MXPA06014307A - Preparacion de conjugados macromoleculares por reaccion de condensacion de cuatro componentes. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a conjugados de polimero-biomolecula preparados, en general, en una manera selectiva o especifica del sitio, por una reaccion de condensacion de cuatro componentes. El metodo puede ser usado para preparar conjugados que tienen dos moleculas polimericas unidas a un sitio unico en una biomolecula. Los conjugados son tipicamente solubles en agua y tienen propiedades farmacologicas beneficas, tales como inmunogenicidad reducida y tiempo de circulacion incrementado.

Description

PREPARACIÓN DE CONJUGADOS MACROMOLECULARES POR REACCIÓN DE CONDENSACIÓN DE CUATRO COMPONENTES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención pertenece a la preparación de conjugados de biomoléculas con polímeros solubles en agua, y en particular, para la preparación de tales conjugados por una reacción de condensación de cuatro componentes .

REFERENCIAS De Nouy, A. E.J. et al., Biomacromolecules 1:259-267 (2000) Dixon, H.B., J. Protein Chem. 3:99-108 (1984) Domling, A. and Ugi, I., Angew. Chem. Int. Ed. 39:3168-3210 (2000) Gaertner, H.F. et al., Bioconjugate Chem. 3:262-6 (1992) Geoghegan, KF. et al., Bioconjugate Chem. 3:138-46 (1992) Goldstein, L. et al., Appl. Biochem. & Biotech. 42:19-35 (1993) King, T.P. et al., Biochemistry 25:511 A (1986). Marcaurelle, L.A. et al., Org. Lett. 3:3691-94 (2001) Morehead, H. W. and Talmadge, K. W., J. Chromat. 587:171-176 (1991) Monfardini, C. et al., Bioconjugate Chem. 6:62-9 (1995) O'Shannessy, D.J. and Quarles, R.H., J. Immunol.

Methods 99(2):153-61 (1987) Page, P., PCT Pubn. No. WO 01/37983 (2001) Park, W.K.C. et al., J. Am. Chem. Soc. 118: 10150-10155 (1996) Rodríguez, E.C. et al., J. Org. Chem. 63:9614 (1998) Ugi, I. et al., Angew. Chemie 71:386 (1959) Vretblad, P. et al., Acta Chemica Scandinavica 27:2769-2780 (1973) Wilchek, M. and Bayer, E.A., Methods of Enzymol 138:429-42 (1987) Wachter, E. and Werhahn, R. in SOLID PHASE METHODS IN PROTEIN SEQUENCE ANALYSIS, Previero, A. & Coletti-Previero, M. -A, eds., Elsevier (1977), pp. 185-192 Yarema, KJ. et al., J. Biol. Chem. 273:31168-79 (1998) Zalipsky, S., Adv. Drug Del. Rev. 16: 157-182 (1995a) Zalipsky, S., Bioconj . Chem. 6: 150-165 (1995b) Zalipsky, S. et al., Bioconjugate Chem. 6:705-8 (1995c) Zalipsky, S. and Harris, J.M., POLY(ETHYLENEGLYCOL) : CHEMISTRY AND BIOLOGICAL APPLICATIONS, ACS Symp. Ser. 680, Washington, D.C. (1997) Zalipsky, S. and Menon-Rudolph, S., in POLY(ETHYLENEGLYCOL) : CHEMISTRY AND BIOLOGICAL APPLICATIONS, Zalipsky, S. & Harris, J.M., eds., ACS Symp. Ser. 680, Washington, D.C. (1997), chapter 21, pp. 328-341 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los polímeros hidrofílicos, tales como polietilenglicol (PEG) , han sido usados para modificación de varios sustratos, tales como polipéptidos, fármacos y liposomas, para reducir la inmunogenicidad del sustrato y/o mejorar su tiempo de vida de circulación en la sangre (Zalipsky & Harris, 1997) . Por ejemplo, las proteínas parenteralmente administradas, puede ser inmunogénicas y pueden tener una vida media farmacológica corta. Algunas proteínas pueden también ser relativamente insolubles en agua. Consecuentemente, puede ser difícil lograr niveles de sangre terapéuticamente útiles de las proteínas en pacientes . La conjugación de polímeros hidrofílicos, particularmente PEG (Zalipsky & Harris, 1997), a proteínas, ha sido descrita como un procedimiento para superar estas dificultades. Por ejemplo, Davis et al . , en la Patente Estadounidense No. 4,179,337, describe la conjugación de PEG a proteínas, tales como enzimas e insulina para formar conjugados de proteína PEG que tienen menos inmunogenicidad aún reteniendo una proporción sustancial de actividad fisiológica. Veronese et al . , (Applied Biochem. and Biotech, 11:141-152 (1985)), describe activación de polietilenglicoles con cloroformiatos de fenilo para conjugación a ribonucleasa y una superóxido dismutasa, respectivamente. Katre et al . , en Patentes Estadounidenses Nos. 4,766,106 y 4,917,888, describe proteínas solubilizantes por conjugación de polímeros. La Patente Estadounidense No. 4,902,502 (Nitecki et al . ) , y Publicación de PCT No. WO 90/13540 (Enzon, Inc.), describe conjugación de PEG y otros polímeros a proteínas recombinantes para reducir la inmunogenicidad e incrementar la vida media. El PEG también ha sido descrito para uso en el mejoramiento del tiempo de vida de circulación en la sangre de liposomas (Patente Estadounidense No. 5,103,556). El polímero PEG está covalentemente unido al grupo principal polar de un lípido, para enmascarar o cubrir las liposomas de ser reconocidas y removidas por el sistema reticuloendotelial . Las varias químicas de conjugación para unión del PEG a moléculas biológicamente relevantes, han sido revisadas (Zalipsky, 1995a) .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un método versátil para preparar conjugados de polímeros solubles en agua, preferiblemente, polímeros PEG, con moléculas biológicamente activas o biológicamente relevantes, particularmente polipéptidos. La conjugación a la biomolécula puede a menudo, llevarse a cabo en una manera selectiva del sitio o específica del sitio. El método permite, por ejemplo, unión de una cadena PEG a un grupo funcional en un polipéptido seleccionado de una amina, un ácido carboxílico, o un aldehido o cetona sintéticamente introducidos. El método también proporciona la preparación de diversos conjugados en una forma combinatorial, si se desea. En un aspecto, la invención proporciona un método para preparar un conjugado de una proteína o polipéptido con un polímero soluble en agua, el método comprende: hacer reaccionar componentes (a)-(d) siguientes: (a) RA-C(0)R' (un componente carbonilo), en donde R' es H o alquilo inferior, preferiblemente H o metilo y más preferiblemente, H (es decir, un aldehido) , (b) RN-NH2 (un componente de amina) , (c) Rc-C(0)OH (un componente de ácido carboxílico) , y (d) Ri-NC (un componente de isonitrilo) , para formar un producto conjugado que incorpora al menos, una de cada porción representada por RA, RN, Rc y Ri . Al menos uno de (a)-(c) es dicha proteína o polipéptido; esto es, la reacción incluye una proteína o polipéptido que porta un carbonilo reactivo (RA-C(0)R'), una proteína o polipéptido que porta una amina reactiva (RN-NH2) , y/o una proteína o polipéptido que porta un ácido carboxílico reactivo (Rc-C(0)OH). Al menos uno de (a)-(d) es un polímero soluble en agua, esto es, la reacción incluye un polímero soluble en agua que porta un carbonilo reactivo (RA-C(0)R'), polímero soluble en agua que porta una amina reactiva (RN-NH2) , polímero soluble en agua que porta un ácido carboxílico reactivo (Rc-C(0)OH), y/o polímero soluble en agua que porta un isonitrilo reactivo (Ri-NC) . En una modalidad, el producto conjugado es de la forma RiNH-C (O) -CR' RA-NRN-C (0) Rc, que incorpora exactamente un residuo de cada uno de los componentes (a)-(d). En otras modalidades, por ejemplo, en las cuales uno de los componentes (a)-(d) porta más de una de las funcionalidades indicadas (tales como un componente RN-NH2 que porta múltiples grupos amino, o un componente Rc-C(0)OH que porta grupos de ácido carboxílico múltiples) , el producto conjugado puede incluir dicho componente conjugado a residuos adicionales de los otros componentes. El polímero y el conjugado formado a partir de este, son preferiblemente solubles en agua a temperatura ambiente a pH fisiológico. La proteína o polipéptido es representado por al menos, un componente seleccionado de (a)-(c) anteriores, el polímero soluble en agua es representado por al menos un diferente componente seleccionado de (a)-(d) anterior, y cualquiera de los componentes restantes de (a)-(d) son compuestos no interferentes, estables, como se define en este documento. En una modalidad preferida, la proteína o polipéptido es un componente único seleccionado de (a)-(c), el polímero es un componente diferente seleccionado de (a)- (d) , y los componentes restantes de (a)-(d) son compuestos no interferentes, estables. Los componentes restantes pueden ser seleccionados de por ejemplo, porciones objetivo, porciones etiquetantes y grupos "retenedores de lugar" benignos (es decir, no interferentes, estables. Preferiblemente, los componentes restantes son compuestos de bajo peso molecular como se define en este documento. Tales compuestos de bajo peso molecular preferiblemente incluyen aquellos en los cuales el grupo RA, RN, Rc o Rx (el cual puede ser representado por Rx) , es una porción orgánica estable que tiene 1-12, preferiblemente 1-8 átomos de carbono y 0-4 heteroátomos, seleccionados de oxígeno, nitrógeno y azufre. El grupo RA, RN o Rc puede también ser hidrógeno. Preferiblemente, Rx, cuando no es hidrógeno o metilo, incluye enlaces seleccionados de alquilo, alquenilo, éter, hidroxilo, éster carboxílico, cetona y amida. Ejemplos no limitantes incluyen grupos alquilo inferiores, grupos cicloalquilo, grupos hidroxialquilo inferior, esteres de alquilo inferior y amidas de alquilo inferior. En modalidades seleccionadas, la proteína o polipéptido se selecciona de (b) RN-NH2 y (c) Rc-C(0)OH. En modalidades seleccionadas adicionales, el polímero soluble en agua se selecciona de (a) RA-C(0)R'; (b) RN-NH2, y (d) Ri-NC, o de (a) RA-C(0)R', (b) RN-NH2, y (c) Rc-COOH. En todavía modalidades adicionales, el polímero se selecciona de (a) RA-C(0)R' y (b) RN-NH2. En las modalidades anteriores, R' es preferiblemente H. En otra modalidad preferida, el componente (d) , Rj-NC, es un polímero soluble en agua . El polímero soluble en agua es preferiblemente un óxido de polialquileno funcionalizado (PAO), tal como óxido de polipropileno (PPO), o en una modalidad preferida, polietilenglicol (PEG) . Tal molécula de óxido de polialquileno funcionalizada tienen una funcionalidad carbonilo, amina, carboxilo o isonitrilo disponible (dependiendo de si el polímero es RA-C(0)R', RN-NH2, Rc-COOH, o Ri-NC, respectivamente) . Una molécula de PEG o PPO que tiene una funcionalidad de isonitrilo, adecuada para uso en los métodos de conjugación descritos en este documento, formas los mismos, otro aspecto de la invención. Tal molécula típicamente tiene una estructura RCAp (OCHR"CH ) n-X-N=C, en donde R" es H o metilo, RCAp es un grupo de extremo tapado estable, X representa un enlace directo o una porción de enlace estable, y n es un número entero entre 10 y aproximadamente 2300, de manera tal que, por ejemplo, la porción - (OCH2CH2)n-, en donde R" es H, tiene un peso molecular entre aproximadamente 440 y 100,000 Daltons. Pesos moleculares ejemplares para la porción - (OCH2CH2) n-incluyen, por ejemplo, 2000, 5000, 10,000, 20,000, y 40,000 Daltons . En modalidades seleccionadas, RCAP es acilo, arilo o alquilo, por ejemplo, metilo. El enlazador X preferiblemente consiste de enlaces seleccionados de alquilo, arilo, cicloalquilo, éter, amida y combinaciones de los mismos. Más preferiblemente, X consiste de enlaces seleccionados de alquilo, cicloalquilo, arilo y combinaciones de alquilo y arilo o alquilo y cicloalquilo.

El enlazador es preferiblemente de hasta doce átomos de longitud. En una modalidad, cada uno de los componentes (a)-(d) es un componente único. En otras modalidades, empleados en la síntesis combinatorial de conjugados, al menos uno de los componentes (a)-(d) comprende una pluralidad de compuestos. Preferiblemente, el conjugado de la proteína o polipéptido con el polímero soluble en agua, tiene una inmunogenicidad reducida y/o una vida media incrementada en la circulación, cuando se administra in vivo a un sujeto, incluyendo a un sujeto humano, comparado con la proteína o polipéptido no conjugado. La reacción de conjugación puede incluir una variedad de diferentes combinaciones de los componentes referenciados anteriormente. Ejemplos incluyen las siguientes subseries de reacciones, en las cuales, el componente de polímero soluble en agua es ejemplificado por PEG. Sin embargo, otros polímeros solubles en agua, por ejemplo, PPO, pueden también ser usados en cualquiera de estas reacciones. En una primera subserie de reacciones, (a) es una proteína, uno de (a) , (b) y (d) es un reactivo PEG, y los componentes restantes son compuestos no interferentes, estables. En estas reacciones, cuando (d) es un reactivo de PEG-isonitrilo, o (a) es un reactivo de PEG-carbonilo, el componente (b) es preferiblemente una amina de bajo peso molecular, la cual puede ser suministrada en exceso. Cuando (b) es un reactivo de amina PEG, el reactivo es preferiblemente una amina de pKa bajo, por ejemplo, una oxiamina de PEG, una hidrazida de PEG, una carbazida de PEG o una amina aromática de PEG. En una subserie relacionada de reacciones, útiles para conjugar dos cadenas poliméricas a un sitio de unión único en una molécula de proteína, (c) es una proteína, dos de (a) , (b) y (d) son reactivos PEG, y el componente restante es un compuesto no interférente, estable. En una segunda subserie de reacciones, (a) es una proteína modificada para contener un aldehido o un grupo cetona, uno de (b) , (c) y (d) es un reactivo de PEG, y los componentes restantes son compuestos no interferentes, estables. En estas reacciones, cuando (b) es un reactivo de amina PEG, el reactivo es preferiblemente una amina de pKa bajo, por ejemplo, una hidrazida de PEG, una carbazida de PEG, o una amina aromática de PEG, y (c) es preferiblemente un ácido carboxílico de bajo peso molecular proporcionado en exceso, por ejemplo, un acetato como un componente amortiguador o aditivo. Cuando (c) es un reactivo de PEG-carboxilo, (b) es preferiblemente una amina de bajo peso molecular proporcionada en exceso.

En una subserie de reacciones, empleadas para conjugar dos cadenas poliméricas a un sitio único en una molécula de proteína, (a) es una proteína modificada para contener un carbonilo reactivo, por ejemplo, grupo aldehido, dos de (b) , (c) y (d) son reactivos PEG, y los componentes restantes son compuestos no interferentes, estables. En este caso, cuando (b) es un reactivo de PEG-amina y (d) es un reactivo de PEG-isonitrilo, un reactivo de PEG-amina, el reactivo amina es preferiblemente una amina de pKa bajo, por ejemplo, una hidrazida de PEG, una carbazida de PEG, o una amina aromática de PEG, y (c) es preferiblemente un ácido carboxílico de bajo peso molecular proporcionado en exceso, por ejemplo, acetato. En una tercera subserie de reacciones, (b) es una proteína, uno de (a) , (c) y (d) es un reactivo PEG, y los dos restantes de (a) , (c) y (d) son compuestos no interferentes, estables. En estas reacciones, cuando (d) es un reactivo de PEG-isonitrilo, (c) es preferiblemente un ácido carboxílico de bajo peso molecular proporcionado en exceso. En una subserie relacionadas de reacciones, empleadas para conjugar dos polímeros a una molécula de proteína, (b) es una proteína, dos de (a) , (c) y (d) son reactivos PEG y los componentes restantes son un compuesto no interférente, estable. En estas reacciones, cuando (a) es un reactivo de PEG-carbonilo y (d) es un reactivo de PEG-isonitrilo, (c) es preferiblemente un ácido carboxílico de bajo peso molecular proporcionado en exceso. En otro aspecto, la invención proporciona un método para preparar una composición farmacéutica, la composición comprende, en un vehículo farmacéutico, un conjugado de una molécula biológicamente activa o relevante con un polímero preferiblemente soluble en agua, biocompatible, el método comprende: (i) hacer reacciones los componentes (a)-(d) siguientes : (a) RA-C(0)R', en donde R' es H o alquilo inferior, preferiblemente H o Me y más preferiblemente, H, (b) RN-NH2, (c) Rc-C(0)OH, y (d) R?-NC, para formar un producto conjugado que incorpora al menos, una de cada porción representada por RA, RN, Rc y Ri. En una modalidad, como se discute anteriormente, el conjugado es de la forma R?NH-C (O) -CRAR' -NRN-C (O) Rc, incorporando exactamente una de cada porción representada por RA, RN, Rc y Ri • En otras modalidades, por ejemplo, en las cuales uno de los componentes (a)-(d) porta más de una de las funcionalidades reactivas indicadas (tales como un componente RN-NR2 que porta múltiples grupos amino, o un componente Rc-C(0)OH que porta múltiples grupos de ácido carboxílico) , el producto conjugado puede incluir dicho componente conjugado a residuos múltiples de los otros componentes. Véase por ejemplo, el conjugado de ácido hialurónico del Ejemplo 16, abajo. Al menos uno de los componentes (a)-(d) es una molécula biológicamente activa o relevante, y al menos uno de los componentes (a)-(d) es un polímero preferiblemente soluble en agua, biocompatible, y (ii) formular el conjugado, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en un vehículo farmacéutico, preferiblemente un vehículo acuoso. El conjugado formado es preferiblemente soluble en agua a temperatura ambiente y pH fisiológico. En la formación del conjugado RSNH-C (O) -CRAR' -NRN-C(0)RC, la molécula biológicamente activa está representada por al menos un componente seleccionado de (a)-(d) anterior, y preferiblemente seleccionado de (a)-(c); el polímero está representado por al menos, un componente diferente seleccionado de (a)-(d) anterior; y cualquiera de los componentes restantes de (a)-(d) son seleccionados de porciones etiquetantes, porciones objetivo y otros compuestos no interferentes, estables. En una modalidad preferida, la molécula es un componente seleccionado de ( a ) - ( c ) , el polímero es un componente diferente seleccionado de (a)-(d), y los componentes restantes de (a)-(d) se seleccionan de porciones etiquetantes, porciones objetivo, y otros compuestos no interferentes, estables. Típicamente, los componentes restantes son compuestos de bajo peso molecular, como se define en este documento. En modalidades preferidas, la molécula biológicamente activa se selecciona de (a) RA-C(0)R', (b)RN-NH2í y (c) Rc-C(0)OH, y más preferiblemente de (b) RN-NH2 y (c) Rc-C(0)OH. En modalidades seleccionadas, la molécula es una proteína o polipéptido. En modalidades seleccionadas adicionales, el polímero se selecciona de (a) RA-C(0)R', (b) RN-NH2, y (d) Ri-NC o de (a) RA-C(0)R', (b) RN-NH2 y (c) Rc-COOH. En modalidades todavía adicionales, el polímero se selecciona de (a) RA-C(0)R' y (b) RN-NH2. El polímero es preferiblemente un óxido de polialquileno funcionalizado (PAO), tal como óxido de polipropileno (PPO), o preferiblemente, polietilenglicol (PEG), por ejemplo, una molécula de PEG que tiene una funcionalidad de carbonilo, amina o isonitrilo disponible. En una modalidad particular, el polímero es un isonitrilo PEG como se describe en este documento. La reacción de conjugación de la etapa (i) puede incluir una variedad de diferentes combinaciones de los componentes referenciados anteriormente, que incluyen la primera hasta la tercera y relacionadas subseries de reacciones descritas anteriormente. La proteína en estas reacciones, puede ser reemplazada con otra molécula biológicamente activa, tal como un polisacárido, polinucleótido o compuestos de fármaco de molécula pequeña. Preferiblemente, el conjugado de la molécula biológicamente activa con el polímero, tiene inmunogenicidad reducida, degradación reducida y/o una vida media incrementada en circulación, cuando se administra in vivo a un sujeto, que incluye un sujeto humano, comparado con la molécula biológicamente activa no conjugada. En un aspecto adicional, la invención proporciona un conjugado soluble en agua de la forma RxNH-C (O) -CRAR' -NRN-C (O) Rc, en donde al menos uno de RA, RN y Rc es una proteína o polipéptido, al menos uno de Rt , RA, RN y Rc, preferiblemente Ri, es un óxido de polialquileno, preferiblemente polietilenglicol (PEG) ; y los elementos restantes de Ri, RA, RN y Rc son seleccionados independientemente de porciones etiquetantes, porciones objetivo, y R, en donde R es una porción orgánica estable que tiene 1-12, preferiblemente 1-8, átomos de carbono y 0-4 heteroátomos seleccionados de oxígeno, nitrógeno y azufre. Cuando R es una modalidad de RA, RN o Rc, R puede también ser hidrógeno. R' es preferiblemente H o alquilo inferior, por ejemplo, CH3 y es más preferiblemente H. Preferiblemente, R cuando no es hidrógeno o metilo, incluye enlaces seleccionados de alquilo, alquenilo, éter, hidroxilo, éster carboxílico, cetona y amida. Ejemplos incluyen, grupos alquilo inferior, grupos cicloalquilo, grupos hidroxialquilo inferior, esteres de alquilo inferior, y amidas de alquilo inferior. El conjugado es preferiblemente soluble en agua a temperatura ambiente y a pH fisiológico. En el conjugado soluble en agua RiNH-C (O) -CRAR' -NRN-C(0)Rc, una porción RN o Rc la cual representa una proteína o polipéptido, se puede ligar a residuos adicionales de los otros componentes, si dicha porción RN o Rc incluye incidencias múltiples del grupo funcional indicado (por ejemplo, un polipéptido RN-NH2 que porta grupos amino múltiples, o un polipéptido Rc-C(0)OH que porta grupos de ácido carboxílico múltiples) , como se discute anteriormente. En una modalidad, dichas porciones no están ligadas a residuos adicionales de los componentes restantes; esto es, el conjugado incluye exactamente uno de cada uno de los residuos RIf RA, RN y Rc- L presencia de ausencia de tales residuos adicionales puede ser controlada por condiciones de reacción; por ejemplo, por las relaciones molares de los componentes presentes. La invención incluye conjugados que tienen varias combinaciones de los componentes referenciados anteriormente, dentro de las estipulaciones dadas anteriormente. Típicamente, el conjugado incluye una proteína única o molécula de polipéptido conjugada a uno o dos moléculas de PAO, preferiblemente moléculas de PEG. Tales combinaciones incluyen conjugados en los cuales: Rc es una proteína, Ri es PEG, y RA y RN son seleccionados independientemente de porciones etiquetantes, porciones objetivo y R; Rc es una proteína, RN es PEG, y RA y Ri son seleccionados independientemente de porciones etiquetantes, porciones objetivo y R; Rc es una proteína, RA es PEG, y Rt y RN son seleccionados independientemente de porciones etiquetantes, porciones objetivo y R; Rc es una proteína, cada una de RN y RA es PEG, y Ri es una porción etiquetante, porción objetivo, o R; Rc es una proteína, cada una de RN y Ri es PEG, y RA es una porción etiquetante, porción objetivo, o R; RA es una proteína, RN es PEG, y Rc y Ri son seleccionados independientemente de porciones etiquetantes, porciones objetivo, y R; RA es una proteína, RN es PEG, Ri es PEG, y Rc es una porción etiquetante, una porción objetivo, o R; RA es una proteína, Rc es PEG, y Rt y RN son seleccionados independientemente de porciones etiquetantes, porciones objetivo, y R; RN es una proteína, Rt es PEG y RA y Rc son seleccionados independientemente de porciones etiquetantes, porciones objetivo, y R; RN es una proteína, RA es PEG, Rt es PEG, y Rc es una porción etiquetante, una porción objetivo, o R; RN es una proteína, Rc es PEG, y Ri y Rc son seleccionados independientemente de porciones etiquetantes, porciones objetivo, y R; o RN es una proteína, RC es PEG, Rl es PEG y RA es una porción etiquetante, una porción objetivo, o R. En modalidades seleccionadas de las combinaciones anteriores, los componentes no PAO, no proteínas, son modalidades de R. En otras modalidades, uno de tal componente no PAO, no proteína, es una porción etiquetante u objetivo. Estos y otros objetos y características de la invención, llegarán a ser más completamente aparentes cuando se lea la siguiente descripción detallada de la invención, en conjunto con la(s) figura (s) acompañantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el mecanismo en general aceptado para una reacción de condensación de cuatro componentes, de los cuales, modalidades específicas se describen en este documento. La Figura 2 muestra un esquema de conjugación que ilustra la unión de PEG a un grupo carbonilo generado específicamente en sitio en un polipéptido, realizado en amortiguador de acetato (es decir, Rc = CH3) , de conformidad con una modalidad de la invención. Rt en este caso podría ser, por ejemplo, otra cadena PAO, una etiqueta o un residuo benigno menor.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. Definiciones Un "polipéptido" como se usa en este documento, es un polímero de aminoácidos, sin limitación como a una longitud específica. De este modo, por ejemplo, los términos péptido, oligopéptido, proteína y enzima, están incluidos dentro de la definición de polipéptido. El término también incluye modificaciones post-expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. El término "polímero" como se usa en este documento, está propuesto para referirse a un polímero preferiblemente soluble en agua, hidrofílico, tal como PEG, el cual está conjugado a una molécula biológicamente activa, aún a través del último puede ser el mismo polimérico. "PEG", se refiere a un polietilenglicol, un polímero que tiene la unidad de repetición (CH2CH20)n, en donde n es preferiblemente aproximadamente 10 hasta aproximadamente 2300, la cual corresponde a pesos moleculares de aproximadamente 440 Daltons hasta aproximadamente 100,000 Daltons. Los polímeros son solubles en agua sobre sustancialmente el intervalo en peso molecular completo. Para conjugación a un polipéptido, un intervalo preferido de peso molecular de PEG es desde aproximadamente 2,000 hasta aproximadamente 50,000 Daltons, más preferiblemente desde aproximadamente 2,000 hasta aproximadamente 40,000 Daltons. El PEG puede ser de extremo tapado con cualquier grupo que no interfiere con las reacciones de conjugación descritas en este documento, por ejemplo, hidroxilo, éster, amida, tioéter, alcoxi, o una variedad de grupos reactivos bloqueados con porciones protectoras apropiadas. Un PEG de extremo tapado común, es metoxiPEG (mPEG) . Mientras los homopolímeros de PEG son preferidos, el término puede también incluir copolímeros de PEG con otro monómero. Esto podría ser, por ejemplo, otro éter que forma monómero, tal como propilenglicol.

Una molécula "biológicamente activa", se refiere a una molécula conocida por tener actividad biológica y/o propuesta para el uso diagnóstico o terapéutico, particularmente uno esperado por tener actividad terapéutica. Tal molécula puede también ser referida como "biológicamente relevante". Por "estable" y/o "no interferente", con respecto a los componentes de reacción de las reacciones de conjugación descritas en este documento, significa que un componente de reacción no se somete a cualquier reacción química bajo las condiciones de conjugación, distinta de la que funciona su papel propuesto en la reacción de conjugación y proporciona un sustituyente biológicamente benigno, estable, en el conjugado resultante. Por "bajo peso molecular", como se usa en este documento, típicamente en referencia a un componente de reacción no interferente, en general, significa de aproximadamente 500 Daltons o menos, preferiblemente 350 o menos, y más preferiblemente 200 o menos. Un componente "carbonilo", como se usa en este documento con referencia a un componente de una reacción de condensación de cuatro componentes, se refiere a un aldehido o una cetona. El componente puede ser designado por RA-C(0)R', en donde R' es H o alquilo inferior, preferiblemente H o metilo, y más preferiblemente H (es decir, en donde el componente carbonilo es un aldehido) , y RA es un residuo de una molécula biológicamente activa (por ejemplo, una proteína o polipéptido), un polímero soluble en agua, o compuesto no interferente, estable, como se define en este documento. "Alquilo" se refiere a un radical monovalente acíclico completamente saturado, que contiene carbono e hidrógeno, el cual puede ser lineal o ramificado. Ejemplos de grupos alquilo son metilo, etilo, n-butilo, t-butilo, n-heptilo e isopropilo. "Cicloalquilo" se refiere a un radical monovalente cíclico completamente saturado que contiene carbono e hidrógeno, preferiblemente que tiene tres a siete, más preferiblemente, cinco o seis, átomos en el carbono del anillo, el cual puede ser además sustituido con alquilo. Ejemplos de grupos cicloalquilo incluyen, ciclopropilo, metilciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, etilciclopentilo, y ciclohexilo. "Alquilo inferior", se refiere a un radical alquilo de uno a seis átomos de carbono, como se ejemplifica por metilo, etilo, n-butilo, i-butilo, t-butilo, isoamilo, n-pentilo e isopentilo. En modalidades seleccionadas, un grupo "alquilo inferior" tiene uno a cuatro átomos de carbono. "Acilo" se refiere a un grupo alquilo, el cual puede ser un grupo alquilo inferior, ligado a un grupo carbonilo, es decir, R-(C=0)-. "Hidrocarbilo" abarca grupos que consisten de carbono e hidrógeno; es decir, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, y arilo no heterocíclico. "Arilo" se refiere a un radical aromático monovalente sustituido o insustituido que tiene un anillo único (por ejemplo, fenilo) , dos anillos condensados (por ejemplo, naftilo) o tres anillos condensados (por ejemplo, antracilo o fenantrilo) . Los grupos monocíclicos son generalmente preferidos. Este término en general, incluye grupos heteroarilo, los cuales son grupos de anillo aromático que tienen uno o más átomos de nitrógeno, oxígeno o azufre en el anillo, tal como furilo, pirrol, piridilo e indol. Por "sustituid", significa que uno o más hidrógenos en el anillo en el grupo arilo, son reemplazados con un haluro tal como flúor, cloro o bromo; con un grupo alquilo inferior que contiene uno o dos átomos de carbono; o con nitro, amino, metilamino, dimetilamino, metoxi, halometoxi, halometilo, o haloetilo. Los sustituyentes preferidos cuando se presentan, incluyen flúor, cloro, metilo, etilo y metoxi . El término "sal farmacéuticamente aceptable", abarca por ejemplo, sales de carboxilato que tienen counteriones orgánicos o inorgánicos, tales como cationes álcalis o alcalino térreos (por ejemplo, litio, sodio, potasio, magnesio, bario o calcio) ; amonio; o cationes orgánicos, por ejemplo, dibencilamonio, bencilamonio, 2-hidroxietil amonio, bis (2-hidroxietil) amonio, feniletilbencilamonio y similares. Otros cationes incluyen las formas protonadas de aminoácidos básicos tales como glicina, ornitina, histidina, fenilglicina, lisina y arginina. El término también incluye sales de grupos básicos tales como aminas, que tienen un counterión derivado de ácido orgánico u inorgánico. Tales counteriones incluyen cloruro, sulfato, fosfato, acetato, succinato, citrato, lactato, maleato, fumarato, palmitato, colato, glutamato, glutarato, tartrato, estearato, salicilato, metansulfonato, bencensulfonato, sorbato, picrato, benzoato, cinamato y similares. Un "portador farmacéuticamente aceptable", es un portador adecuado para administrar el conjugado a un sujeto, que incluye un sujeto humano, tal como una formulación farmacéutica. El portador es típicamente un vehículo acuoso, tal como salina acuosa, dextrosa, glicerol o etanol. Los ingredientes activos, tales como amortiguadores, estabilizadores, etc., pueden ser incluidos en la formulación. Un "vehículo acuoso", como se usa en este documento, tiene agua como su componente primario pero puede incluir solutos como se describen. Cosolventes tales como alcoholes o glicerol, pueden también estar presentes. Las formulaciones sólidas, las cuales pueden también ser usadas, típicamente incluyen excipientes inactivos tales como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa o éteres de celulosa, glucosa, gelatina, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. El conjugado puede también ser formulado como una suspensión en un lípido o fosfolípido, en una formulación liposomal, o en una formulación transdérmica o inhalable, de conformidad con los métodos conocidos en la técnica.

II. Conjugados Macromoleculares De conformidad con ciertos aspectos de la invención, los conjugados macromoleculares comprenden al menos, una molécula biológicamente activa, conjugada en al menos un polímero soluble en agua, y se proporcionan métodos para su preparación. Los conjugados se preparan vía un esquema de condensación de cuatro componentes ($CC) que emplea un componente de ácido carboxílico, un componente amina, un componente isonitrilo, y un componente de aldehido o cetona, como se ilustra en la Figura 1 (en donde un componente aldehido es representado) . El mecanismo de la reacción de cuatro componentes, fue primero descrita por Ugi et al . , (Ugi et al . , 1959), y fue recientemente revisada (Domling and Ugi, 2000) . De conformidad con la invención, los cuatro componentes referenciados anteriormente, se seleccionan de manera que al menos un componente, seleccionado del componente de ácido carboxílico, el componente amina, y el componente carbonilo reactivo (por ejemplo, aldehido), está presente en una molécula biológicamente activa, o macromolécula, preferiblemente un polipéptido, y al menos uno, un componente diferente, seleccionado del componente de ácido carboxílico, el componente amina, el componente isonitrilo y el componente carbonilo, está presente en un polímero hidrofílico, preferiblemente un poliéter, tal como PEG. El polímero hidrofílico es preferiblemente soluble en un medio acuoso y es de este modo, preferiblemente no reticulado. Cualquiera de los componentes restantes no está propuesto como molécula (s) biológicamente activa (s) o polímero (s) hidrofílico (s) , son típicamente proporcionados como preferiblemente compuestos de bajo peso molecular, no interferentes, estables. Por ejemplo, ácido fórmico o acético puede ser usado como el (los) componente (s) de ácido carboxílico, o terc-butilo o ciclohexil isonitrilo puede ser usado como el componente isonitrilo. Estos componentes pueden formar esencialmente, sustituyentes inertes (por ejemplo, metilo u otros grupos alquilo) en la porción de enlace del producto conjugado. Estos componentes restantes pueden también suministrar una porción objetivo o etiquetante al conjugado. Por ejemplo, biotina, ácido cumarin-4-acético, 7-aminocumarina, Lucifer Amarillo CH, ácido fólico y queladores, tales como DTPA, pueden ser potencialmente utilizados para tales propósitos. Preferiblemente, los pesos moleculares de los componentes restantes son tales, que no interfieren estéricamente con la formación del conjugado. Los intervalos en peso molecular preferido son menos de 500, más preferiblemente menos de 350 y mayormente preferible menos de 200 Daltons. Los componentes reaccionan para formar un conjugado que incorpora al menos, una de cada una de las porciones representadas por RA, RN, Rc y Ri • En una modalidad como se discute anteriormente, el conjugado es de la forma: en donde R? se deriva del componente isonitrilo, RA se deriva del componente carbonilo reactivo (por ejemplo, aldehido, cuando R'=H), RN se deriva del componente amina y Rc se deriva del componente de ácido carboxílico. Un mecanismo en general aceptado para la reacción, se muestra en la Figura 1. En otras modalidades, por ejemplo, en las cuales uno de los componentes (a)-(d) porta más de una de las funcionalidades reactivas indicadas (tales como un componente RN-NH2 que porta grupos amino múltiples, o un componente RC-C(0)OH que porta múltiples grupos de ácido carboxílico) , el producto conjugado puede incluir dicho componente conjugado a residuos múltiples de los otros componentes. Véase por ejemplo, el conjugado de ácido hialurónico del Ejemplo 16 abajo. La presencia, ausencia y/o número de tales residuos adicionales, puede ser controlada por condiciones de reacción, tales como las relaciones molares de los componentes presentes. La reacción se puede llevar a cabo como una reacción de "un crisol". La eficiencia de la conjugación se puede mejorar en algunos casos, condensando primero la amina y componentes carbonilo, de este modo, generando el primer intermediario mostrado en la Figura 1, y subsecuentemente, haciendo reaccionar este intermediario con los componentes restantes (véase Ejemplos 7 y 16 siguientes) .

A. La Molécula Biológicamente Activa El agente biológicamente activo es típicamente un agente terapéutico o de diagnóstico. Los agentes biológicamente activos incluyen sustancias de fármacos seleccionadas de biomoléculas poliméricas u oligoméricas, por ejemplo, proteínas, polisacáridos o ácidos nucleicos, o compuestos de moléculas pequeñas. Un compuesto de "molécula pequeña", puede ser definido ampliamente como un compuesto orgánico, inorgánico u organometálico, el cual no es un polímero u oligómero. Típicamente, tales compuestos tienen pesos moleculares de 1000 Da o menos, o en una modalidad, 500 Da o menos. La molécula biológicamente activa es frecuentemente la amina o el componente de ácido carboxílico en las reacciones descritas en este documento. Tales grupos funcionales son comúnmente originados en moléculas biológicamente activas, por ejemplo, en polipéptidos en varias sustancias de fármacos de molécula pequeña. Como se discute anteriormente, cuando la molécula biológicamente activa incluye múltiples incidencias de un grupo funcional indicado (por ejemplo, un polipéptido RN-NH2 que porta múltiples grupos amino, o un polipéptido Rc-C(0)OH que porta múltiples grupos de ácido carboxílico), el residuo de la molécula en el conjugado puede ser ligado a residuos adicionales de los componentes restantes. Véase por ejemplo, el conjugado de ácido hialurónico del Ejemplo 16 siguiente. La presencia o ausencia de tales residuos adicionales puede ser controlada por condiciones de reacción; por ejemplo, por las relaciones molares de los componentes presentes. Cuando más de uno de los grupos funcionales de componentes diferentes está presente en la molécula biológicamente activa, las condiciones de reacción son preferiblemente seleccionadas para favorecer la reacción de uno sobre el otro. Por ejemplo, para promover la reacción de grupos amina sobre grupos de ácido carboxílico en una molécula, tal como una proteína, la reacción se puede llevar a cabo a un pH alto (por ejemplo, 7-8.5) y/o en la presencia de una alta concentración de un amortiguador de acetato, tal como el acetato efectivamente compite con los grupos de carboxilato en la molécula en actuación como el componente carboxilo de la reacción. Alternativamente, para promover la reacción de ácidos carboxílicos sobre aminas en una molécula, la reacción se puede realizar a un pH bajo. Por ejemplo, a pH 4-6, las aminas en un polipéptido, son ampliamente protonadas. Para suprimir la reactividad de los grupos amino de la proteína, la mezcla de reacción puede también incluir un exceso de una amina preferiblemente de bajo pKa, de bajo peso molecular, tal como una hidrazida o una amina aromática, o un amortiguador que contiene amina, tal como TRIS o glicinamida. En una modalidad preferida, la molécula biológicamente activa, tal como un polipéptido o glicopéptido, es el componente carbonilo, por ejemplo, aldehido en la reacción. Mientras los aldehidos ocurren menos comúnmente en las moléculas biológicamente activas, por ejemplo, polipéptidos, que en aminas o ácidos carboxílicos, existen varios métodos para incorporar sintéticamente un carbonilo reactivo en tal molécula. Por ejemplo, Rodrigues et al . , ( J. Org. Chem . 63:9614, 1998) y Marcaurelle et al . , ( Org. Lett . 3:3691-94, 2001), describen la síntesis de un ceto aminoácido que puede ser incorporado en un péptido. La oxidación de periodato de porciones 1,2-cis diol o 1, 2-aminoalcohol en glicoproteínas, es un método bien conocido para generar grupos de aldehido en estos compuestos (véase por ejemplo, Wilchek, 1987; O'Shannessy, 1987; Morehead, 1991). La oxidación mediada por galactosa oxidasa en la posición 6 en residuos de galactopiranósido o N-acetil galactopiranósido, es otro método conocido para generar aldehidos reactivos en una glicoproteína (Wilchek, 1987). La introducción de una función aldehido en un péptido que contiene serina o treonina, se puede realizar por oxidación mediada por DMSO/carbodiimida de los grupos hidroxilo de estos residuos de aminoácido en grupos aldehido y cetona reactivos, respectivamente (Di Bello et al . , 1972) . Un aldehido puede también ser incorporado en un polipéptido vía reacción de una amina en el péptido con un reactivo heterobifuncional apropiado, por ejemplo, éster NHS de ácido 4-formulbenzoico, como se describe por King et al . , (1996). Los grupos amino de péptidos o amínosacáridos, pueden ser convertidos en residuos N-levulinoilo, por ejemplo, por el método de Yarema et al . , (1998). Muchos de los métodos anteriores, tales como oxidación de periodato de glicoproteínas (O'Shannessy et al . ; Wilchek, et al . , ) , proporciona generación específica del sitio de carbonilos reactivos en polipéptidos, de este modo, permitiendo la conjugación de polímeros selectiva del sitio, de conformidad con los métodos de la invención. Otras rutas incluyen oxidación mediada por periodato de péptidos que contienen serina o treonina N-terminal, las cuales se convierten en residuos N-glioxalilo reactivos (Dixon, 1987; Geoghegan et al . , 1992). La transaminación N-terminal de péptidos, es otro método general para generar grupos carbonilo reactivos en una manera específica del sitio (revisado en Dixon, 1984). Los carbonilos reactivos generados en esta forma, han sido previamente usados para conjugación de biomoléculas con varios compuestos de hidrazida y oxiamina, formando hidrazona y bioconjugados enlazados a oxima, respectivamente (Gaerthner et al . , 1992; Zalipsky et al . , 1995c; Zalipsky and Menon-Rudolph, 1997; Wei et al . , Patente Estadounidense No. 6,077,939). Sin embargo, estos enlaces son lábiles en pH acídico, particularmente en la presencia de derivados de hidrazina o hidroxilamina competentes. Los bioconjugados preparados de conformidad con los métodos descritos en este documento, ofrecen mucha mayor estabilidad.

B. El polimero El polímero a ser conjugado con la molécula biológicamente activa, puede ser cualquier polímero biocompatible el cual contiene o puede ser modificado para contener un grupo reactivo seleccionado de una amina, un ácido carboxílico, un aldehido o cetona o un isonitrilo. Preferiblemente, el polímero es un polímero hidrofílico no inmunogénico. El polímero es preferiblemente soluble en agua, por consiguiente, el polímero debe ser no reticulado. Preferiblemente, el polímero es soluble en agua a temperatura ambiente y a pH fisiológico. Polímeros hidrofílicos ejemplares incluyen polivinilpirrolidona, pilivinilmetiléter, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropiloxazolina, polihidroxipropil-metacrilamida, polimetacrilamida, polidimetil-acrilamida, polihidroxipropilmetacrilato, polihidroxietilacrilato, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polietilenglicol (PEG), óxido de polipropileno (PPO), poliaspartamida, y copolímeros de los polímeros mencionados anteriormente, por ejemplo, copolímeros de óxido de polietileno-óxido de polipropileno. Las propiedades y reacciones de muchos de estos polímeros son descritas en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,395,619, y 5,631,018. En modalidades preferidas, el polímero es un poli (óxido de alquileno), tal como PPO o PEG, y es más preferiblemente, un polímero PEG (polietilenglicol) . (Note que los términos "óxido" de polialquileno y "glicol" de polialquileno, son equivalentes) . Los métodos para la preparación de polímeros PEG que contienen aminas, isonitrilos, grupos carboxilo, carbonilos, se describe en los Ejemplos 1-4 siguientes; véase también Zalipsky (1995b) y Zalipsky & Harris (1997) . Otros tipos de polímeros hidrofílicos, tales como aquellos listados anteriormente, pueden ser similarmente funcionalizados, usando modificaciones de los procedimientos de los Ejemplos 1-4 para polímeros que contienen hidroxilo, o de conformidad con procedimientos sintéticos disponibles para un experto en la técnica. Los derivados PEG-isonitrilo y PPO-isonitrilo fueron hasta ahora desconocidos. En tales derivados, un intervalo preferido de peso molecular PEG es desde aproximadamente 2,000 hasta aproximadamente 50,000 Daltons, más preferiblemente, desde aproximadamente 2,000 hasta aproximadamente 40,000 Daltons. El PEG puede ser de extremo tapado en el término no isonitrilo con cualquier grupo de extremo tapado estable que no reacciona con el isonitrilo o interfiere con las reacciones de conjugación descritas en este documento, por ejemplo, éster, amida, tioéter, hidroxilo, alcoxi o una variedad de grupos reactivos bloqueados con porciones protectoras apropiadas. Un PEG de extremo tapado común es metoxiPEG (mPEG) . Mientras los homopolímeros PEG son preferidos, el término puede también incluir copolímeros de PEG con otros monómeros. Esto podría ser, por ejemplo, otro éter que forma monómero, tal como propilenglicol . Un compuesto de PAO-isonitrilo como se proporciona en este documento, típicamente tiene la estructura RCAp(OCHR"CH2)n-X-N=C, en donde RCAP es un grupo de extremo tapado estable; R" es H o metilo, preferiblemente H; X representa un enlace directo o una porción enlazante estable; y n es un número entero entre 10 y aproximadamente 2300, de manera tal que la porción -(OCH2CH2)n- tiene un peso molecular entre aproximadamente 440 y 100,000 Daltons. En modalidades seleccionadas, RCAP es acilo, arilo o alquilo, por ejemplo, metilo. El enlazador X, cuando no es un enlace directo, preferiblemente consiste de enlaces seleccionados de alquilo, arilo, cicloalquilo, éter, amida, lineales o ramificados, o combinaciones de los mismos. Más preferiblemente, X consiste de enlaces seleccionados de alquilo inferior, cicloalquilo, arilo y combinaciones de alquilo inferior y arilo o alquilo inferior y cicloalquilo. Arilo es preferiblemente monocíclico, por ejemplo, fenilo, y cicloalquilo es preferiblemente ciclopentilo o ciclohexilo. El enlazador es preferiblemente de hasta aproximadamente doce átomos, más preferiblemente de hasta aproximadamente ocho átomos, de longitud. Enlazadores ejemplares incluyen ciclohexilo y alquilo inferior, por ejemplo, -(CH2)n- en donde n es 1 a 4. Un método ejemplar para la preparación de un PEG-isonitrilo, se proporciona en el Ejemplo 1 siguiente. Este método emplea deshidratación de un intermediario de formamida, el cual es en cambio, preparado por reacción de una amina PEG con formiato de etilo. Esta ruta podría ser adaptada para la preparación de PEG-isonitrilo que contienen enlazadores estables, tales como enlazadores alquilo o cicloalquilo. Cuando un componente de amina polimérica se usa para conjugación a un polipéptido, se prefiere que la funcionalidad amina en el polímero, tenga un pKa inferior que los grupos amino en un polipéptido. En esta manera, como se describe abajo, la conjugación con un polipéptido se puede llevar a cabo a pH 4-7, en el cual, los grupos amino en el polipéptido (principalmente cadenas laterales de lisina, las cuales tienen un pKa de aproximadamente 10), son protonadas y de este modo no reactivas, mientras las aminas poliméricas menos básicas, serán no protonadas y de este modo, reactivas. Una carbazida o hidrazida PEG, que tiene un pKa de aproximadamente 3, a un conjugado PEG a una amina aromática, típicamente que tiene un pKa de aproximadamente 4, son reactivos adecuados para este propósito. En una modalidad de las reacciones de conjugación descritas en este documento, se proporcionan dos de los componentes reactivos como reactivos poliméricos funcionalizados; por ejemplo, un polipéptido o un polisacárido debe reaccionar vía su grupo carboxilo con un aducto di-PEG C=N enlazado preformado formado por una reacción entre componentes de PEG-amina y PEG-carbonilo (por ejemplo, entrada 4 en la Tabla 1, abajo; Ejemplo 7). Alternativamente, PEG-isonitrilo y un PEG-carbonilo (por ejemplo, entrada 10 en la Tabla 1, abajo) deben ser usados para lograr un sitio único unido a dos cadenas PEG. Las reacciones presentes pueden así proporcionar un conjugado de polipéptido que tiene dos cadenas PEG unidas enlazadas a un aminoácido o residuo de azúcar (entradas 4, 5, 7 y 10 de la Tabla 1) . Algunas ventajas de reactivos PEG de brazos múltiples y sus conjugados preparados por química alternativa se han descrito previamente (Monfardini et al., 1995; Patente Estadounidense 5,932,462).

C. Otros Componentes de Reacción En general, una reacción de conjugación emplea un polímero hidrofílico que comprende uno de los cuatro grupos funcionales requeridos y una molécula biológicamente activa que comprende otro de los cuatro grupos funcionales requeridos. También es posible generar un conjugado que contiene dos o aún tres polímeros hidrofílico (o moléculas biológicamente activas) , seleccionando dos o tres diferentes polímeros (o moléculas), cada una comprende uno diferente de uno de los cuatro grupos funcionales requeridos . Los componentes restantes (si cualquiera; generalmente uno o dos) se proporcionan como compuestos de peso molecular preferiblemente bajo, sin interferencia, estable. Por "estable" significa que el componente no sufre cualquier reacción química bajo las condiciones de conjugación, diferentes a los que juegan su papel pensado en la reacción de conjugación y proporciona un sustituyente biológicamente benigno, estable en el conjugado resultante. Por "bajo peso molecular" significa aproximadamente 500 Daltons o menos, preferiblemente menos de 350 Daltons, y más preferiblemente menor de 200 Daltons. Ejemplos son compuestos que tienen 1-12 átomos de carbono y hasta aproximadamente 4 heteroátomos. La naturaleza de RN, Rc, RA, y/o Ri (colectivamente referidos como Rx) en estos aditivos no es crítica como Rx no interfiere adversamente con la reacción de conjugación deseada o la actividad o estabilidad de almacenaje del conjugado resultante. Rx puede proporcionar una porción objetivo o etiquetada. Ejemplos incluyen fluoróforos, tales como cumarina, fluoresceína y porciones objetivo o enlazantes tales como biotina, folato o piridoxal. Otras porciones objetivo incluyen aquellas descritas en la Patente Estadounidense No. 6,660,525 co-propietaria, la cual se incorpora en este documento por referencia. Alternativamente, Rx es un grupo "retenedor de lugar", biológicamente benigno, inactivo, el cual puede ser representado por R. Preferiblemente, R tiene 1-12 átomos de carbono y puede contener hasta aproximadamente 4 heteroátomos. Más preferiblemente, R tiene 1-8 ó 1-6 átomos de carbono. Cuando R es una modalidad de RA, RN o Rc, R puede también ser hidrógeno. Cualquiera de los grupos funcionales dentro de R debe ser estable bajo las condiciones de la reacción de conjugación. (Se entenderá que algunas porciones etiquetadas u objetivo deben también caer dentro de la definición de R como se define en este documento) . R puede incluir grupos arilo, como se define anteriormente. Preferiblemente, R no es aromático y, cuando no es hidrógeno o metilo, incluye enlaces seleccionados de alquilo, alquenilo, éter, hidroxilo, éster carboxílico y amida. Ejemplos de R incluyen grupos alquilo inferior, tal como metilo, etilo, isopropilo o grupos terc-butilo, cicloalquilo, tales como grupos ciclohexilo, hidroxialquilo inferior, esteres de alquilo inferior, cetonas de alquilo inferior y amidas de alquilo inferior. Se pueden usar los compuestos los cuales son comúnmente usados como solventes o amortiguadores. Ejemplos particulares de tales componentes incluyen TRIS (tris (hidroximetil) aminometano) o glicinamida (H2NCH2C (O) NH2) para ácido acético RN-NH2 para Rc-COOH, acetaldehído para RA-CHO y isonitrilo de terc-butilo, isocianoacetato de etilo (C=NCH2C (O) OEt) , o isocianopropionato de etilo (C=NCH2CH2C02Et) para R?-NC El último isonitrilo es ventajoso para caracterización de los conjugados resultantes, como se incorpora un equivalente de ß-alanina en cada conjugado del producto. Se pueden usar análisis de aminoácido estándar para determinar el número de las uniones formadas. Se deben tomar en cuenta consideraciones esféricas cuando se seleccionan los componentes para la conjugación. Por lo tanto, si se usa una molécula grande y/o polímero, o sí más de uno de ya sea de estas entidades es usado, los componentes restantes son preferiblemente compuestos de bajo peso molecular, pequeños, tales como derivados de alquilo inferior.

II . Condiciones de Reacción Las reacciones son generalmente realizadas en solventes orgánicos, tales como, por ejemplo, metanol, trifluoroetanol o DMF, aunque no son ejemplos limitantes en la literatura de reacciones 4CC se llevan a cabo en medio acuoso (de Nouy, 2000; Vredblad, 1973; Goldstein, 1993) . Las condiciones de reacción se pueden ajustar para producir conjugados que tienen exactamente uno de cada uno de los residuos representados por RA, Rc, Ri y N, O (cuando uno o más de estos componentes es multifuncional, como se discute anteriormente) por tener ocurrencias múltiples de residuos seleccionados, por ejemplo, por selección de relaciones molares de componentes. Las condiciones de reacción se pueden también ajustar para favorecer la reacción de grupos funcionales seleccionados en un componente el cual puede contener más de uno de los grupos funcionales anteriormente referidos, tal como una proteína que contiene grupos funcionales tanto amina como ácido carboxílico. Las condiciones de reacción se pueden ajustar para suprimir la reacción de ácidos carboxílicos o aminas en una proteína, respectivamente, incluyendo exceso de ácido carboxílico de bajo peso molecular (por ejemplo, un amortiguador de acetato) como el componente carboxilo y/o amina de bajo peso molecular (por ejemplo, hidrazina) como el componente de amina. La reacción de las aminas de cadena lateral de la proteína también se puede suprimir, llevando a cabo la reacción a pH 4-7, en la cual las aminas de cadena lateral (principalmente cadenas laterales de lisina, las cuales tienen un pKa de aproximadamente 10) son protonadas y así sin reaccionar. En este caso, el componente de amina el cual es deseable para hacer reaccionar, es preferiblemente una amina de pKa bajo. Por ejemplo, cuando un componente PEG-amina para ser usado para conjugación a una proteína (u otra biomolécula que tiene grupos amino reactivos) , se prefiere que la funcionalidad PEG-amina tiene un pKa inferior que los grupos amino en la proteína. En esta manera, el PEG amina será desprotonado, y así reactivo, en un intervalo de pH en el cual las aminas de cadena lateral de la proteína son protonadas. Las carbazidas o hidrazidas PEG, que tienen un pKa de aproximadamente 3, o reactivos de amina PEG aromáticos, típicamente que tienen un pKa de aproximadamente 4, son reactivos adecuados para este propósito.

Para incrementar la eficiencia de la conjugación, en algunos casos, es ventajoso condensar la amina y los primeros componentes de carbonilo, así generando el primer intermediario de la reacción 4CC, y después agregarlos a los componentes restantes para la terminación de la conjugación (véase Ejemplo 7, abajo) . La reacción de conjugación también se puede usar para generar conjugados múltiples simultáneamente o en reacciones paralelas, cambiando uno de los cuatro componentes o las condiciones de reacción, así generando mezclas de varios grados de diversidad molecular. La variedad de conjugados generados en esta forma puede ser rápidamente seleccionada por varias propiedades químicas y/o biológicas, por ejemplo, peso molecular, contenido de polímero, receptor enlazante o proliferación celular. Por ejemplo, empleando diferentes polímeros como uno de los componentes (por ejemplo, varias modalidades de RI-NC, en donde Rl representa diferentes polímeros) , una pluralidad de conjugados se deben formar teniendo diferentes polímeros unidos en la misma ubicación en una molécula. Alternativamente, empleando una molécula particular para representar más de un componente (por ejemplo, varias modalidades de R-X, en donde R es un polímero o una molécula a ser conjugada, y X representa grupos múltiples seleccionados de una amina, un ácido carboxílico, un aldehido o cetona, y un isonitrilo) , una pluralidad de conjugados se deben formar teniendo polímeros y/o moléculas biológicamente activas unidas vía diferentes enlaces en el conjugado.

III . Escenarios de Conjugación de Condensación de Cuatro Componentes Ejemplares (4CC) . La tabla de abajo presenta ejemplos no limitantes de varios escenarios de conjugación, empleando, para el propósito de ilustración, una proteína y una molécula PEG a ser conjugada.

Tabla 1. Escenarios de Reacción de Conjugación Ejemplar En los escenarios 1-5, los grupos carboxilo de las proteínas son PEGilados, puesto que la proteína es el componente carboxilo, y al menos uno de los otros componentes es un reactivo PEG. En los escenarios 4 y 5, dos cadenas PEG están unidas por la proteína. En cada uno de los escenarios 1-8, en donde el componente amina no es la proteína, se pueden tomar mediciones, como se describe anteriormente, para favorecer la reacción del componente de amina deseado, RN, sobre las cadenas laterales de proteína, por ejemplo, trabajando a pH inferior (4-6) . Además, cuando PEG es el componente amina (como en los escenarios 2 y 4-7), se pueden usar una amina de pKa bajo, tal como PEG-hidrazida, PEG-carbazida, PEG-oxiamina o amina PEG aromática. Cuando PEG no es el componente de amina (es decir, los escenarios 1, 3 y 8), se puede usar en exceso de amina de bajo peso molecular, tal como TRIS (H2NC (CH2OH) 3) ; también se puede proporcionar en exceso una amina de pKa bajo (por ejemplo, glicinamida, acetilhidrazina) . En escenarios 6-8, un grupo carbonilo sintéticamente introducido o una proteína o glicoproteína es PEGilada. Tal escenario es ilustrado en la Figura 2. En el esquema mostrado en la Fig. 2, Rt puede representar un residuo benigno pequeño, una porción etiquetada u otra cadena PEG. Como se describe anteriormente, tales reacciones son particularmente atractivas debido a que proporcionan especificidad de sitio incrementada de unión (Fig. 2), en comparación a PEGilación aleatoria de grupos amino o carboxilo múltiples en la proteína. En escenarios 9-12, los grupos amino de las proteínas son PEGiladas, puesto que la proteína es el componente amino, y al menos uno de los otros componentes es un reactivo PEG. En escenarios 10 y 12, dos cadenas PEG están unidas por proteína, vía grupos amino y carboxilo. En los escenarios 9 y 10, en donde únicamente los grupos amino en la proteína son para ser reaccionados, en exceso de componente carboxilo de bajo peso molecular, tal como ácido acético como se muestra, se puede usar para suprimir reacciones de grupos carboxilo en la proteína. En una modalidad, el componente isonitrilo es isocianopropionato de etilo (C=NCH2CH2C (O) OEt) , como se muestra. Como se puede apreciar a partir del mecanismo mostrado en la Fig. 1, este componente se convierte en el conjugado a una porción ß-alanina (-NHCH2CH2C02Et) , el cual se puede detectar a través de análisis de aminoácido del producto de proteína conjugada. Tal análisis proporciona un significado conveniente para determinar la composición del conjugado y/o examinar la terminación de formación de los productos de conjugación (véase Ejemplos 5, 7, 10 y 11).

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos están propuestos para ilustrar, pero no para limitar la invención. Los ejemplos 1-4 ilustran procedimientos ejemplares para preparar cada componente de la reacción de conjugación como un polímero hidrofílico, ejemplificado en estos Ejemplos por PEG. Los ejemplos 5-16 ilustran protocolos de conjugación ejemplares, tal como aquellos resumidos en la Tabla 1 abajo. Cada uno de estos es un procedimiento de crisol que proporciona un conjugado de una biomolécula con un polímero hidrofílico, ejemplificado en estos Ejemplos por PEG. El ejemplo 16 ilustra un conjugado que incorpora residuos múltiples de ciertos componentes. Las biomoléculas en los Ejemplos incluyen un péptido de adhesión sintético derivado de laminina, albúmina de suero bovino (BSA) , eritropoyetina (EPO) y ácido hialurónico (HA) , un licosaminoglicano el cual se usa para tratamiento de trastornos de tejido conectivo.

Ejemplo 1. Preparación de derivados de PEG-isocianida (isonitrilo) El procedimiento general para conversión de mPEG- OH en mPEG-isonitrilo, descrito abajo para mPEG de peso molecular de 2000 Da (mPEG2?) , es igualmente aplicable a otros PEG de peso molecular.

A. Preparación de mPEG2?-NH3+CH3S03 (mesilato de mPEG amonio) Se disolvió mPEG2? mesilato (Harris et al., J.

Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 22:341 (1984)) (20 g, 9.62 mmol) en hidróxido de amonio acuoso (200 ml) en una botella de plástico y se agitó a 60°C por 48 horas. La solución se enfrió a temperatura ambiente, y el amoníaco se removió de la mezcla por evaporación. El residuo se liofilizó por 24 horas y se recristalizó usando isopropanol. El producto obtenido se secó bajo vacío sobre P205. El rendimiento de sal de amonio fue 91% (18.43 g) . 1ti RMN (DMSO-d6): 2.30 (s, 3H) , 2.97 (t, 2H), 3.23 (s, 3H) , 3.50 (vs, 180), 7.63 (bs, 3H) .

B. Preparación de mPEG2?-NH-CHO (mPEG formamida) Se preparó mesilato de mPEG2? amonio como se describe abajo (0.5 g, 0.238 mmol), se disolvió en formiato de etilo (10 ml) a 60°C. A esta solución se agregó trietil amina (0.133 ml, 0.954 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a 60°C por 24 horas, tiempo en el cual la CCD mostró terminación de la reacción. Se removió el exceso de formiato de etilo por evaporación, y el residuo se purificó por precipitación de isopropanol. El producto se secó bajo vacío sobre P205. El rendimiento fue 88% (0.425 g) . 1 RMN (DMSO-d6): 3.19-3.25 (m, 5H) , 3.5-3.53 (m, 176H) , 3.68 (t, 2H), 8.0 (s, ÍH), 8.03 (bs, 1H, intercambiable con D20) .

C. Preparación de mPEG2?~NC (mPEG isonitrilo) Se preparó mPEG2?-formamida como se describe anteriormente (0.2 g, 0.1 mmol), se disolvió en diclorometano (2 ml) y se enfrió a 0°C. A esta solución se agregó tetracloruro de carbono (38 µl, 0.3944 mmol) y trietilamina (137 µl, 0.986 mmol), y la solución se agitó a 0°C por 5 minutos bajo nitrógeno. Después se agregó tributil fosfina (98.26 µl, 0.3944 mmol) a 0°C. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 24 horas, tiempo durante el cual llegó a ser marrón oscura. El solvente se evaporó y el producto se purificó por precipitación de isopropanol. El rendimiento fue 88% (0.175 g) . IR (puro): 2150 (NC) , XH RMN (DMSO-d6): 3.23 (s, 3H) , 3.41-3.59 (m, 178H) , 3.68 (m, 2H) . Para preparar isocianida de mPEG-ciclohexilo, mPEG-OH fue el primero activado con carbonildiimidazol, y después se hizo reaccionar con exceso de 1,4-diaminociclohexano, siguiendo el procedimiento de la literatura de E. Ranucci y P. Ferrutti (Synth. Commun. 20: 2951 (1990) ) . La amina de mPEG-ciclohexilo resultante se convirtió a la isocianida en una manera similar a la descrita anteriormente para mesilato de mPEG-amonio.

Ejemplo 2. Preparación de derivados de PEG-aldehido Se prepararon derivados de mPEG-acetaldehído por procedimientos de la literatura (por ejemplo, Llanos and Sefton, Macromolecules 24:6065 (1991); S.M. Chamow et al., Bioconjugate Chem. 5:133 (1994)). El aldehido aromático mPEG-NHC (0) -C6H4-CH0 se preparó por reacción de mPEG-amina con 4-carbaldehído. Se adquirieron derivados de PEG-propionaldehído de Nektar Therapeutics, NOF Corporation, o SunBio Corporation.

Ejemplo 3. Preparación de derivados de mPEG-amino Se prepararon derivados de mPEG-amino siguiendo varios protocolos de la literatura (revisada en S. Zalipsky (1995b) ) . Por ejemplo, se preparó PEG-hidrazida como se describe en Zalipsky et al., WO 92/16555 (1992). Se preparó PEG-carbazida como se describe en Zalipsky & Menon-Rudolph (1997). Se prepararon derivados de éster de glicina como se describe en Zalipsky et al., J. Macromol. Sci. Chem. A21:839 (1984). Se prepararon derivados de amina aromática como se describe en D. Rozzell, Meth. Enzymol. 136:479 (1987); A. Pollak and G.M. Whitesides, J. Amer. Chem. Soc. 98:289 (1976); o M. Weber and R. Staddler, Polymer 29:1064 (1988) .

Ejemplo 4. Preparación de derivados de PEG-carboxilo Se prepararon derivados de PEG-carboxilo de conformidad con los protocolos de la literatura, como se revisó en S. Zalipsky (1995b), o se obtuvo de fuentes comerciales (Nektar Therapeutics, NOF Corporation, o SunBio Corporation) .

Ejemplo 5. Preparación de PEG-BSA utilizando RN = mPEG5?, RA = CH3, Ri = CH2CH2C02Et, y Rc = BSA. (véase escenario 2, Tabla 1) . En esta reacción, se conjugó PEG a alúmina de suero bovino (BSA) , la cual se empleó como el componente de carboxilo. Se empleó un componente de amina pKa bajo (mPEG2o?_carbazida) , a pH 5, para favorecer su reacción sobre la reacción en cadenas laterales amino en la proteína. Una solución de albúmina suero de bovino (1 mg/ml, 2 ml) en amortiguador MES (25 mM) ajustada a pH 5 se trató con «=20 veces el exceso molar de mPEG5K-carbazida (235 mg) , acetaldehído (1M en acetonitrilo, 50 µl) y finalmente isocianopropionato de etilo (1M en acetonitrilo, 50 µl) . La solución resultante se agitó durante la noche, después se dializó y se purificó adicionalmente por cromatografía de intercambio iónico. El producto se caracterizó por SDS-PAGE, MS y análisis de aminoácido.

Ejemplo 6. Preparación de ácido hialurónico PEG injertado (HA) utilizando RN = mPEG5?, RA = CH3, RS = CH2CH2C02Et, y Rc = HA. (véase escenario 4, Tabla 1) . En esta reacción, se conjugó PEG al ácido hialurónico (HA) , un polisacárido carboxilado, el cual se empleó como el componente carboxilo. Se disolvió hialuronato de sodio (Genzyme, Cambridge, MA, 6 mg 15 µmol de carboxilo) en agua (1.5 ml) y se acidificó con HCl a pH 4.5. A esta solución se agregó mPEG5K-carbazida (25 mg, 5 µmol) , seguido por soluciones de acetonitrilo de acetaldehído e isocianoacetato de etilo (0.1M, 50 µl, 5 µmol cada uno). La mezcla de reacción se agitó durante la noche y después se diafiltró extensivamente (MWCO 100 kDa) nuevamente agua destilada. Se determinó el contenido de PEG por integración 1H RMN de las señales de acetamida y oxietileno de HA y PEG, respectivamente a 2.0 y 3.7 ppm.

Ejemplo 7. Preparación de PEG-BSA utilizando RN = mPEG5?, RA = mPEG5?, Ri = CH2CH2CQ2Et, y c = BSA. (véase escenario 4, Tabla 1) . En esta reacción, se conjugaron dos moléculas de PEG a albúmina suero de bovino (BSA) , la cual se empleó como el componente de carboxilo. Se empleó un componente de amina pKa bajo (mPEG2o?_carbazida) , a pH 5, para favorecer su reacción sobre la reacción en cadenas laterales de aminoácido en la proteína. Dos derivados de mPEG5?, que portan grupos terminales de carbazida y aldehido, respectivamente (250 mg 50 µmol cada uno) , se condensaron en solución de acetonitrilo (2 ml) para formar un (mPEG) 2-carbazona, el primer intermediario en la reacción de condensación del cuarto componente. El solvente se removió por evaporación, y se agregó una solución de albúmina suero de bovino (BSA, 1 mg/ml, 2 ml) en amortiguador MES (25 mM) ajustada a pH 5, seguido por isocianatopropionato de etilo (1M en acetonitrilo, 50 µl) . La solución de reacción se agitó durante la noche, y el producto se dializó y después se purificó adicionalmente por cromatografía de intercambio iónico. El producto se caracterizó por SDS-PAGE, MS y análisis de aminoácido.

Ejemplo 8. Preparación de PEG-BSA utilizando RN = mPEG5?, RA = CH3, Rx = PEGsK y Rc = BSA. (véase escenario 5, Tabla 1) . En esta reacción, se conjugaron dos moléculas de PEG a albúmina suero de bovino (BSA) , la cual se empleó como el componente carboxilo. Se empleó un componente amina pKa bajo (mPEG2o?_carbazida) , a pH 5, para favorecer su reacción sobre la reacción en cadenas laterales de amino en la proteína. Se trató una solución de albúmina suero de bovino (1 mg/ml, 2 ml) en amortiguador MES (25 mM) ajustada a pH 5 con * 20 veces exceso molar de mPEGs?-carbazida (235 mg) , acetaldehído (1M de solución en acetonitrilo, 50 µl) , y finalmente mPEGs?-NC (250 mg) . La solución resultante se agitó durante la noche, después se dializó, y se purificó adicionalmente por cromatografía de intercambio iónico. El producto se caracterizó por SDS-PAGE y MS.

Ejemplo 9. Preparación de ácido hialurónico (HA) PEG injertado utilizando RN = mPEG5?, RA = CH3, Rt = mPEG5? y Rc = HA. (véase escenario 5, Tabla 1) . En esta reacción, se conjugaron dos moléculas PEG a ácido hialourónico (HA) , un polisacárico carboxilado, el cual se empleó como el componente carboxilo. Se disolvió sal de sodio HA (6 mg, 15 µmol de carboxilo) en agua (1.5 ml) y acidificó con HCl a pH 4.5. A esta solución se agregó mPEG5?-carbazida (25 mg, 5 µmol) , seguido por solución de acetonitrilo AN de acetaldehído (0.1 M, 50 µl, 5 µmol) y finalmente por mPEG5?-isonitrilo (30 mg) . Se determinó el contenido de PEG por integración H RMN de las señales de acetamido y oxietileno de HA y PEG, respectivamente, a 2.0 y 3.7 ppm.

Ejemplo 10. Preparación del conjugado mPEG-YIGSR-NH2 utilizando RN = mPEG2o?, RA = YIGSR-NH2, Ri = CH?CH?CO?Et, y Rc = CH3. (véase escenario 6, Tabla 1) . En esta reacción, se conjugó mPEG a YIGSR (un derivado de adhesión sintética derivado de laminina) el cual se derivatizó con un grupo aldehido a su N-término. El péptido TYIGRS-NH2 (5 mM, 0.450 ml) en amortiguador de fosfato (10 mM, pH 7) se trató con una solución fresca de peryodato de sodio en agua (100 mM, 50 µl) por 5 minutos a 4°C en la oscuridad, y se apagó con sulfito de sodio (200 mM, 50 µl) . La solución resultante se mezcló con solución mPEG20?_carbazida (0.45 g, 22 µmol) en amortiguador de acetato (0.5 M, 1 ml, pH 4.5). Se agregó isocianopropionato de etilo (C=NCH2CH2C02Et ) en acetonitrilo (250 mM, 0.1 ml, 25 µmol), y la solución resultante se incubó durante la noche a temperatura ambiente. El producto se purificó por diálisis seguido por cromatografía de intercambio iónico y se caracterizado por MS . Se confirmó la conjugación N-terminal secuencialmente y análisis de aminoácido.

Ejemplo 11. Preparación de PEG-EPO utilizando RN = mPEG20?, RA = glicano de EPO, Rt = CH2CH2C02Et, y Rc = CH3. (véase escenario 6, Tabla 1) . En esta reacción, se conjugó mPEG a EPO (eritropoyetina) el cual ha sido tratado con peryodato para producir • grupos funcionales carbonilo en la porción glicano de la molécula. Se usó un componente de amina pKa bajo (mPEG20?_carbazida) para favorecer su reacción sobre la reacción en cadenas laterales de aminoácido en la proteína. Se trató una solución de eritropoyetina (EPREX®, 0.76 ml, 1 mg) en amortiguador de acetato de sodio (0.2 M, pH 5.0) con peryodato de sodio (80 mM, 40 µl) por 10 minutos a 4°C en la oscuridad. El exceso de peryodato se apagó con sulfito de sodio (300 mM, 20 µl) . Se agregó mPEG2o?""carbazida (20 mg, 1 µmol), seguido por isocianopropionato de etilo (20 mM, 50 µl, 1 mmol) en acetonitrilo. La mezcla de conjugación resultante se incubó por 24 horas a temperatura ambiente. El conjugado se purificó por cromatografía de intercambió iónico y se caracterizó por MS, análisis de aminoácido y SDS-PAGE. Se confirmó la conjugación de glicano específico por determinación del contenido de oligosacárido.

Ejemplo 12. Preparación del conjugado mPEG-YIGSR utilizando RN = mPEG5?, RA = YIGSR-NH2, Ri = mPEG5? y Rc = CH3. (véase escenario 7, Tabla 1). En esta reacción, se conjugaron dos moléculas de mPEG a YIGSR (un péptido de adhesivo sintético derivado de laminina) el cual se ha derivatizado con un grupo aldehido a su N-término. El péptido TYIGSR-NH2 (5 mM, 0.450 ml) en amortiguador de fosfato (10 mM, pH 7) se trató con una solución fresca de peryodato de sodio en agua (100 mM, 50 µl) por 10 minutos a 4°C en la oscuridad, después se apagó con sulfito de sodio (200 mM, 50 µl) . La solución resultante se mezcló con solución mPEG5?-carbazida (110 mg, 22 µmol) en amortiguador de acetato (0.5 M, 1 ml, pH 4.5). Se agregó un derivado de PEG-isonitrilo (mPEGsR-NC, 125 mg, 25 µmol), preparado como se describe en el Ejemplo 1, y la solución resultante se incubó durante la noche a temperatura ambiente. El producto se purificó por diálisis seguido por cromatografía de intercambio iónico y caracterizado por MS. Se confirmó la conjugación N-terminal por secuenciamiento y análisis de aminoácido.

Ejemplo 13. Preparación de PEG-EPO utilizando RN = mPEG5?, RA = EPO glicano, Rt = mPEG5 y Rc = CH3. (véase escenario 7, Tabla 1) . En esta reacción, se conjugaron dos moléculas mPEG a EPO (eritropoyetina) el cual ha sido tratado con peryodato para producir grupos funcionales aldehido en la porción glicano de la molécula. Como anteriormente, se usó un componente amina pKa bajo (mPEG2o?-carbazida) para favorecer su reacción sobre la reacción en cadenas de aminoácido en la proteína. Se trató una solución de eritropoyetina (EPREX®, 0.76 ml, 1 mg) en amortiguador de acetato de sodio (0.2 M, pH 5.0) con peryodato de sodio (80 mM, 40 µl) por 10 minutos a 4°C en la oscuridad. El exceso de peryodato se apagó con sulfito de sodio (300 mM, 20 µl) . Se agregó MPEG5?-carbazida (100 mg, 1 µmol), seguido por mPEG5?-isonitrilo (100 mg, 1 µmol). La mezcla de conjugación resultante se incubó por 24 horas a temperatura ambiente. El conjugado se purificó por cromatografía de intercambio iónico y se caracterizó por MS, y SDS-PAGE. La conjugación de glicano específico se confirmó por la determinación del contenido de oligosacárido.

Ejemplo 14. Preparación de PEG-BSA utilizando RN = CH3, RA = H, Rt = mPEG5?, y Rc = BSA. (análogo al escenario 1, Tabla 1) • En esta reacción, se conjugó PEG a albúmina suero de bovino (BSA) , el cual se empleó como el componente carboxilo. Se empleó un exceso de componente de amina de bajo peso molecular (metilamina), a pH 4.5, para favorecer su reacción sobre la reacción en cadenas laterales de amino en la proteína. Específicamente, se disolvieron 6 mg de BSA (0.09 µmol) en 860 µl de H20, y el pH se ajustó a 4.5 con 0.25 M de HCl (~ 5 µl) . Se agregaron formaldehído (9 µmol, 100 veces en exceso) y metilamina (9 µmol, 100 veces en exceso), seguido por mPEGs?N=C (5 mg, 1 µmol, 11.11 veces en exceso) . Se retiraron un total de seis muestras de 25 µl, a 5 min., 10 min., 1 hora, 4 horas, 7.5 horas y 24 horas, y cada una se agregó inmediatamente a 230 µl de amortiguador de acetato de sodio 2M (pH 4.5, ca. 2 x 105 veces en exceso sobre BSA) para detener la reacción. La composición del producto de cada una de estas etapas se caracterizó por SDS-PAGE. La cantidad de productos de conjugado de PEG-proteína se incrementaron con el tiempo, y esencialmente todos el BSA de partida se consumió por el punto de tiempo 7.5 horas.

Ejemplo 15. Preparación de PEG-lisozima utilizando RN = CH3, RA = H, Ri = mPEG5?, y Rc = hisozima. (análogo al escenario 1, Tabla 1). En esta reacción, se conjugaron PEG a lisozima, el cual se empleó como el componente carboxilo. Se empleó un exceso del componente de amina de bajo peso molecular (metil amina), a pH 4.5, para favorecer su reacción sobre la reacción en cadenas laterales de amino en la proteína. Específicamente, se disolvieron 1.4 mg de lisozima (0.09 µmol) en 860 µl de H20, y el pH se ajustó a 4.5 con 0.25 M de HCl (~5 µl) . Se agregaron formaldehído (9 µmol, 100 veces en exceso) y metilamina (9 µmol, 100 veces en exceso), seguido por mPEG5?N=C (5 mg, 1 µmol, 11.11 veces en exceso) . Se retiraron un total de seis muestras de 25 µl, a 5 min., 10 min., 1 hora, 4 horas, 7.5 horas y 24 horas, y cada una se agregó inmediatamente a 230 µl de amortiguador de acetato de sodio 2M (pH 4.5, ca. 2 x 105 veces en exceso sobre BSA) para detener la reacción. Se corrieron dos reacciones adicionales, una usando 3.1 mg (0.2 µmol) y la otra usando 7.74 mg (0.5 µmol) de lisosoma. Se descargaron cantidades de otros reactivos y condiciones de reacción. Las muestras se purificaron por diálisis con 7000 MWCO unidades de Mini diálisis (Slide-A-Lyzer®, 50 unidades) nuevamente PBS (4 1, pH 7.4) a 4°C durante la noche. La composición del producto de cada muestra se caracterizó por SDS-PAGE. La cantidad de los productos de conjugado de PEG-proteína se incrementaron con el tiempo en cada reacción, aunque algunas proteínas permanecen sin reaccionar a 24 horas, y hay evidencia de alguna formación de dímeros y trímeros de proteína.

Ejemplo 16. Preparación de Conjugados de ácido PEG-PPO-hialurónico: RN = PPO, RA = H, Rt = mPEG2?, y Rc = ácido hialurónico (análogo al escenario 5, Tabla 1) .

PPO-enlazador-NH? H(CO)H mPEG-N=C Ácido hialurónico (sal) 4 (a) Se agregó agua (6 ml) a hialuronato de sodio (32 mg, 0.08 mmol), y la solución se agitó a temperatura ambiente hasta ser clara (aproximadamente 30 minutos) . Se agregó formaldehído (6 µl, 0.08 mmol, 37% en H20) a la solución, seguido por óxido de polipropileno amino-funcionalizado (PPO-C6H4-CH (CH3) -NH2, 150 mg, 0.08 mmol en MeOH (12 ml) . La solución resultante se acidificó ligeramente con 2N de HCl (~36 µl) para obtener un pH de 3-3.5. Se agregó mPEG isonitrilo (mPEG2ooo-NC, 168.08 mg, 0.08 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 50 horas, resultando en una solución marrón ligera clara, la cual después se liofilizó. El residuo similar a gel se extrajo con CH2C12 para remover PPO y PEG sin reaccionar, y el producto se filtró y se secó bajo vacío sobre P205. Rendimiento: 36 mg (10%). 1ti RMN (D20) d: 1.02 (br, s CH3 (polímero PPO), 90H) , 1.88 (s, CH3CONH (HA), 3H) , 3.4-3.57 (m, PEG * 9 HA picos de protón, 189H), 6.95 (d, C6H4, 2H) , 7.3 (d, C6H4, 2H) . El análisis indica un conjugado que tiene aproximadamente 16-17 HA repitiendo unidades por PPO/PEG; es decir, m+n en la anterior estructura igualado a aproximadamente 16-17. Por lo tanto, en este conjugado, residuos múltiples de RA, Ri y RN se conjugan al residuo RC, representado por el polímero del ácido hialurónico. (La descripción de la anterior estructura no significa que implica que las porciones PPO/PEG son necesariamente distribuidas uniformemente a lo largo de la cadena del polímero HA) . Las reacciones similares se realizaron con variaciones en las condiciones de reacción, como sigue. (b) Repitiendo las condiciones de reacción anteriores, pero agitando por un periodo corto de tiempo (24 h) , se produce un conjugado (28 mg) que tiene aproximadamente 21-25 HA unidades de repetición por porción PPO/PEG. (c) En una reacción adicional, las condiciones originales de (a) se siguieron, con la excepción que el pH se ajustó a un valor mayor (4-4.5). Esta reacción produce un conjugado (18 mg) que tiene aproximadamente 10-11 HA de unidades de repetición por porción PPO/PEG. (d) En una reacción adicional, el óxido de polipropileno amino-funcionalizado (PPO-NH2) y formaldehído primero se combinaron y se agitaron por 2 horas, seguido por la adición del hialuronato de sodio. La reacción después se dejó proseguir como se describe en las condiciones originales (a) anteriores. Esta reacción produjo un conjugado (33 mg) que tiene aproximadamente 11-14 HA de unidades de repetición por porción PPO/PEG. (e) Finalmente, las condiciones de (d) se siguieron, con la excepción que el pH se ajustó a un valor mayor (4-4.5). Esta reacción produjo un conjugado (71.6 mg) que tiene aproximadamente 1-2 HA de unidades de repetición por porción de PPO/PEG. Los resultados anteriores muestran una tendencia en la cual la reacción a pH mayor produce un nivel mayor de conjugación de PPO/PEG al polímero HA. La pre-reacción de la amina y componentes de aldehido antes de la adición del HA y PEG-isonitrilo tiene una similar pero menos efecto pronunciado.

Claims (42)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar un conjugado de una proteína o polipéptido con un polímero soluble en agua, caracterizado porque comprende: hacer reaccionar componentes (a)-(d) siguientes: (a) RA-C(0)R', en donde R' es H o alquilo inferior, (b) RN-NH2, (c) Rc-C(0)OH, y (d) R?-NC. para formar un producto conjugado que incorpora al menos, una de cada porción representada por RA, RN, Rc y RS; en donde al menos uno de (a)-(c) es una proteína o polipéptido, al menos uno de (a)-(d) es un polímero soluble en agua, y cualquiera de los componentes restantes de (a)-(d) son compuestos no interferentes, estables.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho producto conjugado es de la forma RSNH-C (0) -R' RA-NRN-C (0) Rc.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha proteína o polipéptido se selecciona de (a) RA-C(0)R', (b) RN-NH2, y (c) Rc-C(0)0H.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque dicha proteína o polipéptido es (a) RA-C(0)R' .

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho polímero se selecciona de (a) RA-C(0)R'; (b) RN"NH2, y (c) Rc-C00H.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho polímero es Ri-NC.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho polímero es polietilenglicol funcionalizado (PEG) .

8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque dicho polímero es un compuesto PEG-isonitrilo.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha proteína o polipéptido es representado por al menos, un componente seleccionado de (a)-(c), dicho polímero es representado por al menos un componente diferente seleccionado de (a)-(d), y cualquiera de los componentes restantes de (a)-(d) se seleccionan de porciones etiquetantes, porciones objetivo y otros compuestos no interferentes, estables.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha proteína o polipéptido es un componente seleccionado de (a)-(c), dicho polímero es un componente diferente seleccionado de (a)- (d) , y los componentes restantes de (a)-(d) son compuestos no interferentes, estables.

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos uno de los componentes (a)-(d) comprende una pluralidad de compuestos.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha proteína o polipéptido es un componente seleccionado de (a)-(c), dicho polímero es representado por dos diferentes componentes seleccionados de (a)-(d), y el componente restante es un componente no interferente, estable.

13. Un método para preparar una composición farmacéutica, caracterizado porque comprende, en un vehículo farmacéutico, un conjugado de molécula biológicamente activa con un polímero biocompatible, el método comprende: (i) hacer reaccionar componentes (a)-(d) siguientes : (a) RA-C(0)R', en donde R' es H o alquilo inferior, (b) RN-NH2, (c) Rc-C(0)OH, y (d) Rx-NC, para formar un producto conjugado que incorpora al menos, una de cada porción representada por RA, RN, Rc y Ríen donde al menos uno de los componentes (a)-(d) designado RM, es una molécula biológicamente activa, al menos uno de los componentes (a)-(d), designado RP, es un polímero biocompatible, y cualquiera de los componentes restantes (a)-(d) son compuestos no interferentes, estables; y (ii) formular el conjugado o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en un vehículo farmacéutico.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho conjugado es de la forma R?NH-C (O) -CRAR' -NRN-C (O) Rc.

15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque dicha molécula biológicamente activa se selecciona de (a) RA-C(0)R', (b) RN-NH2, y (c) Rc-C(0)OH.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque dicha molécula biológicamente activa es RA-C(0)R'.

17. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho polímero es soluble en agua.

18. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho polímero es (d) Ri-NC.

19. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho polímero es un óxido de polialquileno funcionalizado (PAO) .

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque dicho polímero es un polietilenglicol (PEG) funcionalizado de isonitrilo.

21. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque dicho polímero es un polietilenglicol (PEG) que tiene una funcionalidad amina o carbonilo disponible.

22. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque dicha molécula es representada por al menos, un componente seleccionado de (a)-(d), dicho polímero es representado por al menos un componente diferente seleccionado de (a)-(d), y cualquiera de los componentes diferentes de (a)-(d) se seleccionan de porciones etiquetantes, porciones objetivo y otros componentes no interferentes, estables.

23. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque dicha molécula es un componente seleccionado de (a) - (d) , dicho polímero es un componente diferente seleccionado de (a)-(d), y los componentes restantes de (a)-(d) son compuestos no interferentes, estables.

24. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho vehículo es un vehículo acuoso.

25. Un conjugado soluble en agua de la forma R?NH-C(O) -CHRA-NRN-C(0)Rc, en donde al menos uno de RA, RN y Rc es una proteína o polipéptido, al menos uno de Ri, RA, RN y Rc es un óxido de polialquileno (PAO) ; y los elementos restantes de RIf RA, RN y Rc son seleccionados independientemente de porciones etiquetantes, porciones objetivo y R, en donde R es hidrógeno o una porción orgánica estable que tiene 1-8 átomos de carbono y 0-4 heteroátomos seleccionados de oxígeno, nitrógeno y azufre.

26. El conjugado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque los elementos restantes de RA, RN y Rc son independientemente modalidades de R, con la condición de que Rt no sea hidrógeno.

27. El conjugado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque Rt es PEG.

28. El conjugado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque R es una proteína, Ri es PEG, y RA y RN son seleccionados independientemente de porciones etiquetantes, porciones objetivo y R.

29. El conjugado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque Rc es una proteína, RN es PEG, y RA y Ri son seleccionados independientemente de porciones etiquetantes, porciones objetivo y R, con la condición de que Ri no sea hidrógeno.

30. El conjugado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque Rc es una proteína, cada uno de RN y RA es PEG, y Rt es una porción etiquetante, una porción objetivo, o R, con la condición de que Rt no sea hidrógeno.

31. El conjugado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque Rc es una proteína, RN es PEG, R;[ es PEG, y RA es una porción etiquetante, una porción objetivo, o R.

32. El conjugado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque RA es una proteína, RN es PEG, y Rc y Ri son seleccionados independientemente de porciones etiquetantes, porciones objetivo y R, con la condición de que Rl no sea hidrógeno.

33. El conjugado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque RA es una proteína, RN es PEG, Rt es PEG, y EC es una porción etiquetante, una porción objetivo, o R.

34. Un compuesto caracterizado porque tiene la estructura RCAp (OCHR"CH2) n-X-N=C, en donde RCAP es un grupo de extremo tapado estable, X representa un enlace directo o una porción enlazante estable, R" es H o metilo, y n es un número entero entre 10 y aproximadamente 2300.

35. El compuesto de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque RCAP es alquilo, acilo o arilo.

36. El compuesto de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque RCAP es metilo.

37. El compuesto de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque R" es H.

38. El compuesto de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la porción (OCH2CH2)n- tiene un peso molecular de aproximadamente 5000 Daltons .

39. El compuesto de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la porción (OCH2CH2)n- tiene un peso molecular de aproximadamente 20000 Daltons .

40. El compuesto de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque X consiste de enlaces seleccionados de alquilo, arilo, cicloalquilo, éter, amida, lineales o ramificados, y combinaciones de los mismos .

41. El compuesto de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque X consiste de enlaces seleccionados de alquilo inferior, cicloalquilo, arilo y combinaciones de alquilo inferior y arilo y arilo o alquilo inferior y cicloalquilo.

42. El compuesto de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque X es ciclohexilo.