KR20130137966A - 생체적합성 고분자가 접합된 단백질 및 이의 제조방법 - Google Patents

생체적합성 고분자가 접합된 단백질 및 이의 제조방법 Download PDF

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KR20130137966A
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Abstract

본 발명은 생체적합성 고분자가 접합된 단백질 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 생체적합성 고분자가 접합된 단백질의 제조방법은 생체적합성 고분자를 단백질 C-말단에 위치 선택적으로 접합시킴으로써 단백질의 고유 활성이 유지되며, 종래 기술에 비해 반응 수율 및 생산 수율이 높아, 단백질 의약품의 체내 안정성 및 지속성을 증진시키는 우수한 효과가 있다.

Description

생체적합성 고분자가 접합된 단백질 및 이의 제조방법 {Biocompatible polymer-conjugated protein and method for preparing the same}
본 발명은 생체적합성 고분자가 접합된 단백질 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
단백질, 펩타이드, 앱타머, siRNA 등의 바이오 의약품은 단백질 분해효소 (proteinase), 펩타이드 분해효소 (peptidase), 핵산 분해 효소 (nuclease) 등에 의해 몸 안에서 쉽게 분해되거나, 신장을 통해 빠르게 배출되기 때문에, 수 분에서 수 시간 정도의 짧은 체내 반감기를 가지는 것으로 알려져 있다. 따라서, 바이오 의약품을 이용하여 지속적으로 치료 효과를 얻기 위해서는 매일 혹은 적어도 일주일에 3회 이상 주사로 투여하여야 한다.
최근, 바이오 의약품의 중요성이 점점 부각되면서 세계적인 다국적 제약회사들을 중심으로 약물전달시스템 개발에 대한 연구가 전 세계적으로 활발하게 진행되고 있다. 특히, 고분자를 이용한 장기약효 지속제형 및 서방출성 제형과 관련하여 많은 제품들이 상업화되었으며, 보다 효율적인 제품화 기술 확보를 위한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 특히, 단백질 공학 기술을 이용한 장기 약효 지속형 단백질 치료제 제조기술의 발전은 인류의 의료복지 향상에 기여할 수 있을 것으로 예상된다.
바이오 의약품 중의 하나인, 성장 호르몬 (growth hormone)은 1950년대 초에 개발되었으며 뇌하수체 기능 감퇴증으로 인한 성장호르몬결핍증을 치료하는데 성공적으로 이용되었다. 또한, 소아성장호르몬결핍증, 성인성장호르몬결핍증, 만성신부전증, 터너 증후군 및 AIDS에 의한 이차적인 악액질 등 다양한 적응증에 대해 성장 호르몬의 판매승인이 이루어졌다. 이러한 성장 호르몬 치료의 가장 큰 단점은 짧은 체내 반감기, 신장 독성, 빈번한 주사 등이 있다. 즉, 1일 1회 또는 일주일에 3회 이상 주사로 투여하여야 하기 때문에, 이에 따르는 항원성 또는 면역원성 등의 부작용이 문제가 되고 있다. 따라서, 지속형 hGH (2세대 제제)에 대한 연구 개발이 국내외적으로 활발하게 진행되고 있으나, 아직까지 주당 6-7회 주사하는 1세대 성장호르몬요법이 대부분 사용되고 있다.
인간 에리스로포이에틴(erythropoietin, EPO)은 적혈구 전구세포의 마지막 성숙과 성장을 조절하는 역할을 하는 호르몬으로서(Goldwasser 등, Ann. NY Acad. Sci., 149, 49, 1968), 주로 태아 간이나 성인 신장에서 생산되며, 혈액 내 인간 EPO의 양은 저산소 혈중상태에서 증가하여, 그 결과로 성숙한 산소전달 적혈구 세포의 생산을 조절한다. 인간은 정상적인 조직의 기능을 위해 적정한 수준의 적혈구 수를 유지하고 있으므로 적혈구 수가 감소하면 조직의 기능 장애가 일어나 빈혈을 일으키게 된다. 인간 EPO는 1977년에 미야케 등이 재생불량성 빈혈환자의 뇨로부터 대량 분리, 정제하는데 최초로 성공한 이후(Miyake 등, J. Biol. Chem., 252(15), 5558, 1977), 분자생물학과 당생물학에서 연이은 연구가 본격화되기 시작하여 야나가와 등에 의해 N-말단 30개의 아미노산 서열이 처음으로 보고되었고 (Yanagawa 등, J. Biol. Chem., 295(5), 2707, 1984), 2년 후에는 래이 등이 인간 뇨 유래 EPO로부터 전체 아미노산 서열을 결정하여 보고하였다(Lai 등, J. Biol. Chem., 261, 3116, 1986). 천연형 인간 EPO는 산성(acid), 단일형(monomer)의 당단백질로서 전체 분자량이 약 34,000 달톤 정도이며, 당을 제외한 단백질 부분만의 분자량은 약 18,000 달톤이다(Wang 등, Endocrinology, 116, 2286, 1985). 인간 EPO에서 전체 분자량의 약 40%인 당쇄 부분은 인간 EPO의 생체 내 활성 및 구조 안정성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 왔다(Linda et al, J. Biological Chemistry 266, 23022-23026(1991)). 따라서, 인간 EPO의 당 함량이 감소되면 인간 EPO 분자의 생물학적 반감기가 급격히 감소되어 인간 EPO의 생체 내 생물학적 활성이 소실된다(Goto 등, Biotechnology, 6, 67, 1988).
콜로니 자극인자(CSF)는 산성의 당 단백으로서 조혈원세포(Hematopoietic Progenitor Cell)의 생존, 분열 및 분화에 필수적인 요소이며(Burgess, A.W. and Metcalf, D, Blood, 56, 947-958, 1980, Metcalf, D., The hemopoietic colony stimulating factors, Elservier, Amsterdam, 1984), 과립구콜로니자극인자 (granulocyte colony stimulating factor, GCSF)는 골수 원세포(bone marrow precursor cell)의 과립구군으로의 분열 및 분화를 촉진시키는 인자로 확인되었다(Nicola, N.A., Metcalf, D., Matsumoto, M. and Johnson, G.R., J. Biol. Chem., 258, 9017-9023, 1983).
인터페론 (interferon)은 바이러스의 침입을 받은 세포에서 분비되는 단백질로 바이러스의 침입에 대하여 저항하도록 생체내의 세포들을 자극하는 물질이며 또한 이것은 바이러스의 침입을 받지 않은 세포들의 표면에 붙어 그들을 보호하며, 1957년에 아이작(Isacc)과 린든먼(Lindenmann)에 의해 그 존재가 밝혀진 이래, 항바이러스의 역할이 밝혀지면서 관심이 모아져 급격히 연구가 진행되었으며, 최근 들어 인터페론의 항바이러스 효과와 항암효과가 입증되어 암치료, 바이러스 질환의 예방 치료 및 응용 연구가 진행되고 있다. 또한 두상포진, B형 간염, C형 간염, AIDS 등의 바이러스성 질환에 효과가 있는 것으로 밝혀졌고 현재는 재조합 DNA 기술을 이용하여 인공적으로 대량 생산하고 있다.
한편, PEGylation은 기존의 단백질 약물의 생물학적 반감기를 극대화하고, 생체 내에서의 약효를 지속적으로 유지하며, 기존의 빈번한 투여로 인해 약물의 부작용인 면역원성 및 항원성을 감소시키기 위한 DDS (Drug delivery system) 기술이다. PEG는 수용성 생체 적합성 고분자로 단백질/펩타이드에 공유결합하여 그 단백질의 물리적 성질을 변화시킴으로써 체내 안정성을 증가시키는 역할을 한다.
그러나 대부분의 PEG 접합은 비선택적으로 행해졌으며, 이에 따라 생물학적 활성을 나타내는 부위의 PEG에 의한 블로킹 (blocking) 등의 문제가 있어, 활성이 현저히 떨어지거나, PEG 수식 부위별로 활성의 불균일성을 보이는 등의 문제점을 가지고 있었다.
현재까지 8개의 PEGylated 제품이 치료제로 사용되고 있으며, 특히 2002년에 미 FDA 허가를 받은 C형 간염 치료제인 PEG-interferon은 1주 1회 주사제로 개발되어 그 규모가 2004년에 13억불을 초과하였으며, 기존의 1주 3회 주사제인 1세대 Interferon 시장을 70% 이상 빠르게 대체하고 있다.
한편, 현재까지 국내외 제약사 및 바이오텍사들이 연구 개발을 하고 있는 hGH의 PEG 접합기술은, 추가로 시스테인을 삽입하는 위치 지정 돌연변이(site directed mutagenesis)를 통하여 hGH 돌연변이 단백질(mutein)을 만든 후 PEG를 특정 부위에 접합하거나(WO 99/03887, WO00/42175), GH 변이체 (variant)의 라이신 (lysine) 부위에 PEG를 접합하는 방법(US5849535, US6004931) 등이 있다. 그러나 상기 방법을 통해 hGH에 PEG를 접합시킬 경우, 특정한 부위에 PEG가 접합되지 않고 여러 반응 가능한 부위에 PEG가 접합되며, 접합 PEG의 개수도 일정치 않아 필요에 따라 여러 과정을 거쳐 mono-PEGylated, di-PEGylated, tri-PEGylated 등 PEG-hGH 접합체를 분리 정제하여야 하기에, 반응 수율 및 생산 수율이 낮은 문제점이 있었다. 또한, 분리 정제과정을 거쳐 mono-PEG-hGH를 분리하더라도, 각각 다른 라이신기에 접합된 위치 이성질접합체가 생성되어 생물학적 활성이 일정치 않은 문제점도 있었다.
또한, G-CSF의 경우, 메톡시 PEG 카르복시메틸-N-하이드록시 석시니미딜 에스테르(methoxy PEG carboxymethyl-N-hydroxy succinimidyl ester)와 반응시켜 G-CSF-폴리머 결합체를 생성하고, 생성된 결합체의 불안정한 링커(linker)를 제거하기 위해 2몰의 하이드록실아민(hydroxylamine)(pH7.3)으로 처리하고 pH를 3.5로 낮추는 방법이 있다(Kinstler et al ., 1996, Pharmaceutical Res. 13(7):996-1002). 또한, 니벤 등(Niven et al ., J. of Contr., Rel. 32, 177-189, 1994)은 재조합 인간 과립구-군 자극인자(rhG-CSF)의 PEG와 결합을 보여주었고, EP 0,401,384은 G-CSF에 PEG을 결합시키는 방법 및 물질들에 대해 설명하였고, EP 0,473,268에는 여러 가지 G-CSF 유사체에 수용성 입자 폴리머인 PEG를 공유 결합하여 만든 G-CSF 결합체에 대한 보고가 있다. 미국특허 제5824778호는 G-CSF의 아민기나 카르복실기에 PEG를 결합한 접합체에 대해 개시하였다. 그러나 상기 미국특허에서는 단백질의 카르복실기를 활성화하기 위해 사용되는 EDAC를 과량으로 사용함으로써 여러 잔기의 카르복실기가 활성화되어 다수의 PEG가 결합되었으며, 수득된 PEG-G-CSF 접합체의 분자량 측정 결과 다양한 분자량 분포의 불균질 혼합물 형태로 접합체가 생성되었으며 단백질 활성이 상당히 저하되었다. 또한, 부착된 PEG의 수 및 위치가 상이한 PEG 결합 단백질의 이종성(heterogeneous) 혼합물을 생성하게 된다. 따라서 동일한 수의 PEG가 결합된 단백질 또는 단일한 타입 또는 동종성(homogeneous)의 PEG 결합 단백질을 얻기 위해서는 부차적인 시간 및 비용이 소요되는 정제 및 분리 과정을 거쳐야 하는데, 이로 인하여 특정 PEG 결합 단백질의 전체적인 수율을 감소시키게 하는 문제점이 있었다.
또한, EPO의 경우, 기존의 PEG-EPO의 접합체는 주로 EPO의 아민기에 PEG가 접합된 것으로서, 많은 생물학적 활성 물질, 예를 들어 단백질의 경우, 라이신에 PEG가 접합되면 상당한 생물 활성을 잃게 된다는 보고가 있다. EPO는 단 8개의 라이신기만을 가지고 있어 활성 감소의 문제가 있을 수 있으며, 또한 라이신에 접합되는 PEG의 수가 많을수록 EPO의 생리 활성은 더 감소하는 것으로 보고되고 있다(WO 94/28024). 그 예로 PCT/JP01/08539에서 PEG 유도체가 EPO의 라이신의 아민기에 결합한 경우, PEG의 결합 수가 증가함에 따라 생물학적 활성이 천연(native) EPO에 비해 13 % 내지 0.79 %만 유지하는 것으로 보고되고 있다. 또한 미국 엔존사의 PCT/US92/02047 (WO 92/16555)는 펩타이드 상의 카르복실기(carboxylic acid group of a peptide moiety)에 PEGylation 되는 것을 기재하고 있으며, 카르복시기와 반응된 결합형태로 diacylhydrazine linkage를 사용하여 하나 또는 그 이상의 폴리머가 결합되는 것을 보고하고 있다.
이에 본 발명자들은 상기한 바와 같이, 종래 PEG 접합기술이 가지고 있는 단점을 보완하고, 반응 수율 및 생체 수율이 높으면서도, 체내 안정성과 지속성이 높은 생체적합성 고분자가 접합된 단백질 약물의 제조방법을 개발하기 위한 연구를 계속한 결과, 목적 단백질의 C말단에 위치 선택적으로 생체적합성 고분자가 접합되며, 단백질 당 하나의 생체적합성 고분자만을 도입하고, 단백질 발현, 제조 시 생체적합성 고분자를 동시에 접합할 수 있는 방법을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 생체적합성 고분자가 접합된 단백질 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 생체적합성 고분자가 접합된 단백질 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 생체적합성 고분자가 접합된 단백질의 제조방법은 생체적합성 고분자를 단백질 C-말단에 위치 선택적으로 접합시킴으로써 단백질의 고유 활성이 유지되며, 종래 기술에 비해 반응 수율 및 생산 수율이 높아, 단백질 의약품의 체내 안정성 및 지속성을 증진시키는 우수한 효과가 있다.
도 1은 pTXB1 벡터의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 2는 인테인을 이용한 목적 단백질의 분리 정제 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3 은 hGH의 염기서열 및 프라이머 위치를 나타낸 도이다.
도 4는 pTXB1-hGH 벡터의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 5는 pTXB1-hGH 벡터 내의 hGH를 PCR을 통해 확인한 도이다.
도 6은 pTXB1-hGH 벡터 내의 hGH를 제한효소 분석을 통해 확인한 도이다.
도 7 은 pTXB1-hGH를 시퀀싱을 통해 클로닝이 제대로 이루어졌는지를 나타낸 도이다.
도 8은 2-머캅토에탄올을 이용하여 hGH 단백질의 분리, 정제됨을 SDS-PAGE를 통해 확인한 도이다.
도 9는 mPEG164-SH 합성 과정을 나타낸 도이다.
도 10은 mPEG164-SH 합성 과정 중 1차 반응물을 TLC를 통해 확인한 도이다.
도 11은 mPEG164-SH 합성 과정 중 최종 산물을 TLC를 통해 확인한 도이다.
도 12는 mPEG350-SH 합성 과정을 나타낸 도이다.
도 13은 mPEG350-SH 합성 과정 중 1차 반응물을 TLC를 통해 확인한 도이다.
도 14는 mPEG350-SH 합성 과정 중 최종 산물을 1H NMR을 통해 확인한 도이다.
도 15는 mPEG2K-SH 합성 과정을 나타낸 도이다.
도 16은 mPEG2K-SH 합성 과정 중 1차 반응물을 TLC를 통해 확인한 도이다.
도 17은 mPEG2K-SH 합성 과정 중 1차 반응물을 1H NMR을 통해 확인한 도이다.
도 18은 mPEG2K-SH 합성 과정 중 2차 반응물을 1H NMR을 통해 확인한 도이다.
도 19는 mPEG2K-SH 합성 과정 중 최종 산물을 TLC를 통해 확인한 도이다.
도 20은 mPEG2K-SH 합성 과정 중 최종 산물을 1H NMR을 통해 확인한 도이다.
도 21은 mPEG5K-Cys 합성 과정을 나타낸 도이다.
도 22는 mPEG5K-Cys 합성 과정 중 최종 산물을 1H NMR을 통해 확인한 도이다.
도 23은 mPEG5k-SH 합성 과정을 나타낸 도이다.
도 24는 mPEG20k-SH 합성 과정을 나타낸 도이다.
도 25는 mPEG20k-Cys 합성 과정을 나타낸 도이다.
도 26은 mPEG20k-Cys 합성 과정 중 최종 산물을 1H NMR을 통해 확인한 도이다.
도 27은 목적 단백질에 생체적합성 고분자를 결합시키는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 28은 thiolated PEG를 이용하여 PEGylation된 hGH가 수득됨을 SDS-PAGE를 통해 확인한 도이다.
도 29는 pegylated hGH 단백질 조각을 사이즈 배제 컬럼으로 정제한 후, HPLC 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 30은 pegylated hGH 단백질 조각을 사이즈 배제 컬럼으로 정제한 후, SDS-PAGE를 통해 확인한 도이다.
도 31은 pegylated hGH 단백질 조각을 CM 컬럼으로 정제한 후, HPLC 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 32는 pegylated hGH 단백질 조각을 CM 컬럼으로 정제한 후, SDS-PAGE를 통해 확인한 도이다.
도 33은 PEGylated 단백질의 생물학적 활성을 나타낸 도이다.
본 발명은 (a) 목적 단백질의 C-말단에 시스테인 및 인테인 (intein)을 삽입하는 단계;
(b) 티올 (thiol, -SH)기를 가진 생체적합성 고분자 유도체를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 (a) 단계의 목적 단백질 및 (b) 단계의 생체적합성 고분자 유도체를 반응시키는 단계;를 포함하는, 생체적합성 고분자가 접합된 단백질의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
상기 (a) 단계는 목적 단백질의 C-말단에 시스테인 및 인테인을 삽입하는 단계로, 상기 인테인은 목적 단백질의 C-말단에 선택적인 작용기를 결합시키기 위해 도입된다. 상기 인테인의 삽입 시, 인테인은 목적 단백질의 분리 정제를 위해 키틴 바인딩 도메인 (CBD, chitin binding domain)과 연결된 형태일 수 있고, 상기 인테인의 삽입을 위해 pTXB1 벡터를 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 (a) 단계에서 목적 단백질은 성장 호르몬 (growth hormone, GH), 에리스로포이에틴(erythropoietin, EPO), 과립구콜로니자극인자 (granulocyte colony stimulating factor, GCSF), 인터페론 (interferon) 등이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.
상기 (b) 단계는 티올 (thiol, -SH)기를 가진 생체적합성 고분자 유도체를 제조하는 단계로, 상기 생체적합성 고분자를 티올기로 치환시키는 방법은 당업계에 공지된 방법으로 수행될 수 있다.
상기 (b) 단계에서 생체적합성 고분자는, 천연 또는 인공 합성 고분자 물질 등 생물학적 활성 물질에 부가될 수 있는 인체에 유용한 모든 생체적합성 고분자를 총칭한다.
본 발명에서 "생체적합성"이란 생체 독성 반응, 염증 반응, 면역 반응, 발암성 등을 일으킴이 없이, 생체에 무독 무해하고 면역학적 거부 반응을 일으키지 않으면서 생체 조직이나 생체 시스템과 좋은 친화성으로 양립할 수 있는 능력을 말한다.
상기 (b) 단계에서 생체적합성 고분자는 다양한 용매에 쉽게 용해될 수 있고 평균 분자량이 약 100 달톤 내지 약 100,000 달톤, 바람직하게는 약 2,000 달톤 내지 약 40,000 달톤인 생체적합성 고분자로서, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리트리메틸렌글리콜, 폴리락트산 및 이들의 유도체, 폴리아크릴산 및 그의 유도체, 폴리아미노산, 폴리비닐 알콜, 폴리우레탄, 폴리포스파진, 폴리(L-라이신), 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴아마이드 및 이들의 둘 이상의 공중합체로 이루어진 그룹 중에서 선택된 비면역원성 고분자 물질이 포함되고, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)이며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 생체적합성 고분자에는 선형 고분자뿐만 아니라, 문헌[미국 특허 제5,643,575호 및 미국 특허 제5,919,455호]에 기재된 바와 같이, 지방족 연결 잔기를 통해 친핵성 치환을 수행할 수 있는 활성화 작용기에 결합된 수용성 비항원성 고분자가 포함된다.
상기 (c) 단계는 (a) 단계의 목적 단백질 및 (b) 단계의 생체적합성 고분자 유도체를 반응시키는 단계로, 키틴 비드를 통해 이루어질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 제조방법에 따라 생체적합성 고분자가 접합된 단백질을 제조할 경우, 생체적합성 고분자를 단백질 C-말단에 위치 선택적으로 접합시킴으로써 단백질의 고유 활성이 유지되며, 단백질 당 하나의 생체적합성 고분자만을 도입할 수 있어 균일한 단백질 활성을 나타내며, 단백질 발현, 제조 시 생체적합성 고분자를 동시에 접합할 수 있어 종래 기술에 비해 반응 수율 및 생산 수율이 높은 우수한 효과를 가지고 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 생체적합성 고분자가 접합된 단백질을 제공한다.
본 발명의 생체적합성 고분자가 접합된 단백질은, 기존 단백질 약물이 가지는 단점을 극복하고, 체내 안정성 및 지속성이 우수하여, 기존 단백질 약물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 용도로 이용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 1일 10 μg 내지 500 mg의 양으로 투여할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 기존의 1일 1회 내지 수 회 또는 2일 1회인 치료용 약물을 주 1회 또는 2주 1회의 투여 등의 횟수로 대폭 줄여 빈번한 투여로 인한 약물 독성 및 부작용을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인테인 기반 단백질 발현 벡터 설계
단백질 C-말단에 위치 선택적으로 PEG가 접합된 단백질을 제조하기 위하여, 크기가 작고 박테리아 시스템에서 높은 발현 효율을 보이는 pTXB1 벡터(NEB, USA)를 이용하였다.
pTXB1 벡터 시스템은 마이코박테리움 제노피(Mycobacterium xenopi)의 gryA 유전자 서열 중 호밍 엔도뉴클레아제 (homing endonuclease) 서열을 제거함으로써 만들어진 198개의 아미노산으로 이루어진 미니 인테인 (intein)을 포함하고 있다. 상기 pTXB1 벡터의 구체적인 벡터맵을 도 1에 나타내었다.
목적 단백질의 분리, 정제를 위하여 키틴 바인딩 도메인(CBD: chitin binding domain)을 도입하였으며, 최종적으로 목적 단백질의 C 말단이 Mxe Gry 인테인 및 키틴 바인딩 도메인과 연결된 형태의 접합 단백질로 발현된다. 상기 과정의 모식도를 도 2에 나타내었다.
실시예 2. pTXB1 -목적 단백질 ( target protein ) 벡터 제조
2.1. pTXB1 - hGH 벡터 제조
목적 단백질로 인간 성장 호르몬 (human growth hormone)을 설정하고, hGH cDNA 클론이 삽입된 cDNA 라이브러리용 벡터(TAKARA, Otsu, Japan)를 주형(template)으로 하여 PCR을 이용해 인테인의 접합 단백질이 발현될 수 있는 pTXB1-hGH 벡터를 구축하기 위한 클로닝을 수행하였다.
2-1-1. 프라이머 제조
pTXB1 벡터에 도입할 hGH 재조합 DNA는 인간 뇌하수체 (human pituitary) cDNA 라이브러리에서 스크리닝하여 수득하였다. hGH 아미노산 서열 중 N 말단에 위치한 26개 아미노산으로 이루어진 신호 펩타이드 (signal peptide) 및 종결 코돈 (stop codon)을 제외한 mature hGH를 수득하기 위한 프라이머를 설계하였다. 상기 프라이머 서열을 표 1에 나타내었다.
정방향 프라이머 (forward primer) cat atg TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG C (5’- 3’)
역방향 프라이머 (reverse primer) g gctcttc cgca GAA GCC ACA GCT GCC CTC CAC AGA GCG (5’- 3’)
표 1에 나타낸 바와 같이, hGH를 증폭하기 위한 정방향 프라이머 (forward primer)는 5’에 pTXB1 벡터에 도입하기 위한 Nde I 제한효소 인식 서열을 포함하고 있으며, 역방향 프라이머 (reverse primer)는 Sap Ⅰ 제한효소 인식 서열 및 재조합 벡터 구축 후 단백질 발현 시에 목적 단백질과 인테인 사이에 시스테인 (cystein)을 삽입시켜 발현 후 PEG를 접합시키기 위한 링커 서열(gca)을 포함하고 있다.
2-1-2. 제한효소 처리 및 라이게이션
상기 프라이머를 이용하여 hGH유전자를 PCR을 통해 증폭하고, 상기 PCR 산물 및 pTXB1 벡터 각각을 제한효소(Nde Ⅰ 및 Sap Ⅰ 제한효소)로 동시에 절단한 후, 겔 추출(gel extraction)을 통해 정제하고, 이를 4°C에서 18시간 동안 라이게이션 (ligation)하였다. hGH의 cDNA 서열 및 프라이머 위치를 도 3에 나타내었으며, pTXB1-hGH 벡터의 벡터맵을 도 4에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, hGH 아미노산 서열의 N 말단에는 노란색 박스로 표시된 26 아미노산의 신호 펩타이드가 존재함을 확인하였다.
또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 목적 유전자인 hGH는 pTXB1의 Nde Ⅰ 및 Sap Ⅰ 제한효소 부위 사이에 라이게이션됨을 확인하였다.
2-1-3. pTXB1 - hGH 검증
라이게이션이 성공적으로 이루어졌는지를 확인하기 위하여, PCR 스크리닝 및 제한효소 분석을 수행하였다. 그 결과를 각각 도 5 및 도 6에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, PCR을 통해 pTXB1-hGH 벡터 내의 hGH를 확인한 결과, 573bp에서 밴드가 형성됨을 확인하였다.
또한 도 6에 나타낸 바와 같이, 제한효소 분석 결과 6.7kb (플라스미드) 및 573bp (hGH)에서 밴드가 형성됨을 확인하였다.
상기 결과를 다시 한번 검증하기 위하여, DNA 시퀀싱(Solgent, Daejeon, Korea)을 수행하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, sequence alignment 프로그램을 이용하여 분석한 결과, pTXB1-hGH 벡터에 mature hGH가 돌연변이 없이 완벽하게 삽입된 것을 확인하였다.
2-2. pTXB1 - EPO 벡터 제조
목적 단백질로 EPO를 설정하고, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 EPO cDNA를 PCR을 이용해 증폭하고, 인테인의 접합 단백질이 발현될 수 있는 pTXB1-EPO 벡터를 구축하기 위한 클로닝을 수행하였다. 제작된 pTXB1-EPO 벡터를 DNA 시퀀싱 후 sequence alignment 프로그램을 이용하여 분석한 결과, pTXB1-EPO 벡터에 EPO가 돌연변이 없이 완벽하게 삽입된 것을 확인하였다
2-3. pTXB1 - GCSF 벡터 제조
목적 단백질로 GCSF를 설정하고, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 GCSF cDNA를 PCR을 이용해 증폭하고, 인테인의 접합 단백질이 발현될 수 있는 pTXB1-GCSF벡터를 구축하기 위한 클로닝을 수행하였다. 제작된 pTXB1-GCSF벡터를 DNA 시퀀싱 후 sequence alignment 프로그램을 이용하여 분석한 결과, pTXB1-GCSF벡터에 GCSF가 돌연변이 없이 완벽하게 삽입된 것을 확인하였다
2-4. pTXB1 - IFN 벡터 제조
목적 단백질로 인터페론 (interferon)을 설정하고, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 인터페론 cDNA를 PCR을 이용해 증폭하고, 인테인의 접합 단백질이 발현될 수 있는 pTXB1-IFN 벡터를 구축하기 위한 클로닝을 수행하였다. 제작된 pTXB1-IFN 벡터를 DNA 시퀀싱 후 sequence alignment 프로그램을 이용하여 분석한 결과, pTXB1-IFN 벡터에 인터페론이 돌연변이 없이 완벽하게 삽입된 것을 확인하였다
실시예 3. 목적 단백질 정제 검증
3-1. hGH 단백질 정제 검증
대장균 BL21(DE3)을 실시예 2-1에서 제조한 pTXB1-hGH로 형질전환시킨 후, 18°C에서 7시간 동안 인덕션시켰다. 원심분리기를 이용하여 세포를 모으고, 초음파 처리하여 세포를 파괴하였다. 상기 파괴된 세포의 상층액을 활성화된 키틴 비드와 반응시킨 후, 분리 정제하였다. 상기 분리 정제된 hGH-intein-CBD는 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol)을 사용하여 thiol cleavage를 수행하였다. 상기 과정 중에 수득된 단백질 샘플을 SDS-PAGE를 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, SH기를 가지고 있는 2-머캅토에탄올 처리를 통해, hGH 단백질이 분리, 정제됨을 확인하였다.
3-2. EPO 단백질 정제 검증
대장균 BL21(DE3)을 실시예 2-2에서 제조한 pTXB1-EPO로 형질전환시킨 후, 18°C에서 7시간 동안 인덕션시켰다. 원심분리기를 이용하여 세포를 모으고, 초음파 처리하여 세포를 파괴하였다. 상기 파괴된 세포의 상층액을 활성화된 키틴 비드와 반응시킨 후, 분리 정제하였다. 상기 분리 정제된 EPO-intein-CBD는 2-머캅토에탄올을 사용하여 thiol cleavage를 수행하였다. 상기 과정 중에 수득된 단백질 샘플을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 그 결과, SH기를 가지고 있는 2-머캅토에탄올 처리를 통해, EPO 단백질이 분리, 정제됨을 확인하였다.
3-3. GCSF 단백질 정제 검증
대장균 BL21(DE3)을 실시예 2-3에서 제조한 pTXB1-GCSF로 형질전환시킨 후, 18°C에서 7시간 동안 인덕션시켰다. 원심분리기를 이용하여 세포를 모으고, 초음파 처리하여 세포를 파괴하였다. 상기 파괴된 세포의 상층액을 활성화된 키틴 비드와 반응시킨 후, 분리 정제하였다. 상기 분리 정제된 GCSF-intein-CBD는 2-머캅토에탄올을 사용하여 thiol cleavage를 수행하였다. 상기 과정 중에 수득된 단백질 샘플을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 그 결과, SH기를 가지고 있는 2-머캅토에탄올 처리를 통해, GCSF 단백질이 분리, 정제됨을 확인하였다.
3-4. Interferon 단백질 정제 검증
대장균 BL21(DE3)을 실시예 2-4에서 제조한 pTXB1-IFN로 형질전환시킨 후, 18°C에서 7시간 동안 인덕션시켰다. 원심분리기를 이용하여 세포를 모으고, 초음파 처리하여 세포를 파괴하였다. 상기 파괴된 세포의 상층액을 활성화된 키틴 비드와 반응시킨 후, 분리 정제하였다. 상기 분리 정제된 IFN-intein-CBD는 2-머캅토에탄올을 사용하여 thiol cleavage를 수행하였다. 상기 과정 중에 수득된 단백질 샘플을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 그 결과, SH기를 가지고 있는 2-머캅토에탄올 처리를 통해, Interferon 단백질이 분리, 정제됨을 확인하였다.
실시예 4. PEG 유도체 제조
4-1. mPEG 164 - SH 의 제조
mPEG164-SH합성 과정을 도 9에 나타내었다. 보다 구체적으로는, mPEG164-OH (Ald.) 1g (6.1141mmol), TsCl (2eq.), 피리딘 (pyridine) (4eq.)을 MC 30ml에 처리한 후, 상온에서 19시간동안 반응하였다. 이를 MC 추출, 농축한 후, TLC 컬럼 (MC/MeOH)으로 분리하여, 1차 반응물을 수득하였다.
상기 1차 반응물 mPEG164-OTs(Y-III-95) 150mg (0.4711mmol)과 KSAc (2eq.)을 EtOH anhydrous 5ml에 처리하고, 90℃에서 하룻동안 반응한 후, 식혔다. 이를 MC 추출, 농축한 후, TLC 컬럼 (MC/MeOH)으로 분리하여, 최종 mPEG164-SH를 수득하였으며, NMR을 통해 확인하였다.
1차 반응물 및 최종 산물의 TLC 결과를 각각 도 10 및 도 11에 나타내었다.
4-2. mPEG 350 - SH 의 제조
mPEG350-SH 합성 과정을 도 12에 나타내었다. 보다 구체적으로는, mPEG350-OH 1.5g (4.2857mmol), CH3I 5ml(veryexcess), triphenylphosphite (3eq.)를 120℃에서 2일간 반응한 후, 식혔다. 이를 감압 농축한 후, TLC 컬럼 (MC/MeOH=20:1→15:1)으로 2회 분리하여, 1차 반응물을 수득하였다 (yield 76%, 1.5g).
상기 1차 반응물 mPEG350-I (Y-III-82) 1.5g (3.2616mmol)과 KSAc (2eq.)를 EtOH anhydrous 25ml에 처리하고, 90℃에서 2 일 동안 반응한 후, 식혔다. 이를 MC 추출, 농축한 후, 최종 mPEG350-SH를 수득하였으며, 1H NMR을 통해 확인하였다.
TLC 결과 및 1H NMR 결과를 각각 도 13 및 도 14에 나타내었다.
4-3. mPEG 2K - SH 의 제조
mPEG2K-SH 합성 과정을 도 15에 나타내었다. 보다 구체적으로는, mPEG2K-OH(Ald.) 1.3g (0.65mmol), CH3I5ml(veryexcess), triphenylphosphite(3eq.)를 120℃에서 42 시간동안 반응 시킨 후, 에테르로 침전하고 여과, 농축한 후, TLC 컬럼 (MC/MeOH)으로 분리하여, 1차 반응물을 수득하였다. TLC 결과 및 1H NMR 결과를 각각 도 16 및 도 17에 나타내었다.
상기 1차 반응물 mPEG2K-I1.3g(0.6161mmol)과 KSAc (2eq.)을 EtOH 20ml에 처리하고, 90℃에서 2 일동안 반응한 후, MC 추출, 에테르 침천하고, 여과 농축하여, TLC 컬럼 (MC/MeOH)으로 분리하여, 2차 반응물을 수득하였다. TLC 컬럼 데이터는 1차 반응물과 유사하게 나왔으며, 1H NMR 결과를 도 18에 나타내었다.
상기 2차 반응물 mPEG2K-Sac 1.2g (0.5831mmol)을 1N HCl 30ml에서 20시간 동안 환류하여 반응시킨 후, MC 추출, 에테르 침전하고, 여과 농축하여 TLC 컬럼 (MC/MeOH)으로 분리하여, 최종 mPEG2K-SH를 수득하였으며, 1H NMR을 통해 확인하였다.
TLC 결과 및 1H NMR 결과를 각각 도 19 및 도 20에 나타내었다.
4-4. mPEG 5K - Cys 의 제조
mPEG5K-Cys 합성 과정을 도 21에 나타내었다. 보다 구체적으로는, mPEG5K-SC1.4g (0.25mmol)과 CysHCl (10eq.)를 3차 증류수 50ml에 처리한 후, 상온에서 1시간동안 반응하였다 이를 MC 추출, 농축한 후, 에테르 침전하고 다시 여과, 농축하여 최종 mPEG5K-Cys를 수득하였으며, 1H NMR을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 22에 나타내었다.
4-5. mPEG 5k - SH 의 제조
mPEG5k-SH합성 과정을 도 23에 나타내었다. 보다 구체적으로는, mPEG5k-OH(Ald.)3.25g(0.65mmol)를 이용한 것을 제외하고는 실시예 4-3과 동일한 방법으로 합성하였다.
4-6. mPEG 20k - SH 의 제조
mPEG20k-SH 합성 과정을 도 24에 나타내었다. 보다 구체적으로는, MC 5ml에 3-mercaptopropionic acid 0.66㎕ (0.0075mmol), HCTU 3.1mg (0.0075mmol), DMF 0.06ml를 가하고 DIPEA 3㎕ (0.017mmol)를 가하였다. 여기에 mPEG20K-NH250mg (0.0025mmol)을 가한 후, 밤새 반응시키고, 용매를 감압 농축, 에테르 침전하고, 여과하여 최종 mPEG20k-SH를 수득하였다.
4-7. mPEG 20k - Cys 의 제조
mPEG20k-Cys합성 과정을 도 25에 나타내었다. 보다 구체적으로는, L-Cysteine·HCl 1.2mg (0.0076mmol)과 HCTU 3.1mg (0.0075mmol)을 MC 5ml에서 반응시키고, DIPEA 3㎕ (0.017mmol)와 mPEG20K-NH250mg(0.0025mmol)를 가한 후, 밤새 반응시켰다. 용매를 감압 농축한 후 에테르 침전하고, 여과하여 최종 mPEG20k-Cys를 수득하였으며, 1H NMR을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 26에 나타내었다.
실시예 5. 목적 단백질의 PEGylation 실시
5-1. hGH 의 PEGylation
5-1-1. hGH 의 PEGylation 실시
상기 실시예 3-1에서 수득한 hGH-인테인-CBD 단백질과 상기 실시예 4-5에서 수득한 PEG 유도체를 반응시켜, hGH 단백질의 PEGylation을 유도하였다. 보다 구체적으로는, 키틴 비드를 이용하여 상기 단백질을 정제하였으며, 5,000 kDa의 mPEG-SH를 사용하여 단백질을 절단하였다. 약 4시간 후 PEGylation이 이루어진 것을 확인하였다. 목적 단백질의 PEGylation 과정의 모식도를 도 27에 나타내었다. 또한, 상기 과정 중에 수득된 단백질 샘플을 SDS-PAGE를 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 28에 나타내었다.
도 28에 나타낸 바와 같이, thiolated PEG 유도체와의 반응을 통해, PEGylation 된 hGH가 수득된 것을 확인하였다.
5-1-2. hGH 의 PEGylation 검증
상기 실시예 5-1-1에서 제조한 hGH의 PEGylation이 정상적으로 수행되었는지를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 분리 정제된 pegylated hGH 단백질을 트립신으로 처리하고, 트립신에 의해 절단되어 생성된 펩타이드 조각을 사이즈 배제 (size exclusion) 컬럼(zorbax-250)으로 정제한 후 HPLC를 통해 분리하고, 그 분획을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 그 결과를 각각 도29 및 도 30에 나타내었다.
도29 및 도 30에 나타낸 바와 같이, 분획물 2 (fraction 2)에 PEG-hGH가 포함되어 있음을 확인하였다.
또한, pegylated hGH 단백질 조각을 CM 컬럼으로 정제한 후, SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 그 결과를 각각 도31 도 32에 나타내었다.
도31 및 도 32에 나타낸 바와 같이, 분획물 3 (fraction 3)에 PEG-hGH가 포함되어 있음을 확인하였다.
5-2. EPO 의 PEGylation
5-2-1. EPO 의 PEGylation 실시
상기 실시예 5-1-1과 동일한 방법으로, 상기 실시예 3-2에서 수득한 EPO-인테인-CBD 단백질과 상기 실시예 4-5에서 수득한 PEG 유도체를 반응시켜, EPO 단백질의 PEGylation을 유도하였다. 보다 구체적으로는, 키틴 비드를 이용하여 상기 단백질을 정제하였으며, 5,000 kDa의 mPEG-SH를 사용하여 단백질을 절단하였다. 약 4시간 후 PEGylation이 이루어진 것을 확인하였다. 상기 과정 중에 수득된 단백질 샘플을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 그 결과, Thiolated PEG 유도체와의 반응을 통해, PEGylation 된 EPO가 수득된 것을 확인하였다.
5-2-2. EPO 의 PEGylation 검증
상기 실시예 5-2-1에서 제조한 EPO의 PEGylation이 정상적으로 수행되었는지를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 분리 정제된 pegylated EPO 단백질을 트립신으로 처리하고, 트립신에 의해 절단되어 생성된 펩타이드 조각을 사이즈 배제 (size exclusion) 컬럼(zorbax-250)으로 정제한 후 HPLC를 통해 분리하고, 그 분획을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
5-3. GCSF 의 PEGylation
5-3-1. GCSF 의 PEGylation 실시
상기 실시예 5-1-1과 동일한 방법으로, 상기 실시예 3-3에서 수득한 GCSF-인테인-CBD 단백질과 상기 실시예 4-5에서 수득한 PEG 유도체를 반응시켜, GCSF 단백질의 PEGylation을 유도하였다. 보다 구체적으로는, 키틴 비드를 이용하여 상기 단백질을 정제하였으며, 5,000 kDa의 mPEG-SH를 사용하여 단백질을 절단하였다. 약 4시간 후 PEGylation이 이루어진 것을 확인하였다. 상기 과정 중에 수득된 단백질 샘플을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 그 결과, Thiolated PEG 유도체와의 반응을 통해, PEGylation 된 GCSF가 수득된 것을 확인하였다.
5-3-2. GCSF 의 PEGylation 검증
상기 실시예 5-3-1에서 제조한 GCSF의 PEGylation이 정상적으로 수행되었는지를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 분리 정제된 pegylated GCSF단백질을 트립신으로 처리하고, 트립신에 의해 절단되어 생성된 펩타이드 조각을 사이즈 배제 (size exclusion) 컬럼(zorbax-250)으로 정제한 후 HPLC를 통해 분리하고, 그 분획을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
5-4. IFN 의 PEGylation
5-4-1. IFN 의 PEGylation 실시
상기 실시예 5-1-1과 동일한 방법으로, 상기 실시예 3-4에서 수득한 IFN-인테인-CBD 단백질과 상기 실시예 4-5에서 수득한 PEG 유도체를 반응시켜, IFN 단백질의 PEGylation을 유도하였다. 보다 구체적으로는, 키틴 비드를 이용하여 상기 단백질을 정제하였으며, 5,000 kDa의 mPEG-SH를 사용하여 단백질을 절단하였다. 약 4시간 후 PEGylation이 이루어진 것을 확인하였다. 상기 과정 중에 수득된 단백질 샘플을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 그 결과, Thiolated PEG 유도체와의 반응을 통해, PEGylation된 IFN가 수득된 것을 확인하였다.
5-4-2. IFN 의 PEGylation 검증
상기 실시예 5-4-1에서 제조한 IFN의 PEGylation이 정상적으로 수행되었는지를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 분리 정제된 pegylated IFN 단백질을 트립신으로 처리하고, 트립신에 의해 절단되어 생성된 펩타이드 조각을 사이즈 배제 (size exclusion) 컬럼(zorbax-250)으로 정제한 후 HPLC를 통해 분리하고, 그 분획을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
실시예 6. PEGylated 단백질의 in vitro 에서의 생물학적 활성 검증
6-1. PEG - hGH 의 in vitro 에서의 생물학적 활성 검증
PEG-hGH의 in vitro에서의 생물학적 활성을 확인하기 위하여, Nb2-11 세포주를 성장 배지(growth media)에서 배양하였다. Low FBS media에 있는 세포를 원심분리를 통해 모은 후, 세포 수를 확인하고 96웰 플레이트에서 배양하였다. 상기 플레이트에 각 샘플을 분주하고, 48시간 동안 배양한 후, MTT를 처리하고, ELISA Leader 로 490nm에서 OD를 측정하였다. 그 결과를 도 33에 나타내었다.
도 33에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 PEG-hGH는 in vitro 상에서 native hGH에 비해 25-30%의 생물학적 활성을 나타냄을 확인하였다.
6-2. PEG - EPO 의 in vitro 에서의 생물학적 활성 검증
PEG-EPO의 in vitro에서의 생물학적 활성을 확인하기 위하여, F36E세포주를 성장 배지에서 배양하였다. Low FBS media 에 있는 세포를 원심분리를 통해 모은 후, 세포 수를 확인하고 96웰 플레이트에서 배양하였다. 상기 플레이트에 각 샘플을 분주하고, 48시간 동안 배양한 후, MTT를 처리하고, ELISA Leader 로 490nm에서 OD를 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 PEG-EPO는 in vitro 상에서 native GCSF에 비해 20~30%의 생물학적 활성을 나타냄을 확인하였다.
6-3. PEG - GCSF 의 in vitro 에서의 생물학적 활성 검증
PEG-GCSF의 in vitro에서의 생물학적 활성을 확인하기 위하여, Nb2-11 세포주를 성장 배지에서 배양하였다. Low FBS media에 있는 세포를 원심분리를 통해 모은 후, 세포 수를 확인하고 96웰 플레이트에서 배양하였다. 상기 플레이트에 각 샘플을 분주하고, 48시간 동안 배양한 후, MTT를 처리하고, ELISA Leader 로 490nm에서 OD를 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 PEG-GCSF는 in vitro 상에서 native GCSF에 비해 30-35%의 생물학적 활성을 나타냄을 확인하였다.
6-4. PEG - IFN 의 in vitro 에서의 생물학적 활성 검증
PEG-IFN의 in vitro에서의 생물학적 활성을 확인하기 위하여, MDBK 세포주를 성장 배지에서 배양하였다. Low FBS media에 있는 세포를 원심분리를 통해 모은 후, 세포 수를 확인하고 96웰 플레이트에서 배양하였다. 상기 플레이트에 각 샘플을 분주하고, 48시간 동안 배양한 후, MTT를 처리하고, ELISA Leader 로 490nm에서 OD를 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 PEG-IFN은 in vitro 상에서 native GCSF에 비해 25-30%의 생물학적 활성을 나타냄을 확인하였다.
이하 본 발명의 상기 조성물을 함유하는 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 약학적 조성물의 제조
1-1. 산제의 제조
본 발명의 생체적합성 고분자가 접합된 단백질 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
1-2. 정제의 제조
본 발명의 생체적합성 고분자가 접합된 단백질 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
1-3. 캡슐제의 제조
본 발명의 생체적합성 고분자가 접합된 단백질 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
1-4. 주사제의 제조
본 발명의 생체적합성 고분자가 접합된 단백질 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4·2H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1-5. 액제의 제조
본 발명의 생체적합성 고분자가 접합된 단백질 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

Claims (7)

  1. (a) 목적 단백질의 C-말단에 시스테인 및 인테인 (intein)을 삽입하는 단계;
    (b) 티올 (thiol, -SH)기를 가진 생체적합성 고분자 유도체를 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 (a) 단계의 목적 단백질 및 (b) 단계의 생체적합성 고분자 유도체를 반응시키는 단계;를 포함하는, 생체적합성 고분자가 접합된 단백질의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 목적 단백질은 성장 호르몬 (growth hormone, GH), 에리스로포이에틴(erythropoietin, EPO), 과립구콜로니자극인자 (granulocyte colony stimulating factor, GCSF) 및 인터페론 (interferon)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 생체적합성 고분자가 접합된 단백질의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 인테인은 키틴 바인딩 도메인 (CBD, chitin binding domain)과 연결된 형태인 것을 특징으로 하는, 생체적합성 고분자가 접합된 단백질의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 생체적합성 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리트리메틸렌글리콜, 폴리락트산, 폴리아크릴산, 폴리아미노산, 폴리비닐 알콜, 폴리우레탄, 폴리포스파진, 폴리(L-라이신), 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈 및 폴리아크릴아마이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 생체적합성 고분자가 접합된 단백질의 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 반응은 키틴 비드를 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는, 생체적합성 고분자가 접합된 단백질의 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자가 접합된 단백질은 단백질 당 하나의 생체적합성 고분자가 접합된 것을 특징으로 하는, 생체적합성 고분자가 접합된 단백질의 제조방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 의해 제조된, 생체적합성 고분자가 접합된 단백질.
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