KR100562895B1 - 약물의 간세포 표적화를 위한 생물학적 활성 고분자 결합체 - Google Patents

약물의 간세포 표적화를 위한 생물학적 활성 고분자 결합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체적합성 고분자의 양쪽에 각각 간세포를 표적으로 할 수 있는 표적화 잔기와 간세포의 표적화가 요구되는 약물이 공유결합 되어 있음을 특징으로 하는 상기 약물의 전달을 위한 생물학적 활성 고분자 결합체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 생물학적 활성 고분자 결합체는 간세포의 표적화가 요구되는 약물의 체내 흡수를 증가시키고, 체내 반감기를 연장하며, 체내 안정성을 증가시켜 상기 약물의 생체이용률을 높이는 한편, 그 약물의 간세포의 표적화를 증가시켜 약물의 수용성 및 효능을 높이면서 유해한 부작용은 감소시킨다.
간세포 표적화, 생체적합성 고분자, 간세포 표적화 약물, 결합체

Description

약물의 간세포 표적화를 위한 생물학적 활성 고분자 결합체 {Biologically Active Polymeric Conjugate For Hepatocyte Targeting Of Drug}
본 발명은 생체적합성 고분자(biocompatible polymer)를 이용한 화학요법에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 생체적합성 고분자의 양쪽에 각각 간세포를 표적으로 할 수 있는 표적화 잔기와 간세포의 표적화가 요구되는 약물이 공유결합되어 있는 생물학적 활성 고분자 결합체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
최근에는 대량 합성법이나 유전 공학에 의해 대량 생산이 가능해짐으로써, 다양한 단백질, 펩타이드, 효소 등이 높은 치료효과를 가진 약물로 사용되고 있다. 그러나, 이러한 약물을 생체에 적용하는 데는 많은 문제점이 있다. 약물은 체내 투여 후 쉽게 가수분해되거나 효소에 의해 단시간에 파괴되어 흡수율이 극히 낮게 될 수 있으며, 또한 반복적으로 투여되면 면역 반응이 자주 유도되어 생성된 항체에 의한 생리활성의 중화작용으로 인해 생명을 위협할 정도의 과민반응이 유발될 뿐만 아니라 망상세포의 내피계(reticuloendothelial system)에 의한 소실(clearance)이 증가하게 될 수 있다.
약물을 합성 고분자와 결합시키는 것은 생체 내(in vivo) 및 생체 외(in vitro) 적용 시에 많은 이점을 제공할 수 있다. 약물에 대한 고분자의 공유결합은 분자의 표면특성 및 용해성을 변화시켜서 물 또는 유기용매에 대한 용해성을 증가시킬 수 있다. 또한, 생체적합성(biocompatibility)을 증가시켜서 면역 반응성을 감소시키며, 생체 내에서의 안정성을 증가시킬 뿐만 아니라 장관 시스템, 신장, 비장 또는 간에 의한 소실을 연장시킬 수 있다. 이와 같이 약물은 이의 생체이용률(bioavailability)을 향상시킬 수 있는 한편, 체내의 선택된 특정 부위에만 분포된다면 약물이 다른 부위에 존재함으로써 일어날 수 있는 독성과 같은 유해한 부작용(adverse side effect)은 감소되어 결국 약물의 효능이 상당히 증가되는 효과를 얻을 수 있을 것이다. 그러나 약물을 생체적합성 고분자에 결합시키는 방법으로 약물이 작용해야할 표적 부위(target site)에 그 약물을 전달하는 것은 그다지 효과적이지 못하다. 항염증제, 항바이러스제, 항암제 등과 같이 고도의 효능을 갖는 약물들은 그 약효가 뛰어남에도 불구하고 표적 부위에 대한 선택성이 없어 정상 세포(normal cells)까지 사멸시키는 부작용을 유발하며 이로 인해 화학요법을 위한 치료제로 사용하는데 한계가 있어 왔다.
화학요법을 통해 간세포의 표적화가 요구되는 약물을 적용하는데 있어 그 한계를 개선하기 위한 연구들이 다양하게 진행되고 있다. 한 가지 방법은 수용체를 매개로 하여 약물이 표적 부위인 간세포를 겨냥 추적하도록 하는 것(receptor-mediated drug targeting)이다. 예를 들면, Seymour 등은 HPMA 공중합체(hydroxypropylmethacrylate copolymer)를 이용하여 간세포 갈락토즈 수용 체(hepatocyte galactose receptor)를 표적화하였고(Br. J. Cancer, 63, 859-866, 1991), Sett 등은 항암제인 메토트렉세이트(methotrexate)를 만노실 사람 혈청 알부민(manosyl human serum albumin)과 반응시켜 수용체-매개된 세포이물흡수(receptor mediated endocytosis)에 사용하였다(J. Antimicrob. Chemother. 31, 151-159, 1993). 또한, Oku 등은 체내에서 불안정한 천연 리포좀(native liposome)의 문제점을 해결하기 위해 페질화 리포좀(PEGylated liposome)을 담체(carrier)로 사용하여 혈중 반감기를 연장시켜 약물의 효능을 증가시켰다고 보고한 바 있다(Adv. Drug Deliv. Rev. 40, 63-73, 1999). 또한, Ishihara 등은 당-인식 기전(sugar-recognition mechanism)에 의거하여 당단백질-피복된 리포좀(glycoprotein coated liposome)을 이용하여 사람 인터페론 감마(human IFN-α)를 랫트의 간세포에 흡수(uptake)시켰다(Pharm. Res. 7, 542-546, 1990). 그러나 리포좀이 약물 전달에 사용되기 위해서는 약물이 정맥투여 전후 기간동안 리포좀과 강력하게 결합되어 있어야 하는 안정성의 문제가 있고 게다가 당단백질-피복된 리포좀들은 면역원성 문제가 제기되고 있다. 또한, Hashida 등은 폴리-L-글루탐산(poly-L-glutamic acid, PLGA) 및 갈락토실화된 폴리-L-라이신(galactosylated poly-L-lysine)과 같은 생체분해성 고분자(biodegradable polymer)를 난용성이고 불안정한 프로스타글란딘(prostaglandin)에 수식하여 고분자 프로드러그(polymeric prodrug)를 제조한 후 약물의 간 표적화를 증가시키고 간에서 고분자의 백본(backbond)이 분해된다는 것을 밝혔다(J. of Contr. Release, 62, 253-262, 1999). 그러나 사용된 고분자가 분해될 때 약물의 안정성 및 면역원 성 문제에 대한 정확한 보고가 되어 있지 않다.
따라서, 간세포의 표적화가 요구되는 약물의 체내 흡수 및 반감기를 증가 및 연장시키고 체내 안정성을 증가시켜 상기 약물의 생체이용률을 높이는 한편 그 약물이 체내 간세포를 표적으로 겨냥하여 그 표적 부위에 높은 비율로 도달하도록 함으로써 그 약물의 수용성 및 효능을 증대시키고 부작용을 줄일 수 있는 새로운 생물학적 활성 고분자 결합체가 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 간세포의 표적화가 요구되는 약물의 체내 안정성 및 용해도와 함께 간세포의 표적화를 증가시켜 상기 약물의 간세포의 흡수 및 생체이용률을 증가시키는데 있다. 이러한 본 발명의 목적은 체내 간세포를 표적으로 할 수 있는 표적화 잔기를 사용하고 이를 생체적합성 고분자의 한쪽에 공유결합시키고 그 생체적합성 고분자의 반대쪽에 약물을 공유결합시킴으로써 달성되었다.
본 발명은 하기 화학식(I)로 표시되는 생물학적 활성 고분자 결합체를 제공한다:
X-P-A1-D (I)
상기식에서,
X는 간세포를 표적으로 할 수 있는 표적화 잔기를 나타내고;
P는 생체적합성 고분자 또는 유도체를 나타내며;
D는 간세포의 표적화가 요구되는 약물을 나타내고;
A1은 생체적합성 고분자와 약물사이의 연결을 나타낸다.
또한, 본 발명은 하기 화학식(Ⅱ)로 표시되는 생물학적 활성 고분자 결합체를 제공한다:
[X-Y-P-Y'-]m-(L)s-A1-D (Ⅱ)
상기식에서,
X는 간세포를 표적으로 할 수 있는 표적화 잔기를 나타내고;
P는 생체적합성 고분자이며;
Y 및 Y'는 동일하거나 상이할 수 있으며, 각각 독립적으로 아미노산중 2개 내지 18개의 임의 조합으로 이루어진 펩타이드이며;
L은 지방족 연결 잔기 또는 디아미노카르복실산이고;
s는 0 또는 1이고;
m은 1 또는 2이며;
D는 간세포의 표적화가 요구되는 약물을 나타내고;
A1은 생체적합성 고분자와 약물사이의 연결을 나타낸다.

또한, 본 발명은 하기 화학식(Ⅲ)으로 표시되는 생물학적 활성 고분자 결합체를 제공한다:
Figure 112003017001815-pat00001
(Ⅲ)
상기식에서,
X는 간세포을 표적으로 할 수 있는 표적화 잔기를 나타내고;
P는 생체적합성 고분자를 나타내며;
PEI는 폴리에틸렌이민을 가리키고;
n은 2 내지 80이고 (따라서, PEI의 이의 수 평균 분자량은 500 내지 20,000이다);
D는 간세포의 표적화가 요구되는 약물을 나타낸다.
본 발명에 따른 생물학적 활성 고분자 결합체는 헤테로작용성 말단을 갖는 생체적합성 고분자의 한쪽 말단에 간세포를 표적으로 할 수 있는 표적화 잔기가 공유결합되고 다른 쪽 말단에 반응성 작용기를 통해 간세포의 표적화가 요구되는 약 물이 공유결합되어 구성된다.
간세포를 표적으로 할 수 있는 표적화 잔기
본 발명의 생물학적 활성 고분자 결합체를 구성하는 헤테로작용성 말단을 갖는 생체적합성 고분자의 한쪽 말단에 공유결합되는 간세포를 표적으로 할 수 있는 표적화 잔기는 간세포의 막 수용체에 의해 인식될 수 있는 시그날 일원(signal member)은 어떠한 것도 가능하다. 바람직한 표적화 잔기는 간세포와 특이적으로 결합하는 당(saccharides)이다. 당은 단당류 또는 이당류가 사용될 수 있다. 단당류의 예로는 갈락토즈, 퓨코즈(fucose), 글루코즈 및 만노즈를 들 수 있고, 이당류의 예로는 갈락토즈를 포함한 이당류, 락토즈 및 말토즈를 들 수 있다. 바람직한 당은 갈락토즈 및 갈락토즈를 포함한 이당류이다. 가장 바람직하게는 갈락토즈이다.
간세포의 표적화가 요구되는 약물
본 발명에 따른 생물학적 활성 고분자 결합체를 구성하는 헤테로작용성 말단을 갖는 생체적합성 고분자의 한쪽 말단에 반응성 작용기를 통해 공유결합되는 간세포의 표적화가 요구되는 약물은 세포, 기관 또는 유기체에 작용하며, 특히 간에서 대사가 이루어지는 약물들로 물에 대한 용해성(solubility)이 낮은 약물들이 또한 선호된다. 이러한 약물로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 항신생물제(anti-neoplastic agents), 항균제(antibacterial agents), 항바이러스제(antiviral compounds), 항진균제(antifungal agents) 및 항기생충제(anti-parasitic compounds)가 포함된다.
항신생물제의 예로는 팍클리탁셀(paclitaxel), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 카미노마이신(carminomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 미토마이신(mitomycin) C, N-메틸 미토마이신 C, 블레오마이신(bleomycin) A.sub.2, 디데아자테트라하이드로폴산(dideazatetrahydrofolic acid), 아미노프테린(aminopterin), 메토트렉세이트(methotrexate), 콜치신(cholchicine) 및 시스플라틴을 들 수 있다.
항균제의 예로는 아미노글리코시드(aminoglycosides) 계로 젠타마이신(gentamicin)을 들 수 있다. 항바이러스제의 예로는 리팜피신(rifampicin), 3'-아지도-3'-데옥시티미딘(AZT) 및 아실로비르(acylovir)를 들 수 있다.
항진균제의 예로는 아졸(azoles) 계로 플루코나졸(fluconazole), 플라이르 마크로라이드(plyre macrolides) 계로 암포테리신(amphotericin) B 및 캔디시딘(candicidin)을 들 수 있다.
항기생충제의 예로는 안티모니알(antimonials)을 들 수 있다.
기타 본 발명에서 사용될 수 있는 약물로는 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 즉 항체, 디프테리아 독소와 독소, 콜로니 자극 인자(colony stimulating factor), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factors), 신경계펩타이드(neuropeptides), 인슐린, 성장호르몬, 에리Tm로포이에틴(erythropoietin) 및 갑상선 호르몬(thyroid hormone)과 같은 펩타이드 호르몬, 아세틸콜린과 같은 신경전달물질(neurotransmitters), 알파-지단백질(alpha-lipoprotein)과 같은 지단백질, 하이알루론산(hyaluronic acid)과 같은 프로테오글리칸(proteoglycans), 인터페론 또는 인터루킨과 같은 사이토킨, 인도메타신(indomethacin), 살리실산 아세테이트(salicylic acid acetate), 케토프로펜(Ketoprofen), 나프록센(Naproxen), 몰핀(Morphine), 이부프로펜(ibuprofen), 설린닥(sulindac), 피록시캄(piroxicam) 및 나프록센(naproxen)과 같은 비스테로이드계 항염증제(non-steroidal anti-inflammatories) 등이 있다.
생체적합성 고분자
본 발명에서 사용되는 생체적합성 고분자는 간세포의 표적화가 요구되는 약물과 결합하기 위해 활성화되어야 한다. 생체적합성 고분자의 활성화는 생체적합성 고분자의 말단기중 하나를 반응성 작용 기(group) 또는 잔기(moiety)로 전환시켜 달성한다. 이러한 전환에 의한 생성물을 "활성화된 생체적합성 고분자"라고 한다. 예를 들면, 폴리(알킬렌 옥사이드)를 약물에 결합시키기 위해 하이드록실 말단기중 하나를 카보네이트와 같은 반응성 작용기로 전환시킬 수 있으며 이에 따라 얻어진 생성물은 활성화된 폴리(알킬렌 옥사이드)가 된다.
A. 활성화된 생체적합성 고분자로서의 첫 번째 그룹
본 발명에서 사용되는 생체적합성 고분자의 한 그룹으로는 하기 화학식(IA)으로 표시되는 화합물이다:
P-A (IA)
상기식에서,
P는 생체적합성 고분자이고;
A는 반응성 작용기이다.
화학식(IA)에서 P로 표기된 생체적합성 고분자는 여러 용매에 쉽게 용해될 수 있고 실질적으로 비항원성을 나타내는 고분자 쇄로서 이의 수 평균 분자량은 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 약 2,000 달톤 내지 약 20,000 달톤이다. 대표적인 생체적합성 고분자(P)로는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG), 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol, PPG), 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene, POE), 덱스트란(dextran), 폴리트리메틸렌 글리콜(polytrimethylene glycol), 폴리락트산(polylactic acid) 및 그 유도체, 폴리아크릴산 및 그 유도체, 폴리(아미노산), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리포스파진(polyphosphazenes), 폴리알킬렌 옥사이드(polyalkylene oxide, PAO), 폴리사카라이드(polysaccharide), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol, PVA), 폴리아크릴 아마이드 또는 기타 유사한 비면역성 고분자가 포함된다. 본 발명의 다 른 양태로서, 생체적합성 고분자(P)는 이차 및 삼차 분지화 하기 위해 가지달린 고분자일 수 있다. 또한, 이작용성 및 헤테로-이작용성 활성 고분자 에스테르가 사용될 수 있다.
화학식(IA)에서 반응성 작용기(A)는 하기 I 내지 Ⅳ로 이루어진 그룹중에서 선택될 수 있다:
I. (a) 카보네이트(예, p-니트로페닐 또는 석신이미딜), (b) 카르보닐 이미다졸, (c) 아즈락톤(azlactones), (d) 사이클릭 이미드 티온 또는 (e) 이소시아네이트 또는 이소티오시아네이트와 같이 아미노 기와 반응할 수 있는 작용기;
Ⅱ. (a) 일급 아민 또는 (b) 하이드라진 및 하이드라자이드 작용기(아실 하이드라자이드, 카르바제이트, 세미카르바제이트, 티오카르바제이트 등)와 같이 카르복실산 및 반응성 카르보닐 기와 반응할 수 있는 작용기;
Ⅲ. 페닐 글라이옥살과 같이 머캅토 또는 설프하이드릴 기와 반응할 수 있는 작용기(참조: 미국특허 제5,093,531호, 이의 내용은 본원에 참고로 원용된다); 및
Ⅳ. (카르복실) 산과 같이 하이드록실 기와 반응할 수 있는 작용기.
상기 예시된 작용기는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이드록실, 아미노, 카르복실, 티올 기, 활성 메틸렌 등을 포함한다.
바람직한 반응성 작용기(A)의 예로는 N-하이드록시석신이미드 에스테르(이하, NHS로 표기할 수 있다), 하이드라진 하이드레이트(이하, NH2NH2로 표기할 수 있다), 카르보닐 이미다졸, 니트로페닐, 이소시아네이트, 설포닐 클로라이드, 알데하 이드, 글라이옥살, 에폭사이드, 카르보네이트, 시아누르산 할라이드, 디티오카르보네이트, 토실레이트 및 말레이미드를 포함한다.
활성화된 고분자의 예로는 아마이드 결합(amide bond)을 가진 PEG-N-하이드록시석신이미드-활성화된 에스테르(PEG-NHS), 알킬 결합을 가진 PEG-에폭사이드(PEG-epoxide)와 PEG-트레실레이트(PEG-tresylate), 우레탄 결합(urethane bond)을 가진 PEG-카보닐 이미다졸(PEG-carbonyl imidazole)과 PEG-니트로페닐 카보네이트(PEG-nitrophenyl carbonates), N-말단에 쉬프 베이스(Schiff's base)를 가진 PEG-알데하이드(PEG-aldehyde) 등이 있다.
생체적합성 고분자를 활성화하는 한 가지 방법은 p-니트로페닐 클로로포르메이트와 같은 고분자의 말단기인 하이드록실 기를 활성화할 수 있는 화합물로 관능화하여 반응성 p-니트로페닐 카르보네이트를 형성하는 것이다. 생성된 p-니트로페닐 카르보네이트 고분자는 생물학적 활성 물질과 직접 반응시킬 수 있다. 또한, p-니트로페닐 카르보네이트 고분자는 중간체로서 작용할 수 있다. p-니트로페닐 카르보네이트 고분자를 과량의 N-하이드록시석신이미드와 반응시켜 석신이미딜 카르보네이트-활성화된 고분자를 생성할 수 있다. 또 다르게는, p-니트로페닐 카르보네이트 고분자 중간체를 무수 하이드라진과 반응시켜 카르바제이트 고분자를 형성할 수 있다.
상기 화학식(IA)의 활성화된 생체적합성 고분자로부터 제조된 본 발명에 따른 생물학적 활성 고분자 결합체는 하기 화학식(I)로 표시된다:
X-P-A1-D (I)
상기식에서,
X는 간세포를 표적으로 할 수 있는 표적화 잔기를 나타내고;
P는 생체적합성 고분자를 나타내며;
D는 간세포의 표적화가 요구되는 약물을 나타내고;
A1은 생체적합성 고분자와 약물사이의 연결을 나타낸다.
화학식(I)의 생물학적 활성 고분자 결합체는 화학식(IA)의 활성화된 생체적합성 고분자를 간세포를 표적으로 할 수 있는 표적화 잔기 및 간세포의 표적화가 요구되는 약물과 차례로 반응시켜 제조할 수 있다. 예를 들면, Schwartz 등(1977, Arch. Biochem. Biophys, 181, 542-549)과 Han(International Journal of Pharmaceutics 188, 39-47, 1999)의 방법으로 당인 락토즈를 나트륨 시아노보로하이드라이드로 환원성 아민화하여 0.2 M 인산염 완충액, pH 8.0, 37℃에서 배양하여 BSA(소 혈청 알부민)의 라이신 기와 결합하여 갈락토실화된 BSA를 합성한 것과 같은 방법으로 화학식(IA)의 고분자를 당화시키고, 당화된 고분자를 pH 6인 인산염 완충액에서 EDC{1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드}를 가한 후 약물과 반응시켜 화학식(I)의 결합체를 수득할 수 있다.
B. 활성화된 생체적합성 고분자로서의 두 번째 그룹
본 발명에서 사용되는 활성화된 생체적합성 고분자의 다른 그룹으로는 소수성을 증가시키기 위해 펩타이드 스페이서를 갖는 하기 화학식(ⅡA)의 화합물이다:
[Y-P-Y']m-(L)s-A (ⅡA)
상기식에서,
P는 생체적합성 고분자이며;
Y 및 Y'는 동일하거나 상이할 수 있고, 아미노산중 2개 내지 18개의 임의 조합으로 이루어진 펩타이드이며;
L은 지방족 연결 잔기 또는 디아미노카르복실산이고;
s는 0 또는 1이고;
A는 반응성 작용기이며;
m은 1 또는 2이다.
화학식(ⅡA)에서 P로 표기된 생체적합성 고분자 및 A로 표기된 반응성 작용기는 상기 화학식(IA)에서 정의한 바와 같다. 본 발명의 다른 양태로서, 생체적합성 고분자(P) 및 (Q)는 이차 및 삼차 분지화하기 위해 가지달린 고분자일 수 있다. 또한, 이작용성 및 헤테로-이작용성 활성 고분자 에스테르가 사용될 수 있다.
화학식(ⅡA)에서 Y 및 Y'로 표기된 펩타이드를 구성하는 아미노산으로는 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토 판, 세린, 트레오닌, 글루타민, 티로신, 시스테인, 라이신, 아르기닌, 아스파라긴, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파트산이 포함된다. 이외에, β-알라닌, 옥시프롤린, 아미노부티르산, 오르니틴, 시트룰린, 호모세린, 디요오드티로신, 트리요오드티로신, 티록신, 디옥시페닐알라닌이 포함될 수 있다. 이들은 글리신을 제외하고 광학이성질체를 가지므로 L-이성체 및 D-이성체 모두 본 발명에 따른 펩타이드에 사용될 수 있다.
화학식(ⅡA)에서 L로 표기된 연결 잔기는 지방족 연결 잔기이거나 디아미노카르복실산 잔기이다. 지방족 연결 잔기는 복수(최대 4개)의 생체적합성 고분자 쇄를 화학식(ⅡA)에서 A로 표기되고 생물학적 활성 물질과 친핵성 치환반응이 일어나는 반응성 작용기에 연결시키기 위한 수단이다. 적합한 지방족 연결 잔기(L)로는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 치환된 알킬 디아민 및 트리아민, 라이신 에스테르 및 말론 산 에스테르 유도체가 포함된다. 연결 잔기(L)는 고분자 쇄가 경직되지 않도록 비평면적인 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 양태로서, 연결 잔기(L)는 복수의 작용기를 갖는 탄소원자 18개의 알킬이다. 더욱 바람직하게는, 알킬의 탄소원자 수는 1 내지 10이다. 또한, 알킬 쇄는 질소, 산소 또는 황과 같은 헤테로원자를 함유할 수 있다. 또한, 알킬 쇄는 탄소 또는 질소 원자에서 분지될 수 있다. 화학식(ⅡA)에서 L로 표기된 디아미노카르복실산 잔기는 생체적합성 고분자 쇄를 화학식(ⅡA)에서 A로 표기되고 생물학적 활성 물질과 친핵성 치환반응이 일어나는 반응성 작용기에 연결시키기 위한 수단이다. 디아미노카르복실산 잔기의 화학식은 다음과 같이 표시될 수 있다:
Figure 112003017001815-pat00002
상기식에서, x는 0 내지 5의 정수이다. 알킬 쇄는 질소, 산소 또는 황과 같은 헤테로원자를 함유할 수 있다. 또한, 알킬 쇄는 탄소 또는 질소 원자에서 분지될 수 있다.
한 가지 바람직한 양태로서, 본 발명의 활성화된 생체적합성 고분자는 하기 화학식(ⅡAa)로 표시되는 선형의 활성화된 고분자를 포함한다:
Y-P-Y'-A (ⅡAa)
상기식에서, P, Y, Y' 및 A는 상기 정의된 바와 같다.
대표적인 화학식(ⅡAa)의 고분자는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하기 화학식으로 표시되는 고분자를 포함한다:
Y-P-Y'-NHS;
Y-P-Y'-NH2NH2; 또는
Y-P-Y'-CHO
상기식에서, P, Y 및 Y'는 상기 정의된 바와 같다.
본 발명의 다른 바람직한 양태는 에스테르-계 프로드러그의 형성에 유용한 말단 카르복실산을 함유하는 가지달린 고분자를 제공한다. 이 가지달린 고분자는 하기 화학식(ⅡAb)로 표시된다:
[Y-P-Y']m-L-COOH (ⅡAb)
상기식에서, P, Y, Y', m 및 L은 상기 정의된 바와 같다.
화학식(ⅡA) [Y-P-Y']m-(L)s-A의 활성화된 생체적합성 고분자는 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, PEG-COOH를 아세토니트릴에 녹인 후 NHS로 활성화하고 D 또는 L-노르루이신을 반응시켜 아미노산이 결합된 PEG를 합성한다(Yamasaki, Agric. Biol. Chem. 52, 2125-2127, 1988). 또 다른 예로서, t-부틸 에스테르 형의 디펩타이드를 NHS와 DCC(N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드)를 사용하여 모노-벤질 에스테르형의 PEG-이산과 축합반응시킨 후 t-부틸 보호기를 제거하여 디펩타이드가 결합된 PEG를 제조한다(Suzawa, J. Controlled Release, 69, 27-41, 2000).
본 발명의 한 가지 양태로서, [Y-P-Y']m-(L)s-A의 활성화된 생체적합성 고분 자를 하기 4단계로 제조한다 (각 단계에서, n은 2 내지 80이다).
1단계. t-Boc-NH-GlyGly-CONH-PEG-COOH 제조
Figure 112003017001815-pat00003
출발물질(t-BocNH-GlyGly-COOH, Sigma, USA)을 MC(메틸렌 클로라이드)에 녹인 후 DCC(N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드)를 적가하고, 상온에서 교반한다. 이 반응용기에 NH2-PEG-COOH (Fw 3,400)를 적가하고 24시간 동안 반응시킨 후 혼합물을 Celite 545(J.T. Baker, USA)로 여과한다. 여액을 감압증류하고 디에틸 에테르로 재결정한다.
2단계. t-BocNH-GlyGly-CONH-PEG-CO-NHS 제조
Figure 112003017001815-pat00004
t-BocNH-GlyGly-CONH-PEG-COOH (Fw 3,614)을 MC 10 ㎖에 녹인 후 DCC 와 N- 하이드록시석신아미드(NHS)을 적가하고, 48시간 동안 상온에서 교반하였다. 이 혼합물을 Celite 545로 여과한 후 여액을 감압증류하고 이소프로필 알코올과 디에틸 에테르로 재결정하여 흰색 고체의 생성물을 수득한다.
3단계. t-BocNH-GlyGly-CONH-PEG-CONH-Gly-Gly-COOH 제조
Figure 112003017001815-pat00005
t-BocNH-GlyGly-CONH-PEG-COO-NHS (Fw 3,700)를 50M 붕산염 완충액에 녹인 후, 이 반응물에 NH2-GlyGly-COOH를 첨가한다. 1시간 동안 교반시킨 후, 1N NaOH 용액을 적가한다. 이 혼합물을 24시간 동안 반응시키고 1N HCl로 산성화하고 MC와 물로 유기층을 추출한다. 이 유기층을 건조시킨 후 감압증류하여 생성된 조(crude) 화합물을 디에틸 에테르로 재결정하여 흰색 고체를 수득한다.
4단계. NH2-GlyGly-CONH-PEG-CONH-Gly-Gly-COOH
Figure 112003017001815-pat00006
t-BocNH-GlyGly-CONH-PEG-CONH-GlyGly-COOH) (Fw 3,700)을 MC 용액 (20% 트리플루오로아세트산)에 첨가하고, 상온에서 6시간 동안 교반한다. 이 혼합물을 물과 MC로 유기층을 추출한 후, 건조시키고 감압증류하여 목적 생성물을 정제없이 순수하게 수득한다.
헤테로이작용성 (heterobifuntional) PEG는 다음과 같은 세 가지 방법으로 합성할 수 있다. 첫 번째 방법으로서, 문헌[Makromol Chem. 184, 1849-1859, 1983]에 공지된 방법으로 제조할 수 있으며 간단히 설명하면 다음과 같다. 3-아미노메틸-3,5,5-트리메틸사이클로헥사놀의 아미노기를 석신산 무수물 (succinic anhydride)로 보호한 후, THF(테트라하이드로퓨란) 용액에 같은 당량의 칼륨 디하이드로나프틸리드 (potassium dihydronaphthylide)를 적가하여 칼륨 알코올레이트를 만든다. 이에 옥시란(oxirane)을 50℃, 진공하에 벤젠/THF중에서 옥시란 중합시킨다. 이미도 말단 PO(폴리옥시란)는 25℃에서 KOH 용액을 가하여 아미노 유도체로 가수분해한 후, 클로로포름에서 추출하고 헥산에서 최종물을 얻는다. 두 번째 방법은 미국특허 제5,679,765에 기술된 바와 같이 에폭시 화합물을 중합 개시제(polymerization initiator)인 칼륨 비스(트리메틸실릴)아미드 또는 프탈아미드를 사용하여 이작용성 폴리에테르 NH2-(CH2CH2O)n-CH2CH 2R2가 만들어진다. 이 때 R2는 머캅토 기, 카르복실 기, 하이드록실 기 등이 되며 n은 5 내지 10,000이다. 세 번째 방법은 문헌[Journal of organic chemistry, 1997, 62, 3013- 3014]에 공 지된 하기 반응식 1에 따라 합성할 수 있다 (여기서, n은 4 내지 82이다).
반응식 1
Figure 112003017001815-pat00007
a) KMnO4, H2O, 환류; b) H2SO4, EtOH, 환류; c) 하이드라진 수화물, EtOH, 톨루엔, 환류; d) NaNO2, HCl; e) EtOH, 크실렌, 환류; f) EtOH, 2.5N NaOH, 환류.
상기 화학식(ⅡA)의 활성화된 생체적합성 고분자로부터 제조된 본 발명에 따른 생물학적 활성 고분자 결합체는 하기 화학식(Ⅱ)로 표시된다:
[X-Y-P-Y'-]m-(L)s-A1-D (Ⅱ)
상기식에서,
X는 간세포를 표적으로 할 수 있는 표적화 잔기를 나타내고;
P 는 생체적합성 고분자이며;
Y 및 Y'는 동일하거나 상이할 수 있고, 각각 독립적으로 아미노산중 2개 내지 18개의 임의 조합으로 이루어진 펩타이드이며;
L은 지방족 연결 잔기 또는 디아미노카르복실산이고;
s는 0 또는 1이고;
m은 1 또는 2이며;
D는 간세포의 표적화가 요구되는 약물을 나타내고;
A1은 생체적합성 고분자와 약물사이의 연결을 나타낸다.
화학식(Ⅱ)의 생물학적 활성 고분자 결합체는 화학식(ⅡA)의 활성화된 생체적합성 고분자를 간세포를 표적으로 할 수 있는 표적화 잔기 및 간세포의 표적화가 요구되는 약물과 차례로 반응시켜 제조할 수 있다. 구체적으로는, 화학식(ⅡA)의 고분자를 당화시키고, 당화된 고분자를 약물과 반응시켜 화학식(Ⅱ)의 결합체를 수득할 수 있다. 예를 들면, (I)의 방법과 같은 방법으로 제조할 수 있다. 즉, 당인 락토즈를 나트륨 시아노보로하이드라이드로 환원성 아민화하여 0.2 M 인산염 완충액, pH 8.0, 37℃에서 배양하여 BSA(소혈청 알부민)의 라이신 기와 결합하여 갈 락토실화된 BSA를 합성한 것과 같은 방법으로 화학식(IA)의 고분자를 당화시키고, 당화된 고분자를 pH 6인 인산염 완충액에서 EDC {1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드}를 가한 후 약물과 반응시켜 화학식(I)의 결합체를 수득할 수 있다.
C. 활성화된 생체적합성 고분자로서의 세 번째 그룹
본 발명에서 사용되는 생체적합성 고분자의 또 다른 그룹으로는 하기 화학식(ⅢA)으로 표시되는 화합물이다:
Figure 112003017001815-pat00008
(ⅢA)
상기식에서,
PEI는 폴리에틸렌이민을 가리키고,
n은 2 내지 80이고 (따라서, PEI의 이의 수 평균 분자량은 500 내지 20,000이다);
P는 생체적합성 고분자이고;
A는 반응성 작용기이다.
폴리에틸렌이민(PEI)은 높은 양전하 밀도를 갖는 가지달린(branched) 합성 고분자이다. 매 세번째 분자는 양전하 아민기로 이루어져 있고 약물, 단백질 또는 효소와 같은 생물학적 활성 물질이 공유 결합한다. 일차, 이차 및 삼차 아민기가 존재하여 넓은 범위의 pKa를 가지고 있어 상당히 효율적인 완충 시스템을 갖는 고분자이다.
PEG와 PEI를 결합하는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 고비 등은 문헌[W.T. Godby, K.K. Wu, and G. Mikos. J. Contr. Rel. 60: 149-160, 1999]에서 고 분자량의 PEI(25-800 kDa)가 시험관내 또는 생체내에서 DNA 또는 RNA의 비-바이러스 전달에 상당히 유용한 시약으로 사용할 수 있는 것으로 기술하고 있다. 구체적으로는, PEI는 비특이성 흡착 메카니즘에 의한 플라스미드의 세포 흡수를 높여 줄뿐만 아니라 엔도좀 구획에서 완충작용을 함으로써 플라스미드의 세포 트래피킹을 높여 플라스미드의 분해를 막고 리소좀 삼투 팽윤과 분열에 의한 플라스미드의 엔도좀 방출을 가능하게 하는 것으로 나타나 있다.
카바노프 등은 문헌[Bioconjugate Chem, 9, 805-812, 1998]에서 4,4'-디메톡시트리틸(이하, 'DMT'이라 한다)로 활성화된 PEG와 PEI를 반응시켜 PEG-다수양이온 블록 공중합체(PEG-polycation block copolymer)를 합성하였음을 밝히고 있다. 문헌에 따르면 상기 활성화된 PEG 공중합체를 결합에 이용하기 위해 모노-DMT-치환된 PEG를 이치환된(bi-substituted) 부산물과 미반응된 초기 화합물로부터 프렙용 컬럼 크로마토그래피하여 정제하였다. 그러나, PEG가 거대한 고분자이므로 결합된 PEG 수를 조절한다는 것은 어려움이 있다.
화학식(ⅢA)에서 P로 표기된 생체적합성 고분자 및 A로 표기된 반응성 작용기는 상기 화학식(IA)에서 정의된 바와 같다. 또한, 생체적합성 고분자는 상기 고 분자중 둘 이상의 공중합체를 포함한다. 화학식(ⅢA)에서 생체적합성 고분자중 폴리알킬렌 옥사이드는 바람직하게는 다음의 화학식으로 표시된다:
Figure 112003017001815-pat00009
상기식에서,
q는 10 내지 600의 지수이고;
R3은 수소 또는 탄소수 1 내지 5의 알킬이다.
한 가지 바람직한 양태로서, 활성화된 생체적합성 고분자는 하기 화학식(ⅢAa)로 표시되는 활성화된 고분자를 포함한다:
Figure 112003017001815-pat00010
(ⅢAa)
상기식에서,
PEG는 폴리에틸렌글리콜이고;
A 및 n은 상기 정의한 바와 같다.
바람직한 화학식(ⅢAa)의 고분자는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하기 화학식으로 표시되는 고분자를 포함한다:
Figure 112003017001815-pat00011
상기식에서, n은 상기 정의한 바와 같다.
다른 바람직한 양태는 에스테르-계 프로드러그의 형성에 유용한 말단 카르복실산을 함유하는 생체적합성 고분자를 제공한다. 이 생체적합성 고분자는 하기 화학식(ⅢAb)로 표시된다:
Figure 112003017001815-pat00012
(ⅢAb)
상기식에서, n은 상기 정의한 바와 같다.
화학식(ⅢA)의 활성화된 고분자의 제조 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 생체적합성 고분자(P)를 활성화시키고 활성화된 고분자를 PEI와 반응시켜 화학식 PEI-P로 표시되는 고분자(공중합체)를 생성하고;
(b) 생성된 고분자를 활성화시켜 화학식(ⅢA)으로 표시되는 고분자를 수득한다.
활성화 방법은 상기된 바와 같이 수행하여 달성한다.
상기 화학식(ⅢA)의 활성화된 생체적합성 고분자로부터 제조된 본 발명에 따른 생물학적 활성 고분자 결합체는 하기 화학식(Ⅲ)으로 표시된다:
Figure 112003017001815-pat00013
(Ⅲ)
상기식에서,
X는 간세포를 표적으로 할 수 있는 표적화 잔기를 나타내고;
P는 생체적합성 고분자를 나타내며;
PEI는 폴리에틸렌이민을 가리키고;
n은 2 내지 80이고 (따라서, PEI의 이의 수 평균 분자량은 500 내지 20,000이다);
D는 간세포의 표적화가 요구되는 약물을 나타낸다.
화학식(Ⅲ)의 생물학적 활성 고분자 결합체는 화학식(ⅢA)의 활성화된 생체적합성 고분자를 간세포를 표적으로 할 수 있는 표적화 잔기 및 간세포의 표적화가 요구되는 약물과 차례로 반응시켜 제조할 수 있다. 예를 들면, PEG-PEI 공중합체를 완충액에 녹인 후, 당인 락토즈를 나트륨 시아노보로하이드라이드로 환원성 아민화하여 0.2M 인산염 완충액, pH 8.0, 37℃에서 배양하여 갈락토실화된 PEG-PEI를 합성한다. 당화된 고분자를 pH 6인 인산염 완충액에서 약물이 수용액인 경우, EDC {1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드}를 가한 후 약물과 반응시켜 화학식(Ⅲ)의 결합체를 수득한다(Yamada, Biochemistry, 20, 4836-4842, 1981). 또한, 난용성인 약물과의 결합체를 만들 경우 약물을 아세토니트릴이나 MC에 녹인 후 DCC를 첨가하여 아미드 결합을 생성한 후 gal-PEG-PEI의 아민기와 반응시켜 gal-PEG-PEI-약물을 합성한다.
본 발명의 구체적인 예는 활성화된 헤테로작용성 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 고분자 유도체와 간세포 표적화를 위한 당과 공유결합시켜 당화 PEG를 형성하고, 형성된 당화 PEG를 약물과 공유결합시켜 하기 화학식으로 표시되는 생물학적 활성 고 분자 결합체를 형성한다:
Figure 112003017001815-pat00014
상기식에서,
X는 갈락토즈, 퓨코즈, 글루코즈, 만노즈, 락토즈 또는 말토즈이며;
D는 간세포 표적화가 요구되는 약물이고;
PEG의 수 평균 분자량은 500 내지 40,000이 바람직하다.
본 발명의 다른 구체적인 예는 헤테로작용성 말단 기를 갖는 활성화된 PEG인 NH2-PEG-COOH로부터 제조되는 갈락토실화된 PEG에 관한 것으로 다음의 화학식을 가진다:
Figure 112003017001815-pat00015
상기식에서, PEG의 수 평균 분자량은 500 내지 40,000이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 구체적인 예는 비스-아민(bis-amine) 말단 기를 갖는 활성화된 PEG인 NH2-PEG-NH2로부터 제조되는 갈락토실화된 PEG에 관한 것으로 다음의 화학식을 가진다:
Figure 112003017001815-pat00016
상기식에서, PEG의 수 평균 분자량은 500 내지 40,000이 바람직하다.
발명의 또 다른 구체적인 예는 활성화된 갈락토실화 PEG로부터 제조된 하기의 화학식을 갖는 갈락토실화된 PEG-약물에 관한 것이다:
Figure 112003017001815-pat00017
상기식에서, PEG의 수 평균 분자량은 500 내지 40,000이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 좀더 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1
NH2-Gly-Gly-CONH-PEG-CONH-Gly-Gly-COOH 제조
1단계. t-Boc-NH-GlyGly-CONH-PEG-COOH 제조
출발물질 (t-BocNH-GlyGly-COOH) (50 ㎎, 0.215 m㏖)을 MC 5 ㎖에 녹인 후 DCC (66.63 ㎎, 0.323 m㏖)를 적가하고, 16시간 동안 상온에서 교반하였다. 이 반응용기에 NH2-PEG-COOH (Fw 3,400) (877.2 ㎎, 0.258 m㏖)을 적가하고 24시간 동안 반응시킨 후 혼합물을 Celite 545로 여과하였다. 여액을 감압증류하고 디에틸 에테르로 재결정하여 고체상의 백색 화합물(660.46 ㎎, 85%)을 얻었다.
2단계. t-BocNH-GlyGly-CONH-PEG-CO-NHS 제조
출발물질 (t-BocNH-GlyGly-CONH-PEG-COOH, Fw 3,614) (500 ㎎, 0.138 m㏖)을 MC 10 ㎖에 녹인 후 DCC (71.18 ㎎, 0.345 m㏖)와 N-하이드록시석신아미드 (39.70 ㎎, 0.345m㏖)을 적가하고, 48시간 동안 상온에서 교반하였. 이 혼합물을 Celite 545로 여과한 후 여액을 감압증류하고 이소프로필 알코올과 디에틸 에테르로 재결정하여 흰색 고체의 생성물 (452 ㎎, 88.5 %)을 얻었다.
3단계. t-BocNH-GlyGly-CONH-PEG-CONH-Gly-Gly-COOH 제조
출발물질 (t-BocNH-GlyGly-CONH-PEG-COO-NHS, Fw 3,700) (300 ㎎, 0.081 m㏖)를 50M 붕산염 완충액 5 ㎖에 녹인 후, 이 반응물에 NH2-GlyGly-COOH (12.94 ㎎, 0.098 m㏖)를 첨가하였다. 1시간 동안 교반시킨 후, 1N NaOH 용액 (0.05 ㎖) 를 적가하였다. 이 혼합물을 24시간 동안 반응시키고 1N HCl로 산성화하고 MC와 물로 유기층을 추출하였다. 이 유기층을 건조시킨후 감압증류하여 생성된 조(crude) 화합물을 디에틸 에테르로 재결정하여 흰색 고체(약 Fw 3,730, 270 ㎎, 90.5% 수율)를 수득하였다.
4단계. NH2-GlyGly-CONH-PEG-CONH-Gly-Gly-COOH
출발물질 (t-BocNH-GlyGly-CONH-PEG-CONH-GlyGly-COOH) (Fw 3,700, 200 ㎎, 54.05 m㏖)을 MC 용액 (20% 트리플루오로아세트산)에 첨가하고, 상온에서 6시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 물과 MC로 유기층을 추출 후, 건조시키고 감압증류하여 목적 생성물인 NH2-GlyGly-CONH-PEG-CONH-GlyGly-COOH (182 ㎎, 약 Fw 3,620, 93.01%)를 정제없이 순수하게 얻었다.
실시예 2
헤테로작용성 말단 기를 갖는 PEG(MW3400)와 갈락토즈의 결합체(갈락토즈-PEG(MW3400)-COOH)의 제조
Figure 112003017001815-pat00018
50 ㎎의 NH2-PEG(MW3400)-OCH2CH2COOH(1.4 x 10-5 moles)를 10 ㎖의 0.1 M 인산 완충액에 녹인 후 20 ㎎의 갈락토즈(1.1 x 10-4 moles)와 100 ㎎의 나트륨 시아노보로하이드라이드(1.6 x 10-3 moles)를 가한 후 실온에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 반응하지 않은 과량의 시약들은 탈염 컬럼(desalting column)으로 제거하였다. 생성물을 동결건조(lyophilization)시켜 45 ㎎(수율: 86%)의 흰색 고형물을 수득하였다.
실시예 3
NH2-Gly-Gly-CONH-PEG-CONH-Gly-Gly-COOH와 갈락토즈와의 결합체 제조
실시예 1에서 제조된 NH2-Gly-Gly-CONH-PEG(3400)-CONH-Gly-Gly-COOH (2.5 x 10-5 moles) 100 ㎎을 10 ㎖의 0.1 M 인산 완충액에 녹인 후 45 ㎎의 갈락토즈(2.4 x 10-4 moles)와 100 ㎎의 나트륨 시아노보로하이드라이드(1.6 x 10-3 moles)를 가한 후 실온에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 반응하지 않은 과량의 시약들은 탈염 컬럼(desalting column)으로 제거하였다. 생성물을 동결건조(lyophilization)시켜 70 ㎎(수율: 70%)의 흰색 고형물을 수득하였다.
실시예 4
갈락토실화된 PEG(MW3400)-COOH와 인슐린의 생물학적 활성 결합체(갈락토즈-PEG(3400)-인슐린)의 제조
Figure 112003017001815-pat00019
실시예 2에서 제조된 갈락토즈-PEG(MW3400)-COOH(10 ㎎, 2.4 x 10-6 moles)을 3 ㎖의 아세토니트릴에 녹인 후 1.5 ㎎의 N,N'-카르보닐 디이미다졸(CDI)(3.6 x 10-7 moles)을 첨가하였다. 실온에서 한 시간 동안 반응시킨 후 7.5 ㎎의 인슐린(1.3 x 10-6 moles)을 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응이 완료된 후 생성물인 갈락토즈-PEG(MW3400)-인슐린을 동결건조시켰다. 이 생성물을 증류수에 다시 용해시킨 후 Centricon-10(Waters, USA)을 사용하여 한외여과(ultrafiltration)하여 정제하였다.
실시예 5.
갈락토실화된 PEG(MW3400)-OCH2CH2CONHS와 알파 인터페론(αIFN)의 생물학적 활성 결합체(갈락토즈-PEG(MW3400)-αIFN)의 제조
1단계. 헤테로작용성 말단 기를 갖는 PEG(MW3400)와 갈락토즈의 결합체(갈락토즈-PEG(MW3400)-OCH2CH2CONHS)의 합성
실시예 2에서 제조된 갈락토즈-PEG(MW3400)-COOH(20 ㎎, 4.8 x 10-6 moles)을 MC에 녹인 후 20 ㎎의 NHS(1.8 x 10-4 moles)와 30 ㎎의 N,N'-디사이클로헥실 카르보디이미드(DCC)(1.8 x 10-4 moles)를 가하여 교반하였다. 반응은 30℃에서 24시간 실행하였고 반응이 완료된 후 실온으로 식히고 셀라이트 여과한 후 석탄으로 여과하고 증발시켰다. 이소프로필 알코올을 넣고 녹인 후 냉각조 하에서 결정화시키고 얻어진 백색 고형분을 여과하고 에테르로 세척 및 진공 건조시켰다. 그 결과 17.5 ㎎(87% 수율)의 갈락토즈-PEG(MW3400)-OCH2CH2CONHS를 포함하는 백색 고형분을 수득하였다.
2단계. 알파 인터페론(αIFN)과의 결합체(갈락토즈-PEG(MW3400)-αIFN)의 제조
3 ㎎의 알파 인터페론을 pH 7.0의 0.1 M 인산 완충액으로 투석한 후, 실시예 5의 1 단계에서 제조된 석시닐-N-하이드록시석신이미드 에스테르형으로 활성화된 3 ㎎의 갈락토즈-PEG(MW3400)을 넣어 실온에서 30분 동안 교반하였다. 0.1 M의 글리 신을 첨가하여 반응을 중단시키고, 반응하지 않은 과량의 PEG과 인터페론을 Centricon-30(Waters, USA)을 사용하여 제거하고 갈락토즈-PEG(MW3400)-INF를 제조하였다.
실시예 6
갈락토실화된 PEG(MW3400)-COOH와 메토트렉세이트(MTX)의 생물학적 활성 결합체(갈락토즈-PEG(MW3400)-MTX)의 제조
Figure 112003017001815-pat00020
실시예 2에서 제조된 갈락토즈-PEG(MW3400)-COOH(10 ㎎, 2.4 x 10-6 moles)을 3 ㎖의 아세토니트릴에 녹인 후 1.5 ㎎의 N,N'-카르보닐 디이미다졸(3.6 x 10-7 moles)을 넣어 주었다. 실온에서 한 시간 반응 후, 2.5 ㎎의 MTX(4.8 x 10-6 moles)을 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응이 완료된 후 생성물인 갈락토즈-PEG(MW3400)-MTX를 동결건조시켰다. 이 생성물을 증류수에 다시 용해시킨 후 탈염 컬럼으로 반응하지 않은 과량의 MTX를 제거하여 갈락토즈-PEG(MW3400)-MTX를 정제하였다.
실시예 7
간세포 흡수실험 (FACS)
갈락토즈-PEG(MW3400)-αIFN 및 천연αIFN을 이용하여 갈락토즈-PEG(MW3400)-αIFN-FITC 및 αIFN-FITC를 제조하였다. 사람 간암세포 HepG2를 각 E-튜브에 약 2x105개 세포가 되도록 넣은 후 갈락토즈-PEG(MW3400)-αIFN-FITC 또는 αIFN-FITC의 농도를 각각 변화시켜 가면서 37℃에서 1시간 반응시킨 후에 12000g에서 30초간 원심분리하여 과량의 FITC 샘플을 제거하였다. FITC 샘플이 결합된 세포들은 200 ㎕의 1% 포름알데하이드로 4℃에서 15분간 고정시킨 후 유세포분석기를 이용하여 세포에서의 FITC 샘플의 흡수를 측정하였다. FACS 결과 갈락토즈-PEG(MW3400)-αIFN-FITC가 갈락토즈-PEG(MW3400)가 결합되지 않은 αIFN에 비하여 약 5 내지 10배 정도 더 간세포에 흡수됨을 알 수 있었다. 또한, 쥐(rat)에서의 반감기 실험 (half life study)에서도 갈락토즈-PEG(MW3400)가 결합된 αIFN이 αIFN 단독이 투여된 경우보다 5배 이상 더 오랫동안 체내에 존재하는 것으로 나타났다.
본 발명의 생물학적 활성 고분자 결합체는 간세포 또는 간종양의 표적화가 요구되는 약물의 생체 흡수 및 생체이용률을 높이고, 상기 약물의 수용성 및 효능을 증대시키며, 유해한 부작용은 감소시키는 효과가 있다.

Claims (7)

  1. 하기 화학식(I)로 표시되는 생물학적 활성 고분자 결합체:
    X-P-A1-D (I)
    상기식에서,
    X는 간세포를 표적으로 할 수 있는 갈락토즈, 퓨코즈, 글루코즈, 만노즈, 갈락토즈를 포함한 이당류, 락토즈 및 말토즈로 구성되는 군으로부터 선택되는 표적화 잔기를 나타내고;
    P는 폴리에틸렌 글리콜이고;
    D는 간세포의 표적화가 요구되는 팍클리탁셀, 다우노루비신, 독소루비신, 카미노마이신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 미토마이신 C, N-메틸 미토마이신 C, 블레오마이신 A.sub.2, 디데아자테트라하이드로폴산, 아미노프테린, 메토트렉세이트, 콜치신, 시스플라틴, 젠타마이신, 리팜피신, 3'-아지도-3'-데옥시티미딘(AZT), 아실로비르, 플루코나졸, 암포테리신 B, 캔디시딘, 안티모니알, 항체, 독소, 콜로니 자극 인자, 종양 괴사 인자, 신경계펩타이드, 인슐린, 성장호르몬, 에리쓰로포이에틴, 갑상선 호르몬, 아세틸콜린, 알파-지단백질, 하이알루론산, 인터페론, 인터루킨, 인도메타신, 살리실산 아세테이트, 케토프로펜, 나프록센, 몰핀, 이부프로펜, 설린닥, 피록시캄 및 나프록센으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 약물을 나타내고;
    A1은 상기 폴리에틸렌 글리콜과 상기 약물 사이의 연결을 나타내는 것으로서, 폴리에틸렌 글리콜 말단을 N-하이드록시석신이미드 에스테르(NHS), 하이드라진 하이드레이트(NH2NH2), 카르보닐 이미다졸, 니트로페닐, 이소시아네이트, 설포닐 클로라이드, 알데하이드, 글라이옥살, 에폭사이드, 카르보네이트, 시아누르산 할라이드, 디티오카르보네이트, 토실레이트 및 말레이미드로 구성되는 군으로부터 선택되는 반응성 작용기로 치환하여 상기 약물과 결합시킨 연결기이다.
  2. 하기 화학식(Ⅱ)로 표시되는 생물학적 활성 고분자 결합체:
    [X-Y-P-Y'-]m-(L)s-A1-D (Ⅱ)
    상기식에서,
    X는 간세포를 표적으로 할 수 있는 갈락토즈, 퓨코즈, 글루코즈, 만노즈, 갈락토즈를 포함한 이당류, 락토즈 및 말토즈로 구성되는 군으로부터 선택되는 표적화 잔기를 나타내고;
    P는 폴리에틸렌 글리콜이고;
    Y 및 Y'는 동일하거나 상이할 수 있고, 각각 독립적으로 아미노산중 2개 내지 18개의 임의 조합으로 이루어진 펩타이드이며;
    L은 지방족 연결 잔기 또는 디아미노카르복실산이고;
    s는 0 또는 1이고;
    m은 1 또는 2이며;
    D는 간세포의 표적화가 요구되는 팍클리탁셀, 다우노루비신, 독소루비신, 카미노마이신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 미토마이신 C, N-메틸 미토마이신 C, 블레오마이신 A.sub.2, 디데아자테트라하이드로폴산, 아미노프테린, 메토트렉세이트, 콜치신, 시스플라틴, 젠타마이신, 리팜피신, 3'-아지도-3'-데옥시티미딘(AZT), 아실로비르, 플루코나졸, 암포테리신 B, 캔디시딘, 안티모니알, 항체, 독소, 콜로니 자극 인자, 종양 괴사 인자, 신경계펩타이드, 인슐린, 성장호르몬, 에리쓰로포이에틴, 갑상선 호르몬, 아세틸콜린, 알파-지단백질, 하이알루론산, 인터페론, 인터루킨, 인도메타신, 살리실산 아세테이트, 케토프로펜, 나프록센, 몰핀, 이부프로펜, 설린닥, 피록시캄 및 나프록센으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 약물을 나타내고;
    A1은 상기 폴리에틸렌 글리콜과 상기 약물 사이의 연결을 나타내는 것으로서, 폴리에틸렌 글리콜 말단을 N-하이드록시석신이미드 에스테르(NHS), 하이드라진 하이드레이트(NH2NH2), 카르보닐 이미다졸, 니트로페닐, 이소시아네이트, 설포닐 클로라이드, 알데하이드, 글라이옥살, 에폭사이드, 카르보네이트, 시아누르산 할라이드, 디티오카르보네이트, 토실레이트 및 말레이미드로 구성되는 군으로부터 선택되는 반응성 작용기로 치환하여 상기 약물과 결합시킨 연결기이다.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적화 잔기가 갈락토즈 또는 갈락토즈를 포함한 이당류인 생물학적 활성 고분자 결합체.
  7. 삭제
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