WO2019066609A1 - 링커로서 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물을 포함하는 단백질 결합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

링커로서 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물을 포함하는 단백질 결합체 및 이의 제조방법 Download PDF

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송지영
김은정
이종민
이종수
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Definitions

  • the present invention relates to a protein conjugate in which a physiologically active polypeptide and a biocompatible substance are linked to each other through a non-peptide polymer-linked fatty acid derivative compound so that the duration of physiological activity is prolonged compared to that in a native form, and a method for producing the same.
  • physiologically active polypeptides are poorly stable, easily denatured, degraded by proteolytic enzymes in the blood, and readily removed through the kidneys and liver. Therefore, in order to maintain the blood concentration and titer of the protein drug containing the physiologically active polypeptide as the pharmacological component, it is necessary to frequently administer the protein drug to the patient.
  • protein drugs that are administered to patients in the form of injections, frequent injections to maintain blood levels of the active polypeptide cause great pain to the patient.
  • efforts have been made to increase the stability of protein drugs in blood and to maintain the drug concentration in blood for a long time to maximize the drug efficacy.
  • Such a sustained-release formulation of a protein drug should not cause an immune response to the patient while enhancing the stability of the protein drug.
  • PEG &quot polyethylene glycol
  • Free fatty acids are known to bind to human serum albumin (HAS) (Curry S. et al. , Biochim, Biophys. Acta, 1441: 131-140, 1999). Due to this feature, when fatty acids are combined with therapeutic drugs (e.g., proteins, peptides, siRNA) and administered to the human body, they bind by noncovalent binding with albumin in blood having affinity for fatty acids. The albumin-drug conjugate thus formed is known to increase the half-life of blood by lowering the protein hydrolysis or membrane-membrane absorption rate.
  • Therapeutic drugs already associated with FDA and EMA approved fatty acid derivatives include Levemir ® (insulin detemir, Novo Nordisk) and Victoza ® (liraglutide [rDNA origin] injection, Novo Nordisk).
  • Another object of the present invention is to provide a protein conjugate in which a physiologically active polypeptide and a biocompatible substance are covalently linked to a linker, a non-peptide polymer-bonded fatty acid derivative compound.
  • One embodiment of the present invention is a non-peptide polymeric conjugated fatty acid derivative compound represented by the following formula (1), a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • L 1 to L 3 each independently represents a straight-chain or branched-chain C 1-6 alkylene
  • R 1 and R 2 each independently represent 2,5-dioxopyrrolidinyl, 2,5- pyrrolyl, aldehydes, maleimides, C 6-20 aryl disulfide, C 5-20 heteroaryl disulfide, vinyl sulfone, thiol, halogenated acetamide, succinimide, p- nitrophenyl carbonate, C 7-10 alkynyl, disulfide ortho
  • M1 to m3 are each independently a natural number of from 1 to 2400 and n is a natural number of from 1 to 40.
  • R 1 and R 2 which correspond to the reactors of the non-peptide polymeric conjugated fatty acid derivative compounds contained in the protein conjugate according to the present invention, are each independently selected from the group consisting of maleimide, N-hydroxysuccinimide, , C 1-4 alkylene aldehyde, orthopyridyl disulfide (OPSS), iodoacetamide (IA), halogenated acetamide including bromine, fluorine, chlorine or astatine instead of iodine, di Difluorocyclooctyne (DIFO), dibenzocyclooctyne (DIBO), dibenzo-aza-cyclooctyne (DIBAC or DBCO), biarylazacyclooctynones (BARAC) , Tetramethylthiacycloheptyne (TMTH), bicyclononyne (BCN), Sondheimer diyne, The use of cyclooct
  • L 1 to L 3 each independently represents a linear or branched C1-6 alkylene
  • Non-Pep is a non-peptide polymer
  • m1 and m2 are each independently a natural number of 1 to 2400
  • the non-peptide polymer-conjugated fatty acid derivative compound has two reactors directly linked to the fatty acid skeleton or through a linker, and the biologically active polypeptide and the biosynthetic polypeptide Each of which is connected to a conformable material.
  • the non-peptide polymer-bound fatty acid derivative compound functions as a linker connecting the biologically active polypeptide and the biocompatible substance.
  • the non-peptide polymeric-linked fatty acid derivative compound contained in the protein conjugate according to the present invention has two or more reactors directly linked to the fatty acid skeleton or through a linker, and the biologically active polypeptide and the biocompatible Respectively.
  • the linker of the non-peptide polymer-bonded fatty acid derivatives contained in the protein conjugate according to the present invention C 1-3 alkylamino, (C 1-3 alkoxy) n (C 1 -3 alkylamino) < / RTI > chain.
  • the non-peptide polymer of the non-peptide polymer-bonded fatty acid derivative compound contained in the protein conjugate according to the present invention may be polyethylene glycol homopolymer, polypropylene glycol homopolymer, ethylene glycol- Glycolic acid copolymer, glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer, lipid polymer, fatty acid, chitin, hyaluronic acid and combinations thereof.
  • the non-peptide polymer of the non-peptide polymer-bound fatty acid derivative compound contained in the protein conjugate according to the present invention is characterized by being a polyethylene glycol having 1 to 2400 polymerized units.
  • the biocompatible material contained in the protein conjugate according to the present invention includes one biocompatible substance, one biocompatible polypeptide and one non-peptide polymer- Or more.
  • the physiologically active polypeptide contained in the protein conjugate according to the present invention may be a hormone, a cytokine, an interleukin, an interleukin binding protein, an enzyme, an antibody, a growth factor, , A vaccine, a structural protein, a ligand protein or receptor, a cell surface antigen or a receptor antagonist.
  • the physiologically active polypeptide contained in the protein conjugate according to the present invention is glucagon analog peptide-1 (GLP-1), glucagon analog peptide-2 (GLP-2) Such as Gastric Inhibitory Polypeptide (GIP), oxytomodulin, Xenin, insulin, CCL (cholecystokinin) amylin, gastrin, ghrelin, PYY (peptide YY) And incretins that regulate body weight; Adipokines secreted from adipose, such as leptin, adiponectin, adipolin, apelin, and cartonectin; Neuropeptides secreted in the brain, such as Kisspeptin, Nesfatin-1; Peptides or proteins secreted in the muscle, such as Irisin, myonectin, decorin, follistatin, musclin; (G-CSF), human growth hormone (hGH
  • the physiologically active polypeptide according to the present invention is characterized by simultaneously activating two or more receptors.
  • the physiologically active polypeptide according to the present invention is characterized in that it is selected from derivatives of a natural type physiologically active polypeptide which does not exist in a natural form.
  • Derivatives of physiologically active polypeptides have been altered in their ability to bind to their native receptors through amino acid substitutions, insertions, deletions, sugar chain additions, sugar chain deletions, unnatural amino acid insertions, ring insertions, Refers to mutations in properties such as phosphorus, increased water solubility, reduced immunogenicity, and includes artificial peptides engineered to bind to two or more different receptors.
  • the biocompatible material included in the protein conjugate according to the present invention may be polyethylene glycol (PEG), cholesterol, albumin and its fragment, albumin binding substance, wherein the polymer is selected from the group consisting of a polymer, an antibody, an antibody fragment, an FcRn binding substance, a binding tissue or derivative thereof in vivo, a nucleotide, a fibronectin, a transferrin, a saccharide, .
  • PEG polyethylene glycol
  • the FcRn binding substance contained in the protein conjugate according to the present invention is a polypeptide comprising an immunoglobulin Fc region.
  • the immunoglobulin Fc region contained in the protein conjugate according to the present invention is characterized in that it is non-glycosylated.
  • the immunoglobulin Fc region included in the protein conjugate according to the present invention is characterized by further including a hinge region.
  • the immunoglobulin Fc region contained in the protein conjugate according to the present invention is selected from the group consisting of IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, combinations thereof and hybrids thereof. ≪ / RTI >
  • the immunoglobulin Fc region contained in the protein conjugate according to the present invention is characterized by being an IgG4 Fc fragment.
  • Another aspect of the present invention is a method for producing a biocompatible peptide comprising the steps of (a) linking a physiologically active peptide and a biocompatible substance through a non-peptide polymer-bonded fatty acid derivative compound represented by the following formula (3) having two or more reactors; And (b) separating the resultant protein binding product of step (a).
  • L 1 , L 2 , L 3 , R 1 , R 2 , Non-Pep, m 1 to m 3 and n are as defined above.
  • the step (a) comprises the steps of (a1) connecting one of the biocompatible material and the biologically active polypeptide to one reactor of the non-peptide polymer-bonded fatty acid derivative compound ; (a2) separating a non-peptide polymer-conjugated fatty acid derivative compound and a conjugate linked with any one of a biocompatible substance or a physiologically active polypeptide from the reaction mixture of step (a1); And (a3) ligating the biocompatible material with another one of the biologically active polypeptides in another reactor of the non-peptide polymer-bonded fatty acid derivative compound of the linkage separated in the step (a2) to form a non-peptide polymer- Characterized in that at least two reactors of the derivative compound each produce a protein conjugate linked to a biologically active polypeptide and a biocompatible substance.
  • the step (a1) and the step (a3) are carried out in the presence of a reducing agent.
  • the reducing agent is sodium cyano in the process according to the invention no borohydride (NaCNBH 3), sodium borohydride, dimethylamine borate, picoline borane complex, or pyridine borate (borane pyridine.
  • the reaction molar ratio of the physiologically active polypeptide to the fatty acid derivative in the step (a1) is 1: 1 to 1:20
  • Derivative is in the range of 1: 1 to 1:20.
  • reaction molar ratio of the biocompatible substance or physiologically active polypeptide separated from the step (a3) to (a2) in the production method according to the present invention is 1: 0.5 To 1:20.
  • the non-peptide polymer-bound fatty acid derivative compound of the present invention may be a physiologically active polypeptide at one end formed by incorporating it into a linker; A non-peptide polymer-bound fatty acid derivative compound as a linker; And the biocompatible substance are sequentially covalently linked to each other to increase the half-life of the physiologically active polypeptide when administered in the form of a protein conjugate, it can be widely used in the field of protein drugs.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of SDS-PAGE analysis for confirming the synthesis of an immunoglobulin Fc-fatty acid derivative-insulin conjugate according to the present invention.
  • FIG. 2 is a view illustrating a chemical structural formula of an immunoglobulin Fc-fatty acid derivative-insulin conjugate prepared according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a pharmacokinetic analysis result of an immunoglobulin Fc-fatty acid derivative-insulin conjugate according to the present invention.
  • the blood concentrations of the immunoglobulin Fc-fatty acid derivative-insulin conjugate administration group according to time after administration were shown together with the results for the groups administered with human insulin and immunoglobulin Fc-PEG-insulin conjugate.
  • One aspect of the present invention provides a non-peptide polymeric conjugated fatty acid derivative compound represented by the following formula (1), a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • L 1 to L 3 each independently represents a straight-chain or branched-chain C 1-6 alkylene
  • R 1 and R 2 each independently represent 2,5-dioxopyrrolidinyl, 2,5- pyrrolyl, aldehydes, maleimides, C 6-20 aryl disulfide, C 5-20 heteroaryl disulfide, vinyl sulfone, thiol, halogenated acetamide, succinimide, p- nitrophenyl carbonate, C 7-10 alkynyl, disulfide ortho
  • M1 to m3 are each independently a natural number of from 1 to 2400 and n is a natural number of from 1 to 40.
  • R 1 and R 2 are each independently 2,5-dioxide Sophie pyrrolidinyl, 2,5-dioxolanyl, Sophie pyrrolyl, aldehyde, maleimide, disulfide aryl, heteroaryl disulfide, halogenated acetamide, or C 7-10 alkynyl ≪ / RTI >
  • the reactor may be a reactor comprising at least one reactor selected from the group consisting of maleimide, N-hydroxysuccinimide, succinimide, formaldehyde, acetaldehyde, propionaldehyde, butylaldehyde, orthopyridyl disulfide (OPSS), iodoacetamide, Instead of halogenated acetamide containing bromine, fluorine, chlorine or astatine, difluorocyclooctyne (DIFO), dibenzocyclooctyne (DIBO),
  • each of m1 to m3 independently represents a natural number of 1 to 2400, specifically, m1 and m2 each independently may be a natural number of 1 to 20, a natural number of 1 to 10, or a natural number of 1 to 5, M3 may be a natural number of 20 or more and 500 or less, or may be a natural number of 10 to 500, 10 to 100, or 100 to 500, but is not limited thereto.
  • n may be a natural number of 1 to 40, specifically 4 to 30, more specifically 10 to 25, but is not limited thereto.
  • Another embodiment of the present invention is a pharmaceutical composition
  • a physiologically active polypeptide at one end A non-peptide polymer-bound fatty acid derivative compound represented by the following formula (2) as a linker; And a biocompatible material are in turn covalently linked.
  • L 1 to L 3 each independently represents a linear or branched C1-6 alkylene
  • Non-Pep is a non-peptide polymer
  • m1 and m2 are each independently a natural number of 1 to 2400
  • the protein conjugate of the present invention may be one in which the physiologically active polypeptide and the biocompatible substance are covalently linked through two or more reactors located at both ends of the non-peptide polymer-bound fatty acid derivative compound, which is a linker.
  • physiologically active polypeptide in the present invention may be a constituent constituting a moiety of the conjugate, and it has a polypeptide structure as a general concept of a polypeptide having a physiological action in vivo Have common features, and have various physiological activities.
  • the physiologically active polypeptide includes a function of correcting genetic expression and physiological function when the abnormality is observed due to deficiency or excessive secretion of substances involved in function regulation in vivo, .
  • the above-mentioned physiologically active polypeptides include not only natural polypeptides but also derivatives thereof.
  • the physiologically active polypeptide is not particularly limited in its kind and size as long as it is a physiologically active polypeptide capable of exhibiting an increase in blood half-life through the conjugate structure of the present invention.
  • physiologically active polypeptides of the present invention can be used in combination with hormones, cytokines, interleukins, interleukin binding proteins, enzymes, antibodies, growth factors, transcription regulators, blood factors, vaccines, structural proteins, ligand proteins or receptors, .
  • the physiologically active polypeptide contained in the protein conjugate according to the present invention is selected from the group consisting of glucagon-like peptide-1 (GLP-1), glucagon-like peptide-2 (GLP-2), glucagon, GIP, Such as insulin, CCK amylin, gastrin, ghrelin, PYY, and the like; Adipocans secreted in lipids such as leptin, adiponectin, adipoin, apelin, carotenectin; Neuropeptides secreted by the brain, such as kispeptin and nepsertin-1; Peptides or proteins secreted from the muscles, such as irisine, myoectin, decolin, polystatin, and muslin; (G-CSF), human growth hormone (hGH), erythropoietin (EPO), growth hormone releasing hormone, growth hormone releasing peptide, interferon, interferon receptor, zi
  • the physiologically active polypeptide according to the present invention is characterized in that it is selected from derivatives of natural type physiologically active polypeptides that are not present in a native form.
  • Derivatives of physiologically active polypeptides have been altered in their ability to bind to their native receptors through amino acid substitutions, insertions, deletions, sugar chain additions, sugar chain deletions, unnatural amino acid insertions, ring insertions, Refers to mutations in properties such as phosphorus, increased water solubility, reduced immunogenicity, and includes artificial peptides engineered to bind to two or more different receptors.
  • physiologically active polypeptide refers to a polypeptide or protein that antagonizes physiological phenomena in vivo .
  • biocompatible material refers to a substance capable of forming a moiety of the conjugate and capable of increasing the half-life in vivo by binding with a physiologically active polypeptide.
  • a “ biocompatible material” is a substance capable of extending the half-life in vivo and is expressed as " carrier "
  • the biocompatible material or carrier includes any substance capable of binding to a physiologically active polypeptide to prolong its half life.
  • the substance examples include polyethylene glycol (PEG), cholesterol, albumin and its fragment, albumin binding substance, A fragment of an antibody, an antibody fragment, an FcRn binding substance, an in vivo connective tissue or a derivative thereof, a nucleotide, a fibronectin, a transferrin, a saccharide, a polymeric polymer and a combination thereof But it is not limited thereto.
  • the FcRn binding material may be a polypeptide comprising an immunoglobulin Fc region, for example, IgG Fc.
  • the biocompatible material or carrier may be bound to the bioactive polypeptide through a fatty acid derivative.
  • the Recode technology of Ambrx which can adhere polyethylene glycol in a site-specific manner can be included, and the glycopegylation technique of Neose which can be specifically attached to the sugar chain site can be included .
  • releasable PEG techniques in which polyethylene glycol is slowly removed in vivo, but this is not so limited and may include techniques to increase bioavailability using PEG.
  • polyoxyethylene alkyl ether such as polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer,
  • polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer The same polymeric polymer may also be bound to the conjugate of the present invention by the above-described techniques.
  • the protein conjugate of the present invention when albumin is used as a carrier, may be a conjugate in which the albumin or albumin fragment is covalently bonded directly to the non-peptide polymer-linked fatty acid derivative compound. Even if albumin is not directly bound, , for example, an albumin-specific binding antibody or an antibody fragment bound to albumin by binding to a non-peptide polymer-linked fatty acid derivative compound. Further, it may be a protein conjugate formed by binding a specific peptide / protein / compound having binding force to albumin to a non-peptide polymer-conjugated fatty acid derivative compound, or may be a protein conjugate in which fatty acid itself having binding ability to albumin is bound, It is not limited.
  • an antibody or an antibody fragment can be used as a carrier, which may be an antibody or an antibody fragment having an FcRn binding site and an antibody fragment not containing an FcRn binding site such as Fab, but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region can be used as a carrier in the present invention.
  • the immunoglobulin Fc region is a biodegradable polypeptide metabolized in vivo, it is safe for use as a carrier of drugs.
  • the immunoglobulin Fc region has a relatively small molecular weight as compared with the whole immunoglobulin molecule, it is not only advantageous in terms of preparation, purification and yield of the conjugate, but also because the amino acid sequence differs from antibody to antibody, And the possibility of inducing blood antigenicity is also lowered.
  • immunoglobulin Fc region means a heavy chain constant region except for the heavy chain and light chain variable region, heavy chain constant region 1 (CH1) and light chain constant region (CL1) of immunoglobulin.
  • the Fc fragment may include a hinge portion in the heavy chain constant region.
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention is an extended Fc fragment comprising only part or all of the heavy chain constant region 1 (CH1) and / or light chain constant region 1 (CL1) except for the heavy and light chain variable regions of the immunoglobulin .
  • an immunoglobulin Fc region is a biodegradable polypeptide metabolized in vivo, it is safe for use as a carrier of a drug. Since the immunoglobulin Fc region has a relatively small molecular weight as compared with the whole immunoglobulin molecule, it is not only advantageous in terms of preparation, purification and yield of a conjugate, but also has a high affinity for a substance It is expected that the homogeneity will be greatly increased and the possibility of inducing blood antigenicity will also be lowered.
  • the immunoglobulin Fc region includes a naturally occurring amino acid sequence as well as its sequence variant (mutant).
  • An amino acid sequence variant is one in which at least one amino acid residue in the native amino acid sequence has a different sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof.
  • amino acid residues 214 to 238, 297 to 299, 318 to 322 or 327 to 331, which are known to be important for binding can be used as sites suitable for modification.
  • mutants can be used, such as a site capable of forming a disulfide bond is removed, some amino acids at the N-terminus are removed from the native Fc, or a methionine residue is added at the N-terminus of the native Fc Do.
  • the complement binding site for example, the C1q binding site may be removed and the antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) site may be removed.
  • ADCC antibody dependent cell mediated cytotoxicity
  • Amino acid exchanges in proteins and peptides that do not globally alter the activity of the molecule are known in the art (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most commonly occurring exchanges involve amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu and Asp / Gly.
  • Fc variants exhibit the same biological activity as the Fc fragments of the present invention, but have increased structural stability against heat, pH, etc. of Fc fragments.
  • Such Fc region may also be obtained from natural forms isolated in vivo in animals such as humans and cattle, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats, guinea pigs, etc., and may be obtained from transformed animal cells or microorganisms Recombinant or derivative thereof.
  • the method of obtaining from the natural form can be obtained by separating the whole immunoglobulin from the living body of human or animal, and then treating the proteolytic enzyme. When papain is treated, it is cleaved into Fab and Fc, and when pepsin is treated, it is cleaved into pF'c and F (ab) 2 .
  • Fc or pF'c can be isolated using size-exclusion chromatography or the like.
  • it is a recombinant immunoglobulin Fc region obtained from a microorganism from a human-derived Fc region.
  • the immunoglobulin Fc region may be a natural type sugar chain, an increased sugar chain as compared to the native type, and a reduced sugar chain or sugar chain as compared with the native type.
  • Conventional methods such as chemical methods, enzymatic methods, and genetic engineering methods using microorganisms can be used to increase or decrease immunoglobulin Fc sugar chains.
  • the immunoglobulin Fc region in which the sugar chain is removed from the Fc is significantly reduced in the binding force of the complement (c1q), and the antibody-dependent cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity is reduced or eliminated to thereby cause an unnecessary immune response in vivo Do not.
  • forms that are more consistent with the original purpose of the drug as a carrier will be referred to as immunoglobulin Fc regions in which the sugar chain is removed or unglycosylated.
  • the " Deglycosylated” Fc region refers to the Fc region from which the sugar is removed by the enzyme, and the " Aglycosylated " Fc region is produced by prokaryotes, preferably E. coli, Means a non-Fc fragment.
  • the immunoglobulin Fc region may be an animal origin such as human or bovine, chlorine, porcine, mouse, rabbit, hamster, rat, guinea pig and the like, preferably human origin.
  • the immunoglobulin Fc region may be an Fc region derived from IgG, IgA, IgD, IgE, IgM or a combination thereof or a hybrid thereof.
  • IgG or IgM most abundant in human blood, and most preferably IgG known to enhance the half-life of the ligand binding protein.
  • combination means that when a dimer or a multimer is formed, a polypeptide encoding a short-chain immunoglobulin Fc fragment of the same origin forms a bond with a short-chain polypeptide of a different origin. That is, it is possible to prepare a dimer or a multimer from two or more fragments selected from the group consisting of Fc fragments of IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc and IgE.
  • Hybrid " in the present invention is a term meaning that a sequence corresponding to two or more immunoglobulin Fc fragments of two or more different origins is present in a short-chain immunoglobulin Fc fragment.
  • various types of hybrids are possible. That is, hybrids of one to four domains from the group consisting of CH1, CH2, CH3 and CH4 of IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc and IgD Fc are possible and may include hinges.
  • IgG can be divided into subclasses of IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, and in the present invention, combinations thereof or hybridization thereof are also possible.
  • the immunoglobulin Fc region for carrier contained in the protein conjugate of the present invention may be an unglycosylated Fc fragment derived from human IgG4. Derived Fc fragment can exert an excellent effect as compared with a non-human derived Fc fragment that can act as an antigen in a human organism to cause an undesirable immune reaction such as the generation of a new antibody thereto.
  • peptides or protein fragments can be used as carriers to increase the half-life in vivo.
  • the peptide or protein fragment used may be an elastin-like polypeptide (ELP) composed of repeating units of a specific amino acid combination, and may be a transferrin known to be highly stable in vivo or fibronectin such as a component of connective tissue, But are not limited to, any peptide or protein that increases in vivo half life is included in the scope of the present invention.
  • ELP elastin-like polypeptide
  • non-peptide polymer-linked fatty acid derivative compound may be a constituent of a moiety of the above-mentioned conjugate.
  • a fatty acid is a compound having a single carboxy group (-COOH) Refers to a hydrocarbon chain.
  • fatty diacids having two carboxy groups are collectively referred to as fatty acids.
  • the fatty acid of the present invention may be a saturated fatty acid in which all of the carbon skeletons forming the hydrocarbon chain are composed of only a single bond.
  • the fatty acid may be a fatty acid having a normal chain structure and a fatty acid having a side chain in an alkyl group.
  • the fatty acid may be classified into a short chain / heavy chain / long chain fatty acid according to the carbon number constituting the hydrocarbon chain.
  • the fatty acid is a short chain fatty acid having 1 to 6 carbon atoms, a medium chain fatty acid having 6 to 12 carbon atoms, Fatty acids.
  • the " non-peptide polymer-bonded fatty acid derivative compound " of the present invention may be a substance in which two or more reactors are bonded to the skeleton of the above-mentioned fatty acid directly or via a linker.
  • the reactor may be coupled to a fatty acid skeleton via a linker comprising C 1-3 alkylamino, (C 1-3 alkoxy) n (C 1-3 alkylamino) chain (where n is an integer of 1-3 ) But the type of the linker is not limited thereto.
  • the fatty acid of the non-peptide polymer-bonded fatty acid derivative of the present invention is a carboxylic acid having the formula R-COOH or R- (COOH) 2 , and the corresponding R group may include a linear or branched saturated hydrocarbon group, May have 1 to 40 carbon atoms, and more specifically may have 4 to 30 carbon atoms. More specifically, the number of carbon atoms may be 10 to 25, but the present invention is not limited thereto.
  • the fatty acids of the present invention may be selected from malonic acid (CH 2 (COOH) 2 ), succinic acid (C 2 H 4 (COOH) 2 ), glutaric acid (C 3 H 6 (COOH) 2 ) C 4 H 8 (COOH) 2 ), pimelic acid (C 5 H 10 (COOH) 2), suberic acid (C 6 H 12 (COOH) 2), azelaic acid (C 7 H 14 (COOH) 2), sebacic acid (C 8 H 16 (COOH) 2), undecane diacid (C 9 H 18 (COOH) 2), dodecanedioic acid (C 10 H 20 (COOH) 2), Brassica acids (C 11 H 22 (COOH ) 2), tetradecanedioic acid (C 12 H 24 (COOH) 2), penta decane diacid (C 13 H 26 (COOH) 2), hexadecanoic diacid (C 14 H 28 (COOH) 2), hepta-de
  • the fatty acid of the non-peptide polymer-bonded fatty acid derivative of the present invention may be a derivative, an analogue, or the like of the fatty acid described above, and in particular, the hydrocarbon constituting the fatty acid may be a mutant including a linear or non-branched ring group.
  • the cyclic group which may be contained in the hydrocarbon may be a saturated homocycle, a heterocycle, an aromatic condensed or non-condensed homocycle or a heterocycle, and may have an ether bond, an unsaturated bond and a substituent.
  • the fatty acid of the non-peptide polymer-bonded fatty acid derivative of the present invention is preferably a fatty acid of the non-peptide polymer-bonded fatty acid derivative of the present invention as disclosed in US 8129343 and WO2015 / 067715, WO2015 / 055801, WO2013 / 041678, WO2014 / 133324, WO2014 / 009316, WO2015 / 052088 Fatty acid derivatives may be used, but are not limited thereto.
  • it may include, without limitation, a multi-fatty acid containing two or more carboxyl groups, a carboxylic acid (bioisostere), a substance containing a phosphoric acid group or a sulfonic acid group, a fatty acid ester and the like instead of a carboxyl group of a fatty acid.
  • a carboxylic acid bioisostere
  • a substance containing a phosphoric acid group or a sulfonic acid group a fatty acid ester and the like instead of a carboxyl group of a fatty acid.
  • the fatty acids of the non-peptide polymeric-derived fatty acid derivative compounds of the present invention may be used as derivatives of such fatty acids, analogs and derivatives and analogues thereof which can be readily prepared at the technical level of the art, .
  • the fatty acid of the non-peptide polymer-bound fatty acid derivative of the present invention may have a molecular weight in the range of 0.1 to 100 kDa, specifically 0.1 to 30 kDa.
  • the fatty acid of the non-peptide polymer- As well as combinations of different types of polymers may be used, but are not limited thereto.
  • the two or more reactors of the non-peptide polymer-bonded fatty acid derivative compound contained in the protein conjugate of the present invention may be the same or different from each other.
  • the maleimide group in one reactor and the aldehyde group, propionaldehyde group, or alkylaldehyde group such as butylaldehyde may be present in the other reactor.
  • a fatty acid or a non-peptide polymer having a hydroxy group in two or more reactors it is possible to activate the hydroxy group by the known chemical reaction with the various reactors, or to use a fatty acid or non-peptide
  • the conjugate of the present invention can be prepared using a polymer.
  • non-peptide polymer-bonded fatty acid derivative compound contained in the protein conjugate of the present invention may be referred to as a biocompatible polymer except for a peptide to which two or more repeating units are bonded. The repeating units are linked to each other via any covalent bond rather than a peptide bond.
  • the non-peptide polymer may be used in combination with a non-peptide linker.
  • Non-peptide polymers that can be used in the present invention include, but are not limited to, polyethylene glycol homopolymers, polypropylene glycol homopolymers, ethylene glycol-propylene glycol copolymers, polyoxyethylated polyols, polyvinyl alcohols, polysaccharides, dextran, polyvinyl ethyl ether, A lipid polymer, a fatty acid, chitin, hyaluronic acid, and combinations thereof. Specifically, it may be a polyethylene glycol homopolymer, more specifically, 1 to 2400 polymerized units, but is not limited thereto.
  • the present invention includes all derivatives thereof already known in the art and derivatives which can be easily produced at the technical level of the present invention in the scope of the present invention.
  • a disadvantage of the peptide linker used in the fusion protein produced by the existing inframe fusion method is that it can not be obtained as expected by the carrier in a short time by the protease in vivo, will be.
  • a polymer resistant to proteolytic enzymes can be used to maintain the blood half-life of the peptide similarly to the carrier. Therefore, the non-peptide polymer which can be used in the present invention can be used without limitation as long as it has the above-mentioned role, that is, a polymer resistant to in vivo protease.
  • the molecular weight of the non-peptide polymer may range from greater than 0 to 100 kDa, ranging from 1 to 100 kDa, more specifically greater than 0, such as from 1 kDa to 20 kDa, or from 0.5 kDa to 20 kDa, 0.5 kDa to 5 kDa, To 20 kDa, but is not limited thereto.
  • the non-peptide polymer of the present invention may use not only one kind of polymer but also a combination of different kinds of polymers.
  • non-peptide polymer may have two or more terminals, and examples thereof include, but are not limited to, a non-peptide polymer having two terminals and a non-peptide polymer having three terminals.
  • One non-peptide polymer contained in the non-peptide polymer-bound fatty acid derivative compound molecule may be one kind or more.
  • the protein conjugate of the present invention is characterized in that the fatty acid or non-peptide polymer portion of the non-peptide polymer-bonded fatty acid derivative compound is linked to the N-terminal region or the C-terminal region of the physiologically active polypeptide or the intermediate amino acid residue not at the terminal of the polypeptide And a biocompatible material may be connected to the fatty acid or non-peptide polymer portion of the non-peptide polymer-bonded fatty acid derivative compound linked to the physiologically active polypeptide.
  • N-terminal region refers to the amino terminal region of a peptide or protein.
  • the "N-terminal region” may include both the terminal terminal amino acid residue in the N-terminal region as well as the amino acid residue in the vicinity of the N-terminal amino acid residue, And may include first to twentieth amino acid residues.
  • the present invention is not particularly limited thereto.
  • C-terminal region refers to the carboxyl terminal region of a peptide or protein.
  • the “ C-terminal region” may include both the terminal terminal amino acid residue in the C-terminal region and the amino acid residue in the vicinity of the C-terminal amino acid residue, And may include first to twentieth amino acid residues.
  • the present invention is not particularly limited thereto.
  • the protein conjugate of the present invention contains at least one structure of [physiologically active polypeptide-fatty acid derivative-non-peptide polymer-biocompatible substance] or [physiologically active polypeptide-non-peptide polymer-fatty acid derivative-biocompatible substance] And the constituent elements thereof may be linearly or branched-chain linked by covalent bonding, and the protein conjugate of the present invention may include one or more components of each component.
  • the non-peptide polymer-linked fatty acid derivative compound of the present invention contains two or more reactive groups, and can be linked to the biologically active polypeptide and the biocompatible substance through covalent bonds, respectively.
  • a biocompatible material may be formed by linking at least one linkage in which a physiologically active polypeptide and a non-peptide polymer-linked fatty acid derivative compound are linked by a covalent bond, so that a physiologically active polypeptide monomer, Or multimer thereof, thereby enabling to more effectively achieve the in vivo activity and stability of the physiologically active polypeptide.
  • the physiologically active polypeptide and the biocompatible material may be combined at various molar ratios.
  • Another aspect of the present invention is a method for producing a biocompatible peptide comprising: (a) linking a biologically active peptide and a biocompatible material through a non-peptide polymeric-linked fatty acid derivative compound; And (b) separating the protein conjugate resulting from the reaction of step (a).
  • physiologically active peptides biocompatible substances and non-peptide polymer-bonded fatty acid derivative compounds are as described above.
  • the connection of the three components may be a covalent bond, and the covalent bond may occur sequentially or simultaneously.
  • physiologically active polypeptides and biocompatible substances are respectively bound to a reactor of a non-peptide polymer-bound fatty acid derivative compound having two or more reactors, any one of the physiologically active polypeptide and the biocompatible substance is first bound to the non- It is advantageous to minimize the production of byproducts other than the desired protein conjugate by sequentially performing the reaction in such a manner that the remaining components are bound to one reactor of the fatty acid derivative and the other component is bound to the other reactor of the fatty acid derivative.
  • step (a2) separating a non-peptide polymer-conjugated fatty acid derivative compound and a conjugate linked with any one of a biocompatible substance or a physiologically active polypeptide from the reaction mixture of step (a1);
  • the non-peptide polymer-bound fatty acid derivative compound of the linkage separated in the step (a2) is ligated to another reactor of the biocompatible substance and the other biologically active polypeptide to form a non-peptide polymer- But not limited to, two reactors of the compound each producing a protein conjugate linked to a biologically active polypeptide and a biocompatible material.
  • step (a1) and step (a3) may be carried out in the presence of a reducing agent, if necessary, in consideration of the kind of the non-peptide polymer-bonded fatty acid derivative compound participating in the reaction.
  • a reducing agent include sodium cyanoborohydride (NaCNBH 3 ), sodium borohydride, dimethylamine borate, picoline borane complex, or borane pyridine.
  • the steps (a2) and (b) may be carried out by appropriately selecting among the usual methods used for protein separation, taking into account the required purity and properties such as molecular weight and charge amount of the resulting product .
  • a variety of known methods including size exclusion chromatography or ion exchange chromatography can be applied, and if necessary, a plurality of different methods can be used in combination to purify at higher purity.
  • the reaction molar ratio of the biologically active polypeptide to the non-peptide polymer-linked fatty acid derivative compound and the reaction mole ratio of the biocompatible substance to the non-peptide polymer-linked fatty acid derivative compound are independently 1: 1 to 1:20 May be a ratio selected from the range.
  • the reaction molar ratio of the biologically active polypeptide to the non-peptide polymer-linked fatty acid derivative compound may be 1: 2 to 1:10, and the reaction molar ratio of the biocompatible substance to the non-peptide polymer- To 1:20.
  • the reaction molar ratio of the linker separated from (a3) to (a2) and the biocompatible substance or the biologically active polypeptide may be in the range of 1: 0.5 to 1:20, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the protein conjugate prepared through the method for producing the protein conjugate of the present invention and the protein conjugate prepared as described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may have increased persistence in vivo persistence and stability compared to natural type physiologically active polypeptides.
  • the pharmaceutical composition comprising the conjugate of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be a binder, a lubricant, a disintegrant, an excipient, a solubilizing agent, a dispersing agent, a stabilizer, a suspending agent, a pigment and a flavoring agent in the case of oral administration.
  • a solubilizer, an isotonic agent, and a stabilizer may be used in combination.
  • a base, an excipient, a lubricant and a preservative may be used.
  • Formulations of the pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared in a variety of ways by mixing with pharmaceutically acceptable carriers as described above.
  • oral administration may be in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc.
  • unit dosage ampoules or multiple dosage forms may be prepared.
  • Other solutions, suspensions, tablets, pills, capsules, and sustained release formulations may be prepared.
  • suitable carriers, excipients and diluents for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a filler, an anti-coagulant, a lubricant, a wetting agent, a fragrance, and an antiseptic.
  • Triethylamine (229 mL, 1.645 mol) and benzyl chloroformate (211 mL, 1.459 mol) were added to 2- (2-aminoethoxy) ethanol (150 mL, 1.459 mol) dissolved in tetrahydrofuran (THF, 1.495 mol) was added thereto, followed by stirring for 12 hours.
  • the solid was filtered, washed with ethyl acetate and the filtrate was concentrated. Purification by column chromatography gave the title compound (202 g).
  • Oxo-1-phenyl-2,7,10-trioxa-4-azadodecane-12-oate (9.5 g, 26.880 mmol) obtained in the above step 2 was dissolved in dichloromethane , Trifluoroacetic acid (32 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 5 hours. The reaction solution was filtered and the filtrate was concentrated to give the title compound (7.1 g).
  • the benzyl 2- (2-hydroxyethoxy) ethylcarbamate (20.0 g, 83.588 mmol) obtained in the above step 1 was dissolved in THF (320 mL) 0.0 > 0 C. < / RTI > After 30 minutes, ethyl bromoacetate (11.5 mL, 100.305 mmol) was added, and the mixture was stirred at 0 ° C for 3 hours and further at room temperature for 15 hours. Water was added to the reaction solution to terminate the reaction, followed by concentration and extraction with ethyl acetate. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate and filtered, and the filtrate was concentrated and purified by column chromatography to obtain the title compound (9.5 g).
  • Oxo-1-phenyl-2,7,10-trioxa-4-azadodecane-12-oate (9.5 g, 29.198 mmol) obtained in the above step 4 was dissolved in anhydrous THF , Diisobutylaluminium hydride (DIBAL-H, 43.8 mL, 23.051 mmol) was slowly added dropwise at -78 ° C under an argon atmosphere, and the mixture was stirred at 0 ° C for 1 hour. 10% hydrochloric acid was added to the reaction solution, stirred at 0 ° C for 30 minutes, extracted with ethyl acetate. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate and filtered, and the filtrate was concentrated.
  • DIBAL-H Diisobutylaluminium hydride
  • Oxo-1-phenyl-2,7,10-trioxa-4-azadodecane-12-oxacic acid (1.2 g, 5.951 mmol) obtained in the above step 3 was dissolved in acetonitrile N, N-diisopropylethylamine (DIPEA, 3.0 mL, 17.003 mmol) was added to the solution, followed by addition of BOP (benzotriazol-1-yloxy) tris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate And the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes.
  • DIPEA N-diisopropylethylamine
  • Example One At the end of a horse Aldehyde group Have Nonpeptide Polymer-bonded fatty acid derivative compounds ( Ald -PEG-FA) < / RTI >
  • Acetal-PEG-FA (30 mg, 0.007 mmol) obtained in the above step 4 was dissolved in dichloromethane (1 mL), trifluoroacetic acid (53 ⁇ L, 0.714 mmol) was added thereto, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was concentrated and recrystallized from diethyl ether to give the title compound (18 mg).
  • Example 2 physiological activity Polypeptides and Nonpeptide Bond with polymer-bound fatty acid derivative
  • a non-peptide polymer-linked fatty acid derivative compound having an aldehyde group at both ends was used as a linker, which was prepared according to Example 1 and was used as a linker to bind to the N-terminus of the beta chain of insulin, which is a kind of physiologically active polypeptide , And insulin powder (Biocon, India) were dissolved in 10 mM HCl. The insulin and the linker were mixed at a molar ratio of 1: 2 and reacted at room temperature for 2 hours at an insulin concentration of 5 mg / mL.
  • the reaction was carried out by adding sodium cyanoborohydride (SCB) (NaCNBH 3 ) reducing agent in a mixed solvent of 50 mM sodium citrate (pH 5.0) and isopropanol.
  • SB sodium cyanoborohydride
  • the reaction solution was purified by using sodium citrate (pH 3.0), a buffer containing ethanol, and an SP-HP (GE, USA) column using a potassium chloride concentration gradient.
  • the immunoglobulin Fc fragment which is a kind of biocompatible substance
  • the immunoglobulin Fc fragments were mixed at a molar ratio of 1:10.
  • the total protein concentration was adjusted to 20 mg / mL, and the mixture was reacted at 25 ° C for 12 to 18 hours.
  • 100 mM HEPES buffer (pH 8.2) containing sodium chloride was used as a reaction solution, and 20 mM sodium cyanoborohydride was added as a reducing agent.
  • reaction solution was purified using a Q-HP column (GE, USA) using a Tris (pH 7.5) buffer and a calcium chloride concentration gradient, and then subjected to a size exclusion chromatography column (Superdex 200 , GE, USA) was used to isolate unreacted proteins. Further, it was applied to a Sourse 15 Q column (GE, USA) using a concentration gradient of sodium chloride and tris (pH 6.0) to obtain a conjugate of insulin and immunoglobulin Fc fragments covalently linked via a non-peptide polymeric conjugated fatty acid derivative compound linker Lt; / RTI > The prepared protein conjugate was confirmed by SDS-PAGE (Fig. 1).
  • SD rats widely used as normal animal models, were used for pharmacokinetic validation.
  • Non-fasting 8-week-old normal rats were treated with human insulin (172 nmol / kg), immunoglobulin Fc-PEG-insulin conjugate treated group (3.88 nmol / kg) and the protein conjugate of Example 3, i.e., immunoglobulin Fc- (3.88 nmol / kg) group of fatty acid derivative-insulin complex (for convenience, hereinafter abbreviated as "immunoglobulin Fc-fatty acid derivative-insulin" in Examples and Figures).
  • ELISA analysis was performed by inserting serum and anti-human IgG4-HPR (Alpha Diagonosis, # 10124) taken at each time into a plate coated with insulin monoclonal antibody (ALPCO, # 80-INSHU-E10.1) After reacting at room temperature, color reaction was performed with TMB reagent and absorbance was measured at 450 nm wavelength. The pharmacokinetic parameters were calculated using Phoenix TM WinNonin 7.0 based on the serum concentration per hour and are shown in FIG.
  • both the immunoglobulin Fc-PEG-insulin conjugate and the immunoglobulin Fc-fatty acid derivative-insulin conjugate were remarkably increased in persistence as compared with human insulin.
  • the half-lives of the immunoglobulin Fc-PEG-insulin conjugate were 35.8 hours and 14.8 hours, respectively. This indicates that the persistence of the immunoglobulin Fc-fatty acid derivative-insulin conjugate of the present invention is improved in the body. In particular, this suggests an excellent effect of a non-peptide polymer-bonded fatty acid derivative newly proposed as a linker.

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Abstract

본 발명은 생리활성 폴리펩타이드와 생체적합성 물질이 링커로서 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물을 통해 연결되어 생리활성 지속기간이 천연형에 비해 연장된 단백질 결합체 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 생체적합성 물질, 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물을 및 생리활성 폴리펩타이드가 연결된 단백질 결합체는 생리활성 폴리펩타이드의 혈중 반감기가 증가됨을 확인하였는바, 단백질 약물 분야에서 널리 사용될 수 있다.

Description

링커로서 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물을 포함하는 단백질 결합체 및 이의 제조방법
본 발명은 생리활성 폴리펩타이드와 생체적합성 물질이 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물을 통해 연결되어 생리활성 지속기간이 천연형에 비해 연장된 단백질 결합체 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 생리활성 폴리펩타이드는 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 신장이나 간을 통해 쉽게 제거된다. 따라서, 약리성분으로 생리활성 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나, 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사를 놓는 것은 환자에게 엄청난 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 단백질 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다. 이러한 단백질 약물의 지속성 제제는 단백질 약물의 안정성을 높이는 동시에 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다.
단백질을 안정화시키고 단백질 가수분해효소와의 접촉 및 신장 소실을 억제하기 위한 방법으로, 종래에는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, 이하 "PEG")과 같이 용해도가 높은 고분자를 단백질 약물 표면에 화학적으로 부가시키는 단백질 페길화(Pegylation) 방법이 사용되어 왔다. PEG는 목적 단백질의 특정 부위 또는 다양한 부위에 비특이적으로 결합하여 용해도를 높임으로써 단백질을 안정화시키고, 단백질의 가수분해를 방지하는데 효과가 있으며 특별한 부작용도 일으키지 않는 것으로 알려져 있다(Sada et al., J. Fermentation Bioengineering, 71: pp 137-139, 1991).
유리 지방산은 인혈청알부민(human serum albumin; HAS)과 결합력이 있는 것으로 알려져 있다(Curry S. et al., Biochim, Biophys. Acta, 1441: 131-140, 1999). 이러한 특징으로 인해, 지방산을 치료적 약물들(예컨대, 단백질, 펩타이드, siRNA)과 결합시켜 인체에 투여하면, 지방산과 친화력을 가진 혈중의 알부민과 비공유 결합으로 결합한다. 이와 같이 형성된 알부민-약물 결합체는 단백질의 가수분해나 세포막 흡수율을 떨어뜨려 혈중 반감기를 늘리는 것으로 알려져 있다. 이미 FDA와 EMA에 의해 승인된 지방산 유도체와 결합된 치료적 약물로는 Levemir®(insulin detemir, Novo Nordisk)와 Victoza®(liraglutide[rDNA origin] injection, Novo Nordisk)가 있다.
본 발명의 하나의 목적은 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생리활성 폴리펩타이드 및 생체적합성 물질이 링커인 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물과 공유결합으로 연결된, 단백질 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 결합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 양태는 하기 화학식 1로 표시되는 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2018011626-appb-I000001
상기 화학식 1에서, L1 내지 L3은 각각 독립적으로 직쇄 또는 분지쇄 C1-6 알킬렌이고, R1 및 R2는 각각 독립적으로 2,5-디옥소피롤리디닐, 2,5-디옥소피롤릴, 알데하이드, 말레이미드, C6-20 아릴디설파이드, C5-20 헤테로아릴디설파이드, 비닐술폰, 티올, 할로겐화 아세트아미드, 석신이미드, p-니트로페닐 카보네이트, C7-10 알키닐, 이황화 오르토피리딜(orthopyridyl disulfide; OPSS), 할로겐 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되며, m1 내지 m3은 각각 독립적으로 1 내지 2400의 자연수이고, n은 1 내지 40의 자연수임.
하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 단백질 결합체에 포함되는 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 반응기에 상응하는 R1 및 R2는 각각 독립적으로 말레이미드, N-하이드로석신이미드, 석신이미드, C1-4 알킬렌 알데하이드, 오르소피리딜 디설파이드(Orthopyridyl disulfide; OPSS), 요오드화 아세트아마이드(iodoacetamide; IA), 상기 요오드 대신에 브롬, 불소, 염소, 또는 아스타틴을 포함하는 할로겐화 아세트아마이드, 디플루오로사이클로옥틴(difluorocyclooctyne; DIFO), 디벤조사이클로옥틴(dibenzocyclooctyne; DIBO), 디벤조-아자-사이클로옥틴(Dsibenzo-aza-cyclooctyne; DIBAC 또는 DBCO), 바이아릴아자사이클로옥티논(biarylazacyclooctynones; BARAC), 테트라메틸티아사이클로헵틴(tetramethylthiacycloheptyne; TMTH), 바이사이클로노닌(bicyclononyne; BCN) 손드하이머 디인(Sondheimer diyne), 사이클로옥틴(cyclooctyne; OCT), 단불소화 사이클로옥틴(monofluorinated cyclooctyne; MOFO), 디메톡시아자사이클로옥틴(dimethoxyazacyclooctyne; DIMAC), 2,3,6,7-테트라메톡시-디벤조사이클로옥틴(2,3,6,7-tetramethoxy-DIBO, TMDIBO), 술폰화 디벤조사이클로옥틴(sulfonylated DIBO; S-DIBO), 카르복시메틸모노벤조사이클로옥틴(carboxymethylmonobenzocyclooctyne; COMBO), 피롤로사이클로옥틴(pyrrolocyclooctyne; PYRROC) 또는 알카인(alkyne)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 하나의 양태는 생리활성 폴리펩타이드 및 생체적합성 물질이 링커인 하기 화학식 2로 표시되는 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물과 공유결합으로 연결된, 단백질 결합체이다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2018011626-appb-I000002
상기 화학식 2에서, L1 내지 L3은 각각 독립적으로 직쇄 또는 분지쇄 C1-6 알킬렌이고, Non-Pep은 비펩타이드성 중합체이며, m1 및 m2은 각각 독립적으로 1 내지 2400의 자연수이고, n은 1 내지 40의 자연수임.
하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 단백질 결합체에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물은 지방산 골격에 직접 또는 링커를 통해 연결된 두 개의 반응기를 가지며, 상기 반응기를 통해 생리활성 폴리펩타이드 및 생체적합성 물질과 각각 연결된 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 상기 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물은 생리활성 폴리펩타이드 및 생체적합성 물질을 연결시키는 링커로서 작용한다.
다른 구체예로서, 본 발명에 따른 단백질 결합체에 포함되는 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물은 지방산 골격에 직접 또는 링커를 통해 연결된 두 개 이상의 반응기를 가지며, 상기 반응기를 통해 생리활성 폴리펩타이드 및 생체적합성 물질과 각각 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 본 발명에 따른 단백질 결합체에 포함되는 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 링커는 C1-3 알킬아미노, (C1-3 알콕시)n(C1-3 알킬아미노) 사슬을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 본 발명에 따른 단백질 결합체에 포함되는 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 단독 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단독 중합체, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 지방산, 키틴, 히알루론산 및 이들의 조합인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 본 발명에 따른 단백질 결합체에 포함되는 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 비펩타이드성 중합체는 중합단위 1 내지 2400개의 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 본 발명에 따른 단백질 결합체에 포함되는 생체적합성 물질에는 단위 생체적합성 물질을 기준으로 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 연결체가 1개 이상 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 본 발명에 따른 단백질 결합체에 포함되는 생리활성 폴리펩타이드는 호르몬, 사이토카인, 인터루킨, 인터루킨 결합 단백질, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질 또는 수용체, 세포표면항원 또는 수용체 길항물질인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 본 발명에 따른 단백질 결합체에 포함되는 생리활성 폴리펩타이드는 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 글루카곤 유사 펩타이드-2(GLP-2), 글루카곤, GIP(Gastric inhibitory polypeptide), 옥신토모듈린, 제닌(Xenin), 인슐린, CCK(Cholecystokinin) 아밀린(amylin), 가스트린(gastrin), 그렐린(ghrelin), PYY(peptide YY) 등과 같이 위나 장에서 혈당과 체중을 조절하는 인크레틴류(incretins); 렙틴(Leptin), 아디포넥틴(adiponectin), 아디포린(adipolin), 아페린(apelin), 카르토넥틴(cartonectin)과 같이 지방질(adipose)에서 분비되는 아디포카인류(adipokines); 키스펩틴(Kisspeptin), 네스파틴-1(Nesfatin-1)과 같이 뇌에서 분비되는 뉴로펩타이드류(neuropeptides); 이리신(Irisin), 마이오넥틴(myonectin), 데코린(decorin), 폴리스타틴(follistatin), 머슬린(musclin)과 같이 머슬(muscle)에서 분비되는 펩타이드 혹은 단백질류; 혈관작동성장펩타이드(Vasoactive intestinal peptide), 나트륨이뇨펩타이드류(natriuretic peptides), 호중구 증가 인자(G-CSF), 인간 성장 호르몬(hGH), 에리스로포이에틴(EPO), 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론, 인터페론 수용체, 지프로테인 관련수용체(G protein-coupled receptor), 인터루킨류, 인터루킨 수용체, 효소류, 인터루킨 결합 단백질, 사이토카인 결합 단백질, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, VIII, Ⅸ, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 본 발명에 따른 생리활성 폴리펩타이드는 2개 이상의 수용체를 동시에 활성화시키는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 본 발명에 따른 생리활성폴리펩타이드는 천연형으로 존재하는 것이 아닌 천연형 생리활성폴리펩타이드의 유도체들에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 생리활성폴리펩타이드의 유도체는 아미노산의 치환, 삽입, 삭제, 당쇄첨가, 당쇄삭제, 비천연형 아미노산 삽입, 링삽입, 메틸잔기와 같은 화학적 수식 등을 통해 고유의 수용체에 대한 결합력이 변경되었거나 물리화학적인 성질, 즉 수용성 증가, 면역원성 감소와 같이 성질이 변이된 것을 의미하며, 서로 다른 2개 이상의 수용체에 결합력을 갖도록 조작된 인위의 펩타이드류도 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 본 발명에 따른 단백질 결합체에 포함되는 생체적합성 물질은 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG), 콜레스테롤, 알부민 및 이의 단편, 알부민 결합물질, 특정 아미노산 서열의 반복단위의 중합체, 항체, 항체 단편, FcRn 결합물질, 생체 내 결합조직 혹은 그 유도체, 뉴클레오타이드, 파이브로넥틴, 트랜스페린(Transferrin), 사카라이드(saccharide), 고분자 중합체 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 본 발명에 따른 단백질 결합체에 포함되는 상기 FcRn 결합물질은 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 본 발명에 따른 단백질 결합체에 포함되는 면역글로불린 Fc 영역은 비당쇄화된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 본 발명에 따른 단백질 결합체에 포함되는 면역글로불린 Fc 영역은 힌지(hinge) 영역을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 본 발명에 따른 단백질 결합체에 포함되는 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, 이들의 조합(combination) 및 이들의 하이브리드(hybrid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 본 발명에 따른 단백질 결합체에 포함되는 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 단편인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 생리활성 펩타이드 및 생체적합성 물질을 두 개 이상의 반응기를 갖는, 하기 화학식 3으로 표시되는, 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물을 통해 연결하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 반응 결과물인 단백질 결합체를 분리하는 단계를 포함하는, 단백질 결합체를 제조하는 방법이다:
[화학식 3]
Figure PCTKR2018011626-appb-I000003
상기 화학식 3에서, L1, L2, L3, R1, R2, Non-Pep, m1 내지 m3 및 n은 이상에서 정의된 바와 같음.
하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 제조방법에서 상기 (a) 단계는 (a1) 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 하나의 반응기에 생체적합성 물질과 생리활성 폴리펩타이드 중 어느 하나를 연결시키는 단계; (a2) 상기 (a1) 단계의 반응 혼합물로부터 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물과 생체적합성 물질 또는 생리활성 폴리펩타이드 중 어느 하나가 연결된 연결체를 분리하는 단계; 및 (a3) 상기 (a2) 단계에서 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 다른 하나의 반응기에 생체적합성 물질과 생리활성 폴리펩타이드 중 다른 하나를 연결하여, 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 두 개 이상의 반응기가 각각 생리활성 폴리펩타이드와 생체적합성 물질에 연결된 단백질 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 본 발명에 따른 제조방법에서 상기 (a1) 단계 및 (a3) 단계는 환원제의 존재하에서 수행되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 본 발명에 따른 제조방법에서 상기 환원제가 나트륨 시아노 보로하이드라이드(NaCNBH3), 수소화붕소나트륨, 디메틸아민 붕산염, 피콜린 보란 컴플렉스 또는 피리딘 붕산염(borane pyridine)인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 본 발명에 따른 제조방법에서 상기 (a1) 단계에서 생리활성 폴리펩타이드와 지방산 유도체의 반응 몰비는 1:1 내지 1:20이고, 생체적합성 물질과 지방산 유도체의 반응 몰비는 1:1 내지 1:20인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 구체예로서, 본 발명에 따른 제조방법에서 상기 (a3) 단계에서 (a2) 단계에서 분리된 연결체와 생체적합성 물질 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 몰비는 1:0.5 내지 1:20인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물은 이를 링커로 포함하여 형성된, 일 말단에 생리활성 폴리펩타이드; 링커로서 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물; 및 생체적합성 물질이 차례로 공유결합으로 연결된, 단백질 결합체의 형태로 투여시 생리활성 폴리펩타이드의 혈중 반감기를 증가시키는 것을 확인하였는바, 단백질 약물 분야에서 널리 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 면역글로불린 Fc-지방산 유도체-인슐린 결합체의 합성을 확인하기 위한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 면역글로불린 Fc-지방산 유도체-인슐린 결합체의 화학적 구조식을 예시한 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 면역글로불린 Fc-지방산 유도체-인슐린 결합체의 약동학 분석 결과를 나타낸 도이다. 비교를 위하여, 면역글로불린 Fc-지방산 유도체-인슐린 결합체 투여군에 대해 측정한 투여후 시간에 따른 혈중 농도를 인간 인슐린 투여군 및 면역글로불린 Fc-PEG-인슐린 결합체 투여군에 대한 결과와 함께 나타내었다.
본 발명의 하나의 양태는 하기 화학식 1로 표시되는 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2018011626-appb-I000004
상기 화학식 1에서, L1 내지 L3은 각각 독립적으로 직쇄 또는 분지쇄 C1-6 알킬렌이고, R1 및 R2는 각각 독립적으로 2,5-디옥소피롤리디닐, 2,5-디옥소피롤릴, 알데하이드, 말레이미드, C6-20 아릴디설파이드, C5-20 헤테로아릴디설파이드, 비닐술폰, 티올, 할로겐화 아세트아미드, 석신이미드, p-니트로페닐 카보네이트, C7-10 알키닐, 이황화 오르토피리딜(orthopyridyl disulfide; OPSS), 할로겐 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되며, m1 내지 m3은 각각 독립적으로 1 내지 2400의 자연수이고, n은 1 내지 40의 자연수임.
예컨대, R1 및 R2는 각각 독립적으로 2,5-디옥소피롤리디닐, 2,5-디옥소피롤릴, 알데하이드, 말레이미드, 아릴디설파이드, 헤테로아릴디설파이드, 할로겐화 아세트아마이드, 또는 C7-10 알키닐을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 반응기는 말레이미드, N-하이드로석신이미드, 석신이미드, 포름알데하이드, 아세트알데하이드, 프로피온알데하이드, 부틸알데하이드, 오르소피리딜 디설파이드(Orthopyridyl disulfide; OPSS), 요오드화 아세트아마이드, 상기 요오드 대신에 브롬, 불소, 염소, 또는 아스타틴을 포함하는 할로겐화 아세트아마이드, 디플루오로사이클로옥틴(difluorocyclooctyne; DIFO), 디벤조사이클로옥틴(dibenzocyclooctyne; DIBO), 디벤조-아자-사이클로옥틴(Dsibenzo-aza-cyclooctyne; DIBAC 또는 DBCO), 바이아릴아자사이클로옥티논(biarylazacyclooctynones; BARAC), 테트라메틸티아사이클로헵틴(tetramethylthiacycloheptyne; TMTH), 바이사이클로노닌(bicyclononyne; BCN) 손드하이머 디인(Sondheimer diyne), 사이클로옥틴(cyclooctyne; OCT), 단불소화 사이클로옥틴(monofluorinated cyclooctyne; MOFO), 디메톡시아자사이클로옥틴(dimethoxyazacyclooctyne; DIMAC), 2,3,6,7-테트라메톡시-디벤조사이클로옥틴(2,3,6,7-tetramethoxy-DIBO, TMDIBO), 술폰화 디벤조사이클로옥틴(sulfonylated DIBO; S-DIBO), 카르복시메틸모노벤조사이클로옥틴(carboxymethylmonobenzocyclooctyne; COMBO), 피롤로사이클로옥틴(pyrrolocyclooctyne; PYRROC) 또는 알카인(alkyne)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 상기 m1 내지 m3은 각각 독립적으로 1 내지 2400의 자연수, 구체적으로는, m1 및 m2는 각각 독립적으로 1 내지 20의 자연수, 1 내지 10의 자연수 또는 1 내지 5의 자연수일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, m3은 20 이상 500 이하의 자연수일 수 있으며, 또는 10 내지 500, 10 내지 100, 또는 100 내지 500의 자연수일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 상기 n은 1 내지 40의 자연수, 구체적으로는 4 내지 30, 보다 구체적으로는 10 내지 25의 자연수일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 하나의 양태는 일 말단에 생리활성 폴리펩타이드; 링커로서 하기 화학식 2로 표시되는 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물; 및 생체적합성 물질이 차례로 공유결합으로 연결된, 단백질 결합체를 제공한다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2018011626-appb-I000005
상기 화학식 2에서, L1 내지 L3은 각각 독립적으로 직쇄 또는 분지쇄 C1-6 알킬렌이고, Non-Pep은 비펩타이드성 중합체이며, m1 및 m2은 각각 독립적으로 1 내지 2400의 자연수이고, n은 1 내지 40의 자연수임.
특히, 본 발명의 단백질 결합체는 상기 생리활성 폴리펩타이드 및 생체적합성 물질이 링커인 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 양말단에 위치한 두 개 이상의 반응기를 통해 각각 공유 결합으로 연결된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "생리활성 폴리펩타이드"는 상기 결합체의 모이어티(moiety)를 이루는 일 구성일 수 있는 것으로, 생체 내에서 어떤 생리작용을 가지는 폴리펩타이드를 총칭하는 개념으로서, 폴리펩타이드 구조를 가진다는 공통점을 가지며, 다양한 생리활성을 가진다. 상기 생리활성 폴리펩타이드는 유전표현과 생리기능을 조정하여 생체 내에서 기능조절에 관여하는 물질의 결핍이나 과도한 분비에 의해 비정상적인 병태를 보일 때 이를 바로잡아 주는 역할을 하는 것을 포함하며, 일반적인 단백질 치료제 역시 포함할 수 있다. 또한, 상기 생리활성 폴리펩타이드는 천연형 폴리펩타이드 외에도 이의 유도체도 모두 포함하는 개념이다.
본 발명의 결합체에서, 생리활성 폴리펩타이드는 본 발명의 결합체 구조를 통하여 혈중 반감기 증대를 나타낼 수 있는 생리활성 폴리펩타이드라면 특별히 그 종류 및 크기에 제한되지 않는다.
본 발명의 생리활성 폴리펩타이드는 호르몬, 사이토카인, 인터루킨, 인터루킨 결합 단백질, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질 또는 수용체, 세포표면항원, 수용체 길항물질인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 본 발명에 따른 단백질 결합체에 포함되는 생리활성 폴리펩타이드는 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 글루카곤 유사 펩타이드-2(GLP-2), 글루카곤, GIP, 옥신토모듈린, 제닌, 인슐린, CCK 아밀린, 가스트린, 그렐린, PYY 등과 같이 위나 장에서 혈당과 체중을 조절하는 인크레틴류; 렙틴, 아디포넥틴, 아디포린, 아페린, 카르토넥틴과 같이 지방질에서 분비되는 아디포카인류; 키스펩틴, 네스파틴-1과 같이 뇌에서 분비되는 뉴로펩타이드류; 이리신, 마이오넥틴, 데코린, 폴리스타틴, 머슬린과 같이 머슬에서 분비되는 펩타이드 혹은 단백질류; 혈관작동성장펩타이드, 나트륨이뇨펩타이드류, 호중구 증가 인자(G-CSF), 인간 성장 호르몬(hGH), 에리스로포이에틴(EPO), 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론, 인터페론 수용체, 지프로테인 관련수용체, 인터루킨류, 인터루킨 수용체, 효소류, 인터루킨 결합 단백질, 사이토카인 결합 단백질, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, VIII, Ⅸ, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 본 발명에 따른 생리활성폴리펩타이드는 천연형으로 존재하는 것이 아닌 천연형 생리활성폴리펩타이드의 유도체들에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 생리활성폴리펩타이드의 유도체는 아미노산의 치환, 삽입, 삭제, 당쇄첨가, 당쇄삭제, 비천연형 아미노산 삽입, 링삽입, 메틸잔기와 같은 화학적 수식 등을 통해 고유의 수용체에 대한 결합력이 변경되었거나 물리화학적인 성질, 즉 수용성 증가, 면역원성 감소와 같이 성질이 변이된 것을 의미하며, 서로 다른 2개 이상의 수용체에 결합력을 갖도록 조작된 인위의 펩타이드류도 포함한다.
본 발명에서 "생리활성 폴리펩타이드", "생리활성 단백질", "활성 단백질" 또는 "단백질 약물"이란 생체 내에서 생리적 현상에 길항작용을 나타내는 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미하는 용어로 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서, "생체적합성 물질"은 상기 결합체의 모이어티(moiety)를 이루는 일 구성일 수 있는 것으로, 생리활성 폴리펩타이드와 결합되어 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명에서 "생체적합성 물질"은 생체 내 반감기를 연장시킬수 있는 물질로서 "캐리어"로써 표현되어 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 생체적합성 물질 혹은 캐리어는 생리활성 폴리펩타이드와 결합되어 이의 반감기를 연장시킬 수 있는 물질이라면 모두 포함하며, 그 예로 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG), 콜레스테롤, 알부민 및 이의 단편, 알부민 결합물질, 특정 아미노산 서열의 반복단위의 중합체, 항체, 항체 단편, FcRn 결합물질, 생체 내 결합조직 혹은 그 유도체, 뉴클레오타이드, 파이브로넥틴, 트랜스페린(Transferrin), 사카라이드(saccharide), 고분자 중합체 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 FcRn 결합물질은 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 예로 IgG Fc일 수 있다. 상기 생체적합성 물질 혹은 캐리어는 지방산 유도체를 통해서 생리활성 폴리펩타이드에 결합될 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜을 캐리어로 사용할 경우, 위치특이적으로 폴리에틸렌 글리콜을 부착할 수 있는 Ambrx사의 Recode기술이 포함될 수 있으며, 당쇄부위에 특이적으로 부착할 수 있는 Neose사의 당페길화(glycopegylation) 기술이 포함될 수 있다. 또한 생체 내에서 폴리에틸렌 글리콜이 천천히 제거되는 releasable PEG 기술이 이에 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 PEG를 이용하여 생체 내 이용율을 높인 기술들이 포함될 수 있다. 또한, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히알루론산과 같은 고분자 중합체 역시 상기 기술에 의해 본 발명의 결합체에 결합될 수 있다.
본 발명에서 알부민을 캐리어로 사용할 경우, 본 발명의 단백질 결합체는 알부민 혹은 알부민 단편이 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물에 직접 공유결합된 결합체일 수 있으며, 알부민을 직접 결합하지 않더라도 알부민에 결합하는 물질, 예를 들어 알부민 특이적 결합 항체 혹은 항체 단편을 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물에 결합시켜 알부민에 결합한 결합체일 수 있다. 또한, 알부민에 결합력을 가지는 특정 펩타이드/단백질/화합물 등을 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물에 결합하여 형성되는 단백질 결합체일 수 있으며, 알부민에 결합력을 가지는 지방산 자체가 결합된 단백질 결합체일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 항체 혹은 항체 단편을 캐리어로 사용할 수 있으며, 이는 FcRn 결합 부위를 갖는 항체 혹은 항체 단편일 수 있고, Fab 등 FcRn 결합부위를 포함하지 않는 항체 단편일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 발명에서는 면역글로불린 Fc 영역을 캐리어로 이용할 수 있다.
면역글로불린 Fc 영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역을 의미한다. 다만, 상기 Fc 단편은 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 단편일 수 있다.
이러한 면역글로불린 Fc 영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 작기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되어 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
본 발명에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 변이체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 변이체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 변이체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 단편의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화 (acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 변이체는 본 발명의 Fc 단편과 동일한 생물학적 활성을 나타내나 Fc 단편의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 변이체다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다.
바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"된 Fc 영역은 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, "비당쇄화(Aglycosylation)"된 Fc 영역은 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 단편을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"은 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 단편을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"는 단쇄의 면역글로불린 Fc 단편 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 구체적으로는 보체 의존적 독성(CDC, complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다. 특히, 본 발명의 단백질 결합체에 포함되는 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgG4 유래의 비당쇄화된 Fc 단편일 수 있다. 인간 유래의 Fc 단편은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비인간 유래의 Fc 단편에 비하여 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서는 생체 내 반감기를 증가시키기 위해 펩타이드 혹은 단백질 단편을 캐리어로 사용할 수 있다. 사용되는 펩타이드 혹은 단백질 단편은 특정 아미노산의 조합의 반복단위로 구성된 Elastin like polypeptide (ELP)일 수 있으며, 생체 내 안정성이 높다고 알려진 트랜스페린(transferrin) 혹은 결합조직의 구성성분인 피브로넥틴(fibronectin) 등과 이의 유도체 등도 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 생체 내 반감기를 증가시키는 어떠한 펩타이드 혹은 단백질은 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명에서 용어, "비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물"에서 지방산(fatty acid)은 상기 결합체의 모이어티(moiety)를 이루는 일 구성일 수 있는 것으로, 통상 1개의 카복시기(-COOH)를 가지는 탄화수소 사슬을 의미하나, 본 발명에서는 2개의 카복시기를 갖는 지방이산(fatty diacid)까지 총칭하여 지방산이라 한다. 본 발명의 지방산은 탄화수소 사슬을 이루는 탄소 골격의 결합이 모두 단일결합만으로 이루어진 포화지방산일 수 있다.
또한, 본 발명의 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물에서 지방산은 노르말 사슬 구조를 가지는 지방산일 수 있으며 알킬기에 곁사슬이 있는 지방산일 수 있다. 지방산은 탄화수소 사슬을 이루는 탄소수에 따라 단쇄/ 중쇄/ 장쇄 지방산으로 분류될 수 있으며, 일반적으로 탄소수 1 내지 6개를 가지는 경우에 단쇄 지방산, 6 내지 12개를 가지는 경우에 중쇄 지방산, 14 이상은 장쇄 지방산으로 분류될 수 있다.
나아가, 본 발명의 "비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물"은 전술한 지방산의 골격에 두 개 이상의 반응기가 직접 또는 링커를 통해 결합된 물질일 수 있다. 예컨대, 상기 반응기는 C1-3 알킬아미노, (C1-3 알콕시)n(C1-3 알킬아미노) 사슬(여기서, n은 1 내지 3의 정수)을 포함하는 링커를 통해 지방산 골격에 결합될 수 있으나, 링커의 종류는 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 지방산은 R-COOH 또는 R-(COOH)2의 화학식을 가지는 카복실산이고 해당 R기는 선형 또는 분지형 포화 탄화수소기를 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 탄화수소 사슬을 이루는 탄소수가 1 내지 40인 것일 수 있고, 더욱 구체적으로는 탄소수가 4 내지 30인 것일 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 탄소수가 10 내지 25인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 지방산은 말론산(CH2(COOH)2), 숙신산(C2H4(COOH)2), 글루타르산(C3H6(COOH)2), 아디프산(C4H8(COOH)2), 피멜산(C5H10(COOH)2), 수베르산(C6H12(COOH)2), 아젤라산(C7H14(COOH)2), 세바스산(C8H16(COOH)2), 운데칸이산(C9H18(COOH)2), 도데칸이산(C10H20(COOH)2), 브라실산(C11H22(COOH)2), 테트라데칸이산(C12H24(COOH)2), 펜타데칸이산(C13H26(COOH)2), 헥사데칸이산(C14H28(COOH)2), 헵타데칸이산(C15H30(COOH)2), 옥타데칸이산(C16H32(COOH)2), 노나데칸이산(C17H34(COOH)2), 이코산이산(C18H36(COOH)2), 헤니코산이산(henicosanedioic acid; C19H38(COOH)2) 및 도코산이산(C20H40(COOH)2)으로 이루어진 군으로부터 선택된 지방이산일 수 있으며, 더욱 구체적으로 테트라데칸이산, 펜타데칸이산, 헥사데칸이산, 헵타데칸이산, 옥타데칸이산, 노나데칸이산, 이코산이산, 헤니코산이산 또는 도코산이산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 지방산은 상기 설명된 지방산의 유도체, 유사체 등일 수 있으며, 특히 지방산을 이루는 탄화수소가 선형, 분지형 외의 고리기를 포함하는 변이체일 수 있다. 상기 탄화수소에 포함될 수 있는 고리기는 포화 호모사이클, 헤테로사이클, 방향족 축합 또는 비축합 호모사이클 또는 헤테로사이클일 수 있으며 에테르 결합, 불포화 결합 및 치환기를 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 지방산으로 미국 등록 US8129343호 및 국제공개특허 WO2015/067715호, WO2015/055801, WO2013/041678, WO2014/133324, WO2014/009316, WO2015/052088에 기재된 지방산 유도체가 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 2개 이상의 카르복실기를 포함하는 다중 지방산, 지방산의 카르복실기 대신에 카르복실산 동배체(carboxylic acid (bio)isostere), 인산기 또는 술폰산기를 포함하는 물질, 지방산 에스테르 등을 제한없이 포함할 수 있다.
이외에도 본 발명의 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 지방산은 당해 분야에 이미 알려진 상기 지방산의 유도체, 유사체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체, 및 유사체들도 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 지방산은 분자량이 0.1 내지 100 kDa 범위, 구체적으로 0.1 내지 30 kDa 범위인 것일 수 있으며, 본 발명의 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 지방산은 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 단백질 결합체에 포함된 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 두 개 이상의 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한쪽 반응기에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 반응기에는 알데하이드 그룹, 프로피온 알데하이드 그룹, 또는 부틸 알데하이드 등의 알킬 알데하이드 그룹을 가질 수 있다. 두 개 이상의 반응기에 히드록시 반응기를 갖는 지방산 또는 비펩타이드성 중합체를 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 지방산 또는 비펩타이드성 중합체를 이용하여 본 발명의 결합체를 제조할 수 있다.
본 발명의 단백질 결합체에 포함된 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물에서 "비펩타이드성 중합체"는 2개 이상의 반복단위가 결합된, 펩타이드를 제외한, 생체적합성 중합체를 통칭할 수 있다. 상기 반복단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 본 발명에서 비펩타이드성 중합체는 비펩타이드성 링커와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에 사용 가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 단독 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단독 중합체, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 지방산, 키틴, 히알루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 구체적으로는 폴리에틸렌 글리콜 단독 중합체이며, 보다 구체적으로는 1 내지 2400개의 중합단위가 연결된 중합체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 뿐만 아니라 본 발명은 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 모두 본 발명의 범위에 포함할 수 있다.
기존 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합단백질에서 사용된 펩타이드성 링커의 단점은 생체 내에서 단백질분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성약물의 혈중반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없다는 것이다. 그러나, 본 발명에서는 단백질분해효소에 저항성있는 중합체를 사용하여 캐리어와 유사하게 펩타이드의 혈중반감기를 유지할 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 중합체는 상기와 같은 역할, 즉 생체 내 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체이면 제한없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체의 분자량은 0 초과 내지 100kDa 이하, 1 내지 100 kDa 범위, 구체적으로는 0 초과, 예컨대 1 kDa 이상 20 kDa 이하 범위일 수 있으며, 또는 0.5kDa 내지 20kDa, 0.5kDa 내지 5kDa, 또는 5kDa 내지 20kDa의 범위일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
또한, 상기 비펩타이드성 중합체는 2 이상의 말단을 가지는 것일 수 있으며, 그 예로 2 말단을 가지는 비펩타이드성 중합체 및 3 말단을 가지는 비펩타이드성 중합체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
하나의 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물 분자에 포함된 비펩타이드성 중합체는 1종류 또는 그 이상의 종류가 사용될 수 있다.
본 발명의 단백질 결합체는 상기 생리활성 폴리펩타이드의 N-말단 영역 또는 C-말단 영역이나 폴리펩타이드의 말단이 아닌 중간 아미노산 잔기에 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 지방산 또는 비펩타이드성 중합체 부분이 연결되고, 생리활성 폴리펩타이드와 연결된 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 지방산 또는 비펩타이드성 중합체 부분에 생체적합성 물질이 연결된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "N-말단 영역"은 펩타이드 또는 단백질의 아미노 말단 영역을 의미한다. 그 예로, 이에 제한되지는 않으나, 상기 "N-말단 영역"은 N-말단 영역의 최말단 아미노산 잔기뿐만 아니라 N-말단 아미노산 잔기 주변의 아미노산 잔기를 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로는 최말단으로부터 첫 번째 내지 20번째의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "C-말단 영역"은 펩타이드 또는 단백질의 카르복실 말단 영역을 의미한다. 그 예로, 이에 제한되지는 않으나, 상기 "C-말단 영역"은 C-말단 영역의 최말단 아미노산 잔기뿐만 아니라 C-말단 아미노산 잔기 주변의 아미노산 잔기를 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로는 최말단으로부터 첫 번째 내지 20번째의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 단백질 결합체는 [생리활성 폴리펩타이드-지방산 유도체-비펩타이드성 중합체-생체적합성 물질] 또는 [생리활성 폴리펩타이드-비펩타이드성 중합체-지방산 유도체-생체적합성 물질]의 구조를 하나 이상 포함할 수 있으며, 이를 구성하는 요소들은 공유결합에 의해 선형 또는 분지형으로 연결될 수 있으며, 본 발명의 단백질 결합체는 각각의 구성요소를 하나 이상 포함할 수 있다. 본 발명의 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물은 두 개 이상의 반응기를 포함하고 있어 이를 통해 생리활성 폴리펩타이드 및 생체적합성 물질과 각각 공유결합으로 연결될 수 있다. 또한, 하나의 생체적합성 물질에, 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물이 결합된 연결체가 하나 이상이 공유결합으로 연결됨으로써, 생체적합성 물질을 매개체로 하여 생리활성 폴리펩타이드 단량체, 이량체 또는 다량체를 형성할 수 있으며, 이를 통해 생리활성 폴리펩타이드의 생체 내 활성 및 안정성 증가를 보다 효과적으로 달성할 수 있다.
본 발명의 단백질 결합체에 있어 생리활성 폴리펩타이드와 생체적합성 물질은 다양한 몰비로 결합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 생리활성 펩타이드 및 생체적합성 물질을 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물을 통해 연결하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 반응 결과물인 단백질 결합체를 분리하는 단계를 포함하는, 단백질 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 생리활성 펩타이드, 생체적합성 물질 및 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 (a) 단계에서, 세 구성요소의 연결은 공유결합일 수 있으며, 해당 공유결합은 순차적으로 또는 동시에 일어날 수 있다. 예를 들어, 두 개 이상의 반응기를 가지는 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 반응기에 각각 생리활성 폴리펩타이드 및 생체적합성 물질을 결합시키는 경우, 생리활성 폴리펩타이드와 생체적합성 물질 중 어느 하나를 먼저 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 하나의 반응기에 결합시킨 후, 나머지 성분을 지방산 유도체의 다른 하나의 반응기에 결합시키는 방식으로 순차적으로 반응을 진행하는 것이 목적하는 단백질 결합체 외의 부산물 생성을 최소화하는데 유리하다.
따라서, 상기 (a) 단계는
(a1) 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 하나의 반응기에 생체적합성 물질과 생리활성 폴리펩타이드 중 어느 하나를 연결시키는 단계;
(a2) 상기 (a1) 단계의 반응 혼합물로부터 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물과 생체적합성 물질 또는 생리활성 폴리펩타이드 중 어느 하나가 연결된 연결체를 분리하는 단계; 및
(a3) 상기 (a2) 단계에서 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 다른 하나의 반응기에 생체적합성 물질과 생리활성 폴리펩타이드 중 다른 하나를 연결하여, 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 두 개의 반응기가 각각 생리활성 폴리펩타이드와 생체적합성 물질에 연결된 단백질 결합체를 생성하는 단계를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 (a1) 단계 및 (a3) 단계의 반응은 반응에 참가하는 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 반응기의 종류를 고려하여 필요에 따라 환원제의 존재하에서 수행될 수 있다. 구체적인 환원제로는 나트륨 시아노 보로하이드라이드(NaCNBH3), 수소화붕소나트륨, 디메틸아민 붕산염, 피콜린 보란 컴플렉스 또는 피리딘 붕산염(borane pyridine) 등이 사용될 수 있다.
상기에서 (a2) 단계 및 (b)는 요구되는 순도 및 생성된 산물의 분자량 및 전하량과 같은 특성을 고려하여, 단백질의 분리에 사용되는 통상의 방법들 중에서 필요에 따라 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 다양한 공지의 방법들을 적용할 수 있으며, 필요에 따라서는 보다 높은 순도로 정제하기 위해 복수개의 서로 다른 방법을 조합하여 사용할 수 있다.
상기 (a1) 단계에서 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 반응 몰비 및 생체적합성 물질과 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 반응 몰비는 각각 독립적으로 1:1 내지 1:20의 범위에서 선택되는 비율일 수 있다. 구체적으로, 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 반응 몰비는 1:2 내지 1:10일 수 있으며, 생체적합성 물질과 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 반응 몰비는 1:4 내지 1:20일 수 있다. 한편, 상기 (a3)에서 (a2)에서 분리된 연결체와 생체적합성 물질 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 몰비는 1:0.5 내지 1:20 범위일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 단백질 결합체를 제조하는 방법을 통해 제조한 단백질 결합체와 상기 제조된 단백질 결합체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 생체 내 지속성 및 안정성이 천연형 생리활성 폴리펩타이드에 비하여 증가된 지속성 제제일 수 있다.
본 발명의 결합체를 포함한 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
이하, 하기 예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 2 -(2-(2- 아미노에톡시 ) 에톡시 )-N-(2-(2-(2,2- 디메톡시에톡시 ) 에톡시 )에틸)아세트아미드(중간체 1)의 합성
[반응식 1]
Figure PCTKR2018011626-appb-I000006
단계 1. 벤질 2-(2-히드록시에톡시)에틸카바메이트의 제조
테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran; THF, 5 L)에 녹인 2-(2-아미노에톡시)에탄올(150 mL, 1.459 mol)에 트리에틸아민(229 mL, 1.645 mol), 벤질 클로로포르메이트(211 mL, 1.495 mol)를 가한 후, 12시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하고 에틸아세테이트로 세척한 후 여과액을 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제화합물(202 g)을 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.37-7.29(m, 5H), 5.25(br, 1H), 5.10(s, 2H), 4.13-4.11(m, 2H), 3.57-3.54(m, 4H), 3.43-3.38(m, 2H), 2.24(br, 1H).
단계 2. t-부틸 3-옥소-1-페닐-2,7,10-트리옥사-4- 아자도데칸 -12- 오에이트의 제조
상기 단계 1로부터 수득한 벤질 2-(2-히드록시에톡시)에틸카바메이트(129 g, 0.539 mol)를 THF(2 L)에 녹인 후, 포타슘 t-부톡사이드(60.5 g, 0.593 mol)를 0℃에서 적가하였다. 30분 후 t-부틸 브로모아세테이트를 가하고 0℃에서 3시간 동안 교반하고 상온에서 15시간 더 교반하였다. 상기 반응 용액에 물을 넣어 반응을 종결한 후, 농축하고 에틸아세테이트를 넣어 추출하였다. 유기층을 무수황산마그네슘으로 건조한 후 여과하고, 여과액을 농축한 후 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제화합물(87.5 g)을 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.36-7.30(m, 5H), 5.38(br, 1H), 5.10(s, 2H), 4.00(s, 2H), 3.70-3.64(m, 4H), 3.60-3.56(m, 2H), 3.43-3.40(m, 2H), 1.46(s, 9H).
단계 3. 3-옥소-1-페닐-2,7,10-트리옥사-4- 아자도데칸 -12- 오익산의 제조
상기 단계 2로부터 수득한 t-부틸 3-옥소-1-페닐-2,7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-오에이트(9.5 g, 26.880 mmol)를 디클로로메탄(32 mL)에 녹인 후, 트리플루오로아세트산(32 mL)을 가하고 상온에서 5시간 동안 교반하였다. 상기 반응 용액을 여과하고, 여과액을 농축하여 표제화합물(7.1 g)을 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.36-7.31(m, 5H), 5.24(s, 1H), 5.11(s, 2H), 4.15(s, 2H), 3.75-3.59(m, 6H), 3.43-3.41(m, 2H).
단계 4. 에틸 3-옥소-1-페닐-2,7,10-트리옥사-4- 아자도데칸 -12- 오에이트의 제조
상기 단계 1로부터 수득한 벤질 2-(2-히드록시에톡시)에틸카바메이트(20.0 g, 83.588 mmol)를 THF(320 mL)에 녹인 후, 포타슘 t-부톡사이드(9.4 g, 83.588 mmol)를 0℃에서 적가하였다. 30분 후 에틸 브로모아세테이트(11.5 mL, 100.305 mmol)를 가하고 0℃에서 3시간 동안 교반하고 상온에서 15시간 더 교반하였다. 상기 반응 용액에 물을 넣어 반응을 종결한 후, 농축하고 에틸아세테이트를 넣어 추출하였다. 유기층을 무수황산마그네슘으로 건조한 후 여과하고, 여과액을 농축한 후 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제화합물(9.5 g)을 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.36-7.30(m, 5H), 5.32(br, 1H), 5.10(s, 2H), 4.19(q, 2H), 4.12(s, 2H), 3.72-3.65(m, 4H), 3.59-3.56(m, 2H), 3.41-3.38(m, 2H), 1.26(t, 3H).
단계 5. 2-(2-(2,2- 디메톡시에톡시 ) 에톡시 )에탄-1- 아민의 제조
상기 단계 4로부터 수득한 에틸 3-옥소-1-페닐-2,7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-오에이트(9.5 g, 29.198 mmol)를 무수 THF(60 mL)에 녹이고, 아르곤 분위기 하에 -78℃에서 디이소부틸알루미늄 하이드라이드(diisobutylaluminium hydride; DIBAL-H, 43.8 mL, 23.051 mmol)를 천천히 적가한 후 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 반응 용액에 10% 염산을 가하고 0℃에서 30분 동안 교반한 후 에틸아세테이트를 넣고 추출하였다. 유기층을 무수황산마그네슘으로 건조한 후 여과하고, 여과액을 농축하였다. 생성물을 아르곤 분위기 하에 메탄올(36 mL)에 녹이고 트리메틸오르소포르메이트(25.6 mL, 233.587 mmol), p-톨루엔술폰산(278 mg, 1.460 mmol)을 넣고 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 에틸아세테이트를 넣고 추출한 후 유기층을 무수황산마그네슘으로 건조한 후 여과하고, 여과액을 농축하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물은 다시 메탄올(40 mL)에 녹이고 10% Pd/C(780 mg, 0.4wt%)을 넣고 수소 분위기 하에 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 여과하고 여과액을 농축한 후 감압 건조하여 표제화합물(1.2 g)을 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.66(br, 2H), 4.54(t, 1H), 3.74-3.64(m, 6H), 3.65(d, 2H), 3.41(s, 6H), 3.01(t, 2H).
단계 6. 2-(2-(2- 아미노에톡시 ) 에톡시 )-N-(2-(2-(2,2- 디메톡시에톡시 ) 에톡시 )에틸)아세트아미드의 제조
상기 단계 3으로부터 수득한 3-옥소-1-페닐-2,7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-오익산(1.2 g, 5.951 mmol)를 아세토니트릴(70 mL)에 녹이고, BOP((benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, 2.8 g, 6.235 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-diisopropylethylamine; DIPEA, 3.0 mL, 17.003 mmol)을 넣은 후 상온에서 30분 동안 교반하였다. 상기 반응 용액에 단계 5로부터 수득한 2-(2-(2,2-디메톡시에톡시)에톡시)에탄-1-아민(1.7 g, 5.668 mmol)을 넣고 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 에틸아세테이트를 첨가하고 중조(탄산수소타느륨)으로 세척하였다. 이후 무수황산마그네슘을 사용하여 건조하고, 여과하여 여과액을 농축하고 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물은 다시 메탄올(30 mL)에 녹이고 10% Pd/C(640 mg, 0.4wt%)을 넣고 수소 분위기 하에 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 여과하고 여과액을 농축한 후 감압 건조하여 표제 화합물(중간체 1, 1.0 g)을 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.51(t, 1H), 4.02(s, 2H), 3.71-3.49(m, 16H), 3.41(s, 6H), 2.94(t, 2H).
제조예 2: 2 ,5- 디옥소피롤리딘 -1-일 (S)-24-(t-부톡시카보닐)-3-메톡시-12,21,26-트리옥소-2,5,8,14,17-펜타옥사-11,20,25-트리아자트리테트라콘탄-43-오에이트(중간체 2)의 합성
[반응식 2]
Figure PCTKR2018011626-appb-I000007
단계 1. 18-( 벤질옥시 )-18- 옥소옥타데칸산의 제조
톨루엔(3.7 L)에 옥타데칸이산(octadecandioic acid, 100 g, 318 mmol), p-톨루엔술폰산(756 mg, 3.975 mmol), 벤질알콜(26.4 mL, 254.4 mol)을 가하고 증류하였다. 상기 반응 용액에 셀라이트를 넣고 40℃로 냉각하여 1시간 동안 교반한 후 실리카겔에 여과하였다. 여과액을 감압 농축하고 50℃에서 헵탄을 가하였다. 고체를 여과하고 헵탄으로 세척한 후 건조하여 표제화합물(67.9 g)을 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.36-7.34(m, 5H), 5.11(s, 2H), 2.35(t, 4H), 1.64(t, 4H), 1.25(s, 24H).
단계 2. 1- 벤질 18-(2,5- 디옥소피롤리딘 -1-일) 옥타데칸디오에이트의 제조
상기 단계 1로부터 수득한 18-(벤질옥시)-18-옥소옥타데칸산(20.0 g, 49.433 mmol)을 N-히드록시석신이미드(6.8 g, 59.319 mmol), DIC(N,N'-diisopropylcarbodiimide, 12.24 g, 59.312 mmol)을 NMP(N-methyl-2-pyrrolidone, 200 mL)에 녹인 후, 60℃에서 2.5시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 반응 용액을 상온으로 냉각시켜 고체를 여과하였다. 여과액에 물을 가하고 생성된 고체를 여과하여 물로 세척하였다. 고체를 이소프로필알코올로 재결정하여 표제화합물(21.6 g)을 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.37-7.31(m, 5H), 5.11(s, 2H), 2.83(s, 2H), 2.60(t, 2H), 2.35(t, 2H), 1.77-1.53(m, 6H), 1.25(s, 24H).
단계 3. (S)-1-t-부틸 5-(2,5- 디옥소피롤리딘 -1-일) 2-(18-( 벤질옥시 )-18- 옥소옥타데칸아미도 )펜탄디오에이트의 제조
상기 단계 2로부터 수득한 1-벤질 18-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 옥타칸디오에이트(9.0 g, 17.940 mmol), L-글루타믹산 5-t-부틸 에스테르(3.8 g, 18.837 mmol)를 NMP(80 mL)에 넣고, 50℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 반응 용액을 상온으로 냉각시키고, 물(230 mL), 0.5 M 포타슘 바이설페이트(34 mL), 에틸아세테이트를 첨가하여 추출하였다. 유기층을 무수황산마그네슘을 사용하여 건조하고, 여과 후 여과액을 농축하였다. 생성물을 NMP(68 mL)에 녹인 후, N-히드록시석신이미드(3.3 g, 28.705 mmol), DCC(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide, 4.8 g, 23.323 mmol)를 가한 후, 상온에서 16시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하고 여과액을 물로 세척한 후 유기층을 무수황산마그네슘을 사용하여 건조하고, 여과하여 여과액을 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제화합물(4.9 g)을 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.36-7.32(m, 5H), 6.24(d, 1H), 5.12(s, 2H), 4.62-4.60(m, 1H), 3.39(t, 2H), 2.85(s, 4H), 2.80-2.73(m, 2H), 2.33(t, 2H), 2.25-2.00(m, 2H), 1.67-1.63(m, 4H), 1.48(s, 9H), 1.25(s, 24H).
단계 4. (S)-24-(t- 부톡시카보닐 )-3- 메톡시 -12,21,26- 트리옥소 -2,5,8,14,17-펜타옥사-11,20,25-트리아자트리테트라콘탄-43-오익산의 제조
상기 단계 3으로부터 수득한 (S)-1-t-부틸 5-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 2-(18-(벤질옥시)-18-옥소옥타데칸아미도)펜탄디오에이트(1.9 g, 2.814 mmol), 상기 제조예 1에 따라 준비한 중간체 1(1.0 g, 2.955 mmol), 트리에틸아민(1.2 mL, 8.443 mmol)을 아세트니트릴(40 mL)에 넣고 상온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후 반응 용액을 농축하고 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물을 메탄올(80 mL)에 녹이고 10% Pd/C(600 mg, 0.4wt%)을 넣고 수소 분위기 하에 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 여과한 후 여과액을 농축하고 감압 건조하여 표제화합물(1.1 g)을 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.21(br, 1H), 6.87(br, 1H), 6.66(d, 1H), 4.52(t, 1H), 4.41-4.37(m, 1H), 4.03(s, 2H), 3.70-3.47(m, 18H), 3.40(s, 6H), 2.36-2.20(m, 7H), 1.93-1.86(m, 1H), 1.63-1.61(m, 4H), 1.46(s, 9H), 1.25(s, 24H).
단계 5. (S)-2,5- 디옥소피롤리딘 -1-일 24-(t-부톡시카보닐)-3-메톡시-12,21,26-트리옥소-2,5,8,14,17-펜타옥사-11,20,25-트리아자테트라콘탄-43-오에이트의 제조
상기 단계 4로부터 수득한 (S)-24-(t-부톡시카보닐)-3-메톡시-12,21,26-트리옥소-2,5,8,14,17-펜타옥사-11,20,25-트리아자트리테트라콘탄-43-오익산(1.1 g, 1.293 mmol)을 디클로로메탄(35 mL)에 녹이고, N-히드록시석신이미드(164 mg, 1.422 mmol), EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, 297 mg, 1.551 mmol)를 넣은 후 상온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 중조로 세척하고 무수황산마그네슘을 사용하여 건조하였다. 여과하여 여과액을 농축하고 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제화합물(중간체 2, 778 mg)을 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.20(br, 1H), 6.75(br, 1H), 6.54(d, 1H), 4.51(t, 1H), 4.43-4.40(m, 1H), 4.01(s, 2H), 3.70-3.47(m, 18H), 3.39(s, 6H), 2.84(s, 4H), 2.60(t, 2H), 2.29-2.19(m, 5H), 1.99-1.98 (m, 1H), 1.75(t, 2H), 1.63-1.59(m,2H), 1.25(s, 24H);
MS(ESI+): [M+H]+ m/z 917.6.
실시예 1: 양말단에 알데하이드기를 갖는 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물( Ald -PEG-FA)의 제조
[반응식 3]
Figure PCTKR2018011626-appb-I000008
단계 1. 양말단에 아세탈기가 도입된 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물(Acetal-PEG-FA)의 제조
아세탈-PEG-아민(3.4kDa, n=평균 77, 370 mg, 0.11 mmol)을 디클로로메탄(22 mL)에 녹이고, 트리에틸아민(23 μL, 0.164 mmol), 상기 제조예 2에 따라 준비한 중간체 2(50 mg, 0.055 mmol)를 넣은 후 상온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액을 농축하고 MPLC로 정제하여 표제화합물(60 mg)을 수득하였다.
MS: MW 4100-4400.
단계 2. 양말단에 알데하이드기를 갖는 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물(Ald-PEG-FA)의 제조
상기 단계 4로부터 수득한 Acetal-PEG-FA(30 mg, 0.007 mmol)을 디클로로메탄(1 mL)에 녹이고 트리플루오로아세트산(53 μL, 0.714 mmol)을 넣은 후 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액을 농축하고 디에틸에테르로 재결정하여 표제화합물(18 mg)을 수득하였다.
MS: MW 3900-4300.
실시예 2: 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체와의 결합
상기 실시예 1에 따라 제조한, 반응기로서 양말단에 알데하이드기를 포함하는 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물을 링커로 사용하여 생리활성 폴리펩타이드의 일종인 인슐린의 베타 체인의 N-말단에 결합시키기 위하여, 인슐린 분말(Biocon, India)을 10 mM HCl에 용해시켜 준비하고, 인슐린과 상기 링커를 1:2의 몰비로 혼합하고, 인슐린 농도가 5 mg/mL이 되도록 하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이때 반응은 50 mM 구연산 나트륨 완충액(sodium citrate, pH 5.0)과 아이소프로판올(isopropanol)의 혼합 용매에서, 소디움 시아보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride; SCB; NaCNBH3) 환원제를 첨가하여 수행하였다. 반응액은 구연산 나트륨(pH 3.0), 에탄올이 포함된 완충액과 염화칼륨 농도 구배를 이용한 SP-HP(GE, 미국) 컬럼을 사용하여 정제하였다.
실시예 3: 면역글로불린 Fc가 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물로 결합된 단백질 결합체의 제조
다음으로, 상기 실시예 2에 따라 제조한, 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물과 인슐린이 결합된 연결체를 생체적합성 물질의 일종인 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단과 결합시키기 위하여, 실시예 2의 연결체와 면역글로불린 Fc 단편을 1:10의 몰비가 되도록 혼합하되, 전체 단백질 농도를 20 mg/mL로 조절하여 25℃에서 12 내지 18시간 동안 반응시켰다. 이때, 반응액은 염화 나트륨을 함유하는 100 mM HEPES 완충액(pH 8.2)을 사용하였으며, 환원제로서 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드를 첨가하였다. 반응을 종료한 후, 상기 반응액을 트리스(pH 7.5) 완충액과 염화칼슘 농도 구배를 이용한 Q-HP 컬럼(GE, 미국)을 이용하여 정제 후, 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 컬럼(Superdex 200, GE, 미국)을 사용하여 미반응된 단백질을 분리하였다. 나아가, 염화나트륨과 트리스(pH 6.0)의 농도 구배를 이용한 Sourse 15 Q 컬럼(GE, 미국)에 적용하여, 인슐린 및 면역글로불린 Fc 단편이 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물 링커를 통해 공유결합으로 연결된 결합체만을 정제하였다. 제조된 단백질 결합체는 SDS-PAGE로 확인하였다(도 1).
실시예 4: 단백질 결합체의 in vivo 약동학(pharmacokinetics) 확인
상기 실시예 3에 따라 제조한 단백질 결합체의 인 비보(in vivo) 약물동태를 확인하고, 기존의 인슐린에 비해 생체 내 지속성이 증가되었는지를 비교하였다. 구체적으로, 정상 동물 모델로 널리 사용되는 SD 랫드를 약물 동력학 확인에 사용하였다. 비절식 8주령 정상 랫드를 인간 인슐린 투여군(172 nmol/kg), 면역글로불린 Fc-PEG-인슐린 결합체 투여군(3.88 nmol/kg) 및 실시예 3의 단백질 결합체 즉, 면역글로불린 Fc-비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체-인슐린 복합체(편의를 위하여, 이하 실시예 및 도면에서 '면역글로불린 Fc-지방산 유도체-인슐린'으로 간략히 표기함) 투여군(3.88 nmol/kg)으로 각각 나누었다. 정상 랫드에 상기 시험물질을 각 군마다 3마리씩 단회 피하 주사 투여 후 인간 인슐린 투여군의 경우는 0.25, 0.75, 1, 1.5, 2, 3 및 5시간에, 면역글로불린 Fc-PEG-인슐린 결합체 투여군 및 실시예 3의 단백질 결합체인, 면역글로불린 Fc-지방산 유도체-인슐린 결합체 투여군의 경우에는 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120 및 144시간에 미정맥 채혈을 통해 전혈을 수집하였다. 전혈을 1.5 mL 용량의 마이크로 튜브에 넣고 5,000 rpm으로 10분간 상온에서 원심 분리하여 혈청을 분리한 뒤, -20℃에 보관하였다. 보관된 각 군의 혈청은 ELISA 분석법을 이용하여 혈청 내 인슐린 결합체의 농도를 정량화하였다. ELISA 분석은 인슐린 단 클론 항체가 코팅된 플레이트(ALPCO, #80-INSHU-E10.1)에 각 시간에 취하여진 혈청과 항 인간 IgG4-HPR(Alpha Diagonosis, #10124)를 동시에 넣고, 한 시간 동안 상온에서 반응시킨 뒤, TMB 시약으로 발색 반응시키고, 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하는 방식으로 하였다. 약물 동력한 파라미터는 시간당 혈청 농도를 바탕으로 Phoenix™ WinNonin 7.0을 이용하여 산출하여 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 면역글로불린 Fc-PEG-인슐린 결합체 및 면역글로불린 Fc-지방산 유도체-인슐린 결합체는 모두 인간 인슐린에 비해 지속성이 현저히 증가되었다. 특히, 면역글로불린 Fc-지방산 유도체-인슐린 결합체의 경우, 동량으로 투여한 면역글로불린 Fc-PEG-인슐린 결합체와 비교하여, 각각의 반감기는 35.8시간과 14.8시간으로 측정되었다. 이는 본 발명의 면역글로불린 Fc-지방산 유도체-인슐린 결합체에서 체내 지속성이 향상되었음을 나타내는 것이다. 특히, 새롭게 링커로 제안한 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체의 우수한 효과를 시사하는 것이다.
이와 같은 결과는, 본 발명에서 새롭게 제안하는 생리활성 폴리펩타이드 및 생체 적합성 물질을 연결시키는 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 링커가 획기적으로, 결합된 생리활성 폴리펩타이드의 지속성을 증가시켜, 투여 용량 및 횟수를 줄일 수 있는 새로운 약물 플랫폼으로서의 지위를 제공할 수 있음을 제안하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (23)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018011626-appb-I000009
    상기 화학식 1에서,
    L1 내지 L3은 각각 독립적으로 직쇄 또는 분지쇄 C1-6 알킬렌이고,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 2,5-디옥소피롤리디닐, 2,5-디옥소피롤릴, 알데하이드, 말레이미드, C6-20 아릴디설파이드, C5-20 헤테로아릴디설파이드, 비닐술폰, 티올, 할로겐화 아세트아미드, 석신이미드, p-니트로페닐 카보네이트, C7-10 알키닐, 이황화 오르토피리딜(orthopyridyl disulfide; OPSS), 할로겐 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되며,
    m1 내지 m3은 각각 독립적으로 1 내지 2400의 자연수이고,
    n은 1 내지 40의 자연수임.
  2. 제1항에 있어서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 말레이미드, N-하이드로석신이미드, 석신이미드, 포름알데하이드, 아세트알데하이드, 프로피온알데하이드, 부틸알데하이드, 오르소피리딜 디설파이드(Orthopyridyl disulfide; OPSS), 요오드화 아세트아마이드, 상기 요오드 대신에 브롬, 불소, 염소, 아스타틴 또는 테네신을 포함하는 할로겐화 아세트아마이드, 디플루오로사이클로옥틴(difluorocyclooctyne; DIFO), 디벤조사이클로옥틴(dibenzocyclooctyne; DIBO), 디벤조-아자-사이클로옥틴(Dsibenzo-aza-cyclooctyne; DIBAC 또는 DBCO), 바이아릴아자사이클로옥티논(biarylazacyclooctynones; BARAC), 테트라메틸티아사이클로헵틴(tetramethylthiacycloheptyne; TMTH), 바이사이클로노닌(bicyclononyne; BCN) 손드하이머 디인(Sondheimer diyne), 사이클로옥틴(cyclooctyne; OCT), 단불소화 사이클로옥틴(monofluorinated cyclooctyne; MOFO), 디메톡시아자사이클로옥틴(dimethoxyazacyclooctyne; DIMAC), 2,3,6,7-테트라메톡시-디벤조사이클로옥틴(2,3,6,7-tetramethoxy-DIBO, TMDIBO), 술폰화 디벤조사이클로옥틴(sulfonylated DIBO; S-DIBO), 카르복시메틸모노벤조사이클로옥틴(carboxymethylmonobenzocyclooctyne; COMBO), 피롤로사이클로옥틴(pyrrolocyclooctyne; PYRROC) 또는 C7-10 알키닐인 것인, 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 생리활성 폴리펩타이드 및 생체적합성 물질이 링커인 하기 화학식 2로 표시되는 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물과 공유결합으로 연결된, 단백질 결합체:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2018011626-appb-I000010
    상기 화학식 2에서,
    L1 내지 L3은 각각 독립적으로 직쇄 또는 분지쇄 C1-6 알킬렌이고,
    Non-Pep은 비펩타이드성 중합체이며,
    m1 및 m2은 각각 독립적으로 1 내지 2400의 자연수이고,
    n은 1 내지 40의 자연수임.
  4. 제3항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물은 지방산 골격에 직접 또는 링커를 통해 연결된 두 개 이상의 반응기를 가지며, 상기 반응기를 통해 생리활성 폴리펩타이드 및 생체적합성 물질과 각각 연결된 것인, 단백질 결합체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 링커는 C1-3 알킬아미노, (C1-3 알콕시)n(C1-3 알킬아미노) 사슬(여기서, n은 1 내지 3의 정수)을 포함하는 것인, 단백질 결합체.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 단독 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단독 중합체, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 지방산, 키틴, 히알루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인, 단백질 결합체.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 중합단위 1 내지 2400개의 폴리에틸렌 글리콜인 것인, 단백질 결합체.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체적합성 물질을 기준으로 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 연결체가 1개 이상 연결된 것인, 단백질 결합체.
  9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드는 호르몬, 사이토카인, 인터루킨, 인터루킨 결합 단백질, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질 또는 수용체, 세포표면항원 또는 수용체 길항물질인, 단백질 결합체.
  10. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드는 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 글루카곤 유사 펩타이드-2(GLP-2), 글루카곤, GIP(Gastric inhibitory polypeptide), 옥신토모듈린, 제닌(Xenin), 인슐린, CCK(Cholecystokinin) 아밀린(amylin), 가스트린(gastrin), 그렐린(ghrelin), PYY(peptide YY) 등과 같이 위나 장에서 혈당과 체중을 조절하는 인크레틴류(incretins); 렙틴(Leptin), 아디포넥틴(adiponectin), 아디포린(adipolin), 아페린(apelin), 카르토넥틴(cartonectin)과 같이 지방질(adipose)에서 분비되는 아디포카인류(adipokines); 키스펩틴(Kisspeptin), 네스파틴-1(Nesfatin-1)과 같이 뇌에서 분비되는 뉴로펩타이드류(neuropeptides); 이리신(Irisin), 마이오넥틴(myonectin), 데코린(decorin), 폴리스타틴(follistatin), 머슬린(musclin)과 같이 머슬(muscle)에서 분비되는 펩타이드 혹은 단백질류; 혈관작동성장펩타이드(Vasoactive intestinal peptide), 나트륨이뇨펩타이드류(natriuretic peptides), 호중구 증가 인자(G-CSF), 인간 성장 호르몬(hGH), 에리스로포이에틴(EPO), 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론, 인터페론 수용체, 지프로테인 관련수용체(G protein-coupled receptor), 인터루킨류, 인터루킨 수용체, 효소류, 인터루킨 결합 단백질, 사이토카인 결합 단백질, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, VIII, Ⅸ, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단백질 결합체.
  11. 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드는 2개 이상의 수용체를 동시에 활성화시키는 것을 특징으로 하는 단백질 결합체.
  12. 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체적합성 물질은 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG), 콜레스테롤, 알부민 및 이의 단편, 알부민 결합물질, 특정 아미노산 서열의 반복단위의 중합체, 항체, 항체 단편, FcRn 결합물질, 생체 내 결합조직 혹은 그 유도체, 뉴클레오타이드, 파이브로넥틴, 트랜스페린(Transferrin), 사카라이드(saccharide), 고분자 중합체 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 단백질 결합체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 FcRn 결합물질은 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드인 것인, 단백질 결합체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 비당쇄화된 것인, 단백질 결합체.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 힌지(hinge) 영역을 추가로 포함하는 것인, 단백질 결합체.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, 이들의 조합(combination) 및 이들의 하이브리드(hybrid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단백질 결합체.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 단편인 것인, 단백질 결합체.
  18. (a) 생리활성 펩타이드 및 생체적합성 물질을 두 개 이상의 반응기를 갖는, 하기 화학식 3으로 표시되는, 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물을 통해 연결하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 반응 결과물인 단백질 결합체를 분리하는 단계를 포함하는, 단백질 결합체를 제조하는 방법:
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2018011626-appb-I000011
    상기 화학식 3에서,
    L1 내지 L3은 각각 독립적으로 직쇄 또는 분지쇄 C1-6 알킬렌이고,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 2,5-디옥소피롤리디닐, 2,5-디옥소피롤릴, 알데하이드, 말레이미드, C6-20 아릴디설파이드, C5-20 헤테로아릴디설파이드, 비닐술폰, 티올, 할로겐화 아세트아미드, 석신이미드, p-니트로페닐 카보네이트, C7-10 알키닐, 이황화 오르토피리딜(orthopyridyl disulfide; OPSS), 할로겐 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되며,
    Non-Pep은 비펩타이드성 중합체이고,
    m1 내지 m3은 각각 독립적으로 1 내지 2400의 자연수이며,
    n은 1 내지 40의 자연수임.
  19. 제18항에 있어서, 상기 (a) 단계는
    (a1) 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 하나의 반응기에 생체적합성 물질과 생리활성 폴리펩타이드 중 어느 하나를 연결시키는 단계;
    (a2) 상기 (a1) 단계의 반응 혼합물로부터 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물과 생체적합성 물질 또는 생리활성 폴리펩타이드 중 어느 하나가 연결된 연결체를 분리하는 단계; 및
    (a3) 상기 (a2) 단계에서 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 다른 하나의 반응기에 생체적합성 물질과 생리활성 폴리펩타이드 중 다른 하나를 연결하여, 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 두 개 이상의 반응기가 각각 생리활성 폴리펩타이드와 생체적합성 물질에 연결된 단백질 결합체를 생성하는 단계를 포함하는, 단백질 결합체를 제조하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 (a1) 단계 및 (a3) 단계는 환원제의 존재하에서 수행되는 것인, 단백질 결합체를 제조하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 환원제는 나트륨 시아노 보로하이드라이드(NaCNBH3), 수소화붕소나트륨, 디메틸아민 붕산염, 피콜린 보란 컴플렉스 또는 피리딘 붕산염(borane pyridine)인 것인, 단백질 결합체를 제조하는 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a1) 단계에서 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물의 반응 몰비는 1:1 내지 1:20이고, 생체적합성 물질과 지방산의 반응 몰비는 1:1 내지 1:20인 것인, 단백질 결합체를 제조하는 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a3) 단계에서 (a2) 단계에서 분리된 연결체와 생체적합성 물질 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 몰비는 1:0.5 내지 1:20인 것인, 단백질 결합체를 제조하는 방법.
PCT/KR2018/011626 2017-09-29 2018-10-01 링커로서 비펩타이드성 중합체 결합 지방산 유도체 화합물을 포함하는 단백질 결합체 및 이의 제조방법 WO2019066609A1 (ko)

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