う細胞を除去または中和するであろう。ＩＬ−２自体のように、 該分子がすべての３つのクラスのＩＬ−２受容体に親和性を有する場合、低親和 性受容体を担う細胞へ有意に結合させない濃度にて該分子を投与することにより 選択性を達成できる。ハイブリッド分子は、ＩＬ−２に比して改変された受容体 親和性を有していてもよい。かかるハイブリッド分子は、高親和性ＩＬ−２受容 体を担う細胞に多かれ少ながれ選択性を有していてもよい。例えば、高親和性受 容体を担う細胞は、ノフ刊アトキシンの一部およびＩＬ−２の一部よりなる融合 タンパク質であるＤＡ　８４ａ６１　Ｌ−２に対し、中親和性受容体を担う細胞 より５００−１０００倍も感受性である（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）ら、ヨ ーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ、　Ｊ　、Ｉ　ｍｍｕｎ ｏｌ、　）第２０巻ゴ８５頁、１９９０年）。

サイトトキシンは数多くの方法でＩＬ−２誘導体に結合させることができる。

好ましくは、ＩＬ−２／トキシンハイブリツドは、融合遺伝子の発現により産生 されるハイブリッドタンパク質である。別法として、該サイトトキシンおよびＩ Ｌ−２誘導体は、別々に産生させ、後に非ペプチド共有結合の方法により結合さ せることができる。結合方法を以下に記載する。

有用なサイトトキシンは、好ましくは、細胞内に存在し、標的ドメインの不在下 にいずれの与えられた細胞からも実質的に排除される場合においてのみ有意な細 胞毒性を有する。ペプチドトキシンは、これらの両基準を満たし、ハイブリッド 分子中に容易に取り込まれる。また、２またはそれを超えるトキシンの全てまた は一部よりなるサイトトキシンである混合サイトトキシンも用いることができる 。い（つかの有用なトキシンを以下にされに詳細に記載する。

トキシン 本発明の方法に有用なトキシン分子は、好ましくは、細胞内に存在する時のみ有 意に細胞毒性を示すペプチドトキシンのごときトキシンである。勿論、これらの 条件下で該分子は標的受容体を担う細胞中に入っていくことができなければなら ない。この能力は、該分子の性質および該細胞受容体の性質に依存している。

例えば、自然にリガンドを取り込むことができる細胞受容体は、その受容体を担 う細胞へ入って行くトキシンを包含する分子につき手段を供するようである。

本発明の方法に有用なペプチドトキシンは、！シブリッドタンパク質分子をコー ドする組換えＤＮＡ分子を産生させることによってＩＬ−２Ｒ結合ドメインに融 合させる。かかるアプローチは組成物の一貫性を保証する。

多くのペプチドトキシンは、共通の真核生物受容体結合ドメインを有し：これら の例において、該トキシンは、該受容体を担わない細胞の毒性を防ぐように修飾 されていなければならない。いずれのかかる修飾も、分子の細胞毒性作用を保つ ように作製しなければならない（ユウ・ニス・デパートメント・オブ・ヘルス・ アンド・ヒユーマン・サービシーズ（Ｕ、　Ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ 　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　ＨｕｍａｎＳ　ｅｒｖｉｃｅｓ）、米国特許番号４０ １，４１２号参照）。潜在的に有用なトキシンは、：コレラトキシン、リノン、 ０−シガ様トキンン（ＳＬＴ−１，５ＬＴ−１１、ＳＬＴ　ＩＩｖ）、ＬＴトキ ンン、Ｃ３トキシン、／ガトキンン、百日咳トキシン、破傷風トキシン、ンユー ドモーナスエキソトキンン、アロリン（ａｌｏｒｉｎ）、サボリン（ｓａｐｏｒ ｉｎ）、モデンン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）およびゲラエン（ｇｅｌａｎｉｎ）を包 含するが、それらに限定されるものではない。

混合トキシン 本発明に有用ない（つかの分子の細胞毒性部分は、混合トキシン分子で提供でき る。混合トキシン分子は、２種の異なったポリペプチドトキシン由来の分子であ る。一般的に前記にシフテリアトキシンとの関連で論じたごと（、ポリベブチド トキンンは、真核生物細胞に共通した結合を担うドメインに加えて、酵素的に活 性なドメインおよび転移ドメインを有する。結合ドメインおよび転移ドメインは 、各々細胞認識およびトキシン移入に必要である。酵素的に活性なドメインは、 一旦該分子が細胞の内側に存在すると細胞毒性活性を担うドメインである。

転移ドメインを有することが知られている天然に存在するタンパク質としては、 ジフテリアトキシン、ノユードモーナスエキソトキンンＡ、および恐らく他のト キシンを包含する。シフテリアトキノンおよびンユードモーナスエキソトキンン Ａの転移ドメインは、十分に特徴付けられており（例えば、ホック（Ｈｏｃｈ　 ）ら、ブロン−ディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンノー ズ・イン・ニー　ニスエイ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ） 第８２巻＋１６９２頁、１９８５年、コロンパンティ（Ｃｏｌｏｍｂａｔｔｉ） ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、）第２６１巻　３０３０頁、１９８６年、およびディシーズ（Ｄｅｌｅｅｒ ｓ）ら、フェブス・レター（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、）第１６０巻　８２頁、１９ ８３年参照）、かかるドメインの他の分子における存在および位置は、ワンらに より用いられたもののごとき方法（ワン（Ｈｖａｎｇ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）第 ４８巻・１２９頁、１９８７年：およびグレイ（Ｇｒａｙ）ら、プロシーディン グ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・イン・ニーニスエ イ（Ｐ　ｒｏｅ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ）第８１巻＋２６４５頁、１９ ８４年）により同定できる。

１の有用なＩＬ−２／混合トキンンハイブリッド分子は、イー・コリ（Ｅ、ｃｏ ｌｉ）／ガ様トキシンの酵素的に活性なＡサブユニットを、ジフテリアトキシン の転移ドメイン（アミノ酸残基２０２ないし４６０）およびＩ　Ｌ−２へ融合す ることにより作製する。この３部分のハイブリッド分子、５ＬＴ−Ａ／ＤＴＢ’ ／ＩＬ−２は、前記したＤＡＢ４ｇａＩＬ−２の場合と同様に本発明に有用であ る。該３部分のハイブリッドのＩＬ−２部分は、ＩＬ−２Ｒを担う細胞への該分 子の特異的な結合を起こし、該ジフテリアＩ・キノンの転移部分は、ツガ様トキ ／ンの酵素的に活性なＡサブユニットの標的細胞への挿入に作用する。シフテリ アトキシンのようなンガ様トキンンの酵素的に活性な部分は、細胞のタンパク質 合成機構に作用してタンパク質合成を阻害し、かくして該細胞を死滅させる。こ れらの２つの型のハイブリソドトキンンの間の相違は、それらの酵素的な活性： ＤＡＢ＜５−ｓＩＬ−２の酵素部分は、延長因子２のニコチンアミドアデニンジ ヌクレオチドによるＡＤＰ−リポノル化を触媒し、それによってタンパク質合成 に必要なこの因子を不活化する、一方、５ＬＴ−Ａ／ＤＴＢ’／ＩＬ−２の酵素 部分は重要な部位でリポソームＲＮＡを切断できるリボヌクレアーゼであり、こ の作用により該リポソームを不活化する、という性質による。従って、５ＬＴ− Ａ／ＤＴＢ’／ＩＬ−２ハイブリツドは、ＤＡ８４８６１Ｌ−２の適用と同様の 処理で有用で、例えば、ＤＡＢ４８６１　Ｌ−２に抵抗性となった場合に、それ と置き換えたり、組み合わせて也者の活性化Ｔ細胞がＤＡ８４ａｇｌＬ−２を用 いることができる。

トキシンの結合リガンドへのＰＯ合 有用なハイブリッド分子の結合リガンドおよびサイトドキノンは、いくつかの方 法で結合することができる。もし該ハイブリッド分子が融合遺伝子の発現により 産生される場合、ペプチド結合は該サイトドキノンおよび該結合リガンドの間の 結合として働く。別法として、該トキシンおよび該結合リガンドを、別々に産生 させ、後に非ペプチド結合の方法によって結合させることができる。

例えば、該共有結合は、ジスルフィド結合の形成を採ることもできる。この場合 、該結合リガンドが、例えばＩ　Ｌ−２のごときタンパク質の場合、Ｌ−２をコ ードする該Ｄ　Ｎ　Ａは、マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）ら記載（米国特許出願番 号３１３．５９９号、出典明示して本明細書の一部とみなす）の余分なノスティ ンコドンを含有するよう設計できる。該システィンは、該分子の１ｌ−２Ｒ結合 活性を妨げないよう位置させなければならない。例えば、該システィンコドンは 、ＩＬ−２の熟成形態のＰｒｏ２をコードするＤＮＡのすぐ上流に挿入すること ができる。該トキシン分子は、修飾ＩＬ−２の７ステインと反応するスルヒドリ ル基で誘導体化しなければならない。ペプチドトキノンの場合、これは該トキシ ンをコードするＤＮＡ配列に／スティンコドンを挿入することにより達成できる 。別法として、それ自体または／スティン残基の一部として、スルヒドリル基を 、固相ポリペプチド技術を用いて導入することができる。例えば、ペプチドへの 該スルヒドリル基の導入は、ヒスキー（Ｈｉｓｋｅｙ）により記載されている（ ベブチズ（Ｐ　ｅｐｔｉｄｅｓ）第３巻１３７頁、１９８１年）。また、誘導体 化は、バンカ（Ｂａｃ、′ｌａ）らのペプチドホルモンの誘導体化に記載された 方法に準じて行うこともてきる（バンカ（Ｂ　ａｃｈａ）ら、米国特許第４．４ ６８．３８２号、出典明示して本明細書の一部とみなす）。スルヒドリル基のタ ンパク質への導入は、マツセン（Ｍａｓｓｅｎ）らにより記載されている（ヨー ロピアン・／ヤーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅ　ｕｒ、　Ｊ　、　Ｂ　 ｉｏｃｈｅｍ、　）第１３４巻：３２頁、１９８３年）。一旦、正確なスルヒド リル基が存在すると、該サイトドキノンおよびＩＬ−２Ｒ結合リガンドを精製し 、両方の硫黄基を還元し、（約１５ないし１．２０の比率で）サイトドキノンお よびリガンドを混合し：ジスルフィド結合の形成を室温にて反応が完了するまで 進行させる（一般的に２０ないし３０分）。次いで、該混合物をリン酸緩衝液セ ーラインに透析して未反応のりガントおよびトキシン分子を除去する。次いで、 セファデックスクロマトグラフィー等を行って、サイズに基づいて、トキンシー トキンンおよびリガントリガンド結合体からトキシン−リガンド結合体を分離す る。

Ｉ　Ｌ−２受容体結合のアッセイ 種々の分子のＩＬ−２Ｒ結合能力は、高親和性（ユウ（Ｊｕ）ら、ジャーナル・ オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）第２６２巻 ：５７２３頁、１９８７年）または中親相性受容体（ロブ（Ｒｏｂ）ら、プロシ ーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンノーズ・イン・ニ ーニスエイ（Ｐ　ｒｏｅＮａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ）第８ ４巻：　２００２頁、１９８７年）のためのＩ　Ｌ−２Ｒアツセイを用いて測定 することができる。

毒性アッセイ 本発明の分子は、以下に記載するようなアッセイ方法によって標的受容体を担う 細胞の生存性を減少させる能力でスクリーニングできる。

ＩＬ−２Ｒを担う細胞に対する毒性は、以下のように試験できる。培養したＨＵ Ｔ　１０２／６ＴＧ（ラド（Ｔｓｕｄｏ）ら、プロン−ディング・オブ・ナショ ナル・アカデミ−・オブ・サイエンノーズ・イン・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　ＡｃａｄＳｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ）第８３巻＋　９６４９頁、１９８ ６年）またはＹＴ２Ｃ２（テンギワリ（Ｔｅｓｈｉｇｉｗａｒｉ）ら、ジャーナ ル・オブ・エクスペリメンタル・メディノン（Ｊ。

Ｅ　ｘｐ、　Ｍｅｄ、　）第１６５巻・２２３頁、１９８７年）細胞を、２５ｍ ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，４）、２ｍＭの１−グルタミン、１００Ｕ／ｍｆのペ ニノリン、１００μｇ／ｍｅのストレプトマイシン、および１０％のラン胎児血 清（ハゼルトン社（Ｈａｚｅｌｔｏｎ）製、レネキサ、カンザス州（Ｌｅｎｅｘ ａ、　Ｋ　Ｓ））を補足したＲＰＭ１１６４０培地（ギブコ社（Ｇ　１ｂｃｏ） 製、グランド・アイランド、ニューヨーク州（Ｇｒａｎｄ　Ｉ　５ｌａｎｄ、　 ＮＹ））中に維持する。該細胞を９６ウエルＶ底プレート（リンブローフロラ・ ラボラトリーズ社（Ｌｉｎｂｒｏ−Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製、 マクリーン、バージニア州（Ｍａｃ　Ｌ　ｅａｎ、　Ｖ　Ａ　））にウェル当た り１×１０５の濃度にて完全培地に蒔く。推定トキノ：、ｚ（ｐｕｔａｔｉｖｅ 　ｔｏｘｉｎ）を変化させた濃度（１０”Ｍないし１０−６Ｍ）にて添加し、該 培養を５％のＣｏ２雰囲気中、３７℃にて１８時間インキュベートする。インキ ュベート後、該プレートを１７０Ｘｇで５分間遠心し、該培地を除去し、８μＣ ｉ／ｍｒ（３Ｈ−ロイ／ン、ニュー・イングランド・ニューフレア社（Ｎｅｗ　 Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）製、ボストン、マサチューセソツ州（Ｈｏｓ ｔｏｎ、　ＭＡ））を含有する１００μｌの無ロイノン培地（ＭＥＭ、ギブコ社 （Ｇｉｂｃｏ）製）で置き換える。さらに３７℃にて９０分後に、該プレートを １７０Ｘｇにて５分間遠心し、該培地を除去し、セル・ハーベスタ−（スカトロ ン社（Ｓ　ｋａｔｒｏｎ）製、スターリング、バージニア州（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ 、　ＶＡ））を用いて該細胞をグラスファイバー・フィルター上に収集する。フ ィルターを洗浄して、乾燥し、標準的な方法に従って計測する。培地単独で培養 した細胞を対照として供する。

ジフテリアトキシンに基づいた分子 本発明の方法に有用な分子を作製するためジフテリアトキシンを用いることがで きる。その配列が公知のジフテリアトキシンは、マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）の 米国特許第４．６７５．３８２号（出典明示して本明細書の一部とみなす）に詳 細に記載されている。該天然ジフテリアトキシン分子は、コリネバクテリウム・ ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）によ り分泌され、転移ドメインおよび共通の細胞結合ドメイン（アミノ酸残基４７５ ないし５３５）を包含し、該分子のアミノ末端から始まり、酵素的に活性なＡフ ラグメント（アミノ酸Ｇｌｙ＋−Ａｒｇ＋ｓｓ）およびＢフラグメント（アミノ 酸Ｓ　ｅｒ　１９４−　Ｓ　ｅｒい、）で特徴付けられるいくつかの機能ドメイ ンよりなる。

ジフテリアトキシンが感受性の真核生物細胞に毒性を示す過程は、少なくとも以 下の段階を包含する　（１）ジフテリアトキシンの結合ドメインが感受性細胞表 面上の特異的受容体へ結合し　（ｉｆ）その受容体に結合している間に、該トキ ノン分子がエンドサイト−メス小胞へ取り込まれ、（ｍ）取り込まれる前または エンドサイトーンス小胞中のいずれかで、該トキシン分子がＡフラグメントおよ びＢフラグメントの間のタンパク分解を受け、（■）エンドサイトーメス小胞の ｐＨが６未満まで低下すると、該トキシンがエンドソーム膜を通過し、Ａフラグ メントのサイドシルへの運搬が容易となり；（ｖ）Ａフラグメントの触媒活性（ すなわち、［延長因子２ｊなる真核生物タンパク賃合成因子のニコチンアミドア デノシンジヌクレオチド依存性アデノノンニリン酸（ＡＤＰ）のリボンル化）が 毒性化された細胞の死滅を引き起こす。サイドシルに導入されたＡフラグメント の単一分子が、十分に細胞のタンパク質合成機構を遮断し、該細胞を死滅させる ことは明らかである。ンユードモーナスエキソトキ７ンへによる細胞死滅の機構 、およびある種の他の天然に存在するトキシンによるものは、恐らく大変類似し ている。

ジフテリアトキシンの受容体結合ドメインがヒトＩＬ−２の部分で置き換わって いる融合タンパク質、ＤＡ８４ａ＊ＩＬ−２（ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ）ら、ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅ■、）第３５巻：２０６７３頁、１９９０年：ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉ ａｍｓ）ら、プロティン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ、）第１ 巻：４９３頁、１９８７年も参照）は、本発明の方法に有用な分子の一例である 。この分子は、ＩＬ−２Ｒ−発現腫瘍細胞およびリンパ球を選択的に死滅させる （ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オン・イムノ ロノー（Ｅｕｒ、　Ｊ　、　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　）第２０巻、７８５頁、１９ ９０年；キヨカワ（Ｋｉｙｏｋａｗａ）ら、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅ ｒ　Ｒｅｓ、　）第４９巻４０４２頁、１９８９年）。活性化リンパ球を死滅さ せるその能力のために、ＤＡＢ４ｇａＩＬ−２は、移植組織拒絶反応を制御する のに（バンケビクッ（Ｐ　ａｎｋｅｖｙｃｚ）ら、トランスプランテーション（ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）第４７巻：３１８頁、１９８９年：キックマ ン（Ｋｉｃｋ＋ｎａｎ）ら、トランスプランテーション（Ｔ　ｒａｎｓｐｌａｎ ｔａｔｉｏｎ）第４７巻　３２７頁、１９８９年）、また、ある種の自己免疫疾 患を治療するのに用いてきた（フォルテ（Ｆ　ｏｒｔｅ）ら、セカンド・インタ ーナショナル・シンポジウム・オン・イムノトキンンズ（２ｎｄ　Ｉ　ｎｔｅｒ ｎａｔｉｏｎａｌＳｙ＋＊ｐｏｓｉｕ＋＊　ｏｎｌ　ｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ） 、１９９０年）。

ＤＡ８４ａｓｌＬ−２は、メチオニンに続き、ＩＬ−２の２ないし１３３アミノ 酸残基に融合した成熟ジフテリアトキシンの１ないし４８５アミノ酸残基よりな るキメラ分子である。か（して、ＤＡ８４８８１Ｌ−２は、該分子の酵素的に活 性な部分をコードする全ジフテリアトキシン・Ａフラグメント、ならびにＢフラ グメントの部分を含有する。ＤＡＢ＜５ｓＩＬ−２中に存在するＢフラグメント の部分は、共通の受容体結合ドメインを包含しないが、該酵素的に活性な部分を サイドシル中へ運搬するのを容易とする転移ドメインを包含する。

本発明に有用な第２の分子は、ＤＡＢＵ６１　Ｌ−２より９７残基少ないアミノ 酸を含有することを除いてはＤＡ　Ｂ４ａｓ　Ｉ　Ｌ−２と同様なりＡＢｓａｏ Ｉ　Ｌ−２である。

ＤＡＢ４□Ｉ　Ｌ−２およびＤＡＢｓｓｓＩ　Ｌ−２の調製ＤＡ　８４ｇ、　Ｉ 　Ｌ−２およびＤＡ８３８Ｇ１Ｌ−２は、１９９０年６月１３日出願の米国特許 出願番号０７１５３７．４３０号、および対応するＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ ＵＳ９１１０１２８２号（出典明示して本明細書の一部とみなす）に記載のごと く作製し精製する。

ＩＬ−２）キンン処理は、ＮＯＤマウスにおける糖尿病性自己免疫を遮断する高 親和性インターロイキン−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）は、近くに活性化された細胞 に特徴的であり、休止期のＴ細胞には認められない（スミス（Ｓｗｉｔｈ）、１ ９８８年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２４０巻　１１６９頁、テノガワラ （Ｔｅｓｈｉｇａｗａｒａ）ら、ジャーナル・オン・エクスペリメンタル・メデ イノン（Ｊ　、　Ｅ　ｘｐ、　Ｍｅｄ、　）第１６５巻：２２３頁）。糖尿病の 理想的な治療は、活性化された自己攻撃性Ｔ細胞を迅速がる選択的に破壊すべき である。糖尿病誘発性細胞が、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）においてＩＬ−２Ｒを 発現していることが証明された（ノクンケビクツ（Ｐ　ａｎｋｅｖｙｃｚ）ら、 １９９１年、ヨーロピアン・ジャーナル・オン・イムノロジー（Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｉ　ｍｏｕｎｏｌ、　）第２１巻：８７３頁）。以下に記載するデータは、ＩＬ −２Ｒ”Ｔ細胞の特異的な除去により糖尿病誘発性の過程が阻害されたことを証 明している。

要約すれば、ＮＯＤマウスをＩし一２融合トキノン（ＤＡＢ４８＠Ｉ　Ｌ−２） で処理した。ＤＡＢｔａａｌｌ−２は、高親和性ＩＬ−２Ｒヘテロダイマーに選 択的に結合する（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）ら、１９９０年、ヨーロピアン ・ジャーナル・オン・イムノロノー（Ｅｕｒ、　Ｊ　、　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　 ）第２０巻　７８５頁）。この融合トキシンは、抗原活性化Ｔ細胞の選択的な標 的化を経て遅延型過敏症を阻害することにより（ケリ＝（Ｋｅｌｌｙ）ら、１９ ８８年、プロンーデインルオブ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンンー ズ・イン・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉＵ　Ｓ 　、Ａ　）第８５巻　３９８０頁）、同種異系の心臓または膵島移植片のしＩｆ ＬＪ不明確ではあるが、長期植え付け（カークマン（Ｋｉｒｋｍａｎ）ら、１９ ８９年、トランスブランチーンｇン（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）第４７ 巻・３２７頁、ノぐンケビクツ（Ｐ　ａｎｋｅｗｙｃｚ）ら、１９８９年、トラ ンスプランテーション（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）第１７巻　３１８頁 ）によって生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ’）において潜在的な免疫抑制をｅこす。以 下に記載したデータは、ＤＡＢ＋ａａＩＬ−２処理がＮＯＤマウスにおける糖尿 病誘発性自己免疫を阻害することを示す。加えて、ＤＡ８４ｓｓＩＬ−２で処理 した糖尿病ＮＯＤマウスは、ＩＤＤＭを前糖尿病ＮＯＤマウスに移入する膵臓細 胞を受け入れない。

材料および方法 前記したごと（、ＤＡＢ４ａｓｌＬ−２はヒ）ＩＬ−２配列をジフテリアトキシ ンの受容体結合ドメインのコドンに置き換えた融合遺伝子の産物である（ウィリ アムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら、１９８７年、プロティン・エンジニアリング（ Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ、）第１巻：４９３頁）。ＤＡ（１９７）８４８６１　 Ｌ−２１ｋ、位ｒＪ１５２で単一１７１７ミ／Ｍが（グリシンからグルタミン酸 へ）変化してＡＤＰ−リボンルトランスフエラーゼ活性を失ったＤＡＢ、、、Ｉ 　Ｌ−２のミュータントの形態である。

ＤＡ（１９７）Ｂ４ｓｅｌＬ−２を対照分子として用いた。これらのタンノくり 質は、工７エリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の細胞性抽出 物から精製した。エンドトキシンにより汚染されていないこれらのタンパク質を 、担体緩衝液（トリス緩衝液セーライン）、ｐＨ７，９に懸濁し、１０．５およ び１μｇ／ｍｌの濃度にて等分した。組換えヒトＩ　Ｌ−２はバイオジエン社（ Ｂｉｏｇｅｎ　Ｉｎｃ、）（ケンブリッジ、マサチューセソツ（Ｃａ＋ｎｂｒｉ ｄｇｅ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ））から購入した。

糖尿病の養子移入 ２ヶ月齢のメスＮＯＤマウス（ブリハム・アンド・ウイミンズ・ホスピタル（Ｂ 　ｒｉｇｈａｍ　ａｎｄ　Ｗｏｍｅｎ’　ｓ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ）　；オリジナ ル・ブリーデインルペアーズ・ンャクソン・ラボラトリ−（Ｏｒｉｇｉｎａｌ　 Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｐａｉｒｓ　Ｊ　ａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、 バー＋ハーバ−・メイン（Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｍａｉｎｅ））を（１，００ ０ラドで）致死的に照射し、＞　３００ｍｄ／ｄｉの血中グルコースレベルを有 する自然発生糖尿病ＮＯＤマウスから採取した１、５ないし２．０Ｘ１０’の単 核膵臓細胞を照射４時間以内に静脈注射した。この細胞数の投与は、２１日まで に２ヶ月齢のメスのマウス１こ均一して糖尿病を誘導した。

マウスを１０ｇｇ／ｄ、５μｇ／ｄまたは１μｇ／ｄのＤＡＢ４８６１Ｌ−２、 もしくは１０　ｕ　ｇ／ｄのＤＡ（１９７）Ｂ４８６１Ｌ−２、もしくはＱ、１ ｍＡの担体緩衝液で皮下的に処理した。ＤＡＢａｓｓｌＬ−２の糖尿病誘発性自 己免疫を予防する能力を評価するため、数匹の糖尿病ＮＯＤを１０μｇ／ｄのＤ Ａ’Ｂ４＊＠ＩＬ−２で１週間処理した。処理マウスまたは対照マウスからの膵 臓細胞を、致死照射し、さらに処理しなかった２ヶ月齢の前糖尿病ＮＯＤに養子 移入した。

結果 ＤＡ８４ｓｇＩ　Ｌ−２は、養子移入された糖尿病からＮＯＤマウスを保護する 皮下的に投与したＤＡＢ＋＠ａｌｌ−２処理は、糖尿病ＮＯＤマウスから単核牌 臓細胞を養子移入した前糖尿病ＮＯＤマウスにおいて糖尿病を予防する。担体緩 衝液を注射した８匹のＮＯＤマウスの各々は養子移入８週間以内に糖尿病となっ た（２００　＞ｍｇ／ｄ　］の持続した血中グルコースレベルとして測定、すな わち、前糖尿病ＮＯＤマウスにおいて測定した血中グルコースレベルの平均値を 超える３つの標準偏差）。比較により、１０μｇ／ｄのＤＡ　Ｂ４＋１６　］　 Ｌ−２を注射した１７９匹のマウスだ（ブがこの期間中で糖尿病となった（ｐ＜ ０．００１）。

一方、ＤＡ（１９７）Ｂ２Ｓ３１　Ｌ−２を注射した４／８匹のマウスは同期間 中に真性血糖症のままであった（ｐ＜０．００７Ｘ図１ａ）。糖尿病誘発性Ｔ細 胞を摂取した後も普通の血糖症のままのＤＡ８４ａａｌｌ−２を摂取した群のマ ウスの９週に屠殺した組織学的な試験をすると、膵島内で最小数の単核浸潤物が あった（１２±０６、ｎ＝８）。比較により、４週までに糖尿病となった５７８ 匹の担体対照処理し、たマウスは、すでに死んでおり、３匹の糖尿病で死んだマ ウスにおいてはほとんど膵島が残っていなかった。予期せぬことには、糖尿病Ｎ ＯＤマウスからの単核膵臓細胞を摂取した前糖尿病ＮＯＤマウスにＤＡ８４８６ １Ｌ−２またはＤＡＢａｔｅＩ　Ｌ−２を静脈投与した場合、両化合物とも該糖 尿病過程にいずれの影響も及ぼさなかった。

ＤＡＢ＋ｇｓＩ　Ｌ−２が糖尿病誘発性細胞を標的とするかを確認するため設定 した第２の一連の実験において、ＤＡＢ＜５ｇ１Ｌ−２を注射した糖尿病ドナー ＮＯＤマウスから移行した膵臓細胞をレシピエンドに移行し、養子移入後８週以 内に糖尿病を誘導できないことが見い出された（０７４匹のマウス）。比較によ り、無処理糖尿病ドナーＮＯＤマウスからの膵臓細胞は、この同期間内に８７９ 匹の動物に糖尿病を誘導した（表２）。従って、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）にお ける糖尿病ドナー膵臓細胞からのＩＬ−２Ｒを担う細胞の除去により、少なくと も自己免疫糖尿病誘発性Ｔ細胞が部分的に除去された。

第３の一連の実験は、５μｇ／ｄのＤＡＢ４ｓｓＩＬ−２で４週間処理したマウ スが恒久的に無ＩＤＤＭの状態のままであるか否かを確認するため設定した。糖 尿病の進展速度は、ＤＡ８４８６１　Ｌ−２処理マウスにおいては極めて遅れた が、８匹の処理マウスは糖尿病誘発性細胞の養子移入後８および１６週の間に最 終的に糖尿病になった。全ての対照マウスは、養子移入後５週で糖尿病となった （図１ｂ）。

興味深いことに、最終的に糖尿病となったＤＡ８４８８１Ｌ−２処理マウスの血 中グルコースレベルは、常に無処理マウスより低い状態であった。例えば、ＩＤ ＤＭの開始の時点では、無処理マウスが２７４±８ｍｇ／ｄ　ｌの血中グルコー スレベルを有し、一方、処理マウスは２３１±１０ｍｇ／ｄｌの値を有していた （ｐ＜０．０１）。無処理マウスにおいては、血中グルコースレベルは上昇し続 け、この群のほとんどのマウスは３００ｍｇ／ｄｌより高い値に達した。一方、 １０または５　μｇ／ｄのいずれかのＤＡ８４ｓｓＩＬ−２を摂取したマウスは 、３００ｍｇＩｃｌｌもの高い値は決して示さなかった。かくして、４週間ＤＡ 　８４ｎｇ　Ｉ　Ｌ−２で処理したマウスは最終的に糖尿病となったにもかかわ らず、この融合トキシンでの処理は、疾病の重度および進行速度を低下させた。

ｌ　Ｌ−２単独で処理したマウスは、担体対照群（５１５）に比して同等の糖尿 病発病率（７／８）を有し、ＤＡ（１９７）Ｂ４ａｓＩ　Ｌ−２単独で接種した マウスも糖尿病となった（表１）。か（して、ｌ　Ｌ−２単独またはＤＡ（１９ ７）Ｂ２Ｓ３１　Ｌ−２は、ＤＡＢ＋５ａｌＬ−２の優れた作用に及ばなかった 。

表１ 表２ Ｄ、八Ｂ１６１　Ｌ−２（１０μｇ／ｄ）＊　８．　１４．　＞１６．　＞１６ （ｐ＜０．０１）ス。

ジ 一般的に本発明の分子は、静脈内移入／注射により投与できる。また、それらは 、皮下的または筋肉内的にも投与できる。本発明の方法に有用な分子の投与量は 、患者の年齢、患者の糖尿病の重度および投与経路のごとき要因により変化しつ る。磨者は、ＤＡＢ４８６１Ｌ−２またはＤＡＢ３ｓｅｌＬ−２のいずれかを２ ５ないし３００　ｋ　Ｕ／ｋ　ｇで処理できる。いずれかの化合物は、毎日また は間欠的に患者に投与でき、もしくは一定の期間毎日投与した後に間欠的に患者 に投与できる。

１００を超える患者が、フェーズＩ／ＩＩ臨床プロトコルにてＤＡＢ４ＨＩ　Ｌ −２を摂取した。該分子は、最大耐量（ＭＴＤ）で処理した患者の約３０％の一 過性の無症状な肝臓トランスアミナニゼの上昇により確立したＭＴＤに良好な耐 性を示した。抗腫瘍効果は、約４０％の患者で認められた；反応は、Ｂ細胞白血 病およびＢ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫およびホジキン病で記録した（ル メストル（ＬｅＭａｉｓｔｒｅ）ら、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）第３６０ａ巻・ア ブストラクト１４２９頁、１９９０年；ウッドワース（Ｗｏｏｄｗｏｒｔｈ）ら 、フォース・インターナショナル・カンファレンス・オン・ヒユーマン・レトロ バイロロジー（４ｔｈ　１　ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　 ｏｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１９９１年）。１０−＠Ｍ のＤＡ　Ｂ４ｓｓ　Ｉ　Ｌ−２の血清濃度が、悪性度が高いことを示すＩＬ−２ 受容体を発現している患者に達成された。有意な抗−腫瘍効果が、極めて難治性 の白血病／リンパ腫患者で見い出され、これらの効果は全ての患者において可溶 性ＩＬ−２Ｒの高レベルの存在にもかかわらず起こった。この知見は、可溶性Ｉ Ｌ−２ＲがＩＬ−２の高親和性インターロイキン−２受容体への結合を妨害しな いことを示唆するデータと一致する。動物およびヒトの試験は、ＤＡ８４ｓｓＩ Ｌ−２が一般的なの免疫抑制効果を有しないことを立証した（ルメストル（Ｌ　 ｅＭａｉｓｔｒｅ）ら、前掲刊行物：ウッドワース（Ｗｏｏｄｗｏｒｔｈ）ら、 前掲刊行物）。

試験は、高親和性ＩＬ−２受容体を担う細胞によるＤＡＢ４ｓｓＩＬ−２の結合 および取り込みが曝露して３０分以内に起こり、その結果タンパク質合成の最大 阻害が数時間以内に起こることを示している。従って、該分子はたとえ血清の半 減期が短くとも効果的なはずである。

ＩＤＤＭ発病初期のヒトにおけるＤＡＢ４＋＋５ＩＬ−２の安全性、耐性、薬理 学動態性および生物学的反応のフェーズＩ／ＩＩ試験は進行中である。

この予備的な試験は、ＩＤＤＭ患者におけるＤＡ８４ａｓｌＬ−２の安全性およ び耐性を評価し、薬理学的動態および免疫機能の効果をインシュリン要求性、Ｃ −ベブチドレベルおよび高血糖症の制御により測定される糖尿病状態の変化と共 に評価するよう設定した。同様の研究の実験に基づいて、かかる効果は投与後４ ないし６週間にわたり予備的に評価でき、か（して、自己免疫真性糖尿病の発病 初期から、ＤＡＢ４１＋６１　Ｌ−２のごとき新規の治療薬の潜在的な免疫的お よび抗糖尿病効果の評価の臨床モデルが提供される。

症状かく４ケ月続き、ＨＬＡ　ＤＲ３または４および／または抗膵島細胞抗体を 形成している１５歳を超える個人にＤＡ８４８＠ＩＬ−２を投与した。患者は、 ７日間毎日６０分間の静脈内注入を、００２５．０．０５および０．０７５ｍｇ ／ｋ　ｇの投与量レベルを評価するコホート投与量−上昇プロトコル（ｃｏｈｏ ｒｔ　ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ）にて摂取させた。

この予備的な試験は、各々が単一コースを受けた２４人の患者を評価した。

今日までに１８人の患者を評価した。核剤はこの群の患者においては良好な耐性 を示した。１５ないし２０％の患者において軽度の一過性肝臓トランスアミナー ゼ上昇が、２人の患者において浮腫の一過性発現が、２人の患者において過敏症 様効果を示唆する軽度の発疹の発症があった。驚くべきことには、これらの患者 のうち８人（３人が０．０２５ｍｇ／ｋｇ、３人が０．０５ｍｇ／ｋｇ、２人が ０．０７５ｍｇ／ｋｇの投与量群）で、Ｃ−ペプチドの持続した増加（≧領６ナ ノモル）ならびに糖鎖付加化ヘモグロビンの普遍化とともに実質的なインシュリ ン要求性の減少が認められた。他の６人の患者のデータ分析は進行中である。

さらにこれらの反応する唐音において、非腎臓毒性投与量でのサイクロスポリン Ａの添加（４−５ｍｇ／ｋｄ／ｄ）により、反応パラメーターが持続されたか、 あるいはより良く改善された。この低投与量のサイクロスポリンＡがかかる改善 を誘導するとは期待されていなかった（バック（Ｂａｃｈ）、１９８９年、トン プソン編、サイクロスポリ〉Ａ：モード・オブ・アクンヨン・アンド・クリニカ ル・アブリケーションズ（ｉｎ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、　ｅｄ、　Ｃｙｃｌｏｓｐ ｏｒｉｎ　Ａ　：Ｍｏｄｅ　ｏｆ　Ａｃｔｉｏｎ　ａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌ　Ａ ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ロンドン・クリユーバー・アカデミツク・パブリッ ンヤーズ（Ｌｏｎｄｏｎ　Ｋｌｅｕｖｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈ ｅｒｓ）、１８１頁）ので、この発見は、ＤＡＢ４ｓｓｌＬ−２のごときＩＬ− ２融合トキンン、続いであるいはそれと共に低投与量のサイクロスポリンＡで糖 尿病患者を治療することが、糖尿病患者にサイクロスポリンＡを安全に投与する 最も効果的な方法であることを示唆している。

前記したデータは、ＤＡＢａｓｓＩＬ−２がＮＯＤマウスにおいてＩＤＤＭを抑 制できること、ならびに、この抑制がＤＡＢ４ｓｓｌＬ−２のＩＬ−２発現Ｔ細 胞を標的とし、それらを死滅できることに寄与しうることを立証している。また 、前記したデータは、驚（べきことに、ＤＡＢ４８６１Ｌ−２が、すでにＩＤＤ Ｍになっているヒト患者におけるインシュリン依存性を減じることに有用である ことも証明している。

ＦＩＧ、　ＩＡ 養子移入後（週） ＦＩＧ、１Ｂ フロントページの続き （７１）出願人　バック、ジャンーフランソワフランス７５００７パリ、リュ・ ドウ・ブレネル１８０番 （７２）発明者　バック、ジャンーフランソワフランス７５００７パ１バリュ・ ドウ・ブレネル１８０番 （７２）発明者　ルーピン−ケリー、ビッキ・イーアメリカ合衆国マサチューセ ッツ州０２１４６、プルツクライン、アパートメント２−７、イースト・グレン ・ロード６０番 （７２）発明者　ストローム、テリー・ビイアメリカ合衆国マサチューセッツ州 ０２１４６、プルツクライン、ケナード・ロード２２番（７２）発明者　ニコル ス、ジーン・シイアメリカ合衆国マサチューセッツ州０１７７８、ウェイランド 、アストラ１幡

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．医薬上許容される担体と、共有結合した第１および第２部分からなるハイブ リッド分子とを混合することよりなり、該第１部分は細胞の生存性を減じ得るサ イトトキシンよりなり、該第２部分は細胞上の高親和性インターロイキン−２受 容体に結合し得るインターロイキン２全部またはインターロイキン−２受容体結 合部分よりなり、核細胞は糖尿病症状の原因である糖尿病治療のための医薬剤の 製法。
2. ２．サイクロスポリンＡおよび請求項１記載のハイブリッド分子を混合すること よりなり、該サイクロスポリンＡは効果的ではあるが投与量当たりで実質的に非 毒性レベルである糖尿病治療用医薬剤の製法。
3. ３．該ハイブリッド分子が該受容体を担う細胞を死滅させる請求項１または２記 載の製法。
4. ４．該サイトトキシンが、酵素的に活性であるが共通の真核生物受容体結合活性 を有しないペプチドトキシンの断片である請求項１または２記載の製法。
5. ５．該サイトトキシンが、ジフテリアトキシンのＡフラグメントと、細胞膜に孔 を形成するシフテリアトキシンのＢフラグメントの十分部分とからなる請求項１ または２記載の製法。
6. ６．該ハイブリッド分子がＤＡＢ４８６ＩＬ−２である請求項１または２記載の 製法。
7. ７．該ハイブリッド分子がＤＡＢ３８９ＩＬ−２である請求項１または２記載の 製法。
8. ８．該ＤＡＢ４８６ＩＬ−２を投与量当たり２５ないし３００ｋＵ／ｋｇ存在さ せる請求項６記載の製法。
9. ９．該ＤＡＢ３８９ＩＬ−２を投与量当たり２５ないし３００ｋＵ／ｋｇ存在さ せる請求項６記載の製法。
10. １０．該糖尿病が外因性のインシュリンの投与で治療できない請求項１または２ 記載の製法。
11. １１．該糖尿病が外因性インシュリンの投与により治療される請求項１または２ 記載の製法。
12. １２．共有結合した第１および第２部分よりなるハイブリッド分子の糖尿病の治 療用医薬剤の製造における使用であって、該第１部分は細胞の生存性を減じるこ とができるサイトトキシンからなり、該第２部分は細胞上の高親和性インターロ イキン−２受容体に結合できるインターロイキン−２の全部またはインターロイ キン−２受容体結合部分からなり、該細胞が糖尿病症状の原因である該使用。
13. １３．請求項１２で製造した医薬剤と共に用いる医薬剤の製造におけるサイクロ スポリンＡの使用。