WO2019066603A1 - 효력이 향상된 지속성 단백질 결합체 - Google Patents

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fatty acid
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김은정
김대진
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Definitions

  • the present invention relates to a protein conjugate in which a physiologically active polypeptide modified with a fatty acid molecule and an immunoglobulin Fc region are linked through a non-peptide polymer linker, a pharmaceutical composition comprising the same, and a method for producing the protein conjugate.
  • the protein conjugate extends the blood half-life of the physiologically active polypeptide through the linkage of the binding site of the immunoglobulin Fc and the binding of the fatty acid molecule to the substance, and provides a protein conjugate having an excellent in vivo activity and no risk of inducing an immune response to provide.
  • Polypeptides are generally poorly stable, easily denatured, degraded by protein hydrolytic enzymes in the blood, and easily removed through the kidneys and liver. Therefore, in order to maintain the blood concentration and titer of the protein drug containing the polypeptide as the pharmacological component, it is necessary to frequently administer the protein drug to the patient. However, in the case of protein medicines, which are mostly administered to patients in the form of injections, frequent injections to maintain the plasma concentration of the active polypeptide cause tremendous pain to the patient. In order to solve such problems, efforts have been made to increase the stability of protein drugs in blood and to maintain the drug concentration in blood for a long time to maximize the drug efficacy. Such a sustained-release preparation of a protein drug should not only increase the stability of the protein drug but also maintain the titer of the drug itself sufficiently high and cause no immune response to the patient.
  • PEG & Has a high-solubility polymer such as polyethylene glycol
  • the stability of the protein may increase, but the activity of the physiologically active protein is markedly lowered, and as the molecular weight of the PEG increases, the reactivity with the protein decreases and the yield decreases.
  • Immunoglobulin (Ig) is classified into Fab region having antigen binding site and Fc region having complement binding region.
  • the method of preparing recombinant fusion protein using Fc region of modified immunoglobulin is as follows: 6,277,375, 6,410,008, 6,444,792, and the like.
  • the Fc fusion protein produced by such a recombinant method is capable of protein fusion only at a specific site of the immunoglobulin Fc region, that is, at an amino terminal or a carboxy terminal, and is expressed only in the form of a homodimer, , Fusion between glycosylated proteins or non-glycosylated proteins is possible, and fusion of glycosylated and non-glycosylated proteins is impossible.
  • the newly generated amino acid sequence due to fusion can not only cause an immune response, but also increase the sensitivity of the protein hydrolase to the linker site.
  • the present inventors have found that the preparation of a conjugate using a linker can be selectively performed by selecting and regulating the binding site and the orientation of the two proteins to be bound, and it is possible to prepare monomers, dimers or oligomers, .
  • a natural immunoglobulin Fc region that does not contain a target protein is mass-produced from Escherichia coli at a high yield and used in a sustained-release formulation.
  • E. coli-derived immunoglobulin Fc region produced by this recombinant method, Has been mentioned in Korean Patent Publication No. 10-2005-0047032 filed by the present applicant for a method of producing a conjugate with a target protein through mediation.
  • the present inventors have also found that the above-mentioned patent discloses a persistent protein drug preparation which can simultaneously achieve minimization of activity reduction and increase of stability, which has been conventionally considered to be difficult to attain at the same time, and which comprises a recombinant or naturally occurring immunoglobulin Fc region, It has been confirmed that the protein conjugate prepared by linking the non-peptide polymer and the physiologically active polypeptide by mutual covalent bonding greatly increases the blood half-life of the bioactive protein and maintains a higher potency than the known protein drug.
  • One object of the present invention is to provide a protein conjugate in which a physiologically active polypeptide modified with a fatty acid molecule and an immunoglobulin Fc region are linked through a non-peptide polymer linker.
  • One embodiment for implementing the present invention provides a protein conjugate in which a physiologically active polypeptide modified with a fatty acid molecule and an immunoglobulin Fc region are linked through a non-peptide polymer linker.
  • the biologically active polypeptide modified with a fatty acid molecule is characterized in that one or more fatty acid molecules are bound to the biologically active polypeptide, wherein the fatty acid molecule used in the modification is not linked to an immunoglobulin Fc region do.
  • the fatty acid molecule used for the modification is not a linker linking the physiologically active polypeptide with the immunoglobulin Fc region.
  • the fatty acid molecule modified with the physiologically active polypeptide is a fatty acid or a fatty acid derivative.
  • the non-peptide polymer linker is covalently linked to a physiologically active polypeptide modified with a fatty acid molecule through an end-capped reactor and an immunoglobulin Fc region, respectively.
  • the immunoglobulin Fc region is unglycosylated.
  • the immunoglobulin Fc region is a protein complex consisting of one to four domains selected from the group consisting of CH1, CH2, CH3 and CH4 domains.
  • the immunoglobulin Fc region is a protein complex further comprising a hinge region.
  • said immunoglobulin Fc region is selected from the group consisting of IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, combinations thereof and Fc regions of their hybrids Which is an immunoglobulin Fc fragment.
  • the immunoglobulin Fc region is a protein complex selected from the group consisting of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, a combination thereof, and an Fc region of a hybrid thereof as a specific example according to any one of the preceding specific examples .
  • the immunoglobulin Fc fragment is characterized by being a dimeric or multichain protein complex composed of a short chain immunoglobulin having domains of the same origin.
  • the immunoglobulin Fc fragment is a protein conjugate which is an IgG4 Fc fragment.
  • the immunoglobulin Fc fragment is a protein complex that is a human non-glycosylated IgG4 Fc fragment.
  • the non-peptide polymer linker is selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene Glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer, lipopolymer, fatty acid, fatty acid derivative, chitin, hyaluronic acid and combinations thereof Wherein the protein is a protein complex.
  • the non-peptide polymer linker is characterized by being a fatty acid, a fatty acid derivative or a protein conjugate which is polyethylene glycol.
  • the reactor of the non-peptide polymer constituting the conjugate is selected from the group consisting of an aldehyde group, a maleimide group and a succinimide derivative. .
  • the aldehyde group may be a propionaldehyde group or a butylaldehyde group.
  • the succinimide derivative is selected from the group consisting of succinimidyl carboxymethyl, succinimidyl valerate, succinimidyl methyl butanoate, succinimidyl methyl propionate, succinimidyl butano Is a protein conjugate that is N-hydroxysuccinimide, succinimidyl propionate, N-hydroxysuccinimide or succinimidyl carbonate.
  • the non-peptide polymer linker is a protein conjugate having an aldehyde group, a maleimide reactor or a succinimide derivative at each end.
  • the fatty acid molecule is a protein conjugate having an aldehyde group, a maleimide reactor or a succinimide derivative at each end.
  • both ends of the non-peptide polymer linker are linked to the N-terminus, the lysine residue, or the alginine residue of the immunoglobulin Fc region and the N-terminus, C- A lysine residue, a histidine residue or a cysteine residue, or a free conjugate of each terminal or residue.
  • the glass reactor is a reactor that is not bonded to any other reactor other than the non-peptide polymer linker.
  • the free reactor is a reactor that is free before bonding with the non-peptide polymer linker, But are not limited to, a reactor capable of binding a peptide polymer linker.
  • the physiologically active polypeptide is selected from the group consisting of hormones, cytokines, enzymes, antibodies, growth factors, transcription factors, blood factors, vaccines, structural proteins, ligand proteins and receptors And is a protein binding body selected.
  • the physiologically active polypeptide is selected from the group consisting of human growth hormone, growth hormone releasing hormone, growth hormone releasing peptide, interferon, interferon receptor, colony stimulating factor, glucagon-like peptide GLP-1, etc.), exendins (Exendin4, etc.), oxytomodulin, G-protein-coupled receptors, interleukins, interleukin receptors, enzymes, interleukin binding proteins, cytokine binding proteins An immunosuppressive agent, an immunotoxin, a lymphotoxin, a tumor necrosis factor, a tumor suppressor, a metastatic growth factor, an alpha-1 integrin, an anti-inflammatory agent, a macrophage activator, a macrophage peptide, a B cell factor, a T cell factor, Antitrypsin, albumin, a-lactalbumin, apolipoprotein-E, erythropoietin, hyperg
  • the physiologically active polypeptide is selected from the group consisting of human growth hormone, interferon-alpha, granulocyte colony stimulating factor, erythropoiesis factor, blood factor, insulin, oxytomodulin, glucagon-like peptides , Exendins and their respective derivatives or analogs.
  • the physiologically active polypeptide is insulin or analog thereof
  • the fatty acid molecule modified with the physiologically active polypeptide is a fatty acid or a fatty acid derivative
  • the non-peptide polymer linker is polyethylene glycol
  • a protein-coupled substance is polyethylene glycol
  • the insulin analogue is selected from the group consisting of amino acid 8 of insulin B chain, amino acid 23 of insulin B chain, amino acid 24 of insulin B chain, amino acid 25 of insulin B chain, insulin Wherein one amino acid selected from the group consisting of amino acid 1 of the A chain, amino acid 2 of the insulin A chain and amino acid 19 of the insulin A chain is substituted with alanine, or amino acid 14 of the A chain is substituted with glutamic acid or asparagine Phosphorus, and protein complexes.
  • Another aspect for implementing the present invention is to provide a method for producing a protein conjugate in which the physiologically active polypeptide modified with the fatty acid molecule and the immunoglobulin Fc region are linked through a non-peptide polymer linker.
  • a more specific embodiment for implementing the present invention is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising: (a) a physiologically active polypeptide in the form of one or more fatty acid molecules linked together; and at least one non-peptide polymer having at least two reactive groups at both ends of the immunoglobulin Fc region Linking with a covalent bond through a linker to prepare a protein conjugate; And (b) a physiologically active polypeptide and an immunoglobulin Fc region in the form of a fatty acid molecule linked by a covalent bond through the non-peptide polymer linker prepared in the step (a) And separating the protein complex bound by the peptide polymer linker to the immunoglobulin Fc fragment.
  • step (a) comprises: (a1) covalently linking to any one of physiologically active polypeptides in which an immunoglobulin Fc region or a fatty acid molecule is linked to one end of a non-peptide polymer linker Producing a connector; And (a2) separating the conjugate prepared in the step (a1), and adding physiologically active polypeptide or immunoglobulin Fc region at the other end of the physiologically active polypeptide in which the fatty acid molecules of the separated conjugate are linked And covalently linking the other with the other.
  • reaction molar ratio of the physiologically active polypeptide in which the fatty acid molecules are linked in the step (a1) and the non-peptide polymer linker is 1: 1 to 1:30, wherein the reaction molar ratio of the immunoglobulin Fc fragment to the non-peptide polymer is 1: 1 to 1:20.
  • step (a1) is performed at a pH of 4.0 to 9.0.
  • the step (a1) is characterized in that the step (a1) is performed at 4.0 to 25 ° C.
  • the reaction concentration of the physiologically active polypeptide in which the immunoglobulin Fc region or the fatty acid molecule is linked in the step (a1) is 0.1 to 100 mg / ml , And a manufacturing method.
  • reaction molar ratio of the linking substance: immunoglobulin Fc region or the physiologically active polypeptide in the step (a2) is 1: 0.1 to 1:20. .
  • step (a2) is performed at a pH of 4.0 to 9.0.
  • step (a2) is performed at a temperature ranging from 4.0 to 25 ° C.
  • the method according to any one of the preceding embodiments is characterized in that the step (a2) is performed at 4.0 to 25 ° C.
  • the reaction concentration of the physiologically active polypeptide in which the immunoglobulin Fc region or the fatty acid molecule is linked in the step (a2) is 0.1 to 100 mg / ml , And a manufacturing method.
  • step (a1) and the step (a2) are carried out in the presence of a reducing agent as a specific example according to any one of the preceding specific examples.
  • the reducing agent is selected from the group consisting of sodium cyanoborohydride (NaCNBH 3 ), sodium borohydride, dimethylamine borate, and pyridine borate salt as an embodiment according to any one of the preceding embodiments .
  • the method for separating the conjugate from the step (a2) comprises the steps of: (a2) selecting anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography or size exclusion chromatography Wherein the purification method is carried out singly or in plurality.
  • AAE diethylaminoethyl
  • PEI polyethyleneimine
  • PEI polyethylenimine
  • DMAE dimethylaminomethyl
  • TMAE trimethylaminoethyl
  • the functional group of the cation exchange chromatography resin is selected from the group consisting of methylsulfonate (S), sulfopropyl (SP), carboxymethyl (CM), polyaspartic acid, Is one selected from the group consisting of ethyl (SE), sulfopropyl (SP), phosphate (P) or sulfonate (S).
  • the functional group of the resin in the hydrophobic chromatography is selected from the group consisting of phenyl, octyl, (iso) propyl, butyl and ethyl ), which is a compound represented by the general formula (1).
  • the functional group of the resin of the affinity chromatography is selected from the group consisting of protein A, heparin, blue, benzamidine, metal ions (cobalt, Nickel, copper) and a fatty acid molecule are bound to the immunoglobulin Fc region and the physiologically active polypeptide, respectively, are bound to the immunoglobulin Fc region and the physiologically active polypeptide, Which is one of the selected ones.
  • the resin of the size exclusion chromatography is selected from the group consisting of superdex, sephacryl, superose and sephadex Which is a manufacturing method.
  • the step of separating the protein conjugate of step (b) may be performed by anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, or size exclusion chromatography Is carried out singly or in a plurality of ways.
  • AAE diethylaminoethyl
  • PEI polyethyleneimine
  • PEI polyethylenimine
  • DMAE dimethylaminomethyl
  • TMAE trimethylaminoethyl
  • the functional group of the cation exchange chromatography resin is selected from the group consisting of methylsulfonate (S), sulfopropyl (SP), carboxymethyl (CM), polyaspartic acid, Is one selected from the group consisting of ethyl (SE), sulfopropyl (SP), phosphate (P) or sulfonate (S).
  • the functional group of the resin in the hydrophobic chromatography is selected from the group consisting of phenyl, octyl, (iso) propyl, butyl and ethyl ), which is a compound represented by the general formula (1).
  • the functional group of the resin of the affinity chromatography is selected from the group consisting of protein A, heparin, blue, benzamidine, metal ions (cobalt, Nickel, copper) and a group consisting of an antibody to a part or the whole of a component of a protein conjugate bound to a physiologically active polypeptide in which both ends of the non-peptide polymer are linked to an immunoglobulin Fc region and a fatty acid molecule, respectively Which is one of the selected ones.
  • the functional group of the resin of the size exclusion chromatography is selected from the group consisting of superdex, sephacryl, superose and sephadex which is one of the production methods of the present invention.
  • the step (b) may include a step of binding a physiologically active polypeptide having a fatty acid molecule constituting the protein conjugate to an immunoglobulin Fc region through the N-terminus of the immunoglobulin Fc region And separating the bound protein binding substance.
  • Another embodiment for implementing the present invention is a method for producing a fusion protein comprising the steps of (a ') covalently linking a non-peptide polymer with any one of physiologically active polypeptides in which an immunoglobulin Fc region or a fatty acid molecule is linked to one end of the non-
  • the reaction molar ratio of the physiologically active polypeptide having the fatty acid molecule linked thereto to the non-peptide polymer is 1: 1 to 1:30, and the reaction mole of the immunoglobulin Fc region and the non-peptide polymer linker
  • the ratio is 1: 1 to 1:20, the reducing agent is contained at a concentration of 1 to 100 mM, the pH is 4.0 to 9.0, and the reaction temperature is 4.0 to 25 ° C .; the reaction concentration of the immunoglobulin Fc region or physiologically active polypeptide is 0.1 To 100 mg / ml; (b ') separating the linkage prepared in the step (a'), and covalently linking
  • compositions comprising a protein conjugate wherein the biologically active polypeptide modified with the fatty acid molecule and the immunoglobulin Fc region are linked through a non-peptide polymer linker.
  • the composition is a pharmaceutical composition for increasing the bioavailability and stability of a physiologically active polypeptide in vivo.
  • the present invention relates to a novel type of protein conjugate in which a physiologically active polypeptide modified with a fatty acid molecule, that is, a physiologically active polypeptide to which at least one fatty acid molecule is bound, and an immunoglobulin Fc region are linked by a non-peptide polymer which is a linker, to provide.
  • the protein conjugate of the present invention has a remarkable superior in vivo persistence and potency as compared with the conventional protein conjugate.
  • the protein conjugate prepared by the present invention can be usefully used for the development of a sustained-release preparation of various physiologically active polypeptide drugs.
  • FIG. 1A shows the results of SDS-PAGE analysis of (PBA-F) -fatty acid-native insulin-immunoglobulin Fc conjugate.
  • FIG. 1B shows the results of SDS-PAGE of the (PBA-F) -fatty acid-insulin analogue-immunoglobulin Fc conjugate.
  • FIG. 2A shows the results of confirming the purity of (PBA-F) -fatty acid-native insulin-immunoglobulin Fc conjugate prepared by RP-HPLC, IE-HPLC and SE-HPLC analysis.
  • the X axis represents minute (min) and the Y axis represents mAU.
  • FIG. 2B is a graph showing the purity of the prepared (PBA-F) -fatty acid-insulin analog-immunoglobulin Fc conjugate through RP-HPLC, IE-HPLC and SE-HPLC analysis.
  • the X axis represents minute (min) and the Y axis represents mAU.
  • Figure 3 is a graph comparing blood glucose lowering effects in diabetic model mice between the manufactured sustained insulin and analogue combinations.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of a protein conjugate of the present invention in which a physiologically active polypeptide modified with a fatty acid molecule (insulin) and an immunoglobulin Fc region are linked to a non-peptide polymer linker, polyethylene glycol.
  • a physiologically active polypeptide modified with a fatty acid molecule (insulin) and an immunoglobulin Fc region are linked to a non-peptide polymer linker, polyethylene glycol.
  • One aspect of the present invention provides a protein conjugate wherein a physiologically active polypeptide modified with a fatty acid molecule and an immunoglobulin Fc region are linked through a non-peptide polymer linker.
  • the physiologically active polypeptide modified with the fatty acid molecule is characterized in that at least one fatty acid molecule is bound to the physiologically active polypeptide, and the fatty acid molecule used in the modification is not linked to the immunoglobulin Fc region.
  • the fatty acid molecule used for the modification does not act as a linker, so it is not a linker and is not connected to an immunoglobulin Fc region.
  • the inventors of the present invention prepared a protein conjugate in which a physiologically active polypeptide modified with a fatty acid molecule and an immunoglobulin Fc region are linked through a non-peptide polymer linker, which is a new structure that has not been actually produced and confirmed its effect, It was confirmed that the structure of the novel protein conjugate is superior to the protein conjugate used in the conventional protein drug product, as compared with the protein conjugate (Table 3 and FIG. 3). Through such confirmation, the present inventors have developed a novel protein conjugate structure and provide it as an aspect of the present invention.
  • the physiologically active polypeptide modified by the fatty acid molecule may be a physiologically active polypeptide having one or more fatty acid molecules linked thereto, but is not limited thereto.
  • protein complex or " conjugate” of the present invention refers to one or more physiologically active polypeptides, one or more non-peptide polymeric linkers and one or more immunoglobulin Fc regions, , And these components are interconnected by a covalent bond.
  • the non-peptide polymer may be, but is not limited to, having reactors at both ends prior to constituting the conjugate to form a conjugate.
  • conjugate a structure in which only two kinds of substance molecules selected by a physiologically active polypeptide, a fatty acid molecule, a non-peptide polymer and an immunoglobulin Fc region are covalently bonded is referred to as a " conjugate " . ≪ / RTI >
  • the protein conjugate of the present invention may be one in which a non-peptide polymer linker is covalently linked to a physiologically active polypeptide and an immunoglobulin Fc region in which at least one fatty acid molecule is linked through a two-terminal reactor.
  • physiologically active polypeptide in the present invention may be a constituent constituting a moiety of the protein conjugate, and is a concept collectively referred to as a polypeptide having any physiological activity in vivo. And have various physiological activities.
  • the physiologically active polypeptide includes a function of correcting genetic expression and physiological function when the abnormality is observed due to deficiency or excessive secretion of substances involved in function regulation in vivo, .
  • the above-mentioned physiologically active polypeptides include not only natural polypeptides but also derivatives thereof.
  • physiologically active polypeptide means a polypeptide or protein which exhibits an agonist and / It can be used interchangeably.
  • fatty acid molecule means a fatty acid or a fatty acid derivative which may be a constituent of a moiety of the protein conjugate, and the repeating units are connected to each other via any covalent bond But is not limited thereto.
  • the fatty acid in the fatty acid molecule used for the modification includes, but is not limited to, a fatty acid which is a monomer, a fatty acid which is a monomer, or a polymer in which a polymer is polymerized, or a derivative thereof.
  • fatty acid in the present invention means a carboxylic acid of a hydrocarbon chain having one carboxy group (-COOH), which may be a constituent of a moiety of the conjugate, and R-
  • the monovalent carboxylic acids having the formula COOH are collectively referred to as fatty acids.
  • the fatty acid of the present invention may be a saturated fatty acid or an unsaturated fatty acid depending on the bond between the carbon skeletons constituting the hydrocarbon chain.
  • the unsaturated fatty acid refers to a fatty acid having at least one double bond in the bond of the carbon skeleton forming the hydrocarbon chain, and the fatty acid in which the bonds of the carbon skeleton are all single bonds is a saturated fatty acid.
  • the fatty acid of the present invention may be a fatty acid having a normal chain structure and a fatty acid having a side chain in an alkyl group.
  • the fatty acid may be classified into a short chain / heavy chain / long chain fatty acid depending on the number of carbon atoms constituting the hydrocarbon chain. Generally, the fatty acid has 1 to 6 carbon atoms, the short chain fatty acid has 6 to 12 carbon atoms, Long-chain fatty acids.
  • unsaturated fatty acids the characteristics may vary depending on the position of the double bond.
  • the fatty acid of the present invention is a carboxylic acid having the formula R-COOH, wherein the R group may include a linear or branched saturated hydrocarbon group, may be a saturated or unsaturated fatty acid, may be a short chain, a heavy chain or a long chain fatty acid, And the number of carbon atoms constituting the hydrocarbon chain may be 1 to 40, and more specifically, the number of carbon atoms may be 4 to 30, but the present invention is not limited thereto.
  • the fatty acids of the present invention are formic acid (HCOOH, form acid), acetic acid (CH 3 COOH), propionic acid (C 2 H 5 COOH), butyric acid (C 3 H 7 COOH), valeric acid (C 4 H 9 COOH ), caproic acid (C 5 H 11 COOH), heptanoic acid (C 6 H 13 COOH), caprylic acid (C 7 H 15 COOH), pelargonic (C 8 H 17 COOH), capric acid (C 9 H 19 COOH), undecanoic acids (C 10 H 21 COOH), lauric acid (C 11 H 23 COOH), tree to acids (C 12 H 25 COOH), myristic acid (C 13 H 27 COOH), penta having acids (C 14 H 29 COOH), palmitic acid (C 15 H 31 COOH), heptyl tade acids (C 16 H 33 COOH), stearic acid (C 17 H 35 COOH), nona-decanoic acid (C 18 H 37 COOH ), Iraq acid
  • the fatty acid molecule of the present invention may be a derivative, an analogue, or the like of the fatty acid described above, and in particular, the hydrocarbon constituting the fatty acid may be a mutant including a linear or non-branched ring group.
  • the cyclic group which may be contained in the hydrocarbon may be a saturated homocycle, a heterocycle, an aromatic condensed or non-condensed homocycle or a heterocycle, and may have an ether bond, an unsaturated bond and a substituent.
  • the fatty acid derivative may be, but not limited to, a fatty acid to which the PBA compound is linked.
  • the fatty acid molecules of the present invention are also included within the scope of the present invention, derivatives and analogues of the fatty acids already known in the art, as well as derivatives and analogues which can be easily prepared at the state of the art.
  • the fatty acid molecule of the present invention may have a molecular weight in the range of 0.1 to 100 kDa, specifically 0.1 to 30 kDa, and the fatty acid molecule of the present invention may use not only one kind of polymer but also a combination of different kinds of polymers, It does not.
  • Non-peptide polymer means a biocompatible polymer in which two or more repeating units are bonded, which may be a constituent of the moiety of the protein conjugate, and the repeating units are arbitrary shares But they are not limited thereto.
  • the "immunoglobulin Fc region" in the present invention may be a constituent constituting a moiety of the conjugate.
  • the heavy chain and the light chain variable region, the heavy chain constant region 1 (C H 1) and the light chain constant region 1 (C L 1), and the immunoglobulin Fc region may further include a hinge region in the heavy chain constant region. Particularly a fragment comprising the entire immunoglobulin Fc region and a portion thereof, and in the present invention the immunoglobulin Fc region may be mixed with an immunoglobulin fragment.
  • the sugar chain is present at the Asn297 site in the heavy chain constant region 1, but the recombinant Fc derived from Escherichia coli is expressed in a form without sugar chains. Removal of the sugar chain in Fc lowers binding ability of Fc gamma receptors 1,2,3 and complement (c1q) binding to heavy chain constant region 1 and reduces or eliminates antibody-dependent or complement-dependent cytotoxicity.
  • an " immunoglobulin constant region" is defined as a heavy chain constant region 2 (CH2) and a heavy chain constant region 3 (CH2) except for the heavy and light chain variable regions of the immunoglobulin, heavy chain constant region 1 (CH1) and light chain constant region CH3) (or including the heavy chain constant region 4 (CH4)), and may also include a hinge portion in the heavy chain constant region.
  • the immunoglobulin constant region of the present invention includes (1) a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain and a CH4 domain, (2) a CH1 domain and a CH2 domain, (3) a CH1 domain and a CH3 domain, Domain, (5) a combination of one or more constant domain domains with immunoglobulin hinge regions (or portions of hinge regions), and (6) a heavy chain constant region angular domain and light chain constant region dimer.
  • Constant domains including immunoglobulin Fc fragments, are biodegradable polypeptides that are metabolized in vivo and are therefore safe for use as carriers for drugs. Since the immunoglobulin Fc fragment has a relatively small molecular weight as compared with the whole immunoglobulin molecule, it is not only advantageous in terms of preparation, purification and yield of the conjugate, but also because the amino acid sequence differs from antibody to antibody, the Fab portion exhibiting high heterogeneity is removed. It is expected that the homogeneity will be greatly increased and the possibility of inducing blood antigenicity will also be lowered.
  • the immunoglobulin constant region may be an animal origin such as human or bovine, goat, pig, mouse, rabbit, hamster, rat, guinea pig and the like, preferably human origin.
  • the immunoglobulin constant region may be selected from the group consisting of IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, or a combination thereof, or a constant region by hybridization thereof.
  • the immunoglobulin Fc region may be a dimer or a multimer composed of a short chain immunoglobulin composed of domains of the same origin.
  • the term " combination" means that, when a dimer or multimer is formed, a polypeptide encoding the same-origin short chain immunoglobulin constant region (preferably, the Fc region) binds to a short chain polypeptide of a different origin . That is, it is possible to prepare a dimer or a multimer from two or more fragments selected from the group consisting of Fc fragments of IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc and IgE.
  • hybrid in the present invention is a term meaning that a sequence corresponding to two or more immunoglobulin constant regions of different origin is present in a short-chain immunoglobulin constant region (preferably, Fc region).
  • Fc region immunoglobulin constant region
  • various types of hybrids are possible. That is, hybrids of one to four domains selected from the group consisting of CH1, CH2, CH3 and CH4 of IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc and IgD Fc are possible, can do.
  • IgG can also be divided into subclasses of IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, and a combination thereof or a hybridized form thereof is also possible in the present invention. Specifically IgG2 and IgG4 subclasses, and more specifically, an Fc region of IgG4 with little effector function such as complement dependent cytotoxicity (CDC).
  • CDC complement dependent cytotoxicity
  • the immunoglobulin constant region may be a natural type sugar chain, an increased sugar chain as compared with the native type, and a reduced sugar chain or sugar chain as compared with the native type.
  • Conventional methods such as chemical methods, enzymatic methods, and genetic engineering methods using microorganisms can be used to increase or decrease the immunoglobulin constant region sugar chains.
  • the immunoglobulin constant region in which the sugar chain is removed in the immunoglobulin constant region significantly decreases the binding force of the complement (c1q) and reduces or eliminates the antibody-dependent cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity, Lt; / RTI >
  • forms that are more consistent with the original purpose of the drug as a carrier will be immunoglobulin constant regions with or without glycosylation.
  • non-glycosylated Fc regions derived from human IgG4, i.e., human unchallenged IgG4 Fc regions can be used.
  • the human-derived Fc region may be preferable to the non-human-derived Fc region which can act as an antigen in a human organism and cause an undesirable immune response such as the generation of new antibodies thereto.
  • the immunoglobulin constant region of the present invention includes a naturally occurring amino acid sequence as well as its sequence derivative (mutant).
  • An amino acid sequence derivative means that one or more amino acid residues in the native amino acid sequence have different sequences by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof.
  • amino acid residues 214 to 238, 297 to 299, 318 to 322 or 327 to 331, which are known to be important for binding, can be used as sites suitable for modification.
  • various kinds of derivatives are possible, such as a site capable of forming a disulfide bond is removed, some amino acid at the N-terminus is removed from the native Fc, or a methionine residue is added to the N-terminus of the native Fc.
  • the complement binding site for example the C1q binding site, may be removed and the ADCC site may be removed.
  • Amino acid exchanges in proteins and peptides that do not globally alter the activity of the molecule are known in the art (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most commonly occurring exchanges involve amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thr / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu and Asp / Gly.
  • the above-described immunoglobulin constant region derivative may have the same biological activity as the immunoglobulin constant region of the present invention, but may be a derivative having increased structural stability against heat, pH, etc. of the immunoglobulin constant region.
  • immunoglobulin constant regions may also be obtained from natural forms isolated in vivo in humans and animals such as cattle, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats, guinea pigs, etc., and may be obtained from transformed animal cells or microorganisms Or a derivative thereof.
  • the method of obtaining from the natural form can be obtained by separating the whole immunoglobulin from the living body of human or animal, and then treating the proteolytic enzyme.
  • it may be a recombinant immunoglobulin constant region obtained from a microorganism, but is not limited to, a human immunoglobulin constant region.
  • the protein conjugate of the present invention may include one or more unit structures of [a physiologically active polypeptide in the form of a fatty acid molecule / non-peptide polymer linker / immunoglobulin Fc region], wherein all the components are covalent bond
  • a non-peptide polymeric linker may have a reactor at both ends, thereby linking it with a physiologically active polypeptide and an immunoglobulin Fc region, respectively, with a covalent bond.
  • a linkage of a non-peptide polymer linker bonded with a physiologically active polypeptide having a form in which a fatty acid molecule is linked to one immunoglobulin Fc region is covalently linked to one or more immunoglobulin Fc regions, Biologically active polypeptide monomers, dimers, or multimers, thereby achieving more effective in vivo activity and increased stability.
  • the two terminal reactors of the non-peptide polymer are preferably selected from the group consisting of a reaction aldehyde group, a propionaldehyde group, a butylaldehyde group, a maleimide group and a succinimide derivative.
  • succinimide derivative include succinimide derivatives such as hydroxy succinimidyl, succinimidyl carboxymethyl, succinimidyl bellarate, succinimidyl methyl butanoate, succinimidyl methyl propionate, succinimidyl butanoate, Succinimidyl propionate, N-hydroxysuccinimide or succinimidyl carbonate may be used.
  • the non-peptide polymer has a reactive aldehyde group reactor at both ends, it is effective to minimize the non-specific reaction and to bind the biologically active polypeptide and the immunoglobulin Fc region at both ends of the non-peptide polymer, respectively to be.
  • the final products formed by reductive alkylation by aldehyde linkages are much more stable than those linked by amide linkages.
  • the non-peptide polymer of the present invention or the both terminal reactors of the fatty acid molecule may be the same or different from each other.
  • the non-peptide polymer or the fatty acid molecule may have an aldehyde group reactor at both ends and the non-peptide polymer or fatty acid molecule may have an aldehyde group and a maleimide reactor at both ends, respectively, An aldehyde group, and a succinimide reactor, but the present invention is not limited thereto.
  • a maleimide group may be present at one end and an aldehyde group, propionaldehyde group or butylaldehyde group may be present at the other end.
  • a succinimidyl group may be at one end and a propionaldehyde group or a butylaldehyde group at the other end.
  • both ends of the non-peptide polymer are linked to the N-terminus of the immunoglobulin Fc region and the physiologically active polypeptide (Amino terminus), the C terminus (carboxyl terminus), the lysine residue, the histidine residue, the arginine residue, or the cysteine residue of the active polypeptide.
  • the non-peptide polymers of the present invention may be selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, polyoxyethylated polyols, polyvinyl alcohol, polysaccharides, dextran, polyvinyl ethyl ether, poly lactic acid) and PLGA (poly (lactic-glycolic acid)), a lipid polymer, a fatty acid, a chitin, a hyaluronic acid and a combination thereof. Specific examples thereof include polyethylene glycol ) Or a fatty acid, but is not limited thereto.
  • non-peptide polymers of the present invention those having a molecular weight in the range of 1 to 100 kDa, specifically in the range of 1 to 20 kDa, can be used.
  • the physiologically active polypeptide of the present invention may be a hormone, a cytokine, an interleukin, an interleukin binding protein, an enzyme, an antibody, a growth factor, a transcription regulator, a blood factor, a vaccine, a structural protein, a ligand protein or a receptor, , And variants and analogs, or analogs thereof.
  • the physiologically active polypeptides include human growth hormone, growth hormone releasing hormone, growth hormone releasing peptide, interferons and interferon receptors (e.g. interferon-alpha, -beta and -gamma, water soluble type-I- , Colony stimulating factors, interleukins such as interleukin-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30 (Such as IL-1 receptor and IL-4 receptor), enzymes (such as glucocerebrosidase, iduronate-2-sulfatase, alpha-galactosidase-A, agalsidase alpha, beta , interleukin and
  • CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40 but are not limited to, various types, such as clone antibodies, polyclonal antibodies, antibody fragments such as scFv, Fab, Fab ', F (ab') 2 and Fd,
  • the physiologically active polypeptide of the present invention is useful as a therapeutic agent for the treatment or prevention of diseases, in which human growth hormone, interferon (interferon-alpha, -beta, -gamma etc.), granulocyte colony An exendin, an antibody fragment, and a derivative thereof, and the like can be used as the antagonist, the erythropoietic factor, the blood factor VII, the blood factor VIIa, the blood factor VIII, insulin, oxytomodulin, glucagon, Also, any mutant or derivative, or analogue thereof, is included within the scope of the physiologically active polypeptide of the present invention as long as it has substantially the same or increased function, structure, activity or stability as the natural form of the physiologically active polypeptide .
  • insulin encompasses all peptides or modified peptides having an insulin receptor-stimulating activity. For example, substitution, addition, or substitution of some amino acids in natural insulin, fast-acting insulin, basal insulin, An insulin analog, or a fragment thereof, which is a substance that has undergone a modification through either deletion or modification or a combination of these methods.
  • insulin may be a persistent insulin using a persistent technique to overcome a short half-life. Preferably, it is a continuous insulin or a continuous insulin analogue that can be administered once a week.
  • Specific examples of the insulin according to the present invention include insulin or insulin analogues described in Korean Patent No. 10-1058290, Korean Patent Publication No. 10-2014-0106452 and International Patent Publication No. 2014/133324, But the scope thereof is not limited.
  • insulin analogue in the present invention means that one or more amino acids are modified in the native type sequence.
  • the insulin analog may be an insulin analogue in which the amino acid of the B chain or A chain of the insulin is mutated in which the insulin titer is decreased and / or the insulin receptor binding ability is reduced compared to the native type.
  • said insulin analogue is selected from the group consisting of amino acid 8 of insulin B chain, amino acid 23 of insulin B chain, amino acid 24 of insulin B chain, amino acid 25 of insulin B chain, amino acid 1 of insulin A chain, Amino acid and the 19th amino acid of the insulin A chain may be replaced by alanine or the 14th amino acid of the A chain may be replaced by glutamic acid or asparagine.
  • the physiologically active polypeptide may be insulin or an analog thereof
  • the fatty acid molecule modified by the physiologically active polypeptide may be a fatty acid or a fatty acid derivative
  • the non-peptide polymer linker may be a polyethylene glycol, It does not.
  • the antibody fragment may be Fab, Fab ', F (ab') 2, Fd or scFv having the ability to bind to a specific antigen, preferably Fab '.
  • the Fab fragment comprises the variable domain (VL) and the constant domain (CL) of the light chain and the variable domain (VH) and the first constant domain (CHl) of the heavy chain.
  • Fab fragments are distinguished from Fab fragments in that several amino acid residues are added to the carboxyl terminus of the CH1 domain, including one or more cysteines from the hinge region.
  • the Fd fragment is a fragment consisting only of the VH and CH1 domains
  • F (ab ') 2 is the Fab' fragment of two molecules bound through a disulfide bond or a chemical reaction.
  • scFv is a single polypeptide chain in which only the VL and VH domains are linked by a peptide linker.
  • the protein conjugate of the present invention can also be used for the development of sustained-release protein preparations of animal growth hormone, such as bovine growth hormone or porcine growth hormone, and proteins for the treatment or prevention of diseases in animals such as interferon.
  • animal growth hormone such as bovine growth hormone or porcine growth hormone
  • proteins for the treatment or prevention of diseases in animals such as interferon.
  • the present invention provides a method for producing a protein conjugate of the present invention.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising (a) a physiologically active polypeptide in the form of one or more fatty acid molecules linked together, and at least one immunoglobulin Fc region covalently linked via at least one non-peptide polymeric linker having a reactor at both ends Preparing a protein conjugate; And (b) a physiologically active polypeptide and an immunoglobulin Fc region in the form of a fatty acid molecule linked by a covalent bond through the non-peptide polymer linker prepared in the step (a) And isolating a protein conjugate wherein the peptide polymer linker binds to the immunoglobulin Fc fragment.
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention may be in the form of a monomer (dimer), but may be in the form of a homodimer or a heterodimer. Accordingly, the immunoglobulin Fc region constituting the protein conjugate of the present invention can bind through the immunoglobulin Fc region with one or more non-peptide polymeric linkers.
  • the immunoglobulin Fc region of the invention can be in the form of a homodimer, through which one or two non-peptide polymer linkers can be linked to the immunoglobulin Fc region homodimer. In this case, each of the non-peptide polymer linker can bind to the physiologically active polypeptide, and thus can form a protein conjugate.
  • the protein conjugate of the present invention may comprise one or more non-peptide polymer linkers, one or more biologically active polypeptides modified with two or more fatty acid molecules, and one or more immunoglobulin Fc regions covalently linked And can be manufactured to be connected.
  • the covalent bonding of the three components may occur sequentially or simultaneously.
  • physiologically active polypeptides and immunoglobulin Fc regions are bound to both ends of a non-peptide polymer
  • either the physiologically active polypeptide or the immunoglobulin Fc region is first bound to one end of the non-peptide polymer
  • the step (a) comprises: (i) connecting a physiologically active polypeptide having a specific position of an immunoglobulin Fc region or a fatty acid molecule linked to one end of a non-peptide polymer linker by covalent bonding; (ii) isolating from the reaction mixture a non-peptide polymer homologous to a specific site of the immunoglobulin Fc region or the linkage to which the biologically active polypeptide is bound; And (iii) producing a protein conjugate in which specific positions of the physiologically active polypeptide or immunoglobulin Fc region are bound to the other end of the non-peptide polymer of the separated ligand.
  • the step (a) comprises: (a1) preparing a conjugate by covalently linking a non-peptide polymer with any one of physiologically active polypeptides to which an immunoglobulin Fc region or a fatty acid molecule is linked, ; And (a2) separating the linkage prepared in the step (a1), and sharing the linkage with another one of the physiologically active polypeptide or immunoglobulin Fc region to which the fatty acid molecule is linked at the other end of the non-peptide polymer of the separated linkage And connecting them to each other.
  • the step (a) comprises: (a1 ') preparing a conjugate by linking an immunoglobulin Fc region to one end of the non-peptide polymer with a covalent bond; And (a2 ') separating the linkage prepared in the step (a1') and linking the physiologically active polypeptide with the covalent bond to the other end of the non-peptide polymer of the separated linkage have.
  • the step (a) comprises: (a1 ") preparing a conjugate by linking a physiologically active polypeptide to one end of a non-peptide polymer through a covalent bond; And (a2 ") separating the linkage prepared in the step (a1") and linking the immunoglobulin Fc region to the other end of the non-peptide polymer of the separated link by a covalent bond Lt; / RTI >
  • the reaction molar ratio of the physiologically active polypeptide having a fatty acid molecule linked to the non-peptide polymer linker in the step (a1), (a1 ') or (a1' : 30, and the reaction molar ratio of the immunoglobulin Fc region to the non-peptide polymer may be 1: 1 to 1:20.
  • the reaction molar ratio of the immunoglobulin Fc region to the non-peptide polymer in the step (a1 ') may be 1: 1 to 1:20, particularly 1: 1 to 1:15, 1: 1 to 1:10 or 1 to 1: 4, and in the step (a1 "), the reaction molar ratio of the biologically active polypeptide to the non-peptide polymer may be 1: 1 to 1:30, particularly 1: 1 to 1: 15, 1: 1 to 1:10.
  • the production yield and cost can be optimized according to the reaction molar ratio.
  • the step (a1), the step (a1 ') or the step (a1') may be carried out at pH 4.0 to 9.0;
  • the steps (a1), (a1 '), or (a1' ') may be performed at 4.0 to 25 ° C;
  • the reaction concentration of the immunoglobulin Fc region or the physiologically active polypeptide may be 0.1 to 100 mg / ml.
  • the reaction molar ratio of the linker: immunoglobulin Fc region or the physiologically active polypeptide may be 1: 0.1 to 1:20 in the step (a2), the step (a2 ') or the step (a2' 1: 0.2 to 1: 10.
  • the reaction molar ratio of the linker: physiologically active polypeptide may be 1: 0.1 to 1:20
  • step (a2 ") the reaction of the linker: immunoglobulin Fc region
  • the molar ratio may be 1: 0.1 to 1: 20.
  • the production yield and cost can be optimized according to the reaction molar ratio.
  • the step (a2), the step (a2 ') or the step (a2' ') may be carried out at pH 4.0 to 9.0;
  • the step (a2), (a2 ') or (a2' ') may be carried out at 4.0 to 25 ° C;
  • the reaction concentration of the immunoglobulin Fc region or the physiologically active polypeptide in the step (a2), (a2 ') or (a2' ') may be 0.1 to 100 mg / ml.
  • the production method of the present invention comprises the steps of (a ') linking one end of a non-peptide polymer with an immunoglobulin Fc region or a physiologically active polypeptide through a covalent bond to produce a conjugate, wherein the physiologically active polypeptide And the non-peptide polymer is 1: 1 to 1:30, the reaction molar ratio of the immunoglobulin Fc region to the non-peptide polymer is 1: 1 to 1:20, the reducing agent is contained at a concentration of 1 to 100 mM , a pH of 4.0 to 9.0, and a reaction temperature of 4.0 to 25 ⁇ , wherein a reaction concentration of the immunoglobulin Fc region or the physiologically active polypeptide is 0.1 to 100 mg / ml; (b ') separating the linkage prepared in the step (a'), and covalently linking the other end of the non-peptide polymer of the separated linkage to the other of the physiologically active polypeptide or immunoglobulin Fc region
  • the reaction of (a1), (a1 '), (a1''), (a2), (a2') and (a2 ' can be carried out in the presence of a reducing agent, if necessary, in consideration of the kind of both terminal reactors of the polymer.
  • a reducing agent sodium cyanoborohydride (NaCNBH 3 ), sodium borohydride, dimethylamine borate or pyridine borate may be used.
  • the concentration of the reducing agent for example, sodium cyanoborohydride
  • the temperature of the reaction solution the pH
  • physiologically active polypeptide and immunoglobulin Fc region participating in the reaction It is important to have a combination of various conditions to produce as many homogeneous high purity binders as possible. Various conditions can be used depending on the characteristics of the physiologically active polypeptide to be produced.
  • a reducing agent for example, sodium cyanoborohydride
  • a concentration of 1 to 100 mM, 25 ° C, pH 4.0 to 9.0 is contained at a concentration of 1 to 100 mM, 25 ° C, pH 4.0 to 9.0, and the reaction protein concentration (concentration of the immunoglobulin Fc region or physiologically active polypeptide contained in the reaction is 5 to 100 mg / ml).
  • Separation of the conjugate in the step (a2), the step (a2 ') and the step (a2') may be carried out by taking into consideration the characteristics such as purity, hydrophobicity, Among the conventional methods used for separation, it can be appropriately selected and carried out according to need. For example, by applying a variety of known methods, including size exclusion chromatography, hydrophobic chromatography or ion exchange chromatography, and optionally combining a plurality of different methods to purify at higher purity Can be used.
  • physiologically active polypeptide Depending on the characteristics of the physiologically active polypeptide to be produced, various conditions can be used. In general, size exclusion chromatography is most easily applied in order to separate immunoglobulin Fc regions bound to non-peptide polymers or physiologically active polypeptide chains. Hydrophobic chromatography or ion exchange chromatography may be used to separate scale-ups and small amounts of non-peptide polymer-bound isomers or small amounts of degenerates that may be produced during manufacture, at a location other than the desired location.
  • the step (b) may be carried out by appropriately selecting among conventional methods used for protein separation in consideration of properties such as hydrophobicity, molecular weight and charge amount, in order to finally purify a highly pure conjugate .
  • a variety of known methods can be applied including, for example, size exclusion chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography or ion exchange chromatography and, if necessary, purification of a plurality of different Methods can be used in combination.
  • various separation conditions may be used.
  • physiologically active polypeptides and immunoglobulin Fc regions are added at both ends of the non-peptide polymer Size exclusion chromatography is also the easiest to apply, in order to separate the conjugates linked by covalent bonds, respectively.
  • physiologically active polypeptide or immunoglobulin Fc region including a non-peptide polymer at a position other than a desired position, a small amount of modified substance which may be produced during manufacture,
  • it may be a combination of hydrophobic chromatography, ion exchange chromatography or affinity chromatography.
  • hydrophobic chromatography and ion exchange chromatography are preferred, and combinations with hydrophobic chromatography or ion exchange chromatography are possible, and ion-exchange chromatography or hydrophobic chromatography may be used depending on the binding substance to be prepared The method may be used alone, but is not limited thereto.
  • ion exchange chromatography separates proteins through the difference in the migration rate of proteins by passing a charged ionic resin through fixed chromatography using the charge of the protein at a specific pH, Exchange chromatography or cation exchange chromatography.
  • the anion exchange chromatography employs a cation resin.
  • the functional group of the resin constituting the anion exchange chromatography is quaternary ammonium (Q), quaternary aminoethyl (QAE), diethylaminoethyl (DEAE), polyethyleneimine (PEI), dimethylaminomethyl (DMAE), or trimethylaminoethyl (TMAE), but the present invention is not limited thereto.
  • the cation exchange chromatography employs an anionic resin.
  • the functional group of the resin constituting the cation exchange chromatography is methyl sulfonate (S), sulfopropyl (SP), carboxymethyl (CM), polyaspartic acid but are not limited to, one selected from the group consisting of aspartic acid, sulfoethyl (SE), sulfopropyl (SP), phosphate (P) or sulfonate (S).
  • the hydrophobic chromatography is carried out in such a manner that the functional group of the resin constituting it is selected from the group consisting of phenyl, octyl, (iso) propyl, butyl and ethyl) , But is not limited thereto.
  • the size exclusion chromatography may be one in which the resin constituting it is selected from the group consisting of superdex, sephacryl, superose and sephadex, It is not limited.
  • affinity chromatography in the present invention uses a resin having a ligand capable of interacting with a specific protein and separates the protein using the difference in protein migration rate depending on whether or not the ligand interacts with the ligand .
  • the functional groups of the resin constituting the affinity chromatography include protein A, heparin, blue, benzamidine, metal ions (cobalt, nickel, copper) and nonpeptide polymers But are not limited to, those selected from the group consisting of antibodies to some or all of the constituents of the protein conjugate bound to the immunoglobulin Fc region and the physiologically active polypeptide, respectively.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition having enhanced bioavailability and stability in vivo of a biologically active polypeptide comprising the protein conjugate or the protein conjugate prepared according to the protein conjugate production method as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous, or muscular, and can be administered preferably in the form of an injection.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated using methods well known in the art so as to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to the mammal.
  • Formulations may be in the form of tablets, pills, powders, sachets, elixirs, suspensions, emulsions, solutions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, sterile powders and the like.
  • suitable carriers, excipients and diluents for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltoditol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, Methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil. Further, it may further include a filler, an anticoagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, an antiseptic, and the like.
  • the actual dosage of the protein conjugate of the present invention will depend on the type of physiologically active polypeptide, which is the active ingredient, together with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex and weight of the patient, and the severity of the disease. Since the protein conjugate of the present invention is excellent in blood persistence and in vivo activity, the dose, administration frequency and frequency of the peptide preparation containing the protein conjugate of the present invention can be remarkably reduced.
  • a conjugate in which the acylated native insulin was linked to the immunoglobulin Fc fragment by a nonpeptide polymer was prepared.
  • acylated insulin As an acylated insulin, acylated insulin (hereinafter referred to as Ins-PBA-F), which is a natural insulin through 12-dodecanoic acid, is linked to 4-carboxy-3-fluoro-phenylboronic acid (Chou et al., PNAS Vol. 112, No. 8, pp. 2401-2406). ≪ tb > < TABLE >
  • the ⁇ -amino group of the B chain 29 lysine residue of the insulin is reacted with the 12-dodecanoic acid of the 12-dodecanoic acid using the DCC (dicyclohexylcarbodiimide) / NHS (N-hydroxysuccinimide) Linked with an amide bond with a carboxy group.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the method for producing 12- (4-borono-2-fluorobenzamido) dodecane used for the acylation of insulin is as follows.
  • the acylation of insulin was performed in the following manner.
  • Natural type insulin (100 mg, 17.23 ⁇ mol) was dissolved in 0.1 M Na 2 CO 3 (1 mL), and then added to the reaction solution of 12- (4-borono-2-fluorobenzamido) dodecanoic acid reacted with stirring. After 1 h, 0.2 M CH 3 NH 2 (1 mL) and 6 N HCl (26 ⁇ L) were added to the reaction. The reaction solution and precipitate were centrifuged and the pellet resuspended in DMSO (2 mL). The product was purified by reverse phase HPLC (Atlantis C18 column (250 x 10 mm, 5 [mu] m; Waters). The fractions were collected and lyophilized under vacuum to give a white product. The product was identified by deconvolution ESI using QSTAR hybrid Q-TOF (Koch Institute Swanson Biotechnology Center Biopolymers and Proteomics core).
  • the mass obtained is as follows: Ins-PBA-F, Prediction: 6153, Actual 6115.
  • acylated insulin the amino group of 12-dodecanoic acid of paracarboxyphenylboronic acid and the ⁇ -amino group of lysine of B-chain 29 of natural human insulin are linked by an amide bond with the carboxy group of 12-dodecanoic acid.
  • a schematic diagram thereof is shown in Fig.
  • Acylated natural insulin is (PBA-F) -fatty acid - mixed with natural insulin.
  • reaction solution was applied to SP Sepharose High Performance (GE, USA) using a buffer containing 20 mM sodium citrate (pH 3.0), ethanol and a gradient of 0.25 M KCl, Monopegylated (PBA-F) -fatty acid-natural type insulin was purified.
  • GE Sepharose High Performance
  • reaction mole ratio 1: 1.2 and a total protein concentration of about 20 mg / For about 16 hours.
  • the reaction solution was carried out in an environment in which sodium cyanoborohydride, a reducing agent, was added to 100 mM HEPES buffer (pH 8.2) and sodium chloride.
  • reaction solution was applied to Source 15Q (GE, USA) using a gradient of 20 mM Tris (pH 7.5) and 0.15 M sodium chloride, and the concentration of ammonium sulfate and 20 mM Tris (pH 7.5) Gradient was applied to SourceISO (GE, USA) to purify the conjugate in which Ins-PBA-F was bound to immunoglobulin Fc by covalent bond by PEG
  • the purified conjugate was analyzed for purity using IE-HPLC, SE-HPLC, RP-HPLC, and SDS-PAGE and found to have a purity of 95% or greater (FIGS.
  • a conjugate in which an acylated insulin analog was linked to an immunoglobulin Fc fragment by a non-peptide polymer was prepared.
  • insulin analogues insulin analogues with amino acid mutations in the insulin A chain or B chain described in the example of International Patent Publication No. 2014/133324 were used.
  • Table 1 shows the change sequence and analog name of the amino acid of the A chain or B chain of each of the insulin analogues. That is, in case of analogue 1, the first glycine of the A chain is replaced with alanine, and in the case of analogue 4, the 8th glycine of the B chain is replaced with alanine.
  • Table 2 below shows the DNA and protein sequences of specific insulin analogues 1 to 9.
  • Example 1 The experimental procedure described in Example 1 was followed except that the insulin analog was used instead of the natural insulin, and the analogue conjugate showed a purity of 95% or more. (Figs. 1B and 2B). Acylated insulin analogues are mixed with (PBA-F) -fatty acid-insulin analogues.
  • physiologically active polypeptide bound to the non-peptide polymer of the present invention and the protein conjugate in which the immunoglobulin Fc region is linked to the non-peptide polymer, which is a linker, are compared with the existing protein conjugates, Respectively.
  • human insulin receptor overexpression A method of measuring the phosphorylation of insulin receptor using CHO (chinese hamster ovary) cell line was used.
  • the cell line was subcultured two or three times a week, and CHO cells expressing 5x10 4 human insulin receptor were dispensed into a 96-well plate and cultured for 24 hours.
  • Human insulin was diluted continuously from 344.4 nM to 0.2 nM in triplicate for continuous insulin analog titer validation and comparison, and continuous insulin analog and continuous insulin analogues were serially diluted from 3,177 nM in triplicate to 9.2 nM.
  • CHO cells expressing the cultured human insulin receptor were washed with KRB buffer, 100 ⁇ l of each of the serially diluted substances was added to the cells, and then cultured in a CO 2 incubator at a temperature of 37 ⁇ for 10 minutes . The cell lysate was then applied to a Phospho-Insulin Receptor? Sandwich ELISA kit (Cell signaling, USA) to measure the phosphorylated insulin receptor.
  • the cell lysate was then added to the cell lysate buffer , From which EC 50 values were calculated and then the in vitro activities were compared.
  • the EC 50 value of each substance and the relative activity versus human insulin according to the second repeated test are shown in Table 3 below.
  • the inverse of the conjugates of Examples 1 and 2 was the same as that of Example 1 except that natural non-acylated insulin and non-acylated natural insulin were used.
  • the in vitro activities of the acylated insulin analogue-immunoglobulin Fc conjugates were 5.4, 2.1, 2.8 and 2.2%, respectively.
  • Test substance EC 50 (nM) % activity vs. human natural insulin Natural type insulin 14.2 ⁇ 0.8 100 Native insulin-immunoglobulin Fc binding 264.8 ⁇ 31.8 5.4 ⁇ 0.3 Insulin analogue - immunoglobulin Fc binding 675.2 ⁇ 90.2 2.1 ⁇ 0.1
  • the acylated native type insulin conjugate of Example 1 520.1 ⁇ 68.8 2.8 ⁇ 0.2
  • the acylated insulin analogue conjugate of Example 2 661.4 + - 7.0 2.2 ⁇ 0.1
  • the present inventors conducted the following in vivo effect experiments to confirm whether the bioactive polypeptide-modified continuous protein conjugates modified with the non-peptide polymer actually improved in vivo .
  • physiologically active polypeptide bound to the non-peptide polymer of the present invention and the protein conjugate in which the immunoglobulin Fc region is linked to the non-peptide polymer which is a linker have increased in vivo persistence in comparison with the existing protein conjugate.
  • STZ streptozotocin
  • Diabetic mice were treated with 100 nmol / kg (single injection), Group 3: (PBA-F) -fatty acid-insulin analogue-immunoglobulin Fc conjugate 100 nmol / kg (single injection), Group 4: (PBA-F) -fatty acid - native insulin-immunoglobulin Fc conjugate 100 nmol / kg (single injection).
  • blood glucose was measured at 0, 2, 4, 8 hours, 1, 1.25, 2, 2.25, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10 days after the test substance administration.
  • AUC was calculated using the blood glucose change value during the study.
  • Statistical analysis was performed using the one - way ANOVA between the excipient group and the test group.
  • the blood glucose change and the calculated AUC value are shown in Fig. (PBA-F) -fatty acid-insulin analogue-immunoglobulin Fc-conjugate, and (PBA-F) -fatty acid-natural insulin-immunoglobulin Fc conjugate were compared with Vehicle- -27, and -8%, respectively.

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Abstract

본 발명은 지방산 분자로 개질된 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 링커를 통하여 연결된, 단백질 결합체 및 이를 포함하는 약학적 조성물, 및 상기 단백질 결합체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 단백질 결합체는 면역글로불린 Fc의 결합부위의 연결과 지방산 분자의 물질 내 결합을 통하여, 생리활성 폴리펩타이드의 혈중 반감기를 연장시키고, 우수한 생체 내 역가를 가지며, 면역 반응 유발의 위험이 없는 단백질 결합체를 제공한다.

Description

효력이 향상된 지속성 단백질 결합체
본 발명은 지방산 분자로 개질된 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 링커를 통하여 연결된 단백질 결합체, 이를 포함하는 약학적 조성물, 및 상기 단백질 결합체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 단백질 결합체는 면역글로불린 Fc의 결합부위의 연결과 지방산 분자의 물질 내 결합을 통하여, 생리활성 폴리펩타이드의 혈중 반감기를 연장시키고, 우수한 생체 내 역가를 가지며, 면역 반응 유발의 위험이 없는 단백질 결합체를 제공한다.
폴리펩타이드는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 신장이나 간을 통해 쉽게 제거된다. 따라서, 약리성분으로 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사를 놓는 것은 환자에게 엄청난 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 단백질 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다. 이러한 단백질 약물의 지속성 제제는 단백질 약물의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다.
단백질을 안정화시키고 단백질 가수분해효소와의 접촉 및 신장 소실을 억제하기 위한 방법으로, 종래에는 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol: 이하 "PEG"라 약칭함)과 같이 용해도가 높은 고분자를 단백질 약물 표면에 화학적으로 부가시키는 방법이 사용되어 왔다. 그러나 PEG를 결합시키는 경우에 단백질의 안정성은 증가할 수 있지만 생리활성 단백질의 역가가 현저히 낮아지고, PEG의 분자량이 증가할수록 단백질과의 반응성이 낮아져 수율이 감소하는 문제가 있다.
한편, 면역글로불린(immunoglobulin, Ig)은 크게 항원 결합부위를 가진 Fab 영역과 보체 결합영역을 가진 Fc 영역으로 구분되는데, 변형된 면역글로불린의 Fc 영역을 이용한 유전자 재조합 방식의 융합 단백질의 제조 방법은 미국 등록 특허 제6,277,375호, 제6,410,008호, 제6,444,792호 등에 개시된 바 있다. 그러나, 이러한 유전자 재조합 방법에 의해 생산된 Fc 융합 단백질은 면역글로불린 Fc 영역의 특정 부위 즉, 아미노 말단 또는 카르복시 말단에서만 단백질 융합이 가능하고 동종이량체의 형태로만 발현되어 단량체의 형태로는 생산이 어려우며, 당쇄화 단백질 간의 또는 비당쇄화 단백질 간의 융합만이 가능하여 당쇄화 단백질과 비당쇄화 단백질의 융합은 불가능한 단점이 있다. 또한, 융합에 의해 새로 생긴 아미노산 서열로 인하여 면역반응이 유발될 수 있을 뿐만 아니라 링커 부위에 대한 단백질 가수분해효소의 민감성이 증가될 수 있다.
이에, 본 발명자들은 일찍이 링커를 사용한 결합체의 제조가 결합부위 및 결합되는 두 단백질의 방향성을 선택하여 조절할 수 있고, 단량체, 이량체 또는 다량체 제조가 가능하고, 동종 또는 이종 형태 모두 제조할 수 있는 장점이 있음을 확인하였다. 이에, 목적단백질을 포함하지 않은 천연형 면역글로블린 Fc 영역만을 대장균으로부터 높은 수율로 대량생산하여 지속형 제형에 사용하고, 이러한 재조합 방법에 의해 생산된 대장균 유래 면역글로블린 Fc 영역을 사용하여, 교차결합제를 매개로 목적 단백질과의 결합체를 생산하는 방법을 기 출원한 대한민국 공개 번호 제10-2005-0047032호에 언급한 바 있다. 또한, 본 발명자들은 상기 특허에서 종래에는 동시에 달성하기 어려운 것으로 여겨져 왔던 활성 감소 최소화와 안정성 증가를 동시에 이룰 수 있는 지속성 단백질 약물 제제로, 당쇄가 있거나 또는 없는 유전자 재조합 또는 천연형 유래 면역글로불린 Fc 영역, 비펩타이드성 중합체 및 생리활성 폴리펩타이드를 상호 공유결합에 의해 연결시켜 제조한 단백질 결합체가 생리활성 단백질의 혈중 반감기를 획기적으로 증가시키고, 공지의 단백질 약물에 비해 높은 역가를 유지함을 확인한 바 있다.
그러나, 생리활성 폴리펩타이드의 단점을 개선하기 위한 단백질 결합체 약물의 경우, 생체 내에서의 더욱 긴 활성과 뛰어난 역가 발휘를 위한 새로운 개선은 꾸준히 요구되어 왔다.
본 발명의 하나의 목적은 지방산 분자로 개질된 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 링커를 통하여 연결된, 단백질 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 단백질 결합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 단백질 결합체를 유효성분으로 포함하는, 생리활성 폴리펩타이드의 생체 내 지속성 및 안정성이 증가된, 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명을 구현하기 위한 하나의 양태는 지방산 분자로 개질된 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 링커를 통하여 연결된, 단백질 결합체를 제공한다.
하나의 구체예로서, 상기 지방산 분자로 개질된 생리활성 폴리펩타이드는 하나 이상의 지방산 분자가 생리활성 폴리펩타이드에 결합된 것으로, 상기 개질에 사용된 지방산 분자는 면역글로불린 Fc 영역에 연결되지 않은 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 개질에 사용된 지방산 분자는 생리활성 폴리펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역을 연결시키는 링커가 아닌 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 생리활성 폴리펩타이드를 개질한 지방산 분자는 지방산 또는 지방산 유도체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 비펩타이드성 중합체 링커가 양 말단 반응기를 통해 지방산 분자로 개질된 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역과 각각 공유결합으로 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 비당쇄화됨을 특징으로 하는 단백질 결합체 인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 단백질 결합체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 힌지 (hinge) 영역을 추가로 포함하는 단백질 결합체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, 이들의 조합(combination) 및 이들의 하이브리드(hybrid)의 Fc 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역글로불린 Fc 단편인, 단백질 결합체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 이들의 조합 및 이들의 하이브리드의 Fc 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단백질 결합체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 른 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 단편이 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인, 단백질 결합체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 단편이 IgG4 Fc 단편인 단백질 결합체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 단편이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 단편인 단백질 결합체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 비펩타이드성 중합체 링커는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 지방산, 지방산 유도체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단백질 결합체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 비펩타이드성 중합체 링커는 지방산, 지방산 유도체 또는 폴리에틸렌글리콜인 단백질 결합체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 결합체를 구성하는 일 모이어티인 상기 비펩타이드성 중합체의 반응기는 알데히드 기, 말레이미드 기 및 석신이미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단백질 결합체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 알데히드 기는 프로피온알데히드 기 또는 부틸알데히드 기인 것일 수 있다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 석신이미드 유도체가 석신이미딜 카르복시메틸, 석신이미딜 발레르에이트, 석신이미딜 메틸부타노에이트, 석신이미딜 메틸프로피온에이트, 석신이미딜 부타노에이트, 석신이미딜 프로피온에이트, N-하이드록시석신이미드인 또는 석신이미딜 카보네이트인 단백질 결합체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 비펩타이드성 중합체 링커는 각 말단에 각각 알데히드 그룹, 말레이미드 반응기 또는 석신이미드 유도체를 갖는 것인, 단백질 결합체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 지방산 분자는 각 말단에 각각 알데히드 그룹, 말레이미드 반응기 또는 석신이미드 유도체를 갖는 것인, 단백질 결합체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 비펩타이드성 중합체 링커의 양 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단, 라이신 잔기, 또는 알지닌 잔기와 생리활성 폴리펩타이드의 N 말단, C 말단, 라이신 잔기, 히스티딘 잔기 또는 시스테인 잔기, 또는 각 말단 또는 잔기의 유리 반응기에 결합되어 있는 것인, 단백질 결합체인 것을 특징으로 한다. 상기 유리 반응기는 비펩타이드성 중합체 링커 이외의 타 반응기와 결합되어 있지 않은 반응기로, 비펩타이드성 중합체 링커와 결합하기 전, 유리되어 있는 반응기뿐 아니라 각 말단 또는 잔기에 수식 (modification)을 통해 상기 비펩타이드성 중합체 링커와 결합할 수 있는 반응기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 생리활성 폴리펩타이드가 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질 및 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 결합체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 생리활성 폴리펩타이드는 인간 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론류, 인터페론 수용체류, 콜로니 자극인자류, 글루카곤-유사 펩타이드류 (GLP-1등), 엑센딘류 (Exendin4 등), 옥신토모듈린, 지프로테인 관련수용체 (G-protein-coupled receptor), 인터루킨류, 인터루킨 수용체류, 효소류, 인터루킨 결합 단백질류, 사이토카인 결합 단백질 류, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백 질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 VII, VIIa, VIII, IX, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토 메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체류, 수용체 길항물질, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 단편류 및 각각의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단백질 결합체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 생리활성 폴리펩타이드는 인간 성장 호르몬, 인터페론-알파, 과립구 콜로니자극인자, 적혈구 생성인자, 혈액인자, 인슐린, 옥시토모듈린, 글루카곤-유사 펩타이드류, 엑센딘류 및 각각의 유도체 또는 아날로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단백질 결합체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 생리활성 폴리펩타이드는 인슐린 또는 이의 아날로그이며, 상기 생리활성 폴리펩타이드를 개질한 지방산 분자는 지방산 또는 지방산 유도체이며, 상기 비펩타이드 중합체 링커는 폴리에틸렌 글리콜인, 단백질 결합체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 인슐린 안날로그는 인슐린 B쇄의 8번 아미노산, 인슐린 B쇄의 23번 아미노산, 인슐린 B쇄의 24번 아미노산, 인슐린 B쇄의 25번 아미노산, 인슐린 A쇄의 1번 아미노산, 인슐린 A쇄의 2번 아미노산 및 인슐린 A쇄의 19번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 아미노산이 알라닌으로 치환되거나, A쇄의 14번 아미노산이 글루탐산 또는 아스파라긴으로 치환된 것인, 단백질 결합체인 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는, 상기 지방산 분자로 개질된 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 링커를 통하여 연결된, 단백질 결합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명을 구현하기 위한 보다 구체적인 하나의 양태는, (a) 하나 이상의 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드 및 하나 이상의 면역글로불린 Fc 영역을 양 말단에 반응기를 갖는 하나 이상의 비펩타이드성 중합체 링커를 통해 공유결합으로 연결하여 단백질 결합체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계를 통해 제조한 비펩타이드성 중합체 링커를 통해 공유결합으로 연결된, 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역을 필수적으로 포함하고, 상기 비펩타이드성 중합체 링커가 면역글로불린 Fc 단편에 결합한 단백질 결합체를 분리하는 단계를 포함하는, 상기 단백질 결합체 제조방법인 것을 특징으로 한다.
하나의 구체예로서, 상기 (a) 단계는 (a1) 비펩타이드성 중합체 링커의 한쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 또는 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드 중 어느 하나와 공유결합으로 연결하여 연결체를 제조하는 단계; 및 (a2) 상기 (a1) 단계에서 제조한 연결체를 분리하여, 분리된 연결체의 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드의 다른 쪽 말단에 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역 중 다른 하나와 공유결합으로 연결하는 단계를 포함하는, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 (a1) 단계에서 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체 링커의 반응 몰 비는 1:1 내지 1:30이고, 면역글로불린 Fc 단편과 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비가 1:1 내지 1:20인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 (a1) 단계는 pH 4.0 내지 9.0에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 (a1) 단계는 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 (a1) 단계에서 면역글로불린 Fc 영역 또는 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 (a2) 단계에서 연결체 : 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 몰 비가 1:0.1 내지 1:20인 것을 특징으로 하는, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 (a2) 단계는 pH 4.0 내지 9.0에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 (a2) 단계는 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 (a2) 단계에서 면역글로불린 Fc 영역 또는 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 (a1) 단계 및 (a2) 단계가 환원제의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 것인, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 환원제가 나트륨 시아노보로하이드라이드(NaCNBH3), 수소화 붕소나트륨, 디메틸아민 붕산염 및 피리딘 붕산염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 (a2) 단계에서 연결체를 분리하기 위하여 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 크기배제 크로마토그래피로부터 선택되는 정제방법을 단독 또는 복수개로 수행하는 것인, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 쿼터너리암모늄(Q), 쿼터너리아미노에틸 (QAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 폴리에틸렌이민 (PEI), 디메틸아미노메틸(DMAE), 또는 트리메틸아미노에틸 (TMAE)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 메틸설포네이트 (S), 설포프로필 (SP), 카르복시메틸 (CM), 폴리아스파르트산（Poly aspartic acid), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 또는 설포네이트(S)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 소수성 크로마토그래피의 수지의 작용기가 페닐(phenyl), 옥틸(octyl), (이소)프로필((iso)propyl), 부틸(butyl) 및 에틸(ethyl)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 친화성 크로마토그래피의 수지의 작용기가 프로테인A (proteinA), 헤파린 (heparin), 블루 (blue), 벤자미딘 (benzamidine), 금속이온 (코발트, 니켈, 구리) 및 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 생리활성 폴리펩타이드와 결합된 단백질 결합체의 구성 성분의 일부 혹은 전체에 대한 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 크기배제 크로마토그래피의 수지가 수퍼덱스 (superdex）, 세파크릴 (sephacryl), 수퍼로즈 (superose)및 세파덱스 (sephadex)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것중 하나인, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 (b) 단계의 단백질 결합체를 분리하는 단계는 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피로 또는 크기배제 크로마토그래피로 부터 선택되는 정제방법을 단독 또는 복수개로 수행하는, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 쿼터너리암모늄(Q), 쿼터너리아미노에틸 (QAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 폴리에틸렌이민 (PEI), 디메틸아미노메틸(DMAE), 또는 트리메틸아미노에틸 (TMAE)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 메틸설포네이트 (S), 설포프로필 (SP), 카르복시메틸 (CM), 폴리아스파르트산（Poly aspartic acid), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 또는 설포네이트(S)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 소수성 크로마토그래피의 수지의 작용기가 페닐(phenyl), 옥틸(octyl), (이소)프로필((iso)propyl), 부틸(butyl) 및 에틸(ethyl)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 친화성 크로마토그래피의 수지의 작용기가 프로테인에이 (proteinA), 헤파린 (heparin), 블루 (blue), 벤자미딘 (benzamidine), 금속이온 (코발트, 니켈, 구리) 및 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드와 결합된 단백질 결합체의 구성 성분의 일부 혹은 전체에 대한 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 크기배제 크로마토그래피의 수지의 작용기가 수퍼덱스 (superdex）, 세파크릴 (sephacryl), 수퍼로즈 (superose) 및 세파덱스 (sephadex)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 상기 (b) 단계는 단백질 결합체를 구성하는 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역이 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단을 통해 결합한 단백질 결합체를 분리하는 것을 특징으로 하는 것인, 제조방법인 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는, (a') 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 또는 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드 중 어느 하나와 공유결합으로 연결하여 연결체를 제조하는 단계로서, 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비는 1:1 내지 1:30이고, 면역글로불린 Fc 영역과 비펩타이드성 중합체 링커의 반응 몰 비가 1:1 내지 1:20이며, 환원제가 1 ~ 100 mM 농도로 포함되고, pH 4.0 내지 9.0, 반응온도 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지며, 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 단계; (b') 상기 (a') 단계에서 제조한 연결체를 분리하여, 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체 링커의 다른 쪽 말단에 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역 중 다른 하나와 공유결합으로 연결하는 단계로서, 연결체와 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드 링커의 반응 몰 비가 1:0.1 내지 1:20이고, 환원제가 1 ~ 100 mM 농도로 포함되며, pH 4.0 내지 9.0, 반응온도 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지고, 면역글로불린 Fc 영역 또는 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 단계; 및 (c') 상기 (b') 단계를 통해 제조한 공유결합으로 연결된 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체 링커 및 면역글로불린 Fc 영역을 필수적으로 포함하고, 상기 비펩타이드성 중합체 링커가 면역글로불린 Fc와 결합한 단백질 결합체를 분리하는 단계를 포함하는, 상기 지방산 분자로 개질된 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 링커를 통하여 연결된, 단백질 결합체 제조방법을 제공한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는, 상기 지방산 분자로 개질된 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 링커를 통하여 연결된, 단백질 결합체를 포함하는 조성물이다.
하나의 구체예로서, 상기 조성물은 생리활성 폴리펩타이드의 생체 내 지속성 및 안정성 증가용 약학적 조성물인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 지방산 분자로 개질된 생리활성 폴리펩타이드, 즉 하나 이상의 지방산 분자가 결합된 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 링커인 비펩타이드성 중합체로 연결된, 새로운 형태의 단백질 결합체 및 이의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 단백질 결합체는 기존의 단백질 결합체에 비해 획기적으로 우수한 생체내 지속성 및 역가가 증가된 특징을 갖는다. 이에 본 발명에 의하여 제조된 단백질 결합체는 다양한 생리활성 폴리펩타이드 약물의 지속형 제제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1a는 제조된 (PBA-F)-지방산-천연형 인슐린-면역글로블린 Fc 결합체를 SDS-PAGE 를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1b는 제조된 (PBA-F)-지방산-인슐린 아날로그-면역글로블린 Fc 결합체를 SDS-PAGE 를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2a는 제조된 (PBA-F)-지방산-천연형 인슐린-면역글로블린 Fc 결합체의 순도를 RP-HPLC, IE-HPLC 및 SE-HPLC 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다. X축은 분(min)을 Y축은 mAU를 나타낸다.
도 2b는 제조된 (PBA-F)-지방산-인슐린 아날로그-면역글로블린 Fc 결합체의 순도를 RP-HPLC, IE-HPLC 및 SE-HPLC 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다. X축은 분(min)을 Y축은 mAU를 나타낸다.
도 3은 제조된 지속형 인슐린 및 아날로그 결합체들 간의 당뇨 모델 마우스에서 혈당 강하 효력을 비교한 그래프이다.
도 4는 Ins-PBA-F의 모식도이다.
도 5는 지방산 분자로 개질된 생리활성 폴리펩타이드 (인슐린)와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 링커인 폴리에틸렌글리콜과 연결된, 본 발명의 단백질 결합체의 일 모식도이다.
본 발명의 일 양태는, 지방산 분자로 개질된 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 링커를 통하여 연결된, 단백질 결합체를 제공한다. 구체적으로, 상기 지방산 분자로 개질된 생리활성 폴리펩타이드는 하나 이상의 지방산 분자가 생리활성 폴리펩타이드에 결합된 것으로, 상기 개질에 사용된 지방산 분자는 면역글로불린 Fc 영역에 연결되지 않은 것을 특징으로 한다. 상기 개질에 사용된 지방산 분자는 링커로 작용하지 않으므로, 링커가 아니며, 면역글로불린 Fc 영역에 연결되지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명자들은 기존에 실질적으로 제조 및 그 효과를 확인하지 못하였던 새로운 구조인, 지방산 분자로 개질된 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 링커를 통하여 연결된, 단백질 결합체를 제조하고, 이와 같은 신규 단백질 결합체의 구조가 기존의 단백질 의약품에 사용되던, 단백질 결합체에 비해 지속성 및 역가가 우수함을 확인하였다 (표 3 및 도 3). 이와 같은 확인을 통해, 본 발명자들은 새로운 단백질 결합체 구조를 개발하여, 본 발명의 일 양태로 제공하는 것이다.
상기 지방산 분자로 개질된 생리활성 폴리펩타이드는 하나 이상의 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "단백질 결합체(complex)" 또는 "결합체"라 함은 지방산 분자로 개질된, 하나 이상의 생리활성 폴리펩타이드, 하나 이상의 비펩타이드성 중합체 링커 및 하나 이상의 면역글로불린 Fc 영역을 각각 일 모이어티로 포함하고, 이들 구성요소가 공유결합으로 상호 연결되어 있는 것을 의미한다. 상기 비펩타이드성 중합체는 결합체를 구성하기 위해 결합체 구성 전에 양 말단에 반응기를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 "결합체"와 구별하기 위하여, 생리활성 폴리펩타이드, 지방산 분자, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역에서 선택된 2 종류의 물질 분자만이 공유결합으로 연결된 구조물은 "연결체(conjugate)"로 표시될 수 있다.
본 발명의 단백질 결합체는 비펩타이드성 중합체 링커가 양 말단 반응기를 통해 하나 이상의 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역과 각각 공유결합으로 연결되는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "생리활성 폴리펩타이드"는 상기 단백질 결합체의 모이어티(moiety)를 이루는 일 구성일 수 있는 것으로, 생체 내에서 어떤 생리작용을 가지는 폴리펩타이드를 총칭하는 개념으로서, 폴리펩타이드 구조를 가진다는 공통점을 가지며, 다양한 생리활성을 가진다. 상기 생리활성 폴리펩타이드는 유전표현과 생리기능을 조정하여 생체 내에서 기능조절에 관여하는 물질의 결핍이나 과도한 분비에 의해 비정상적인 병태를 보일 때 이를 바로잡아 주는 역할을 하는 것을 포함하며, 일반적인 단백질 치료제 역시 포함할 수 있다. 또한, 상기 생리활성 폴리펩타이드는 천연형 폴리펩타이드 외에도 이의 유도체도 모두 포함하는 개념이다.
본 발명에서 "생리활성 폴리펩타이드", "생리활성 단백질", "활성 단백질" 또는 "단백질 약물"이란 생체 내에서 생리적 현상에 작용제 및/또는 길항작용을 나타내는 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미하는 용어로서 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 "지방산 분자"는 상기 단백질 결합체의 모이어티(moiety)를 이루는 일 구성일 수 있는 것으로, 지방산 또는 지방산 유도체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 개질에 사용되는 지방산 분자 중 지방산은 모노머 (monomer) 인 지방산 또는 모노머인 지방산이 중합 반응을 이루어 중합체를 이룬 것, 또는 각각의 유도체를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "지방산(fatty acid)"은 상기 결합체의 모이어티(moiety)를 이루는 일 구성일 수 있는 것으로, 1개의 카복시기(-COOH)를 가지는 탄화수소 사슬의 카복실산을 의미하며, R-COOH의 화학식을 가지는 1가의 카복실산을 총칭하여 지방산이라 한다.
본 발명의 지방산은 탄화수소 사슬을 이루는 탄소 골격 간의 결합에 따라 포화지방산 또는 불포화지방산일 수 있다. 상기 불포화지방산은 탄화수소 사슬을 이루는 탄소 골격의 결합 중에 이중 결합을 한 개 이상 가지는 지방산을 의미하며, 탄소 골격의 결합이 모두 단일결합만으로 이루어진 지방산은 포화지방산이다.
또한, 본 발명의 지방산은 노르말 사슬 구조를 가지는 지방산일 수 있으며 알킬기에 곁사슬이 있는 지방산일 수 있다. 지방산은 탄화수소 사슬을 이루는 탄소 수에 따라 단쇄/ 중쇄/ 장쇄 지방산으로 분류될 수 있으며, 일반적으로 탄소수 1 내지 6개를 가지는 경우에 단쇄 지방산, 6 내지 12개를 가지는 경우에 중쇄 지방산, 14 이상은 장쇄 지방산으로 분류될 수 있다. 아울러, 불포화 지방산의 경우에는 이중 결합의 위치에 따라 특성이 달라질 수 있다.
본 발명의 지방산은 R-COOH의 화학식을 가지는 카복실산이고 해당 R기는 선형 또는 분지형 포화 탄화수소기를 포함하는 것일 수 있으며, 포화지방산 또는 불포화지방산일 수 있고, 단쇄, 중쇄 또는 장쇄 지방산일 수 있으며, 구체적으로 탄화수소 사슬을 이루는 탄소수가 1 내지 40인 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 탄소수가 4 내지 30인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 지방산은 포름산(HCOOH, form acid), 아세트산(CH3COOH), 프로피온산(C2H5COOH), 부티르산(C3H7COOH), 발레르산(C4H9COOH), 카프로산(C5H11COOH), 에난트산(C6H13COOH), 카프릴산(C7H15COOH), 펠라르곤산(C8H17COOH), 카프르산(C9H19COOH), 운데실산(C10H21COOH), 라우르산(C11H23COOH), 트리데실산(C12H25COOH), 미리스트산(C13H27COOH), 펜타데실산(C14H29COOH), 팔미트산(C15H31COOH), 헵타데실산(C16H33COOH), 스테아르산(C17H35COOH), 노나데칸산(C18H37COOH), 이라크산(C19H39COOH), 베헨산(C21H43COOH), 리그노세르산(C23H47COOH), 세로트산(C25H51COOH),헵타코산산(C26H53COOH), 몬탄산(C28H57COOH), 멜리스산(C29H59COOH), 락세르산(C31H63COOH), 아크릴산(CH2=CHCOOH), 크로톤산(CH3CH=CHCOOH), 이소크로톤산(CH3CH=CHCOOH), 운데실렌산(CH2=CH(CH2)8COOH), 올레산(C17H33COOH), 엘라이드산(C17H33COOH), 세톨레산(C21H41COOH), 에루크산(C21H41COOH), 브라시드산(C21H41COOH), 소르브산(C5H7COOH, F2), 리놀레산(C17H31COOH, F2), 리놀렌산(C17H29COOH, F3), 아라키돈산(C19H31COOH, F4), 프로피올산(CH≡CCOOH), 히알루론산(C14H21NO11)n) 및 스테아롤산(C17H31COOH, F1)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 지방산 분자는 상기 설명된 지방산의 유도체, 유사체 등일 수 있으며, 특히 지방산을 이루는 탄화수소가 선형, 분지형 외의 고리기를 포함하는 변이체일 수 있다. 상기 탄화수소에 포함될 수 있는 고리기는 포화 호모사이클, 헤테로사이클, 방향족 축합 또는 비축합 호모사이클 또는 헤테로사이클일 수 있으며 에테르 결합, 불포화 결합 및 치환기를 가질 수 있다. 그 예로 지방산 유도체는 PBA 화합물이 연결된 지방산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이외에도 본 발명의 지방산 분자는 당해 분야에 이미 알려진 상기 지방산의 유도체, 유사체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체, 및 유사체들도 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 지방산 분자는 분자량이 0.1 내지 100kDa 범위, 구체적으로 0.1 내지 30 kDa 범위인 것일 수 있으며, 본 발명의 지방산 분자는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
"비펩타이드성 중합체"는 상기 단백질 결합체의 모이어티(moiety)를 이루는 일 구성일 수 있는 것으로 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "면역글로불린 Fc 영역"은 상기 결합체의 모이어티(moiety)를 이루는 일 구성일 수 있는 것으로, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1 (CH1)과 경쇄 불변영역 1 (CL1)을 제외한 나머지 부분을 의미하며, 면역글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변영역에 힌지 (hinge) 영역을 추가로 포함하기도 한다. 특히 면역글로불린 Fc 영역 전체 및 이의 일부를 포함하는 단편일 수 있어, 본 발명에서는 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 단편과 혼용될 수 있다.
천연형 Fc는 중쇄 불변영역 1에서 Asn297 부위에 당쇄가 존재하지만, 대장균 유래 재조합 Fc는 당쇄가 없는 형태로 발현된다. Fc에서 당쇄가 제거되면 중쇄 불변영역 1 에 결합하는 Fc 감마 수용체 1,2,3 과 보체(c1q)의 결합력이 저하되어 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거된다.
본 발명에서, "면역글로불린 불변영역"은 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3) (또는 중쇄 불변영역 4(CH4) 포함)부분을 포함하는 Fc 단편을 의미할 수 있으며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 불변영역은 천연형과 실질적으로 동등 하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역(CL)을 포함하는 확장된 면역글로불린 불변영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 불변영역은 (1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, (2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, (3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, (4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, (5) 1개 또는 2개의 이상의 불변영역 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)과의 조합, (6) 중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다. 면역글로불린 Fc 단편을 비롯한 불변영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 단편은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
한편, 면역글로불린 불변영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다. 또한, 면역글로불린 불변영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 불변영역으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래일 수 있다. 본 발명에서 면역글로불린 Fc 영역은 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체일 수 있다.
본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 불변영역(바람직하게는 Fc 영역)을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 불변영역(바람직하게는 Fc 영역)내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 불변영역에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지영역을 추가로 포함할 수 있다.
IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화된 형태도 가능하다. 구체적으로는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 더욱 구체적으로는 보체 의존적 독성(CDC, Complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역일 수 있다.
또한, 면역글로불린 불변영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 불변영역 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, 면역글로불린 불변영역에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 불변영역은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 불변영역이라 할 것이다. 따라서, 더욱더 구체적으로는, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역, 즉 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역을 사용할 수 있다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직할 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 불변영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다. 또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가되는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예를 들어 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 불변영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,197 9). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 면역글로불린 불변영역 유도체는 본 발명의 면역글로불린 불변영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내나, 면역글로불린 불변영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체일 수 있다. 또한, 이러한 면역글로불린 불변영역은 인간 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다.
구체적으로, 인간 유래의 면역글로불린 불변영역을 미생물로부터 수득한 재 조합형 면역글로불린 불변영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 단백질 결합체는 [지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드 /비펩타이드성 중합체 링커/면역글로불린 Fc 영역]의 단위구조를 하나 이상 포함할 수 있으며, 여기에서 모든 구성 요소들은 공유결합에 의해 선형으로 연결되어 있을 수 있다. 비펩타이드성 중합체 링커는 양 말단에 반응기를 가질 수 있으므로, 이를 통해 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역과 각각 공유결합으로 연결된다. 즉, 하나의 면역글로불린 Fc 영역에, 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드와 결합된 비펩타이드성 중합체 링커의 연결체가 하나 이상이 공유결합으로 연결됨으로써, 면역글로불린 Fc 영역을 매개체로 하여 생리활성 폴리펩타이드 단량체, 이량체 혹은 다량체를 형성할 수 있으며, 이를 통해 생체 내 활성 및 안정성 증가를 보다 효과적으로 달성할 수 있다.
상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 반응 알데히드 기, 프로피온 알데히드 기, 부틸 알데히드 기, 말레이미드 (maleimide) 기 및 석시니미드 (succinimide) 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 석시니미드 유도체로는 하이드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸, 석시니미딜 벨러레이트, 석시니미딜 메틸부타노에이트, 석시니미딜 메틸프로피오네이트, 석시니미딜 부타노에이트, 석시니미딜 프로피오네이트, N-하이드록시석시니미드 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 특히 상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 기의 반응기를 갖는 경우, 비 특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역과 각각 결합하는 데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다.
본 발명의 비펩타이드성 중합체 또는 지방산 분자의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 상기 비펩타이드성 중합체 또는 지방산 분자 는 양 말단에 알데히드 그룹 반응기를 갖는 것일 수 있고, 또한 상기 비펩타이드성 중합체 또는 지방산 분자 는 양 말단에 각각 알데히드 기 및 말레이미드 반응기를 가질 수 있거나, 양 말단에 각각 알데히드 기 및 석시니미드 반응기를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 기를, 다른 쪽 말단에는 알데히드 기, 프로피온 알데히드 기 또는 부틸 알데히드 기를 가질 수 있다. 또 한 가지 예로, 한쪽 말단에는 석시니미딜 기를, 다른 쪽 말단에는 프로피온 알데히드 기 또는 부틸 알데히드 기를 가질 수 있다. 프로피온양쪽 말단에 하이드록시 반응기를 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는, 공지의 화학반응에 의해 상기 하이드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)을 이용하여 본 발명의 단백질 결합체를 제조할 수 있다.
지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 링커를 매개로 연결되는 경우에는, 상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단과 생리활성 폴리펩타이드의 N 말단(아미노 말단), C 말단(카르복실 말단), 라이신 잔기, 히스티딘 잔기, 알지닌 잔기, 또는 시스테인 잔기의 유리 반응기에 결합되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(poly(lactic acid)) 및 PLGA(poly(lactic-glycolic acid))와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 지방산, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 구체적으로는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 혹은 지방산 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 비펩타이드성 중합체의 범위에 포함된다. 비펩타이드성 중합체로는 분자량이 1 내지 100 kDa 범위인 것, 구체적으로는 1 내지 20 kDa 범위인 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 생리활성 폴리펩타이드로는 호르몬, 사이토카인, 인터루킨, 인터루킨 결합 단백질, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질 또는 수용체, 세포표면항원, 수용체 길항물질 같은 다양한 생리활성 폴리펩타이드, 및 이들의 변이체 및 유사체, 또는 아날로그들을 예시할 수 있다.
구체적으로, 생리활성 폴리펩타이드는 인간 성장 호르몬, 성장호르몬 방출 호르몬, 성장호르몬 방출 펩타이드, 인터페론류와 인터페론 수용체류(예: 인터페론-알파, -베타 및 -감마, 수용성 타입-I-인터페론 수용체등), 콜로니 자극 인자, 인터루킨류(예: 인터루킨-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30 등)와 인터루킨 수용체류(예 IL-1 수용체, IL-4 수용체등), 효소류 (예:글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), iduronate-2-sulfatase, 알파-galactosidase-A, agalsidase alpha,beta, alpha-L-iduronidase, butyrylcholinesterase, Chitinase, glutamate decarboxylase, imiglucerase, lipase, Uricase, Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase, neutral endopeptidase, myeloperoxidase 등), 인터루킨 및 사이토카인 결합 단백질류(예: IL-18bp, TNF-binding protein 등), 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B세포 인자, T세포 인자, 단백질 A, 알러지 억제 인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사 인자, 종양 억제 인자, 전이 성장 인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, alpha-lactalbumin, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성 인자, 고 당쇄화 적혈구 생성 인자, angiopoeitin류, 헤모글로빈, thrombin, thrombin receptor activating peptide, thrombomodulin, 혈액인자 VII, 혈액인자 VIIa, 혈액인자 VIII, 혈액인자 IX, 혈액인자 XIII, 플라즈미노젠 활성 인자, fibrin-binding peptides, 유로키나제, 스트렙토키나제, hirudin, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장 인자, 상피 성장 인자, 표피 성장 인자, angiostatin, angiotensin, 골 형성 성장 인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 옥신토모듈린, 글루카곤, 글루카곤 유도체, 글루카곤 유사 펩타이드, 엑센딘(Exendin4), 아트리오펩틴, 연골 유도인자, elcatonin, 결합조직 활성인자, tissue factor pathway inhibitor, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장 인자류(예:nerve growth factor, cilliary neurotrophic factor, axogenesis factor-1, brain-natriuretic peptide, glial derived neurotrophic factor, Netrin, neurophil inhibitor factor, neurotrophic factor, neurturin 등), 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출 인자, 갑상선 자극호르몬, autotaxin, lactoferrin, Myostatin, 수용체류 (예: TNFR (P75), TNFR (P55), IL-1 receptor, VEGF receptor, B cell activating factor receptor 등), 수용체 길항물질(예: IL1-Ra 등), 세포표면항원(예: CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69 등), 단일클론 항체, 폴리클론 항체, 항체 단편류 (예: scFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fd), 바이러스 유래 백신 항원 등 다양한 종류를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
특히 구체적으로 본 발명의 생리활성 폴리펩타이드는, 질병의 치료 또는 예방의 목적으로 인체에 투여될 때 투여 빈도가 높은 인간 성장호르몬, 인터페론류 (인터페론-알파, -베타, -감마 등), 과립구 콜로니 자극인자, 적혈구 생성인자, 혈액인자 VII, 혈액인자 VIIa, 혈액인자 VIII, 인슐린, 옥신토모듈린, 글루카곤, 글루카곤 유사 펩타이드류, 엑센딘류, 항체 단편류 및 각각의 유도체 등일 수 있다. 또한, 상기 생리활성 폴리펩타이드의 천연형과 실질적으로 동등하거나 증가된 기능, 구조, 활성 또는 안정성을 갖는 한, 임의의 변이체 또는 유도체, 또는 이의 아날로그도 본 발명의 생리활성 폴리펩타이드의 범위에 포함된다.
본 발명에서 인슐린이란 인슐린 수용체 자극 활성이 있는 모든 펩타이드 또는 변형 펩타이드를 망라하는데, 예를 들어 천연형 인슐린, 속효성 인슐린, basal 인슐린, 천연형 인슐린에서 일부 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중에 어느 하나의 방법 또는 이들 방법의 조합을 통해 변형이 일어난 물질인 인슐린 아날로그, 또는 이들의 단편 일 수도 있다. 또한 본 발명에서 인슐린은 짧은 반감기를 극복하기 위한 지속형 기술을 적용한 지속형 인슐린 일 수 있다. 바람직하게는 일주 일회 투여 가능한 지속형 인슐린 혹은 지속형 인슐린 아날로그다. 본 발명에 따른 인슐린의 구체적인 예를 일부만 들자면 대한민국 등록특허 제10-1058290호, 대한민국 특허공개번호 제10-2014-0106452호, 국제특허공개 제2014/133324호에 기재된 인슐린 또는 인슐린 아날로그와 그 지속형들을 포함하나 그 범위는 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "인슐린 아날로그"란 천연형 서열에서 하나 이상의 아미노산이 변형된 것을 의미한다.
상기 인슐린 아날로그는 천연형에 비해 인슐린 역가가 감소 및/또는 인슐린 수용체 결합력이 감소된, 인슐린의 B 쇄 또는 A 쇄의 아미노산이 변이된 인슐린 아날로그일 수 있다.
상기 인슐린 아날로그는 인슐린 B쇄의 8번 아미노산, 인슐린 B쇄의 23번 아미노산, 인슐린 B쇄의 24번 아미노산, 인슐린 B쇄의 25번 아미노산, 인슐린 A쇄의 1번 아미노산, 인슐린 A쇄의 2번 아미노산 및 인슐린 A쇄의 19번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 아미노산이 알라닌으로 치환되거나, A쇄의 14번 아미노산이 글루탐산 또는 아스파라긴으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
그 예로, 상기 생리활성 폴리펩타이드는 인슐린 또는 이의 아날로그이며, 상기 생리활성 폴리펩타이드를 개질한 지방산 분자는 지방산 또는 지방산 유도체이며, 상기 비펩타이드 중합체 링커는 폴리에틸렌 글리콜인, 단백질 결합체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 항체 단편은 특정 항원에 결합할 수 있는 능력을 지닌 Fab, Fab', F(ab')2, Fd 또는 scFv일 수 있으며, 바람직하게는 Fab'이다. Fab 단편은 경쇄의 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)과 중쇄의 가변 도메인(VH) 및 제 1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 CH1 도메인의 카르복실 말단에 힌지(hinge) 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 수 개의 아미노산 잔기가 부가되어 있다는 점에서 Fab 단편과 구별된다. Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인으로만 구성된 단편이며, F(ab')2는 두 분자의 Fab' 단편이 다이설파이드 결합 혹은 화학적 반응을 통해 결합한 것이다. scFv는 VL 및 VH 도메인만이 펩타이드 링커로 연결된 단일 폴리펩타이드 쇄이다.
또한, 본 발명의 단백질 결합체는 소 성장호르몬 또는 돼지 성장호르몬과 같은 동물 성장호르몬의 지속형 단백질 제제 및 인터페론과 같은 동물의 질병 치료 또는 예방용 단백질의 지속형 단백질 제제의 개발에도 사용될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 단백질 결합체의 제조방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 (a) 하나 이상의 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드 및 하나 이상의 면역글로불린 Fc 영역을 양 말단에 반응기를 갖는 하나 이상의 비펩타이드성 중합체 링커를 통해 공유결합으로 연결하여 단백질 결합체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계를 통해 제조한 비펩타이드성 중합체 링커를 통해 공유결합으로 연결된, 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역을 필수적으로 포함하고, 상기 비펩타이드성 중합체 링커가 면역글로불린 Fc 단편에 결합한 단백질 결합체를 분리하는 단계를 포함하는, 단백질 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 단량체(dimer) 형태일 수도 있으나, 동형 이량체(homodimer) 또는 이형 이량체(heterodimer) 형태일 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 단백질 결합체를 구성하는 면역글로불린 Fc 영역은 하나 이상의 비펩타이드성 중합체 링커와 면역글로불린 Fc 영역을 통해 결합할 수 있다. 특히, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 동형 이량체 형태일 수 있고, 이를 통하여 면역글로불린 Fc 영역 동형 이량체에 1개 또는 2개의 비펩타이드성 중합체 링커와 연결될 수 있다. 이 경우, 비펩타이드성 중합체 링커는 각각 생리활성 폴리펩타이드와 결합할 수 있으므로, 단백질 결합체를 구성할 수 있다.
이에 따라, 본원발명 단백질 결합체는 1개 또는 2개 이상의 비펩타이드성 중합체 링커, 1개 또는 2개 이상의 지방산 분자로 개질된 생리활성 폴리펩타이드 및 1개 또는 2개 이상의 면역글로불린 Fc 영역이 공유결합으로 연결되어 제조될 수 있다.
상기 (a) 단계에서, 세 구성요소의 공유결합은 순차적으로 또는 동시에 일어날 수 있다. 예를 들어, 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단에 각각 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역을 결합시키는 경우에는, 생리활성 폴리펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역 중 어느 하나를 먼저 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 결합시킨 후, 나머지 성분을 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 결합시키는 방식으로 순차적으로 반응을 진행하는 것이 목적하는 단백질 결합체 외의 부산물 생성을 최소화하여 고순도로 제조하는데 유리하다.
따라서, 상기 (a) 단계는 (i) 비펩타이드성 중합체 링커의 한쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역의 특정 위치 또는 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드를 공유결합에 의해 연결시키는 단계; (ii) 상기 반응 혼합물로부터 비펩타이드성 중합체에 면역글로불린 Fc 영역의 특정 위치 또는 생리활성 폴리펩타이드가 결합된 연결체를 균질하게 분리하는 단계; 및 (iii) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역의 특정 위치가 결합된 단백질 결합체를 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명에서 상기 (a) 단계는 (a1) 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 또는 지방산 분자가 연결된 생리활성 폴리펩타이드 중 어느 하나와 공유결합으로 연결하여 연결체를 제조하는 단계; 및 (a2) 상기 (a1) 단계에서 제조한 연결체를 분리하여, 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 지방산 분자가 연결된 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역 중 다른 하나와 공유결합으로 연결하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로 상기 (a) 단계는 (a1') 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 연결체를 제조하는 단계; 및 (a2') 상기 (a1') 단계에서 제조한 연결체를 분리하여, 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 생리활성 폴리펩타이드를 공유결합으로 연결하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
또는, 상기 (a) 단계는 (a1'') 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 생리활성 폴리펩타이드를 공유결합으로 연결하여 연결체를 제조하는 단계; 및 (a2'') 상기 (a1'') 단계에서 제조한 연결체를 분리하여, 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 (a1) 단계, (a1') 단계 또는 (a1'') 단계에서 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체 링커의 반응 몰 비는 1:1 내지 1:30이고, 면역글로불린 Fc 영역와 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비가 1:1 내지 1:20일 수 있다. 구체적으로, 상기 (a1') 단계에서 면역글로불린 Fc 영역과 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비가 1:1 내지 1:20일 수 있으며 특히 1:1 내지 1:15, 1:1 내지 1:10 또는 1:1 내지 1:4 범위일 수 있고, 상기 (a1'') 단계에서 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비가 1:1 내지 1:30일 수 있으며 특히 1:1 내지 1:15, 1:1 내지 1:10 범위일 수 있다. 상기 반응 몰 비율에 따라 제조 수율 및 비용이 최적화될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 (a1) 단계, (a1') 단계 또는 (a1'') 단계는 pH 4.0 내지 9.0에서 이루어지는 것일 수 있으며; 상기 (a1) 단계, (a1') 단계 또는 (a1'') 단계는 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지는 것일 수 있고; 상기 (a1) 단계, (a1') 단계 또는 (a1'') 단계에서 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 (a2) 단계, (a2') 단계 또는 (a2'') 단계에서 연결체 : 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 몰 비가 1:0.1 내지 1:20일 수 있으며, 특히 1:0.2 내지 1:10 범위일 수 있다. 구체적으로, 상기 (a2') 단계에서 연결체 : 생리활성 폴리펩타이드의 반응 몰 비가 1:0.1 내지 1:20인 것일 수 있으며, 상기 (a2'') 단계에서 연결체 : 면역글로불린 Fc 영역의 반응 몰 비가 1: 0.1 내지 1:20인 것일 수 있다. 상기 반응 몰 비율에 따라 제조 수율 및 비용이 최적화될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 (a2) 단계, (a2') 단계 또는 (a2'') 단계는 pH 4.0 내지 9.0에서 이루어지는 것일 수 있으며; 상기 (a2) 단계, (a2') 단계 또는 (a2'') 단계는 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지는 것일 수 있고; 상기 (a2) 단계, (a2') 단계 또는 (a2'') 단계에서 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 것일 수 있다.
한편, 본 발명의 제조방법은 (a') 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드 중 어느 하나와 공유결합으로 연결하여 연결체를 제조하는 단계로서, 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비는 1:1 내지 1:30이고, 면역글로불린 Fc 영역와 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비가 1:1 내지 1:20이며, 환원제가 1 ~ 100 mM 농도로 포함되고, pH 4.0 내지 9.0, 반응온도 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지며, 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 단계; (b') 상기 (a') 단계에서 제조한 연결체를 분리하여, 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역 중 다른 하나와 공유결합으로 연결하는 단계로서, 연결체와 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 몰 비가 1:0.1 내지 1:20이고, 환원제가 1 ~ 100 mM 농도로 포함되며, pH 4.0 내지 9.0, 반응온도 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지고, 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 단계; 및 (c') 상기 (b') 단계를 통해 제조한 공유결합으로 연결된 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역을 필수적으로 포함하고, 상기 비펩타이드성 중합체가 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단을 통해 결합한 단백질 결합체를 분리하는 단계를 포함하는, 위치 특이적 단백질 결합체의 제조방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 (a1) 단계, (a1') 단계, (a1'') 단계, (a2) 단계, (a2') 단계, 및 (a2'') 단계의 반응은, 반응에 참가하는 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단 반응기의 종류를 고려하여 필요에 따라 환원제의 존재 하에 수행될 수 있다. 본 발명에서 환원제로서, 나트륨 시아노보로하이드라이드(NaCNBH3), 수소화붕소나트륨, 디메틸아민 붕산염 또는 피리딘 붕산염 등이 사용될 수 있다. 이때 본 발명에서 환원제(예를 들어, 나트륨 시아노보로하이드라이드)의 농도와 반응용액의 온도, pH 그리고 반응에 참여하는 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역의 전체 농도가 전체적으로 제조 수율과 순도에 중요하며, 균질한 고순도의 결합체를 최대한 많이 제조해내기 위한 다양한 조건의 조합이 필요하다. 제조하고자 하는 생리활성 폴리펩타이드의 특성에 따라서 다양한 조건이 가능하며 제한되지 않으나 일반적으로 환원제(예를 들어 나트륨 시아노보로하이드라이드)는 1 ~ 100 mM 농도로 포함되고, 반응용액의 온도는 0 ~ 25 ℃, pH 4.0 ~ 9.0일 수 있으며, 반응 단백질 농도(반응시 포함되는 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 농도가 5 내지 100 ㎎/㎖인 조건일 수 있다.
한편, 상기 (a2) 단계, (a2') 단계 및 (a2'') 단계에서 연결체를 분리하는 것은 분리된 연결체에 요구되는 순도, 소수성, 분자량 및 전하량과 같은 특성을 고려하여, 단백질의 분리에 사용되는 통상의 방법들 중에서 필요에 따라 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 다양한 공지의 방법들을 적용하여 수행할 수 있으며, 필요에 따라서는 보다 높은 순도로 정제하기 위해 복수개의 서로 다른 방법을 조합하여 사용할 수 있다.
제조하고자 하는 생리활성 폴리펩타이드의 특성에 따라서 다양한 조건이 가능하나 일반적으로 비펩타이드성 중합체에 결합된 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드 연결체를 분리하기 위하여 크기 배제 크로마토그래피가 가장 적용이 쉬우나 향후 스케일업과 원하는 특정 위치가 아닌 다른 위치에 비펩타이드성 중합체가 결합된 이성질체 혹은 제조 중 생성될 수도 있는 소량의 변성체들을 분리해내기 위해서는 소수성 크로마토그래피나 이온 교환 크로마토그래피가 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 (b) 단계는 최종적으로 고순도의 결합체를 정제해내기 위해서 소수성, 분자량 및 전하량과 같은 특성을 고려하여, 단백질의 분리에 사용되는 통상의 방법들 중에서 필요에 따라 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 다양한 공지의 방법들을 적용할 수 있으며, 필요에 따라서는 보다 높은 순도로 정제하기 위해 복수개의 서로 다른 방법을 조합하여 사용할 수 있다. 제조하고자 하는 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체 및 Fc 불변영역으로 이루어진 결합체의 성질에 따라서 다양한 분리 조건이 가능하나, 일반적으로 비펩타이드성 중합체의 양 말단에 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 각각 공유결합에 의해 연결된 결합체를 분리하기 위하여 역시 크기 배제 크로마토그래피가 가장 적용이 쉽다. 하지만, 향후 대량 생산과 원하는 특정 위치가 아닌 다른 위치에 비펩타이드성 중합체를 포함한 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 이성질체나 부반응 물질들, 제조 중 생성될 수도 있는 소량의 변성체, 미반응 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역 등을 효과적으로 분리해내기 위해서는 소수성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피를 조합하는 것일 수 있다. 소수성 크로마토그래피와 이온 교환 크로마토그래피를 조합하는 방법이 바람직하며, 소수성 크로마토그래피로의 조합 또는 이온교환 크로마토그래피로의 조합도 가능하며, 제조하고자하는 결합체에 따라서는 이온교환 크로마토그래피 또는 소수성 크로마토그래피를 단독으로 사용하는 방법도 가능하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 이온 교환 크로마토그래피는 특정 pH에서 단백질이 전하성을 띠는 것을 이용하여, 전하를 띤 이온 수지가 고정된 크로마토그래피를 통과시켜 단백질의 이동 속도의 차이를 통해 단백질을 분리해내는 것으로서, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피일 수 있다.
상기 음이온 교환 크로마토그래피는 양이온 수지를 이용하는 것으로, 해당 음이온 교환 크로마토그래피를 구성하는 수지의 작용기가 쿼터너리암모늄(Q), 쿼터너리아미노에틸 (QAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 폴리에틸렌이민 (PEI), 디메틸아미노메틸(DMAE), 또는 트리메틸아미노에틸 (TMAE)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 음이온 수지를 이용하는 것으로, 해당 양이온 교환 크로마토그래피를 구성하는 수지의 작용기가 메틸설포네이트 (S), 설포프로필 (SP), 카르복시메틸 (CM), 폴리아스파르트산（Poly aspartic acid), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 또는 설포네이트(S)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 소수성 크로마토그래피는 이를 구성하는 수지의 작용기가 페닐(phenyl), 옥틸(octyl), (이소)프로필((iso)propyl), 부틸(butyl) 및 에틸(ethyl)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 크기배제 크로마토그래피는 이를 구성하는 수지가 수퍼덱스 (superdex）, 세파크릴 (sephacryl), 수퍼로즈 (superose)및 세파덱스 (sephadex)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
아울러, 본 발명에서 친화성 크로마토그래피는 특정 단백질과 상호작용할 수 있는 리간드가 부착된 수지를 이용하여, 해당 리간드와 상호작용을 하는지 여부에 따라 단백질 이동 속도의 차이를 이용하여 단백질을 분리해내는 것으로, 상기 친화성 크로마토그래피를 구성하는 수지의 작용기는 프로테인에이 (proteinA), 헤파린 (heparin), 블루 (blue), 벤자미딘 (benzamidine), 금속이온 (코발트, 니켈, 구리) 및 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 생리활성 폴리펩타이드와 결합된 단백질 결합체의 구성 성분의 일부 혹은 전체에 대한 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단백질 결합체 또는 상기 단백질 결합체 제조방법에 따라 제조된 단백질 결합체를 유효성분으로 포함하는 생리활성 폴리펩타이드의 생체 내 지속성 및 안정성이 증가된 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 알약, 분말, 새세이 (sachet), 엘릭서 (elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 단백질 결합체의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 생리활성 폴리펩타이드의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 단백질 결합체는 혈중 지속성과 생체 내 역가가 매우 우수하므로, 본 발명의 단백질 결합체를 포함하는 펩타이드 제제의 투여량, 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 아실화된 천연형 인슐린 및 면역글로불린 Fc가 비펩티드성 중합체에 의해 연결된 결합체의 제조
아실화된 천연형 인슐린이 면역글로불린 Fc 절편에 비펩티드성 중합체로 연결된 결합체를 제조하였다.
구체적으로, 아실화된 인슐린으로서, 12-도데칸산을 통하여 천연형 인슐린이 4-카르복시-3-플루오로-페닐보론산 (PBA-F)에 연결된 아실화 인슐린(이하 이를 Ins-PBA-F로 약칭함)을 인용된 문헌에 있는 방법을 사용하여 합성하여 결합체 제조에 사용하였다(Chou 외, PNAS 통권 112, 제 8호, 2401~2406쪽).
구체적으로, 12-도데칸산으로부터 합성을 시작하여 일반 조건에서 DCC (dicyclohexylcarbodiimide)/NHS(N-hydroxysuccinimide) 커플링 반응을 이용하여 인슐린의 B 사슬 29번 라이신 잔기의 ε-아미노기가 12-도데칸산의 카르복시기와 아미드 결합으로 연결하였다.
인슐린의 아실화에 이용되는 12-(4-보로노-2-플루오로벤자미도) 도데칸산의 제조 방법은 다음과 같다.
(3-플루오로-4-((12-메톡시-12-옥소도데실)카바모일)페닐)보론산 (5.15 g, 13.04 mmol) 및 수산화리튬 (1.56 g, 65.20 mmol)을 3:1 MeOH/물 용액 (80 mL)에서 녹였다. 질소 존재하에서 밤새 섞어가면서 반응을 하였고, 용매는 진공으로 제거하였다. 그 후, 상기 반응물을 물에 녹인 후, 1 N HCl를 이용해 pH 1로 산성화 시킨 후, 침전물을 필터로 수득하였다. 컬럼 크로마토그래피 (DCM 내에 0-20% MeOH)로 백색 산물을 얻었다 (3.23 g, 8.48 mmol, 65%).
1H NMR (CD3OD) δ7.73 (m, 3H), δ3.35 (t, 2H), δ2.26 (t, 2H),δ1.60 (m, 4H), δ1.31 (m, 14H) 13C NMR (CD3OD) δ177.0, 129.7, 127.7, 121.1, 121.0, 40.3, 34.2, 29.9, 29.7, 29.5, 27.3, 25.4 HRMS: calculated 381.2123; found: 381.2124
인슐린의 아실화는 다음의 방법으로 수행하였다.
상기 12-(4-보로노-2-플루오로벤자미도) 도데칸산, 또는 미리스트산 (20.67 μmol), N,N′-디사이클로헥실카보디이미드 (4.26 mg, 20.67 μmol), 및 N-하이드록시석시니이미드 (2.38 mg, 20.67 μmol)를 테트라히드로푸란 (1 mL)에서 녹이고, 실온에서 4 시간 섞어 주었다.
천연형 인슐린 (100 mg, 17.23 μmol)을 0.1 M Na2CO3 (1 mL)에서 녹이고, 그 후 상기 저어주면서 반응시키고 있는 12-(4-보로노-2-플루오로벤자미도) 도데칸산 반응물에 첨가하였다. 1시간 후, 0.2 M CH3NH2 (1 mL) 및 6 N HCl (26 μL)을 상기 반응물에 첨가하였다. 반응 결과 용액 및 침전물은 원심분리하였고, 펠렛을 DMSO (2 mL)에 재현탁하였다. 생성물을 역상 HPLC (Atlantis C18 column (250 × 10 mm, 5 μm; Waters))로 정제하였다. 분획물을 수집하고, 갑압하에 동결건조하여 백색 산물을 수득하였다. 상기 산물은 QSTAR hybrid Q-TOF (Koch Institute Swanson Biotechnology Center Biopolymers and Proteomics core)를 이용해 디콘볼루션 ESI로 확인하였다.
수득된 질량은 다음과 같다: Ins-PBA-F, 예측: 6153, 실제 6115.
이 아실화 인슐린에서는 파라카르복시페닐보론산이 12-도데칸산의 아미노기와, 천연형 사람 인슐린의 B 사슬 29번 라이신의 ε-아미노기가 12-도데칸산의 카르복시기와 아미드 결합으로 연결되어 있다. 이의 모식도는 도 4에 나타냈다. 아실화된 천연형 인슐린은 (PBA-F)-지방산-천연형 인슐린과 혼용된다.
이어서 3.4K PropionALD(2) PEG(양 말단에 각각 프로피온알데히드기를 가지도록 변형된 분자량 3.4 kDa인 폴리에틸렌글리콜, 일본 NOF사)를 Ins-PBA-F의 N-말단에 연결하기 위하여, Ins-PBA-F와 3.4K PropionALD(2) PEG의 몰비를 1:4, Ins-PBA-F의 농도를 5㎎/㎖로 하여 4~8℃에서 약 2시간 동안 반응시켰다. 이때, 반응은 50mM 소디움 시트레이트(sodium citrate) 완충액(pH 5.0)과 아이소프로판올의 혼합용매에 환원제인 소디움 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride(NaCNBH3))가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액은 20mM 소디움 시트레이트(sodium citrate)(pH 3.0), 에탄올이 포함된 버퍼와 0.25M KCl 농도 구배를 이용하여 SP Sepharose High Performance (GE, 미국)에 적용하여 모노-페길화된(Monopegylated) (PBA-F)-지방산-천연형 인슐린를 정제하였다.
다음으로, 상기 정제된 모노-페길화된 Ins-PBA-F와 면역글로불린 Fc의 N말단에 결합하기 위하여 반응 몰비 1:1.2, 총 단백질의 농도를 약 20㎎/㎖로 하여 약 20~25℃에서 약 16시간 동안 반응시켰다. 반응액은 100mM 헤페스(HEPES) 완충액(pH8.2)와 염화나트륨에 환원제인 소디움 시아노보로하이드라이드가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액은 20mM 트리스(Tris)(pH 7.5)와 0.15M 염화나트륨 농도 구배를 이용하여 Source15Q(GE, 미국)에 적용하고, 황산암모늄과 20mM 트리스(pH7.5)의 농도 구배를 이용하여 SourceISO(GE, 미국)에 적용하여 면역글로불린 Fc에 Ins-PBA-F이 PEG에 의하여 공유결합으로 연결된 결합체를 정제하였다
정제된 결합체는 IE-HPLC, SE-HPLC, RP-HPLC 및 SDS-PAGE를 사용하여 순도를 분석하였으며 95% 이상의 순도를 갖는 것을 확인하였다 (도 1a 및 도 2a).
실시예 2. 아실화된 인슐린 아날로그 및 면역글로불린 Fc가 비펩티드성 중합체에 의해 연결된 결합체의 제조
아실화된 인슐린 아날로그가 면역글로불린 Fc 절편에 비펩티드성 중합체로 연결된 결합체를 제조하였다. 인슐린 아날로그로는 국제특허공개 제 2014/133324호의 실시예에 기재된 인슐린 A 쇄 또는 B 쇄 중 아미노산이 변이된 인슐린 아날로그들을 이용하였다.
하기 표 1에 상기 인슐린 아날로그들 각각의 A쇄 또는 B쇄의 아미노산의 변화 서열 및 아날로그 이름을 나타냈다. 즉, 아날로그 1의 경우 A 쇄의 1번 글리신이 알라닌으로 치환, 아날로그 4의 경우 B쇄의 8번 글리신이 알라닌으로 치환된 형태이다.
Figure PCTKR2018011616-appb-T000001
하기 표 2에는 구체적인 인슐린 아날로그 1 내지 9의 DNA 서열 및 단백질 서열을 나타냈다.
아날로그 서열 서열번호
Analog 1 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GCG ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC 1
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Ala Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 2
Analog 2 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC GCG GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC 3
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ala Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 4
Analog 3 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC GCG TGC AAC 5
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Ala Cys Asn 6
Analog 4 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GCG TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC 7
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Ala Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 8
Analog 5 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GCG TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC 9
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Ala Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 10
Analog 6 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC GCG TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC 11
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Ala Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 12
Analog 7 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC GCG TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC 13
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ala Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 14
Analog 8 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC GAA CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC TGA 15
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 16
Analog 9 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC AAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC TGA 17
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Asn Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 18
천연형 인슐린 대신 인슐린 아날로그를 사용한 것 외에는 실시예 1에 기재된 실험 절차를 그대로 따랐으며 아날로그 결합체는 95% 이상의 순도를 나타내었다. (도 1b 및 도 2b). 아실화된 인슐린 아날로그는 (PBA-F)-지방산-인슐린 아날로그와 혼용된다.
실시예 3. 아실화된 천연형 인슐린 결합체와 아실화된 인슐린 아날로그 결합체의 in vitro 활성 비교
본 발명의 비펩타이드성 중합체가 결합된 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 링커인 비펩타이드성 중합체에 연결된 단백질 결합체가 기존 단백질 결합체와 비교하여 상대 역가가 감소하여 역가가 우수한지 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 상기 실시 예 1 및 2에서 제조한 (PBA-F)-지방산이 연결된 천연형 및 인슐린 아날로그 지속형 단백질 결합체의 in vitro 활성 확인을 위해, 인간 인슐린 수용체 (human insulin receptor)를 과다 발현시킨 CHO (chinese hamster ovary) 세포 주를 이용하여 인슐린 수용체의 인산화 (phosphorylation)를 측정하는 방법을 이용하였다.
상기 세포주를 1주일에 2 또는 3회 계대배양 하였고, 96 웰 플레이트에 5x104개의 인간 인슐린 수용체가 발현된 CHO 세포를 각각 분주하여 24시간 동안 배양하였다.
지속형 인슐린 아날로그 역가 확인 및 비교를 위해 인간 인슐린을 344.4nM 부터 3배씩 0.2nM까지 연속적으로 희석하고, 지속형 인슐린 아날로그와 지속형 인슐린 아날로그를 20037.1nM 부터 3배씩 9.2nM까지 연속적으로 희석하였다. 상기 배양된 인간 인슐린 수용체가 발현된 CHO 세포를 KRB 완충액으로 세척하고, 연속적으로 희석된 각 물질들을 100㎕씩 상기 세포에 첨가한 다음, 10분 동안 37℃의 온도조건으로 CO2 배양기에서 배양하였다. 그런 다음, 세포 용해 완충액 (cell lysis buffer)를 25㎕씩 가하여 세포를 용해시켰다, 상기 세포 용해물을 Phospho-Insulin Receptor β Sandwich ELISA kit (Cell signaling, USA)에 적용하여 인산화된 인슐린 수용체를 측정하고, 이로부터 EC50값을 산출한 후, in vitro 활성을 비교하였다. 2회 반복 시험에 의한 각 물질의 EC50값 및 인간 인슐린 대비 상대 역가는 하기 표 3에 나타내었다. 실시예 1과 2의 결합체의 역가는 아실화되지 않은 인간 천연형 인슐린, 아실화되지 않은 천연형 인슐린을 사용한 것 외에는 실시예 1과 동일한 구조 천연형 인슐린 Fc 결합체(천연형 인슐린-면역글로블린 Fc 결합체)와 아실화되지 않은, 실시예 2와 동일한 서열의 인슐린 아날로그를 사용한 것 외에는 실시예 2와 동일한 구조 인슐린 아날로그 Fc 결합체(인슐린 아날로그-면역글로블린 Fc 결합체)와 대비하였다. 실시예 1과 2를 제외한 이들 대비용 결합체들은 WO2014133324에 기재한 대로 제조하였다. 인간 천연형 인슐린을 기준으로 하였을 때, 천연형 인슐린-면역글로블린 Fc 결합체, 인슐린아날로그-면역글로불린 Fc 결합체, 실시예 1의 아실화된 천연형 인슐린-면역글로불블린 Fc 결합체, 실시예 2의 아실화된 인슐린아날로그-면역글로불린Fc 결합체의 in vitro 활성은 각각 5.4, 2.1, 2.8 및 2.2% 였다.
시험 물질 EC50 (nM) % activity vs.인간 천연형 인슐린
천연형 인슐린 14.2±0.8 100
천연형 인슐린-면역글로불린 Fc 결합체 264.8±31.8 5.4±0.3
인슐린 아날로그-면역글로블린 Fc 결합체 675.2±90.2 2.1±0.1
실시예 1의 아실화된 천연형 인슐린 결합체 520.1±68.8 2.8±0.2
실시예 2의 아실화된 인슐린 아날로그 결합체 661.4±7.0 2.2±0.1
상기와 같은 결과들은 본 발명에서 새롭게 개발한 비펩타이드성 중합체로 개질된 생리활성 폴리펩타이드 지속형 단백질 결합체의 in vitro 역가가 유사하여 비펩타이드성 중합체로의 개질이 in vitro상에서 문제가 되지 않는 것을 시사하는 것이다.
이에 본 발명자들은 상기 비펩타이드성 중합체로 개질된 생리활성 폴리펩타이드 지속형 단백질 결합체가 실제 생체 내에서 효력이 향상되는 지를 확인하기 위해 하기 in vivo 효력 실험을 수행하였다.
실시예 4. 아실화된 천연형 인슐린 결합체와 아실화된 인슐린 아날로그 결합체의 in vivo 효력 비교
본 발명의 비펩타이드성 중합체가 결합된 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 링커인 비펩타이드성 중합체에 연결된 단백질 결합체가 기존 단백질 결합체와 비교하여 생체 내 지속성이 증가되었는지를 확인하고자 하였다.
당뇨 동물 모델로 널리 사용되고 있는 STZ (streptozotocin) 유도된 당뇨 마우스를 이 연구를 위해 사용하였다. 당뇨 마우스 유도를 위해 7주령 C57BL/6 마우스를 4시간 동안 절식시킨 후 STZ를 50 mg/kg (10 mM citrate buffer, pH 4.5)을 단회 투여하였다. STZ 투여 4-7일 후, 혈당 측정기 (OneTouch® Ultra®, LifeScan, Inc., USA)를 사용하여 당뇨가 유발되었는지 여부를 확인하였으며, 혈당이 ~400 mg/mL에 도달한 당뇨 마우스만을 시험에 사용하였다.
당뇨 마우스는, 군 1: Vehicle (단회 주사), 군 2: 인슐린 아날로그-면역글로블린 Fc 결합체 100 nmol/kg (단회 주사), 군 3: (PBA-F)-지방산-인슐린 아날로그-면역글로블린 Fc 결합체 100 nmol/kg (단회 주사), 군 4: (PBA-F)-지방산-천연형 인슐린-면역글로블린 Fc 결합체 100 nmol/kg (단회 주사)로 분리되어 시험 물질 투여가 진행되었다. 연구 기간 동안 혈당은 시험 물질 투여 후 0, 2, 4, 8 시간, 1, 1.25, 2, 2.25, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 일에 측정되었으며, 측정된 10일 동안의 혈당 변화 값을 이용하여 AUC을 산출하였다. 통계 처리는 1원 ANOVA를 사용하여 부형제 군 및 시험 군 사이를 비교하였다.
혈당 변화 및 산출 된 AUC 값은 도 3에 나타내었다. Vehicle 투여 군 대비, 인슐린 아날로그-면역글로블린 Fc 결합체, (PBA-F)-지방산-인슐린 아날로그-면역글로블린 Fc 결합체, (PBA-F)-지방산-천연형 인슐린-면역글로블린 Fc 결합체는 각각 -11, -27, -8%의 혈당 감소 효력을 나타냈다.
상기와 같은 결과는 본 발명에서 새롭게 개발된 비펩타이드성 중합체로 개질된 생리활성 폴리펩타이드 지속형 단백질 결합이 기존 단백질 결합체에 비해 in vivo 효과가 우수함을 시사하는 결과이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (52)

  1. 지방산 분자로 개질된 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 링커를 통하여 연결된, 단백질 결합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 지방산 분자로 개질된 생리활성 폴리펩타이드는 하나 이상의 지방산 분자가 생리활성 폴리펩타이드에 결합된 것으로, 상기 개질에 사용된 지방산 분자는 상기 면역글로불린 Fc 영역에 연결되지 않은 것을 특징으로 하는 것인, 단백질 결합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드를 개질한 지방산 분자는 지방산 또는 지방산 유도체인 것인, 단백질 결합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체 링커가 양 말단 반응기를 통해 지방산 분자로 개질된 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역과 각각 공유결합으로 연결된, 단백질 결합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 비당쇄화됨을 특징으로 하는 단백질 결합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 단백질 결합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 힌지 (hinge) 영역을 추가로 포함하는 단백질 결합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, 이들의 조합(combination) 및 이들의 하이브리드(hybrid)의 Fc 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역글로불린 Fc 단편인, 단백질 결합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 이들의 조합 및 이들의 하이브리드의 Fc 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단백질 결합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 단편이 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 단백질 결합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 단편이 IgG4 Fc 단편인 단백질 결합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 단편이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 단편인 단백질 결합체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체 링커는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 지방산, 지방산 유도체, 키틴, 히알루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단백질 결합체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체 링커는 지방산, 지방산 유도체 또는 폴리에틸렌글리콜인 단백질 결합체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체 링커의 양 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단, 라이신 잔기, 또는 알지닌 잔기와 생리활성 폴리펩타이드의 N 말단, C 말단, 라이신 잔기, 히스티딘 잔기 또는 시스테인 잔기, 또는 각 말단 또는 잔기의 유리 반응기에 결합되어 있는 것인, 단백질 결합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드가 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질 및 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 결합체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드는 인간 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론류, 인터페론 수용체류, 콜로니 자극인자류, 글루카곤-유사 펩타이드류 (GLP-1등), 엑센딘류 (Exendin4 등), 옥신토모듈린, 지프로테인 관련수용체 (G-protein-coupled receptor), 인터루킨류, 인터루킨 수용체류, 효소류, 인터루킨 결합 단백질류, 사이토카인 결합 단백질 류, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백 질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 VII, VIIa, VIII, IX, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토 메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체류, 수용체 길항물질, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 단편류 및 각각의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단백질 결합체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드는 인간 성장 호르몬, 인터페론-알파, 과립구 콜로니자극인자, 적혈구 생성인자, 혈액인자, 인슐린, 옥시토모듈린, 글루카곤-유사 펩타이드류, 엑센딘류 및 각각의 유도체 또는 아날로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단백질 결합체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드는 인슐린 또는 이의 아날로그이며, 상기 생리활성 폴리펩타이드를 개질한 지방산 분자는 지방산 또는 지방산 유도체이며, 상기 비펩타이드 중합체 링커는 폴리에틸렌 글리콜인, 단백질 결합체.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 인슐린 아날로그는 인슐린 B쇄의 8번 아미노산, 인슐린 B쇄의 23번 아미노산, 인슐린 B쇄의 24번 아미노산, 인슐린 B쇄의 25번 아미노산, 인슐린 A쇄의 1번 아미노산, 인슐린 A쇄의 2번 아미노산 및 인슐린 A쇄의 19번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 아미노산이 알라닌으로 치환되거나, A쇄의 14번 아미노산이 글루탐산 또는 아스파라긴으로 치환된 것인, 단백질 결합체.
  21. (a) 하나 이상의 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드 및 하나 이상의 면역글로불린 Fc 영역을 양 말단에 반응기를 갖는 하나 이상의 비펩타이드성 중합체 링커를 통해 공유결합으로 연결하여 단백질 결합체를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계를 통해 제조한 비펩타이드성 중합체 링커를 통해 공유결합으로 연결된, 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역을 필수적으로 포함하고, 상기 비펩타이드성 중합체 링커가 면역글로불린 Fc 단편에 결합한 단백질 결합체를 분리하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 단백질 결합체 제조방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체 또는 지방산 분자의 반응기는 알데히드기, 말레이미드기 및 석신이미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제조방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 알데히드기는 프로피온알데히드기 또는 부틸알데히드기인 것인, 제조방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 석신이미드 유도체가 석신이미딜 카르복시메틸, 석신이미딜 발레르에이트, 석신이미딜 메틸부타노에이트, 석신이미딜 메틸프로피온에이트, 석신이미딜 부타노에이트, 석신이미딜 프로피온에이트, N-하이드록시석신이미드인 또는 석신이미딜 카보네이트인, 제조방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체 링커는 각 말단에 각각 알데히드 그룹, 말레이미드 반응기 또는 석신이미드 유도체를 갖는 것인, 제조방법.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지방산 분자는 각 말단에 각각 알데히드 그룹, 말레이미드 반응기 또는 석신이미드 유도체를 갖는 것인, 제조방법.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항 에 있어서, 상기 (a) 단계는
    (a1) 비펩타이드성 중합체 링커의 한쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 또는 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드 중 어느 하나와 공유결합으로 연결하여 연결체를 제조하는 단계; 및
    (a2) 상기 (a1) 단계에서 제조한 연결체를 분리하여, 분리된 연결체의 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드의 다른 쪽 말단에 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역 중 다른 하나와 공유결합으로 연결하는 단계를 포함하는, 제조방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 (a1) 단계에서 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체 링커의 반응 몰 비는 1:1 내지 1:30이고, 면역글로불린 Fc 단편과 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비가 1:1 내지 1:20인 것인, 제조방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 (a1) 단계는 pH 4.0 내지 9.0에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  30. 제27항에 있어서, 상기 (a1) 단계는 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a1) 단계에서 면역글로불린 Fc 영역 또는 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  32. 제27항에 있어서, 상기 (a2) 단계에서 연결체 : 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 몰 비가 1:0.1 내지 1:20인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  33. 제27항 또는 제32항에 있어서, 상기 (a2) 단계는 pH 4.0 내지 9.0에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  34. 제27항 또는 제32항에 있어서, 상기 (a2) 단계는 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  35. 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a2) 단계에서 면역글로불린 Fc 영역 또는 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  36. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a1) 단계 및 (a2) 단계가 환원제의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 것인, 제조방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 환원제가 나트륨 시아노보로하이드라이드(NaCNBH3), 수소화 붕소나트륨, 디메틸아민 붕산염 및 피리딘 붕산염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제조방법.
  38. 제27항에 있어서, 상기 (a2) 단계에서 연결체를 분리하기 위하여 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 크기배제 크로마토그래피로부터 선택되는 정제방법을 단독 또는 복수개로 수행하는 것인, 제조방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 쿼터너리암모늄(Q), 쿼터너리아미노에틸 (QAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 폴리에틸렌이민 (PEI), 디메틸아미노메틸(DMAE), 또는 트리메틸아미노에틸 (TMAE)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법.
  40. 제37항에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 메틸설포네이트 (S), 설포프로필 (SP), 카르복시메틸 (CM), 폴리아스파르트산（Poly aspartic acid), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 또는 설포네이트(S)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법.
  41. 제38항에 있어서, 상기 소수성 크로마토그래피의 수지의 작용기가 페닐(phenyl), 옥틸(octyl), (이소)프로필((iso)propyl), 부틸(butyl) 및 에틸(ethyl)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법.
  42. 제38항에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피의 수지의 작용기가 프로테인A (proteinA), 헤파린 (heparin), 블루 (blue), 벤자미딘 (benzamidine), 금속이온 (코발트, 니켈, 구리) 및 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 생리활성 폴리펩타이드와 결합된 단백질 결합체의 구성 성분의 일부 혹은 전체에 대한 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법.
  43. 제38항에 있어서, 상기 크기배제 크로마토그래피의 수지가 수퍼덱스 (superdex）, 세파크릴 (sephacryl), 수퍼로즈 (superose)및 세파덱스 (sephadex)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것중 하나인, 제조방법.
  44. 제21항에 있어서, 상기 (b) 단계의 단백질 결합체를 분리하는 단계는 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피로 또는 크기배제 크로마토그래피로 부터 선택되는 정제방법을 단독 또는 복수개로 수행하는, 제조방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 쿼터너리암모늄(Q), 쿼터너리아미노에틸 (QAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 폴리에틸렌이민 (PEI), 디메틸아미노메틸(DMAE), 또는 트리메틸아미노에틸 (TMAE)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 메틸설포네이트 (S), 설포프로필 (SP), 카르복시메틸 (CM), 폴리아스파르트산（Poly aspartic acid), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 또는 설포네이트(S)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법.
  47. 제44항에 있어서, 상기 소수성 크로마토그래피의 수지의 작용기가 페닐(phenyl), 옥틸(octyl), (이소)프로필((iso)propyl), 부틸(butyl) 및 에틸(ethyl)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법.
  48. 제44항에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피의 수지의 작용기가 프로테인에이 (proteinA), 헤파린 (heparin), 블루 (blue), 벤자미딘 (benzamidine), 금속이온 (코발트, 니켈, 구리) 및 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드와 결합된 단백질 결합체의 구성 성분의 일부 혹은 전체에 대한 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법.
  49. 제44항에 있어서, 상기 크기배제 크로마토그래피의 수지의 작용기가 수퍼덱스 (superdex）, 세파크릴 (sephacryl), 수퍼로즈 (superose) 및 세파덱스 (sephadex)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법.
  50. 제21항에 있어서, 상기 (b) 단계는 단백질 결합체를 구성하는 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역이 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단을 통해 결합한 단백질 결합체를 분리하는 것을 특징으로 하는 것인, 제조방법.
  51. (a') 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 또는 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드 중 어느 하나와 공유결합으로 연결하여 연결체를 제조하는 단계로서, 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비는 1:1 내지 1:30이고, 면역글로불린 Fc 영역와 비펩타이드성 중합체 링커의 반응 몰 비가 1:1 내지 1:20이며, 환원제가 1 ~ 100 mM 농도로 포함되고, pH 4.0 내지 9.0, 반응온도 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지며, 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 단계;
    (b') 상기 (a') 단계에서 제조한 연결체를 분리하여, 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체 링커의 다른 쪽 말단에 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역 중 다른 하나와 공유결합으로 연결하는 단계로서, 연결체와 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드 링커의 반응 몰 비가 1:0.1 내지 1:20이고, 환원제가 1 ~ 100 mM 농도로 포함되며, pH 4.0 내지 9.0, 반응온도 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지고, 면역글로불린 Fc 영역 또는 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 단계; 및
    (c') 상기 (b') 단계를 통해 제조한 공유결합으로 연결된 지방산 분자가 연결되어 있는 형태의 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체 링커 및 면역글로불린 Fc 영역을 필수적으로 포함하고, 상기 지방산 분자가 면역글로불린 Fc와 결합한 단백질 결합체를 분리하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 단백질 결합체 제조방법.
  52. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 단백질 결합체를 유효성분으로 포함하는 생리활성 폴리펩타이드의 생체 내 지속성 및 안정성 증가용 약학적 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3578204A4 (en) * 2017-02-03 2021-01-06 Hanmi Pharm. Co., Ltd. BIOACTIVE SUBSTANCE CONJUGATE WITH ENHANCED DURABILITY AND ITS USE

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
CN116585466A (zh) 2018-05-10 2023-08-15 瑞泽恩制药公司 含有高浓度vegf受体融合蛋白的制剂
KR20220036720A (ko) * 2020-09-16 2022-03-23 한미정밀화학주식회사 폴리에틸렌글리콜 유도체, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조 방법

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996032478A1 (en) 1995-04-14 1996-10-17 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6410008B1 (en) 1994-12-12 2002-06-25 Beth Israel Hospital Association Chimeric IL-10 proteins and uses thereof
US6444792B1 (en) 1996-02-02 2002-09-03 Repligen Corporation CTLA4-Cγ4 fusion proteins
KR20050047032A (ko) 2003-11-13 2005-05-19 한미약품 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 단백질 결합체 및 그의제조방법
KR101058290B1 (ko) 2007-01-05 2011-08-22 한미홀딩스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 인슐린분비 펩타이드 약물결합체
KR20140106452A (ko) 2013-02-26 2014-09-03 한미약품 주식회사 신규한 인슐린 아날로그 및 이의 용도
KR20140106455A (ko) * 2013-02-26 2014-09-03 한미약품 주식회사 인슐린 위치 특이적 결합체
KR20150140177A (ko) * 2014-06-05 2015-12-15 한미약품 주식회사 단백질 및 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법
KR20170065016A (ko) * 2015-12-02 2017-06-12 한미약품 주식회사 지방산 유도체를 이용한 단백질 결합체 및 이의 제조방법

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01254699A (ja) * 1988-04-05 1989-10-11 Kodama Kk インスリン誘導体及びその用途
NZ273285A (en) * 1993-09-17 1997-10-24 Novo Nordisk As Insulin derivatives and compositions thereof
US7238663B2 (en) * 2001-08-28 2007-07-03 Eli Lilly And Company Pre-mixes of GLP-1 and basal insulin
US20050176108A1 (en) * 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
KR100754667B1 (ko) * 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
TW200722436A (en) * 2005-10-21 2007-06-16 Hoffmann La Roche A peptide-immunoglobulin-conjugate
UA113626C2 (xx) * 2011-06-02 2017-02-27 Композиція для лікування діабету, що містить кон'югат інсуліну тривалої дії та кон'югат інсулінотропного пептиду тривалої дії
KR20130049671A (ko) * 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
AR090281A1 (es) * 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
AR092862A1 (es) * 2012-07-25 2015-05-06 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de insulina de accion prolongada y un peptido insulinotropico y metodo de preparacion
AR091902A1 (es) * 2012-07-25 2015-03-11 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de un conjugado de insulina de accion prolongada
KR101993393B1 (ko) * 2012-11-06 2019-10-01 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 당뇨병 또는 비만성 당뇨병 치료용 조성물
ES2743612T3 (es) * 2013-03-05 2020-02-20 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Procedimiento de preparación mejorado para producción de alto rendimiento de un conjugado de polipéptido fisiológicamente activo
KR101895634B1 (ko) * 2013-05-31 2018-09-05 한미약품 주식회사 변이된 힌지 영역을 포함하는 IgG4 Fc 단편
AR096891A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
KR102406654B1 (ko) * 2014-01-20 2022-06-10 한미약품 주식회사 지속형 인슐린 및 그 용도
AR100639A1 (es) * 2014-05-29 2016-10-19 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composición para tratar diabetes que comprende conjugados de análogos de insulina de acción prolongada y conjugados de péptidos insulinotrópicos de acción prolongada
TWI684458B (zh) * 2014-05-30 2020-02-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 包含胰島素及ｇｌｐ-１/昇糖素雙重促效劑之治療糖尿病之組成物
KR102005456B1 (ko) * 2015-06-30 2019-07-30 한미약품 주식회사 신규 글루카곤 유도체 및 이의 지속형 결합체를 포함하는 조성물

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6410008B1 (en) 1994-12-12 2002-06-25 Beth Israel Hospital Association Chimeric IL-10 proteins and uses thereof
WO1996032478A1 (en) 1995-04-14 1996-10-17 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6444792B1 (en) 1996-02-02 2002-09-03 Repligen Corporation CTLA4-Cγ4 fusion proteins
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
KR20050047032A (ko) 2003-11-13 2005-05-19 한미약품 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 단백질 결합체 및 그의제조방법
KR101058290B1 (ko) 2007-01-05 2011-08-22 한미홀딩스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 인슐린분비 펩타이드 약물결합체
KR20140106452A (ko) 2013-02-26 2014-09-03 한미약품 주식회사 신규한 인슐린 아날로그 및 이의 용도
KR20140106455A (ko) * 2013-02-26 2014-09-03 한미약품 주식회사 인슐린 위치 특이적 결합체
WO2014133324A1 (ko) 2013-02-26 2014-09-04 한미약품 주식회사 신규한 인슐린 아날로그 및 이의 용도
KR20150140177A (ko) * 2014-06-05 2015-12-15 한미약품 주식회사 단백질 및 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법
KR20170065016A (ko) * 2015-12-02 2017-06-12 한미약품 주식회사 지방산 유도체를 이용한 단백질 결합체 및 이의 제조방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BHATNAGAR, S.: "Molecular variants and derivatives of insulin for improved glycemic control in diabetes", PROGRESS IN BIOPHYSICS AND MOLECULAR BIOLOGY, vol. 91, 2006, pages 199 - 228, XP025078418, DOI: doi:10.1016/j.pbiomolbio.2005.05.012 *
CHOU ET AL., PNAS, vol. 112, no. 8, pages 2401 - 2406
H. NEURATHR. L. HILL: "The Proteins", 1979, ACADEMIC PRESS

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3578204A4 (en) * 2017-02-03 2021-01-06 Hanmi Pharm. Co., Ltd. BIOACTIVE SUBSTANCE CONJUGATE WITH ENHANCED DURABILITY AND ITS USE

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