KR101767570B1 - 항 비만 펩타이드의 지속형 결합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체에 동시에 작용하는 항 비만 펩타이드의 지속형 제형을 위한 결합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 항 비만 펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로블린 Fc 영역이 공유 결합에 의해 상호 연결되어 있으며, 특정 아미노산 잔기에 대한 부위 선택적 결합과 특정 아미노산 및 아미노산 잔기의 변형에 의해 생체 내 효력 지속 효과를 보다 획기적으로 증가시킨 항 비만 펩타이드 결합체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 결합체는 생체 내 활성이 높게 유지되고, 혈중 반감기가 현저히 증가되어 비만 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항 비만 펩타이드의 지속형 결합체{A long-lasting conjugate of An anti-obesity peptide derivative complex}
본 발명은 항 비만 펩타이드의 지속형 제형을 위한 결합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 항 비만 펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로블린 Fc 영역이 공유 결합에 의해 상호 연결되어 있으며, 특정 아미노산 잔기에 대한 부위 선택적 결합과 특정 아미노산 및 아미노산 잔기의 변형에 의해 생체 내 효력 지속 효과가 현저히 증가된 항 비만 펩타이드 결합체에 관한 것이다.
최근 경제성장과 생활방식의 변화에 따라 식습관에도 많은 변화가 있다. 특히, 패스트푸드 등의 고열량 식이와 적은 운동량으로 인하여 바쁜 현대인들의 과체중 및 비만이 증가하고 있다. 국제보건기구(World Health Organisation, WHO)에 따르면, 전세계적으로 10억 이상의 성인이 과체중이고, 그 중 적어도 300만 이상이 임상적으로 비만이며, 이는 미국과 유럽에서 두드러지게 증가하고 있다. 과체중 및 비만은 혈압과 콜레스테롤 수치를 높여 심장 질환, 당뇨, 관절염 등 각종 질환의 원인이 되기도 하고, 각종 성인병의 발병률을 증가시키고 있다. 뿐만 아니라, 과체중 및 비만은 성인 뿐만 아니라 어린이나 청소년들에서도 동맥경화, 고혈압, 고지혈증 또는 심장질환 등의 각종 성인병의 발병률을 증가시키는 한 요인이 되고 있다.
이와 같이, 비만은 전세계적인 질병으로서 각종 질환의 원인이 되기도 하는 심각한 질병이지만 쉽게 치료할 수 없는 질병이다. 의학 전문가들 사이에서는 비만의 원인은 복잡하며 다양한 요소에 기인하며, 비만은 단순한 자제력의 문제가 아니라 식욕의 조절과 에너지 대사가 관련된 복잡한 질환이라는 인식 또한 확산되고 있다. 그러나 비만의 일반적인 원인으로는 섭취 에너지가 소비 에너지에 비해 지속적으로 초과하게 되는 것이므로, 비만을 예방 또는 치료하기 위한 장기적 관점에서 식이요법, 운동과 병행하여 사용될 수 있는, 효과적이고 안전한 의약품이 요구되고 있는 실정이다.
최근 비만과 관련한 연구에서 주목되는 펩타이드가 옥신토모둘린(Oxyntomodulin)이다. 이는 전구체인 프리-글루카곤(pre-glucagon)으로부터 만들어진다. 옥신토모둘린(Oxyntomodulin)은 프리-글루카곤을 전구체로 하는 GLP-1과 글루카곤(Glucagon) 두 펩타이드의 수용체(receptor)에 모두 결합하여 이중 기능(dual fuction)을 할 수 있는 펩타이드이기 때문에 비만 치료 목적으로 활발하게 개발중이다.
한편, 당뇨 환자의 고혈당증을 감소시키는 치료제로 개발 중인 GLP-1은 인슐린 합성과 분비 촉진, 글루카곤의 분비 저해와 더불어 음식물 섭취를 저해하는 기능을 가진다. GLP-1과 대략 50% 아미노산 상동성을 가지는 도마뱀 독액(lizard venom)으로부터 만들어지는 엑센딘(exendin)-4 또한 GLP-1 수용체(receptor)를 활성화시켜 당뇨 환자의 고혈당증을 감소시키는 것으로 알려져 있다.
GLP-1 및 GLP-1 아고니스트(agonist)로 작용하는 펩타이드는 식욕을 억제하고 포만감을 유지하여 위 배출을 지연하는 장점이 있는 반면, 체중 감소 후 rebound 현상을 보이며 고용량 투여 시 오심과 구토의 부작용을 나타내는 단점이 있다.
한편, 약물 치료 또는 질병, 호르몬이나 효소 결핍 등의 원인으로 혈당이 떨어지기 시작하면 췌장(pancreas)에 의해 글루카곤이 생산된다. 글루카곤은 간에 글리코겐(glycogen)을 분해하여 글루코오스를 방출하도록 신호하고, 혈당 수준을 정상 수준까지 높인다.
글루카곤 및 글루카곤 아고니스트(agonist)로 작용하는 펩타이드는 hormone-sensitivity lipase 활성화를 통해 지방 세포의 분해를 유도하지만 고용량 투여 시 혈당이 상승되는 부작용이 있다.
따라서 GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체에 동시에 아고니스트(agonist)로 작용하는 옥신토모둘린(Oxyntomodulin)은 GLP-1의 음식물 섭취 저해 기능과 글루카곤의 글리코겐 분해 기능을 보여 항 비만 치료제로서의 가능성을 높이고 있다.
이러한 옥신토모둘린(Oxyntomodulin) 유도체로서, 현재 임상 1상 진행 중인 Dual agonist(Merck)와 전 임상 시험 진행 중인 ZP2929(Zealand, WO2008152403A1) 등이 있다. Dual agonist Oxyntomodulin (Merck)는 옥신토모둘린의 2번째 아미노산 L-Ser을 D-Ser으로 치환하여 효소 DPP-VI 저항성을 높이는 동시에 C-말단에 콜레스테롤 모이어티를 붙여 혈중 반감기를 증가시켰다. 이로서, GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체에 동시에 작용하여 항 비만 치료제로서의 개발 가능성을 증가시키고 체내 반감기 또한 증가시켰다. 그러나 천연형 옥신토모둘린의 반감기인 8~12분보다는 길어졌지만 여전히 1.7hrs으로 매우 짧으며, 약물의 투여 용량 또한 수 mg/kg으로 매우 높은 수준이다. 즉, 여전히 짧은 반감기와 낮은 약효를 나타내어 주 3회 투여해야 하는 단점과 과량 약물을 투여해야 하는 2가지 단점을 해결하지 못하였다.
ZP2929(Zealand)는 옥신토모둘린의 2번째 아미노산 L-Ser을 D-Ser으로 치환하여 효소 DPP-VI 저항성을 높이고 17번째 아미노산 Arg을 Ala로 치환하여 프로테아제(Protease)에 대한 저항성을 높였다. 27번째 아미노산 Met을 Lys으로 치환하여 산화 안정성(oxidative stability)를 증가시켰으며, 각각 20번째와 24번째 아미노산 Gln 과 28번째 아미노산 Asn을 Asp로 치환하여 deamidation stability를 증가시켰다.
하지만 Merk 사의 Dual agonist Oxyntomodulin과 마찬가지로 여전히 짧은 반감기로 인해 매일 투여해야 하는 문제점이 제기 되었다. 이는 환자에게 매우 큰 부담이 아닐 수 없으며 장기적이고 효과적인 항 비만치료제의 개발에 있어 반드시 해결해야 될 과제이다.
현재 비만치료제는 경구용 약물 2종만이 허가되어 있으며, 임상에서의 효력은 5kg 미만의 낮은 체중 감소 효과를 보이는 동시에 부작용이 계속 보고되고 있다. 따라서 고효력을 보이는 항 비만 펩타이드를 개발하는 동시에 낮은 부작용과 충분 한 체내 생리활성 지속시간을 가지는 비만 치료 약물의 개발이 절실히 필요하다.
한편, 폴리에틸렌글리콜(PEG)는 목적 펩타이드의 특정 부위 또는 다양한 부위에 비특이적으로 결합하여 펩타이드의 분자량을 증가시켜 신장에 의한 소실을 억제하고, 가수분해를 방지하는데 효과가 있으며 특별한 부작용도 일으키지 않는다.
예를 들어, US4,179,337은 칼시토닌에 PEG를 결합하여 생리 활성 지속 및 막의 투과성을 높이는 것에 대해 기술하고 있으며, WO2006/076471은 NPR-A에 결합하여 cGMP의 생산을 활성화하여 동맥 내 혈압을 감소시키며, 따라서 울혈성 심부전증(Congestive heart failure) 치료제로 사용되는 B형 나트륨배설증가펩타이드(B-type natriuretic peptide, BNP)에 PEG를 결합하여 생리 활성을 지속시키는 것에 대해 기술하고 있다. 또한 US6,924,264에서는 엑센딘-4의 라이신 잔기에 PEG를 결합시켜 생체 내 지속 시간을 증가시키는 방법을 기술하고 있다. 그러나 이러한 방법은 PEG 분자량을 증가시켜 펩타이드 약물의 생체 내 지속시간을 연장할 수 있는 반면, 분자량이 증가할수록 펩타이드 약물의 역가가 현저히 낮아지고, 또한 펩타이드와의 반응성이 낮아져 수율이 감소하는 문제가 있다.
WO02/46227는 재조합 유전자 기술을 이용한 GLP-1 및 엑센딘-4 또는 그 유사체와 인간 혈청 알부민 또는 면역 글로블린 단편(Fc)과의 융합단백질에 대해 기술하고 있으며, US6,756,480는 부갑상선 호르몬(PTH) 및 그 유사체와 Fc 융합 단백질에 대해 기술하고 있다. 이러한 방법은 낮은 페길화(pegylation) 수율 문제와 비특이성을 극복할 수 있는 반면에, 혈중반감기 증가효과가 예상보다 획기적이지 못하고, 경우에 따라서는 역가가 낮은 문제점을 지니고 있다. 혈중반감기 증가효과를 극대화하기 위하여 다양한 종류의 펩타이드 링커가 사용되기도 하지만 면역반응을 유발할 수 있는 가능성이 있다. 또한 BNP와 같이 디설파이드 결합(disulfide bond)을 가지고 있는 펩타이드를 이용할 경우 미스폴딩(misfolding)의 확률이 높아 적용이 어렵다는 문제점과 천연에 존재하지 않는 아미노산 잔기가 있는 경우 유전자 재조합의 형태로 생산이 불가능하다는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 고효율을 보이는 항 비만 펩타이드를 개발하는 동시에 항 비만 펩타이드의 혈중반감기 증가 및 생체 내 활성유지를 동시에 극대화 할 수 있는 방법으로 비펩타이드성 중합체를 항 비만 펩타이드의 N-말단 이외의 아미노산 잔기에 부위 선택적으로 상호 연결시키는 제조방법을 사용하여 항비만 펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로블린 Fc 영역이 연결된 결합체를 제조하였으며, 이의 생체 내 효력 지속효과가 획기적으로 증가됨을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 항 비만 펩타이드의 지속형 결합체를 제공하는데 있다. 구체적으로, 본 발명은 항 비만 펩타이드가 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 중합체를 통해 면역글로블린 Fc 영역과 공유결합으로 연결된 항 비만 펩타이드 결합체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 GLP-1 및 글루카곤 수용체의 높은 친화력을 가지며, 생체 내 효력 지속효과가 획기적으로 증가된 항 비만 펩타이드 결합체의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항 비만 펩타이드 결합체를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 항 비만 펩타이드의 지속형 결합체에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 항 비만 펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 중합체를 통해 연결되고, 상기 항 비만 펩타이드의 N-말단 이외의 아미노산 잔기에 상기 비펩타이드성 중합체가 결합된 것을 특징으로 하는 항 비만 펩타이드 결합체에 관한 것이다.
본 발명의 항 비만 펩타이드는 체중감소효과를 가지는 펩타이드를 의미하며, 바람직하게는 GLP-1 수용체 및 글루카곤 수용체의 친화력(affinity)을 가지며, 체중을 감소시키고 식이 섭취를 줄이는 효과가 있는 펩타이드를 의미한다. 또한 상기 항 비만 펩타이드는 이의 아고니스트(agonist), 전구물질(precursors), 유도체(derivatives), 단편(fragments), 변이체(variants) 등을 포함한다.
상기 펩타이드 아고니스트는 구조와 상관없이 생체 내 수용체에 결합하여 펩타이드와 동일한 생물학적 활성을 나타내는 물질을 의미한다.
상기 펩타이드 전구물질은 펩타이드를 생성하기 전에 선행하는 물질을 의미한다.
펩타이드 유도체는 천연형 펩타이드와 비교시 최소한 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보이며, 아미노한 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예; deamination) 또는 수식(예; N-methylation)된 형태일수 있다.
펩타이드 단편은 펩타이드의 아미노말단 또는 카르복시말단에 하나 또는 그 이상 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연에 존재하지 않는 아미노산(예; D형 아미노산)도 가능할 수 있고, 이러한 펩타이드 단편은 생리학적 활성과 기능을 보유한다.
펩타이드 변이체는, 천연형 펩타이드와 아미노산 서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, 체내에서 혈당조절 기능 또는 글리코겐 분해 기능을 보유한 펩타이드를 의미한다.
펩타이드 아고니스트, 유도체, 단편 및 변이체는 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고 N-말단 아미노산 잔기에 탈아미노화(deamination) 된 체내에서 혈당조절 기능 또는 글리코겐 분해 기능을 보유한 펩타이드도 포함된다.
본 발명의 상기 항 비만 펩타이드는 천연형 옥신토모둘린(oxyntomodulin) 펩타이드, 이들의 아고니스트(agonist), 유도체, 단편 및 변이체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 항 비만 펩타이드 중 이의 유도체는 N-말단 아민 그룹의 치환(substitution), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중에 선택된 어느 하나의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 보다 구체적으로는, 항 비만 펩타이드의 N-말단 아민 그룹이 제거되거나, N-말단 아민 그룹이 하이드록실 그룹(Hydroxylgroup)으로 치환되거나 또는 N-말단 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 아민 그룹이 제거된 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 이를 화학식으로 일반화하여 나타내면 하기 화학식 1과 같다.
[화학식 1]
Figure 112010069118583-pat00001

본 발명에서 용어 "옥신토모둘린(oxyntomodulin)"은 프리-글루카곤(pre-glucagon)으로부터 만들어지며, 프리-글루카곤을 전구체로 하는 GLP-1과 글루카곤 펩타이드의 수용체에 모두 결합함으로써, GLP-1의 음식물 섭취 저해 기능과 글루카곤의 글리코겐 분해 기능을 보이는 펩타이드를 의미한다.
천연형 옥신토모둘린(oxyntomodulin)의 서열은 하기와 같다.
<옥신토모둘린>
HSQGT FTSDY SKYLD SRRAQ DFVQW LMNTK RNRNN IA(서열번호 1)
본 발명에서의 용어, "글루카곤"은 췌장 섬 알파 세포로부터 분비되는 29개 아미노산 폴리펩타이드인 호르몬으로서, 간의 글리코겐(glycogen)을 분해하여 글루코오스를 방출하도록 신호하고, 또한 인슐린의 방출을 자극하는 역할을 하여 인슐린-의존적 조직에 의해 글루코오스가 이용되도록 한다. 따라서, 글루카곤과 인슐린은 피드백 시스템을 이루어 혈당이 양호한 수준을 유지하는 역할을 한다. 글루카곤의 아미노산 서열은 하기와 같다.
<글루카곤>
HSQGT FTSDY SKYLD SRRAQ DFVQW LMNT(서열번호 2)
본 발명에서의 용어, "엑센딘-4"는 GLP-1과 53%의 아미노산 서열 유사성을 보이는 39개의 아미노산으로 이루어진 인슐린 분비 펩타이드로서, 엑센딘-4의 아미노산 서열은 하기와 같다.
<엑센딘-4>
HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS(서열번호 3)
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 GLP-1 및 글루카곤 수용체에 대해 강한 결합력을 가지는 항 비만 펩타이드를 제공한다. 본 발명의 항 비만 펩타이드는 천연형 옥신토모둘린(oxyntomodulin), 글루카곤(Glucagon) 및 엑센딘-4(Exendin-4)의 아미노산 서열을 기초로 하여, DPPIV에 저항성을 가지며 GLP-1 수용체의 결합력을 높일 수 있게 구성된 것이 바람직하며, 그 구체적인 서열은 하기와 같다.
<HMOxm-1>
이미다졸아세틸(Imidazoacetyl)-SQGT FTSDY SKYLD EEAVR LFIEW LMNTK RNRNN IA(서열번호 4)
<HMOxm-2>
이미다졸아세틸-SQGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVAW LKNTG PSSGA PPPS(서열번호 5)
<HMOxm-3>
이미다졸아세틸-GQGT FTSDY SRYLE EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS(서열번호 6)
<HMOxm-4>
이미다졸아세틸-GQGT FTSDY SRQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS(서열번호 7)
<HMOxm-5>
이미다졸아세틸-GEGT FTSDL SRQME EEAVR LFIEW AAHSQ GTFTS DYSKY LD(서열번호 8)
상기 서열의 항 비만 펩타이드는 GLP-1 및 글루카곤 수용체에 대한 친화력이 강하다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 HMOxm-1 및 HMOxm-2 펩타이드의 인비트로 활성을 측정한 결과, 천연형 옥신토모둘린보다 GLP-1 수용체에 대한 결합력이 8배 정도 강함을 확인할 수 있었다(실시예 5, 도 1).
본 발명의 바람직한 항 비만 결합체는 상기 서열의 항 비만 펩타이드가 비펩타이드성 중합체를 통해 면역글로불린 Fc 영역과 공유결합으로 연결된 결합체이다. 보다 구체적으로는, 하기 화학식 2를 포함하는 결합체인 것이다.
[화학식 2]
R1-X-Y-Z
상기 식에서
R1은 히스티딘, 데스-아미노-히스티딜, N-디메틸-히스티딜, 베타-하이드록시 이미다조프로필 및 이미다조아세틸로 구성된 군에서 선택되고;
X는 서열번호 4 내지 8로 표시되는 아미노산을 포함하는 펩타이드들로 구성된 군에서 선택되고;
Y는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택될 수 있으며,
Z는 면역글로블린 Fc 영역이다.
보다 바람직하게는, 상기 R1은 이미다조아세틸이며, X는 서열번호 4 또는 5로 표시되는 아미노산을 포함하는 펩타이드이며, Y는 폴리에틸렌글리콜인 결합체이다.
구체적인 일 양태로서 본 발명에서 사용한 항 비만 펩타이드는 재조합 방법을 통하여 생산될 수 있으며, Solid phase 합성법을 통하여 합성하는 방법으로도 생산 가능하다.
생체 내 활성에 중요한 부위인 N-말단 이외의 위치에 커플링 할 경우, 천연형 아미노산 서열에서 수식하고자 하는 아미노산 잔기 위치에 반응성 티올 그룹을 도입하여 비펩타이드성 중합체의 말레이미드 링커를 사용하여 공유결합을 형성할 수 있다.
생체 내 활성에 중요한 부위인 N-말단 이외의 위치에 커플링 할 경우, 천연형 아미노산 서열에서 수식하고자 하는 아미노산 잔기 위치에 반응성 있는 아민 그룹을 도입하여 비펩타이드성 중합체의 알데히드 링커를 사용하여 공유결합을 형성할 수 있다.
비펩타이드성 중합체에 알데히드 링커를 사용하면 N-말단과 라이신 잔기에 있는 아민 그룹과 반응하며, 선택적으로 반응 수율을 향상시키기 위해 변형된 형태의 펩타이드를 사용할 수 있다. 예를 들어, N-말단을 블로킹하는 방법, 라이신 잔기 치환 방법, 카르복시 말단에 아민 그룹을 도입방법 등을 사용하여 반응할 수 있는 아민 그룹을 원하는 위치에 하나만 유지할 수 있고, 페길화 및 커플링 수율을 향상시킬 수 있다. N-말단의 보호방법은 디메틸화(dimethylation) 외에 메틸화(methylation), 탈아미노화(deamination) 또는 아세틸화(acetylation) 방법으로도 가능하며, 이러한 알킬화(alkylation) 방법에 한정되지 않는다.
본 발명의 바람직한 양태로서, 본 발명의 펩타이드 결합체는 펩타이드의 N-말단 이외의 아민 그룹에 특이적으로 면역글로블린 Fc 영역이 결합된 식욕억제 기능과 지방 세포 분해 기능이 있는 펩타이드 결합체이다.
구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 항 비만 펩타이드의 라이신 잔기에 선택적으로 커플링하기 위한 방법으로, PEG를 결합시킬 때 pH9.0로 반응시켜 라이신 잔기로의 페길화 반응을 유도하였으며, 다른 방법으로는 N-말단의 제거 또는 보호된 형태의 항 비만 펩타이드에 PEG를 결합시킬 때 pH9.0로 반응시켜 라이신 잔기로의 페길화 반응을 유도하였다. 첫 번째 아미노산(히스티딘)의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아민 그룹을 제거하여 이미다조-아세틸(imidazo-acetyl) 그룹만을 남겨두는 방법 등을 사용하여 링커 PEG의 N-말단 결합을 미연에 방지하였다.
면역글로블린 Fc 영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로블린 Fc 영역은 면역글로블린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분을 제거함으로써 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
본 발명에서, "면역글로블린 Fc 영역"은, 면역글로블린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge)부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로블린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로블린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄 불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH 3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수 도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로블린 Fc 영역은 (1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, (2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, (3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, (4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, (5) 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로블린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, (6) 중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로블린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체 (mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다. 또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로블린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,197 9). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내나 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로블린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다.
바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로블린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로블린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로블린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로블린 Fc 영역은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로블린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 당쇄의 제거(deglycosylation)는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(aglycosylation)는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
또한, 면역글로블린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성 (hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
한편, 본 발명에서 조합(combination)이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로블린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이 드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로블린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로블린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC, Complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다.
즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로블린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
본 발명에서 “비펩타이드성 중합체”는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다.
본 발명에 사용가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준 에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
기존 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합단백질에서 사용된 펩타이드성 링커의 단점은 생체내에서 단백질분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성약물의 혈중반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없다는 것이다. 그러나, 본 발명에서는 단백질분해효소에 저항성있는 중합체를 사용하여 캐리어와 유사하게 펩타이드의 혈중반감기를 유지할 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 중합체는 상기와 같은 역할, 즉 생체 내 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체이면 제한없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체는 분자량이 1 내지 100 kDa 범위, 바람직하게는 1 내지 20 kDa 범위인 것이 바람직하다. 또한, 상기 면역글로블린 Fc 영역과 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
본 발명에 사용되는 비펩타이드성 중합체는 면역글로블린 Fc 영역 및 단백질 약물과 결합될 수 있는 반응기를 가진다.
상기 비펩타이드성 중합체의 양말단 반응기는 반응 알데히드 그룹, 프로피온 알테히드 그룹, 부틸 알테히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 하이드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다.
특히, 상기 비펩타이드성 중합체가 양말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로블린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 아미노 말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
상기 비펩타이드성 중합체의 양말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 양쪽 말단에 하이드록시 반응기를 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 하이드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)을 이용하여 본 발명의 단백질 결합체를 제조할 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서 상기 항 비만 펩타이드 결합체는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 항 비만 펩타이드 지속형 결합체를 마우스에 투여했을 때, 단 1회의 투여만으로도 7일 동안 체중감소가 유지되었으며, 특히, HMOXM-1의 항 비만펩타이드 지속형 제제를 투여했을 때 체중감소효과가 더 오래 지속됨을 확인할 수 있었다(도 2 내지 4).
본 발명에서, 용어 "비만(obesity)"은 에너지 불균형에 의하여 과다한 체지방을 가진 상태(condition) 또는 질환(disease)을 의미한다. 본 발명의 조성물을 개체에 투여함으로써, 체중을 감량하여 비만을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어 "예방"이란 본 발명의 조성물의 투여로 비만의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 "치료"란 본 발명의 조성물의 투여로 비만의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비강내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 지속성 제제는 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물을 포함한 지속성 제제는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 지속성 제제의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 지속성 제제는 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하므로, 본 발명의 약제학적 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
이러한 본 발명의 지속성 제제는 체중을 줄이며 안정적인 혈당 수준을 유지시키므로 항 비만 치료에 효과적이다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기에서 기술한 약학적 조성물을 비만 환자에게 투여하여 비만을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 항 비만 펩타이드 및 면역글로블린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체를 통해 공유결합으로 연결된 단백질 결합체을 유효성분으로 포함하는 조성물을 비만 환자에 투여하여 비만을 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 항 비만 펩타이드는 옥신토모둘린이 바람직하며, 아고니스트(agonist), 전구물질(precursors), 유도체(derivatives), 단편(fragments), 변이체(variants) 등을 포함한다. 바람직하게는, 하기 아미노산 서열을 포함하는 항 비만 펩타이드가 비펩타이드성 중합체를 통해 Fc 영역이 공유결합된 이다.
<HMOxm-1>
이미다졸아세틸(Imidazoacetyl)-SQGT FTSDY SKYLD EEAVR LFIEW LMNTK RNRNN IA(서열번호 4)
<HMOxm-2>
이미다졸아세틸-SQGT FTSDY SKYLD ERRAQ DFVAW LKNTG PSSGA PPPS(서열번호 5)
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (1) 양 말단에 알데히드, 말레이미드, 또는 석시니미드 유도체 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 사용하여 항 비만 펩타이드의 아민 그룹 또는 티올 그룹에 공유결합으로 연결하는 단계; (2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 N-말단 이외의 위치에 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 항 비만 펩타이드를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및 (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로블린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로블린 Fc 영역 및 항 비만 펩타이드와 결합된 펩타이드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 항 비만 펩타이드 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "연결체"란 비펩타이드성 중합체와 항 비만 펩타이드만이 공유결합으로 연결된 중간체로서, 이후 이 연결체에 있는 비펩타이드성 중합체의 항 비만 펩타이드가 연결되지 않은 다른 쪽 말단에 면역글로블린 Fc 영역을 결합시키게 된다.
또한, 바람직한 일 양태로서 본 발명은 (1) 양 말단에 알데히드 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 항 비만 펩타이드의 라이신 잔기에 공유결합으로 연결시키는 단계; (2) (1)의 반응 혼합물로부터 라이신잔기에 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 항 비만 펩타이드를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및 (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로블린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합 체의 양쪽 말단이 각각 면역글로블린 Fc 영역 및 항 비만 펩타이드와 결합된 단백질 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 제조방법을 제공한다.
더욱 바람직하게는 (1)의 비펩타이드성 중합체 및 항 비만 펩타이드의 라이신 잔기는 pH 7.5 이상에서 연결된다.
본 발명의 항 비만 펩타이드 및 지속형 항 비만 펩타이드 결합체는 생체 내 활성이 높게 유지되고, 혈중 반감기가 현저히 증가되어 매일 펩타이드를 투여하는 번거로움으로 인한 환자의 불편함을 줄이고, 낮은 효력으로 인한 과량 약물 투여에 기인한 환자의 부담을 줄일 수 있는 바, 비만 치료의 방법과 질을 보다 효과적으로 개선할 수 있다.
도 1은 In vitro assay를 통해 항 비만 펩타이드의 hGLP-1R과 hGCG-R에 대한 EC50값을 측정하였다.
도 2는 fasted lean mice에서 항 비만 펩타이드의 사료 섭취량 변화 추이를 나타낸 그래프이다.
도 3은 normal mice에서 8일간의 체중 변화를 통해 항 비만 펩타이드 결합체의 효력을 비교한 그래프이다.
도 4는 ob/ob mice에서 8일간의 체중 변화를 통해 항 비만 펩타이드 결합체의 효력을 비교한 그래프이다.
도 5는 In vitro assay를 통해 항 비만 펩타이드가 DPPIV 저항성을 가짐을 나타내는 그래프이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 이미다조-아세틸(Imidazo-acetyl) HMOxm-1(Lys30)-Pegylation
3.4K PropionALD(2) PEG (IDB chem, 한국)를 이미다조-아세틸 에이치엠옥심 원 (CA HMOxm-1,American peptide,미국)의 N 말단으로부터 30번째 Lys과 페길화시키기 위하여 CA HMOmx-1와 3.4K PropionALD(2)의 몰비를 1 :10, 펩타이드 농도 3mg/ml로 하여 4℃에서 4시간 반응하였다. 반응액은 100mM HEPES pH7.5 및 45% 이소프로판올(Isopropanol이며, 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. SOURCE S(XK16ml, GE Healthcare)를 이용하여 monopegylated CA HMOmx-1을 정제하는 동시에 Lys12 와 Lys30에 페길화(pegylation)된 각각의 위치 이성체를 분리하였다.
Column : SOURCE S (XK 16ml, GE Healthcare)
유속 : 2.0ml/분
구배 : A 0 →50% 50분 B (A : 20mM 구연산 pH 3.0 + 45% EtOH, B : 20mM 구연산 pH3.0 + 45% EtOH + 0.5M KCl)
실시예 2. 이미다조-아세틸(Imidazo-acetyl) HMOxm-1(Lys30)- 면역글로블린 Fc 결합체 제조
실시예 1.에서 정제된 monopegylated CA HMOmx-1(Lys30)을 이용하여 커플링을 진행하였다. 펩타이드와 면역글로블린 Fc 몰비를 1 : 8, 전체 단백질농도를 20mg/ml로 하여 4℃에서 20시간 반응하였다. 반응액은 100mM K-P pH6.0이며, 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. 커플링 반응 후 SOURCE Q 16ml과 SOURCE ISO 16ml을 이용한 2단계 정제하였다. SOURCE Q를 이용하여 반응에 참여하지 않은 면역글로블린 Fc를 제거하였으며, SOURCE ISO를 이용하여 결합체 제조 과정에서 생성된 멀티머(multimer)를 제거 하였다.
Column : SOURCE Q (XK 16ml, GE Healthcare)
유속 : 2.0ml/분
구배 : A 0 →20% 70분 B (A: 20mM 트리스 pH 9.0, B: A + 1M NaCl )
Column : SOURCE ISO(HR16ml, GE Healthcare)
유속 : 7.0ml/분
구배 :B 100 →0% 60분 B (A: 20mM 트리스 pH 7.5, B: A + 1.5M 황산암모
늄)
실시예 3. 이미다조-아세틸(Imidazo-acetyl) HMOxm-2(Lys27)-Pegylation
3.4K PropionALD(2) PEG (IDB chem, 한국)를 이미다조-아세틸 에이치엠옥심 원(CA HMOxm-2,American peptide,미국)의 27번째 Lys과 페길화시키기 위하여 CA HMOmx-2와 3.4K PropionALD(2)의 몰비를 1 :10, 펩타이드 농도 3mg/ml로 하여 4℃에서 4시간 반응하였다. 반응액은 100mM HEPES pH7.5 및 45% 이소프로판올(Isopropanol)이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. SOURCE S(XK16ml, GE Healthcare)를 이용하여 monopegylated CA HMOmx-2을 정제하는 동시에 Lys12와 Lys27에 페길화(pegylation)된 각각의 위치 이성체를 분리하였다.
Column : SOURCE S (XK 16ml, GE Healthcare)
유속 : 2.0ml/분
구배 : A 0 →50% 50분 B (A : 20mM 구연산 pH 3.0 + 45% EtOH , B : 20mM 구연산 pH3.0 + 45% EtOH + 0.5M KCl)
실시예 4. 이미다조-아세틸(Imidazo-acetyl) HMOxm-2(Lys27)- 면역글로블린 Fc 결합체 제조
실시예 1.에서 정제된 monopegylated CA HMOmx-2(Lys27)을 이용하여 커플링을 진행하였다. 펩타이드와 면역글로블린 Fc 몰비를 1 : 8, 전체 단백질농도를 20mg/ml로 하여 4℃에서 20시간 반응하였다. 반응액은 100mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. 커플링 반응 후 SOURCE Q 16ml과 SOURCE ISO 16ml을 이용한 2단계 정제하였다. SOURCE Q를 이용하여 반응에 참여하지 않은 면역글로블린 Fc를 제거하였으며, SOURCE ISO를 이용하여 결합체 제조 과정에서 생성된 멀티머(multimer)를 제거하였다.
Column : SOURCE Q (XK 16ml, GE Healthcare)
유속 : 2.0ml/분
구배 : A 0 →20% 70분 B (A: 20mM 트리스 pH9.0, B: A + 1M NaCl )
Column : SOURCE ISO(HR16ml, GE Healthcare)
유속 : 7.0ml/분
구배 :B 100 →0% 60분 B (A: 20mM 트리스 pH7.5, B: A + 1.5M 황산암모
늄)
실시예 5. 항 비만 펩타이드(CA HMOxm-1 / CA HMOxm-2) 인 비트로 활성 측정
항 비만 펩타이드의 효력을 측정하는 방법으로 인 비트로 세포 활성을 측정하는 방법을 이용하였다. GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체에 대한 효력을 측정하기 위해 인간 GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체 유전자를 각각 발현하도록 형질전환된 두 가지 CHO (chinese hamster ovary) 세포주를 이용하였다. 상기 세포주에 GLP-1, 글루카곤(Glucagon), 옥신토모둘린(Oyntomodulin)과 CA HMOxm-1, CA HMOxm-2를 시험물질로 하여 이를 농도별로 처리하였다. 시험물질에 의한 세포 내의 신호전달 물질인 cAMP 발생 정도를 측정하고 이에 따른 EC50값을 산출하여 비교하였다(도 1). 그 결과, 본 발명의 CA HMOxm-1에서 글루카곤의 수용체에 대한 높은 효력을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 항 비만 펩타이드(CA HMOxm-1 / CA HMOxm-2)-면역글로블린 Fc 결합체 인 비보 효력 시험 (lean mice 사료 섭취량 측정)
9 주령(22.5± 0.7 g)의 수컷 C57BL/6 마우스를 군당 6 마리씩 8군으로 분리한 후 투여 전 16 시간 동안 절식하였다. 실험 대조군으로는 당뇨병 치료제 및 비만 치료효과가 있다고 알려진 HM11260C를 투여한 마우스를 사용하였다. 시험물질을 피하로 투여 후 일정량의 사료를 급이하고, 1 시간과 2 시간에 남은 사료량을 측정하여 0-1 시간, 0-2 시간 동안의 사료섭취량을 계산하였다(도 2). 그 결과, 옥신토모둘린(Oyntomodulin), CA HMOxm-1에서 낮은 사료 섭취량이 관찰되었으며, 특히, CA HMOxm-1은 농도 의존적으로 2시간 동안 사료 섭취량을 감소시켰다.
실시예 7. 항 비만 펩타이드(CA HMOxm-1 / CA HMOxm-2)-면역글로블린 Fc 결합체 인 비보 효력 시험 (normal mice 체중 변화 측정)
9 주령(22.7±0.6 g)의 수컷 C57BL/6 마우스를 군당 5마리씩 5 군으로 분리하였다. 1일째 체중을 측정한 후 시험물질을 피하로 단 1회 투여하고 7일 동안 매일 일정시간에 체중을 측정하였다(도 3). 그 결과, CA-옥신토모둘린 지속형 제제, CA HMOxm-1 지속형 제제, CA HMOxm-2 지속형 제제에서 체중 감소효과가 확인되었으며, 특히 CA HMOxm-1 지속형 제제에서는 시간이 지나도 체중 감소효과가 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8. 항 비만 펩타이드(CA HMOxm-1 / CA HMOxm-2)-면역글로블린 Fc 결합체 인 비보 효력 시험 (ob/ob mice 체중 변화 측정)
16 주령(66.1± 1.3 g)의 수컷 ob/ob 마우스를 군당 4 마리씩 5 군으로 분리하였다. 1일 째 체중을 측정한 후 시험물질을 피하로 단 1회 투여하고 7일 동안 매일 일정시간에 체중을 측정하였다(도 4). 그 결과, CA-옥신토모둘린 지속형 제제, CA HMOxm-1 지속형 제제, CA HMOxm-2 지속형 제제에서 체중 감소효과가 확인되었으며, 특히 CA HMOxm-1 지속형 제제에서는 시간이 지나도 체중 감소효과가 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 9. 항 비만 펩타이드(CA HMOxm-1 / CA HMOxm-2) DPPIV 저항성 test
CA HMOxm-1, CA HMOxm-2에 대한 DPPIV 저항성을 확인하였다.
각 펩타이드 5nmole에 DPPIV 5mU / 100ul (0.1M Tris pH7.5)을 처리하여 37℃에서 4시간 동안 배양(Incubation)하였다. 0.5hrs, 1hrs, 2hrs, 4hrs 4포인트에 펩타이드를 얻어 HPLC, C18 (4.6 x 250, 5u)으로 분석하였다(도 5). 그 결과, 천연형 옥신토모둘린은 DPPIV에 대한 저항성이 낮았지만, CA-옥신토모둘린, CA HMOxm-1, CA HMOxm-2은 모두 일관되게 100% 저항성을 나타내 DPPIV에 대한 저항성이 높음을 확인할 수 있었다.
<110> Hanmi Holdings Co., Ltd <120> A long-lasting conjugate of An anti-obesity peptide derivative complex <130> PA100672/KR <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> human <400> 1 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> human <400> 2 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> human <400> 3 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 4 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HMOxm-1 <400> 4 Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu Glu 1 5 10 15 Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Arg 20 25 30 Asn Asn Ile Ala 35 <210> 5 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HMOxm-2 <400> 5 Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu Arg 1 5 10 15 Arg Ala Gln Asp Phe Val Ala Trp Leu Lys Asn Thr Gly Pro Ser Ser 20 25 30 Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 6 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HMOxm-3 <400> 6 Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Glu Glu Glu 1 5 10 15 Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser 20 25 30 Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 7 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HMOxm-4 <400> 7 Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu 1 5 10 15 Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser 20 25 30 Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 8 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HMOxm-5 <400> 8 Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu 1 5 10 15 Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Ala Ala His Ser Gln Gly Thr Phe 20 25 30 Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp 35 40

Claims (26)

  1. 항 비만 펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 중합체의 링커를 통해 연결되고, 상기 항 비만 펩타이드의 N-말단 이외의 아미노산 잔기에 상기 비펩타이드성 중합체가 결합된 것을 특징으로 하는 항 비만 펩타이드 결합체로서,
    상기 항 비만 펩타이드는 서열번호 4 또는 5의 아미노산을 포함하는 펩타이드의 유도체이고,
    상기 유도체는 펩타이드의 N-말단 아민 그룹의 치환(substitution), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중에 선택된 어느 하나의 방법에 의해 제조되는 것인, 항 비만 펩타이드 결합체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 유도체는 펩타이드의 N-말단 아민 그룹이 제거되거나, N-말단 아민 그룹이 하이드록실 그룹(Hydroxylgroup)으로 치환되거나 또는 N-말단 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 아민 그룹이 제거된 펩타이드인 항 비만 펩타이드 결합체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 유도체는 펩타이드의 N-말단의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 아민 그룹이 제거된 펩타이인 항 비만 펩타이드 결합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 결합체는 하기 화학식 2를 포함하는 결합체인 것을 특징으로 하는 항 비만 펩타이드 결합체:

    [화학식 2]
    R1-X-Y-Z
    상기 식에서
    R1은 데스-아미노-히스티딜, N-디메틸-히스티딜, 베타-하이드록시 이미다조프로필 및 이미다조아세틸로 구성된 군에서 선택되고;
    X는 서열번호 4 내지 5로 표시되는 아미노산을 포함하는 펩타이드들로 구성된 군에서 선택되고;
    Y는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되며;
    Z는 면역글로블린 Fc 영역이다.
  7. 제1항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단이 각각 면역글로블린 Fc 영역 및 항 비만 펩타이드의 아민 그룹 또는 티올 그룹(Thiol group)에 결합된 항 비만 펩타이드 결합체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 면역글로블린 Fc 영역이 비당쇄화됨을 특징으로 하는 항 비만 펩타이드 결합체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 면역글로블린 Fc 영역이 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 1개 내지 4개 선택되는 도메인으로 이루어진 항 비만 펩타이드 결합체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 면역글로블린 Fc 영역이 힌지영역을 추가로 포함하는 것인 항 비만 펩타이드 결합체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 면역글로블린 Fc 영역이 IgG, IgA,IgD, IgE 및 IgM로 구성되는 군으로부터 선택되는 면역글로블린에서 유래된 Fc 영역인 항 비만 펩타이드 결합체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 면역글로블린 Fc 영역의 각각의 도메인이 IgG, IgA, IgD,IgE 및 IgM로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로블린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 항 비만 펩타이드 결합체.
  13. 제11항에 있어서, 상기 면역글로블린 Fc 영역이 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로블린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 항 비만 펩타이드 결합체.
  14. 제11항에 있어서, 상기 면역글로블린 Fc 영역이 IgG4 Fc 영역인 항 비만 펩타이드 결합체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 면역글로블린 Fc 영역이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인 항 비만 펩타이드 결합체.
  16. 제1항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 알데히드 그룹, 프로피온알데히드 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석시니미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응기를 가지고,
    상기 석시니미드 유도체는 석시니미딜 프로피오네이트, 석시니미딜 카르복시메틸, 히드록시 석시니미딜 및 석시니미딜 카보네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항 비만 펩타이드 결합체.
  17. 삭제
  18. 제16항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 항 비만 펩타이드 결합체.
  19. 제18항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체가 폴리에틸렌글리콜인 항 비만 펩타이드 결합체.
  20. (1) 양 말단에 알데히드, 말레이미드, 및 석시니미드 유도체 중에서 선택되는 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 항 비만 펩타이드의 아민 그룹 또는 티올 그룹에 공유결합 시키는 단계;
    (2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 N-말단 이외의 아미노산 잔기에 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 항 비만 펩타이드를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
    (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로블린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로블린 Fc 영역 및 항 비만 펩타이드와 결합된 펩타이드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 항 비만 펩타이드 결합체의 제조방법으로서,
    상기 석시니미드 유도체는 석시니미딜 프로피오네이트, 석시니미딜 카르복시메틸, 히드록시 석시니미딜 및 석시니미딜 카보네이트로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    상기 항 비만 펩타이드는 서열번호 4 또는 5의 아미노산을 포함하는 펩타이드의 유도체이고;
    상기 유도체는 펩타이드의 N-말단 아민 그룹의 치환(substitution), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중에 선택된 어느 하나의 방법에 의해 제조되는 것인 항 비만 펩타이드 결합체의 제조방법.
  21. (1) 양 말단에 알데히드 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 항 비만 펩타이드의 라이신 잔기에 pH 7.5 이상에서 공유결합하는 단계;
    (2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 라이신 잔기에 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 항 비만 펩타이드를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
    (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로블린Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로블린 Fc 영역 및 항 비만 펩타이드와 결합된 단백질 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 항 비만 펩타이드 결합체의 제조방법으로서,
    상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    상기 항 비만 펩타이드는 서열번호 4 또는 5의 아미노산을 포함하는 펩타이드의 유도체이고;
    상기 유도체는 펩타이드의 N-말단 아민 그룹의 치환(substitution), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중에 선택된 어느 하나의 방법에 의해 제조되는 것인 항 비만 펩타이드 결합체의 제조방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 항 비만 펩타이드는 첫번째 아미노산(히스티딘)의 알파 카본이 제거(deletion)된 펩타이드인 항 비만 펩타이드 결합체의 제조방법.
  23. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜인 항 비만 펩타이드 결합체의 제조방법.
  24. 제1항, 제4항 내지 제16항, 제18항, 및 제19항 중 어느 한 항의 항 비만 펩타이드 결합체를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  25. 삭제
  26. 삭제
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