KR100480432B1 - Ｇ-ｃｓｆ와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 배합체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 G-CSF(granulocyte-colony stimulating factor, 과립구 집락 자극 인자)의 아미노 말단(amino-terminus, N-terminus)의 알파-아미노기(α-amino group)에 신규한 형태의 메톡시 또는 펜던트형 폴리에틸렌 글리콜-프로피온알데히드 (methoxypolyethylene glycol-propionaldehyde) 유도체가 결합된 배합체 (conjugate)에 관한 것으로, 본 배합체는 G-CSF의 항원유발성을 감소시키고 생리활성 저하를 최대한 감소시키면서 체내 잔존 시간을 증가시켜 향상된 약동학 프로필(pharmacokinetic profile)과 약리적 성질을 갖게 되므로, 골수이식(bone marrow transplantation) 후 호중구 회복 촉진제, 항암 화학요법(chemotherapy)에 의한 호중구 감소증(neutropenia) 치료제, 그리고 여러 감염 질환에 대한 예방 및 치료제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 G-CSF(granulocyte-colony stimulating factor, 과립구 집락 자극 인자)의 아미노 말단(amino-terminus, N-terminus)에 신규한 형태의 메톡시 또는 펜던트형 폴리에틸렌글리콜-프로피온알데히드 유도체를 결합시킨 폴리에틸렌글리콜-G-CSF 배합체 (conjugate)에 관한 것이다.
G-CSF(granulocyte-colony stimulating factor, 과립구 집락 자극 인자)는 호중구 선조세포(neutrophil progenitor cell)에 특이적으로 작용하여 호중구의 증식과 분화를 촉진하고 호중구의 항체 의존성 세포 살생 능력을 증가시키는 한편, IgA-매개성 대식작용(phagocytosis)을 촉진하고 수퍼옥사이드(superoxide) 생성 능력을 증가시키는 작용이 있다. 따라서, G-CSF는 화학주성 펩티드(chemotactic peptide)에 대한 반응능력을 향상시켜 감염증 발생을 억제하고 발열의 빈도를 낮추는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, G-CSF는 GM-CSF(granulocyte-macrophage CSF) 등의 다른 CSF에 비해 보다 분화된 골수세포에 작용하기 때문에 생체내에서 백혈병 모세포에 대한 영향이 적을 것으로 기대되고 있다. 이에 따라, G-CSF는 항암 화학요법, 항암제의 대량요법, 방사선요법과의 병합요법, 골수 이식후 호중구의 회복을 촉진시키는 약물로 널리 사용되고 있다(Julie M. Vores et al., Clinical Applications of Hematopoietic Growth Factors. Journal of Clinincal Oncology, 13: 1023-1035, 1995).
G-CSF는 호중구의 증식과 분화에 주요하게 작용하는 조혈제(hematopoietic agent)로 골수이식(bone marrow transplantation)과 항암제 투여로 인한 호중구 감소증(neutropenia)에 주로 사용하며 척수이형성 증후군(myelodysplastic syndromes), 재생불량성 빈혈(aplastic anemia)이나 선천성, 주기성, 특발성 호중구 감소증(congenital, cyclic, idiopathic neutropenia)과 같은 심한 만성 호중구 감소증 및 HIV 감염 환자에서 호중구를 증가시키고 호중구 감소로 인한 감염을 예방하기 위해 사용되고 있는 것으로 밝히고 있다(www.drugdex.com). 호중구는 방어기전(host defense mechanism)에 중요한 역할을 하는 식세포(phagocytic cell)로, 정상적인 면역기능과 조혈기능(hematopoietic status)을 가지고 있는 경우는 감염시 호중구의 수가 증가하게 된다. 호중구의 수(neutrophil count)가 1500 cells/㎣ 이하로 감소된 상태를 호중구 감소증(neutropenia)이라 하고, 호중구 수가 500 cells/㎣ 이하인 경우는 정상적 방어기전이 크게 손상된 상태로 균감염의 위험이 매우 증가되는 것으로 알려져 있다.
최근에는 G-CSF를 위와 같은 호중구 감소증에 임상적으로 사용하는 것 외에도, G-CSF가 호중구의 생성을 촉진하고 기능을 강화시킴으로써 폐렴, 패혈증 등 여러 감염 질환의 예방과 치료에 유효할 것이라는 기대와 함께, 감염 질환에 G-CSF의 단독 투여 또는 항생제와의 병용 투여에 관한 연구가 진행중이다.
성숙한 G-CSF 단백질은 4 개의 알파-헬릭스(alpha-helix)로 구성되며, 분자량은 대략 20,000 정도로 2 개의 이황화 결합을 가지는데, 133 번 잔기 쓰레오닌(threonine)이 유일하게 O-링크된(O-linked) 탄수화물이 부가되는 위치이다. 과립구(granulocyte)들의 표면에 존재하는 G-CSF 수용체(receptor)의 분자량은 대략 150,000 정도로, 하나의 펩티드 사슬로 구성되어 있고 N-당화(N-glycosylation)되어 있으며, 세포가 성숙되면서 수용체의 숫자가 증가되어 세포당 수백 개에 이르는 것으로 알려져 있다.
폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, 이하 PEG)은 HO-(-CH2CH2O-)n-H의 구조를 갖는 고분자 화합물로, 친수성이 강하기 때문에 의약 단백질에 결합시켜 그 용해도를 증가시킬 수 있다. 또한 적절하게 결합시키면 효소활성, 수용체 결합과 같은 주요 생물학적 기능들을 유지하면서 결합된 단백질의 분자량을 증가시키는 것에 의해, 신장여과를 감소시키고 외부항원을 인식하는 세포와 항체로부터 단백질을 보호하며 분해효소에 의한 단백질의 분해도 감소시킬 수 있다. 이와 같이 단백질에 결합 가능한 PEG의 분자량 범위는 대략 1,000∼100,000으로, PEG 분자량이 1,000 이상일 경우에는 독성이 상당히 낮은 편으로 알려져 있다. PEG의 분자량 범위가 1,000∼6,000인 것은 전신에 분포하고 신장을 통해 대사되며, 특히 분자량 40,000의 분지 PEG는 혈액과 간을 포함한 기관들에 분포되고 대사는 간에서 이루어지는 것으로 알려져 있다.
비경구(parenteral) 경로를 통해 투여되는 의학적, 약리학적으로 유용한 단백질들은 항원성을 가지며, 대체로 수용성이 낮고 체내 잔존기간이 짧다는 단점이 있어 이를 극복하고자 하는 연구가 수행되고 있다. 데이비스(Frank F. Davis) 등의 미국특허 제4,179,337호에서는, PEG와 결합된 단백질 및 효소 등을 치료제로 사용할 경우, PEG가 갖는 장점인 항원성의 감소, 수용성의 증가, 체내 잔류 기간 증가 등의 효과를 얻을 수 있음을 개시하고 있다. 이 특허 이후, 생리활성 단백질을 PEG와 결합시켜 그 단점을 극복하고자 하는 시도가 이루어지고 있는데, 예를 들어, 베로니즈 등(Veronese et al., Applied Biochem. and Biotech. 11:141-152, 1985)은 리보뉴클레아제(ribonuclease)와 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)를 PEG와 결합시키고 있다. 또한, 카터 등(Katre et al.)은 미국특허 제4,766,106호와 제4,917,888호에서 단백질들에 PEG를 포함한 폴리머(polymer, 중합체)를 결합시켜 단백질의 수용성을 증가시킨 내용을 개시하고 있으며, 나이테키 등(Nitecki et al.)은 미국특허 제4,902,502호에서 PEG나 다른 중합체들을 재조합 단백질에 결합시켜 항원성을 줄이고 체내 잔존 기간을 증가시키고 있다.
PEG와 단백질의 결합에는 이와 같은 장점 외에 결점도 존재한다. 즉, PEG는 대개 결합할 단백질의 하나 또는 그 이상의 자유 라이신(lysine, Lys) 잔기에 공유결합을 통해 결합하게 되는데, 이때 단백질의 표면 부위중 단백질의 활성도와 직접적인 관계가 있는 부위가 PEG와 결합할 경우, 그 부위는 더 이상 생물학적 기능을 수행할 수 없게 되어 단백질의 활성도가 감소하게 된다. 또한, PEG와 라이신 잔기의 결합은 대개 무작위적으로 일어나게 되므로 결합 위치에 따라 많은 종류의 PEG-단백질 배합체(conjugate)들이 혼합물로 존재하게 되고, 따라서 원하는 배합체를 순수 분리하는 과정이 복잡하고 어려워지게 된다. 예를 들어, 인터페론-알파 2b의 경우에는 단백질 표면에 8 개의 자유 라이신 잔기가 존재하는데, 이 잔기들 중에서 인터페론의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 아미노산 부위에 위치 선택적인 방법으로 PEG를 결합시켜야만 의학적으로 유용한 배합체를 얻을 수 있게 된다.
PEG를 목적 물질에 부가하는 행위, 즉 페길레이션(pegylation)으로 얻어지는 효과들은 대상 단백질에 따라 큰 차이가 나는데, PEG의 결합 부위, 배합체 형성에 사용되는 화학반응, 그리고 PEG 폴리머의 분자량과 형태 등에 따라 더 현저한 차이가 발생할 수 있다(Delgado et al., Pharm. Sci, 3: 59-66, 1997).
단백질의 아미노 말단에 PEG를 결합시킨 예로서, 암젠(Amgen)사의 미국특허 제5,985,265호에서는 컨센서스(consensus) 인터페론-알파의 메티오닌(methionine) 아미노 말단에 분자량 12,000의 메톡시PEG-알데히드 (methoxyPEG-aldehyde)를 결합시키고 있다. 여기에서는, 8 몰 과량의 메톡시PEG-알데히드를 100 mM 인산나트륨, 환원제로 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride), pH 4.0, 4 ℃ 조건 하에서 컨센서스 인터페론과 10 시간 동안 반응시키고 있는데, 이 결합 반응으로 한 개의 PEG만이 N-말단에 결합하게 되며 이 배합체의 항 바이러스 활성은 20 %였다. 또한, 미국특허 제5,795,569호에서는 5 몰 과량의 메톡시PEG-알데히드(분자량 20,000)를 MGDF(Megakaryocyte Growth and Development Factor)의 아미노 말단에 pH 5.0, 4 ℃의 완충용액 조건에서 반응시켜 결합시키고 있으며, 엔존(Enzon)사는 미국특허 제6,042,822호에서 1.75∼5 몰 과량의 분자량 5,000과 12,000인 메톡시PEG-석시니미딜 카보네이트(succinimidyl carbonate)를 인터페론-알파 2b의 34 번 아미노산 히스티딘(histidine) 잔기와 시스테인 아미노 말단에 pH 5.5∼6.5, 실온의 완충용액상에서 1∼2 시간 반응시켜 결합시키고 있다. 이 경우, 위 pH 범위에서는 아미노 말단 보다 히스티딘 잔기에 대한 결합이 더 선호되었으며, pH 8.0∼10.0 범위에서는 라이신(lysine)잔기에 대한 결합이 선호되었다.
아미노 말단의 알파-아미노(α-amino)기에 선택적으로 결합할 수 있는 PEG 폴리머로는 메톡시PEG-알데히드, 메톡시PEG-아세트알데히드(acetaldehyde), 메톡시 PEG-프로피온알데히드(propionaldehyde) 등이 사용되어 왔는데, 이는 알데히드 그룹이 아미노 말단에 선택적으로 반응하기 때문이다. 또한, 메톡시PEG-아세트알데히드는 알돌 축합(aldol condensation)에 의한 이합체 형성(dimerization)에 민감하기 때문에, 아세트알데히드 보다 프로피온알데히드 형태가 합성과 사용이 수월하다고 알려져 있다. 결합 반응은 쉬프(Schiff) 염기를 통해 알파-아미노기와 알데히드 그룹 간에 안정한 2차 아민 결합이 형성되어 PEG와 단백질의 배합체를 형성하게 되는 것이다. 메톡시PEG-프로피온알데히드를 사용한 예로서는, 재조합 인간 G-CSF(granulocyte-colony stimulating factor)의 아미노 말단(Kinstler et al., Pharm Res., 13(7): 996-1002, 1996)과, 재조합 인간 TNF(tumor necrosis factor) 수용체 타입 1의 아미노 말단(Edwards et al., Ann. Rheum. Dis., 58(S1): I73-I81, 1999)에 PEG 폴리머를 결합시킨 것을 들 수 있다.
G-CSF의 자유 아민기에 PEG 폴리머를 결합시킨 예로서, 기린-암젠사의 미국특허 제6,166,183호에서는 분자량 4,500의 메톡시PEG-석시니미딜 석시네이트 (methoxyPEG-succinimidyl succinate, mPEG-SS)를 G-CSF의 자유 아민기에 pH 8.0, 4 ℃의 0.25 몰 소디움 보레이트(soduim borate) 완충용액 중에서 1 시간 동안 반응시켜 결합시키고 있다. 또한, 분자량 10,000의 시아누릭 클로라이드-PEG(cyanuric chloride-PEG)도 G-CSF의 자유 아민기에 결합시킨 바 있다.
한편, G-CSF의 아미노 말단을 화학적으로 변형시킨 예로서, 암젠사는 미국특허 제6,017,876호에서 석시닉 언하이드라이드(succinic anhydride)와 하이드록실아민(hydroxylamine)을 이용하여 4 ℃의 20 mM NaHPO4 완충용액 중에서 G-CSF의 아미노 말단을 변형시켜 용해도, 물리적 안정성, 그리고 시험관내 생물활성을 증가시켰음을 밝히고 있다.
또한, 암젠사는 미국특허 제5,985,265호에서 재조합 인간 G-CSF에 대해 1.5 몰 과량의 석시니미딜카르복시메틸-메톡시PEG(분자량 6,000, succinimidyl carboxymethyl-methoxyPEG; SCM-MPEG)을 실온, pH 8.0, 100 mM 바이신(bicine) 완충용액 중에서 반응시켜 아미노 말단에 PEG폴리머를 결합시켰다.
이와 같은 종래의 PEG-단백질 간의 결합을 고려해볼 때, 호중구 감소증 치료라든가 여러 감염질환에 대한 예방 및 치료제 등으로 유용하게 사용되는 G-CSF에 있어서 수용체 결합에 관여하지 않는 부위의 특정 아미노산 특정 잔기에 선택적인 반응성을 나타내는 신규한 형태의 PEG 유도체를 제공하고, 이러한 신규의 PEG 유도체와 G-CSF와의 배합체를 제공할 수 있다면 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
본 발명에서는 야생형(wild-type) 또는 재조합 G-CSF의 아미노 말단(N-terminus)에 신규한 형태의 메톡시 또는 펜던트형 PEG-프로피온알데히드 유도체를 선택적으로 결합시킴으로써, G-CSF의 항원유발성(immunogenicity)을 감소시키고 생리활성 저하를 최대한 감소시키면서 체내 잔존 시간을 증가시켜, 야생형이나 재조합 G-CSF 단백질의 치료효과에 필요한 투여량(dose)이나 투여횟수를 줄일 수 있도록 향상된 약동학 프로필(pharmacokinetic profile)과 약리적 성질을 갖도록 변형된 G-CSF와 PEG의 배합체를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, G-CSF(granulocyte-colony stimulating factor, 과립구 집락 자극 인자)의 아미노 말단(amino-terminus, N-terminus)의 알파-아미노기(α-amino group)에 메톡시 또는 펜던트형 폴리에틸렌 글리콜-프로피온알데히드(methoxypolyethylene glycol-propionaldehyde) 유도체가 결합된 배합체 (conjugate)를 제공한다.
여기에서 G-CSF는 야생형 또는 재조합 G-CSF일 수 있다.
또한, 상기 메톡시 또는 펜던트형 폴리에틸렌글리콜(PEG)-프로피온알데히드 유도체는 G-CSF의 아미노 말단의 알파-아미노기(α-amino group)에 선택적인 반응성을 나타내는 신규한 형태의 메톡시PEG-프로피온알데히드 유도체로서, 직선(linear)형의 메톡시PEG-아미드(amide)-프로피온알데히드 유도체 및 메톡시PEG-우레탄(urethane) -프로피온알데히드 유도체, 그리고 펜던트(pendant)형의 PEG-아미드-프로피온알데히드 유도체 및 PEG-우레탄-프로피온알데히드 유도체의 적어도 하나일 수 있다.
여기에서, 메톡시 또는 펜던트형 폴리에틸렌글리콜-프로피온알데히드 유도체는 분자량 범위가 1,000∼1,000,000인 것이 바람직하다. 구체적으로, 직선형의 메톡시PEG-프로피온알데히드 유도체는 분자량 범위가 1,000∼100,000인 것이 바람직하고, 1,000∼40,000인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 펜던트형의 PEG-프로피온알데히드 유도체는 PEG 뼈대의 분자량 범위가 5,000∼1,000,000인 것이 바람직하고, 5,000∼100,000인 것이 더욱 바람직하다. 그리고, 펜던트 그룹인 아미드-프로피온알데히드나 우레탄-프로피온알데히드의 개수는 1∼20인 것이 바람직하다.
본 발명에서는, G-CSF의 아미노 말단의 알파-아미노기에 선택적인 반응성을 나타내는 신규한 형태의 메톡시 또는 펜던트형 PEG-프로피온알데히드 유도체를 결합시킴으로써, 이에 의해 형성되는 배합체의 종류를 한정시키는 동시에 단백질 활성도 감소를 최대한 억제하고 있다. 즉, 단백질의 2, 3차 구조상에서 라이신(lysine) 잔기의 곁사슬(side chain)에 존재하는 입실론-아미노기에 반응성을 갖는 PEG 유도체들은 단백질 표면에 노출된 다수의 입실론-아미노기와 반응함으로써 단백질의 활성부위를 저해하여 활성도를 감소시키지만, 본 발명에 따른 메톡시 또는 펜던트형 PEG-프로피온알데히드 유도체는 아미노 말단의 알파-아미노기에 선택적인 반응성을 나타내기 때문에 목적하는 단백질에 하나의 PEG 유도체만을 결합시킬 수 있다. 또한, 이 아미노 말단이 수용체와의 결합에 관여하지 않는 부위라면, PEG 유도체와의 배합체 형성에 의한 야생형의 활성도 감소를 최대한 억제할 수 있다.
본 발명에 따르면, G-CSF와의 배합체 형성에 사용되는 메톡시 또는 펜던트형 PEG-프로피온알데히드 유도체의 양(amount)은 적어도 G-CSF와 동일한 당량(equimolar)이어야 하며, 아미노 말단의 알파-아미노 그룹과의 완전한 반응을 유도하기 위하여 메톡시 또는 펜던트형 PEG-프로피온알데히드 유도체를 과량(G-CSF 단백질 1 몰당 PEG 유도체의 몰비가 1∼10 배의 범위)으로 가해주는 것이 바람직하다. 또한, G-CSF와 메톡시 또는 펜던트형 PEG-프로피온알데히드의 배합반응은 pH 6.0∼7.0 범위에서 실온 조건 하에 약 5∼20 시간이 소요된다.
이와 같이, G-CSF의 아미노 말단의 알파-아미노기에 메톡시 또는 펜던트형 PEG-프로피온알데히드 유도체가 결합되어 얻어지는 G-CSF와 PEG 유도체의 배합체는, G-CSF의 항원유발성(immunogenicity)이 감소되고 생리활성 저하가 억제되면서 체내 잔존 시간이 증가되어 향상된 약동학 프로필과 약리적 성질을 갖게 된다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 일부 실험방법과 조성을 나타낸 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.
다음 실시예에서 사용된 PEG 유도체들은 선바이오(주)에 의해 합성된 제품을 이용한 것이다.
[실시예 1] 메톡시PEG-아미드(amide)-프로피온알데히드의 제조
메톡시PEG(mPEG-OH)(MW. 20,000)과 포타슘 t-부톡사이드(potassium t-butoxide)를 t-부틸알콜(t-buthyl alcohol)에 넣고 60 ℃ 조건 하에서 교반하였다. 이 혼합물에 에틸브로모아세테이트(ethyl bromoacetate)를 천천히 첨가하고 80∼85 ℃ 조건 하에 15 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과한 후 여액을 감압증류하여 유기용매를 제거하고 증류수를 가하여 녹였다. 디에틸에테르(diethyl ether)로 1 회 세척하고 디클로로메탄(dichloromethane)으로 2 회 추출하였다. 추출된 유기층을 황산마그네슘(magnesium sulfate)으로 건조한 후 감압증류하여 유기용매를 제거하였다. 농축된 반응 혼합물에 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 유도하고, 침전된 화합물은 감압 여과후 진공 감압 하에 건조하여 백색 분말 형태의 mPEG-에틸아세테이트 화합물을 얻었다. 이상의 반응 과정을 다음 반응식 1에 나타내었다.
다음 반응식에서 n=22∼2273으로, 22∼909가 바람직하다. 이는 반응식 1∼5까지 적용된다.
상기 mPEG-에틸아세테이트를 1 N 수산화나트륨 수용액에 녹여 상온에서 15 시간 동안 교반하였다. 1 N 염산수용액으로 반응 수용액의 pH를 2로 산성화시키고 디클로로메탄으로 2 회 추출하였다. 추출된 유기층을 황산마그네슘으로 건조하고, 유기용매를 감압증류하여 제거하였다. 농축된 반응 혼합물에 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 유도하고, 침전된 화합물은 감압 여과후 진공 감압 하에 건조하여 백색 분말 형태의 mPEG-아세트산(mPEG-acetic acid) 화합물을 얻었다. 이상의 반응 과정을 다음 반응식 2에 나타내었다.
상기 mPEG-아세트산을 디클로로메탄에 녹여 0∼5 ℃ 조건 하에 교반하였다. 이 혼합물에 N-하이드록시석시니미드(N-hydroxysuccinimide)를 첨가한 다음, 디사이클로헥실카르보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide)를 디클로로메탄에 녹여 0∼5 ℃ 조건 하에 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 약 15 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 여과하여 부산물인 디사이클로헥실우레아 (dicyclohexylurea)를 제거하고 감압 증류하여 유기용매를 제거하였다. 농축된 반응 혼합물은 에틸 아세테이트로 재결정하였다. 재결정 화합물은 감압 여과후 디에틸에테르로 2 회 세척하고, 진공 감압 하에 12 시간 동안 건조하여 백색 분말 형태의 mPEG-석시니미딜 아세테이트(mPEG-succinimidyl acetate) 화합물을 얻었다. 이상의 반응 과정을 다음 반응식 3에 나타내었다.
상기 mPEG-석시니미딜 아세테이트를 디클로로메탄에 녹여 상온에서 교반하였다. 이 혼합물에 1-아미노-3,3-디에톡시프로판(1-amino-3,3-diethoxypropane)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 유도하고, 침전된 혼합물은 감압 여과한 후 에틸아세테이트로 재결정하였다. 재결정 화합물은 감압 여과하고 디에틸에테르로 2 회 세척후 진공 감압 하에 12 시간 동안 건조하여 백색 분말 형태의 mPEG-프로피온알데히드디에틸아세탈(mPEG-propionaldehydediethylacetal) 화합물을 얻었다. 이상의 반응 과정을 다음 반응식 4에 나타내었다.
상기 mPEG-프로피온알데히드디에틸아세탈을 인산(phosphoric acid, pH 1) 수용액에 녹여 40∼50 ℃ 조건 하에 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 상온으로 식힌 다음, 5 % 중탄산나트륨(sodium bicarbonate) 수용액으로 pH를 6으로 조정하고 브라인(brine)을 넣어준 후 디클로로메탄으로 2 회 추출하였다. 추출된 유기층은 황산마그네슘으로 건조하고 유기용매를 감압 증류하여 제거하였다. 농축된 반응 혼합물에 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 유도하고, 침전된 화합물을 감압 여과후 진공 감압하에 건조하여 백색 분말 형태의 메톡시PEG-아미드-프로피온알데히드 화합물을 얻었다. 이상의 반응 과정을 다음 반응식 5에 나타내었다.
[실시예 2] 메톡시PEG-우레탄(urethane)-프로피온알데히드의 제조
메톡시PEG(mPEG-OH)(MW. 20,000)를 디클로로메탄에 넣고 상온에서 교반하였다. 이 혼합물에, 디클로로메탄에 녹인 트라이포스겐(triphosgene)를 천천히 첨가하고 상온에서 15 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 증류하여 유기용매와 남아있는 포스겐을 제거하였다. 감압 증류한 혼합물을 디클로로메탄에 녹여서 교반하였다. 이 반응 혼합물에 N-하이드록시석시니미드를 첨가한 다음, 트리에틸아민을 넣고 상온 조건에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과한 후 여액을 감압 증류하여 유기용매를 제거하고, 따뜻한(50 ℃) 에틸아세테이트에 녹였다. 반응혼합물을 여과한 여액을 저온에서 침전을 유도하고, 침전된 화합물은 감압 여과후 진공 감압하에 건조하여 백색 분말 형태의 mPEG-석시니미딜카보네이트(mPEG-succinimidylcarbonate) 화합물을 얻었다. 이상의 반응 과정을 다음 반응식 6에 나타내었다.
다음 반응식에서 n=22∼2273으로, 22∼909가 바람직하다. 이는 반응식 6∼8까지 적용된다.
상기 mPEG-석시니미딜카보네이트를 디클로로메탄에 녹여 상온에서 교반하였다. 이 혼합물에 1-아미노-3,3-디에톡시프로판(1-amino-3,3-diethoxypropane)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 유도하고, 침전된 혼합물은 감압 여과한 후 에틸아세테이트로 재결정하였다. 재결정 화합물은 감압 여과하고 디에틸에테르로 2 회 세척후 진공 감압 하에 12 시간 동안 건조하여 백색 분말 형태의 mPEG-프로피온알데히드디에틸아세탈 화합물을 얻었다. 이상의 반응 과정을 다음 반응식 7에 나타내었다.
상기 mPEG-프로피온알데히드디에틸아세탈을 인산(pH 1) 수용액에 녹여 40∼50 ℃ 조건 하에 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 상온으로 식힌 다음, 5 % 중탄산나트륨 수용액으로 pH를 6으로 조정하고 브라인(brine)을 넣어준 후 디클로로메탄으로 2 회 추출하였다. 추출된 유기층은 황산마그네슘으로 건조하고 유기용매를 감압 증류하여 제거하였다. 농축된 반응 혼합물에 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 유도하고, 침전된 화합물을 감압 여과후 진공 감압 하에 건조하여 백색 분말 형태의 메톡시PEG-우레탄-프로피온알데히드 화합물을 얻었다. 이상의 반응 과정을 다음 반응식 8에 나타내었다.
[실시예 3] 펜던트 PEG-아미드-프로피온알데히드의 제조
메톡시PEG(MW 20,000) 또는 PEG(MW 20,000)이 들어있는 반응 용기에 노난(nonane)을 넣고 140∼145 ℃ 온도 조건으로 상승시키면서 교반하였다. 이 반응 혼합물에 아크릴산(acrylic acid)과 반응 개시제 t-부틸 퍼옥시벤조에이트(t-butyl peroxybenzoate)를 각각 1.5 시간 동안 천천히 첨가하였다. 반응물 첨가후 약 1 시간 동안 140∼145 ℃ 조건 하에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 증류하여 노난을 제거하고 메탄올을 가하여 균일한 액상이 되도록 가열한 후 교반하였다. 이 혼합물을 여과지로 여과한 후 메탄올과 증류수의 혼합용액(9:1)을 가하고 팔 필트론 울트라필트레이션 장치(Pall Filtron Ultrafiltration system)로 정제하였다. 정제된 혼합물을 감압 증류하여 용매를 제거한 후 아세톤과 이소프로필알콜의 혼합용액(1:1)을 가하고 가열하여 균일한 용액을 얻었다. 이 혼합 용액을 0 ℃ 조건에서 12 시간 동안 방치하여 침전을 유도하였다. 침전된 화합물을 아세톤과 이소프로필알콜의 혼합용액(1:1)으로 3 회 및 디에틸에테르로 1 회 세척하면서 감압 여과하고, 진공 감압하에 건조하여 백색 분말 형태의 펜던트-PEG-프로피온산(pendant-PEG-propionic acid) 화합물을 얻었다. 이상의 반응 과정을 다음 반응식 9에 나타내었다.
다음 반응식에서 n=113∼22,728로, 113∼2273이 바람직하고. m=1∼20이다. 이는 반응식 9∼12까지 적용된다.
상기 펜던트-PEG-프로피온산을 디클로로메탄에 녹여 0∼5 ℃ 조건 하에 교반하였다. 이 혼합물에 N-하이드록시석시니미드를 첨가한 다음, 디사이클로헥실카르보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide, DCC)와 4-(디메틸아미노)피리딘[4-(dimethylamino)pyridine, DMAP]을 디클로로메탄에 녹여 0∼5 ℃ 조건 하에 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 약 15 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 여과하여 부산물인 디사이클로헥실우레아(dicyclohexylurea)를 제거하고 감압 증류하여 유기용매를 제거하였다. 농축된 반응 혼합물은 에틸아세테이트로 재결정하였다. 재결정 화합물은 감압 여과하고 디에틸에테르로 2 회 세척후 진공 감압 하에 12 시간 동안 건조하여 백색 분말 형태의 펜던트-PEG-석시니미딜 프로피오네이트(pendant PEG-succinimidyl propionate) 화합물을 얻었다. 이상의 반응 과정을 다음 반응식 10에 나타내었다.
상기 펜던트-PEG-석시니미딜 프로피오네이트를 디클로로메탄에 녹여 상온에서 교반하였다. 이 혼합물에 1-아미노-3,3-디에톡시프로판(1-amino-3,3-diethoxypropane)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 유도하고, 침전된 혼합물은 감압 여과한 후 에틸아세테이트로 재결정하였다. 재결정 화합물은 감압 여과하고 디에틸에테르로 2 회 세척후 진공 감압 하에 12 시간 동안 건조하여 백색 분말 형태의 펜던트-PEG-프로피온알데히드디에틸아세탈 화합물을 얻었다. 이상의 반응 과정을 다음 반응식 11에 나타내었다.
상기 펜던트-PEG-프로피온알데히드디에틸아세탈을 인산(pH 1) 수용액에 녹여 40∼50 ℃ 조건 하에 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 상온으로 식힌 다음, 5 % 중탄산나트륨 수용액으로 pH를 6으로 조정하고 브라인(brine)을 넣어준 후 디클로로메탄으로 2 회 추출하였다. 추출된 유기층은 황산마그네슘으로 건조하고 유기용매를 감압 증류하여 제거하였다. 농축된 반응 혼합물에 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 유도하고, 침전된 화합물을 감압 여과후 진공 감압하에 건조하여 백색 분말 형태의 펜던트-PEG-아미드-프로피온알데히드(pendant PEG-amide propionaldehyde) 화합물을 얻었다. 이상의 반응 과정을 다음 반응식 12에 나타내었다.
[실시예 4]
G-CSF와 직선형 메톡시PEG-아미드-프로피온알데히드의 배합(conjugation)
위 실시예 1에서 제조한 분자량 1,000∼40,000의 직선형 메톡시PEG-아미드-프로피온알데히드와 G-CSF 단백질을 배합하는데, G-CSF:PEG의 몰비율(molar ratio)이 1:1∼1:5가 되도록 준비하고 소디움 시아노보로하이드라이드를 포함하는 NaH2PO4, pH 6.0 완충용액에서 반응시켜 PEG-G-CSF 배합체를 형성하였다. 반응은 실온에서 5∼20 시간 동안 수행하며, 배합체의 완성은 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-polyacrylamide electrophoresis)으로 확인하였다.
[실시예 5]
G-CSF와 직선형 메톡시PEG-우레탄-프로피온알데히드의 배합
위 실시예 2에서 제조한 분자량 1,000∼40,000의 직선형 메톡시PEG-우레탄-프로피온알데히드와 G-CSF 단백질을 배합하는데, G-CSF:PEG의 몰비율이 1:1∼1:5가 되도록 준비하고 소디움 시아노보로하이드라이드를 포함하는 NaH2PO4, pH 6.0 완충용액에서 반응시켜 PEG-G-CSF 배합체를 형성하였다. 반응은 실온에서 5∼20 시간 동안 수행하며, 배합체의 완성은 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동으로 확인하였다.
[실시예 6]
G-CSF와 펜던트형 PEG-아미드-프로피온알데히드의 배합
위 실시예 3에서 제조한 분자량 5,000∼1,000,000의 PEG 뼈대에 1∼20 개의 아미드-프로피온알데히드 그룹을 갖는 펜던트 PEG-아미드-프로피온알데히드와 G-CSF 단백질을 배합하는데, G-CSF:PEG의 몰비율이 1:1∼1:5가 되도록 준비하고 소디움 시아노보로하이드라이드를 포함하는 NaH2PO4, pH 6.0 완충용액에서 반응시켜 PEG-G-CSF 배합체를 형성하였다. 반응은 실온에서 5∼20 시간 동안 수행하며, 배합체의 완성은 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동으로 확인하였다.
[실시예 7]
G-CSF와 펜던트형 PEG-우레탄-프로피온알데히드의 배합
분자량 5,000∼1,000,000의 PEG 뼈대에 1∼20 개의 우레탄-프로피온알데히드 그룹을 갖는 펜던트 PEG-우레탄-프로피온알데히드와 G-CSF 단백질을 배합하는데, G-CSF:PEG의 몰비율이 1:1∼1:5가 되도록 준비하고 소디움 시아노보로하이드라이드를 포함하는 NaH2PO4, pH 6.0 완충용액에서 반응시켜 PEG-G-CSF 배합체를 형성하였다. 반응은 실온에서 5∼20 시간 동안 수행하며, 배합체의 완성은 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동으로 확인하였다.
본 발명에 따라 제조된 G-CSF의 아미노 말단의 알파-아미노기에 메톡시PEG-프로피온알데히드 유도체가 결합된 배합체는, G-CSF의 항원유발성을 감소시키고 생리활성 저하를 최대한 감소시키면서 체내 잔존 시간을 증가시켜 향상된 약동학 프로필(pharmacokinetic profile)과 약리적 성질을 갖게 되므로, 골수이식(bone marrow transplantation) 후 호중구 회복 촉진제, 항암 화학요법(chemotherapy)에 의한 호중구 감소증(neutropenia) 치료제, 그리고 여러 감염 질환에 대한 예방 및 치료제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (7)
- 삭제
- 삭제
- G-CSF (granulocyte-colony stimulating factor, 과립구 집락 자극 인자)의 아미노 말단(amino-terminus, N-terminus)의 알파-아미노기(α-amino group)에 직선(linear)형 메톡시폴리에틸렌글리콜-프로피온알데히드(methoxypolyethylene glycol-propionaldehyde) 유도체가 결합된 배합체(conjugate)에 있어서, 상기 직선형 메톡시폴리에틸렌글리콜-프로피온알데히드 유도체는 메톡시폴리에틸렌글리콜-아미드(amide)-프로피온알데히드 유도체 또는 메톡시폴리에틸렌글리콜-우레탄(urethane)-프로피온알데히드 유도체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 배합체.
- 삭제
- 제 3 항에 있어서, 상기 직선형 메톡시폴리에틸렌글리콜-프로피온알데히드 유도체는 분자량 범위가 1,000∼40,000인 것을 특징으로 하는 배합체.
- G-CSF (granulocyte-colony stimulating factor, 과립구 집락 자극 인자)의 아미노 말단(amino-terminus, N-terminus)의 알파-아미노기(α-amino group)에 펜던트(pendant)형 폴리에틸렌글리콜-프로피온알데히드(methoxypolyethylene glycol-propionaldehyde) 유도체가 결합된 배합체(conjugate)에 있어서, 상기 펜던트형 폴리에틸렌글리콜-프로피온알데히드 유도체는 펜던트 폴리에틸렌글리콜-아미드-프로피온알데히드 유도체 또는 펜던트 폴리에틸렌글리콜-우레탄-프로피온알데히드 유도체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 배합체.
- 제 6 항에 있어서, 상기 펜던트형 폴리에틸렌글리콜-프로피온알데히드 유도체는 폴리에틸렌글리콜 뼈대의 분자량 범위가 5,000∼1,000,000으로, 펜던트 그룹인 아미드-프로피온알데히드 또는 우레탄-프로피온알데히드의 개수가 1∼20인 것을 특징으로 하는 배합체.
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