TW201305196A - 包含長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物之用以治療糖尿病之組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明係有關包含長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物之用以預防或治療糖尿病之組成物，以及有關治療糖尿病之方法，更特定言之，共同投予該長效胰島素接合物與該長效促胰島素肽接合物係抑制由胰島素治療所引起之體重增加，及由促胰島素肽治療所引起之嘔吐及噁心，並且降低所需之胰島素劑量，藉以顯著改善服藥順從性。此外，本發明長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物係分別由胰島素或促胰島素肽利用非肽基連接體而連接免疫球蛋白Fc區所製成，藉以展現改善之活體內之持續效力及安定性。

Description

包含長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物之用以治療糖尿病之組成物
本發明係有關一種包含長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物之用以預防或治療糖尿病之組成物，以及有關一種治療糖尿病之方法，其包括投予該組成物之步驟。
胰島素係由胰臟之β細胞分泌之胜肽，且在控制體內血糖濃度上扮演重要角色。代謝性疾病糖尿病係與胰島素分泌或功能異常所造成之血糖濃度提高有關。第1型糖尿病係由胰臟胰島素生產功能失常造成血糖濃度提高所引起，而第2型糖尿病係由胰島素分泌或功能異常造成血糖濃度提高所引起。第2型糖尿病患者通常使用具有化學物質作為主要成份之口服降血糖劑治療，並於有些例子中其與胰島素一起給予，而第1型糖尿病則需要胰島素治療。
最常用之胰島素療法涉及在餐前及/或餐後之胰島素注射。目前，可使用注射用胰島素，且通常係皮下注射。該投予方法隨作用時程變化。注射胰島素展現比經口投予更快速之降血糖效力，且當無法經口投予時，其可安全使用。此外，胰島素之使用劑量沒有限制。然而，長期以來每天3次使用胰島素時，可能造成如：厭惡針頭、注射裝置操作困難、低血糖及體重增加之缺點。因長期使用胰島素造成之體重增加可能提高心血管疾病與胰島素抗性之風險。同時，有許多努力試圖藉由體內吸收後維持長期高度胰島素肽藥物濃度來達到最大效力。例如：已發展出如蘭 德仕(Lantus)(胰島素甘精(glargine)；Sanofi Aventis)及瑞和密爾(Levemir)(胰島素得密爾(detemir)；Novo Nordisk)之長效胰島素製劑且可自市售商品取得。不同於胰島素NPH(赫氏中性魚精蛋白胰島素(Neutral Protamine Hagedorn))，此等長效藥物降低睡眠期間低血糖之風險，且瑞和密爾特別與較少的體重增加有一些關係。然而，此等藥物製劑亦具有必需一天投予一次或兩次之缺點。
同時，有一種促胰島素肽：似升糖素肽-1(glucagon like peptide-1，GLP-1)，係由迴腸及結腸之L-細胞分泌之增泌素(incretin)激素。似升糖素肽-1之功能在於以隨葡萄糖變化之方式促進釋放胰島素，以預防低血糖發作。基於此性質，已注意到其於治療第2型糖尿病上之潛力。然而，使用GLP-1作為醫療劑之主要障礙在於其在血漿中短於2分鐘之極短半衰期。目前，可自市面上取得促胰島素分泌素(exendin)-4商品作為似升糖素肽-1受體促效劑，且其係自美國毒蜥(gila monster)之唾液腺中純化之似升糖素肽-1類似物。促胰島素分泌素-4對DPP IV(二肽基肽酶-4)具有抗性，且具有高於似升糖素肽-1之生理活性。因此其活體內半衰期為2至4小時，比似升糖素肽-1更長(US 5,424,286)。然而，僅藉由提高對DPP IV之抗性之方法並不足以保持生理活性，且例如以市售促胰島素分泌素-4(艾塞那肽(exenatide))之商品為例，必需為患者一天注射2次，且接受艾塞那肽(exenatide)治療之患者仍會出現如：噁心及嘔吐之副作用。
為了解決上述問題，本案發明者建議一種長效肽接合物，其係由生理活性多肽與免疫球蛋白Fc區利用非肽基聚合物作為連接體，而藉由共價鍵連接所製成，藉此同時維持蛋白質藥物之活性及改善安定性(韓國專利案案號10-0725315)。特定言之，已發現長效胰島素接合物與長效促胰島素分泌素-4接合物分別具有顯著提高之活體內效力(韓國專利申請案案號10-2008-0001479及10-2010-0054068)。
然而，當注射可維持穩定血糖濃度之胰島素或胰島素分泌素-4用量時，仍然存在體重增加、或噁心及嘔吐之問題。因此，極需要研發一種在藥物之較低劑量且減少使用頻率下可對糖尿病展現優異醫療效力之醫療方法。
本案發明者積極努力發展對糖尿病具有長期醫療效力且同時降低諸如噁心及嘔吐等副作用之醫療劑。他們試圖共同投予長效促胰島素分泌素-4接合物與長效胰島素接合物，其同時刺激似升糖素肽-1受體及胰島素受體。因此他們發現共同投予長效胰島素接合物與長效促胰島素分泌素-4接合物可改善活體內之持續效力及安定性，並顯著降低藥物劑量，達到穩定之血糖濃度。此外，他們發現其可改善由似升糖素肽-1促效劑及促胰島素分泌素-4或其衍生物誘發之諸如嘔吐及噁心之副作用，且使用長效促胰島素分泌素-4接合物時可減少因使用胰島素所造成之體重增 加，因而完成本發明。
本發明一項目的係提供用於預防或治療糖尿病之醫藥組成物，其包含長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物。
本發明另一項目的係提供預防或治療糖尿病之方法，其包括對罹患糖尿病或有罹患糖尿病風險之個體投予該組成物之步驟。
本發明另一項目的係提供預防或治療糖尿病之醫藥組成物，其包含長效胰島素接合物與促胰島素肽。
本發明另一項目的係提供預防或治療糖尿病之醫藥組成物，其包含胰島素與長效促胰島素肽接合物。
本發明長效胰島素接合物與長效促胰島素分泌素-4接合物對糖尿病展現優異之醫療效力，且特別地，當其共同投予時，能同時刺激胰島素受體與似升糖素肽-1受體，以改善其於活體內之持續效力(duration of the efficacy)及安定性，並顯著降低所需之藥物劑量且穩定控制血糖在穩定之濃度，可以改善低血糖及體重增加。此外，當其作為糖尿病之醫療劑時，可抑制噁心及嘔吐，且具有改善之服藥順從性。特定言之，其可顯著改善安定性及活體內之持續效力，因此可以減少治療頻率，提供患者方便性。
[最佳模式]
一項態樣中，本發明提供預防或治療糖尿病之醫藥組成物，其包含長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物。本發明組成物之特徵在於共同投予長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物。
本文所採用術語“長效胰島素接合物”係指利用非肽基連接體連接免疫球蛋白Fc區之胰島素。
本發明長效胰島素接合物具有比天然胰島素改善之活體內持續效力，且長效胰島素接合物可包括由天然胰島素之胺基酸序列經過修飾、取代、增加或缺失所製成之胰島素，與生物可降解性聚合物(如：聚乙二醇(PEG))接合之胰島素，與長效蛋白質(如：白蛋白或免疫球蛋白)接合之胰島素，與有能力結合體內白蛋白之脂肪酸接合之胰島素，或包封在生物可降解性奈米粒子中之胰島素，但長效胰島素接合物之型態並不限於此。
本文所採用術語“胰島素”係指由胰臟因應血液中葡萄糖濃度提高所分泌之肽，以便使肝臟、肌肉或脂肪組織吸收葡萄糖，然後轉換成肝醣，並停止使用脂肪作為能量來源，因此控制血糖濃度。這種肽包括天然胰島素、基礎胰島素、胰島素促效劑、前驅物、衍生物、其片段與其變異體。
術語“天然胰島素”係指由胰臟分泌以促進吸收葡萄糖並抑制脂肪分解之激素，因此具有控制血糖濃度之功能。胰島素係由不涉及血糖濃度調節功能之前驅物(稱為胰島素原)經過修飾後形成。胰島素之胺基酸序列如下： α鏈：Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID NO.1)
β鏈：Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID NO.2)
術語“基礎胰島素”係指控制每日正常血糖波動之肽，例如：瑞和密爾(Levemir)、甘精(Glargine)、德穀胰島素(Deglude)，等等。
術語“胰島素促效劑”意指會與胰島素受體結合並顯現與胰島素同等生物活性之化合物，其與胰島素結構無關。
術語“胰島素變異體”為具有一或多種不同於天然胰島素之胺基酸序列之肽，並指保留其在體內控制血糖濃度功能之肽，且其可由天然胰島素之一部份胺基酸序列經過取代、增加、缺失與修飾或其組合中任一種方式製成。
術語“胰島素衍生物”意指與天然胰島素具有至少80%胺基酸序列同源性之肽，其胺基酸殘基上某些基團可能經過化學性取代(例如：α-甲基化、α-羥基化)、缺失(例如：去胺基化)或修飾(例如：N-甲基化)，且於體內具有調節血糖濃度之功能。
術語“胰島素片段”意指在天然胰島素之N-末端或C-末端增加或缺失一個或多個胺基酸之片段，其中可增加 非天然胺基酸(例如：D-型胺基酸)，且在體內具有調節血糖濃度之功能。
胰島素之促效劑、衍生物、片段及變異體之個別製法可以分開採用或組合使用。例如：本發明包括具有一個或多個不同於天然肽之胺基酸的肽，且在N-末端胺基酸殘基去胺基化，並具有調節體內血糖濃度之功能。
在明確之具體實施例中，本發明所採用胰島素可利用重組技術製造，且亦可利用固相合成法合成。
此外，本發明所採用胰島素之特徵在於該非肽基聚合物係連接胰島素β鏈之胺基末端。此非肽基聚合物可用來作為本發明之連接體。該非肽基聚合物係作為連接體連接，藉以維持胰島素之活性及改善安定性。
本文所採用術語“非肽基聚合物”係指包括兩個或更多個利用肽鍵以外之共價鍵相互連接之重覆單位所形成之生物可相容性聚合物。本發明中，該非肽基聚合物可與非肽基連接體交換使用。
適用於本發明之非肽基聚合物選自下列各者所組成之群組：生物可降解性聚合物、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸與其組合，更佳者，該生物可降解性聚合物可為聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯基醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、聚乳酸(PLA)或聚乳酸-乙醇酸(PLGA)，且更佳為聚乙二醇(PEG)。此外，本領域已知之其衍生物與容易利用本領域已知方法製備之衍生物亦於本發明範疇內。
採用習知同義融合(inframe fusion)法製得之融合蛋白質所利用之肽連接體之缺點在於其容易在活體內被蛋白質水解酵素降解，因此無法利用載劑達到充份延長活性藥物之血清半衰期之預期效力。然而，本發明中，可使用對蛋白質水解酵素具有抗性之聚合物以如同載劑般維持肽之血清半衰期。因此，任何非肽基聚合物沒有限制均可使用，只要其係具有上述功能之聚合物即可，亦即該聚合物對活體內蛋白質水解酵素具有抗性。該非肽基聚合物之分子量在1至100 kDa之範圍內，較佳為1至20 kDa。本發明連接至免疫球蛋白Fc區之非肽基聚合物可為一種聚合物或為多種不同聚合物之組合。
本發明所使用非肽基聚合物具有可與免疫球蛋白Fc區及蛋白質藥物結合之反應性基團。該非肽基聚合物之兩端具有反應性基團，其較佳係選自下列各者所組成之群組：反應性醛、丙醛、丁醛、馬來醯亞胺與琥珀醯亞胺衍生物。琥珀醯亞胺衍生物可為琥珀醯亞胺基丙酸酯(succinimidyl propionate)、羥基琥珀醯亞胺基(hydroxy succinimidyl)、琥珀醯亞胺基羧甲基(succinimidyl carboxymethyl)或琥珀醯亞胺基碳酸酯(succinimidyl carbonate)。特定言之，當非肽基聚合物之兩端具有反應性醛基時，其兩端可在最低之非專一性反應下有效連接生理活性多肽與免疫球蛋白。由醛鍵之還原性烷化反應產生之終產物遠比醯胺鍵連接產生之終產物更穩定。該醛反應性基團可在低pH選擇性結合至N-末端，及在高pH(如：pH 9.0)結合至離胺酸殘基，形成共價鍵。非肽基聚合物兩端之反應性基團可相同或相異。例如：該非肽基聚合物可在一端具有馬來醯亞胺基，而在另一端具有乙醛基、丙醛基或丁醛基。當使用兩端均具有反應性羥基之聚乙二醇作為非肽基聚合物時，該羥基可經過已知化學反應活化成各種不同反應性基團，或可採用具有可自市售商品取得之經修飾反應性基團之聚乙二醇來製備本發明長效胰島素接合物。較佳為該非肽基聚合物可連接在胰島素β鏈之N-末端。
本發明胰島素可經過非肽基聚合物修飾。
事實上，為了預防低血糖及改善持續效力之PEG(聚乙二醇)修飾法會顯著降低生理活性肽之效價。然而，此缺點卻變成研發使用免疫球蛋白片段之長效胰島素接合物之優點。因此，PEG-修飾之胰島素可利用非肽基聚合物連接至免疫球蛋白Fc區。用於胰島素修飾之非肽基聚合物可選自下列各者所組成之群組：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯基醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、生物可降解性聚合物、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸與其組合，較佳為聚乙二醇。PEG-修飾之胰島素之PEG修飾法之特徵在於PEG選擇性結合至胰島素α鏈之N-末端或β鏈之特定離胺酸殘基。該PEG修飾之胰島素較佳係在其末端包括反應性醛及琥珀醯基，及以反應性琥珀醯基更佳。
本發明長效胰島素接合物之製法及效力已詳細說明於 韓國專利申請案案號2010-0054068、2010-0054067及2011-0030868。在本發明一項實例中，在免疫球蛋白Fc區之N-末端進行單-PEG基化(mono-PEGylation)，並在胰島素β鏈1-位置之苯丙胺酸進行修飾，製備長效胰島素接合物(實施例1)。
本文所採用術語”長效促胰島素肽接合物”係指促胰島素肽利用非肽基連接體連接免疫球蛋白Fc區。
本發明中，“促胰島素肽”係指保留釋放胰島素功能及刺激胰臟β細胞合成或表現胰島素之肽。該促胰島素肽較佳為GLP(似升糖素肽)-1、促胰島素分泌素-3或促胰島素分泌素-4，但不限於此。促胰島素肽包括天然促胰島素肽、其前驅物、其促效劑、其衍生物、其片段及其變異體。
本發明促胰島素肽衍生物可包括去胺基-組胺醯基(desamino-histidyl)衍生物(其中已缺失該促胰島素肽之N-末端胺基)、β-羥基咪唑基丙醯基-衍生物(其中胺基已被羥基取代)、二甲基-組胺醯基衍生物(其中胺基經過兩個甲基修飾)、β-羧基咪唑基丙醯基-衍生物(其中N-末端胺基被羧基取代)、或咪唑基乙醯基-衍生物(其中已缺失N-末端組胺酸殘基之α碳，僅殘留咪唑基乙醯基，因此移除了胺基之正電價)，而其他N-末端胺基經修飾之衍生物亦包括於本發明範疇內。
本發明中，該促胰島素肽衍生物更佳為具有經化學修飾之N-末端胺基(或胺)基團或胺基酸殘基之促胰島素分泌素-4衍生物，甚至更佳為由促胰島素分泌素-4之N-末端 His1殘基之α碳移除或取代α胺基，或移除或取代α碳所製成之促胰島素分泌素-4衍生物。亦更佳為已移除N-末端胺基之去胺基-組胺醯基-促胰島素分泌素-4(DA-促胰島素分泌素-4)、由羥基取代胺基所製得之β-羥基咪唑基丙基-促胰島素分泌素-4(HY-促胰島素分泌素-4)、由羧基取代胺基所製得之β-羧基咪唑基丙基-促胰島素分泌素-4(CX-促胰島素分泌素-4)、由兩個甲基殘基修飾胺基所製得之二甲基-組胺醯基-促胰島素分泌素-4(DM-促胰島素分泌素-4)、或移除N-末端組胺酸殘基之α碳所製得之咪唑基乙醯基-促胰島素分泌素-4(CA-促胰島素分泌素-4)。
GLP-1係小腸分泌之激素，通常會促進胰島素之生合成與分泌、抑制升糖素分泌及促進細胞吸收葡萄糖。在小腸中，升糖素前驅物會分解成三種肽，亦即升糖素、GLP-1及GLP-2。文中，GLP-1係指GLP-1(1-37)，其原本呈沒有促胰島素功能之型式，後來才經過修飾及轉化成一種活化之GLP-1(7-37)型。GLP-1(7-37)之胺基酸序列如下：GLP-1(7-37)
HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G(SEQ ID NO.3)
術語“GLP-1衍生物”係指與GLP-1之胺基酸序列具有至少80%同源性之肽，其可能呈化學修飾型，且具有至少等同或超過GLP-1之促胰島素功能。
術語“GLP-1片段”係指在天然GLP-1之N-末端或C-末端增加或缺失一個或多個胺基酸之型式，其中該增加之 胺基酸可能為非天然胺基酸(例如：D-型胺基酸)。
術語“GLP-1變異體”係指具有促胰島素功能之肽，其具有一或多種不同於天然GLP-1之胺基酸序列。
促胰島素分泌素-3及促胰島素分泌素-4為由39個胺基酸組成之促胰島素肽，其具有與GLP-1具有53%同源性之胺基酸序列。促胰島素分泌素-3與促胰島素分泌素-4之胺基酸序列如下：促胰島素分泌素-3
HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS(SEQ ID NO.4)
促胰島素分泌素-4
HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS(SEQ ID NO.5)
術語“促胰島素分泌素促效劑”係指能於活體內與受體反應且具有等同促胰島素分泌素之生物活性之化合物。
術語“促胰島素分泌素衍生物”係指與天然促胰島素分泌素之胺基酸序列具有至少80%同源性之肽，其胺基酸殘基上有些基團可能經化學取代(例如：α-甲基化、α-羥基化)、缺失(例如：去胺基化)或修飾(例如：N-甲基化)，且具有促胰島素分泌功能。
術語“促胰島素分泌素片段”係指在天然促胰島素分泌素N-末端或C-末端增加或缺失一個或多個胺基酸之片段，其中可增加非天然胺基酸(例如：D-型胺基酸)，且具有促胰島素功能。
術語“促胰島素分泌素變異體”係指具有至少一個不同於天然促胰島素分泌素之胺基酸序列且具有促胰島素功能之肽，且促胰島素分泌素變異體包括由絲胺酸或精胺酸取代促胰島素分泌素-4上12-位置之離胺酸所製成之肽。
促胰島素分泌素促效劑、衍生物、片段及變異體之個別製法可分開採用或組合使用。例如：本發明包括其胺基酸序列具有至少一個不同於天然促胰島素肽之胺基酸且其N-末端胺基酸殘基已去胺基化之促胰島素肽。
在明確之具體實施例中，本發明所採用之天然促胰島素肽與經修飾之促胰島素肽可採用固相合成法合成，且大多數天然肽包括可採用重組技術製造之天然促胰島素肽。
本發明所採用長效促胰島素肽接合物意指促胰島素肽利用非肽基連接體而連接免疫球蛋白片段，如：免疫球蛋白Fc。該非肽基連接體係與上述說明相同。該長效促胰島素肽接合物為使用如長效胰島素接合物所使用之免疫球蛋白片段之接合物，並維持促胰島素肽之習知活體內活性，如：促進胰島素合成與分泌、控制食慾、減輕體重、提高β細胞對血中葡萄糖之敏感性、促進β細胞增生、延緩胃排空、及抑制升糖素，且進一步顯著提高促胰島素肽之血中半衰期，以及後續之該肽之活體內效力的維持效果。因此其適用於治療糖尿病及肥胖症。
長效促胰島素肽接合物之型態與製法已詳細說明於韓國專利申請案案號2008-001479、2008-0069234及2010-0047019。
本發明一項實例中，咪唑基-乙醯基促胰島素分泌素-4(CA促胰島素分泌素-4)之離胺酸(Lys)已經過PEG修飾，且該經PEG-修飾之促胰島素分泌素-4連接至免疫球蛋白Fc，而製成長效促胰島素分泌素-4接合物(實施例2)。
本發明所採用胰島素與促胰島素肽係使用非肽基聚合物作為連接體而連接載劑物質。適用於本發明之載劑物質可選自下列各者所組成之群組：免疫球蛋白Fc區、白蛋白、轉鐵蛋白及PEG，且以免疫球蛋白Fc區較佳。
本發明長效胰島素接合物與促胰島素肽接合物係分別由胰島素或促胰島素肽利用非肽基連接體連接免疫球蛋白Fc區而製成，藉以展現持續性及安定性。本發明中，免疫球蛋白Fc可與免疫球蛋白片段交換使用。
此外，由於Fc片段之分子量小於完整免疫球蛋白分子，因此對具Fc片段之錯合物之製法、純化及產量是有利的。此外，由於因抗體之間胺基酸序列差異而展現高度非同源性之Fab區已移除，因此Fc片段大幅提高物質同源性性，且降低誘發血清抗原性之可能性。
本文所採用術語“免疫球蛋白Fc區”係指包含免疫球蛋白重鏈恆定區(constant region)2(CH2)及重鏈恆定區3(CH3)(但不包括免疫球蛋白之重鏈及輕鏈之可變區)、重鏈恆定區1(CH1)及輕鏈恆定區1(CL1)之蛋白質。其可進一步包括重鏈恆定區之樞紐區(hinge region)。此外，本發明免疫球蛋白Fc區可包含一部份或所有Fc區，其包括重鏈恆定區1(CH1)與/或輕鏈恆定區1(CL1)，但不包括重鏈 及輕鏈之可變區，只要其具有實質上類似或優於天然蛋白質之生理功能即可。此外，免疫球蛋白Fc區可為在CH2與/或CH3之胺基酸序列中相對長的部份具有缺失之片段。亦即本發明之免疫球蛋白Fc區可包含1)CH1功能部位(domain)、CH2功能部位、CH3功能部位與CH4功能部位，2)CH1功能部位與CH2功能部位，3)CH1功能部位與CH3功能部位，4)CH2功能部位與CH3功能部位，5)一個或多個功能部位與免疫球蛋白樞紐區(或一部份樞紐區)之組合，及6)重鏈恆定區與輕鏈恆定區之各功能部位之二聚體。
本發明免疫球蛋白Fc區包括天然胺基酸序列與其序列衍生物(突變體)。胺基酸序列衍生物為因其中一個或多個胺基酸殘基之缺失、插入、非保留性或保留性取代或其組合而不同於天然胺基酸序列之序列。例如：在IgG Fc中，已知對結合性具有重要性之位置214至238、297至299、318至322、或327至331之胺基酸殘基可用來作為修飾之合適標靶。
此外，可能有其他各種不同衍生物，包括其中已缺失可以形成雙硫鍵之區域，或已在天然Fc型之N-末端消去某些胺基酸殘基或增加甲硫胺酸殘基者。此外，為了排除效應子(effector)功能，可缺失補體結合位置，如：Clq-結合位置及ADCC(抗體依賴性細胞介導之細胞毒性)位置。製備此等免疫球蛋白Fc區之序列衍生物之技術揭示於WO 97/34631及WO 96/32478。
本領域已知蛋白質與肽中之通常不會改變蛋白質或肽 之活性的胺基酸交換(H.Neurath、R.L.Hill之蛋白質學(The Proteins,Academic Press,New York,1979))。最常發生之交換法為Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu及Asp/Gly，反之亦然。此外，若需要時，Fc區可經由磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法呢基化(farnesylation)、乙醯基化、醯胺化，等等方式修飾。
上述Fc衍生物為具有與本發明Fc區相同生物活性或具有改良結構安定性(例如：對抗熱、pH，等等)之衍生物。
此外，此等Fc區可得自從人類及其他動物(包括牛、羊、豬、小鼠、兔子、倉鼠、大鼠及天竺鼠)單離之天然型，或可為由轉型動物細胞或微生物得到之重組體或衍生物。本文中，其可得自天然免疫球蛋白，此係藉由從人類或動物生物體單離出完整免疫球蛋白並以蛋白質水解酵素處理。木瓜酵素消解天然免疫球蛋白形成Fab及Fc區，且胃蛋白酶處理結果產生pF’c及F(ab)2片段。此等片段可經由例如：分子大小篩選層析法(size exclusion chromatography)，單離出Fc或pF’c。較佳為該衍生自人類之Fc區係得自微生物之重組免疫球蛋白Fc區。
此外，本發明之免疫球蛋白Fc區可呈具有天然糖鏈之形式、比天然型增加糖鏈之形式或比天然型減少糖鏈之形式，或可呈脫糖基化之形式。可採用本領域已知之方法增 加、減少或移除免疫球蛋白Fc糖鏈，如：化學法、酵素法與使用微生物之基因工程法。移除Fc區之糖鏈會大幅降低對第一補體組份C1之C1q部份之結合親和力，並降低或喪失抗體依賴性細胞所介導之細胞毒性或補體依賴性細胞毒性，因此不會在活體內誘發不必要之免疫反應。基於此點，脫糖基化或非糖基化型之免疫球蛋白Fc區可能更適合在本發明目的中作為藥物載劑。
本文所採用術語“脫糖基化(deglycosylation)”係指經酵素性移除Fc區之糖部份(moiety)，且術語“非糖基化(aglycosylation)”係指該Fc區係由原核細胞生物(較佳為大腸桿菌(E.coli))製造之未糖基化型。
同時，該免疫球蛋白Fc區可衍生自人類或其他動物，包括牛、羊、豬、小鼠、兔子、倉鼠、大鼠及天竺鼠，以源自人類較佳。
此外，免疫球蛋白Fc區可能為衍生自IgG、IgA、IgD、IgE及IgM之Fc區，或由其組合或其雜合體(hybrid)製成。較佳係衍生自IgG或IgM，其係人類血液中含量最高之蛋白質，最佳係衍生自IgG，已知其可加強配體結合性蛋白質之半衰期。
另一方面，本文所採用術語"組合"係指由編碼相同來源之單鏈免疫球蛋白Fc區之多肽係連接不同來源之單鏈多肽，形成二聚體或集合體。亦即該二聚體或集合體可由兩個或更多個選自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc及IgE Fc片段所組成之群組之片段形成。
本文所採用術語“雜合體”係指單鏈免疫球蛋白Fc區中包含編碼不同來源之兩個或更多個免疫球蛋白Fc區之序列。本發明中，可能有各種不同型態之雜合體。亦即雜合體功能部位可由1至4個選自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc及IgD Fc之CH1、CH2、CH3及CH4所組成之群組之功能部位組成，且可包括樞紐區。
另一方面，IgG分成IgG1、IgG2、IgG3及IgG4子群，本發明包括其組合及雜合體。較佳為IgG2及IgG4子群，最佳為幾乎沒有效應子功能，如：CDC(補體依賴性細胞毒性)之IgG4之Fc區。
亦即，作為本發明藥物載劑之最佳免疫球蛋白Fc區為衍生自人類IgG4之非糖基化Fc區。衍生自人類之Fc區比非衍生自人類之Fc區更佳，後者可能在人體中成為抗原且引起不必要之免疫反應，如：針對抗原產生新抗體。
本發明之組成物之特徵在於共同投予長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物。
當共同投予本發明之長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物時，長效胰島素接合物作用在胰島素受體上，且同時長效促胰島素肽接合物則作用在似升糖素肽-1受體上，因此比其單獨投予時，較能降低血糖濃度並維持穩定之血糖濃度。共同投予接合物之效果在於降低單獨投予胰島素時所誘發之低血糖及體重增加風險，且基於促胰島素肽之作用，亦可降低胰島素總劑量。該共同投予法亦有利於降低促胰島素肽(如：促胰島素分泌素-4)之劑量，以防 止單獨投予促胰島素分泌素-4時所引起之副作用，如：噁心及嘔吐。使用長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物時，會顯著延長血中半衰期及活體內之持續效力，因此可降低治療頻率，以改善每天接受注射之慢性患者之生活品質。因此，極適用於治療糖尿病。此外，本發明之醫藥組成物展現優異之活體內持續效力及效價(titer)，且共同投予時可大幅降低劑量。
長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物可同時、依序或依相反順序投予，且可依有效劑量之適當組合共同投予。較佳者，該長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物可分開存放在個別容器，然後同時、依序或依相反順序投予。
此外，供本發明共同投予之組成物可呈糖尿病之醫療套組型式，其於單一容器或分開在個別容器中包括有長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物。該套組可包括醫藥上可接受之載劑及說明書。
本發明一項明確實例中，在對以STZ(鏈佐黴素(Streptozotocin))誘發糖尿病之小鼠共同投予長效胰島素接合物與長效促胰島素分泌素-4接合物後，檢測血糖濃度之變化。結果相較於單獨投予，共同投予接合物後展現穩定型態之血糖濃度(第1圖)。在每周投予一次之第2型糖尿病小鼠模式中，比較共同投予長效胰島素接合物與長效促胰島素分泌素-4接合物之前及之後之空腹血糖濃度。結果相較於單獨投予時，共同投予法在血糖濃度上展現優 異之改善(第2圖)。此外，未觀察到胰島素治療所造成之體重增加，此表示共同投予法可降低胰島素所致之體重增加副作用(第3圖)。
本文所採用術語“糖尿病”意指由胰島素分泌或功能異常所引起之代謝疾病。以本發明組成物共同投予個體，以控制血糖濃度，藉以治療糖尿病。
本文所採用術語“預防”意指所有藉由共同投予本發明組成物來限制糖尿病症狀或阻止糖尿病發生之作用，術語“治療”意指所有藉由共同投予本發明組成物來改善或以有利方式改變已發生之糖尿病症狀之作用。糖尿病之治療可應用於可能罹患糖尿病之任何哺乳動物，其實例包括人類與靈長類，及牲畜，如：牛、豬、羊、馬、狗與貓，但未限於此，以人類較佳。
本文所採用術語“投予”意指採用某些合適方法將預定量之物質引進患者體內。該組成物可利用任何常用途徑投予，只要其可以到達所需組織即可。有各種不同投予模式可以採用，包括經腹膜、靜脈、肌肉、皮下、經皮、經口、局部、鼻內、經肺與經直腸，但本發明並不限於此等例舉之投予模式。然而，由於肽在經口投予時會被消化，因此供經口投予之組成物中活性成份應經包覆或或經過調配，以保護防止在胃中降解。較佳者，該集合體可呈注射型投予。此外，該醫藥組成物可使用可以運送活性成份至標靶細胞之某些方式投予。
此外，本發明醫藥組成物可由數種相關因素決定，包 括所治療疾病型態、投予途徑、患者之年齡、性別、體重及病情嚴重性，及作為活性成份使用之藥物種類。
此外，本發明醫藥組成物可包括醫藥上可接受之載劑。本文所採用術語“醫藥上可接受之載劑”係指該載劑或稀釋劑不會對生物體造成顯著刺激且不會破壞所投予化合物之生物活性及性質。經口投予時，醫藥上可接受之載劑可包括結合劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、溶解劑、分散劑、安定劑、懸浮劑、著色劑與香料。用於注射劑時，醫藥上可接受之載劑可包括緩衝劑、防腐劑、止痛劑、溶解劑、等滲劑與安定劑。供局部投予劑時，醫藥上可接受之載劑可包括基質、賦形劑、潤滑劑與防腐劑。本發明醫藥組成物可組合上述醫藥上可接受之載劑，而調配成各種不同劑型。例如：經口投予時，該醫藥組成物可調配成錠劑、口含錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿或薄片(wafer)。用於注射劑時，該醫藥組成物可調配成單位劑型，如：多劑量容器或呈單一劑量劑型之安瓶。該醫藥組成物亦可調配成溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊與長效製備劑。
另一方面，適用於醫藥製劑之載劑、賦形劑與稀釋劑實例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯膠、褐藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯基吡咯啶酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂與礦物油。此外，該等醫藥製劑可進一步包括填料、抗結塊劑、潤滑劑、保濕劑、香料與 抗菌劑。
另一態樣中，本發明提供預防或治療糖尿病之方法，其包括對罹患糖尿病或有罹患糖尿病風險之個體投予包含長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物之組成物。
進行投予步驟時，可共同投予長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物，但不限於同時、依序或依相反順序投予，且長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物可依有效劑量之適當組合共同投予。
甚至即使一周投予一次，本發明之包含長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物之組成物仍展現改善血糖濃度之優異效果且不會造成體重增加之副作用，因此可用於預防或治療糖尿病。
另一態樣中，本發明提供預防或治療糖尿病之醫藥組成物，其包含長效胰島素接合物與促胰島素肽。
長效胰島素接合物與促胰島素肽係如上述之相同說明。長效胰島素接合物可與促胰島素肽(如：GLP-1促效劑(例如：艾塞那肽(exenatide)、利樂格肽(Liraglutide)或利希肽(Lixisenatide))共同投予。
另一態樣中，本發明提供預防或治療糖尿病之醫藥組成物，其包含胰島素與長效促胰島素肽接合物。
該胰島素及長效促胰島素肽接合物係如上述之相同說明。長效促胰島素肽接合物可與胰島素(如：天然胰島素)、胰島素衍生物或基礎胰島素共同投予。
[發明模式]
下文中，本發明將參考下列實例更詳細說明。然而，此等實例僅供說明，本發明並無意限於此等實施例。
實施例1：長效胰島素接合物製備
為了以5K PropionALD(3)PEG(具有三個丙醛基之PEG，NOF，日本)在免疫球蛋白Fc區之N-末端進行PEG基化，由免疫球蛋白Fc區與PEG依莫耳比1：2，免疫球蛋白Fc濃度為10毫克/毫升(mg/mL)，在4℃反應4.5小時。此時，在100毫莫耳(mM)磷酸鉀(pH 6.0)中進行反應，添加還原劑20 mM SCB(NaCNBH3)。使用SOURCE 15Q(GE Healthcare)純化管柱，自反應混合物中純化單-PEG基化免疫球蛋白Fc。
為了製備在其胰島素β鏈之1-位置苯丙胺酸(B1F)上具有90%或以上的修飾之胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc接合物，準備單-PEG基化免疫球蛋白Fc與胰島素，莫耳比4：1，總蛋白質濃度為20 mg/mL，並在4℃反應20小時。使用100 mM磷酸鉀(pH 6.0)作為反應溶液，並添加20 mM SCB作為還原劑。反應結束後，使用Source 15Q純化管柱為反應混合物進行初次純化。然後再使用Source 15ISO純化管柱進行第二次純化，得到胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc接合物。
實施例2：長效促胰島素分泌素-4接合物製備
使用咪唑基-乙醯基促胰島素分泌素-4(CA促胰島素分泌素-4,AP,USA)，令3.4k PropionALD(2)PEG與CA促胰島素分泌素-4之離胺酸(Lys)反應。在兩個Lys異構物 波峰中，將出現較多反應且比較容易與N-末端異構物波峰區分之最後一個異構物波峰(Lys27之位置異構物)用於偶合反應。
該反應係在肽：免疫球蛋白Fc之莫耳比為1：8且蛋白質總濃度為60 mg/mL下，於4℃進行20小時。該反應係在100 mM K-P溶液(pH 6.0)中進行，且添加20 mM SCB作為還原劑。偶合反應溶液係通過兩支純化管柱進行純化。首先使用SOURCE Q(XK 16 mL,Amersham Biosciences)移除未參與偶合反應之大量免疫球蛋白Fc。使用20 mM Tris(pH 7.5)及1 M NaCl之鹽梯度，先溶離出結合力相對較弱之免疫球蛋白Fc，然後溶離出促胰島素分泌素-4-免疫球蛋白Fc。透過此第一次純化程序，移除免疫球蛋白Fc至某種程度，但由於免疫球蛋白Fc及促胰島素分泌素-4-免疫球蛋白Fc在離子交換管柱中具有彼此類似之結合力，因此無法彼此完全分離。因此分別利用這兩種物質之疏水性進行第二次純化。使用20 mM Tris(pH7.5)及1.5 M硫酸銨，於SOURCE ISO(HR 16 mL,Amersham Biosciences)中，偶合第一次純化之樣本，並利用逐漸下降之硫酸銨濃度溶離該樣本。在HIC管柱中，結合力較弱之免疫球蛋白Fc先溶離出，然後再溶離出結合力較強之促胰島素分泌素-4-免疫球蛋白Fc樣本。由於其具有顯著不同之疏水性，因此比在該離子交換管柱中更容易彼此分開。
管柱：SOURCE Q(XK 16 mL,Amersham Biosciences)
流速：2.0毫升/分鐘(mL/min)
梯度：A0->25% 70 min B(A：20mM Tris,pH7.5,B：A+1 M NaCl)
管柱：SOURCE ISO(HR 16 mL,Amersham Biosciences)
流速：7.0 mL/min
梯度：B 100→0% 60 min B(A：20 mM Tris,pH7.5,B：A+1.5M硫酸銨)
實施例3：共同投予長效胰島素接合物與長效促胰島素分泌素-4接合物對STZ(鏈佐黴素(Streptozotocin))所誘發糖尿病之效力試驗
為了測試投予包含實施例1與2所製備長效胰島素接合物與長效促胰島素分泌素-4接合物之組成物之活體內效力，或共同投予長效胰島素接合物與長效促胰島素分泌素-4接合物之活體內效力，利用STZ(鏈佐黴素(Streptozotocin))誘發糖尿病之小鼠檢測小鼠血糖濃度變化。
對已禁食16小時之7周齡C57BL/6小鼠經腹膜注射含STZ(50 mg/kg，1 mg/mL)之10 mM檸檬酸鹽緩衝液(pH 4.5)，連續5天，以誘發糖尿病。2天後，使用26 G針筒自尾靜脈抽取1至2滴血，採用血糖計(OneTouch Ultra,LifeScan,Inc.,USA)測定血糖。由所測得之血糖來決定是否誘發糖尿病(350-600 mg/dL)。將已誘發糖尿病之小鼠分成5組，每組5隻：G1、G2、G3、G4及G5。
該等組係分成無處理之對照組(載劑組)、長效促胰島素分泌素-4接合物處理組(5 mcg/kg)、長效胰島素接合物 處理組(100 mcg/kg)、長效促胰島素分泌素-4接合物(5 mcg/kg)與長效胰島素接合物(50 mcg/kg)處理組、及長效促胰島素分泌素-4接合物(5 mcg/kg)與長效胰島素接合物(100 mcg/kg)處理組。處理上述試驗材料後，每天測定每組之血糖濃度變化。
結果，以長效胰島素接合物與長效促胰島素分泌素-4接合物共同處理時，展現穩定之血糖濃度與持續之降血糖效果第1圖)，並比單獨投予長效促胰島素分泌素-4接合物或長效胰島素接合物時，展現顯著較低血糖濃度。
此等結果顯示，共同投予本發明之長效胰島素接合物與長效促胰島素分泌素-4接合物展現穩定且持續之降血糖效果，因此可顯著降低投予劑量，因而降低促胰島素分泌素-4之副作用(如嘔吐及噁心)及預防胰島素治療所引起之體重增加。
實施例4：共同投予長效胰島素接合物與長效促胰島素分泌素-4接合物時之空腹血糖變化(△FBG)及體重變化(△BW)
為了測試投予包含實施例1與2所製備長效胰島素接合物與長效促胰島素分泌素-4接合物之組成物之活體內效力，或共同投予長效胰島素接合物與長效促胰島素分泌素-4接合物之活體內效力，採用第2型糖尿病db/db小鼠檢測血糖濃度之改善及對體重增加之抑制。
將第2型糖尿病db/db小鼠分成長效胰島素接合物與長效促胰島素分泌素-4接合物之單獨投予組及共同投予 組。單獨投予組分別接受430 nmol/kg長效胰島素接合物與2.3 nmol/kg長效促胰島素分泌素-4接合物處理，每周皮下注射一次。共同投予組則接受108 nmol/kg及216 nmol/kg長效胰島素接合物與2.3 nmol/kg長效促胰島素分泌素-4接合物處理，每周皮下注射一次。試驗進行28天，動物在開始接受藥物處理之前及在試驗最後一天禁食8小時，然後測定接受藥物處理之前及在試驗最後一天之空腹血糖變化(△FBG)及體重變化(△BW)，並計算作為最後試驗項目。
△FBG及△BW之測定結果顯示，一周一次共同投予長效胰島素接合物與長效促胰島素分泌素-4接合物時，在四分之一胰島素劑量(108 nmol/kg)下，比單獨投予長效胰島素接合物展現改善之血糖濃度(第2圖)及抑制體重增加(第3圖)之優異效果。此等結果顯示共同投予長效胰島素接合物與長效CA促胰島素分泌素-4接合物可藉由減少胰島素劑量而有利於降低低血糖風險並抑制體重增加，其顯示即使一周共同投予一次，仍比每天注射胰島素及GLP-1促效劑展現優異之降血糖效果，亦比單獨投予時展現更優異之控制血糖效果，並降低胰島素之需要量，藉以降低因胰島素引起之低血糖及體重增加之風險。
此等結果證實，即使一周投予一次，該包含本發明之長效胰島素接合物與長效促胰島素分泌素-4接合物之組成物仍可展現優異之控制血糖效果，且不會導致因胰島素治療而誘發之體重增加，同時顯著降低由單獨投予已知胰島 素肽與促胰島素分泌素-4所引起之副作用。
第1圖係顯示對STZ(鏈佐黴素(Streptozotocin))所誘發糖尿病小鼠共同投予長效胰島素接合物與長效促胰島素分泌素-4接合物後持續7天期之血糖濃度變化之圖示；第2圖係顯示對db/db小鼠共同投予長效胰島素接合物與長效促胰島素分泌素-4接合物後之空腹血糖變化(△FBG)之圖示(鄧氏MC測驗法(Dunnet’s MC test)，* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001)；及第3圖係顯示對db/db小鼠共同投予長效胰島素接合物與長效促胰島素分泌素-4接合物後之體重變化(△BW)(鄧氏MC測驗法，* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001)。
<110> 韓美科學股份有限公司
<120> 包含長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物之用以治療糖尿病之組成物
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<160> 5
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰島素之α鏈
<400> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<223> GLP-1(7-37)
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<220>
<223> 促胰島素分泌素-3
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 促胰島素分泌素-4
<400> 5
該代表圖無元件符號及其所代表之意義。

Claims (20)

  1. 一種預防或治療糖尿病之醫藥組成物，其包含長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物，其中該長效胰島素接合物與長效促胰島素肽接合物係分別由胰島素或促胰島素肽利用選自下列各者所組成之群組之非肽基連接體而連接免疫球蛋白Fc區而製成：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯基醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、生物可降解性聚合物、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸及其組合。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中該胰島素為天然胰島素、基礎胰島素、由天然胰島素之胺基酸序列經過取代、增加、缺失、修飾或其組合中任一者所製成之胰島素變異體、胰島素衍生物或其片段。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中該胰島素係經過非肽基聚合物修飾。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之組成物，其中該非肽基聚合物係選自下列各者所組成之群組：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯基醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、生物可降解性聚合物、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸及其組合。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中該促胰島素肽係選自下列各者所組成之群組：GLP-1、促胰島素分泌素-3、促胰島素分泌素-4、其促效劑、其衍生物、其片段、其變異體及其組合。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中該促胰島素肽係由選自下列各者所組成之群組之物質取代促胰島素肽之N-末端組胺酸殘基所製成：去胺基-組胺醯基、二甲基-組胺醯基、β-羥基咪唑基丙醯基、4-咪唑基乙醯基及β-羧基咪唑基丙醯基。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中該促胰島素肽係選自下列各者所組成之群組：天然促胰島素分泌素-4、缺失N-末端胺基所製成之促胰島素分泌素-4衍生物、以羥基取代N-末端胺基所製成之促胰島素分泌素-4衍生物、以二甲基修飾N-末端胺基所製成之促胰島素分泌素-4衍生物、缺失促胰島素分泌素-4之第一個胺基酸(組胺酸)上α-碳所製成之促胰島素分泌素-4衍生物、以絲胺酸取代促胰島素分泌素-4上第12個胺基酸(離胺酸)所製成之促胰島素分泌素-4變異體、及以精胺酸取代促胰島素分泌素-4上第12個胺基酸(離胺酸)所製成之促胰島素分泌素-4變異體。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中該免疫球蛋白Fc區為非糖基化。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中該免疫球蛋白Fc區係由一至四個選自下列各者所組成之群組之功能部位組成：CH1、CH2、CH3及CH4功能部位。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中該免疫球蛋白Fc區進一步包括樞紐區。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中該免疫球蛋 白Fc區係衍生自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM之Fc區。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中該免疫球蛋白Fc區之各功能部位為選自IgG、IgA、IgD、IgE及IgM所組成之群組之不同來源之雜合功能部位。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中該免疫球蛋白Fc區係由相同來源之單鏈免疫球蛋白組成之二聚體或集合體。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其進一步包含醫藥上可接受之載劑。
  15. 如申請專利範圍第1至14項中任一項所述之組成物，其中該長效胰島素接合物與該長效促胰島素肽接合物係同時、依序或依相反順序投予。
  16. 一種預防或治療糖尿病之方法，其包括對罹患糖尿病或有罹患糖尿病風險之個體投予如申請專利範圍第1至14項中任一項所述之組成物之步驟。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該投予步驟係藉由共同投予該長效胰島素接合物與該長效促胰島素肽接合物而實施。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該共同投予係藉由同時、依序或依相反順序投予該長效胰島素接合物與該長效促胰島素肽接合物而實施。
  19. 一種預防或治療糖尿病之醫藥組成物，其包含長效胰島素接合物與促胰島素肽。
  20. 一種預防或治療糖尿病之醫藥組成物，其包含胰島素與 長效促胰島素肽接合物。
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