KR20030036081A - 펩타이드 스페이서를 갖는 생체적합성 고분자 - Google Patents

펩타이드 스페이서를 갖는 생체적합성 고분자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 화학식 [P-OCH2CO-Y]n-(L)s-(Q)t-(Y')k-A로 표시되는 펩타이드 스페이서-함유 생체적합성 고분자 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 화학식의 활성화된 고분자에 생물학적 활성 물질이 공유 또는 비공유 결합하여 형성된 생물학적 활성 결합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 생체적합성 고분자는 소수성과 양전하를 나타내는 펩타이드 스페이서를 포함하고 있어 음전하를 띠는 세포막과의 상호작용이 증가하고 또한 펩타이드 스페이서를 구성하는 아미노산의 완충능에 의해 증가된 세포 트래피킹과 엔도좀 분열을 제공함으로써 본 발명의 생체적합성 고분자에 결합된 생물학적 활성 물질의 생체이용률은 매우 높다.

Description

펩타이드 스페이서를 갖는 생체적합성 고분자{BIOCOMPATIBLE POLYMERS INCLUDING PEPTIDE SPACER}
본 발명은 펩타이드 스페이서를 갖는 신규한 생체적합성 고분자 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 활성화된 상기 생체적합성 고분자에 생물학적 활성 물질이 공유 또는 비공유 결합하여 형성된 생물학적 활성 결합체에 관한 것이다.
최근에는 대량 합성법이나 유전 공학에 의해 대량 생산이 가능해짐으로써, 다양한 단백질, 펩타이드, 효소, 유전자 등이 높은 치료효과를 가진 의약품으로 사용되고 있다. 그러나, 이러한 생물학적 활성 물질을 생체에 적용하는 데는 많은 문제점이 있다.
단백질, 펩타이드, 효소와 같은 물질은 체내 투여 후 쉽게 가수분해되거나 효소에 의해 단시간에 파괴되어 흡수율이 극히 낮게 될 수 있으며, 또한 반복적으로 투여되면 면역 반응이 자주 유도되어 생성된 항체에 의한 생리활성의 중화작용으로 인해 생명을 위협할 정도의 과민반응이 유발될 뿐만 아니라 망상세포의 내피계(reticuloendothelial system)에 의한 소실(clearance)이 증가하게 될 수 있다. 유전자 요법에서 사용되는 핵산의 경우 핵산을 세포내로 효율적으로 전신 전달하는 것이 필요하며, 이와 관련하여 필요한 유전자를 특정 조직 또는 표적 세포의 구획(compartment)에 전달하는데 있어서 핵산의 분해를 줄여 줄 수 있는 비히클의 개발이 절대적으로 요구되고 있다. 리포소옴(H.M. Temin, J. Human Gene Therapy 111, 1990) 또는 폴리-엘-라이신(G.Y. Wu et al. J. Biol. Chem. 263, 14621, 1988)과 같은 비-바이러스성 유전자 전달 시스템은 낮은 형질감염율과 침전의 문제점이 있다. 또한, 합성적인 전달시스템도 반복투여에 의한 면역원성 문제가 나타나고 있다(P.L. Felgner, 5 Adv. Drug Deliv. 163, 1990).
생물학적 활성 물질을 합성 고분자와 결합시키는 것은 생체 내(in vivo)및 생체 외(in vitro) 적용 시에 많은 이점을 제공할 수 있다. 생물학적 활성 물질에 대한 고분자의 공유결합은 분자의 표면특성 및 용해성을 변화시켜서, 물 또는 유기용매에 대한 용해성을 증가시킬 수 있다. 또한, 생체적합성(biocompatibility)을 증가시켜서 면역 반응성을 감소시키며, 생체 내에서의 안정성을 증가시킬 뿐만 아니라 장관 시스템, 신장, 비장 또는 간에 의한 소실을 연장시킬 수 있다.
생물학적 활성 물질을 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 및 유사한 수용성 폴리알킬렌 옥사이드(polyalkylene oxides, PAO)에 결합시키는 개념은 많은 특허공보 및 문헌에서 찾아 볼 수 있다.
미국특허 제4,179,337호에는 생물학적 활성 폴리펩타이드가 탄소수 5개 이하의 알콕시 또는 알킬 기에 의해 치환되거나 비치환되고 분자량이 약 500 내지 약 20,000 달톤인 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol, PPG)에 결합된 생물학적 활성, 비면역원성, 수용성 폴리펩타이드 조성물이 청구되어 있다. 이 특허에 따르면, 폴리펩타이드 조성물은 PEG 또는 PPG의 하이드록시 기-함유 말단 탄소 원자를 결합제와 반응시켜 반응성 말단 기를 함유한 활성화된 고분자를 형성하고 이 활성화된 고분자의 반응성 말단 기에 생물학적 활성 폴리펩타이드의 아민기, 라이신 부위 또는 N-말단 기와 결합시킴으로써 제조되며 PEG 또는 PPG는 생물학적 활성 폴리펩타이드의 활성이 상실되는 것을 방지하는 역할을 하는 것으로 기술되어 있다.
미국특허 제4,301,144호에는 헤모글로빈(hemoglobin)을 폴리알킬렌 글리콜 또는 이의 유도체와 결합시켜 얻은 변형된 헤모글로빈이 청구되어 있으며 이러한 변형된 헤모글로빈은 산소-수송 능력이 천연 헤모글로빈과 거의 동일하고 체내에서의 체류 시간도 만족할 정도로 충분히 긴 것으로 기술되어 있다.
문헌[Abuchowskiet al.,Cancer Biochem. Biophys.,7, 175-186, 1984]에는 PEG와 결합된 여러 가지 단백질들이 혈장에서 체내 반감기가 증가되고 면역원성이 감소된 것으로 기술되어 있다.
미국특허 제5,951,974호 및 문헌[Algranati et al, Hepatology, 40 (suppl), 190A, 1999]에는 PEG12000과 가지달린 PEG40000을 알파 인터페론에 결합시킴으로써 알파 인터페론의 체내 소실기간이 감소되고 이로 인해 주 3회 투여하던 인터페론을 주 1회 투여할 수 있는 것으로 기술되어 있다. 문헌[Daviset al.,Lancet,2, 281-283, 1981]에는 유리카제(uricase)가 PEG와 결합하면 체내 반감기가 증가되고 요산의 대사시 부작용이 감소되는 것으로 기술되어 있다. 또한, 문헌[Niven et al, J. of Contr., Rel. 32, 177-189, 1994]에는 PEG에 재조합 사람 과립구-콜로니 자극 인자(recombinant human granulocyte-colony stimulating factor, rhG-CSF)를 결합시켜 장시간의 백혈구 증가를 얻은 것으로 기술되어 있다.
그러나, 생물학적 활성 물질에 과량의 고분자를 결합시키거나 또는 생물학적 활성 물질의 활성과 관련된 기에 고분자를 결합시키는 경우 그 생물학적 활성 물질의 활성이 종종 저해되고 결국 그의 유용성을 떨어뜨리게 된다. 이러한 문제는 생물학적 활성 물질의 활성과 관련이 없는 결합 부위가 거의 없는 저 분자량의 펩타이드에서 흔히 나타난다. 비-펩타이드성 치료제의 경우에도 많은 경우가 고분자 변형에 의한 수혜를 받을 만큼 충분한 수의 결합 부위를 갖고 있지 않다.
이러한 문제점을 극복하기 위한 방안으로, 미국특허 제5,643,575호 및 미국특허 제5,932,462호에는 가지달린 고분자가 청구되어 있다. 이들 가지달린 고분자는 짧은 링커에 의해 두개의 비항원성 중합체가 연결되어 있으면서 링커에 생물학적 활성 물질과 결합할 수 있는 반응기를 하나 가지고 있다. 이러한 구조를 갖는 고분자에 생물학적 활성 물질이 결합될 경우 링커에 의해 연결된 두개의 고분자가 생물학적 활성 물질에 비하여 상대적으로 크기가 거대하여 생물학적 활성 물질의 표면에 입체적 장애(steric hindrance)를 유발함으로써 생물학적 활성 물질의 반응성을 저하시키고 또한 결합체의 수율이 낮은 문제가 있다.
또한, 미국특허 제5,919,455호에는 지방족 연결 잔기를 링커로 하여 두개의 비항원성 고분자가 연결되어 있는 가지달린 고분자가 기술되어 있다. 그러나, 이들 가지달린 고분자는 친수성이 너무 강하여 단백질이나 유전자의 수송체로는 부적합하다.
베로니스 등은 문헌[Veronese, et al., Bioconjugate Chem, 12, 62, 2001] 및 국제특허 WO 00/33881에서 디펩타이드와 가지달린 PEG와의 합성을 소개하고 있으나, 이들 합성물은 PEG와 같은 고분자를 분석하기에 용이한 리포터(reporter)의 역할로 응용되고 있으며 본 발명의 고분자와 구조가 다르다.
따라서, 생물학적 활성 물질을 생체내로 효율적으로 전달하기 위하여 개선된 새로운 고분자가 여전히 요구되고 있다. 본 발명자들은 고분자에 펩타이드 스페이서(peptide spacer)를 삽입시켜 생물학적 활성 단백질이나 약물의 표적도달(targeting)을 증가시키는 한편 특정 세포 수용체에 대한 결합을 증가시킴으로써 생물학적 활성 단백질이나 약물의 효과가 증대된 의약품 제조하는데 성공하였다.
본 발명은 펩타이드 스페이서를 갖는 신규한 생체적합성 고분자(biocompatible polymer)를 제공한다.
또한, 본 발명은 펩타이드 스페이서를 갖는 상기 신규한 생체적합성 고분자의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 펩타이드 스페이서를 갖는 신규한 활성화된 생체적합성 고분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 펩타이드 스페이서를 갖는 상기 신규한 활성화된 생체적합성 고분자의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신규한 생체적합성 고분자에 생물학적 활성 물질이 공유 또는 비공유 결합하여 형성된 생물학적 활성 결합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 생물학적 활성 결합체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 생물학적 활성 결합체를 포함한 약제학적 조성물을 제공한다.
도 1은 랫트에서의 본 발명에 따른 생물학적 활성 결합체 (mPEG12000-OCH2COGly-Gly)2(2,4-디아미노부틸산)-PEG'-인터페론의 인터페론 효능 측정 결과이다.
도 2는 랫트에서의 본 발명에 따른 생물학적 활성 결합체 (mPEG12000-OCH2COGly-Gly)2(2,4-디아미노부틸산)-PEG'-G-CSF의 G-CSF 효능 측정 결과이다.
본 발명에 따른 펩타이드 스페이서를 갖는 활성화된 생체적합성 고분자는 하기 화학식(I)로 표시된다:
[P-OCH2CO-Y]n-(L)s-(Q)t-(Y')k-A(I)
상기식에서,
P 및 Q는 동일하거나 상이할 수 있고, 생체적합성 고분자이며,
t는 0 또는 1이고,
Y 및 Y'는 동일하거나 상이할 수 있고, 아미노산중 2개 내지 18개의 임의 조합으로 이루어진 펩타이드이며,
k는 0 또는 1의 정수이고,
L은 지방족 연결 잔기(aliphatic linking moiety) 또는 디아미노카르복실산(diamino carboxylic acid)이고,
s는 0 또는 1이고,
A는 반응성 작용기(reactive functional group)이며,
n은 1 또는 2이다.
화학식(I)에서 P 및 Q로 표기된 생체적합성 고분자
화학식(I)에서 P 및 Q로 표기된 고분자는 여러 용매에 쉽게 용해될 수 있고 실질적으로 비항원성을 나타내는 생체적합성 고분자 쇄로서 이의 수 평균 분자량은 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 약 2,000 달톤 내지 약 20,000 달톤이다. 대표적인 생체적합성 고분자 (P) 및 (Q)로는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG), 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol, PPG), 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene, POE), 폴리트리메틸렌 글리콜(polytrimethylene glycol), 폴리락트산(polylactic acid) 및 그 유도체, 폴리아크릴산(polyacrylic acid) 및 그 유도체, 폴리(아미노산)(poly(amino acid)), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리포스파진(polyphosphazene), 폴리알킬렌 옥사이드(polyalkylene oxide, PAO), 폴리사카라이드(polysaccharide), 덱스트란(dextran), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol, PVA), 폴리아크릴 아마이드(polyacryl amide) 또는 기타 유사한 비면역성 고분자가 포함된다.
본 발명의 다른 양태로서, 생체적합성 고분자(P) 및 (Q)는 이차 및 삼차 분지화하기 위해 가지달린 고분자일 수 있다. 또한, 이작용성 및 헤테로-이작용성 활성 고분자 에스테르가 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용된 고분자는 또한 폴리(알킬렌 글리콜) 디아민과 같은 이작용성 물질과 공중합하여 투과성 콘택 렌즈, 상처 드레싱, 약물 전달물 등에 사용하기에 적합한 상호침투성 고분자망을 형성할 수 있다.
화학식(I)에서 Y 및 Y'로 표기된 펩타이드
화학식(I)에서 Y 및 Y'로 표기된 펩타이드를 구성하는 아미노산으로는 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 세린, 트레오닌, 글루타민, 티로신, 시스테인, 라이신, 아르기닌, 아스파라긴, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파트산이 포함된다. 이외에, β-알라닌, 옥시프롤린, 아미노부티르산, 오르니틴, 시트룰린, 호모세린, 디요오드티로신, 트리요오드티로신, 티록신, 디옥시페닐알라닌이 포함될 수 있다. 이들은 글리신을 제외하고 광학이성질체를 가지므로 L-이성체 및 D-이성체 모두 본 발명에 따른 펩타이드에 사용될 수 있다.
화학식(I)에서 L로 표기된 연결 잔기: 지방족 연결 잔기
화학식(I)에서 L로 표기된 지방족 연결 잔기는 복수(최대 4개)의 생체적합성 고분자 쇄를 화학식(I)에서 A로 표기되고 생물학적 활성 물질과 친핵성 치환반응이 일어나는 반응성 작용기에 연결시키기 위한 수단이다. 적합한 지방족 연결 잔기(L)로는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 치환된 알킬 디아민 및 트리아민, 라이신 에스테르 및 말론 산 에스테르 유도체가 포함된다. 연결 잔기(L)는 고분자 쇄가 경직되지 않도록 비평면적인 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 양태로서, 연결 잔기(L)은 복수의 작용기를 갖는 탄소원자 18개의 알킬이다. 더욱 바람직하게는, 알킬의 탄소원자 수는 1 내지 10이다. 또한, 알킬 쇄는 질소, 산소 또는 황과 같은 헤테로원자를 함유할 수 있다. 또한, 알킬 쇄는 탄소 또는 질소 원자에서 분지될 수 있다.
화학식(I)에서 L로 표기된 연결 잔기: 디아미노카르복실산 잔기
화학식(I)에서 L로 표기된 디아미노카르복실산 잔기는 생체적합성 고분자 쇄를 화학식(I)에서 A로 표기되고 생물학적 활성 물질과 친핵성 치환반응이 일어나는 반응성 작용기에 연결시키기 위한 수단이다. 구조식은
이며 x는 0 내지 5의 정수이다.
알킬 쇄는 질소, 산소 또는 황과 같은 헤테로원자를 함유할 수 있다. 또한, 알킬 쇄는 탄소 또는 질소 원자에서 분지될 수 있다.
화학식(I)에서 A로 표기된 반응성 작용기
화학식(I)에서 A로 표기된 반응성 작용기는 목적하는 생물학적 활성 물질과 결합하는 활성화된 기(group) 또는 잔기(moiety)이다. 생체적합성 고분자를 생물학적 활성물질에 결합시키기 위해 말단기중 하나를 반응성 작용기로 전환시키는데이 과정을 "활성화"라고 하며, 이 과정에 의한 생성물은 "활성화된 생체적합성 고분자"라고 한다. 예를 들면, 폴리(알킬렌 옥사이드)를 생물학적 활성 펩타이드에 결합시키기 위해 하이드록실 말단기중 하나를 카보네이트와 같은 반응성 작용기로 전환시킬 수 있으며 이에 따라 얻어진 생성물은 활성화된 폴리(알킬렌 옥사이드)가 된다.
반응성 작용기(A)는 하기 I 내지 IV로 이루어진 그룹중에서 선택될 수 있다:
I. (a) 카보네이트(예, p-니트로페닐 또는 석신이미딜), (b) 카르보닐 이미다졸, (c) 아즈락톤(azlactones), (d) 사이클릭 이미드 티온 또는 (e) 이소시아네이트 또는 이소티오시아네이트와 같이 아미노 기와 반응할 수 있는 작용기;
II. (a) 일급 아민 또는 (b) 하이드라진 및 하이드라자이드 작용기(아실 하이드라자이드, 카르바제이트, 세미카르바제이트, 티오카르바제이트 등)와 같이 카르복실산 및 반응성 카르보닐 기와 반응할 수 있는 작용기;
III. 페닐 글라이옥살과 같이 머캅토 또는 설프하이드릴 기와 반응할 수 있는 작용기(참조: 미국특허 제5,093,531호, 이의 내용은 본원에 참고로 원용된다); 및
IV. (카르복실) 산과 같이 하이드록실 기와 반응할 수 있는 작용기.
상기 예시된 작용기는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이드록실, 아미노, 카르복실, 티올 기, 활성 메틸렌 등을 포함한다.
본 발명에 따른 바람직한 반응성 작용기(A)의 예로는 N-하이드록시석신이미드 에스테르(이하, NHS로 표기할 수 있다), 하이드라진 하이드레이트(이하, NH2NH2로 표기할 수 있다), 카르보닐 이미다졸, 니트로페닐, 이소시아네이트, 설포닐 클로라이드, 알데하이드, 글라이옥살, 에폭사이드, 카르보네이트, 시아누르산 할라이드, 디티오카르보네이트, 토실레이트 및 말레이미드를 포함한다.
본 발명의 바람직한 양태
한 가지 바람직한 양태로서, 본 발명의 활성화된 생체적합성 고분자는 하기 화학식(Ia)로 표시되는 선형의 활성화된 고분자를 포함한다:
P-OCH2CO-Y-A(Ia)
상기식에서, P, Y 및 A는 상기 정의된 바와 같다.
대표적인 화학식(Ia)의 고분자는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하기 화학식으로 표시되는 고분자를 포함한다:
P-OCH2CO-Y-NHS;
P-OCH2CO-Y-NH2NH2; 또는
상기식에서, P 및 Y는 상기 정의된 바와 같다.
본 발명의 다른 바람직한 양태는 에스테르-계 프로드러그의 형성에 유용한 말단 카르복실산을 함유하는 가지달린 고분자를 제공한다. 이 가지달린 고분자는 하기 화학식(Ib)로 표시된다:
[P-OCH2CO-Y]n-L-COOH(Ib)
상기식에서, P, Y, n 및 L은 상기 정의된 바와 같다.
바람직한 화학식(Ib)의 고분자는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하기 화학식으로 표시되는 고분자를 포함한다:
상기식에서,
Y는 상기 정의된 펩타이드이고,
a는 1 내지 5의 정수이며,
m은 0 또는 1이고,
X는 O, NQ(여기서, Q는 H, C1-8알킬, C1-8가지달린 알킬, C1-8치환된 알킬, 아릴 또는 아르알킬이다), S, SO 또는 SO2이며,
p는 0 내지 6의 정수이고,
R2는 고분자 -CO-NH-(CH2-)dX2, -CO-NH-(CH2-CH2-O-)dX2,
및
로 이루어진 그룹중에서 선택되며, 여기서, d는 1 내지 18의 정수이고 X2는 H, OH, NH2또는 COOH이다. 물론, 상기된 PEG는 예시적인 목적으로 제시된 것이며 PEG가 다른 폴리알킬렌 옥사이드 또는 상기된 다른 생체적합성 고분자로 치환될 수 있다는 것은 당업자에게는 너무도 자명한 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 하기 화학식으로 표시되는 가지달린 고분자를 포함한다:
상기식에서, Y, Y', Q, t, k, A, a, m, p 및 x는 상기 정의된 바와 같다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 하기 화학식(Ic)로 표시되는 가지달린 고분자를 포함한다:
(Ic)
상기식에서, P, Y 및 A는 상기 정의된 바와 같고, x는 0 내지 5이다.
화학식(Ic)로 표시되는 가지달린 고분자는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하기 화학식으로 표시되는 것을 포함한다:
상기식에서, P, Y 및 x는 상기 정의된 바와 같다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 하기 화학식(Id)로 표시되는 가지달린 고분자를 포함한다:
(Id)
상기식에서, P, Y, Q, A 및 x는 상기 정의된 바와 같다.
화학식(Id)로 표시되는 가지달린 고분자는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하기 화학식으로 표시되는 것을 포함한다:
상기식에서, P, Y, Q 및 x는 상기 정의된 바와 같다.
화학식(I)의 생체적합성 고분자의 제조
화학식(I)의 생체적합성 고분자의 제조 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) P-OH를 에테르화하여 화학식 P-OCH2COOH를 생성하고;
(b) 생성된 화학식 P-OCH2COOH를 활성화시키고 펩타이드(Y)와 반응시켜 P-OCH2CO-Y-COOH를 생성하고;
(d) 생성된 P-OCH2CO-Y-COOH를 활성화시키고 친핵성 작용기를 갖는 지방족 연결 화합물과 반응시켜 화학식 [P-OCH2CO-Y]n-L을 생성하고;
(e) 생성된 [P-OCH2CO-Y]n-L을 활성화된 고분자(Q)와 반응시켜 화학식 [P-OCH2CO-Y]n-(L)s-(Q)t을 생성하고;
(f) 생성된 [P-OCH2CO-Y]n-(L)s-(Q)t를 펩타이드(Y')와 반응시켜 화학식 [P-OCH2CO-Y]n-(L)s-(Q)t-(Y')를 생성하고;
(g) 화학식 [P-OCH2CO-Y]n-(L)s-(Q)t-(Y')를 활성화시켜 상기 화학식(I)로 표시되는 활성화된 고분자를 수득한다.
고분자를 활성화하는 한 가지 방법은 p-니트로페닐 클로로포르메이트와 같은 고분자의 말단기인 하이드록실 기를 활성화할 수 있는 화합물로 관능화하여 반응성 p-니트로페닐 카르보네이트를 형성하는 것이다. 생성된 p-니트로페닐 카르보네이트 고분자는 생물학적 활성 물질과 직접 반응시킬 수 있다. 또한, p-니트로페닐 카르보네이트 고분자는 중간체로서 작용할 수 있다. p-니트로페닐 카르보네이트 고분자를 과량의 N-하이드록시석신이미드와 반응시켜 석신이미딜 카르보네이트-활성화된 고분자를 생성할 수 있다. 또 다르게는, p-니트로페닐 카르보네이트 고분자 중간체를 무수 하이드라진과 반응시켜 카르바제이트 고분자를 형성할 수 있다.
고분자를 활성화하는 또 다른 방법은 염기의 존재하에 고분자를 알킬 할로아세테이트와 반응시켜 상응하는 고분자 카르복실산의 중간 알킬 에스테르를 형성한 후 중간 알킬 에스테르를 트리플루오로아세트산과 같은 산과 반응시켜 말단 카르복실산을 함유하는 상응하는 고분자 화합물을 생성할 수 있다. 이 반응에 있어서, 알킬 할로아세테이트 대 고분자의 몰비는 1:1 이상이다. 알킬 에스테르를 산과 반응시키는 두 번째 반응 단계는 약 0℃ 내지 약 50℃의 온도, 바람직하게는 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도에서 실시한다. 임의로, 두 번째 반응 단계는 물의 존재하에서 실시할 수 있다. 바람직하게는 사용되는 알킬 할로아세테이트는 하기 화학식으로 표시되는 삼차 알킬 할로아세테이트이다:
상기식에서, X3은 염소, 브롬 또는 요오드이고, R10, R11및 R12는 독립적으로 C1-8알킬, C1-8치환된 알킬 및 C1-8분지된 알킬 및 아릴로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 바람직한 삼차 알킬 할로아세테이트로는 t-부틸 브로모아세테이트 또는 t-부틸 클로로아세테이트와 같은 삼차 부틸 할로아세테이트가 포함된다. 적합한 염기로는 칼륨 t-부톡사이드 또는 부틸 리튬, 나트륨 아미드 및 수소화나트륨이 포함된다. 적합한 산으로는 트리플루오로아세트산, 황산, 인산 및 염산이 포함된다.
말단 작용기가 아미노인 고분자는 락트산 또는 글리콜산과 같은 하이드록시 산과 반응시켜 하이드록시 아미드를 형성한 후 생성된 하이드록시 아미드를 p-니트로페닐 클로로포르메이트로 관능화하여 활성화시킬 수 있다.
한 가지 양태로서, mPEG-OH를 질소 기체하에서 THF에 녹인후 실온에서 교반하면서 나트륨, 나프탈렌용액을 가하고 3시간동안 반응시킨다. 브로모에틸렌아세틸을 실온에서 교반하면서 가한다. 실온에서 반응 후, 냉각조에서 에테르를 가하여 응고시킨다. 생성물을 여과한 후 에테르로 세척하고 진공건조하여 mPEG-OCH2COOH를 수득한다. 만들어진 생성물을 염화메틸렌에 녹인 후 교반하면서 NHS와디사이클로헥실 카르보디이미드 (dicyclohexyl carbodiimide, DCC)를 넣어 반응시켜 mPEG-OCH2COONHS를 제조한다.
이어서, Ala-His나 Gly-Gly-에틸 에스테르, Gly-His, His-His, Lys-Lys 및 그 외의 아미노산으로 구성된 펩타이드(Y)를 붕산염 완충용액에 녹여 교반한 후 mPEG-OCH2COONHS에 가한다. 실온에서 48시간 정도 반응시킨 후 옥살산을 가하여 pH를 조정한 후 메틸렌 클로라이드로 추출한 후 건조시켜 mPEG-OCH2COYCOOH를 합성한다.
또한, mPEG-OH를 톨루엔에 녹인 후 용매를 증발시키고 건조시킨다. 이를 메틸렌 클로라이드에 녹여 p-니트로페닐클로로포르메이트를 가하여 실온에서 교반하면서 반응을 진행시킨다. 혼합물의 pH는 트리에틸아민(TEA)을 넣어 pH 8을 유지한다. 밤새 반응시킨 후 에테르에서 침전시키고 여과하여 생성물을 수득한다. 생성물 (PEG-니트로페놀)에 펩타이드(Y)를 가하면 펩타이드(Y)의 아민기가 활성화된 PEG를 공격하여 PEG-Y-COOH가 생성된다.
활성화된 에스테르는 0- and p-니트로페놀, 2,4-디니트로페놀, N-하이드록시-석신이미드, 2- 및 4-티오피리딘, 8-하이드록시퀴놀린 및 1-하이드록시벤조트리아졸과 같은 산성 알코올로부터 만들어진 카르복실산 기의 에스테르로 생성된다 (미국특허 제4101380호).
mPEG-OCH2CO-Y-NHS는 상기의 방법을 사용하여 제조한다.
또한, mPEG-OCH2CO-Y-NHNH2는 다음의 방법으로 제조한다. mPEG-OCH2CO-Y-COOH를 메틸렌 클로라이드에 녹인 후 SOCl2를 넣고 3시간동안 환류시킨 후 실온까지 식힌 후 증발시킨다. 얻어진 물질 mPEG-OCH2CO-Y-COCl을 다시 메틸렌 클로라이드에 녹여 NH2NH2를 가한 후 실리카 칼럼에서 분리하여 증발시키고 진공건조시킨다.
또한, mPEG-OCH2CO-Y-COH는 mPEG-OH를 디옥산이나 벤젠에 녹인 후 K2CO3를 가한다. 1 내지 5 몰%의 촉매를 가한 후 O2나 공기로 40℃에서 버블링한다. 에테르로 침전시킨 후 결정물을 여과하여 진공 건조시킨다.
또 다른 방법으로 PEG-알데하이드를 DMSO에 녹여 NaBH3CH3또는 NaBH4와 같은 환원제의 존재하에 과량의 하이드라진과 반응시켜 PEG-하이드라진, PEG-NHNH2를 합성한다.
가지달린 PEG 유도체는 상기 만들어진 PEG-Y-NHS를 염기성 용액(pH 8-9, 붕산염 완충액)에 용해하여 라이신을 가한 후 30분 동안 실온에서 교반하여 반응을 진행한다. 반응이 완료된 후 크기별 배제 컬럼(size exclusion column)으로 정제하고 농축한다. 농축물을 에테르에서 침전시킨 후 상기 방법으로 생성물을 얻는다. PEG-Y-NHS 대신 PEG-Y-니트로페놀을 사용하여 같은 생성물을 얻을 수도 있다.
본 발명에서 사용된 또 다른 가지달린 PEG 유도체의 제조 방법으로는 mPEG-니트로페닐을 수용액에 녹인 후 NH2AlaHisCOOH를 넣어 직접 가지달린 PEG 유도체를 제조하는 것이다. 이러한 본 발명의 방법은 가지달린 고분자유도체를 합성 과정을 단축시켜 제조공정을 용이하게 한다.
가지달린 PEG 유도체에 PEG' 링커를 넣는 방법으로는
1) 헤테로이작용성 (heterobifuntional) PEG를 다음과 같은 방법으로 합성한다 (Makromol Chem. 184, 1849-1859, 1983).
3-아미노메틸-3,5,5-트리메틸사이클로헥사놀의 아미노 기를 석신산 무수물 (succinic anhydride)로 보호한 후, THF 용액에 같은 당량의 칼륨 디하이드로나프틸리드 (potassium dihydronaphthylide)를 적가하여 칼륨 알코올레이트를 만든다. 이에 옥시란 (oxirane)을 50℃, 진공하에 벤젠/THF중에서 옥시란 중합시킨다. 이미도 말단 PO(폴리옥시란)는 25℃에서 KOH 용액을 가하여 아미노 유도체로 가수분해한 후, 클로로포름에서 추출하고 헥산에서 최종물을 얻는다.
또 다른 방법은 미국특허 제5,679,765에 기술된 바와 같이 에폭시 화합물을 중합 개시제 (polymerization initiator)인 칼륨 비스(트리메틸실릴)아미드 또는 프탈아미드를 사용하여 이작용성 폴리에테르 NH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2R2가 만들어진다. 이 때 R2는 머캅토 기, 카르복실 기, 하이드록실 기 등이 되며 n은 5 내지 10,000이다.
2) 상기 제조된 헤테로작용성 PEG 유도체와 가지달린 PEG-NHS를 메틸렌 클로라이드에 녹여 40℃에서 2일 동안 반응시킨 후 셀라이트로 여과한다. 여과물을 에테르로 세척한 후 진공 건조시킨다. 수득된 (mPEG-Y-)2-Lys-PEG'-COOH를 석신이미드 (NHS)로 활성화한다.
화학식(I)의 활성화된 생체적합성 고분자와의 결합에 적합한 생물학적 활성 물질
다른 관점으로서, 본 발명은 화학식(I)의 활성화된 생체적합성 고분자에 생물학적 활성 물질이 결합하여 형성된 생물학적 활성 결합체를 제공한다.
용어 "생물학적 활성 물질"은 활성화된 생체적합성 고분자와 결합되는 모든 친핵체를 가리키며 결합체를 형성한 후 고유 활성중 적어도 일부분은 유지된다. 본원에서 "생물학적 활성"이라는 용어는 생리학적 또는 약물학적 활성으로 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 효소를 함유한 것과 같은 일부 친핵체 결합체는 유기 용매에서 반응을 촉매할 수 있다. 마찬가지로, 콘카나발린 A, 면역글로불린 등과 같은 단백질을 함유한 일부 고분자 결합체는 또한 실험실 진단체로서 유용하다. 일반적으로, 생물학적 활성 물질로는 화학적으로 합성된 것이거나 천연으로부터 분리된 것 모두를 포함하여 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 효소, 의학물질, 유전자, 플라스미드 또는 유기잔기가 포함된다.
단백질, 펩타이드 및 폴리펩타이드로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 헤모글로빈, 혈청 단백질(예, 인자 VII, VIII 및 IX를 포함한 혈액 인자), 면역글로불린, 사이토킨(예, 인터루킨), α-, β- 및 γ-인터페론, 콜로니 자극 인자(G-CSF 및 GM-CSF 포함), 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF) 및 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP)이 포함된다. 다른 일반적인 생물학적 또는 치료학적 단백질로는 인슐린, 식물 단백질(예, 렉틴 및 리신), 종양 괴사 인자(TNF) 및 연관된 대립형질체, 성장 인자(예, TGFα 또는 TGFβ와 같은 조직 성장 인자 및 내피 성장 인자), 호르몬(예, 소낭-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 색소성 호르몬 및 부갑상선 호르몬, 황체호르몬 분비 호르몬 및 이의 유도체), 칼시토닌(calcitonin), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(calcitonin gene related peptide, CGRP), 합성 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리쓰로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide, GHRP), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor, THF) 등이 포함된다. 면역글로불린으로는 IgG, IgE, IgM, IgA, IgD 및 이들의 단편이 포함된다.
인터루킨, 인터페론 및 콜로니 자극 인자와 같은 일부 단백질은 또한 보통 재조합 기술을 이용한 결과로서 비당화 형태로 존재할 수 있다. 비당화 형태 또한 본 발명의 생물학적 활성 물질에 포함된다.
본 발명에 유용한 생물학적 활성 물질은 단백질 및 펩타이드로 한정되는 것은 아니다. 필수적으로 생물학적 활성을 나타내는 화합물은 어떠한 것도 본 발명의 범위에 속한다. 본 발명에 특히 적합한 것은 천연 또는 합성된 의학적 화학물질과 같이 고분자 결합 부위가 하나 또는 소수인 화합물이다. 약제학적 화합물질과 같은 화학요법 분자, 예를 들면 파클리탁셀, 탁소테레, 관련된 탁소테레, 탁소이드 분자, 캠프토페신, 포도필로톡시, 아트라사이클린, 메토트렉세이트 등과 같은 항종양제, 심장혈관제, 위장관제, 중추신경계 활성화제, 진통제, 임신촉진제, 불임제, 항염증제, 스테로이드제, 심장혈관제, 혈관확장제, 혈관수축제 등이 포함된다.
또한, 본 발명의 생물학적 활성 물질은 생체내 생활성(bioactivity)을 증명하는 폴리펩타이드중 일부분을 포함한다. 이의 예로는 아미노산 서열, 안티센스 잔기 등, 항체 단편, 단일쇄 결합 항원(참조: 미국특허 제4,946,778호), 항체 또는 단편의 융합체를 포함한 결합 분자, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 촉매성 항체, 뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드가 포함된다. 기타 단백질로는 두드러기쑥, 항원 E, 꿀벌의 독액, 진드기 알레르겐 등과 같은 알레르겐 단백질이 포함된다.
또한, 본 발명의 생물학적 활성 물질은 효소를 포함한다. 효소의 예로는 탄수화물-특이적 효소, 단백질분해 효소, 산화환원 효소, 트랜스퍼라제, 하이드롤라제, 라이아제, 이소머라제 및 리가제가 포함된다. 구체적인 효소로는 이들로 한정하는 것은 아니지만 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제 및 빌리루빈 옥시다제를 들 수 있다. 탄수화합물-특이적 효소의 예로는 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 글루코우로니다제 등이 포함된다.
상기된 것들은 본 발명의 고분자와 결합하기에 적합한 생물학적으로 활성적인 친핵체의 예이다. 위에서 특정적으로 언급되지 않았으나 적합한 친핵성 기를 갖는 생물학적으로 활성적인 물질 또한 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
이외에, 본 발명의 생물학적 활성 물질은 안티센스 올리고뉴클레오타이드,유전자, 플라스미드 DNA와 같은 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)과 같은 비공유 결합에 의해 본 발명의 생체적합성 고분자와 물리적 결합체를 형성한다.
본 발명의 결합체는 생물학적으로 활성적이고 많은 치료 용도로 적용된다. 치료를 요하는 포유동물은 목적하는 생체활성 물질을 함유한 유효량의 고분자 결합체를 그 동물에게 투여함으로써 치료될 수 있다. 예를 들면, 효소 대체 요법, 유전자 요법 또는 혈액 인자를 요하는 포유동물에게 상기 목적하는 물질을 함유한 가지달린 고분자 결합체를 투여할 수 있다.
결합체의 제조 방법
결합체의 제조 방법은 생물학적 활성 물질의 고유 활성중 적어도 일부분을 유지하면서 결합이 이루어지도록 하기에 충분한 조건하에서 상기 활성화된 생체적합성 고분자와 치환 반응을 할 수 있는 친핵체를 함유한 생물학적 활성 물질을 접촉시킴을 포함한다.
하나 이상의 활성화된 생체적합성 고분자가 표준 화학 반응에 의해 생물학적 활성 물질에 결합될 수 있다. 결합체는 하기 화학식으로 표시될 수 있다:
{[P-OCH2CO-Y-]n-(L)s-(Q)t-(Y')k-A1}z-(생물학적 활성 물질)
상기식에서, P, Y, n, L, s, Q, t, Y' 및 k는 상기 정의된 바와 같고; A1은 생체적합성 고분자와 생물학적 활성 물질사이의 연결을 나타내고; z는 생물학적 활성 물질에 결합된 고분자의 수로서 1 이상의 정수이다. z의 상한치는 가능한 친핵성 결합 부위의 수 및 고분자 결합의 정도에 의해 결정될 것이다. 결합 정도는 잘 알려진 기술을 이용하여 반응의 화학량론을 조정하여 변경시킬 수 있다. 생물학적 활성 물질에 결합된 하나 이상의 고분자는 화학량론 과량의 고분자를 생물학적 활성 물질과 반응시켜 수득할 수 있다. 예를 들면, 단백질-고분자, 펩타이드-고분자, 효소-고분자, 항체-고분자 및 약물-고분자 결합체의 제조시, 생물학적 활성 물질 대 활성화된 생체적합성 고분자의 몰비는 약 1:1 내지 1:100이며, 1:1 내지 1:20인 것이 보다 바람직하다.
마찬가지로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 유전자, 플라스미드 DNA와 같은 핵산 분자와 고분자의 물리적 결합체를 제조할 경우도 약 1:1 내지 1:100의 비율로 사용할 수 있으며 바람직하게는 1:1 내지 1:20이다.
생물학적 활성 물질은 완충작용을 하는 수용성 반응매질에서 pH에 의존적으로 활성화된 고분자와 반응할 수 있다. 일반적으로, 단백질/폴리펩타이드 물질을 고려할 때 반응시 pH는 약 4 내지 약 9이고, 바람직하게는 약 6.5 내지 8.0이며, 가장 바람직하게는 약 7.4이다. 유기물/화학치료제 잔기는 비수용성 시스템에서 반응할 수 있다. 이들 물질의 안정화 및 반응 효율을 위한 최적 반응 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다. 바람직한 온도 범위는 0 내지 60℃이고 보다 바람직하게는 4 내지 30℃이다. 반응 매질의 온도는 생물학적 활성 물질이 변성되거나 또는 분해될 수 있는 온도를 초과할 수 없다. 반응시간은 5 분 내지 10 시간으로 하는 것이 바람직하다. 형성된 결합체는 투과여과(diafiltration), 컬럼 크로마토그래피 또는 상기 방법을 조합하여 사용함으로써 회수하고 정제할 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명의 다른 관점은 본 발명의 결합체를 투여하여 포유동물, 바람직하게는 사람에서 여러 의학적 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 치료하고자 하는 의학적 상태에 따라 본 발명의 결합체에 포함된 생물학적 활성 물질은 적절히 선택될 수 있다. 예를 들면, 활성 물질이 인터페론인 경우, 이 물질로 치료할 수 있는 의학적 상태로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 세포 증식 질환, 특히 암(예, 카포시 육종, 난소암, 다발성 골수종) 및 바이러스 감염(예, 헤르페스 심플렉스, 사이토메갈로바이러스, 엡스타인-바르 바이러스)이 포함된다.
투여 용량은 생물학적 활성 물질에 따라 다를 수 있으나 이들에 관해서는 중증도 및 환자 상태 등의 변수를 고려하여 잘 알려져 있으며, 단백질인 경우 일반적으로 2일에 일회, 바람직하게는 1주에 1회 또는 2회이다. 용량의 투여는 정맥내, 피하, 근육내, 비내, 경구 또는 기타 허용되는 전신, 국소 투여로 이루어질 수 있다.
본 발명의 결합체는 치료학적으로 유효한 양으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형되어 되어 이용될 수 있다. 약제학적 제형은 통상의 방법으로 제조될 수 있으며 사용되는 담체로는 예를 들면 트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트의 완충액과 같은 부형제(adjuvants), 사람 혈청 알부민과 같은 담체(carriers), 폴리옥시에틸렌 솔비탄과 같은 희석제(diluents), 티메로졸(thimerosol) 또는 벤질 알코올과 같은 보존제(preservatives) 및/또는 가용화제(solubilizers) 등일 수 있다. 본 발명의 결합체를 함유한 약제학적 조성물은 본 분야에 잘 알려진 방법에 제조되는 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 동결건조 분말의 형태일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
1. 활성화된 PEG 유도체의 합성
<실시예 1> mPEG5000-OCH 2 COGly-GlyCOOH의 합성
mPEG-니트로페닐(fw 5165.12, 0.75mol, 1eq, 3.8g)을 메틸렌 클로라이드(MC) 150ml에 녹인 후 트리에틸아민(TEA, fw 101.19, 7.5mmol, 10eq, d=1.069, 0.71ml)을 가하고 상온에서 30분 동안 교반하였다. NH2GlyglyCOOH(fw 132.12, 2.25mmol, 3eq, 0.297g)을 적가하고 2시간 교반한 후 4-디메틸아미노에틸아미노피리딘(DMAP, fw 122.17, 7.5mmol, 10eq, 0.916g)을 넣고 밤새 정체해 두었다.
반응 후 1N HCl를 이용해서 pH를 2-3으로 맞추고 H2O 300ml를 가하고 MC 100ml로 3회 추출하였다. 추출한 MC를 황산나트륨을 이용하여 건조시킨 후 증발시켰다. 에테르와 이소프로필 알코올(IPA) 2:1 용액에 천천히 적가하여 결정을 형성하고 여과 후 건조시켜 흰색 고체 3.65g(수율: 95.9%)을 수득하였다.
<실시예 2> mPEG12000-OCH 2 COGly-GlyCOOH의 합성
mPEG-니트로페닐(5000) 대신에 mPEG-니트로페닐(12000)을 사용하고 실시예 1에 기술된 단계를 동일하게 실시하여 0.27 g의 mPEG-OCH2COGly-GlyNHS(12000)(0.025 mmole)을 수득하였다.
2. PEG 링커를 갖는 가지달린 PEG와 가지달린 PEG 유도체의 합성
<실시예 3> 활성화된 가지달린 (mPEG5000-OCH 2 COGlyGly) 2 -Lys-NHS의 합성
상기 실시예 1에서 제조된 mPEGOCH2CONHGlyGlyCOOH(fw 5174.17, 0.2mmol, 2eq, 1.01g)을 MC 10ml에 녹이고 1,3-디사이클로헥실카르보디이드(DCC, fw 266.33, 1mmol, 5eq, 0.26g)을 넣고 상온에서 30분 교반시켰다. 이에 NH2(CH2)4CH(NH2)COOH(라이신·HCl, fw 182.6, 0.1mmol, 1eq, 0.018g)을 넣고 2시간 교반 후 DMAP(fw 122.17, 1mmol, 5eq, 0.122g)을 가하고 밤새 정체해 두었다.
반응 후 1N HCl를 이용해서 pH를 2-3으로 맞추고 H2O 150ml를 가하고 MC 80ml로 3회 추출하였다. 추출한 MC를 황산나트륨을 이용하여 건조시킨 후 증발시켰다. 에테르와 IPA 2:1 용액에 천천히 적가하여 결정을 형성하고 여과 후 건조시켜 흰색 고체 0.95g(수율: 92.7%)을 수득하였다.
상기에서 합성된 mPEGOCH2CONHGlyGlyCO)2LysCOOH(fw 10462.7, 0.008mmol, 1eq, 82.5mg)을 MC 2ml에 녹이고 DCC(fw 266.33, 10eq, 0.08mmol, 9mg)를 가하여 30분 동안 교반하였다. N-하이드록시석신이미드(NHS, fw 115.09, 10eq, 0.08mmol, 0.02g)를 넣고 48시간 교반하였다.
셀라이트(Celite)로 반응액을 여과하고 증발시켰다. 에테르와 IPA 2:1 용액에 천천히 적가하여 결정을 형성하고 여과 후 건조시켜 흰색 고체 78mg(수율: 95.2%)를 수득하였다.
<실시예 4> 활성화된 가지달린 (mPEG12000-OCH 2 COGly-Gly) 2 Lys-NHS 의 합성
15mg의 mPEG12000-OCH2COGly-GlyCOOH를 사용하고 실시예 3에 기술된 단계를 동일하게 실시하여 25 mg의 가지달린 (mPEG12000-OCH2COGly-Gly)2Lys-NHS를 수득하였다.
<실시예 5> 긴 연결쇄(linker)를 가진 활성화된 가지달린
(mPEG5000-OCH 2 COGly-Gly) 2 Lys-PEG3400NHS의 합성
실시예 3에서 제조된 (mPEG5000-OCH2CONHGlyGlyCO)2LysCOONHS(fw 10550, 1eq, 0.0041mmol, 43.5mg)을 MC 2ml에 녹이고 TEA(fw 101.19, 10eq, 0.041mol, 3.9μl)을 넣고 30분 동안 교반한 후 NH2PEGCOOH(fw 3400, 2eq, 0.0123mmol, 41.8mg)을 가하였다. 2시간 교반하고 DMAP(촉매량 소량)넣고 밤새 정체해 두었다.
반응 후 1N HCl를 이용해서 pH를 2-3으로 맞추고 H2O 20ml를 가하고 MC 40ml로 추출하였다. 에테르와 IPA 2:1 용액에 천천히 가하여 결정을 형성하고 여과 후 건조시켜 흰색 고체 25mg(수율: 52.6%)을 수득하였다.
상기에서 합성된 (mPEG5000-OCH2CONHGlyGlyCO)2LysCONHPEGCOOH(fw 13844, 0.0022mmol, 1eq, 30mg)을 실시예 1과 같은 방법으로 처리하여 25 mg의 가지달린 (mPEG5000-OCH2COGly-Gly)2Lys-PEG3400-NHS를 수득하였다.
<실시예 6> 긴 연결쇄(linker)를 가진 활성화된
가지달린 (mPEG12000-OCH 2 COGly-Gly) 2 Lys-PEG3400NHS의 합성
실시예 4에서 제조된 가지달린 (mPEG12000-OCH2COGly-Gly)2Lys-NHS0.06g(0.00247mmole)을 사용하고 실시예 5에 기술된 단계를 동일하게 실시하여 0.05g의 가지달린 (mPEG12000-OCH2COGly-Gly)2Lys-PEG3400NHS)을 수득하였다.
<실시예 7> 활성화된 가지달린
(mPEG5000-OCH 2 COGly-Gly) 2 Lys-PEG3400NHNH 2 (5000)의 합성
실시예 5에서 수득된 0.1g의 가지달린 (mPEG5000-OCH2COGly-Gly)2Lys-PEG3400COOH(0.007mmole)를 메틸렌 클로라이드에 녹인 후 0.05g의 SOCl2(0.4mmole)을 적가하고 가열하여 3시간 동안 환류 반응시킨 후 실온까지 식히고 증발시켰다. 그 결과 갈색의 표제 화합물 (mPEG5000-OCH2COGly-Gly)2Lys-PEG3400-COCl 0.08g을 수득하였다. 상기에서 얻어진(mPEG5000-OCH2COGly-Gly)2Lys-PEG3400-COCl(1.1mmole)을 MC에 녹인 후 NH2NH2, H2O 10ml을 적가하여 넣고 실온에서 교반하여 3시간 반응시킨 후 증발시키고, 실리카 칼럼에서 분리하고 이를 증발시키고 진공 건조시켜 약 1mmole(수율: 92%)의 황색 오일을 수득하였다.
<실시예 8> 활성화된 가지달린
(mPEG12000-OCH 2 COGly-Gly) 2 Lys-PEG3400NHNH 2 의 합성
실시예 6에서 수득된 0.15g의 가지달린 (mPEG12000-OCH2COGly-Gly)2Lys-PEG3400NHS(0.005mmole)을 사용하고 실시예 7에 기술된 단계를 동일하게 실시하여0.12g의 가지달린 (mPEG12000-OCH2COGly-Gly)2Lys-PEG3400NHNH2를 수득하였다.
<실시예 9> mPEG12000-OCH 2 COAla-HisCOOH 의 합성
mPEG12000-니트로페닐(fw 12165.12, 0.1mol, 1eq, 1.23g)을 MC 150ml에 녹인 후 트리에틸아민(TEA, fw 101.19, 1mmol, 10eq, d=1.069, 0.095ml)을 가하고 상온에서 30분 동안 교반하였다. NH2AlaHisCOOH(fw 226.2, 0.3mmol, 3eq, 68mg)을 적가하고 2시간 교반 후 DMAP(fw 122.17, 1mmol, 10eq, 0.122g)을 넣고 밤새 정체해 두었다.
반응 후 1N HCl를 이용해서 pH를 2-3으로 맞추고 H2O 50ml를 가하고 MC 20ml로 3회 추출하였다. 추출한 MC를 황산나트륨을 이용하여 건조시킨 후 증발시켰다. 에테르와 IPA 2:1 용액에 천천히 적가하여 결정을 형성하고 여과 후 건조시켜 흰색 고체 1.15g(수율: 93.9%)을 수득하였다.
<실시예 10>활성화된 가지달린 (mPEG12000-OCH 2 COAla-His) 2 Lys-NHS의 합성
실시예 9에서 만들어진 mPEG12000-OCH2COAla-HisCOOH(fw 12252.2, 0.088mmol, 2.2eq, 1.08g)을 사용하여 <실시예 3>에서와 같은 방법으로 흰색 고체 0.95g(수율: 97.1%)의 (mPEG12000-OCH2COAla-His)2Lys-NHS을 얻었다.
<실시예 11>아미노산 연결쇄(linker)를 가진 활성화된
가지달린 (mPEG12000-OCH 2 COAla-His) 2 Lys-GlyNHS의 합성
(mPEG12000-OCH2CONHAlaHisCO)2LysCOONHS(fw 24565.49, 1eq, 0.02mmol, 0.49mg)을 MC 2ml에 녹이고 TEA(fw 101.19, 10eq, 0.2mol, 0.016ml)을 넣고 30분 동안 교반한 후 NH2CH2COOH(Glycine fw 75.07, 3eq, 0.06mmol, 4.5mg)을 가하였다. 2시간 교반하고 DMAP(fw 122.17, 10eq, 0.3mmol, 37mg)를 넣고 밤새 정체해 두었다.
반응 후 1N HCl를 이용해서 pH를 2-3으로 맞추고 H2O 20ml를 가하고 MC 20ml로 추출하였다. 추출한 MC를 황산나트륨을 이용하여 건조시킨 후 증발시켰다. 에테르와 IPA 2:1 용액에 천천히 적가하여 결정을 형성하고 여과 후 건조시켜 흰색 고체 0.42g(수율: 85.5%)을 수득하였다.
<실시예 12>아미노산 연결쇄(linker)를 가진 활성화된
가지달린(mPEG12000-OCH 2 COAla-His) 2 -(2,4-디아미노부틸산)-GlyNHS의 합성
실시예 9에서 제조한 mPEG12000-OCH2COAla-HisCOOH(fw 12252.2, 0.088mmol, 2.2eq, 1.08g)을 사용하여 <실시예 3>에서와 같은 방법으로 표제 화합물을 제조하였다. 이때 라이신 대신 2,4-디아미노 부틸산을 사용하였다.
<실시예 13>고분자 연결쇄를 가진 활성화된 가지달린 (mPEG12000) 2 -Ala-His-PEG3400-NHS
A. (mPEG12000)2-Ala-His-COOH 합성
NH2-Ala-His-COOH(MW=226.2, 0.04mmol, 1eq, 10mg)를 탈이온수 20ml에 녹이고 0.2N NaOH를 사용하여 pH를 8로 조정하였다. mPEG-NPC(MW=12000, 0.125mmol, 3eq, 1.5g)를 가하고 0.2N NaOH를 사용하여 3시간 동안 pH를 8로 유지시킨 후, 실온에서 밤새 반응시켰다. 반응 후, 1N HCl를 사용하여 pH를 2-3으로 맞춘 후, MC로 추출하였다. 추출한 MC층을 농축하여 에테르에 천천히 적가하여 침전을 형성하고 여과 후 건조시켜 백색 분말 1.2g(수율: 80 %)를 얻었다.
B. (mPEG12000)2-Ala-His-PEG3400-NHS 합성
상기 수득된 생성물 (mPEG12000)2-Ala-His-COOH를 <실시예 3>과 같은 방법으로 (mPEG12000)2-Ala-His-NHS를 만든 후 <실시예 5>와 같은 방법을 실시하여 (mPEG12000)2-Ala-His-PEG3400-NHS를 합성하였다.
<실시예 14> 결합체 (mPEG12000-OCH2CONH-Ala-His)2(2,4-디아미노 부틸산)-Gly-캠프토테신의 제조
실시예 12에서 제조된 (mPEG12000-OCH2CONH-Ala-His)2(2,4-디아미노부틸산)-Gly-COOH 0.1 g(0.004mmoles), 캠프토테신 280mg(0.8 mmoles), 디이소프로필카르보디이미드 1mg(0.008mmoles) 및 4-디메틸아미노피리딘 1mg(0.008mmoles)의 혼합물을 0℃에서 무수 디클로로메탄 2ml에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온으로 가온하고 18 시간 동안 교반한 후 용매를 진공 증류시켜 제거하였다. 잔여물을 2-프로판올로 재결정하여 표제 결합체 34mg을 수득하였다.
<실시예 15> 결합체 (mPEG12000-OCH2COGly-Gly)2(2,4-디아미노부틸산)-Gly-파클리탁셀의 제조
실시예 3에서 제조된 (mPEG12000-OCH2COGly-Gly)2(2,4-디아미노부틸산)-Gly-COOH, 100mg(0.004mmoles), 파클리탁셀 2.8mg(0.008mmoles), 디이소프로필카르보디이미드 1mg(0.008mmoles) 및 4-디메틸아미노피리딘 1mg(0.008mmoles)의 혼합물을 0℃에서 무수 디클로로메탄 1ml에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온으로 가온하고 18시간 동안 교반한 후 용매를 진공 증류시켜 제거하였다. 잔여물을 2-프로판올로 재결정하여 표제 결합체 34mg을 수득하였다.
<실시예 16> 결합체 (mPEG12000-OCH2COGly-Gly)2(2,4-디아미노부틸산)-PEG'-인터페론의 제조
1mg의 인터페론을 pH 7.0인 0.1M 인산용액으로 투석한 후, 7.4mg의 (mPEG12000-OCH2COGly-Gly)2(2,4-디아미노부틸산)-PEG'-NHS를 넣어 실온에서 교반하여 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 크기 배제 컬럼을 이용하여 (mPEG12000-OCH2COGly-Gly)2(2,4-디아미노부틸산)-PEG'-인터페론을 분리 정제하였다.
<실시예 17> 결합체 (mPEG12000-OCH2COGly-Gly)2(2,4-디아미노부틸산)-PEG'-G-CSF의 제조
1mg의 G-CSF를 pH 7.5인 0.1M 인산용액으로 투석한 후, 7.5mg의 (mPEG12000-OCH2COGly-Gly)2(2,4-디아미노 부틸산)-PEG'-NHS를 넣어 실온에서 교반하여 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 크기 배제 컬럼을 이용하여 (mPEG12000-OCH2COGly-Gly)2(2,4-디아미노 부틸산)-PEG'-G-CSF를 분리 정제하였다.
<실시예 18> 랫트에서의 (mPEG12000-OCH2COGly-Gly)2(2,4-디아미노부틸산)-PEG'-인터페론의 효능 측정
MDBK 세포를 계수하여 5% FBS/MEM으로 7.5×105세포/㎖ 농도로 희석하여 부유시켰다. 세포 부유액을 100㎕씩 96 평판 각 웰에 넣고, <실시예 11>에서 제조된PEG-IFN을 랫트에 정맥투여하여 채혈하여 얻은 혈청 시료 100㎕ 씩을 넣은 후 배양기에서 20시간 배양시켰다. 바이러스를 1/100 배 희석시켜 100㎕ 씩 가한 후, 다시 배양기에서 20시간 배양시켰다. 96 웰 평판의 바이러스 배지 용액을 제거한 후, 0.05% 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 염색액 50㎕/well 씩 넣고 마이크로플레이트 리더(Microplate reader)의 파장 550nm에서 각 웰에 대한 O.D.를 측정하여 IFN의 활성을 계산하였다. 이의 결과는 도 1에 나타나 있다.
<실시예 19> 랫트에서의 (mPEG12000-OCH2COGly-Gly)2(2,4-디아미노부틸산)-PEG'-G-CSF의 백혈구(WBC) 측정
7주령 웅성 Sprague-Dawley 랫트(체중 220-240g)을 Charles River Co.(Atsugi, Japan)에서 구입하여 사용하였다. <실시예 12>에서 제조된 PEG-G-CSF를 100㎍/kg의 농도로 랫트의 꼬리 정맥으로 주사하였으며, 대조구는 생리 식염수를 약물 투여량과 같은 용량으로 주사하였다. 또한 같은 양의 G-CSF가 대조구로 사용되었다. 채혈은 약물 투여전, 투여후 6, 12, 24, 48, 72, 96 시간에 꼬리 정맥을 통하여 채혈하였으며, WBC 측정은 채혈 후 즉시 Automated Hematology Analyzer (Cysmex K-4500)로 WBC를 측정하였다. 이의 결과는 도 2에 나타나 있다.
본 발명은 펩타이드 스페이서를 포함하는 고반응성 생체적합성 고분자 유도체에 관한 것으로 이들 펩타이드 스페이서는 고분자 유도체에 양전하를 부가하고균형된 친수성-소수성을 제공함으로써 고분자 유도체에 결합된 단백질, 항-센스 올리고뉴클레오타이드, 플라스미드 DNA 또는 저분자량 물질의 세포 트래피킹과 엔도좀 분열이 증가하고 더불어 혈중 체내 반감기 및 체내 안정성이 증가되어 상기 결합된 물질의 우수한 생체이용률을 얻을 수 있다.

Claims (13)

  1. 하기 화학식(I)로 표시되는 활성화된 생체적합성 고분자:
    [P-OCH2CO-Y]n-(L)s-(Q)t-(Y')k-A(I)
    상기식에서,
    P 및 Q는 동일하거나 상이할 수 있고, 생체적합성 고분자이며,
    t는 0 또는 1이고,
    Y 및 Y'는 동일하거나 상이할 수 있고, 아미노산중 2개 내지 18개의 임의 조합으로 이루어진 펩타이드이며,
    k는 0 또는 1이고,
    L은 지방족 연결 잔기(aliphatic linking moiety) 또는 디아미노카르복실산(diamino carboxylic acid)이고,
    s는 0 또는 1이고,
    A는 반응성 작용기(reactive functional group)이며,
    n은 1 또는 2이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 P 및 Q로 표기된 생체적합성 고분자가 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리트리메틸렌 글리콜, 폴리락트산 및그 유도체, 폴리아크릴산 및 그 유도체, 폴리(아미노산), 폴리우레탄, 폴리포스파진, 폴리(L-라이신), 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올 및 폴리아크릴 아마이드로 이루어진 그룹중에서 선택되는 고분자 유도체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 P로 표기된 고분자의 수 평균 분자량이 200 내지 100,000임을 특징으로 하는 생체적합성 고분자.
  4. 제2항에 있어서, 상기 Q로 표기된 고분자의 수 평균 분자량이 200 내지 20,000인 것을 특징으로 하는 생체적합성 고분자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 A로 표기된 반응성 작용기가 NHS, NH2NH2, 카르보닐 이미다졸, 니트로페닐, 이소시아네이트, 설포닐 클로라이드, 알데하이드, 글라이옥살, 에폭사이드, 카르보네이트, 시아누르산 할라이드, 디티오카르보네이트, 토실레이트 및 말레이미드로 이루어진 그룹중에서 선택되는 생체적합성 고분자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 Y로 표기된 펩타이드가 디펩타이드 또는 트리펩타이드인 생체적합성 고분자.
  7. 제6항에 있어서, 디펩타이드가 Ala-His인 생체적합성 고분자.
  8. 하기 화학식으로 표시되는 생물학적 활성 결합체:
    {[P-OCH2CO-Y-]n-(L)s-(Q)t-(Y')k-A1}z-(생물학적 활성 물질)
    상기식에서,
    P 및 Q는 동일하거나 상이할 수 있고, 생체적합성 고분자이며,
    t는 0 또는 1이고,
    Y 및 Y'는 동일하거나 상이할 수 있고, 아미노산중 2개 내지 18개의 임의 조합으로 이루어진 펩타이드이며,
    k는 0 또는 1이고,
    L은 지방족 연결 잔기 또는 디아미노카르복실산이고,
    s는 0 또는 1이고,
    A는 반응성 작용기이며,
    n은 1 또는 2이다.
    A1은 생체적합성 고분자와 생물학적 활성 물질사이의 연결을 나타내고;
    z는 생물학적 활성 물질에 결합된 고분자의 수로서 1 이상의 정수이다.
  9. 제8항에 있어서, 생물학적 활성 물질이 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 효소, 약물 및 유기잔기로 이루어진 그룹중에서 선택되는 결합체.
  10. 제9항에 있어서, 생물학적 활성 물질이 알파, 베타 및 감마 인터페론, 아스파라기나아제, 아르기나아제, 아르기닌 데이미나아제, 아데노신 디아미나아제, 수퍼옥사이드 디스뮤타아제, 엔도톡시나아제, 카탈라아제, 키모트립신, 리파아제, 유리카제, 아데노신 디포스파타아제, 티로시나아제, 글루코오스 옥시다아제, 글루코시다아제, 갈락토시다아제, 글루코유로니다아제, 헤모글로빈, 혈액인자 VII, VIII 및 IX, 면역글로불린, 사이토카인, G-CSF, GM-CSF, PDGF, 렉틴, 리신, TNF, TGF, EGF, PTH, 칼시토닌, 부갑상선 호르몬, 인슐린, 합성 엔케팔린, 성장호르몬 분비 펩타이드, 황체호르몬 분비 호르몬 및 그 유도체, 시상하부의 분비물질, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드, 갑상선 자극 호르몬 및 흉선 체액성 인자로 이루어진 그룹중에서 선택되는 결합체.
  11. 제1항에 청구된 생체적합성 고분자와 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 유전자 또는 플라스미드 DNA와 비공유 결합하여 형성된 결합체.
  12. (a) P-OH를 에테르화하여 화학식 P-OCH2COOH를 생성하고;
    (b) 생성된 화학식 P-OCH2COOH를 활성화시키고 펩타이드(Y)와 반응시켜 P-OCH2CO-Y-COOH를 생성하고;
    (d) 생성된 P-OCH2CO-Y-COOH를 활성화시키고 친핵성 작용기를 갖는 지방족 연결 화합물과 반응시켜 화학식 [P-OCH2CO-Y]n-L을 생성하고;
    (e) 생성된 [P-OCH2CO-Y]n-L을 활성화된 고분자(Q)와 반응시켜 화학식 [P-OCH2CO-Y]n-(L)s-(Q)t을 생성하고;
    (f) 생성된 [P-OCH2CO-Y]n-(L)s-(Q)t를 펩타이드(Y')와 반응시켜 화학식 [P-OCH2CO-Y]n-(L)s-(Q)t-(Y')를 생성하고;
    (g) 화학식 [P-OCH2CO-Y]n-(L)s-(Q)t-(Y')를 활성화시킴을 포함하여 켜 하기 화학식(I)로 표시되는 활성화된 고분자를 제조하는 방법:
    [P-OCH2CO-Y]n-(L)s-(Q)t-(Y')k-A(I)
    상기식에서,
    P 및 Q는 동일하거나 상이할 수 있고, 생체적합성 고분자이며,
    t는 0 또는 1이고,
    Y 및 Y'는 동일하거나 상이할 수 있고, 아미노산중 2개 내지 18개의 임의 조합으로 이루어진 펩타이드이며,
    k는 0 또는 1이고,
    L은 지방족 연결 잔기 또는 디아미노카르복실산이고,
    s는 0 또는 1이고,
    A는 반응성 작용기이며,
    n은 1 또는 2이다.
  13. 약제학적으로 유효한 양의 제8항의 결합체와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 질환 치료용 약제학적 조성물.
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