KR100761652B1 - 단백질 또는 펩타이드에 결합되는 다가지의 고분자유도체와 접합체 - Google Patents

단백질 또는 펩타이드에 결합되는 다가지의 고분자유도체와 접합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 또는 펩타이드에 결합되는 다가지의 고분자 유도체 및 접합체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 고분자를 활성화하여 고반응성의 가지가 3개 달린 고분자 유도체를 합성하고, 그 유도체에 단백질이나 펩타이드에 연결되는 연결쇄를 접합시키므로써 얻어지는 단백질-고분자 또는 펩타이드-고분자 접합체에 관한 것으로 고분자 유도체가 단백질의 생리활성 부위에 결합하는 수가 적게 되어 단백질의 생리활성 감소를 최소화하면서 생체내 용해도를 증가시키고, 생체내 효소에 의한 분해로부터 분자구조를 보호하고 소실을 연장하여 단백질의 체내활성이 장시간 유지되며, 활성 단백질 또는 펩타이드의 생체 이용율을 높일 수 있다.
단백질, 펩타이드, 다가지 고분자, 유도체, 접합체

Description

단백질 또는 펩타이드에 결합되는 다가지의 고분자 유도체와 접합체{multi-branched polymer used in conjugating protein or peptide, and resulting conjugator}
본 발명은 단백질 또는 펩타이드에 결합되는 다가지의 고분자 유도체 및 접합체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 고분자를 활성화하여 고반응성의 가지가 3개 달린 고분자 유도체를 합성하고, 그 유도체에 단백질이나 펩타이드에 연결되는 연결쇄를 접합시키므로써 얻어지는 단백질-고분자 또는 펩타이드-고분자 접합체에 관한 것이다.
최근들어 산업적으로 급격히 발전되고 있는 화학적, 유전공학적 기법에 의해 많은 효소(enzyme), 단백질(protein), 호르몬(hormone) 및 펩타이드(peptide)들이 대량으로 생산되어 특이적 생체촉매 작용을 하는 생체촉매(biocatalysts) 또는 의약품으로 개발되고 사용되고 있으나, 이러한 단백질 또는 펩타이드를 의약품으로 사용하는데는 많은 제약이 있다. 이러한 제약들로는 첫째, 낮은 안정성(stability)과 빠른 체내 소실(clearance)이 문제가 되는데, 많은 단백질들은 생체내로 투여되었을 때 순환계(circulation)에서 빠르게 소실(clearance)되며, 또한 효소에 의해 단시간에 파괴되거나 쉽게 가수분해된다. 둘째, 반복적인 투여에 의해 면역반응이 유도되어 항체가 생성되고 이 항체에 의해 과민반응(hypersensitivity)이 유발되어 생명을 위협하기도 한다. 또한 망상세포의 내피계(reticuloendothelial system, RES)에 의해 소실이 증가하게 되며, 이러한 문제는 자연적인 생산물뿐만 아니라 기초 구조가 같은 제조된 단백질에서도 나타난다.
지금까지 대부분의 단백질 또는 펩타이드 약물은 주로 주사제로 투여되고 있으며, 투여횟수는 1일 1회 또는 주 3회 등의 잦은 빈도로 투여되어 왔다. 약물의 빈번한 투여는 환자에게 고통을 줄 뿐만 아니라, 특히 장기간 치료가 필요한 환자에 있어서는 양질의 생활을 유지하기가 어려웠다. 따라서 상기와 같은 문제점이 개선된 보다 안정적이고 장기적으로 활성을 유지하는 약물의 개발이 요구되고 있다.
단백질 치료제의 대부분은 혈중에서의 짧은 반감기로 인하여 지속적인 임상 효능을 기대하기 어려운 면이 있다. 단백질 또는 약리 활성을 갖는 분자를 고분자와 결합시키는 것은 생체내(in vivo) 및 생체외(in vitro) 적용시 많은 이점을 제공할 수 있다. 생리활성 분자에 대한 고분자의 공유결합은 생체 내에서의 안정성을 증가시킬 뿐만 아니라 장관 시스템, 신장(kidney), 비장(spleen) 또는 간(liver)에 의한 소실을 연장시킬 수 있으며, 생체적합성(biocompatibility)을 증가시켜서 면역 반응성을 감소시킬 수 있게 된다. 또한 분자의 표면특성 및 용해성을 변화시켜서 물 또는 유기용매에 대한 용해도를 증가시킬 수 있다.
최근에는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, 이하 "PEG"라 칭한다.)-결합 생체분자가 임상적으로 유용한 특성을 갖는 것으로 나타났다. PEG-결합 생체분자가 증가된 물리적, 열적 안정성과 용해도를 가지고, 효소에 의해 쉽게 분해되는 것을 예방하고, 생체내 순환 반감기가 길어지며 제거율이 감소되는 여러 가지의 유익한 효능이 있는 것으로 보고되고 있다. 특히 생체내에서의 고분자의 제거는 그 분자량에 반비례 한다는 사실이 알려져 있다[Inada 등, J. Bioact and Compatible Polymers 5, 343(1990); Delgado 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9, 249(1992); Katre, Advanced Drug Delivery Systems 10, 91(1993)].
아부초브스키 등은 PEG와 결합된 여러 가지 단백질들이 혈장에서 체내 반감기가 증가되고 면역원성이 감소됨을 증명하였으며, 또한 데이비스 등은 유리카제(uricase)가 PEG와 결합하면 체내 반감기가 증가되고 요산의 대사시 부작용이 감소됨을 증명하였다[Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys., 7, 175-186, 1984; Davis et al., Lancet, 2, 281-283, 1981].
미국특허 제4179337호는 단백질과 폴리펩타이드(polypeptide)를 분자량이 500∼20,000의 PEG 또는 수용성 폴리머에 결합시켜 생물학적 활성을 유지하면서 항원성과 면역원성이 감소된 단백질-고분자 결합체에 대해 언급하였다.
Monfardini 등은 PEG-단백질 결합체에서 가지 달린 PEG 결합체는 선형 PEG 결합체보다 pH와 열적 안정성이 증가하고, 단백 분해 효소에 대한 안정성이 크게 증가한다는 것을 증명하였고, PEG-단백질의 경우는 면역원성 및 항원성 뿐만 아니라 독성도 감소됨을 보고하였다[Bioconjugate Chem. 6, 62, 1995].
단백질 또는 펩타이드에 PEG를 결합시키는데는 여러 가지 방법이 있는데, 단백질 또는 펩타이드의 아미노(amino) 잔기, 올리고당의 히드록시기에 활성화된 PEG를 결합시키는 방법이 있다.
활성화된 PEG와 결합하는 단백질 또는 펩타이드의 아미노 잔기로는 라이신(lysine)기와 N-말단을 들 수 있으며, PEG를 활성화시키는 방법은 다음과 같다. PEG의 한쪽 하이드록시기(hydroxy group)을 메칠 에테르기(methyl ether group)로 치환시키고, 나머지 한쪽 하이드록시기에 친전자성 물질(electrophile)을 함유한 작용기를 결합시킨다. 활성화된 고분자의 예로는 아마이드 결합(amide bond)을 가진 PEG-N-하이드록시석신이미드-활성화된 에스테르(PEG-N-Hydroxysuccinimide-activated esters), 알킬 결합(alkyl bond)을 가진 PEG-에폭사이드(PEG-epoxide)와 PEG-트레실레이트(PEG-tresylate), 우레탄 결합(urethane bond)을 가진 PEG-카보닐이미다졸(PEG-carbonyl imidazole), PEG-니트로페닐 카보네이트(PEG-nitrophenyl carbonates) 및 N-말단에 쉬프 베이스(Schiff base)를 가진 PEG-알데하이드(PEG-aldehyde) 등이 있다.
일반적으로 단백질을 수식하는 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(monomethoxy polyethylene glycol, 이하 "mPEG"라 칭한다.)은 선형 고분자로서 분자량은 1,000 내지 20,000 정도의 것이 사용되고 있다. 그런데, 단백질 또는 펩타이드의 생리활성 부위는 한정되어 있으므로, 활성을 유지하면서 다수의 선형 고분자를 상기 단백질 등에 접합시키는 데에는 한계가 있다. 특히 저분자량의 단백질의 경우 상대적으로 생리활성부위가 적어 고분자의 접합에 의해 급격히 활성이 저하되는 문제가 있다. 이에 단백질의 활성을 유지하면서 다수의 고분자 물질을 결합시키는 방법에 대한 연구가 진행되어 왔다. 기존의 선형 고분자를 접합시키는 방법은 이용하는데 한계가 있으므로 이를 극복하기 위하여 같은 분자량을 가지고 있으나 가지 달린 mPEG를 만드는 방법이 시도되었는데 이러한 방법은 와나 등의 보고에 따른 것으로서, 트리클로로트리아진(trichlorotriazine)을 이용하여 가지가 2개 달린 mPEG 유도체를 합성하고, 이를 사용하여 단백질에 접합하는 것이 기재되어 있다[Wana, H et al.,Ann. NY. Acad. Sci. 613, 95-108, 1990].
최근에는 분자량 20,000의 mPEG 2개를 가지로 연결한 mPEG 고분자 유도체를 만드는 방법을 개발하여, 이를 사용하여 인터페론(Interferon)에 접합시켜 이 PEG-인터페론을 개발하였다는 특허가 있다[미합중국특허 제5932462호].
그러나 상기한 바와 같은 활성화된 가지 달린 고분자들도 아직까지 그 크기가 거대하여 수식된 단백질의 표면에 입체적 장애(steric hindrance)를 유발함으로써 단백질의 활성을 떨어뜨리는 문제가 있다.
이에, 본 발명자는 상기한 문제점을 해결하고자 고분자 유도체에 연결쇄(linker)를 연결하여 단백질에 접합시킴으로써 생리활성부위를 방해하는 입체적 장애의 문제점을 최소화하여 생리활성의 감소를 극소화시키고, 보다 가지를 증가시켜 단백질에 대한 고분자의 크기를 증가시킴으로써 입체적 장애를 줄이는 동시에 생체내의 소실 속도를 감소시켜 작용 지속 시간을 증가시킬 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 가지가 3개 달린 생체적합성 고분자 유도체를 합성하고 이 유도체에 연결쇄를 연결한 가지가 4개 달린 고반응성의 고분자 유도체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 고분자 유도체를 이용하여 단백질 또는 펩타이드 고유의 활성을 유지한 단백질-고분자 또는 펩타이드-고분자 접합체를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 목적은 가지가 3개 달린 생체적합성 고분자 유도체를 합성하고 이 유도체에 연결쇄를 연결한 가지가 4개 달린 고반응성의 고분자 유도체를 제공한다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 고분자 유도체를 이용하여 단백질 또는 펩타이 드 고유의 활성을 유지한 단백질-고분자 또는 펩타이드-고분자 접합체를 제공한다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1의 구조를 가진 다가지의 고분자 유도체를 포함한다.
Figure 112001021429249-pat00001
상기식에서,
R1, R2 및 R3는 서로 독립적이며, C1∼C6인 알콕시기이고,
n1, n2 및 n3는 100∼500의 정수이며, 바람직하게는 200∼500의 정수이며,
Z는 활성기를 나타낸다.
상기 화학식 1은 고분자인 RCH2CH2(OCH2CH2)n가 3 개 이상 결합된 가지 달린 구조를 갖는 활성화된 고분자이다.
상기 고분자는 자연적이거나 합성에 의한 수용성 물질로서, 그 종류는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG), 폴리락트산(polylatic acid), 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol), 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene, POE), 폴리 비닐 알콜(polyvinyl alcohol), 폴리우레탄(polyurethane) 및 폴리알킬렌 옥사이드(polyalkylene oxide, PAO) 등의 수용성 고분자 및 덱스트란(dextran), 폴리아크릴 아마이드(polyacryl amide) 등의 비면역성 고분자 등이 사용될 수 있다.
선형고분자의 분자량은 클수록 고분자 접합체의 약동력학은 개선되나 활성은 감소하게 된다. 가지 달린 고분자의 경우에는 이러한 활성의 감소는 완화시킬 수 있으나 현재 선형고분자의 합성이 분자량 20,000 정도로 한계가 되어있기 때문에 본 발명에서는 가지 달린 고분자 유도체의 합성에 사용되는 선형고분자의 분자량은 1,000∼20,000이며, 바림직하게는 3,000∼20,000이다.
또한, 상기 화학식 1에서의 활성기를 나타내는 Z는 단백질 또는 펩타이드와 결합하는 연결쇄의 역할을 하여 고반응성의 고분자 유도체를 제공하는 것으로서, 바람직하게는 COONHS 또는 CONHCH2CH2(OCH2CH2)n4OCOONHS이며, 이 때 n4는 50∼500의 정수이며, 바람직하게는 50∼250의 정수이다. 활성화된 가지 달린 고분자 유도체의 연결쇄로 사용되는 고분자는 분자량이 바람직하게는 1,000∼10,000을 사용한다.
본 발명은 상기 화학식 1의 가지 달린 고분자 유도체의 제조방법을 포함한다.
이하 본 발명에서 사용된 고분자로 모노메톡시 폴리에틸렌글리콜(monomethoxy polyethylene glycol, 이하 "mPEG"라 칭한다.)를 사용하였으며, N-하이드록시석신이미드 에스테르로 치환시켜 활성화시키는 반응식을 하기 반응식 1과 반응식 2에 나타내었다.
Figure 112001021429249-pat00002
Figure 112001021429249-pat00003
상기 반응식 1은 3 개의 가지를 갖는 활성화된 고분자 유도체(이하 "Tri-PEG"라 칭한다.)의 합성과정을 단계적으로 나타낸 것으로, 상기 화학식 1의 가지 달린 고분자 유도체를 합성하기 위해서는 생체적합성 고분자가 활성화된 형태를 갖추도록 하여야 한다. 이를 위해서 고분자 유도체의 말단 작용기는 N-하이드록시석신이미드 에스테르(N-hydroxysuccinimide ester, NHS)로 치환시켜 활성화시켰다. 또한, 단위 PEG를 Lys-Lys-HCl을 사용하여 3개의 가지를 갖는 고분자 유도체를 제조한다.
상기 반응식 2는 활성화된 4개의 가지를 갖는 활성화된 고분자 유도체(이하 "Tetra-PEG"라 칭한다.)를 합성하는 과정을 나타낸 것으로서, 활성화된 Tri-PEG의 Lys-Lys 말단에 긴 사슬의 활성화된 생체적합성 고분자를 단백질 또는 펩타이드에 대한 연결쇄로 사용하기 위해 제조한다.
또한, 본 발명은 다가지 고분자 유도체를 단백질 또는 펩타이드와 결합시켜 제조되는 단백질-고분자 또는 펩타이드-고분자 접합체를 포함한다.
단백질 또는 펩타이드와 고분자의 결합에서 펩타이드 내 결합부위는 라이신의 아민기나 N-말단부위이며, 상기 단백질 또는 펩타이드는 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 염기성 섬유아세포 성장 인자 또는 호종구 생성 자극 인자를 사용한다.
상기 단백질 또는 펩타이드와 활성화된 고분자 유도체의 반응 몰비는 고분자 유도체:단백질 또는 펩타이드에 대해 1:1에서 1:50이며, 바람직하게는 1:5내지 1:20이다.
본 발명의 고반응성 고분자 유도체에 단백질이나 펩타이드와의 접합체는 단백질이나 펩타이드 본래의 활성을 최대한 유지하면서 또한 체내로부터의 소실 및 분해를 더욱 감소시킨다. 일 예로 가지 달린 고분자 유도체-인터페론 접합체의 경우, T1/2가 인터페론보다 Tetra-PEG가 약 12배 정도 증가하였음을 알 수 있으며 mPEG 보다 약 3.5 배 증가함을 알 수 있다. 또한 생물학적 활성은 mPEG와 비교하여 약 4배 정도 감소하였다.
이하 본 발명의 실시예를 다음에 의하여 설명한다.
그러나 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 분자량이 10,000인 활성화된 mPEG-OCH 2 COONHS의 합성
(단계 1) 분자량이 10,000인 mPEG-OCH2COOH의 합성
분자량이 10,000인 PEG를 이용하여 mPEG를 제조하고, 분자량 10,000인 mPEG-OH(20g, 2mM)를 질소기체하에서 THF에 녹인 후 실온에서 교반하면서 나트륨 및 나프탈렌 용액을 가하고 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 브로모에틸렌아세테이트(bromoethylacetate)(1.0g, 6mM)를 실온에서 교반하면서 적하시키는 방법(dropwise)으로 넣어 주었다. 실온에서 15시간 이상 반응시킨 후 냉각조(ice bath)에서 아이스 에테르(ice ether)를 가해 응고시켰다. 생성된 고형분을 여과(solid filter)하여 회수한 후 이를 에테르로 세척하고, 진공 건조하였다. 그 후 상기 고형분을 물에 녹인 후 1N 소디움 하이드록사이드(NaOH)를 가해 pH를 11로 맞추고 55 ℃에서 24시간 동안 교반한 후 실온으로 식히고 HCl을 가해 pH를 3으로 조정한 다음 증발시켰다. 염화메틸렌(methylene chloride, 이하 "MC"라 칭한다.)에 녹이고 실온에 1시간 방치한 후 셀라이트 여과(celite filter)하여 증발시켰다. 그 다음 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol, 이하 "IPA"라 칭한다.)을 넣어 녹인 후 냉각조하에서 결정화시켰다. 결정화되어 얻어진 연갈색 고형분을 여 과하고 에테르로 세척한 후 진공 건조하였다.
(단계 2) 분자량 10,000인 mPEG-OCH2COONHS의 합성
단계 1에서 얻어진 분자량 10,000인 mPEG-OCH2COOH(6g, 0.6mM)를 MC에 녹인 후 교반하면서 NHS(0.2g, 1.8mM)와 N,N-디시클로헥실 카보디이미드(N,N-dicyclohexyl carbodiimide, DCC)(0.37g, 1.8mM)를 넣어 주었다. 30 ℃로 가열하면서 교반하여 18시간 동안 반응시킨 후 실온으로 식혀, 셀라이트 여과한 다음 활성탄소(charcoal)로 여과하여 증발시켰다. IPA를 넣어 녹인 후 냉각조하에서 결정화하였으며, 그 결과 얻은 백색의 고형분을 여과하고 에테르로 세척한 다음 진공 건조하였다.
<실시예 2> 분자량 20,000인 활성화된 mPEG-OCH 2 COONHS의 합성
(단계 1) 분자량 20,000인 mPEG-OCH2COOH의 합성
분자량 20,000인 mPEG-OH(10g, 0.5mM)를 실시예 1의 단계 1과 동일하게 반응시켜 분자량 20,000인 mPEG-OCH2COOH에 대한 연갈색 고형분을 얻었다.
(단계 2) 분자량 20,000인 mPEG-OCH2COONHS의 합성
분자량 20,000인 mPEG-OH(5g, 0.25mM)를 실시예 1의 단계 2와 동일하게 반응시켜 분자량 20,000인 mPEG-OCH2COONHS에 대한 백색 고형분을 얻었다.
<실시예 3> 분자량 30,000인 활성화된 가지 달린 고분자 유도체 Tri-PEG-NHS의 합성
(단계 1) 분자량 30,000인 Tri-PEG-COOH의 합성
라이신-라이신-HCl(Lys-Lys-HCl)(0.32g, 0.0106mM)을 붕산염 완충용액(0.1M pH 8.5)에 녹인 후 교반하면서 분자량 10,000인 mPEG-OCH2COONHS(1.6g, 0.16mM)을 적하하여 넣어 주었다. 2일 동안 실온에서 반응시킨 후 물 30 mL을 넣고 옥살산을 가하여 pH 3으로 조정하였다. MC로 3회 추출한 뒤 MC 분획층에 Na2SO4를 가하여 건조시킨 후 여과하여 증발시켰다. 여과액을 3mL로 농축한 후 차가운 에틸에테르 20mL을 넣어 침전시킨다. 위 반응의 침전물 0.7g을 증류수(distilled water, DW)에 녹이고 DEAE Sepharose FF에 주입한다. DEAE Sepharose FF column은 500mL의 젤(gel)로 충진되어 있고, pH7의 0,5% 붕산(boric acid), 소디움 하이드록사이드(sodium hydroxide) 완충액 1500mL로 평형화하였다. 평형화가 끝난 후 물로 세척하여 사용하였다. mPEG-Lys-Lys, mPEG2-Lys-Lys 그리고 mPEG의 불순물은 컬럼을 물로 세척할 때 제거되는데 반해, mPEG3-COOH는 10mM 염화나트륨(NaCl)에서 용출되었다. 용출액에 옥살산을 가하여 pH 3으로 조정한 후 MC로 3회 추출한 뒤 MC 분획층에 Na2SO4를 가하여 건조시킨 후 여과하여 증발시켰다. IPA를 넣고 녹인 후 냉각조하에서 결정화하여 백색의 고형분을 얻어 여과하고 에테르로 세척한 다음 진공 건조하여 백색 고형분(Tri-PEG-COOH)을 얻었다. 상기 백색 고형분은 하 기 화학식 2과 같은 구조식을 갖는다.(화학식 2에서 mPEG는 분자량이 10,000이다.)
Figure 112007035339914-pat00009
(단계 2) 분자량 30,000인 Tri-PEG-NHS의 합성
상기 단계 1에서 얻은 분자량 30,000 Tri-PEG-COOH(1.2g, 0.043mM)를 NHS(0.02g, 0.174mM) 및 DCC(0.036g, 0.174mM)와 혼합하여 실시예 1의 단계 2와 동일한 방법으로 반응시켜 백색 고형분을 얻었다. 상기 백색 고형분(Tri-PEG-NHS)은 하기 화학식 3과 같은 구조식을 갖는다(화학식 3에서 mPEG는 분자량이 10,000이다.).
Figure 112007035339914-pat00010
<실시예 4> 분자량 60,000인 활성화된 가지 달린 고분자 유도체 Tri-PEG-NHS의 합성
(단계 1) 분자량 60,000인 Tri-PEG-COOH의 합성
분자량 20,000인 mPEG-OCH2COONHS(1.6g, 0.08mM)를 실시예 3의 단계 1과 동일하게 반응시켜 백색 고형분을 얻었다. 결과 백색 고형분은 Tri-PEG-COOH로서 상기 화학식 2의 구조를 갖는 화합물이다(상기 화학식 2에서 mPEG의 분자량은 20,000이다.).
(단계 2) 분자량 60,000인 Tri-PEG-NHS의 합성
분자량 60,000인 Tri-PEG-COOH(1.2g, 0.02mM)을 실시예 3의 단계 2와 동일하게 반응시켜 백색 고형분을 얻었다. 결과 백색 고형분은 Tri-PEG-NHS로서 상기 화학식 3의 구조를 갖는 화합물이다(상기 화학식 2에서 mPEG의 분자량은 20,000이다.).
<실시예 5> 긴 사슬의 연결쇄를 결합시킨 분자량 33,400인 활성화된 가지 달린 고분자 유도체 Tetra-PEG-NHS의 합성
(단계 1) 분자량 33,400인 Tetra-PEG-COOH의 합성
실시예 3에서 얻은 분자량 30,000인 Tri-PEG-NHS(0.4g, 0.0133mM)를 MC에 녹이고 실온에서 교반하면서 분자량 3,400인 NH2PEG-COOH(0.048g, 0.014mM)를 첨가하였다. 40 ℃에서 2일 동안 반응시킨 후 셀라이트로 여과하여 증발시켰다. IPA를 넣고 녹인 후 냉각조하에서 결정화시켜 백색의 고형분을 얻었으며 이를 여과하여 에테르로 세척한 후 진공건조하였다. 이렇게 얻어진 백색 고형분(Tetra-PEG-COOH)은 하기 화학식 4와 같은 구조를 가진다(화학식 4에서 mPEG는 분자량이 10,000이다.).
Figure 112007035339914-pat00011
(단계 2) 분자량 33,400인 Tetra-PEG-NHS의 합성
단계 1에서 얻은 Tetra-PEG-COOH(0.4g, 0.012mM)를 NHS(0.0048g, 0.042mM) 및 DCC(0.0086g, 0.042mM)와 혼합하여 실시예 3의 단계 2와 동일한 방법으로 반응시켜 백색 고형분을 얻었다. 이 백색 고형분(Tetra-PEG-NHS)은 하기 화학식 5와 같은 구조를 가진다(화학식 5에서 mPEG는 분자량이 10,000이다.).
Figure 112007035339914-pat00012
<실시예 6> 긴 사슬의 연결쇄를 결합시킨 분자량 35,000인 활성화된 가지 달린 고분자 유도체 Tetra-PEG-NHS의 합성
실시예 3에서 얻은 분자량 30,000인 Tri-PEG-NHS(0.4g, 0.0133mM)과 분자량 5,000인 NH2PEG-COOH(0.07g, 0.014mM)를 실시예 5에서와 같이 반응하여 분자량 35,000의 tetra-PEG-NHS를 얻었다.
<실시예 7> 긴 사슬의 연결쇄를 결합시킨 분자량 40,000인 활성화된 가지 달린 고분자 유도체 Tetra-PEG-NHS의 합성
실시예 3에서 얻은 분자량 30,000인 Tri-PEG-NHS(0.4g, 0.0133mM)과 분자량 10,000인 NH2PEG-COOH(0.14g, 0.014mM)를 실시예 5에서와 같이 반응하여 분자량 40,000의 tetra-PEG-NHS를 얻었다.
<실시예 8> 긴 사슬의 연결쇄를 결합시킨 분자량 63,400인 활성화된 가지 달린 고분자 유도체 Tetra-PEG-NHS의 합성
(단계 1) 분자량 63,400인 Tetra-PEG-COOH의 합성
실시예 4에서 얻은 분자량 60,000인 Tri-PEG-NHS(0.6g, 0.01mM)를 실시예 5의 단계 1과 동일하게 반응시켜 상기 화학식 4의 구조을 갖는 백색 고형분, Tetra-PEG-COOH를 얻었다(상기 화학식 4에서 mPEG의 분자량은 20,000이다.).
(단계 2) T분자량 63,400인 Tetra-PEG-NHS의 합성
분자량 63,400인 Tetra-PEG-COOH(0.45g, 0.0071mM)을 실시예 5의 단계 2와 동일하게 반응시켜 백색 고형분을 얻었다. 결과 백색 고형분은 Tetra-PEG-NHS로서 상기 화학식 5의 구조를 갖는 화합물이다(상기 화학식 5에서 mPEG의 분자량은 20,000이다.).
<실시예 9> 긴 사슬의 연결쇄를 결합시킨 분자량 65,000인 활성화된 가지 달린 고분자 유도체 Tetra-PEG-NHS의 합성
실시예 4에서 얻은 분자량 60,000인 Tri-PEG-NHS(0.6g, 0.01mM)과 분자량 5,000인 NH2PEG-COOH(0.05g, 0.01mM)를 실시예 8에서와 같이 반응하여 분자량 65,000의 tetra-PEG-NHS를 얻었다.
<실시예 10> 긴 사슬의 연결쇄를 결합시킨 분자량 70,000인 활성화된 가지 달린 고분자 유도체 Tetra-PEG-NHS의 합성
실시예 4에서 얻은 분자량 60,000인 Tri-PEG-NHS(0.6g, 0.01mM)과 분자량 10,000인 NH2PEG-COOH(0.1g, 0.01mM)를 실시예 8에서와 같이 반응하여 분자량 70,000의 tetra-PEG-NHS를 얻었다.
<실시예 11> 분자량 30,000인 Tri-PEG-인터페론 제조
10mg의 인터페론(Interferon)을 pH8의 100mM 바이신(bicine) 완충액 으로 투 석한 후, 실시예 3에서 제조된 분자량 30,000인 Tri-PEG-NHS 160mg을 넣어 실온에서 2시간 동안 교반하면서 반응시킨 후 0.1M 글리신(glycine)을 첨가하여 반응을 중단시켰다. pH4의 40mM 인산나트륨(NaH2PO4) 완충액으로 평형화 된 HiprepTM 26/10(Amersham Pharmacia Biotech)과 같은 De-salting column 에 반응액을 주입한 후 같은 완충액으로써 용출시켜 완충액을 교환하였다. 이때 반응시에 Tri-PEG-NHS에서 분리된 NHS가 제거된다. 용출액을 pH4의 40mM 인산나트륨(NaH2PO4) 완충액으로 평형화된 SP-세파로제(SP-sepharose) 음이온 교환수지(anion exchange chromatography, Amersham Pharmacia Biotech)에 주입한 후 PEG-인터페론을 분리하였다. 분리 과정에서 사용된 염화나트륨(NaCl)은 0∼300 mM의 농도구배를 주어 분획하였다. 분획된 용출액은 SDS-PAGE를 이용하여 크기와 형태를 확인한 후 인터페론에 Tri-PEG가 2개 이상 결합된 형태의 접합체와 반응하지 않은 인터페론을 배제하고 Tri-PEG가 하나만 접합된 인터페론만을 분리하였다. 반응 후 또는 분리된 Tri-PEG-인터페론은 SDS-PAGE, 크기배제 HPLC(size-exclusion HPLC) 또는 MALDI-TOF 질량 분석기(MALDI-TOF mass spectrometer)로 확인하였다.
<실시예 12> 분자량 60,000인 Tri-PEG-인터페론 제조
10mg의 인터페론(Interferon)을 pH8의 100mM 바이신(bicine) 완충액 으로 투석한 후, 실시예 4에서 제조된 Tri-PEG-NHS(60,000) 320mg을 넣어 실온에서 2시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 그 다음은 실시예 11의 방법과 동일하게 하여 Tri- PEG(60,000)-인터페론을 얻었다.
<실시예 13> 분자량 33,400인 Tetra-PEG-인터페론 제조
10mg의 인터페론(Interferon)을 pH 8의 100mM 바이신(bicine) 완충액으로 투석한 후, 실시예 5에서 제조된 분자량 33,400인 Tetra-PEG-NHS 180mg을 넣어 실온에서 2시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 그 다음은 실시예 11의 방법과 동일하게 하여 분자량 33,400인 Tetra-PEG-인터페론을 얻었다.
<실시예 14> 분자량 35,000인 Tetra-PEG-인터페론 제조
10mg의 인터페론(Interferon)을 pH 8의 100mM 바이신(bicine) 완충액으로 투석한 후, 실시예 6에서 제조된 분자량 35,000인 Tetra-PEG-NHS 200mg을 넣어 실온에서 2시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 그 다음은 실시예 11의 방법과 동일하게 하여 분자량 35,000인 Tetra-PEG-인터페론을 얻었다.
<실시예 15> 분자량 40,000인 Tetra-PEG-인터페론 제조
10mg의 인터페론(Interferon)을 pH 8의 100mM 바이신(bicine) 완충액으로 투석한 후, 실시예 5에서 제조된 분자량 40,000인 Tetra-PEG-NHS 240mg을 넣어 실온에서 2시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 그 다음은 실시예 11의 방법과 동일하게 하여 분자량 40,000인 Tetra-PEG-인터페론을 얻었다.
<실시예 16> 분자량 63,400인 Tetra-PEG-인터페론 제조
10mg의 인터페론(Interferon)을 pH8의 100mM 바이신(bicine) 완충액 으로 투석한 후, 실시예 8에서 제조된 분자량 63,400인 Tetra-PEG-NHS 360mg을 넣어 실온에서 2시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 그 다음은 실시예 11의 방법과 동일하게 하여 분자량 63,400인 Tetra-PEG-인터페론을 얻었다.
<실시예 17> 분자량 65,000인 Tetra-PEG-인터페론 제조
10mg의 인터페론(Interferon)을 pH8의 100mM 바이신(bicine) 완충액으로 투석한 후, 실시예 9에서 제조된 분자량 65,000인 Tetra-PEG-NHS 400mg을 넣어 실온에서 2시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 그 다음은 실시예 11의 방법과 동일하게 하여 분자량 65,000인 Tetra-PEG-인터페론을 얻었다.
<실시예 18> 분자량 70,000인 Tetra-PEG-인터페론 제조
10mg의 인터페론(Interferon)을 pH8의 100mM 바이신(bicine) 완충액으로 투석한 후, 실시예 10에서 제조된 분자량 70,000인 Tetra-PEG-NHS 450mg을 넣어 실온에서 2시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 그 다음은 실시예 11의 방법과 동일하게 하여 분자량 70,000인 Tetra-PEG-인터페론을 얻었다.
<실험예 1> 활성화된 가지 달린 고분자 유도체의 활성측정
상기에 합성된 가지 달린 고분자 유도체들의 단백질이나 펩타이드에 대한 반 응성을 조사하기 위하여, 이들을 실시예 11∼18에서와 같이 인터페론에 접합시켰다. 실시예에서와 같이 정제과정을 실시하여 분리한 PEG가 하나만 접합된 인터페론(mono-PEG-인터페론)을 얻었다.
상기에서 얻어진 모노-PEG-인터페론을 수포성 구내염 바이러스 및 마딘-다비 소 신장 세포(Marbin-Darby Bovine Kidney,MDBK)를 이용한 인터페론 cytophatic effect inhibition(CPE) 분석을 실시하여 생물학적 활성을 측정하였다.
<실험예 2> 활성화된 가지 달린 고분자 유도체의 약물역학
인터페론과 PEG-인터페론 접합체를 한 시료당 각 3마리의 랫트(Sprague Dawley)에 300백만IU씩 피하주사하였고, 관찰시점은 약물 투여 후 0분, 5분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 그리고 7일째로 하여 약물역학을 실험하였다. 검정은 인터페론 cytophatic effect inhibition(CPE) 분석으로 측정된 생물학적 활성값을 사용하였다.
하기 표 1에 인터페론과 PEG-인터페론 접합체에 대한 T1/2값을 얻었다.
PEG-인터페론 접합체의 생물학적 활성과 T1/2
고분자 유도체의 종류 생물학적 활성 T1/2
인터페론 100 3.7
mPEG(MW 10,000) 38 15.4
Di-PEG(MW 20,000) 12 23.3
Tri-PEG(MW 30,000) 6.2 32.5
Tetra-PEG(MW 33,400) 10.3 36.5
Tetra-PEG(MW 35,000) 11 37
Tetra-PEG(MW 40,000) 10.5 40.2
mPEG(MW 20,000) 32 18.2
Di-PEG(MW 40,000) 7 33.8
Tri-PEG(MW 60,000) 3 42.1
Tetra-PEG(MW 63,400) 6.5 43.3
Tetra-PEG(MW 65,000) 6.2 43.5
Tetra-PEG(MW 70,000) 7.1 44.9

상술한 바와 같이 본 발명은 단백질 또는 펩타이드를 수식하는데 여러 개의 긴 사슬구조를 가진 분자량이 증가된 고분자를 사용함으로써 체내에서 분해와 소실을 감소시키는 고반응성 유도체를 합성하고, 이 고반응성 유도체에 단백질이나 펩타이드와 접합체를 형성할 수 있는 하나의 긴 사슬을 더 연결하여 더욱 개선된 고활성 유도체를 합성하는데 이용될 수 있다. 이러한 개선된 고활성 유도체를 이용한 단백질이나 펩타이드 접합체는 단백질이나 펩타이드 본래의 활성을 최대한 유지하면서 또한 체내로부터의 소실 및 분해를 더욱 감소시킴으로써 작용시간이 길어지는 치료효과의 개선을 증가시켜 투여되는 약물의 횟수를 줄이고 치료 효과도 개선시킬 수 있을 뿐만 아니라 잦은 투여로 인한 환자의 불편을 줄일 수 있다.

Claims (12)

  1. 폴리에틸렌 글리콜 단위의 평균 분자량이 15,000∼80,000돌턴(Dalton)인 하기 화학식 1로 표시되는 생리적으로 고활성인 고분자 유도체.
    화학식 1
    Figure 112007035339914-pat00008
    상기식에서,
    R1, R2 및 R3는 서로 독립적이며, C1∼C6인 알콕시기이고,
    n1, n2 및 n3는 100∼500의 정수이며,
    Z는 활성기를 나타낸다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 Z는 COONHS 또는 CONH-CH2CH2(OCH2CH2) n4OCOONHS며, 이 때, n4가 50∼500사이의 정수값인 것을 특징으로 하는 생리적으로 고활성인 고분자 유도체.
  3. 제 1항에 있어서, n1, n2 및 n3가 200∼500의 정수값인 것을 특징으로 하는 생리적으로 고활성인 고분자 유도체.
  4. 제 2항에 있어서, n4가 50∼250의 정수값인 것을 특징으로 하는 생리적으로 고활성인 고분자 유도체.
  5. 제 1항에 있어서, 단위 폴리에틸렌 글리콜이 라이신-라이신(Lys-Lys-HCl)에 의해 3개가 연결된 것을 특징으로 하는 생리적으로 고활성인 고분자 유도체.
  6. 제 1항의 활성화된 생체적합성 고분자 유도체에 단백질 또는 펩타이드가 결합된 단백질-고분자 또는 펩타이드-고분자 접합체.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 단백질 또는 펩타이드:고분자 유도체의 반응 몰비가 약 1:1에서 1:50인 것을 특징으로 하는 접합체.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 단백질 또는 펩타이드:고분자 유도체의 반응 몰비가 약 1:5에서 1:20인 것을 특징으로 하는 접합체.
  9. 제 6항에 있어서, 단백질 또는 펩타이드와 고분자의 결합에서 펩타이드 내 결합부위는 라이신의 아민기나 N-말단인 것을 특징으로 하는 접합체
  10. 제 6항에 있어서, 단백질 또는 펩타이드는 인터페론 알파, 베타, 감마(Interferon -α, -β or -γ), 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor, bFGF) 또는 호중구 생성 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)중 하나를 특징으로 하는 접합체.
  11. 제 6항에 있어서, 접합체는 인터페론 알파와 고분자 유도체의 접합체인 것을 특징으로 하는 접합체.
  12. 제 11항에 의한 접합체 및 치료적으로 불활성인 담체를 포함하는 인터페론 감수성 질환 치료용 또는 예방용 약학적 조성물.
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