KR20050025974A - 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드 유도체 - Google Patents

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Abstract

폴리에틸렌 글리콜 화합물이 제공되었다. 이러한 화합물의 제조 및 사용 방법이 제공되었고, 화학 중간체 또한 제공되었다.

Description

폴리에틸렌 글리콜 알데하이드 유도체{POLYETHYLENE GLYCOL ALDEHYDE DERIVATIVES}
본 발명은 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드, 이러한 유도체의 제조 및 이용 방법, 예컨대 폴리펩타이드 및 다른 생체분자의 페길화(pegylation)에서의 이용방법에 관한 것이다.
폴리에틸렌 글리콜("PEG")은 다양한 분자량으로 입수가능한 선형 또는 분지형의 중성 폴리에터이다. PEG의 구조는 HO-(CH2-CH2-O)n-H 이며, 상기 구조에서 n은 에틸렌 옥사이드 단위의 반복 회수를 나타낸다.
PEG 및 PEG 유도체는 다양한 생체분자를 변형시키기 위해 사용되어 왔다. PEG는 이러한 분자에 부착되는 경우 용해도 및 크기를 증가시키지만 바람직한 물성에는 거의 영향을 미치지 않는다. 유리하게도, PEG가 결합된 생체분자는 신체 내에서 증가된 체류 및 지연된 대사를 나타낸다.
다양한 PEG 유도체가 이러한 응용을 위해 개발되었다. 이러한 PEG 유도체는 미국 특허 제 US 5,252,714 호, 제 5,672,662 호, 제 5,959,265 호, 제 5,990,237 호 및 제 6,340,742 호에 개시되어 있다.
PEG의 작용성화를 위해 2가지의 일반적인 접근법이 사용되어 왔다: (1) 일련적인 반응을 통한 말단 하이드록실기의 더 활성적인 작용기로의 변화; 및/또는 (2) 작용기 중 하나가 PEG 고분자와 반응하고 나머지는 활성이 남아 있도록 조절된 조건하에서 PEG와 이작용성 화합물과의 반응. 대부분의 경우에 있어서 원하는 PEG 유도체를 수득하기 위해서 여러 단계가 수행되어야 한다. 원하는 PEG 유도체는 종종 수율이 낮게 생성되고, 단리하는데 복잡한 정제 과정이 요구된다. 더욱이, PEG 유도체는 흥미있는 생체분자로의 비특정 결합을 나타낼 수 있고, 이로 인해 단일 생체분자에 부착된 복수의 PEG 및/또는 활성 부위에서의 PEG 부착이 초래될 수 있다. 복수의 PEG 부착은 페길화된 생체분자의 정제를 어렵게 하는 원인이 될 수도 있다. 복수의 PEG 부착 및/또는 활성 부위에서의 페길화는 또한 생체분자의 활성 저하를 초래할 수 있다.
따라서, α-아미노기를 포함하는 폴리펩타이드 및 다른 생체분자를 포함하는 다른 여러 분자들과의 접합에 적합한 개선된 PEG 유도체를 제공하는 것이 유리하다. 높은 수율 및 순도로 생성될 수 있고, 접합되어 개선된 성능 특성을 가진 생체분자를 제공하는 PEG 유도체를 제공할 필요가 있다.
본 발명의 상기 및 기타 목적이 하기에 더욱 자세히 기술된다.
본 발명의 화합물은 하기 일반 화학식 I을 갖는 폴리에틸렌 글리콜의 알데하이드 유도체이다.
상기 식에서,
R1은 캡핑기(capping group)이고,
X는 O 또는 NH이고,
Y는 [상기 식에서, Z는 아미노산의 측쇄이고, m은 1 내지 17이다]로 구성된 군에서 선택되고,
n은 10 내지 10,000이고,
p는 1 내지 3이다.
본 발명은 또한 하기 화학식 II의 화합물을 제공한다:
상기 식에서,
R1, m, n 및 p는 상기에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 또다른 바람직한 태양은 하기 화학식 VIII의 이작용성 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드 화합물을 제공한다:
상기 식에서,
m, n 및 p는 상기에서 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 하기 화학식 IX의 중간체 화합물을 제공한다:
상기 식에서,
R1, X, Y, Z, m, n 및 p는 상기에서 정의된 바와 같다.
본 발명은 하기 화학식 X의 중간체 화합물을 추가로 제공한다:
상기 식에서,
R1, m, n 및 p는 상기에서 정의된 바와 같다.
또한 본 발명은 화학식 XI의 중간체 화합물을 제공한다:
상기 식에서,
각각의 m, n 및 p는 서로 동일하거나 상이하고, 상기에서 정의된 바와 같다.
본 발명은 하기 화학식 IX의 화합물을 가수분해하여 하기 화학식 I의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드를 생성하는 것을 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드를 제조하는 방법을 추가로 제공한다:
화학식 IX
화학식 I
상기 식에서,
R1, X, Y, Z, m, n 및 p는 상기에서 정의된 바와 같다.
본 발명이 "제조 방법"과 관련이 있는 경우에는 "제조 공정"을 의미한다.
본 발명은 또한 하기 화학식 X의 화합물을 가수분해하여 하기 화학식 II의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드를 생성하는 것을 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드를 제조하는 방법을 제공한다:
화학식 X
화학식 II
상기 식에서,
R1, m, n 및 p는 상기에서 정의된 바와 같다.
본 발명은 하기 화학식 XVII의 화합물을 가수분해하여 하기 화학식 VIII의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드를 생성하는 것을 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드를 제조하는 방법을 제공한다:
화학식 VIII
상기 식에서,
m, n, 및 p는 상기에서 정의된 바와 같다.
본 발명은 폴리펩타이드 및 다른 생체분자의 페길화에 관련되어 사용될 수 있는 다양한 화합물 및 화학 중간체와 방법을 제공한다. 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드의 새로운 화학 구조를 제공한다.
본 발명의 화합물은 일반 화학식 I을 갖는 폴리에틸렌 글리콜의 알데하이드 유도체이다:
화학식 I
상기 식에서,
R1은 캡핑 그룹이고,
X는 O 또는 NH이고,
Y는 [상기 식에서, Z는 아미노산의 측쇄이고, m은 1 내지 17이다]로 구성된 군에서 선택되고,
n은 10 내지 10,000이고,
p는 1 내지 3이다.
본원에서 사용된 R1 "캡핑기"는, 필요에 따라서 일반적으로 다른 화학 잔기와 비반응성 또는 반응성인 임의의 적합한 화학기이다. 상기 화학식의 말단 알데하이드기는 흥미 있는 화학 잔기, 예컨대 폴리펩타이드의 α-아미노기에 쉽게 공유 부착을 허용한다. R1 캡핑기는 이작용성, 예를 들어 제 2의 흥미 있는 화학 잔기에의 공유 부착을 허용하거나 방지하도록 선택된다.
캡핑기가 일반적으로 다른 화학 잔기와 비반응성인 경우 R1은 상대적으로 비활성이다. R1이 상대적으로 비활성이라면, 생성된 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드의 구조는 일작용기이고, 따라서 흥미 있는 단지 하나의 화학 잔기와 공유 결합한다. 적합한 일반적 비반응성 R1 캡핑기는 수소, 하이드록실, 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 사이클로알킬, 저급 알케닐, 저급 사이클로알케닐, 아릴 및 헤테로아릴을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "저급 알킬"은 1 내지 7, 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 분지-쇄 알킬기를 의미하며, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-부틸, 2차 부틸, 3차 부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸 등을 포함한다.
용어 "저급 알콕시"는 산소 원자를 통해 결합된 상기 저급 알킬기를 의미하는데, 저급 알콕시기의 예로는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 아이소프로폭시, n-부톡시, 2차 부톡시, 3차 부톡시, n-펜톡시 등이 있다.
용어 " 저급 사이클로알킬"은 3 내지 7, 바람직하게는 4 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 치환 또는 비치환된 사이클로알킬기를 의미하며, 예컨대 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 또는 사이클로헵틸을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "저급 알케닐"은 2 내지 7, 바람직하게는 2 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 분지-쇄 알케닐기를 의미하며, 예컨대 에테닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐 등을 포함한다.
용어 "저급 사이클로알케닐"은 4 내지 7개의 탄소 원자를 갖는 치환 또는 비치환된 사이클로알케닐기를 의미하며, 예컨대 사이클로부테닐, 사이클로펜테닐, 사이클로헥세닐 등을 포함한다.
용어 "아릴"은 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 트라이플루오로메틸, 하이드록실, 카복시산, 카복실릭 에스터, 니트로, 아미노 또는 페닐, 특히 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 트라이플루오로메틸, 하이드록실, 니트로 아미노 및 페닐에 의해 비치환되거나 선택적으로 일- 또는 다-치환된 페닐 또는 나프틸기를 의미한다.
용어 "헤테로아릴"은 N, S 및 O로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 5- 또는 6-원의 헤테로방향족기를 의미한다.
일반적 비반응성 R1 캡핑기로는 메톡시, 하이드록실 또는 벤질옥시가 바람직하다. 특히 바람직한 R1 캡핑기는 메톡시이다. R1이 메톡시인 경우, 알데하이드 및 관련 화합물은 본원에서 종종 "mPEG" 화합물(여기서, m은 메톡시를 나타낸다)로 언급된다.
R1 캡핑기가 다른 화학 잔기와 일반적으로 반응성인 경우, R1은 여러 다른 작용기, 예컨대 펩타이드 및/또는 단백질 중의 아민 및/또는 설프하이드릴과 반응할 수 있는 작용기이다. 이런 경우, R1은 반응을 위해 강한 촉매 또는 아주 비현실적 반응 조건을 요구하는 기들과 대비하여 다른 분자 상에서 친전자성 또는 친핵성의 기들과 용이하게 반응할 수 있는 작용기일 수 있다. R1이 상대적으로 반응성인 경우, 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드는 이작용성이고, 따라서 2개의 화학 잔기와 공유 결합할 수 있다.
적합한 일반적 반응성 R1 캡핑기의 예로는 할로겐, 에폭사이드, 말레이마이드, 오르토피리딜 다이설파이드, 토실레이트, 아이소시아네이트, 하이드라진 하이드레이트, 시아누릭 할라이드, N-석신이미딜옥시, 설포-N-석신이미딜옥시, 1-벤조트라이아졸릴옥시, 1-이미다졸릴옥시, p-니트로페닐옥시 및, 이다.
용어 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 의미한다.
바람직한 일반적 반응성 R1 캡핑기는 이다. 이 R1 기를 사용하면 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드의 양 말단 상에 알데하이드기가 있는 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드가 생성된다. 따라서, 생성물 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드는 양 말단 상에 결합성을 나타낸다. 그러나, 이러한 이작용성 화합물은 완전히 대칭일 필요가 없고, 화학식 중에 첫번째 m, n, 및/또는 p는 두번째 m, n 및/또는 p와 동일하거나 상이할 수 있는 것으로 이해된다. 그러나 대칭적 화합물, 즉 두 m이 동일한 값, 두 n이 동일한 값 및 두 p가 동일한 값인 화합물이 바람직하다.
본 발명의 화합물에서 X는 O 또는 NH이다. 바람직하게는, X는 O이다. 추가로, Y는 [상기 식에서, Z는 아미노산의 측쇄이다]로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명에서 m은 1 내지 17이다. 바람직한 태양에서는 m은 1 내지 14이다. 더 바람직하게는 m은 1 내지 7, 더욱 더 바람직하게는 m은 1 내지 4이다. 가장 바람직하게는 m은 1이다.
일반식 를 갖는 Y기의 경우, Y기는 펩타이드 결합을 통한 아미노산에의 결합을 나타낸다. 따라서, 단일 글리신이 아미노산으로서 사용되는 경우, 상기 일반 구조는 하기의 간단한 특정 구조로 된다:
Z가 CH3인 경우, 아미노산이 알라닌이다. Z가 CH2OH인 경우에는 아미노산이 세린이다.
명백히, 하기에 나타낸 다양한 아미노산 구조의 조사로부터 알 수 있듯이, 더 많은 상이한 아미노산이 이용되는 경우에는 더 복잡한 구조가 가능하다. 바람직하게는 단지 하나의 아미노산이 사용된다.
본 발명에서, n은 10 내지 10,000이다. 본 발명의 바람직한 태양에서는, n은 20 내지 5,000이다. 바람직하게는, n은 50 내지 2,500이고, 더욱 바람직하게는, n은 75 내지 1,000이다. 가장 바람직하게는, n은 100 내지 750이다.
본 발명에서 p는 1 내지 3이다. 바람직하게는, p는 3이다.
바람직한 태양에서는, p는 3, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이거나; p는 2, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이거나; p는 1, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이다.
본 발명의 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 II 내지 VI의 화합물을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
화학식 II
바람직한 R1 캡핑 잔기는 상대적으로 비반응성이고, 메톡시, 하이드록시 및 벤질옥시가 바람직하다.
본 발명의 바람직한 화합물은 상기의 A 군에 속한다. 따라서 본 발명은 하기 화학식 II의 화합물을 제공한다:
화학식 II
상기 식에서,
R1, m, n 및 p는 상기에서 정의된 바와 같다.
바람직한 태양에서 R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이다. 더 바람직하게는, p는 3, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이다.
본 발명의 또다른 바람직한 태양은 화학식 VIII의 이작용성 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드 화합물이다:
화학식 VIII
상기 식에서,
m, n 및 p는 상기에서 정의된 바와 같다.
바람직한 태양에서, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이다. 더 바람직하게는, p는 3, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이다.
본 발명은 또한 상기한 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드 화합물로 전환될 수 있는 다양한 화학 중간체를 제공한다. 이 중간체는 하기 화합물 IX의 화합물을 포함한다:
화학식 IX
상기 식에서,
R1, X, Y, Z, m, n 및 p는 상기에서 정의된 바와 같다.
바람직한 태양에서는, p는 3, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이거나; p는 2, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이거나; p는 1, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이다.
본 발명은 하기 화학식 X의 중간체 화합물을 추가로 제공한다:
화학식 X
상기 식에서,
R1, m, n 및 p는 상기에서 정의된 바와 같다.
바람직한 태양에서, p는 3, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이거나; p는 2, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이거나; p는 1, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이다.
하기 화합물 XI의 중간체 화합물 또한 제공한다.
화학식 XI
상기 식에서,
각각의 m, n 및 p는 동일하거나 상이하고, 상기에서 정의된 바와 같다.
바람직한 태양에서, p는 3, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이거나; p는 2, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이거나; p는 1, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이다.
본 발명의 화합물은 공지된 시약과 방법을 사용하여 임의의 적합한 방법으로 생성될 수 있다. 그러나, 본 발명은 하기 화학식 IX의 화합물을 가수분해하여 하기 화학식 I의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드를 생성하는 것을 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드를 제조하는 특정의 방법을 제공한다:
화학식 IX
화학식 I
상기 식에서,
R1, X, Y, Z, m, n 및 p는 상기에서 정의된 바와 같다. 바람직하게는, 가수분해는 산으로 촉매된다. 적합한 촉매 산은 트라이플루오로아세트산, 염산, 인산, 황산 및 질산을 포함한다. 바람직한 산은 트라이플루오로아세트산이다.
바람직한 태양에서는, p는 3, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이거나; p는 2, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이거나; p는 1, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이다.
화학식 II의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드 화합물은 또한 임의의 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다. 예로서, 화학식 II의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드는 하기 기술된 방법에 의해 생성될 수 있다: 첫째, 폴리에틸렌 글리콜을 건조시킨다. 둘째, 폴리에틸렌 글리콜을 아세트산의 할로겐화된 유도체와 반응시킨다. 생성된 반응 혼합물을 가수분해시켜 PEG 카복시산을 생성시킨다. 다르게는, 생성물 PEG 카복시산은 건조 단계 후 PEG의 직접 산화로부터 유도될 수도 있다. 다음 단계로, PEG 카복시산을 다이에틸 아세탈의 유도체와 반응시켜 PEG 아세탈 아민을 생성시킨 다음, 이를 할로겐화된 카복시산과 반응시켜 상기 화학식의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드를 생성시킨다. 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드 생성물을 회수한 후 정제시킨다.
폴리에틸렌 글리콜 알데하이드 생성물을 임의의 적합한 방법으로 회수하고 정제시킬 수 있다. 예로서, 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드 생성물은 다이클로로메탄으로 추출할 수 있다. 유기층을 나트륨 설페이트 상에서 건조시키고, 여과 및 농축시켜 다이에틸 에터로 침전시킨다. 생성물인 PEG 알데하이드는 여과에 의해 회수하고 진공상태에서 건조시킨다.
그러므로, 본 발명은 하기 화학식 X의 화합물을 가수분해하여 하기 화학식 II의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드를 생성하는 것을 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드를 제조하는 방법을 제공한다:
화학식 X
화학식 II
상기 식에서,
R1, m, n 및 p는 상기에서 정의된 바와 같다.
화학식 X의 화합물은 하기 화학식 XII의 화합물을 하기 화학식 XIII의 화합물과 반응시킴으로써 생성될 수 있다:
PEG 산 또는 PEG 카복시산을 제조하는 또다른 방법은 직접 산화법이다. 이 경우에 산화제, 예컨대 CrO3 또는 K2Cr2O7/H2SO 4, HNO3가 암모늄 바나데이트 또는 조운스(Jone's) 시약(CrO3 및 H2SO4)의 존재하에 사용될 수 있다.
화학식 XII의 화합물은 하기 화학식 XIV의 화합물의 가수분해에 의해 생성될 수 있다:
상기 식에서,
R3은 분지 또는 비분지된 C1-C4 알킬이다.
화학식 XIV의 화합물은 하기 화학식 XV의 화합물과 하기 화학식 XVI의 화합물을 반응시킴으로써 생성될 수 있다:
상기 식에서,
R2는 할로겐이다. 바람직하게는 R2는 브롬 또는 염소이다. 화합물 XVI의 적합한 화합물은 t-부틸 브로모아세테이트, 메틸 브로모아세테이트, 에틸 브로모아세테이트, t-부틸 클로로아세테이트, 메틸 클로로아세테이트 및 에틸 클로로아세테이트이다. 이 반응 단계에 사용될 수 있는 다른 시약, 즉 화학식 XVI의 대체물질은, 예를 들면 칼륨 t-부톡사이드, 알칼리 금속 하이드라이드, 예컨대 나트륨 하이드라이드, 또는 칼륨 나프탈라이드의 존재하의 t-부틸 브로모아세테이트, 메틸 브로모아세테이트, 에틸 브로모아세테이트, t-부틸 클로로아세테이트, 메틸 클로로아세테이트 또는 에틸 클로로아세테이트이다. 바람직하게는, 화학식 XVI의 화합물은 t-부틸 브로모아세테이트이다.
바람직한 태양에서, p는 3, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이거나; p는 2, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이거나; p는 1, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이다.
화학식 III 내지 VI의 화합물(각각 B 내지 E 군으로도 지칭됨)은 마찬가지로 임의의 적합한 수단에 의해 제조될 수 있다. 예로서, 화학식 III 내지 VI( B 내지 E군)을 생성시키기 위해 하기 반응식들이 사용될 수 있다.
상기에서 논의된 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드와 같이, 이작용성 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드는 임의의 적합한 수단에 의해 생성될 수 있다. 본 발명은 하기 화학식 XVII의 화합물을 가수분해하여 하기 화학식 VIII의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드를 생성하는 것을 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드를 제조하는 방법을 제공한다:
화학식 XVII
화학식 VIII
상기 식에서,
m, n 및 p는 상기에서 정의된 바와 같다.
화학식 VI의 화합물은 하기 화학식 XVIII의 화합물과 하기 화학식 XIX의 화합물을 반응시켜 생성될 수 있다:
화학식 XVIII의 화합물은 하기 화학식 XX의 화합물을 가수분해시켜 생성될 수 있다:
상기 식에서,
R3은 분지 또는 비분지된 C1-C4 알킬이다.
화학식 XX의 화합물은 하기 화학식 XXI의 화합물과 하기 화학식 XVI의 화합물을 반응시켜 생성될 수 있다:
화학식 XVI
상기 식에서,
R2는 할로겐이다.
상기에서 논의된 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드 조성물은 임의의 적합한 방법을 사용하여 생체분자를 비롯한 다양한 분자를 유도하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 PEG 알데하이드 화합물은 펩타이드 및 다른 생체분자의 페길화에 대해 N-말단 부위-특정적이다. 본 발명의 PEG 알데하이드는 PEG와 생체분자 또는 단백질 사이에 안정한 2차 아민 결합을 형성하는 생체분자 또는 단백질의 N-말단 α-아미노기와의 접합체를 형성한다.
본 발명의 PEG 알데하이드와 페길화된 생체분자는 PEG 부착의 수 및 위치에 있어 재현성을 보여주므로 그다지 복잡하지 않게 정제시킬 수 있다. 이 부위-특정적인 페길화는, 생체분자 또는 펩타이드가 세포의 수용체에 결합하는 부위로부터 페길화 부위가 멀리 있는 접합체를 생성할 수 있고, 이는 페길화된 생체분자, 단백질 또는 펩타이드가 대부분 또는 모든 생물학적 활성을 보유하는 것을 허용할 것이다. 본 발명의 PEG-알데하이드는 알파(α)-아미노기를 포함하는 임의의 생체분자와 반응할 수 있다.
선택된 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드에 따라 폴리에틸렌 글리콜은 한쪽 말단(일작용성 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드) 또는 양쪽 말단(이작용성 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드)에서 생체분자와 공유 결합될 수 있다.
상기에 기술된 바와 같이, 본발명의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드는 N-말단 부위-특정적 페길화에 사용될 수 있다. 부위-특정적 N-말단 결합은 단일 폴리펩타이드의 가교-결합 및 다중 유도가 없는 페길화된 폴리펩타이드를 생성한다. 이 부위-특정적 공유 결합을 생성시키기 위해 임의의 적합한 반응 조건이 사용될 수 있다. 일반적으로, 반응 혼합물의 pH는 페길화될 폴리펩타이드의 α-아미노산을 활성화시키기에 충분한 산성이다. 전형적으로, pH는 약 5.5 내지 7.4, 바람직하게는 약 6.5이다.
따라서, 폴리에틸렌 글리콜 분자를 폴리펩타이드에 부착하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 적어도 하나의 하기 화학식 XXII의 폴리펩타이드와 화학식 I의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드 분자를 반응시켜 하기 화학식 XXIII의 화합물을 생성하는 것을 포함하고, 이때 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드 분자는 폴리펩타이드의 N-말단 아미노기와 결합된다:
화학식 I
상기 식에서,
R1, X, Y, Z, m, n 및 p는 상기에서 정의된 바와 같다.
바람직한 태양에서, p는 3, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이거나; p는 2, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이거나; p는 1, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이다.
화학식 XXII의 화합물은 인터페론-알파, 인터페론-베타, 일치 인터페론(consensus interferon), 에리트로포이에틴(erythropoietin, EPO), 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony simulating factor, GCSF), 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte/macrophage colony simulating factor, GM-CSF), 인터루킨(interleukins)(IL-2, IL-10 및 IL-12를 포함) 및 콜로니 자극 인자(colony simulating factor, CSF)를 포함하는 임의의 폴리펩타이드일 수 있다.
화학식 XXII의 화합물은 또한 면역 글로불린, 예컨대 IgG, IgE, IgM, IgA, IgD 및 이들의 하위 부류, 및 이들의 단편(fragment)일 수 있다. 용어 "항체" 또는 "항체 단편"은 다클론성(polyclonal) 또는 단클론성(monoclonal)의 항체, 전체 면역 글로불린 또는 항체, 또는 표적 항원과 결합하는 면역 글로불린의 임의의 작용성 단편을 의미한다. 이러한 항체 단편의 예는 Fv(단편 변수), 단일 쇄 Fv, 보충 산출 영역(CDRs), VL(경쇄 변수 영역), VH(중쇄 변수 영역), Fab(단편 항체 결합), F(ab)2', 및 이들 또는 표적 항원에 결합할 수 있는 면역 글로불린 펩타이드의 임의의 다른 작용기와의 임의의 조합을 포함한다.
상기에서 기술된 바와 같이, 페길화된 화합물은 임의의 원하는 방법으로 제조될 수 있다. 조건, 예컨대 pH는 α-아미노기의 부위-특정적 페길화에 유리하게 선택되어 져야만 한다.
일반적으로, 폴리펩타이드는 화학식 XXII의 화합물 및 PEG 시약을 1:1 내지 1:100의 몰비 범위로 첨가함으로써 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜 화합물과 페길화될 수 있다. 반응 농축액은 약 0.5 내지 24 시간 동안 실온 또는 4℃ 및 pH 5.5 내지 9.0의 범위에서 붕산염, 인산염 또는 트라이 완충액 중에 둘 수 있다. PEG 시약의 펩타이드/단백질에 대한 몰비는 일반적으로 1:1 내지 100:1이다. 펩타이드/단백질의 농도는 일반적으로 1 내지 10 mg/ml이다. 완충액의 농도는 대체로 10 내지 500 mM이다.
페길화된 화합물은 임의의 원하는 방법으로 단리되거나 정제될 수 있다. 예로서, 생성된 반응 혼합물은 평형 완충액(20mM 트리스, pH 7.5)으로 희석되고, 생성된 혼합물은 Q-세파로즈(Q-Sepharose) 칼럼 상에 적용시킨다. 혼합물을 QA 칼럼에 적용한 후에 75M의 NaCl; 200mM의 NaCl; 1M NaCl을 녹인 평형 완충액으로 세척하고, 1M HOAC + 1M NaCl 및 0.5 NaOH로 재생시켰다. 역상 HPLC를 사용함으로써, 혼합물 중의 다른 부산물로부터 N-말단, 단일 페길화된 생성물의 분리 및 단리가 가능하다. 각각의 회수된 생성물은 MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/ Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry)에 의해 확인할 수 있다.
본 발명의 페길화 방법의 바람직한 태양에서, 화학식 XXII의 폴리펩타이드는 하기 화학식 II의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드와 반응하여 하기 화학식 XXIV의 화합물을 생성하고, 이때 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드 분자는 폴리펩타이드의 N-말단 아미노기에 결합된다:
화학식 XXII
화학식 II
상기 식에서,
R1, m, n 및 p는 상기에서 정의된 바와 같다.
바람직한 태양에서, p는 3, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이거나; p는 2, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이거나; p는 1, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이다.
본 발명의 화합물의 용도에 대한 추가적 설명은 동시에 출원된 "페길화된 T20 폴리펩타이드"라는 제목의 미국 특허 출원, "페길화된 T1249 폴리펩타이드"라는 제목으로 2002년 7월 24일에 출원된 U.S. 출원 번호 60/398,195, 2002년 7월 24일에 출원된 U.S. 출원 번호 60/398,190, 2003년 1월 10일에 출원된 U.S. 출원 번호 60/439,213에 개시되어 있는데, 이들은 전체적으로 본원에 참고로 인용한다.
또한 폴리에틸렌 글리콜 분자를 부착하는 방법이 추가로 제공되는데, 이 방법은 하기 화학식 XXII의 폴리펩타이드와 하기 화학식 VIII의 폴리에틸엔 글리콜 알데하이드 분자를 반응시켜 하기 화학식 XXV의 화합물이 생성되는 것을 포함하고, 이때 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드 분자는 폴리펩타이드의 N-말단 아미노기에 결합된다:
화학식 XXII
화학식 VIII
상기 식에서,
각각의 m, n 및 p는 동일하거나 상이하고, 상기에서 정의된 바와 같다.
바람직한 태양에서, p는 3, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이거나; p는 2, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이거나; p는 1, R1은 메톡시, m은 1, 그리고 n은 100 내지 750이다.
페길화된 폴리펩타이드는 임의의 원하는 방법으로 사용될 수 있다. 적합하게는, 약학적으로 허용가능한 부형제와의 혼합물에 의해, 약학 조성물을 제조하는데 사용된다. 이러한 약학 조성물은 단위 투여 형태로 될 수 있다. 이들은 주사 가능한 용액 또는 현탁액, 경피 운반체 또는 임의의 다른 원하는 형태일 수 있다.
본 발명의 추가적인 설명을 위해 하기 실시예가 제공된다. 이들은 단지 예시적인 것으로 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
실시예 1: PEG 알데하이드 화합물의 제조
톨루엔(50 내지 100 ml)중의 PEG(5g, 1,000 내지 60,000 돌턴의 분자량)를 1 내지 3시간 동안 환류하여 공비적으로 건조시킨 다음, 톨루엔(20 내지 30 mL)을 제거하였다. 생성된 용액을 실온까지 냉각시킨 다음, 절대 tert-부탄올(20 내지 50 ml) 및 톨루엔( 20 내지 50 ml) 중의 칼륨 tert-부톡사이드(1 내지 10 몰 과량)를 PEG 용액에 첨가하였다. 생성 혼합물을 2 시간 동안 아르곤하의 실온에서 교반하였다.
tert-부틸 브로모아세테이트(1 내지 10 몰 과량)를 주사기로 반응에 첨가하고 반응 혼합물을 아르곤 가스하의 실온에서 밤새 교반하였다. 화학식 XVI에서 정의된 "m" 기의 원하는 크기에 따라, tert-부틸 브로모아세테이트는 아세트산의 다른 할로겐화된 유도체, 즉 프로피온산, 부티르산 등으로 대체될 수 있다.
반응 용액을 로타리 증발기에 의해 농축시키고 잔류물은 다이에틸 에터를 첨가하여 침전시켰다. 침전 생성물, PEG t-부틸 카복시 에스터를 여과 한 후 진공 상태에서 건조시켰다.
PEG t-부틸 카복시 에스터(4g)을 1N의 나트륨 하이드록사이드(50 내지 100 ml)중에 용해시키고 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 1 내지 6N의 염산을 첨가하여 혼합물의 pH를 2.5 내지 3.0으로 조절한 후 혼합물을 다이클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 나트륨 설페이트 상에서 건조시킨 다음 여과하고 농축한 후 다이에틸 에터로 침전시켰다. 생성물, PEG-카복시산을 여과에 의해 회수한 후 진공 상태에서 건조시켰다.
PEG-카복시산(3g)을 무수의 다이클로로메탄(20 내지 30 ml)에 용해시키고 4-아미노부틸알데하이드 다이에틸 아세탈(1 내지 5몰 과량), 1-하이드록시벤조트라이아졸(1 내지 5몰 과량) 및 다이사이클로헥실카보다이이미드(1 내지 5몰 과량)를 첨가하였다. 화학식 XIII에서 정의된 "p" 기의 원하는 크기에 따라, 4-아미노부틸알데하이드 다이에틸 아세탈은 다이에틸 아세탈의 또다른 아민 유도체, 예컨대 3-아미노프로피온알데하이드 다이에틸 아세탈 또는 2-아미노아세트알데하이드 다이에틸 아세탈로 대체될 수 있다.
생성된 혼합물은 아르곤하의 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 여과하고 농축한 다음 2-프로판올 및 다이에틸 에터(1:1)의 혼합물로 침전시켰다. PEG 아세탈 생성물은 진공 상태에서 밤새 건조시켰다.
PEG 아세탈 생성물을 1 내지 90%의 CF3COOH(10 내지 200 ml)에 용해시키고 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 1 N의 NaOH 용액을 첨가하여 혼합물의 pH를 6.0으로 조절한 후 염화 나트륨(10 wt%)를 첨가한 다음, 용액의 pH를 1 N의 NaOH를 첨가하여 7.0으로 조절하였다. 혼합물을 다이클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 나트륨 설페이트 상에서 건조시킨 다음 여과하고 농축한 후 다이에틸 에터로 침전시켰다. 생성물, PEG 알데하이드를 여과에 의해 회수한 후 진공 상태에서 건조시켰다.
실시예 2: mPEG 10K -부타노알데하이드의 제조
본 발명의 mPEG10K-부타노알데하이드의 제조하기 위한 일반적 반응식을 하기에 나타낸다:
mPEG10K-부타노알데하이드를 위한 반응식
우선, 톨루엔(300 ml)중의 카복시메틸 PEG(mPEG, 30 g, 3 mmol, 10,000 돌턴의 분자량)를 2시간 동안 환류하여 공비적으로 건조시킨 다음, 톨루엔(100 ml)을 제거하였다. 생성된 용액을 실온까지 냉각시킨 다음, 절대 tert-부탄올(20 ml) 및 톨루엔(20 ml) 중의 칼륨 tert-부톡사이드(0.68 g, 6 mmol)를 PEG 용액에 첨가하였다(1). 생성 혼합물을 2 시간 동안 아르곤하의 실온에서 교반하였다.
tert-부틸 브로모아세테이트(1.00 mL, 6.75 mmol)를 주사기로 반응에 첨가하고 반응물을 아르곤 가스하의 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 용액을 로타리 증발기에 의해 농축시켰다. 잔류물은 다이에틸 에터를 첨가하여 침전시켰다. 침전 생성물을 여과 한 후 진공 상태에서 건조시켰다. 수율: 28 g. NMR(d6-DMSO): 1.40 ppm(t, 9H, -CH3); 3.21 ppm(s, -OCH3); 3.50 ppm(s, -O-CH2CH2-O-); 3.96 ppm(s, 2H, -O-CH2-COO-).
다음으로, mPEG10K t-부틸 카복시메틸 에스터(20g)을 1 N의 나트륨 하이드록사이드(200 ml)중에 용해시키고 용액을 실온에 밤새 교반하였다(2). 6 N의 염산을 첨가하여 혼합물의 pH를 2.5로 조절한 후 혼합물을 다이클로로메탄(50mL, 40mL 및 30mL)으로 추출하였다. 유기층을 나트륨 설페이트 상에서 건조시킨 다음 여과하고 농축한 후 다이에틸 에터로 침전시켰다. 생성물, mPEG10K 카복시메틸산을 여과에 의해 회수한 후 진공 상태에서 건조시켰다. 수율: 18 g. NMR(d6-DMSO): 3.21 ppm(s, -OCH3); 3.5 ppm(s, -O-CH2CH2-O-); 3.99 ppm(s, 2H, -O-CH2-COOH).
mPEG10K 카복시메틸산(3 g, 0.3 mmol)을 무수의 다이클로로메탄(20 mL)에 용해시키고 4-아미노부틸알데하이드 다이에틸 아세탈(50 mg, 0.3 mmol), 1-하이드록시벤조트라이아졸(40 mg, 0.3 mmol) 및 다이사이클로헥실카보다이이미드(80 mg, 0.39 mmol)를 첨가하였다(3). 혼합물을 아르곤하의 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 농축한 다음 2-프로판올 및 다이에틸 에터(1:1)의 혼합물로 침전시켰다. 생성물, mPEG10K 카복시메틸산은 진공 상태에서 밤새 건조시켰다. 수율: 2.7 g. NMR(d6-DMSO): 1.07-1.12 ppm(t, 6H, (-O-CH2-CH3)2 ); 1.46 ppm(m, 4H, -NHCH2CH2CH2-CH-); 3.08-3.11 ppm(q, 2H, -NHCH2CH2CH 2-CH-); 3.21 ppm(s, -OCH3); 3.5 ppm(s, -O-CH2CH2-O-); 3.85 ppm(s, 2H, -O-CH2-CO-NH-); 4.44 ppm (t, 1H, -NHCH2CH2CH2-CH-); 7.67 ppm(-NH-).
마지막으로, mPEG10K-부타노아세탈(5 g, 0.5 mmol)을 10% CF3COOH(50 mL)에 용해시키고 용액을 실온에서 밤새 교반하였다(4). 1 N의 NaOH 용액을 첨가하여 혼합물의 pH를 6.0으로 조절한 후 염화 나트륨(10 wt%)를 첨가한 다음 용액의 pH를 1 N의 NaOH를 첨가하여 7.0으로 조절하였다. 혼합물을 다이클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 나트륨 설페이트 상에서 건조시킨 다음 여과하고 농축한 후 다이에틸 에터로 침전시켰다. 생성물, mPEG10K-부타노알데하이드(5)를 여과에 의해 회수한 후 진공 상태에서 건조시켰다. 수율: 4.1 g(82 %). NMR(d6-DMSO): 3.21 ppm(s, -OCH3); 3.5 ppm(s, -O-CH2CH2-O-); 3.85 ppm(s, 2H, -O-CH2-CO-NH-); 7.67 ppm(-NH-); 9.66 ppm(-CHO-).
실시예 3: mPEG 10K -아세탈 알데하이드의 제조
mPEG10K-아세탈 알데하이드를 80% 트라이플루오아세트산(10ml, 알드리치(Aldrich, 99+%))중에서 실시예 1의 절차에 따라 제조된 mPEG10K-다이에틸 아세탈(1 g, 분자량 10,000)에 용해시켜 제조하였다. 반응 용액을 아르곤 가스하의 실온에서 밤새 교반하였다. pH가 6.0이 될 때까지 1N NaOH를 반응 용액에 적가하였다. 다음으로 NaCl(10 wt%)을 상기 용액에 첨가하였다. 0.1 N NaOH를 첨가함으로써 pH를 6.95±0.05까지 조절하였다. 용액을 메틸렌 클로라이드로 추출하였다. 유기층을 나트륨 설페이트 상에서 건조시킨 다음 여과하고 농축한 후 다이에틸 에터로 침전시켰다. 생성물, mPEG10K-아세탈 알데하이드를 여과에 의해 회수한 후 진공 상태에서 건조시켰다. 수율: 0.85 g(85 %).
실시예 4: mPEG 10K -프로피온알데하이드의 제조
mPEG10K-프로피온알데하이드를 80% 트라이플루오아세트산(20ml, 알드리치(Aldrich, 99+%))중에서, 실시예 1의 절차에 따라 제조된 mPEG10K-프로피온아세탈(2 g, 분자량 10,000)에 용해시켜 제조하였다. 반응 용액을 아르곤 가스하의 실온에서 밤새 교반하였다. pH가 6.0이 될 때까지 1N NaOH를 반응 용액에 적가하였다. 다음으로 NaCl(10 wt%)을 상기 용액에 첨가하였다. 1 N NaOH를 첨가함으로써 pH를 6.95±0.05까지 조절하였다. 용액을 메틸렌 클로라이드로 추출하였다. 유기층을 나트륨 설페이트 상에서 건조시킨 다음 여과하고 농축한 후 다이에틸 에터로 침전시켰다. 생성물, mPEG10K-프로피온알데하이드를 여과에 의해 회수한 후 진공 상태에서 건조시켰다. 수율: 1.8 g(90 %).
실시예 5: mPEG 20K -다이-부타노알데하이드의 제조
mPEG20K-다이-부타노알데하이드를 80% 트라이플루오아세트산(20ml, 알드리치(Aldrich, 99+%))중에서, 실시예 1의 절차에 따라 제조된 mPEG20K-다이-부티르알데하이드 다이에틸 아세탈(3.1 g, 분자량 20,000)에 용해시켜 제조하였다. 반응 용액을 아르곤 가스하의 실온에서 밤새 교반하였다. pH가 6.0이 될 때까지 1N NaOH를 반응 용액에 적가하였다. 다음으로 NaCl(10 wt%)을 상기 용액에 첨가하였다. 0.1 N NaOH를 첨가함으로써 pH를 6.95±0.05까지 조절하였다. 용액을 메틸렌 클로라이드로 추출하였다. 유기층을 나트륨 설페이트 상에서 건조시킨 다음 여과하고 농축한 후 다이에틸 에터로 침전시켰다. 생성물, mPEG10K-다이-부타노알데하이드를 여과에 의해 회수한 후 진공 상태에서 건조시켰다. 수율: 2.5 g(81 %).
실시예 6: mPEG 20K -부타노알데하이드의 제조
mPEG20K-부타노알데하이드를 80% 트라이플루오아세트산(30ml, 알드리치(Aldrich, 99+%))중에서, 실시예 1의 절차에 따라 제조된 mPEG20K-부티르알데하이드다이에틸 아세탈(3.0 g, 분자량 20,000)에 용해시켜 제조하였다. 반응 용액을 아르곤 가스하의 실온에서 밤새 교반하였다. pH가 6.0이 될 때까지 1 N NaOH를 반응 용액에 적가하였다. 다음으로 NaCl(10 wt%)을 상기 용액에 첨가하였다. 1 N NaOH를 첨가함으로써 pH를 6.95±0.05까지 조절하였다. 용액을 메틸렌 클로라이드로 추출하였다. 유기층을 나트륨 설페이트 상에서 건조시킨 다음 여과하고 농축한 후 다이에틸 에터로 침전시켰다. 생성물, mPEG10K-부타노알데하이드를 여과에 의해 회수한 후 진공 상태에서 건조시켰다. 수율: 2.5 g(83.3 %).
실시예 7: mPEG 20K -부타노알데하이드의 제조
mPEG20K-부타노알데하이드를 10% 트라이플루오아세트산(200ml, 알드리치(Aldrich, 99+%))중에서, 실시예 1의 절차에 따라 제조된 mPEG20K-부티르알데하이드다이에틸 아세탈(14.7 g, 분자량 20,000)에 용해시켜 제조하였다. 반응 용액을 아르곤 가스하의 실온에서 밤새 교반하였다. pH가 6.0이 될 때까지 1 N NaOH를 반응 용액에 적가하였다. 다음으로 NaCl(10 wt%)을 상기 용액에 첨가하였다. 0.1 N NaOH를 첨가함으로써 pH를 6.95±0.05까지 조절하였다. 용액을 메틸렌 클로라이드로 추출하였다. 유기층을 나트륨 설페이트 상에서 건조시킨 다음 여과하고 농축한 후 다이에틸 에터로 침전시켰다. 생성물, mPEG20K-부타노알데하이드를 여과에 의해 회수한 후 진공 상태에서 건조시켰다. 수율: 13.1 g(89 %).

Claims (22)

  1. 하기 화학식 I의 화합물:
    화학식 I
    상기 식에서,
    R1은 캡핑기(capping group)이고,
    X는 O 또는 NH이고,
    Y는 [상기 식에서, Z는 아미노산의 측쇄이고, m은 1 내지 17이다]로 구성된 군에서 선택되고,
    n은 10 내지 10000이고,
    p는 1 내지 3이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    R1이 할로겐, 에폭사이드, 말레이마이드, 오르토피리딜 다이설파이드, 토실레이트, 아이소시아네이트, 하이드라진 하이드레이트, 시아누릭 할라이드, N-석신이미딜옥시, 설포-N-석신이미딜옥시, 1-벤조트라이아졸릴옥시, 1-이미다졸릴옥시, p-니트로페닐옥시 및, 로 구성된 군에서 선택된 화합물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    하기 화학식 III을 갖는 화합물:
    화학식 III
  4. 제 1 항에 있어서,
    하기 화학식 IV를 갖는 화합물:
    화학식 IV
  5. 제 1 항에 있어서,
    하기 화학식 V를 갖는 화합물:
    화학식 V
  6. 제 1 항에 있어서,
    하기 화학식 VI를 갖는 화합물:
    화학식 VI
  7. 하기 화학식 II의 화합물:
    화학식 II
    상기 식에서,
    R1은 캡핑기이고,
    m은 1 내지 17이고,
    n은 10 내지 10,000이고,
    p는 1 내지 3이다.
  8. 제 7 항에 있어서,
    p가 3인 화합물.
  9. 제 7 항에 있어서,
    p가 3이고, R1이 메톡시이고, m이 1이고, n이 100 내지 750인 화합물.
  10. 하기 화학식 VIII의 화합물:
    화학식 VIII
    상기 식에서,
    m은 1 내지 17이고,
    n은 10 내지 10,000이고,
    p는 1 내지 3이다.
  11. 하기 화학식 IX의 화합물:
    화학식 IX
    상기 식에서,
    R1은 캡핑기이고,
    X는 O 또는 NH이고,
    Y는 [상기 식에서, Z는 아미노산의 측쇄이고, m은 1 내지 17이다]로 구성된 군에서 선택되고,
    n은 10 내지 10,000이고,
    p는 1 내지 3이다.
  12. 하기 화학식 X의 화합물:
    화학식 X
    상기 식에서,
    R1은 캡핑기이고,
    m은 1 내지 17이고,
    n은 10 내지 10,000이고,
    p는 1 내지 3이다.
  13. 하기 화학식 XI의 화합물:
    화학식 XI
    상기 식에서,
    m은 1 내지 17이고,
    n은 10 내지 10,000이고,
    p는 1 내지 3이다.
  14. 하기 화학식 IX의 화합물을 가수분해하여 하기 화학식 I의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드를 생성하는 것을 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드의 제조 방법:
    화학식 IX
    화학식 I
    상기 식에서,
    R1은 캡핑기이고,
    X는 O 또는 NH이고,
    Y는 [상기 식에서, Z는 아미노산의 측쇄이고, m은 1 내지 17이다]로 구성된 군에서 선택되고,
    n은 10 내지 10,000이고,
    p는 1 내지 3이다.
  15. 하기 화학식 X의 화합물을 가수분해하여 하기 화학식 II의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드를 생성하는 것을 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드의 제조 방법:
    화학식 X
    화학식 II
    상기 식에서,
    R1은 캡핑기이고,
    m은 1 내지 17이고,
    n은 10 내지 10,000이고,
    p는 1 내지 3이다.
  16. 제 15 항에 있어서,
    화학식 X의 화합물이 하기 화학식 XII의 화합물을 하기 화학식 XIII의 화합물과 반응시킴으로써 생성되는 제조 방법:
    화학식 XII
    화학식 XIII
  17. 제 16 항에 있어서,
    화학식 XII의 화합물이 하기 화학식 XIV의 화합물을 가수분해시킴으로써 생성되는 제조 방법:
    화학식 XIV
    상기 식에서,
    R3은 분지 또는 비분지된 C1-C4 알킬이다.
  18. 제 17 항에 있어서,
    화학식 XIV의 화합물이 하기 화학식 XV의 화합물을 하기 화학식 XVI의 화합물과 반응시킴으로써 생성되는 제조 방법:
    화학식 XV
    화학식 XVI
    상기 식에서,
    R2는 할로겐이다.
  19. 하기 화학식 XVII의 화합물을 가수분해하여 하기 화학식 VIII의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드를 생성하는 것을 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드의 제조 방법:
    화학식 XVII
    화학식 VIII
    상기 식에서,
    m은 1 내지 17이고,
    n은 10 내지 10,000이고,
    p는 1 내지 3이다.
  20. 제 19 항에 있어서,
    화학식 VIII의 화합물이 하기 화학식 XVIII의 화합물을 하기 화학식 XIX의 화합물과 반응시킴으로써 생성되는 제조 방법:
    화학식 XVIII
    화학식 XIX
  21. 제 20 항에 있어서,
    화학식 XVIII의 화합물이 하기 화학식 XX의 화합물을 가수분해시킴으로써 생성되는 제조 방법:
    화학식 XX
    상기 식에서,
    R3은 분지 또는 비분지된 C1-C4 알킬이다.
  22. 제 21 항에 있어서,
    화학식 XX의 화합물이 하기 화학식 XXI의 화합물을 하기 화학식 XVI의 화합물과 반응시킴으로써 생성되는 제조 방법:
    화학식 XXI
    화학식 XVI
    상기 식에서,
    R2는 할로겐이다.
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