KR101424550B1 - 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물, 및 당뇨병 치료 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 상기 조성물은 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 병용 투여를 통하여 인슐린 투여에 따른 체중 증가 억제와 인슐린 분비 펩타이드 투여에 따른 구토 및 메스꺼움 현상을 억제 및 인슐린 투여량을 낮추어 복약 순응도를 월등히 개선할 수 있다. 아울러, 본 발명의 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 각각 인슐린 및 인슐린 분비 펩타이드가 비펩타이드성 링커를 통해 면역글로불린 Fc 영역과 연결되어 생체 내 지속성 및 안정성이 향상된다.

Description

지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병 치료용 조성물{Composition for Treating Diabetes Comprising Long-acting Insulin Conjugate and Long-acting Insulinotropic Peptide Conjugate}
본 발명은 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물, 및 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병의 치료 방법에 관한 것이다.
인슐린은 췌장의 베타세포에서 분비되는 펩타이드로서 체내의 혈당을 조절하는데 매우 중요한 역할을 담당하는 물질이다. 이러한 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않아 혈중 포도당의 농도가 높아지는 대사질환을 당뇨병이라 한다. 인슐린이 제대로 분비되지 않거나 분비된 인슐린이 체내에서 제대로 작용하지 못하여 체내의 혈당이 조절되지 못하고 상승하는 경우를 제 2형 당뇨병이라고 하며, 췌장에서 인슐린을 분비하지 못하여 혈당이 상승하는 경우를 제 1형 당뇨병이라고 한다. 제 2형 당뇨병의 경우 화학물질을 주성분으로 하는 경구용 혈당 강하제를 이용하여 치료를 하며 일부 환자에는 인슐린을 사용하여 치료하기도 한다. 반면 제 1형 당뇨병의 경우에는 인슐린의 투여가 필수적으로 요구된다.
현재 많이 사용되고 있는 인슐린 치료법은 식사 전, 후에 주사를 통하여 인슐린을 투여하는 방법이다. 인슐린은 현재 주사약으로 나와있으며, 피하주사로 투여하는 것을 원칙으로 하고 있고, 작용 시간에 따라 투여방법이 다르다. 인슐린 주사 투여는 먹는 약에 비해서 혈당 강하 효과가 더 빠르게 나타나고, 먹는 약을 사용할 수 없는 환경에서도 안전하게 사용할 수 있으며, 용량의 제한도 없지만, 하루에 3번씩 지속적으로 사용되어야 하기 때문에 주사침에 대한 거부감, 투여방법의 어려움, 저혈당 증상, 장기적인 인슐린투여에 의해 발생하는 체중증가 현상 등이 단점으로 꼽히고 있다. 체중증가 현상은 심장혈관 질환의 위험도를 높이며, 혈당 조절기능을 저하시키는 부작용으로 이어질 수 있다. 한편, 인슐린 펩타이드 약물이 체내로 흡수된 이후, 약물의 혈중 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔으며, 그 예로 란투스(Lantus, Insulin glargine; Sanofi Aventis)와 레버미어(Levemir, Insulin detemir; Novo Nordisk) 등 지속성 인슐린이 개발되어 시판 및 상용화되었다. 상기 지속성 약물들은 인슐린 NPH(Neutral Protamine Hagedorn)와 다르게 수면상태의 저혈당 위험도를 낮추었고, 특히 레버미어의 경우 체중증가 현상을 완화시켰다. 하지만 여전히 하루 1회에서 2회의 투여용법이 단점으로 여겨지고 있다.
한편 인슐린 분비 펩타이드의 일종인 글루카곤 유사 펩타이드-1(Glucagon like peptide 1, GLP-1)은 회장과 대장의 L-세포에서 분비되는 인크레틴(incretin) 호르몬이다. 글루카곤 유사 펩타이드-1의 주요한 작용은 인슐린 분비를 증가시키며, 포도당의 농도에 따른 인슐린 분비(Glucose dependent secretion)가 이루어져 저혈당이 발생하지 않는다. 이런 특징으로 제 2형 당뇨병의 치료방법으로 적용되나, 혈중 반감기가 2분 내외로 매우 짧기 때문에 약제로 개발하는데 큰 제약을 갖고 있다. 이에 따라 개발되어 시판되는 글루카곤 유사 펩타이드-1(Glucagon like peptide-1) 작용제(아고니스트)로서는 글리아 몬스터 도마뱀(glia monster)의 침샘으로부터 정제된 글루카곤 유사 펩타이드-1 유사체인 엑센딘(Exendin)-4가 있다. 이는 DPP-IV(Dipeptidyl peptidase-4)에 대한 저항성과 함께 글루카곤 유사 펩타이드-1 보다 높은 생리 활성을 가지며, 따라서 체내 반감기가 2-4시간으로 글루카곤 유사 펩타이드-1에 비해 길어진 체내 반감기를 가진다(US 5,424,286). 그러나 DPP-IV의 저항성을 증가시키는 방법만으로는 충분한 생리활성의 지속기간을 기대할 수 없는데, 예를 들어 현재 시판되고 있는 엑센딘-4(엑세나티드, exenatide)의 경우 환자에게 하루 2회 주사를 통해 투여되어야 하며, 투여에 따른 구토유발 및 메스꺼움 현상이 환자에게 큰 부담으로 작용되는 단점이 여전히 남아있다.
따라서, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 단백질 약물의 활성을 유지하고 안정성 향상을 동시에 달성하는 기술로서, 종래 생리활성 폴리펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역을 비펩타이드성 중합체를 링커로 하여 상호 공유결합에 의해 연결시킨 지속형 단백질 결합체를 제안한 바 있고(대한민국 등록 특허 제10-0725315호), 특히 지속형 인슐린 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체 각각의 생체 내 효력 지속효과가 획기적으로 증가됨을 확인한 바 있다(대한민국 출원 제10-2008-0001479호 및 제10-2010-0054068호). 그러나 여전히 안정적인 혈당 변화를 가져오는 양의 인슐린 또는 엑센딘-4의 투여시, 체중 증가 현상이 나타나거나 구토 및 메스꺼움 현상이 나타나는 문제점이 있어, 약물의 투여량과 횟수를 줄이면서도 당뇨병 치료효과가 우수한 치료방법의 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 당뇨병 치료 지속효과가 증가되는 동시에 구토유발 및 메스꺼움 현상을 줄일 수 있는 당뇨병 치료제를 개발하고자 예의 노력한 결과, 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체와 인슐린 수용체를 동시에 자극하는 지속형 엑센딘-4 결합체와 지속형 인슐린 결합체의 병용투여를 시도하였고, 이러한 지속형 인슐린 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체 약물을 함께 사용할 때, 생체 내 지속성 및 안정성이 향상되고 두 약물의 투여 용량을 획기적으로 줄여서 안정적인 혈당 변화를 가져옴을 확인하였다. 또한, 글루카곤 유사 펩타이드-1 아고니스트 및 엑센딘-4, 또는 이의 유도체들의 특징인 구토 및 메스꺼움 현상을 개선하고, 인슐린 투여에 의한 체중 증가 현상을 지속형 엑센딘-4 결합체를 통하여 완화시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 당뇨병에 걸릴 위험이 있거나 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 당뇨병의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 지속형 인슐린 결합체 및 인슐린 분비 펩타이드를 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 인슐린 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체가 병용 투여되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어, "지속형 인슐린 결합체"는 인슐린이 면역글로불린 Fc 영역과 비펩타이드성 링커를 통하여 연결된 것을 의미한다.
본 발명의 지속형 인슐린 결합체는 효력의 지속성이 천연형 인슐린에 비해 증가한 것을 의미하며, 상기 지속형 인슐린 결합체는 천연형 인슐린의 아미노산이 수식, 치환, 추가 또는 제거된 형태, 폴리에틸렌글리콜 (PEG)과 같은 생분해성 중합체가 인슐린에 결합된 결합체, 알부민이나 면역글로불린과 같은 지속성이 뛰어난 단백질이 인슐린에 결합된 결합체, 생체 내 알부민과 결합력을 갖는 지방산이 인슐린에 결합된 결합체 또는 생분해성 나노파티클에 봉입된 형태의 인슐린을 포함할 수 있으나, 지속형 인슐린 결합체의 종류는 본 발명에 제한을 두지 않는다.
본 발명에서 용어, "인슐린"은 체내의 혈당이 높을 때 췌장에서 분비되어 간, 근육, 지방 조직에서 당을 흡수하여 글리코겐으로 저장하며, 지방을 분해하여 에너지원으로 사용되는 것을 억제하여 혈당을 조절하는 기능을 가지는 펩타이드를 의미한다. 상기 펩타이드는 천연형 인슐린, 기초 인슐린(basal insulin), 인슐린 아고니스트(agonist), 전구물질(precursor), 유도체 (derivatives), 단편 (fragments) 및 변이체 (variants) 등을 포함한다.
본 발명에서 용어, "천연형 인슐린"은 췌장에서 분비되는 호르몬으로서 일반적으로 세포 내 글루코스 흡수를 촉진하고 지방의 분해를 억제하여 체내의 혈당을 조절하는 역할을 한다. 인슐린은 혈당조절 기능이 없는 프로인슐린 (Proinsulin) 전구체의 형태에서 프로세싱을 거쳐 혈당조절 기능을 가지는 인슐린이 된다. 인슐린 아미노산 서열은 아래와 같다 :
알파 체인 :
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (서열번호 1)
베타 체인 :
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly- Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (서열번호 2)
본 발명에서 용어, "기초 인슐린(basal insulin)"은 정상적인 하루의 혈중 글루코스 변동을 조절하는 펩타이드로서, 그 예로 래브미어(levemir), 글라긴(glagine) 및 디글루드(deglude) 등이 있다.
본 발명에서 용어, "인슐린 아고니스트"는 인슐린의 구조와 상관없이 인슐린의 생체내 수용체에 결합하여 인슐린과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 물질을 의미한다.
본 발명에서 용어, "인슐린 변이체"는, 인슐린과 아미노산서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, 체내에서 혈당조절 기능을 보유한 펩타이드를 의미하며, 천연형 인슐린에서 일부 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중에 어느 하나의 방법 또는 이들의 방법의 조합을 통해 제조될 수 있다.
본 발명에서 용어, "인슐린 유도체"는 천연형 인슐린과 비교시 아미노산 서열에서 최소한 80% 이상 상동성을 보이며, 아미노산 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예; deamination) 또는 수식(예; N-methylation)된 형태일 수 있고, 체내에서 혈당을 조절하는 기능을 보유한 펩타이드를 의미한다.
본 발명에서 용어, "인슐린 단편"은 인슐린의 아미노말단 또는 카르복시말단에 하나 또는 그 이상 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연에 존재하지않는 아미노산(예; D형 아미노산)도 가능할 수 있다. 이러한 인슐린 단편은 체내에서 혈당조절 기능을 보유한다.
인슐린 아고니스트, 유도체, 단편 및 변이체에서 각각 사용된 제조방법은 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고, N-말단 아미노산 잔기에 탈아미노화(deamination)된 체내에서 혈당조절 기능을 보유한 펩타이드도 포함된다.
구체적인 일 실시예로서 본 발명에서 사용한 인슐린은 재조합 방법을 통하여 생산될 수 있으며, Solid phase 합성법을 통하여 합성하는 방법으로도 생산 가능하다.
또한, 본 발명에서 사용된 인슐린은 베타 체인의 아미노 말단에 비펩타이드성 중합체가 결합될 수 있다. 이와 같은 비펩타이드성 중합체는 본 발명에서 링커로 이용된다. 상기 비펩타이드성 중합체를 링커로 연결함으로서 인슐린의 활성을 유지시키면서, 안전성을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, "비펩타이드성 중합체"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 본 발명에서 상기 비펩타이드성 중합체는 비펩타이드성 링커와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에 사용가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
기존 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합단백질에서 사용된 펩타이드성 링커의 단점은 생체내에서 단백질분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성약물의 혈중반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없다는 것이다.그러나, 본 발명에서는 단백질분해효소에 저항성있는 중합체를 사용하여 캐리어와 유사하게 펩타이드의 혈중반감기를 유지할 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 중합체는 상기와 같은 역할, 즉 생체 내 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체이면 제한없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체의 분자량은 1 내지 100 kDa 범위, 바람직하게는 1 내지 20 kDa 범위이다. 또한, 상기 면역글로불린 Fc 영역과 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
본 발명에 사용되는 비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역 및 단백질약물과 결합될 수 있는 반응기를 가질 수 있다. 상기 비 펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 반응 알데히드 그룹, 프로피온 알테히드 그룹, 부틸 알테히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 특히, 상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다. 상기 비펩타이드성 중합체인 링커의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 양쪽 말단에 히드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 본 발명의 지속형 인슐린 결합체를 제조할 수 있다.
바람직하게는 상기 비펩타이드성 중합체는 인슐린 베타 체인의 N-말단에 결합된 형태일 수 있다.
본 발명의 인슐린은 비펩타이드성 중합체로 개질된 형태일 수 있다.
면역글로불린 단편을 이용한 지속형 인슐린 약물 결합체의 개발 시, 저혈당 증상을 나타내지 않으면서 보다 긴 약물 지속시간을 나타내기 위하여 PEG(polyethylene glycol)로 생리활성 폴리펩타이드를 수식할 경우 역가가 줄어드는 현상이 오히려 지속형 인슐린 약물 결합체에 있어서는 특수하게 장점으로 사용되므로, PEG 수식된 인슐린을 비펩타이드성 중합체를 통하여 면역글로불린 Fc 영역과 결합시킬 수도 있다. 인슐린 개질에 사용할 수 있는 비펩타이드성 중합체의 종류로는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜이다. 상기 PEG 수식된 인슐린에서 PEG의 수식은, PEG가 인슐린의 알파 체인 N-말단 또는 베타 체인 특정 라이신 잔기에 선택적으로 결합한 것을 특징으로 한다. 상기 인슐린을 수식하는 PEG는 바람직하게 말단에 알데히드 및 숙신 반응기를 포함하고, 더욱 바람직하게 숙신 반응기를 포함하는 PEG이다.
본 발명의 지속형 인슐린 결합체의 자세한 제조방법 및 효력은 대한민국 출원번호 제2010-0054068호, 제2010-0054067호, 제2011-0030868호에 기술되어 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단에 모노 페길화(mono-PEGylation)한 다음, 이를 인슐린의 베타 체인의 1번 페닐알라닌에 수식시켜 지속형 인슐린 결합체를 제조하였다(실시예 1).
본 발명에서 용어, "지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체"는 인슐린 분비 펩타이드가 면역글로불린 Fc 영역과 비펩타이드성 링커를 통하여 연결된 것을 의미한다.
본 발명에서 "인슐린 분비 펩타이드"는 인슐린 분비 기능을 보유한 펩타이드를 의미하며, 췌장 베타세포의 인슐린의 합성 또는 발현을 자극할 수 있다. 상기 인슐린 분비 펩타이드는 바람직하게는 GLP(Glucagon like 펩타이드)-1, 엑센딘-3(exendin-3) 또는 엑센딘-4(exendin-4)이나 이에 제한되지 않는다. 상기 인슐린 분비 펩타이드에는 천연형 인슐린 분비 펩타이드뿐만 아니라, 그의 전구물질 (precursors), 아고니스트(agonist), 유도체(derivatives), 단편(fragments) 및 변이체(variants) 등을 포함한다.
본 발명의 인슐린 분비 펩타이드 유도체는 인슐린 분비 펩타이드의 N-말단 아미노(또는 아민) 그룹이 제거된 유도체(Desamino-histidyl 유도체), 아미노 그룹을 하이드록실 그룹으로 치환한 유도체(beta-hydroxy imidazopropionyl-유도체), 아미노 그룹에 2개의 메틸(methyl) 잔기로 수식된 유도체(Dimethyl-histidyl-유도체), 아미노 말단의 아미노 그룹을 카복실 그룹으로 치환한 유도체(beta-carboxyimidazopropionyl-유도체) 또는 아미노 말단 히스티딘 잔기의 알파 카본을 삭제하여 이미다졸아세틸(imidazoacetyl) 그룹만을 남겨두어 아미노 그룹의 양전하(positive charge)를 제거한 유도체(Imidazoacetyl-유도체) 등이 포함될 수 있으며, 또한 기타 다른 형태의 아미노-말단 아미노 그룹 변이 유도체가 본 발명의 범주에 속한다.
본 발명에서 인슐린분비 펩타이드 유도체는 더욱 바람직하게는 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹 또는 아미노산 잔기를 화학적으로 변이시킨 유도체이며, 더욱 바람직하게는 엑센딘-4의 아미노 말단의 첫 번째 아미노산인 히스티딘 잔기의 알파 카본에 존재하는 알파 아미노 그룹 또는 알파 카본을 치환 또는 제거한 엑센딘-4 유도체이며, 더욱더 바람직하게는 N-말단 아미노 그룹을 제거한 데스아미노-히스티딜-엑센딘-4(Desamino-histidylexendin-4, DA-엑센딘-4), 하이드록실 그룹 또는 카복실 그룹으로 치환한 베타-히드록시 이미다조프로피오닐-엑센딘-4(beta-hydroxy imidazopropionyl-exendin-4, HY-엑센딘-4), 베타-카르복시 이미다조프로필-엑센딘-4(beta-carboxyimidazopropionyl-exendin-4, CX-엑센딘-4), 2개의 메틸 잔기로 수식한 디메틸-히스티딜-엑센딘-4(Dimethyl-histidyl-exendin-4, DM-엑센딘-4), 또는 아미노 말단 히스티딘 잔기의 알파 탄소를 제거한 이미다조아세틸-엑센딘-4(Imidazoacetyl-exendin-4, CA-엑센딘-4)이다.
GLP-1은 소장에서 분비되는 호르몬으로서 일반적으로 인슐린 생합성 및 분비를 촉진하고 글루카곤 분비를 억제하며 세포 내 글루코스 흡수를 촉진한다. 소장에서 글루카곤 전구체는 3개의 펩타이드로 분해되는데, 글루카곤, GLP-1, GLP-2이다. 여기서 GLP-1 은 GLP-1(1-37) 을 의미하며 인슐린 분비기능이 없는 형태이고, GLP-1(7-37) 형태로 프로세싱되어 활성형 GLP-1(7-37)이 된다. GLP-1(7-37) 아미노산 서열은 아래와 같다 :
GLP-1(7-37):
HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G (서열번호 3)
본 발명에서 용어, "GLP-1 유도체"는, GLP-1과 비교 시 최소한 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보이며, 화학적으로 수식된 형태일 수도 있고, 인슐린 분비기능도 최소한 동등 또는 그 이상을 나타내는 펩타이드를 의미한다.
본 발명에서 용어, "GLP-1 단편"은, 천연형 GLP-1 의 N-말단 또는 C-말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연에 존재하지 않는 아미노산 (예; D형 아미노산)도 가능하다.
본 발명에서 용어, "GLP-1 변이체"는, 천연형 GLP-1 과 아미노산서열이 하나 이상 다른 펩타이드로 인슐린 분비기능을 보유한 펩타이드를 의미한다.
엑센딘-3 와 엑센딘-4는, GLP-1 과 53%의 아미노산 서열 유사성을 보이는 39 개 아미노산으로 이루어진 인슐린분비 펩타이드이며, 엑센딘-3와 엑센딘-4의 아미노산서열은 아래와 같다.
엑센딘-3 :
HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS (서열번호 4)
엑센딘-4 :
HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS (서열번호 5)
엑센딘 아고니스트는 엑센딘의 구조와 상관없이 엑센딘의 생체 내 수용체에 결합하여 엑센딘과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 물질을 의미하며, 엑센딘 유도체는, 천연형 엑센딘과 비교시 최소한 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보 이며, 아미노산 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예; deamination) 또는 수식(예; N-methylation)된 형태일수 있고, 인슐린 분비기능을 보유한 펩타이드를 의미한다.
엑센딘 단편은, 천연형 엑센딘의 N-말단 또는 C-말단에 하나 또는 그 이상 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 천연에 존재하지 않는 아미노산(예: D-형 아미노산)의 추가도 가능할 수 있고, 이러한 엑센딘 단편은 인슐린 분비기능을 보유한다.
엑센딘 변이체는, 천연형 엑센딘과 아미노산서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, 인슐린 분비기능을 보유한 펩타이드를 의미하며, 상기 엑센딘 변이체는 엑센딘-4의 열두 번째 아미노산인 라이신이 세린(serine) 또는 알지닌(arginine)으로 치환된 펩타이드를 포함한다.
엑센딘 아고니스트, 유도체, 단편 및 변이체에서 각각 사용된 제조방법은 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고 N-말단 아미노산 잔기에 탈아미노화 (deamination)된 인슐린분비 펩타이드도 포함된다.
구체적인 일 실시예로서 본 발명에서 사용한 천연형 인슐린 분비 펩타이드와 변형된 인슐린 분비 펩타이드는 Solid phase 합성법을 통하여 합성될 수 있으며, 천연형 인슐린분비 펩타이드를 포함한 대부분의 천연형 펩타이드는 재조합 방법으로도 생산 가능하다.
본 발명에서 사용된 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 인슐린 분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc와 같은 면역글로불린 단편을 비펩타이드성 링커를 통하여 연결된 형태를 의미한다. 상기 비펩타이드성 링커에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 지속형 인슐린 결합체와 같이 면역글로불린 단편을 이용한 결합체로서, 인슐린 합성 및 분비 촉진, 식욕억제, 체중감소, 베타 세포 혈중 글루코스 민감도 증가, 베타세포 증식 (beta cell proliferation) 촉진, 위내 정체 (gastric emptying) 지연, 글루카곤 억제와 같은 기존의 인슐린 분비 펩타이드의 생체 내 활성이 유지될 뿐만 아니라 인슐린 분비 펩타이드의 혈중 반감기 및 이로 인한 상기 펩타이드의 생체 내 효력 지속 효과가 획기적으로 증가하게 하므로, 당뇨 및 비만의 치료에 유용하다.
지속형 분비 펩타이드 결합체의 종류 및 제조방법은 대한민국 출원번호 제2008-001479호, 제2008-0069234호와 제2010-0047019호에 자세히 기술되어 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 이미다조-아세틸 엑센딘-4(CA 엑센딘-4)의 라이신(lysine, Lys)에 PEG로 수식시켰으며, PEG 수식된 엑센딘-4를 면역글로불린 Fc에 연결하여 지속형 엑센딘-4 결합체를 제조하였다(실시예 2).
본 발명에서 사용되는 인슐린 및 인슐린 분비 펩타이드는 캐리어 물질과 비펩타이드성 중합체를 링커로 사용하여 연결된다. 본 발명에 사용가능한 캐리어 물질은 면역글로불린 Fc 영역, 알부민, 트랜스페린 및 PEG로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 면역글로불린 Fc 영역이다.
본 발명의 상기 지속성 인슐린 결합체 및 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 각각 인슐린 및 인슐린 분비 펩타이드가 면역글로불린 Fc 영역과 비펩티이드성 링커를 통해 연결된 형태로서, 지속성 및 안전성을 나타낸다. 본 발명에서 면역글로불린 Fc는 면역글로불린 단편과 혼용하여 사용될 수 있다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 항체마다 달라 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1)CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2)CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3)CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4)CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5)1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6)중쇄 불변 영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC, Complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다.
즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
본 발명의 상기 조성물은 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 병용 투여하는 것을 특징으로 한다.
이러한 본 발명의 상기 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 병용 투여하면 상기 지속형 인슐린 결합체는 인슐린 수용체에, 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체에 동시에 작용하여 각각의 투여시보다 혈중 당의 농도를 감소시키고, 안정적인 변화추이를 보인다. 또한 상기 결합체를 병용 투여하는 경우, 인슐린 단독투여시 나타날 수 있는 저혈당의 위험을 낮출 수 있으며, 체중을 감소시키는 효과가 있고, 인슐린 분비 펩타이드에 의해 전체 인슐린 투여량을 낮출 수 있다. 또한 엑센딘-4와 같은 인슐린 분비 펩타이드의 용량을 낮출 수 있어 엑센딘-4 단독 치료시 나타날 수 있는 메스꺼움, 구토 등의 부작용을 낮출 수 있는 장점이 있다. 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 사용은 혈중 반감기 및 생체 내 효력 지속 효과의 획기적인 증가로 인해 매일 투여되야 하는 만성환자에게 투여 횟수를 감소시켜 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있는 큰 장점이 있어 당뇨병의 치료에 큰 도움을 준다.또한, 본 발명의 약학적 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하고 병용투여방법을 이용하여 용량을 현저하게 감소시킬 수 있다.
지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 각각 동시, 순차적, 또는 역순으로 투여될 수 있으며, 적절한 유효량의 조합으로 동시에 투여될 수 있다. 또한 바람직하게는 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체가 각각 별도의 용기에 보관된 후 동시, 순차적 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 병용 투여용 조성물인 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 하나의 용기에 포함된 당뇨병 치료용 키트, 각각 별도의 용기에 보관된 것인 당뇨병 치료용 키트의 형태일 수 있다. 이와 같은 키트는 약학적으로 허용가능한 담체, 키트의 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, STZ (Streptozotocin) 약물로 유도된 고혈당 마우스에 지속형 인슐린 결합체와, 지속형 엑센딘-4 결합체를 병용 투여한 후, 혈당의 변화 추이를 관찰한 결과, 상기 결합체를 병용투여한 경우에 그렇지 않은 경우보다 혈당의 변화가 안정적인 추이를 보인 것을 확인하였다(도 1). 또한, 2형 당뇨 모델 마우스에서 지속형 인슐린 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체를 주1회씩 병용 투여한 경우, 투여 전후의 공복 혈당 차이를 비교한 결과 상기 결합체를 각각 투여한 경우에 비해 혈당 개선 효과가 우수하였으며(도 2), 인슐린 투여에 따른 체중증가 부작용도 나타나지 않아 인슐린에 의한 체중증가 부작용도 감소시킬 수 있음을 나타내었다(도 3).
본 발명에서 용어, "당뇨(Diabetes)병"은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환 (metabolic disease)를 의미한다. 본 발명의 조성물을 개체에 병용 투여함으로써, 혈당을 조절하여 당뇨병을 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어, "예방"이란 본 발명의 조성물의 병용투여로 당뇨병을 방지하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란 본 발명의 조성물의 병용투여로 당뇨병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 상기 당뇨병 치료는 당뇨병이 발생할 수 있는 임의의 포유 동물에 적용이 가능하며, 그 예로 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등 가축을 제한없이 포함하나, 바람직하게는 인간일 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물들의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비강내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여 시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
또한 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서 본 발명은 상기 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 조성물을 당뇨병에 걸릴 위험이 있거나 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 투여하는 단계는 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 병용 투여하는 것에 의해 수행될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나 각각 동시, 순차적, 또는 역순으로 투여될 수 있으며, 적절한 유효량의 조합으로 동시에 투여될 수 있다.
지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드를 모두 포함하는 본 발명의 조성물은 주1회의 투여로도 혈당을 우수하게 낮추면서 체중 증가의 부작용을 가지고 오지 않는바, 당뇨병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 지속형 인슐린 결합체 및 인슐린 분비 펩타이드를 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 지속형 인슐린 결합체 및 인슐린 분비 펩타이드에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 지속형 인슐린 결합체는 GLP-1 아고니스트(agonist)와 같은 인슐린 분비 펩타이드와 병용투여될 수 있다. GLP-1 아고니스트(agonist)의 예로 엑세나티드(exenatide), 리라글루티드(liraglutide) 및 릭시세나타이드(lixisenatide)가 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 인슐린 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 인슐린 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 천연형 인슐린, 인슐린 유도체 또는 기초 인슐린(basal insulin)과 같은 인슐린과 병용투여될 수 있다.
본 발명의 지속형 인슐린 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체는 우수한 당뇨병 치료 효능을 나타내며, 특히 병용 투여 시, 인슐린 수용체와 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체를 동시에 자극하여 생체 내 지속성 및 안정성이 향상되고 투여 용량을 획기적으로 줄이면서도 혈당의 안정적인 조절로 저혈당 및 체중증가 양상을 완화 시키고, 구토 및 메스꺼움 현상을 억제 하여 복약 순응도가 개선된 당뇨병 치료제로서 효과가 있으며 특히 획기적으로 개선된 혈중 안정성 및 효력의 지속성으로 투여 빈도를 낮추어 환자의 편의성을 극대화하였다.
도 1은, STZ(Streptozotocin)에 의해 고혈당이 유도된 마우스에 지속형 인슐린 결합체(long acting insulin conjugate)와 지속형 엑센딘-4 결합체(long acting CA exendin-4 conjugate)를 병용투여한 후, 7일간 혈당 변화 추이를 나타낸 그래프이다.
도 2는, db/db 마우스에서 지속형 인슐린 결합체(long acting insulin conjugate)와 지속형 엑센딘-4 결합체(long acting CA exendin-4 conjugate)의 병용 투여에 의한 공복 혈당 차이 값(△FBG)의 변화를 나타낸 그래프이다(* P<0.05, ** P< 0.01, *** P<0.001 by Dunnet's MC test).
도 3은, db/db 마우스에서 지속형 인슐린 결합체(long acting insulin conjugate)와 지속형 엑센딘-4 결합체(long acting CA exendin-4 conjugate)의 병용 투여에 의한 체중 변화 값 (△BW)의 변화를 나타낸 그래프이다(* P<0.05, ** P< 0.01, *** P<0.001 by Dunnet's MC test).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 지속형 인슐린 결합체의 제조
5K PropionALD(3) PEG(프로필알데히드기를 3개 가지고 있는 PEG, NOF, 일본)를 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 페길화시키기 위하여 면역글로불린 Fc 영역과 PEG의 몰비 1 : 2, 면역글로불린 Fc 농도를 10 ㎎/㎖로 4℃에서 4.5 시간 반응시켰다. 이 때 반응은 100 mM 인산 칼륨(Potassium phosphate, pH6.0)에서 이루어졌으며, 환원제인 20 mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 반응시켰다. 반응액은 Source 15Q(GE Healthcare) 정제컬럼을 사용하여 모노 페길화된 (Mono-PEGylated) 면역글로불린 Fc를 정제하였다.
인슐린의 베타 체인의 1번 페닐알라닌(B1F)에 90%이상 수식된 인슐린-PEG-면역글로불린 Fc 결합체를 제조하기 위하여, 위의 방법으로 제조된 모노 페길화된(mono-PEGylated) 면역글로불린 Fc와 인슐린을 몰비가 4 : 1이 되도록 하고 전체단백질농도를 20 ㎎/㎖로 하여 4℃에서 20시간 반응시켰다. 반응액은 100 mM 인산칼륨(Potassium phosphate, pH6.0)이며 환원제인 20 mM SCB를 첨가하였다. 반응이 종결된 후 반응액은 Source 15Q 정제 컬럼을 사용하여 1차 정제를 하였다. 이후 Source 15ISO 정제 컬럼으로 2차 정제를 진행하여 인슐린-PEG-면역글로불린 Fc 결합체를 얻었다.
실시예 2: 지속형 엑센딘-4 결합체의 제조
이미다조-아세틸 엑센딘-4(CA 엑센딘-4, AP, 미국)를 이용하여 3.4k PropionALD (2) PEG를 CA 엑센딘-4의 Lys과 반응시킨 후, 두개의 Lys 이성질체 피크 중 반응이 많이 가고 N-말단 이성질체와 확연히 구분되는 가장 뒤쪽의 이성질체 피크(Lys27 위치이성체)를 이용하여 커플링을 진행하였다.
펩타이드와 면역글로불린 Fc 몰비를 1:8, 전체단백질 농도를 60 ㎎/㎖로 하여 4℃에서 20시간 반응하였다. 반응액은 100 mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. 커플링 반응액은 두 개의 정제 컬럼을 거쳐 정제되었다. 먼저 커플링 반응에 참여하지 않은 다량의 면역글로불린 Fc를 제거하기 위해여 SOURCE Q(XK-16mL, 아머샴 바이오사이언스)을 이용하였다. 20 mM Tris(pH7.5)에서 1M NaCl을 사용하여 Salt gradient를 주면 상대적으로 결합력이 약한 면역글로불린 Fc가 먼저 용출되고 바로 뒤이어 엑센딘-4-면역글로불린 Fc 가 용출된다. 일차정제를 통하여 어느 정도 면역글로불린 Fc가 제거되지만 이온교환컬럼에서 면역글로불린 Fc와 엑센딘-4-면역글로불린 Fc의 결합력 차이가 크지 않아 완전히 분리되지는 않았다. 따라서 두 물질의 소수성(Hydrophobicity)을 이용하여 이차 정제를 하였다. SOURCE ISO(HR16 ㎖, 아머샴 바이오사이언스)에 20mM Tris(pH7.5) 및 1.5M 황산암모늄을 이용하여 일차 정제된 시료를 결합시킨 후 차츰 황산암모늄 농도를 낮추면서 시료를 용출시켰다. HIC 컬럼에 결합력이 약한 면역글로불린 Fc가 먼저 용출되고 결합력이 강한 엑센딘-4-면역글로불린 Fc 시료가 뒤쪽으로 용출되었다. 이들의 소수성 차이가 커 이온교환 컬럼보다 훨씬 분리가 용이하였다.
컬럼 : SOURCE Q(XK 16 ㎖, 아머샴 바이오사이언스)
유속 : 2.0 ㎖/분
구배 : A0 ->25% 70 분 B (A: 20mM 트리스 pH7.5, B: A + 1M NaCl)
컬럼 : SOURCE ISO(HR 16 ㎖, 아머샴 바이오사이언스)
유속 : 7.0 ㎖/분
구배 : B 100 →0% 60분 B (A: 20mM 트리스 pH7.5, B: A + 1.5M 황산암모늄)
실시예 3: 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용투여에 의한 STZ (Streptozotocin)에 의해 유도된 고혈당에 미치는 효력 확인
상기 실시예 1 및 실시예 2에서 제조한 지속형 인슐린 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체를 포함하는 조성물의 투여 또는 지속형 인슐린 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용투여에 따른 인 비보(in vivo) 효력을 측정하기 위하여 STZ(Streptozotocin)으로 고혈당을 유도한 마우스를 이용하여 혈당의 변화를 확인하였다.
16 시간 절식시킨 7주령의 C57BL/6 마우스에 10 mM 시트르산 완충용액(citrate buffer, pH 4.5)에 녹인 STZ(50 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎖)를 5일 연속 복강 투여하여 당뇨를 유발하였다. 이후 2일 후 혈당을 미정맥 부분에 26 G 주사기로 찔러서 얻은 1-2 방울의 혈액을 사용하여 혈당분석기(OneTouch Ultra, LifeScan, Inc., USA)로 측정하였다. 당뇨가 유발되었는지 여부를 측정된 혈당을 기준으로 판단하였다(350-600 ㎎/㎗ 사이). 당뇨병이 유도된 마우스를 혈당에 따라 군 당 5 마리씩 G1, G2, G3, G4 및 G5의 5개 군으로 분리하였다.
상기 군들을 각각 아무것도 투여하지 않은 대조군(Vehicle), 지속형 엑센딘-4 결합체를 투여한 군(5 mcg/㎏), 지속형 인슐린 결합체(100 mcg/㎏) 투여한 군, 지속형 엑센딘-4 결합체(5 mcg/㎏) 및 지속형 인슐린 결합체(50 mcg/㎏)를 투여한 군, 지속형 엑센딘-4 결합체(5 mcg/㎏) 및 지속형 인슐린 결합체(100 mcg/㎏)를 투여한 군으로 나누었다. 그리고 상기 시험물질 투여 후 상기 각 군에 대하여 매일 혈당의 변화를 측정하였다.
그 결과, 지속형 인슐린 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용 투여군에서 혈당의 변화가 안정적이며 지속적인 강하 추이를 보였다(도 1). 이는 지속형 엑센딘-4 결합체 또는 지속형 인슐린 결합체를 각각 투여한 군에 비해 혈당이 현저히 저하된 결과였다.
본 발명의 지속형 인슐린 결합체와 지속형 엔센딘-4 결합체를 병용 투여하면 안정적이고 지속적인 혈당 감소 효과를 통해, 1회 투여 용량을 획기적으로 줄일 수 있으며, 따라서 구토 및 메스꺼움 현상과 같은 엑센딘-4의 부작용을 개선하고 인슐린 투여에 의한 체중 증가 현상을 완화할 수 있음을 시사한다.
실시예 4: 지속형 인슐린 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용 투여에 의한 공복 혈당 변화(△FBG) 및 체중 변화(△BW) 확인
상기 실시예 1 및 실시예 2에서 제조한 지속형 인슐린 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체를 포함하는 조성물의 투여 또는 지속형 인슐린 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용투여에 따른 인 비보(in vivo) 효력을 측정하기 위하여 2형 당뇨 모델 마우스인 db/db 마우스에서 혈당 개선 효과 및 체중 증가 억제 효과를 비교하였다.
2형 당뇨 모델인 db/db 마우스를 지속형 인슐린 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체를 각각 투여하는 단독 투여군과 병용 투여군으로 분류하였다. 단독 투여군에는 지속형 인슐린 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체를 각각 430 nmol/kg과 2.3 nmol/kg의 양으로 주1회씩 피하 투여하였으며, 병용 투여군에는 108 nmol/kg과 216 nmol/kg의 지속형 인슐린 결합체를 지속형 엑센딘-4 결합체 2.3 nmol/kg과 병용하여 주 1회씩 피하 투여하였다. 시험은 28일 동안 진행 하였으며, 약물 최초 투여 전과 최종 시험일에 시험 동물들을 8시간 금식시킨 후 측정한 공복 혈당 차이 값(△FBG)과, 투여 전과 최종 시험일 체중 변화 값(△BW)을 최종 측정 항목으로 측정 및 계산하였다.
△FBG와 △BW 측정 결과, 주1회 지속형 인슐린 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체를 병용 투여한 군은 지속형 인슐린 결합체 단독 투여 군에 비해 1/4 인슐린 용량(108 nmol/kg)에서도 우수한 혈당 개선 효과(도 2) 및 체중 증가 억제 효과 (도 3)를 보였다. 이러한 결과를 통해, 지속형 인슐린 결합체와 지속형 CA 엑센딘-4 결합체의 병용 투여하는 경우, 인슐린 용량 감소를 통한 저혈당 위험성 감소 효과와 체중 증가 억제 효과 등의 장점을 가짐을 알 수 있었다. 이와 같은 사실은 현재 매일 투여해야하는 인슐린 및 GLP-1 아고니스트(agonist)에 비해 주1회 투여하여도 혈당 감소효력이 나타나며, 단독 투여시보다 혈당 조절 능력이 우월하고, 인슐린 요구량을 낮추어 인슐린에 의한 저혈당 위험을 감소시킬 수 있으며, 인슐린에 의한 체중증가 부작용도 감소시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
이와 같은 결과는 본 발명의 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 엑센딘-4 결합체를 모두 포함하는 조성물은 주1회 투여하여도 혈당 조절 능력이 우수하며 인슐린 투여에 따른 체중증가를 가져오지 않으면서도, 기존 인슐린 펩타이드 및 엑센딘-4 약물을 각각 투여함으로써 나타나는 부작용을 현저히 완화시킬 수 있음을 뒷받침한다.
<110> Hanmi Science Co., Ltd <120> Composition for Treating Diabetes Comprising Long-acting Insulin Conjugate and Long-acting Insulinotropic Peptide Conjugate <130> PA120510KR <150> KR10-2011-0053488 <151> 2011-06-02 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha chain of insulin <400> 1 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> beta chain of insulin <400> 2 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1(7-37) <400> 3 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 4 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-3 <400> 4 His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 5 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 <400> 5 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35

Claims (20)

  1. 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는, 지속형 인슐린 결합체 또는 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 단독에 비해 혈당 강하 효과가 증가된 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 각각 인슐린 및 인슐린 분비 펩타이드가 면역글로불린 Fc 영역과 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드,덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 링커를 통해 연결된 것이고, 상기 인슐린 분비 펩타이드는 천연형 엑센딘-4, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 제거된 엑센딘-4 유도체, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 하이드록실 그룹으로 치환된 엑센딘-4 유도체, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 디메틸기로 수식된 엑센딘-4 유도체 및 엑센딘-4의 첫 번째 아미노산인 히스티딘의 알파 탄소가 제거된 엑센딘-4 유도체로 이루어진 군에서 선택된 것인 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인슐린은 천연형 인슐린 또는 기초 인슐린(basal insulin)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인슐린은 상기 비펩타이드성 링커와 서로 다른 위치에서 추가로 비펩타이드성 중합체로 개질된 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물을 투여하여도 이에 의한 메스꺼움, 구토 또는 체중 증가 현상을 나타내지 않는 것이 특징인 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 비당쇄화(aglycosylation)됨을 특징으로 하는 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 1개 내지 4개 선택되는 도메인으로 이루어진 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 힌지(Hinge)영역을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 Fc 영역인 것인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인은 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 것인 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 것인 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  15. (i) 지속형 인슐린 결합체를 포함하는 제1 조성물; 및
    (ii) 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 제2 조성물을 포함하는, 지속형 인슐린 결합체 또는 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 단독에 비해 혈당 강하 효과가 증가된 당뇨병의 예방 또는 치료용 키트에 관한 것으로서, 상기 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 각각 인슐린 및 인슐린 분비 펩타이드가 면역글로불린 Fc 영역과 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드,덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 링커를 통해 연결된 것이고, 상기 인슐린 분비 펩타이드는 천연형 엑센딘-4, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 제거된 엑센딘-4 유도체, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 하이드록실 그룹으로 치환된 엑센딘-4 유도체, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 디메틸기로 수식된 엑센딘-4 유도체 및 엑센딘-4의 첫 번째 아미노산인 히스티딘의 알파 탄소가 제거된 엑센딘-4 유도체로 이루어진 군에서 선택된 것인, 당뇨병의 예방 또는 치료용 키트.
  16. 제1항 내지 제5항 및 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항의 조성물; 또는 제15항의 키트의 지속형 인슐린 결합체를 포함하는 제1 조성물 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 제2 조성물을 당뇨병에 걸릴 위험이 있거나 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 당뇨병의 예방 또는 치료 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 제1 조성물 및 제2 조성물을 투여하는 단계는 지속형 인슐린 결합체를 포함하는 제1 조성물 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 제2 조성물을 병용 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 병용 투여는 지속형 인슐린 결합체를 포함하는 제1 조성물 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 제2 조성물을 동시, 순차적 또는 역순으로 투여하는 것인 방법.
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