JP6076902B2 - 新規な持続型グルカゴン結合体およびこれを含む肥満の予防および治療用薬学的組成物 - Google Patents

新規な持続型グルカゴン結合体およびこれを含む肥満の予防および治療用薬学的組成物 Download PDF

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Description

本発明は、新規な持続型グルカゴン結合体(long−acting glucagon conjugate)およびこれを含む肥満の予防および治療用薬学的組成物に関する。具体的には、本発明は、グルカゴンまたはその誘導体が、非ペプチドリンカー(non−peptide linker)によって重合体キャリア(polymer carrier)に共有的に連結された新規な持続型グルカゴン結合体およびこれを有効成分として含む肥満の予防および治療用薬学的組成物に関する。本発明による持続型グルカゴン結合体は、生体内持続性および安定性が顕著に向上し、抗肥満薬物との併用投与時、薬物の投与量を画期的に減少させながら血糖のグルコースレベルにゆらぎのない改善された服薬順応度を示す。したがって、本発明の持続型グルカゴン結合体は、肥満の予防および治療に極めて有用に使用できる。
近年、経済成長や生活方式の変化に伴い、食習慣にも多くの変化がある。特に、忙しい現代人は高熱量食事と少ない運動量によって過体重および肥満が増加している。国際保健機関(World Health Organization、WHO)によれば、全世界的に10億人以上の成人が過体重で、そのうち少なくとも300万人以上が臨床的に重症の肥満と診断されており、毎年25,000人が過体重または肥満関連疾患によって死亡していることが報告された(World Health Organization,Global Strategy on Diet,Physical Activity and Health,2004)。
過体重および肥満は、血圧と血液のコレステロール数値を高めて心臓疾患、糖尿病、関節炎などを含む多様な成人病の発病を増加させている。そればかりか、過体重および肥満は、成人だけでなく、子供や青少年の間においても、動脈硬化、高血圧、高脂血症または心臓疾患などのような成人病の発病を増加させる主要な要因となっている。
肥満は、全世界的に深刻な疾病であり、各種疾患の原因として認識されているが、容易に治療できない疾病である。医学専門家らは、肥満は、単なる自制力の問題ではなく、食欲の調節とエネルギー代謝と密接に関連する複雑な疾患であると認識している。肥満は、消費エネルギーに比べて摂取エネルギーが過度であるが故に誘発される。個々人のレベルでは、過度の飲食エネルギー摂取と身体活動不足の組み合わせで肥満のほとんどの場合を説明すると考えられている。したがって、これを予防または治療するための長期的観点から、食餌療法および運動と並行して使用できる効果的かつ安全な医薬品の開発が切実に求められているのが現状である。
最近、肥満に関連する研究において注目される医薬品は、オキシントモジュリン(oxyntomodulin)であり、プレグルカゴン(pre−glucagon)に由来し、GLP−1およびグルカゴン受容体に結合できる。このようなオキシントモジュリンの二重機能性(dual function)に基づいて抗肥満薬物を開発するための研究が盛んに行われている。
グルカゴン様ペプチド−1(以下、「GLP−1」とする)は、糖尿病患者の高血糖症に対して開発中の物質であり、インスリン合成と分泌促進、グルカゴンの分泌の減少、胃の内容排出の抑制、グルコースの使用増進、および飲食物の摂取を減少させる様々な生理的機能を有する。また、GLP−1と約50%のアミノ酸相同性を有する、トカゲの毒液(lizard venom)によって分泌され、GLP−1と約50%のアミノ酸相同性を示すエキセンディン(exendin)−4は、GLP−1受容体を活性化させて糖尿病患者の高血糖症を減少させることが知られている。
グルカゴンは、例えば薬物治療または疾病、ホルモンまたは酵素欠乏に起因し、血糖レベルがあまりにも低下した場合、膵臓(pancreas)から分泌される。グルカゴンは、肝臓でグリコーゲン(glycogen)をグルコースまで分解し、血流でより多くのグルコースを放出するように信号を出し、これは血中のグルコースレベルを高める結果をもたらす。
GLP−1受容体およびグルカゴン受容体の両方に作動剤(agonist)として作用するオキシントモジュリンは、GLP−1のような飲食物摂取を減少させる機能とグルカゴンのようなグリコーゲンを分解する機能を有している。したがって、抗肥満治療剤としての潜在性を有する。
オキシントモジュリンの誘導体として、現在臨床1相進行中のデュアルアゴニスト(Dual agonist、Merck)、および前臨床試験進行中のZP2929(Zealand、WO2008/152403A1)がある。デュアルアゴニストのペプチド(Merck)はオキシントモジュリンであり、このジペプチジルペプチダーゼIV(以下、「DPP−IV」とする)に対する抵抗性は2番目のアミノ酸のL−SerをD−Serに置換して増加し、血中半減期はそのC末端にコレステロールモイエティを結び付けて延長される。ZP2929(Zealand)は、オキシントモジュリンの2番目のアミノ酸L−SerをD−Serに置換してDPP−IVに対する抵抗性を高め、17番目のアミノ酸ArgをAlaに置換してプロテアーゼに対する抵抗性を高め、27番目のアミノ酸MetをLysに置換して酸化的安定性を増加させ、20番目および24番目のアミノ酸Glnと28番目のアミノ酸AsnをそれぞれAsp、AlaおよびSerに置換して脱アミド化安定性(deamidation stability)を増加させることを含むオキシントモジュリンの誘導体である。
GLP−1受容体とグルカゴン受容体に同時に作用するオキシントモジュリンの能力は、抗肥満治療剤としての開発の可能性を提供する。しかし、オキシントモジュリンを治療的用途に用いるのに問題となるのは非常に短い半減期である。デュアルアゴニストのオキシントモジュリンの血中半減期は天然型オキシントモジュリンの半減期よりは長くなったものの、依然として7時間で生体内半減期が極めて短い。さらに薬物の投与用量が数mg/kgと極めて高い水準である。したがって、現在使用されているオキシントモジュリンまたはその誘導体は、短い半減期と低い効能により多量の薬物を毎日投与しなければならないという欠点がある。有効成分としてこのようなペプチドを含むタンパク質薬物の場合、血中レベルおよび力価を維持するために薬物を注射形態で頻繁に投与しなければならないため、患者にとって極めて苦痛となる。したがって、高い血中レベルおよび適当な効能の維持は肥満治療剤の開発において先決の課題である。
一方、タンパク質薬物の血中安定性を増加させ、長期間かけてこの血中薬物の水準を高く持続させて薬効を極大化しようとする努力が続いてきた。このためタンパク質を安定化させ、タンパク質加水分解酵素との接触および腎臓消失を抑制するために、PEGのような高分子を使用し、薬物の表面を化学的に変更させる方法が開発されてきた。しかし、その方法は、PEGの分子量が増加するほど標的タンパク質との反応性が低下し、ペグ化の収率が減少する問題があった。代案として、国際公開公報第2002/46227号は、遺伝子組み換えによって標的タンパク質をヒト血液アルブミンまたは兔疫グロブリン領域(Fc)とカップリングすることによって製造したタンパク質について記述する。米国特許第6,756,480号は、副甲状腺ホルモン(PTH)およびその類似体をFc領域とカップリングすることによって製造したFc融合タンパク質について記述している。これらの方法は、低いペグ化収率と非特異性のような問題を克服できるものの、依然として血中半減期増加の効果が予想に比べて大差を示さず、時には、力価もまた低いという問題を抱えている。血中半減期増加の効果を極大化するために、様々な種類のペプチドリンカーが使用されたが、免疫反応を引き起こす可能性がある。しかも、ジスルフィド結合を持つペプチドを使用する場合、ミスフォールディング(misfolding)の確率が極めて高い。
これらの問題を解決するために、本発明者らは、生理活性ポリペプチドと兔疫グロブリンFc断片を、非ペプチドリンカーを用いて相互に共有結合によって連結させ、これによって薬物の活性の減少を維持させながら血中の安全性を向上させる持続型タンパク質結合体を提案している(大韓民国登録特許第10−0725315号)。特に、エキセンディン−4およびその誘導体が、兔疫グロブリンFc断片に非ペプチドリンカーを介して連結された持続型エキセンディン−4結合体が延長した生体内持続性を示すことを確認した(大韓民国特許出願公開第10−2008−0064750号)。
さらに、本発明者らは、生体内持続性および安定性が増加した抗肥満治療剤を開発するために、持続型エキセンディン−4結合体を適用することを試みた。これに関連してGLP−1受容体とグルカゴン受容体を同時に刺激するように、前記持続型エキセンディン−4結合体(週1回)と天然型グルカゴン(毎日1回)を併用投与した。天然型グルカゴンと併用投与する場合、持続型エキセンディン−4結合体は単独投与時と比較して、画期的な体重減少効果を確認することができた。しかし、前記併用投与は、血糖のグルコースレベルの激しいゆらぎをもたらし、試験動物に毒性が示された。
したがって、本発明者らは、グルカゴンの血中半減期を増加させながら生体内活性を維持させる方法を開発するために努力した結果、グルカゴンまたはその誘導体に、非ペプチドリンカーを用いて兔疫グロブリンFc断片のような重合体キャリアを共有的に連結した新規な持続型グルカゴン結合体を発明するに至った。本発明の持続型グルカゴン結合体は、生体内持続性および安定性が改善されることを確認した。したがって、本発明にかかる持続型グルカゴン結合体を抗肥満薬物とともに使用する場合、極めて少ない投与量でも体重と飲食物の摂取を効果的に減少させることができる。さらに、そのような併用投与は、血中グルコースレベルに激しいゆらぎを誘導しないと共に、改善された服薬順応度を示した。したがって、本発明の持続型グルカゴン結合体は、肥満の予防および治療に効率的に使用できる。
したがって、本発明の一つの目的は、生体内持続性および安定性が向上した持続型グルカゴン結合体を提供することである。
本発明の他の目的は、前記持続型グルカゴン結合体の製造方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記持続型グルカゴン結合体を有効成分として含む肥満の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記薬学的組成物を、これを必要とする対象に投与するステップを含む、肥満を予防または治療する方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記持続型グルカゴン結合体の、肥満の予防または治療用
薬の製造のための使用を提供することである。
上記の目的を達成するための一態様として、本発明は、グルカゴンまたはその誘導体が、非ペプチドリンカーによって重合体キャリアに共有的に連結された新規な持続型グルカゴン結合体を提供する。
本発明のグルカゴンまたはその誘導体の持続型グルカゴン結合体は、延長した血中半減期と改善された生体内持続性および安定性を示す。したがって、抗肥満薬物と組み合わせて投与する場合、本発明の持続型グルカゴン結合体は顕著に低い投与量で投与することができ、血中グルコースレベルのゆらぎなく服薬順応度が改善されることを示す。したがって、本発明の持続性グルカゴン結合体は、肥満の予防および治療に効率的に使用できる。
持続型CA−グルカゴン結合体と持続型CA−エキセンディン−4結合体を併用投与した後、8日間のDIO(Diet−Induced Obesity)マウスに体重の変化を示したグラフである。 持続型CA−グルカゴン結合体と持続型CA−エキセンディン−4結合体を併用投与後した後、8日間のDIOマウスの飼料摂取量の変化を示したグラフである。 持続型CA−グルカゴン結合体と持続型CA−エキセンディン−4結合体を併用投与後した後、8日間のDIOマウス血中グルコースレベルの変化を示したグラフである。 天然型グルカゴンペプチドと持続型CAエキセンディン−4結合体を併用投与した後、12日間のDIOマウスの体重の変化を示したグラフである。 天然型グルカゴンペプチドと持続型CAエキセンディン−4結合体を併用投与した後、12日間のDIOマウスにの血中グルコースレベルの変化を示したグラフである。
本発明において使用される用語、「グルカゴン」は、ランゲルハンス島のアルファ細胞から分泌し、合成されるポリペプチドホルモンを指しており、配列番号1の29個のアミノ酸で構成されている。グルカゴンは、血中グルコースレベルを維持するのに役立つ。グルカゴンは、肝臓でグリコーゲン(glycogen)を分解してグルコースを血流に放出するように信号を出す。また、グルカゴンは、インスリン分泌を刺激し、インスリン依存的組織によってグルコースが吸収されて使用されるようにする。したがって、グルカゴンとインスリンは、フィードバックシステムの一部分であり、これは血中グルコースレベルを適正水準に維持させる。
本発明において使用される用語、「グルカゴン誘導体」は、グルカゴンの受容体に結合してグルカゴンと同様の生物学的活性を示す物質を意味する。グルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンに対して、アミノ酸配列において少なくとも80%の相同性を有し、一部アミノ酸残基において化学的に置換(substitution)、除去(deletion)または修飾(modification)を含むことができる。本発明に適合するグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンの作動剤(agonist)、誘導体(derivative)、断片(fragment)、変異体(variant)およびこれらの組み合わせからなる群より選択できる。
本発明において使用される用語、「グルカゴン作動剤」は、グルカゴンの構造とは関係なく、グルカゴンの受容体に結合してグルカゴンと同様の生物学的活性を示す物質を意味する。
本発明において使用される用語、「グルカゴン誘導体」は、天然型グルカゴンのアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有するグルカゴン活性を示すペプチドを意味しており、一部のアミノ酸残基において化学的に置換(例;α―メチル化、α―ヒドロキシル化)、除去(例;deamination)または修飾(例;N−メチル化)を含むことができる。
本発明において使用される用語、「グルカゴン断片」は、天然型グルカゴンのN末端またはC末端に少なくとも1個のアミノ酸が追加または削除された、グルカゴン活成を有するペプチドを意味する。グルカゴンペプチドは天然に存在しないアミノ酸(例:D型アミノ酸)がこれに追加されたペプチドであってもよい。
本発明において使用される用語、「グルカゴン変異体」は、天然型グルカゴンと少なくとも1個のアミノ酸配列が異なる、グルカゴン活性を有するペプチドを意味する。
好ましくは、本発明のグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンの少なくとも1個のN末端アミノ酸の置換、除去または修飾によって製造することが出来、グルカゴンの活性を有するペプチド、これらの断片およびこれらの変異体からなる群より選択できる。より好ましくは、グルカゴン誘導体は天然型グルカゴンのN末端の1番目のアミノ酸であるヒスチジンのα炭素またはこれに結合されたアミン基が置換、修飾または除去されることが出来るペプチドであってもよい。最も好ましくは、本発明のグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンのN末端アミン基が除去されたペプチド、そのN末端アミン基がヒドロキシル基(hydroxyl group)に置換されたペプチド、そのN末端アミン基が2個のメチル基で修飾されたペプチド、そのN末端ヒスチジンのアルファ炭素およびアルファ炭素に結合されたアミン基が除去されたペプチドからなる群れより選択され得る。
本発明に適合するグルカゴン誘導体は、下記の下記化学式1ないし4で表示できる。
前記化学式1ないし4において、「ペプチド」は、天然型グルカゴンである。
前記化学式1のグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンのN末端アミン基が除去されたデス−アミノ−ヒスチジルグルカゴン(以下、「DA−グルカゴン」とする)である。
化学式2のグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンのN末端アミン基がヒドロキシル基に置換されたベータ−ヒドロキシ−イミダゾプロピオニルグルカゴン(以下、「HY−グルカゴン」とする)である。
のグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンのN末端アミン基が2個のメチル基で修飾されたジメチルヒスチジルグルカゴン(以下、「DM−グルカゴン」とする)である。
のグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンのN末端ヒスチジン残基のアルファ炭素およびアルファ炭素に結合されたアミン基が除去されたイミダゾアセチルグルカゴン(以下、「CA−グルカゴン」とする)である。
本発明において使用される用語、「持続型グルカゴン結合体」は、非ペプチドリンカーを介して重合体キャリアに共有結合で連結されたグルカゴンまたはその誘導体を意味し、これは延長した血中半減期および向上した生体内活性を有する。本発明の持続型グルカゴン結合体は、天然型グルカゴンまたはその誘導体に比べて10%以上、好ましくは50%以上増加した血中半減期を有する。
本発明において使用される用語、「非ペプチドリンカー」は、繰返し単位が2個以上結合された生体適合性(biocompatible)重合体を意味し、前記繰返し単位は、ペプチド結合でない任意の共有結合を通じて相互に連結された2個以上の繰返し単位を 含む生体適合性重合体を指している。本発明に適合した非ペプチドリンカーは両末端に官能基を有するため、一方の末端にはグルカゴンまたはその誘導体が共有的に連結され、他方の末端には重合体キャリアが共有的に連結できる。
本発明に適合した非ペプチドリンカーには、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸(polylactic acid、PLA)およびポリ乳酸−グリコール酸(polylactic−glycolic acid、PLGA)のような生分解性(biodegradable)高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸などが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。好ましくは、ポリエチレングリコールが非ペプチドリンカーとして使用できる。
通常のインフレーム融合(inframe fusion)方法で製造された融合タンパク質に使用されるペプチドリンカーは、生体内でタンパク質の加水分解性酵素によって容易に切断され、これによってペプチド薬物の血中半減期増加効果を期待通りに得ることができないという欠点がある。しかし、本発明では、タンパク質の加水分解性酵素に耐性を有する非ペプチドリンカーを用いて、ペプチド薬物の血中半減期を高く維持することができる。したがって、タンパク質の加水分解性酵素に耐性を示すものであれば種類に制限なく使用することができる。
本発明において、非ペプチドリンカーは、分子量が1〜100kDaの範囲、好ましくは1〜20kDaの範囲であることがよい。また、本発明において、非ペプチドリンカーは、一種類のリンカーだけでなく、相異なる種類のリンカーの組み合わせで使用されてもよい。
本発明に適合した非ペプチドリンカーは、その両末端に官能基を有する。非ペプチドリンカーの官能基は、アルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、マレイミドおよびスクシンイミド誘導体からなる群より選択されることが好ましい。本発明に適合したスクシンイミド誘導体の例として、スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチルおよびスクシンイミジルカーボネートが含まれ得るが、これらに限られるものではない。特に、非ペプチドリンカーが両末端にアルデヒド基を有する場合、非特異的反応を最小化しながら、非ペプチドリンカーの両末端にグルカゴンまたはその誘導体および重合体キャリアがそれぞれ結合するのに効果的である。しかも、アルデヒド基による結合は、アミド基によって連結されたものよりはるかに安定である。
前記非ペプチドリンカーの両末端官能基は互いに同一でも異なっていてもよい。例えばペプチドリンカーは、一方の末端にはマレイミド基を、他方の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基を有することができる。両末端にヒドロキシ基を有するPEGを非ペプチドリンカーとして使用する場合には、公知の化学反応によってヒドロキシ基を多様な官能基に活性化することができる。他の方法としては、商業的に入手可能な両末端に変形した官能基を有するPEGを使用することができる。
本発明の非ペプチドリンカーは、グルカゴンまたはその誘導体の多様な部位に結合可能であり、それらの間に結合部位に応じて活性差を示すことができる。例えば、ペプチドリンカーはペプチドのN末端またはN末端以外のC末端を含む他のを部位にそれぞれ結合することができ、これは生体外(in vitro)活性の差を誘導する。非ペプチドリンカーのアルデヒドは、低いpHではグルカゴンまたはその誘導体のN末端に選択的に反応する反面、高いpH、(例えば、pH9.0)ではグルカゴンまたはその誘導体のリシン残基に共有結合を形成することができる。反応pHを異にしてペグ化(pegylation)反応を進行した後、イオン交換カラムをクロマトグラフィー用いて反応混合物から結果として生じる異性体を分離することができる。
非ペプチドリンカーが生体内活性に重要な部位であるN末端以外のペプチドの他の位置に結合する場合、修飾しようとするアミノ酸残基の位置にチオール基を導入し、ペプチドのチオール基と非ペプチドリンカーのマレイミド基との間に共有結合を形成する可能性がある。
また、ペプチドリンカーが生体内活性に重要な部位であるN末端以外のペプチドの他の位置にカップリングする場合、修飾しようとするアミノ酸残基の位置にアミン基を導入し、ペプチドのアミン基と非ペプチドリンカーのアルデヒド基との間に共有結合を形成する可能性がある。
非ペプチドリンカーのアルデヒド基は、グルカゴンのN末端および12番目のリシン残基にあるアミン基と反応することができる。ここで、選択的に反応収率を向上させるために、変形した形態のペプチドを使用することができる。例えば、ペプチドの唯一のアミノ基を、このN末端を遮断(blocking)する方法、他のアミノ酸としてリシン残基を置換する方法、C末端にアミン基を導入する方法等を用い、所望の位置に維持することができる。このような変形を介して、ペグ化および非ペプチドリンカーとペプチドとの間のカップリング反応の収率を向上させることができる。ペプチドのN末端は、これらにより限定されるものではない。ジメチル化(dimethylation)、メチル化(methylation)、脱アミノ化(deamination)またはアセチル化(acetylation)等のような方法によって遮断することができる。
本発明の好ましい実施態様として、持続型グルカゴン結合体は、グルカゴン受容体に結合する能力を維持しながら、グルカゴンまたはその誘導体のN末端以外の天然グルカゴンまたはその誘導体のアミン基に、非ペプチドリンカーを介して重合体キャリアが共有的に連結された構造を有する。
本発明において使用される用語、「重合体キャリア」は、薬物に結合され薬物の生理活性を増加、減少または除去する物質を意味する。しかし、本発明における目的に対して重合体キャリアは、結合されるグルカゴンまたはその誘導体の生理活性の減少を最小化しながら、同時にこれらの生体内安定性を増加させるためのものである。本発明に適合した重合体キャリアとしては、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリアミノ酸、アルブミン、ゼラチン、兔疫グロブリン断片、デキストラン、脂肪酸、ポリサッカライドおよび高分子重合体等が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。重合体キャリアとして、兔疫グロブリンFc断片を使用することが好ましい。
兔疫Fc断片は、生体内で代謝する生分解性ポリペプチドであるため、薬物のキャリアとしての使用に安全である。また、兔疫グロブリンFc断片は、兔疫グロブリン全体分子に比べて相対的に分子量が少ないため、結合体の製造、精製および収率の面で有利である。兔疫グロブリンFc断片がFab断片を維持しないため、これは同質性が大きく増加し、血中抗原性の誘発の可能性が低下すると見られる。
本発明において使用される用語、「兔疫グロブリン(IgG)Fc断片」は、兔疫グロブリンの重鎖不変領域2(CH2)および重鎖不変領域3(CH3)部分を含むが、重鎖と軽鎖の可変領域である免疫グロブリンの重鎖不変領域1(CH1)と軽鎖不変領域(CL1)を含まないタンパク質を意味する。これはさらに重鎖不変領域にヒンジ(hinge)領域を含んでもよい。また、本発明の免疫グロブリンFc断片は、天然型と実質的に同等であるかまたは向上した効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域のみを除き、一部または全体のCH1および/またはCL1を含む拡張されたFc断片であり得る。また、IgG Fc断片はCH2および/またはCH3に相当する、極めて長い一部のアミノ酸配列が除去された断片であってもよい。すなわち、本発明の兔疫グロブリンFc断片は、1)CH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメインおよびCH4ドメイン、2)CH1ドメインおよびCH2ドメイン、3)CH1ドメインおよびCH3ドメイン、4)CH2ドメインおよびCH3ドメイン、5)1個以上の前記ドメインとIgGヒンジ領域(またはヒンジ領域の一部)の組み合わせ、および6)重鎖不変領域の各ドメインおよび軽鎖不変領域の二量体であり得る。
また、本発明のIgG Fc断片は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体(mutant)を含む。本発明に使用される用語、「配列誘導体」とは、一個以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせによって天然アミノ酸配列の中で異なる配列を意味する。例えば、IgG Fcの場合、結合に重要であると知られている214〜238、297〜299、318〜322または327〜331番の位置からアミノ酸残基が変形のために適当な標的として使用できる。また、これらの誘導体はジスルフィド結合を形成できる部位が除去されるか、天然型FcでN末端の特定のアミノ酸残基が除去されるか、または天然型FcのN末端にメチオニン残基が導入されることによって製造できる。さらに、エフェクター機能を除去するために、補体結合部位(例として、C1q結合部位)が除去されてもよく、ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity)部位が除去されてもよい。このような配列誘導体の製造は当該技術分野、例えば国際特許公開第1997/34631号、国際特許公開第1996/32478号でよく知られている。
タンパク質およびペプチドにおいて、分子の活性を全体的に変更させないアミノ酸交換は、当該分野で公知のものである(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最も通常的に起こる交換は、両側の方向からアミノ酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、およびAsp/Gly間の交換である。
また、前記Fc断片は、必要によっては、リン酸化(phosphorylation)、硫酸化(sulfation)、アクリル化(acrylation)、糖化(glycosylation)、メチル化(methylation)、ファルネシル化(farnesylation)、アセチル化(acetylation)、アミド化(amidation)などによって修飾(modification)されてもよい。
前述したFc誘導体は、本発明のFc断片と同様の生物学的活性、または例えば熱、pH等に対する向上した構造的安定性を有する誘導体であってもよい。
また、このようなFc断片は、ヒトおよび牛、ヤギ、豚、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットのような動物から分離した天然型から得られてもよく、形質転換された動物細胞または微生物から得られた組み換え型またはその誘導体であってもよい。ここで、天然型兔疫グロブリンから取得する方法は、全体の兔疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、タンパク質分解性酵素を処理して得ることができる。パパインは天然兔疫グロブリンをFabおよびFc断片に切断し、ペプシンを処理した場合にはpFc’およびF(ab)2を生産する。切断された断片を例えば、サイズ排除クロマトグラフィー等を用いてFcまたはFc’を分離することができる。好ましくは、ヒト由来の兔疫グロブリンFc断片は微生物から収得した組み換え型兔疫グロブリンFc断片である。
さらに、本発明の兔疫グロブリンFc断片は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖を有する形態であるとか、または非糖鎖糖化した形態であってもよい。兔疫グロブリンFc糖鎖の増加、減少または除去には、化学的方法、酵素学的方法および微生物を用いた遺伝工学的方法のような通常の方法が利用できる。ここで、兔疫グロブリンFcからの糖鎖の除去は1番目の補体成分C1のC1q部分に結合親和力が著しく低下し、抗体依存性細胞媒介細胞毒性(ADCC)または補体依存性細胞毒性(CDC)が減少または除去されるため、これによって生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このような点で、糖鎖がされたり、非糖鎖化された形態である兔疫グロブリンFc断片は薬物キャリアとして本発明の目的により適合していると言える。
本発明において使用される用語、「糖鎖の除去(deglycosylation)」は、酵素学的にFc断片から糖を除去することを意味し、用語、「非糖鎖化(aglycosylation)」は、Fc断片が原核動物、好ましくは、大膓菌によって糖鎖化されていない形態で生産されることを意味する。
一方、兔疫グロブリンFc断片は、ヒトまたは牛、ヤギ、豚、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットを含む他の動物由来であってもよく、好ましくは、ヒト由来である。また、兔疫グロブリンFc断片は、IgG、IgA、IgD、IgEおよびIgM由来またはこれらの組み合わせ(combination)またはこれらのハイブリッド(hybrid)によって造られたFc断片であってもよい。好ましくは、ヒトの血液に最も豊富なタンパク質の中でIgGまたはIgM由来であり、最も好ましくは、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させるものとして公知のIgG由来である。
一方、本発明において使用される用語、「組み合わせ(combination)」とは、二量体または多量体を形成する時、同一起源の単鎖兔疫グロブリンFc断片をコード化するポリペプチドが、異なる起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。すなわち、二量体または多量は、IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc、およびIgG4 Fc断片からなる群より選択された2個以上の断片から形成されることができる。
本発明において使用される用語、「ハイブリッド(hybrid)」とは、単鎖の兔疫グロブリンFc断片内に異なる起源の2個以上の兔疫グロブリンFc断片をコード化する配列を意味する。本発明において、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、ドメインハイブリッドは、IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3 FcおよびIgG4 FcのCH1、CH2、CH3およびCH4からなる群より選択された1個〜4個のドメインからなることができ、ヒンジ領域を含むことができる。
一方、IgGも、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4のサブクラスに分けることができ、本発明では、これらの組み合わせまたはこれらのハイブリッドも可能である。好ましくは、IgG2およびIgG4のサブクラスであり、最も好ましくは、補体依存性細胞毒性(CDC)のようなエフェクター機能(effector function)がほとんどないIgGの4Fc断片である。
すなわち、本発明の重合体キャリア用として、最も好ましい兔疫グロブリンFc断片は、ヒトIgG4由来の非糖鎖化されたFc断片である。ヒト由来のFc断片は、非ヒト由来のFc断片よりさらに好ましく、これはヒトの体内で抗原として作用することができ、抗体に対する新たな抗体を生成するなどの、好ましくない免疫反応を誘発しない。
好ましい実施態様において、本発明にかかる持続型グルカゴン結合体は、下記化学式5で表示することができる。
前記式中、R1は、ヒスチジン(His)、デス−アミノ−ヒスチジル、N−ジメチル−ヒスチジル、ベータ−ヒドロキシイミダゾプロピルおよび4−イミダゾアセチルからなる群より選択され、
R2は、−NH2、−OHおよび−リシン(Lys)からなる群より選択され、
Xは、SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTであり、
Yは、ポリエチレングリコール(PEG)であり、
Zは、兔疫グロブリンFc断片である。
本発明の好ましい実施態様にかかる、持続型グルカゴン結合体において、PEGの両末端がそれぞれCA−グルカゴン(すなわち、前記化学式5において、R1が4−イミダゾアセチルの場合)の12番目のリシン(Lys12)と兔疫グロブリンFc断片のN末端に相互共有的に連結されたものである。
他の態様として、本発明は、前記持続型グルカゴン結合体の製造方法を提供する。
本発明による製造方法は:
1)天然型グルカゴンまたはその誘導体を、両末端に官能基を有する非ペプチドリンカーと反応させるステップと、
2)ステップ1)の反応混合物から、非ペプチドリンカーの一方の末端に天然型グルカゴンまたはその誘導体が共有的に連結された複合体を分離するステップと、
3)ステップ2)で分離された複合体を重合体キャリアと反応させるステップ、および
4)ステップ3)の反応混合物から、非ペプチドリンカーの一方の末端には天然型グルカゴンまたはその誘導体が、他方の末端には重合体キャリアが共有的に連結された持続型グルカゴン結合体を分離するステップとを含むことができる。
本発明において使用される用語、「複合体(complex)」とは、非ペプチドリンカーの一方の末端に天然のグルカゴンまたはその誘導体が共有的に連結された中間体を意味する。本発明の方法によれば、複合体は非ペプチドリンカーの他方の末端と重合体キャリアの間に共有結合を形成するように注入される。
ステップ1)において、非ペプチドリンカーとグルカゴンまたはその誘導体を反応させ、それらの間に複合体を形成する。このステップで、配列番号1のアミノ酸配列を有する天然型グルカゴンまたはその誘導体が使用できる。誘導体の例は下記に含まれる:天然型グルカゴンのN末端アミン基が除去された化学式1のDA−グルカゴン;天然型グルカゴンのN末端アミン基がヒドロキシル基に置換された化学式2のHY−グルカゴン、天然型グルカゴンのN末端アミン基が2個のメチル基で修飾された化学式3のDM−グルカゴン、天然型グルカゴンのN末端ヒスチジンのアルファ炭素およびアルファ炭素に結合されたアミン基が除去された化学式4のCA−グルカゴンが使用できる。
ステップ1)において使用された非ペプチドリンカーは、両末端に官能基を有する。非ペプチドリンカーの官能基は、好ましくは、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、マレイミド基およびスクシンイミド誘導体からなる群より選択される。本発明に適合したスクシンイミド誘導体の例として、これらに限定されないが、スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチルおよびスクシンイミジルカーボネートを含んでもよい。前記非ペプチドリンカーの両末端官能基は互いに同一でも異なっていてもよい。好ましくは、非ペプチドリンカーとして、両末端にアルデヒド基を有するPEGを使用する。非ペプチドリンカーのこのようなアルデヒド基は非特異的反応を最小化しながら、非ペプチドリンカーの両末端にグルカゴンまたはその誘導体および重合体キャリアがそれぞれ結合するのに効果的である。また、アルデヒド基による結合は、アミド基によるものよりはるかに安定である。
ステップ1)において、ペプチドリンカーが天然型グルカゴンまたはその誘導体のN末端以外のアミノ酸残基、好ましくは、12番目のリシン残基に共有的に連結される。ステップ1)において、N末端以外のアミノ酸残基、好ましくは、12番目のリシン残基で非ペプチドリンカーの選択的結合のために、グルカゴンまたはその誘導体と非ペプチドリンカーをpH7.5〜10.0、好ましくはpH9.0の条件で反応させる。この時、グルカゴンまたはその誘導体と非ペプチドリンカー間の反応モル比は、1:5〜1:50の範囲、好ましくは1:20〜1:30の範囲であり得る。ステップ1)において、N末端の除去または保護された形態のグルカゴン誘導体の使用は、非ペプチドリンカーがグルカゴン誘導体のN末端に結合するのを未然に防止することができる。
ステップ1)の反応は、非ペプチドリンカーの両末端の官能基の種類を考慮して、選択的に還元剤の存在下で実施できる。好ましい還元剤の例としては、ナトリウムシアノボロハイドライド(NaCNBH3)、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンホウ酸塩またはピリジンホウ酸塩などが含まれるが、これに制限されない。
ステップ2)においては、ステップ1)の反応混合物から、非ペプチドリンカーの一方の末端にグルカゴンまたはその誘導体が共有的に連結されたグルカゴン−非ペプチドリンカー複合体が分離される。ステップ2)において分離される複合体は、グルカゴン−非ペプチドリンカーの構造を有している。要求される純度および生成された産物の分子量および電荷量のような特性を考慮して、分離段階はタンパク質の分離に用いられる通常の方法の中から、必要に応じて適切に選択して行うことができる。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを使用することができる。必要によっては、より高純度に精製するために、複数の互いに異なる方法を組み合わせて用いることができる。
ステップ3)においては、ステップ2)で分離されたグルカゴン−非ペプチドリンカー複合体を重合体キャリアと反応させ、非ペプチドリンカーの露出した末端に重合体キャリアを共有結合で連結する。このステップに適合した重合体キャリアは、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリアミノ酸、アルブミン、ゼラチン、兔疫グロブリン断片、デキストラン、脂肪酸、ポリサッカライドおよび高分子重合体からなる群より選択できるが、これらに限定されない。好ましくは、兔疫グロブリン(IgG)Fc断片が重合体キャリアとして使用できる。
このステップにおいて、複合体と重合体キャリアは、1:2〜1:10、好ましくは1:4〜1:8の反応モル比で、pH5.0〜8.0、好ましくはpH6.0で反応する。この時、反応に加わる非ペプチドリンカーの両末端官能基の種類を考慮して、必要に応じて還元剤の存在下で実施できる。還元剤の例として、ナトリウムシアノボロハイドライド(NaCNBH3)、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンホウ酸塩およびピリジンホウ酸塩などが含まれ得るが、これに限定されない。
ステップ4)は、ステップ3)の反応混合物から、非ペプチドリンカーの一方の末端にはグルカゴンまたはその誘導体が、他の一方の末端には重合体リンカーが共有的に連結された持続型グルカゴ結合体を分離するステップである。要求される純度および生成された産物の分子量および電荷量のような特性を考慮して、分離段階はタンパク質の分離に用いられる通常の方法の中から、必要に応じて適切に選択して行うことができる。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを含む多様な公知の方法を使用することができ、必要によっては、より高純度に精製するために、複数の互いに異なる方法を組み合わせて用いることができる。
好ましい一実施態様として、本発明にかかる製造方法は:
1)化学式4のグルカゴン誘導体を、両末端にアルデヒドを有するPEGとpH9.0で反応させるステップと、
2)ステップ1)の反応混合物から、グルカゴン誘導体の12番目のリシン残基にPEGの一方の末端が共有的に連結されたグルカゴン−PEG複合体を分離するステップと、
3)ステップ2)で分離されたグルカゴン誘導体−PEG複合体を兔疫グロブリンFc断片と反応させるステップ、および
4)ステップ3)の反応混合物から、PEGの一方の末端にはグルカゴン誘導体が、他方の末端には兔疫グロブリンFc断片が共有的に連結された持続型グルカゴン結合体を分離するステップとを含むことができる。
さらに他の面において、本発明は、前記持続型グルカゴン結合体を有効成分として含む肥満の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
本発明において使用される用語、「肥満(obesity)」は、エネルギーの不均衡によって過度の体脂肪を有する状態(condition)または疾患(disease)を意味する。本発明による薬学的組成物を個体に投与することにより、体重を著しく減量し食餌摂取を減少させ、肥満を予防または治療することができる。
本発明において使用される用語、「予防」とは、本発明による薬学的組成物の投与で肥満の発病を抑制または遅延させるすべての行為を意味する。
本発明において使用される用語、「治療」とは、本発明による薬学的組成物の投与で肥満の症状が好転するか有利に変更されるすべての行為を意味する。
本発明の薬学的組成物は、延長した血中半減期および向上した生体内持続性および安定性を有する持続型グルカゴン結合体を有効成分として含むため、薬物の投与用量を画期的に減少させながらも血中グルコースレベルのゆらぎのない改善された服薬順応度を示し、肥満の予防および治療に有用に使用できる。
本発明の薬学的組成物は、有効成分として、本発明による持続型グルカゴン結合体のほか、抗肥満薬物をさらに含むことができる。
本発明により、持続型グルカゴン結合体と併用投与するのに適合した抗肥満薬物の例としては、GLP−1作動剤、レプチン(Leptin)作動剤、DPP−IV阻害剤、Y5受容体拮抗剤(antagonist)、メラニン濃縮ホルモン(MCH)拮抗剤、Y2/3作動剤、MC3/4作動剤、胃/膵臓リパーゼ(gastric/pancreatic lipase)阻害剤、5HT2c作動剤、β3A作動剤、アミリン(amylin)作動剤およびグレリン(ghrelin)拮抗剤等が含まれるが、これらに限定されるものではない。
好ましくは、本発明による薬学的組成物は、抗肥満薬物として、大韓民国特許出願公開第10−2008−0064750号に開示された持続型エキセンディン−4結合体を含むことができる。前記持続型エキセンディン−4結合体は、エキセンディン−4(GenBacnk Accession No.AAB22006、配列番号:2)またはその誘導体が、非ペプチドリンカーを介して兔疫グロブリンFc断片と共有的に連結された結合体である。好ましい実施様態において、エキセンディン−4のN末端アミン基が除去された誘導体(DA−エキセンディン−4)であるペプチド、天然型エキセンディン−4のN末端アミン基がヒドロキシル基に置換された誘導体(HY−エキセンディン−4)であるペプチド、天然型エキセンディン−4のN末端アミン基がジメチル基で修飾された誘導体(DM−エキセンディン−4)であるペプチド、および天然型エキセンディン−4のN末端ヒスチジン残基のアルファ炭素およびアルファ炭素に結合されたアミン基が除去された誘導体(CA−エキセンディン−4)であるペプチドから選択されるエキセンディン−4誘導体が、非ペプチドリンカーを介して兔疫グロブリンFc断片と共有的に連結される。
抗肥満薬物と併用投与する場合、本発明の持続型グルカゴン結合体は、持続型グルカゴン結合体の単独投与に比べて、体重の減少および食餌摂取の減少に相乗的効果(synergic effect)が現れる。特に、本発明の持続型グルカゴン結合体を持続型エキセンディン−4結合体のような抗肥満薬物と併用投与すると、持続型グルカゴン結合体 がグルカゴン受容体に作用すると同時に、抗肥満薬物がGLP−1受容体に作用するため、より効果的に体重を減少させ食餌摂取を減少させることができる。前記持続型ペプチド結合体の併用投与は、画期的に増加した血中半減期および生体内効力持続効果を示し、より安定的な血中グルコースレベルの変化推移を示すだけでなく、投与量を画期的に減少させることができ、改善された服薬順応度を示すため、本発明の薬学的組成物は、肥満の予防または治療に有用に使用できる。
好ましい一実施態様において、食餌性誘導肥満(Diet−Induced Obesity、DIO)マウスに、本発明の持続型グルカゴン結合体と持続型エキセンディン−4結合体を併用投与した後、体重、飼料摂取量、血糖の変化推移を観察した。その結果、前記薬物の単独投与に比べて、併用投与した場合に、顕著な体重減少および飼料摂取抑制効果が現れ、血中グルコロースレベルの変化もまた安定的な推移を示した(図1ないし図3参照)。これに反し、DIOマウスに天然型グルカゴンと持続型エキセンディン−4結合体を併用投与した場合には、体重は減少したものの、血中グルコースレベルが激しくゆらぎながら変化する様相を示した(図4および図5参照)。このような結果と通し、グルカゴンおよびエキセンディン−4とも持続型結合体の時にのみ、血中グルコースレベルのゆらぎのような任意の副作用がない、体重減少および食餌摂取減少の相乗的効果を期待することができ、生体内の持続性および安定性により薬物の投与用量を画期的に減少できることを確認した。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。例えば、経口投与の場合、薬学的に許容可能な担体は、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素および香料等を含むことができる。注射投与の場合、薬学的に許容可能な担体は、緩衝剤、保存剤、鎮痛剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを使用することができる。局所投与用の場合、薬学的に許容可能な担体は基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。
本発明の薬学的組成物は、前述のような薬剤学的に許容可能な担体と混合して多様な剤形に製造することができる。例えば、経口投与時には薬学的組成物は錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップまたはウエハーなどの形態で製造することができる。注射剤の場合、薬学的組成物は一回量の投薬形態としてアンプルまたは多数回の服用容器のような投薬形態で製造することができる。薬学的組成物は、その他に溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセルおよび持続型製剤等に剤形化することができる。
一方、本発明の薬学的に許容可能な製剤化に適合した担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシア・ゴム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートまたは鉱物油などが使用できる。また、本発明の薬学的組成物は充填剤、抗凝固剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤等をさらに含むことができる。
本発明の薬学的組成物は、目的の組織に到逹できる限り、何らかの一般的な経路を介して投与できる。投与の様々な方法としては、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与および直腸内投与等が含まれ得るが、これらに限定されない。
しかし、経口投与時、ペプチドは消化されるため、経口用組成物は、薬学的組成物の活性成分をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。好ましくは、本発明の薬学的組成物は注射剤の形態で投与できる。また、本発明の薬学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与できる。
本発明の薬学的組成物の投与頻度と投与量は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別および体重および疾患の重症度等の様々な関連因子とともに、活性成分である薬物の種類によって決定される。例えば、抗肥満薬物との併用投与時、本発明の持続型グルカゴン結合体は、10〜4000μg/kg、好ましくは50〜2000μg/kgの用量で毎週投与することができ、そして5〜100μg/kg、好ましくは10〜50μg/kgの持続型エキセンディン−4結合体を毎週投与することができる。しかし、投与量は投与経路、疾病の重症度および患者の性別、体重および年齢等によって増減することがあるため、前記投与量がどのような方法によっても本発明の範囲を限定するものではない。生体内持続性および力価に優れているため、本発明の薬学的組成物は投与頻度を著しく減少させることができる。本発明の薬学的組成物は、延長した血中半減期とともに生体内持続性および安全性に優れており、薬物の投与頻度および投与量を顕著に減少させることができる。
さらに他の態様によれば、本発明は、治療学的に有効な量の持続型グルカゴン結合体を、これを必要とする対象に投与することを含む、肥満を予防または治療する方法を提供する。この時、本発明の持続型グルカゴン結合体とともに抗肥満薬物を併用投与することができる。
持続型グルカゴン結合体と併用投与できる抗肥満薬物は、好ましくは、大韓民国特許出願公開第10−2008−0064750号に開示された持続型エキセンディン−4結合体である。前記持続型エキセンディン−4結合体は、エキセンディン−4またはその誘導体が、非ペプチドリンカーを介して兔疫グロブリンFc断片と共有的に連結された結合体である。好ましい持続型エキセデイン−4結合体において、エキセンディン−4のN末端アミン基が除去された誘導体(DA−エキセンディン−4)、N末端アミン基がヒドロキシル基に置換された誘導体(HY−エキセンディン−4)、N末端アミン基が2個のメチル基で修飾された誘導体(DM−エキセンディン−4)およびエキセンディン−4のN末端ヒスチジン残基のアルファ炭素およびアルファ炭素に結合されたアミン基が除去された誘導体(CA−エキセンディン−4)から選択されるエキセンディン−4誘導体が、非ペプチドリンカーを介して兔疫グロブリンFc断片と共有的に連結されるが、本発明がこれに限定されるものではない。
本発明において使用される用語、「投与」は、何らかの適切な方法で患者に有効成分を導入することを意味する。投与経路は、有効成分が標的組織に到逹できる限り、任意の一般的な経路を介して投与できる。投与経路の例は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与および直腸内投与を含むことができるが、これらに限定されない。しかし、経口投与時、ペプチドは消化されるため、経口用組成物は、有効成分をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化することが好ましい。好ましくは、活性成分は注射剤の形態で剤形化できる。また、持続性製剤は、有効成分を標的細胞に伝達できる任意の装置を用いて投与できる。
治療となる対象の例としては、ヒト、猿、牛、馬、羊、豚、ニワトリ、七面鳥、ウズラ、猫、犬、マウス、ネズミ、ウサギおよびモルモットを含むが、これらに限定されない。好ましくは、哺乳類である。より好ましくは、ヒトである。
有効成分の文脈で使用された用語、「治療学的に有効な量」は、疾患を予防または治療するために有効な量を意味し、即ち肥満を適切な利益/危険の割合で治療または予防するのに有効な量を意味する。
抗肥満薬物を併用投与する場合、本発明の持続型グルカゴン結合体はグルカゴン受容体に作用し、これと同時に、抗肥満薬物はGLP−1受容体に作用し、血中グルコースレベルのゆらぎのような任意の副作用なくより効果的に体重を減少させ食餌摂取を減少させることができる。したがって、本発明の持続型ペプチド結合体は、肥満を予防または治療するのに極めて効果的である。
本発明のよりよい理解は、例示すために記された下記の実施例を介して得られるが、発明を限定するものとして解釈されるものではない。
実施例1:イミダゾ−アセチルグルカゴン−兔疫グロブリンFc結合体の製造
イミダゾ−アセチル(imidazo−acetyl)グルカゴン(CA−グルカゴン、AP、米国)を、CA−グルカゴンの12番目のリシン(Lys12)残基にペグ化させるために3.4K PropionALD(2)PEG(両末端にプロピオンアルデヒド基を有するPEG、IDB Inc.、大韓民国)に反応させた。この時、CA−グルカゴンとPEGのモル比を1:30にし、ペプチドの濃度を3mg/mLとし、室温で3時間反応させた。さらに、反応は、還元剤として20mMSCBの存在下で、100mMホウ酸ナトリウム(Na−borate)緩衝液中(pH9.0) で行われた。反応終了後、収得された生成物である、CA−グルカゴン−PEG複合体を下記の条件でSOURCE Sカラム(XK16mL、GE Healthcare)を用いたクロマトグラフィーを行い、精製した。
カラム:SOURCE S(XK16mL、GE Healthcare)
流速:2.0mL/分
勾配:溶出液A0%→溶出液B50%(A:20mMクエン酸、pH3.0、B:A+1M KCl)で50分間溶出
前記の精製されたCA−グルカゴン−PEG複合体を兔疫グロブリン(IgG)Fc断片(大韓民国特許登録第10−725315号に従って製造)と1:8のモル比で混合し、ペプチド濃度を20mg/mLにし、4℃で20時間反応させた。この時、反応は、還元剤として20mM SCBの存在下で、pH6.0の100mM K−P緩衝液中で行われた。反応終了後、反応混合物を下記の条件でSOURCE Pheカラム(HR16mL、GE Healthcare)とSOURCE Qカラム(XK16mL、GE Healthcare)を用いた2つの段階のクロマトグラフィーを行い精製した。
カラム:SOURCE Phe(HR16mL、GE Healthcare)
流速:7.0mL/分
勾配:溶出液A100%→0%(A:20mMトリス、pH7.5+2M NaCl)
で60分間溶出
カラム:SOURCE Q(XK16mL、GE Healthcare)
流速:2.0mL/分
勾配:溶出液A0%→溶出液B20%(A:20mMトリス、pH9.0、B:A+1M NaCl)で70分間溶出
まず、SOURCE Pheカラムを用いて、結合反応に加わらない多量の免疫グロブリンFcを除去した。20mM Tris(pH7.5)で1M NaClを用いて塩勾配を与え、相対的に結合親和力の弱いIgGFcを、まず溶出させ、その直後にCA−グルカゴン−PEG−Fc結合体を溶出させた。一次精製によってある程度免疫グロブリンFc断片が除去されるが、IgGFc断片とCA−グルカゴン−PEG−Fc結合体は互いに結合力の差が大きくなく、完全な分離が難しかった。二次精製工程のために、2つの物質の疎水性(hydrophobicity)を利用した。20mM Tris(pH9.0)を用いて一次精製された試料をSOURCE Qカラムにカップリングさせた。試料を1M NaClで塩勾配を与えながら溶出した。SOURCE Qカラムにおいて、弱い結合親和力を有する免疫グロブリンFc断片が先に溶出され、強い結合親和力を有するCA−グルカゴン−PEG−Fc複合体がその後溶出された。逆相HPLCで分析した結果、前記の精製されたCA−グルカゴン−PEG−Fc複合体は95.8%の純度を示した。
実施例2:イミダゾ−アセチルエキセンディン−4−兔疫グロブリンFc結合体の製造
イミダゾ−アセチルエキセンディン−4(CA−エキセンディン−4、AP、米国)を3.4K PropionALD(2)PEG(両末端にプロピオンアルデヒド基を有するPEG、IDB Inc.、韓国)とCA−エキセンディン−4の27番目のリシン(Lys27)残基にペグ化させるために反応させた。この時、CA−エキセンディン−4とPEGのモル比を1:30にし、ペプチドの濃度を3mg/mLにして4℃で12時間反応させた。さらに、反応は還元剤として20mM SCBの存在下で、100mMのリン酸ナトリウム(Na−phosphate)緩衝液中(pH7.5)で行われた。反応終了後、収得された生成物のCA−エキセンディン−4−PEG複合体を下記の条件でSOURCE Qカラム(XK16mL、GE Healthcare)とSOURCE Sカラム(XK16mL、GE Healthcare)を用いた2つの段階のクロマトグラフィーを行い精製した。
カラム:SOURCE Q(XK16mL、GE Healthcare)
流速:2.0mL/分
勾配:溶出液A 0%→溶出液B20%(A:20mMトリス、pH9.0、B:A+
1M NaCl)で70分間溶出
カラム:SOURCE S(XK16mL、GE Healthcare)
流速:2.0mL/分
勾配:溶出液A0%→溶出液B50%(A:20mMクエン酸、pH3.0、B:A+
1M KCl)で50分間溶出
具体的には、SOURCE Qカラムによって一次的にモノペグ化された(monopegylated)ペプチドをSOURCEQカラムによって精製し、続いてSOURCEQカラムによって異性体を分離した。N末端がペグ化された(N−term pegylated)ペプチドのピークが先に溶出され、その後、リシンがペグ化された(Lys−pegylated)2個のピークが溶出された。2個のリシンーペグ化されたピークのペプチドマッピング(mapping)は、先に溶出されたピークのペグ化された分画が12番目のリシン(Lys12)にペグ化された複合体であり、一番後に溶出された分画が27番目のリシン(Lys27)にペグ化された複合体であることを示した。
したがって、得られたLys27ペグ化したCA−エキセンディン−4PEG複合体を兔疫グロブリンFc断片(大韓民国特許登録第10−725315号に従って製造)と1:8のモル比で混ぜ、続いて全体のペプチド濃度を20mg/mLにし、4℃で20時間反応させた。この時、反応は、還元剤として20mM SCBの存在下で、100mM K−P緩衝液中(pH6.0)で行われた。反応終了後、反応混合物を下記の条件でSOURCE Qカラム(XK16mL、GE Healthcare)とSOURCE ISOカラム(HR16mL、GE Healthcare)を用いた2つの段階のクロマトグラフィーを行い、精製した。
カラム:SOURCE Q(XK16mL、GE Healthcare)
流速:2.0mL/分
勾配:溶出液A0%→溶出液B20%(A:20mMトリス、pH9.0、B:A+1M NaCl)で70分間溶出
カラム:SOURCE ISO(HR16mL、GE Healthcare)
流速:7.0mL/分
勾配:溶出液A100%→0%60分(A:20mMトリス、pH7.5+1.5M硫酸アンモニウム)で60分間溶出
最初に、反応に加わらない多量の免疫グロブリンFcを除去するために、SOURCE Qカラムを用いた。20mM Tris(pH7.5)で1M NaClを用いて塩勾配を与え、相対的に結合親和性が弱い免疫グロブリンFc断片を先に溶出し、その後CA−エキセンディン−4−PEG−Fc結合体を溶出した。一次精製によってある程度免疫グロブリンFc断片が除去されるが、イオン交換カラムでは免疫グロブリンFc断片とCA−エキセンディン−4−PEG−Fc結合体との間に類似した結合親和性によって相互に完全な分離が難しかった。二次精製のために、それらの間に疎水性の違いを活用した。SOURCE ISOカラムに20mM Tris(pH7.5)1.5M硫酸アンモニウムを用いて一次精製された試料をカップリングさせた。その後、徐々に塩濃度の勾配を用いて試料を溶出した。SOURCE ISOカラムで、結合親和力の弱い免疫グロブリンFc断片が先に溶出され、結合親和力が強いCA−エキセンディン−4−PEG−Fc結合体はその後に溶出された。逆相HPLCで分析した結果、前記の精製されたCA−エキセンディン−4−PEG−Fc結合体は91.6%の純度を示した。
実施例3:持続型グルカゴン結合体と抗肥満薬物の併用投与による相乗的効果
実施例1で製造された持続型グルカゴン結合体と、実施例2で製造された持続型エキセンディン−4結合体の併用投与による相乗的効果を確認するために、食餌性誘導肥満(DIO)マウスの体重、飼料摂取量および血中グルコースレベルの変化について分析した。
5週齢のC57BL/6マウス(オリエント社、大韓民国)に、13週間、高脂肪式ダイエットを実施し、糖尿病モデルとして食餌性誘導肥満(DIO)マウスを得た。具体的には、マウスを体重によって1グループあたり5匹ずつ、G1、G2、G3、G4およびG5の5つのグループに分離した後、高脂肪飼料(D12492,Research Diets,Inc.New Brunswick,NJ)を毎日変えながら、動物が自由に摂取できるようにした。18週齢(50g/head)になった5つのグループのマウスに、それぞれ対照区として、担体(vehicle);CA−エキセンディン−4−PEG−Fc結合体(HM11260C);CA−エキセンディン−4−PEG−Fc結合体(HM11260C)+CA−グルカゴン;およびCA−エキセンディン−4−PEG−Fc結合体(HM11260C)+CA−グルカゴン−PEG−Fc結合体(LAPS CA−グルカゴン)を、用量を異にして約2週間投与した。
この時、G2グループには毎週20μg/kgの投与量でCA−エキセンディン−4−PEG−Fc結合体を、G3グループには毎週20μg/kgの投与量でCA−エキセンディン−4−PEG−Fc結合体+1日2回ずつ100μg/kgの投与量でCA−グルカゴンを、G4グループには毎週20μg/kgの投与量でCA−エキセンディン−4−PEG−Fc結合体+毎週700μg/kgの投与量でCA−グルカゴン−PEG−Fc結合体を、G5グループには毎週20μg/kgの投与量でCA−エキセンディン−4−PEG−Fc結合体+毎週1400μg/kgの投与量でCA−グルカゴン−PEG−Fc結合体を投与した。
前記試験物質の投与後、各グループに対して、毎日、体重、飼料摂取量および血糖の変化を測定した。
図1ないし図3に示されたように、持続型グルカゴン結合体と持続型エキセンディン−4結合体を併用投与したグループから、他のグループに比べて確実な体重減少および飼料摂取量減少効果を確認した。特に、天然型グルカゴンと持続型エキセンディン−4結合体を併用投与したグループで体重は減少したものの、血中グルコースレベルで激しいゆらぎが観察された。しかし、持続型グルカゴン結合体と持続型エキセンディン−4結合体を併用投与したグループは安定的な血中グルコースレベルの変化推移を示した。
これらの結果は、グルカゴンとエキセンディン−4の双方が持続型結合体の時、併用投与は血中グルコースレベルのゆらぎがなく、体重減少および食餌摂取阻害の相乗効果を誘導することができる。さらに、本発明の持続型結合体は、延長された血中半減期および改善された生体内の持続性により、著しく少ない投与用量で投与できるため、肥満の予防および治療に対する使用が効果的であるといえる。
比較例1:天然型グルカゴンと持続型エキセンディン−4結合体の併用投与
天然型グルカゴンと実施例2にて製造された持続型エキセンディン−4結合体の併用投与による効果を確認するために、実施例3におけて記述した同様の方法に従って、食餌性誘導肥満(DIO)マウスに対照区として、担体(G1);天然型グルカゴンペブチド(G2);CA−エキセンディン−4−PEG−Fc結合体(HM11260C)(G3);および天然型グルカゴン+CA−エキセンディン−4−PEG−Fc結合体(HM11260C)(G4)を、用量を異にして約2週間投与した。
この時、G2グループには1日2回ずつ200μg/kgの天然型グルカゴンを、G3グループには毎週20μg/kgのCA−エキセンディン−4−PEG−Fc結合体を、G4グループには1日2回ずつ200μg/kgの天然型グルカゴン+毎週20μg/kgのCA−エキセンディン−4−PEG−Fc結合体を投与した。
前記試験物質の投与後、各グループのマウスに対して、毎日、体重、飼料摂取量および血中グルコースレベルの変化を測定した。
図4および図5に示されたように、他のグループに比べて、天然型グルカゴンと持続型エキセンディン−4結合体を併用投与したグループで増加した体重減少効果が確認されたが、血中グルコースレベルが激しくゆらぎながら変化する様相が観察された。
本発明の持続型グルカゴン結合体は、増加した血中半減期と改善された生体内持続性および安定性を示す。したがって、抗肥満薬物との併用投与時、本発明の持続型グルカゴン結合体は、極めてし少量の投与量で投与することができ、血中グルコースレベルのゆらぎなく服薬順応度が改善されることを示す。したがって、本発明の持続性グルカゴン結合体は、肥満の予防および治療に効率的に使用できる。

Claims (42)

  1. グルカゴン誘導体が、非ペプチドリンカーによって重合体キャリアに共有的に連結された、持続型グルカゴン結合体であって、
    前記グルカゴン誘導体が、天然型グルカゴンのN末端の1番目のアミノ酸であるヒスチジン残基のアルファ炭素またはそれに結合されたアルファアミン基が置換、修飾または除去されたものである、持続型グルカゴン結合体。
  2. 前記グルカゴン誘導体が、天然型グルカゴンの一番目のN末端ヒスチジン残基のアミン基が除去された誘導体、その一番目のN末端ヒスチジン残基のアミン基がヒドロキシル基(hydroxyl group)に置換された誘導体、その一番目のN末端ヒスチジン残基のアミン基が2個のメチル基で修飾された誘導体およびその一番目のN末端ヒスチジン残基のアルファ炭素およびアルファ炭素に結合されたアミン基が除去された誘導体からなる群より選択されるものである、請求項1に記載の持続型グルカゴン結合体。
  3. 前記グルカゴン誘導体が、下記化学式1〜4で表示される誘導体からなる群より選択されるものである、請求項2記載の持続型グルカゴン誘導体:
    式中、「ペプチド」は、天然型グルカゴンである。
  4. 前記非ペプチドリンカーの一方の末端がグルカゴン誘導体に、他方の末端は重合体キャリアに共有的に連結されるものである、請求項1に記載の持続型グルカゴン結合体。
  5. 前記非ペプチドリンカーが、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるものである、請求項1に記載の持続型グルカゴン結合体。
  6. 前記非ペプチドリンカーが、1〜100kDaの範囲の分子量を有するものである、請求項1に記載の持続型グルカゴン結合体。
  7. 前記非ペプチドリンカーが、両末端にそれぞれグルカゴンまたはその誘導体および重合体キャリアと共有的に連結できる官能基を有するものである、請求項1に記載の持続型グルカゴン結合体。
  8. 前記官能基がアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、スクシンイミジルプロピオン酸、ヒドロキシスクシンイミジルカルボキシメチルおよびスクシンイミジルカーボネートからなる群より選択される官能基を有するものである、請求項7に記載の持続型グルカゴン結合体。
  9. 前記非ペプチドリンカーが、両末端にアルデヒド基を有するものである、請求項8に記載の持続型グルカゴン結合体。
  10. 前記非ペプチドリンカーが、両末端にアルデヒド基を有するポリエチレングリコール(PEG)である、請求項9に記載の持続型グルカゴン結合体。
  11. 前記重合体キャリアが、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリアミノ酸、アルブミン、ゼラチン、兔疫グロブリン断片、デキストラン、脂肪酸、ポリサッカライドおよび高分子重合体からなる群より選択されるものである、請求項1に記載の持続型グルカゴン結合体。
  12. 前記重合体キャリアが、兔疫グロブリンFc断片である、請求項11に記載の持続型グルカゴン結合体。
  13. 前記兔疫グロブリンFc断片が、非糖鎖化されたものである、請求項12に記載の持続型グルカゴン結合体。
  14. 前記兔疫グロブリンFc断片が、CH1、CH2、CH3およびCH4ドメインからなる群より選択される1個〜4個のドメインからなるものである、請求項12に記載の持続型グルカゴン結合体。
  15. 前記兔疫グロブリンFc断片が、ヒンジ領域をさらに含むものである、請求項12に記載の持続型グルカゴン結合体。
  16. 前記兔疫グロブリンFc断片が、IgG、IgA、IgD、IgEおよびIgMからなる群より選択された兔疫グロブリンに由来するものである、請求項12に記載の持続型グルカゴン結合体。
  17. 前記兔疫グロブリンFc断片が、IgG4Fc断片である、請求項12に記載の持続型グルカゴン結合体。
  18. 前記兔疫グロブリンFc断片が、非糖鎖化したヒトIgG4Fc断片である、請求項17に記載の持続型グルカゴン結合体。
  19. 下記化学式5で表示される構造を有する、請求項1記載の持続型グルカゴン結合体:
    式中、R1は、デス−アミノ−ヒスチジル、N−ジメチル−ヒスチジル、ベータ−ヒドロキシイミダゾプロピルおよび4−イミダゾアセチルからなる群より選択され、
    R2は、−NH2、−OHおよびリシン(Lys)からなる群より選択され、
    Xは、SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTであり、
    Yは、ポリエチレングリコール(PEG)であり、
    Zは、兔疫グロブリンFc断片である。
  20. 下記のステップを含む請求項1による持続型グルカゴン結合体の製造方法:
    1)グルカゴン誘導体を、両末端に官能基を有する非ペプチドリンカーと反応させるステップと、
    2)ステップ1)の反応混合物から、非ペプチドリンカーの一方の末端にグルカゴン誘導体が共有的に連結された複合体を分離するステップと、
    3)ステップ2)で分離された複合体を重合体キャリアと反応させるステップと、
    4)ステップ3)の反応混合物から、非ペプチドリンカーの一方の末端にはグルカゴン誘導体が、他方の末端には重合体キャリアが共有的に連結された持続型グルカゴン結合体を分離するステップ。
  21. ステップ1)において、グルカゴン誘導体と非ペプチドリンカーとの反応が、1:5〜1:50の反応モル比で、pH7.5〜10.0の条件で行われるものである、請求項20に記載の製造方法。
  22. ステップ1)において、グルカゴン誘導体と非ペプチドリンカーとの反応が、還元剤の存在下で行われるものである、請求項20に記載の製造方法。
  23. 前記還元剤が、ナトリウムシアノボロハイドライド(NaCNBH3)、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンホウ酸塩およびピリジンホウ酸塩からなる群より選択されるものである、請求項22に記載の製造方法。
  24. ステップ2)で分離された複合体が、グルカゴン誘導体のN末端以外のアミノ酸残基に非ペプチドリンカーの一方の末端が共有的に連結された、グルカゴン−非ペプチドリンカーの構造を有するものである、請求項20に記載の製造方法。
  25. 前記アミノ酸残基が、グルカゴン誘導体の12番目のリシン残基である、請求項24に記載の製造方法。
  26. ステップ3)において、複合体と重合体キャリアの反応が、1:2〜1:10の反応モル比で、pH5.0〜8.0で行われるものである、請求項20に記載の製造方法。
  27. ステップ3)において、複合体と重合体キャリアの反応が、還元剤の存在の下に行われるものである、請求項20に記載の製造方法。
  28. 還元剤が、ナトリウムシアノボロハイドライド(NaCNBH3)、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンホウ酸塩およびピリジンホウ酸塩からなる群より選択されるものである、請求項27に記載の製造方法。
  29. ステップ4)で分離された持続型グルカゴン結合体が、グルカゴン−非ペプチドリンカー−重合体キャリアの構造を有するものである、請求項20に記載の製造方法。
  30. 下記のステップを含むものである、請求項20に記載の製造方法:
    1)天然型グルカゴンのN末端ヒスチジン残基のアルファ炭素およびアルファ炭素に結合されたアミン基が除去されたイミダゾアセチルグルカゴンを両末端にアルデヒドを有するPEGとpH9.0で反応させるステップ:
    2)ステップ1)の反応混合物から、グルカゴン誘導体の12番目のリシン残基にPEGの一方の末端が共有的に連結されたグルカゴン−PEG複合体を分離するステップ;
    3)ステップ2)で分離されたグルカゴン誘導体−PEG複合体を兔疫グロブリンFc断片と反応させるステップ;および
    4)ステップ3)の反応混合物から、PEGの一方の末端にはグルカゴン誘導体が、他方の末端には兔疫グロブリンFc断片が共有的に連結された持続型グルカゴン結合体を分離するステップ。
  31. 有効成分として請求項1記載の持続型グルカゴン結合体、抗肥満薬物および薬学的に許容可能な担体を含む、肥満の予防または治療用薬学的組成物。
  32. 前記抗肥満薬物が、GLP−1作動剤、レプチン(Leptin)作動剤、DPP−IV阻害剤、Y5受容体拮抗剤(antagonist)、メラニン濃縮ホルモン(melanin−concentrating hormone、MCH)拮抗剤、Y2/3作動剤、MC3/4作動剤、胃/膵臓リパーゼ(gastric/pancreatic lipase)阻害剤、5HT2c作動剤、β3A作動剤、アミリン(amylin)作動剤、グレリン(ghrelin)拮抗剤およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるものである、請求項31に記載の薬学的組成物。
  33. 前記GLP−1作動剤が、エキセンディン−4、エキセンディン−4誘導体およびこれらの持続型結合体である、請求項32に記載の薬学的組成物。
  34. 前記エキセンディン−4誘導体が、天然型エキセンディン−4の1番目のN末端ヒスチジン残基のアミン基が除去された誘導体、その一番目のN末端ヒスチジン残基のアミン基がヒドロキシル基に置換された誘導体、その一番目のN末端ヒスチジン残基のアミン基が2個のメチル基で修飾された誘導体およびその一番目のN末端ヒスチジン残基のアルファ炭素およびアルファ炭素に結合されたアミン基が除去された誘導体からなる群より選択されるものである、請求項33に記載の薬学的組成物。
  35. 前記持続型エキセンディン−4結合体が、非ペプチドリンカーを介してエキセンディン−4またはその誘導体と兔疫グロブリンFc断片が共有的に連結された構造を有するものである、請求項33に記載の薬学的組成物。
  36. 前記持続型エキセンディン−4結合体が、非ペプチドリンカーの一方の末端にはエキセンディン−4誘導体が、他方の末端には兔疫グロブリンFc断片が共有的に連結された構造を有するものである、請求項35に記載の薬学的組成物。
  37. 請求項1記載の持続型グルカゴン結合体及び抗肥満薬物の組み合わせの、肥満の予防または治療用薬の製造のための使用。
  38. 前記抗肥満薬物が、GLP−1作動剤、レプチン(Leptin)作動剤、DPP−IV阻害剤、Y5受容体拮抗剤(antagonist)、メラニン濃縮ホルモン(melanin−concentrating hormone、MCH)拮抗剤、Y2/3作動剤、MC3/4作動剤、胃/膵臓リパーゼ(gastric/pancreatic lipase)阻害剤、5HT2c作動剤、βA作動剤、アミリン(amylin)作動剤、グレリン(ghrelin)拮抗剤およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるものである、請求項37に記載の使用。
  39. 前記GLP−1作動剤が、エキセンディン−4、エキセンディン−4誘導体およびこれらの持続型結合体である、請求項38に記載の使用。
  40. 前記エキセンディン−4誘導体が、天然型エキセンディン−4一番目のN末端ヒスチジン残基のアミン基が除去された誘導体、その一番目のN末端ヒスチジン残基のアミン基がヒドロキシル基に置換された誘導体、その一番目のN末端ヒスチジン残基アミン基が2個のメチル基で修飾された誘導体およびその一番目のN末端ヒスチジン残基のアルファ炭素およびアルファ炭素に結合されたアミン基が除去された誘導体からなる群より選択されるものである、請求項39に記載の使用。
  41. 前記持続型エキセンディン−4結合体が、非ペプチドリンカーを介してエキセンディン−4またはその誘導体と兔疫グロブリンFc断片が共有的に連結された構造を有するものである、請求項39に記載の使用。
  42. 前記持続型エキセンディン−4結合体が、非ペプチドリンカーの一方の末端にはエキセンディン−4誘導体が、他方の末端には兔疫グロブリンFc断片が共有的に連結された構造を有し、前記エキセンディン−4誘導体がその一番目のN末端ヒスチジン残基のアルファ炭素およびアルファ炭素に結合されたアミン基が除去されたものである、請求項41に記載の使用。
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