CN101616678B - 聚乙二醇-g-csf缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通式(1)的三分枝的PEG-G-CSF缀合物，其中三分枝的聚乙二醇(PEG)和G-CSF的结合比率是1∶1(mol/mol)，其中PEG具有200-45000道尔顿的平均分子量；涉及包含所述缀合物的药物组合物及其制备方法。

Description

聚乙二醇-G-CSF缀合物
技术领域
本发明涉及三分枝的PEG-G-CSF缀合物。 
背景技术
集落刺激因子(CSF)作为作用于造血细胞的产生、分裂和活性的糖蛋白，分为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、多集落刺激因子(multi-CSF)等。 
众所周知，G-CSF通过促进骨髓嗜中性粒细胞前体的产生和分裂来增加成熟嗜中性粒细胞释放到外周血中；通过激活成熟嗜中性粒细胞来诱导吞噬活性；提供抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；产生超氧化物；以及提高对抗趋化因子的反应性。 
人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)首先由Welt等人于1985年从膀胱癌细胞系5637中分离，而重组hG-CSF(rhG-CSF)则是由Nagata等人、Souza等人于1986年通过克隆来自癌细胞的cDNA文库的基因生产的。目前用于临床试验的rhG-CSF是非格司亭，其在未糖基化的蛋白质的N-末端结合甲硫氨酸，在大肠杆菌中产生；和糖基化的来格司亭，在动物细胞中产生。 
在临床使用rhG-CSF的情况下，rhG-CSF不得不一天给药一次或多次以减少白细胞，因为rhG-CSF的药理学效应持续时间短。因此，已开展许多研究来增加rhG-CSF的循环半衰期，这些研究使用水溶性的聚合物，以此开发具有长的活性持续时间和高稳定性的药物，并减少给药频率。 
而且，在水溶性聚合物中的聚乙二醇是强亲水性的，并且在与用于治疗的蛋白质结合时能增加溶解度。此外，聚乙二醇有效地增加与其结合的蛋白质的分子数量，同时维持主要的生物学功能，例如酶活性和受体结合。因此，聚乙二醇能减少肾的过滤作用并有效地保护蛋白质免遭蛋白水解酶将其分解。因此，已开展许多研究来寻找通过使用聚乙二醇修饰蛋白的方法，因为它具有以下优点：防止蛋白质分解，增加蛋白质的稳定性和循环 时间并降低免疫原性。 
时间并降低免疫原性。 
韩国专利0508358公开了缀合物和其制备方法，其中所述缀合物具有生物活性并且是生物相容性聚合物与G-CSF的半胱氨酸残基的硫醇结合的形式，所述聚合物∶G-CSF(摩尔比)为化学计算地0.7～1.3∶1，优选地1∶1。但是，由于G-CSF中不形成二硫键的G-CSF半胱氨酸残基是与G-CSF受体结合的主要部分，所以使用半胱氨酸残基的缀合物具有其对嗜中性粒细胞的实际增殖效应很小的缺点。而且，因为缀合物立即聚集以使PEG与G-CSF的半胱氨酸残基结合，所以它具有以下缺点：为了妥善保存，应向所述缀合物中加入少量SDS以防止聚集作用，并且，为了体内给药，需通过超滤除去所述SDS。 
韩国专利0507796公开了PEG-同型二聚体缀合物，其结合生物活性多肽和PEG以增加多肽在体内的半衰期。具体地，它描述了所述同型二聚体使两分子的生物活性多肽的赖氨酸残基的氨基与PEG结合，以增加残留时间并长时间地维持生物活性。但是，由于过量PEG的缀合，所述缀合物的活性比单-PEG缀合物低，并且由于非特异性缀合，所述缀合物的物理化学和生物学特征不均一。 
而且，rhG-CSF与线性SCM-MPEG(甲氧基PEG的琥珀酰亚胺基羧甲基酯)结合的方法是众所周知的。由该方法制备的单-PEG-G-CSF缀合物具有三种在N-末端、赖氨酸35和赖氨酸45残基修饰的位置异构体。具体地，在赖氨酸35修饰的缀合物具有使PEG脱离所述缀合物的缺点(韩国专利0248111，美国专利5824784)。 
美国专利5951974公开了线性SC-PEG(聚乙二醇-N-琥珀酰亚胺碳酸酯)与基因重组α-干扰素结合的缀合物。所述缀合物由在干扰素的赖氨酸残基的ε-氨基、N-末端半胱氨酸残基的α-氨基、和组氨酸残基的氨基处具有氨基甲酸乙酯键的共价缀合物组成。但是，所述缀合物具有使PEG脱离所述缀合物的缺点，因为所述缀合物的氨基甲酸乙酯键不稳定。 
通常使用的线性聚乙二醇具有约1000～25000道尔顿的分子量，但对许多线性高分子与蛋白质或多肽结合并维持它们的活性方面有限制，因为蛋白质和多肽的生物活性区域受到限制。 
韩国专利0254097公开了赖氨酸骨架结构的二分枝的PEG与基因重组 α-干扰素结合的缀合物。所述缀合物具有防止PEG与干扰素的多个部分结合的优点，相比线性PEG具有两倍分子量的PEG，因为两个线性PEG与干扰素的一个部分结合。但是，为了妥善保存或在碱性条件下反应，所述二分枝的PEG能水解为单链，因为具有赖氨酸骨架结构的二分枝的PEG在PEG中具有两个氨基甲酸乙酯键。 
发明内容
通常，已知PEG与基因重组蛋白质结合的缀合物的生物活性、耐久性等取决于PEG的大小和PEG中修饰的部分。但是，PEG和rhG-CSF结合的缀合物中PEG的大小是否影响蛋白质的生物活性还未知。因此，本领域需要通过控制PEG的大小和与各种PEG骨架结构的结合以不降低G-CSF的生物活性并增加结合部分的稳定性来克服已知方法的缺点。 
技术问题 
本发明的目的是提供三分枝的聚乙二醇(PEG)-G-CSF缀合物，其由三分枝的PEG和G-CSF缀合来制备，具有高度稳定性，具有与本领域已知的G-CSF和PEG-G-CSF缀合物相同或较之更高的生物活性；所述缀合物的制备方法；和含有它的药物组合物。 
技术方案 
为了实现以上目的，本发明提供三分枝的聚乙二醇(PEG)-G-CSF缀合物，其在三分枝的PEG衍生物和G-CSF之间缀合。 
本发明还提供制备三分枝的聚乙二醇(PEG)-G-CSF缀合物的方法，其包括使三分枝的PEG衍生物和G-CSF缀合。 
本发明还提供包含所述缀合物的药物组合物。 
本发明还提供治疗中性白细胞减少、预防中性白细胞减少或促进在造血干细胞动员至外周血和造血干细胞移植时嗜中性粒细胞数量增加的方法，其包括给药作为有效成分的本发明的缀合物。 
以下详细说明本发明。 
本发明的三分枝的PEG-G-CSF缀合物可以通过缀合三分枝的聚乙二醇(PEG)来制备，其由以下通式(1)表示： 
Figure G2006800564239D00041
其中， 
n是1-1000的整数； 
m是10-1000的整数； 
作为G-CSF和PEG的连接基的Z是(CH2)S或(CH2)SNHCO(CH2)S，其中S是1-6的整数； 
Y是通过使G-CSF中的NH2官能团和PEG衍生物的官能团结合而形成的酰胺键。 
所述PEG具有200-45000道尔顿、优选20000-45000道尔顿、更优选23000-43000道尔顿的平均分子量。因为药物的有效时间可以根据PEG的平均分子量而改变，所以本发明所用的PEG的平均分子量可以根据治疗所需的时间而变化。 
以下详细说明制备本发明的三分枝的PEG-G-CSF缀合物的方法，其包括使三分枝的PEG衍生物和G-CSF缀合。 
通式(1)的三分枝的PEG-G-CSF缀合物通过在以下通式(2)的三分枝的PEG衍生物和G-CSF之间形成共价键来制备，其中PEG具有200-45000道尔顿、优选20000-45000道尔顿、更优选23000-43000道尔顿的平均分子量： 
Figure G2006800564239D00042
其中， 
n是1-1000的整数； 
m是10-1000的整数； 
作为G-CSF和PEG的连接基的Z是(CH2)S或(CH2)SNHCO(CH2)S，其中S是1-6的整数；并且 
能与含有G-CSF的蛋白质和肽进行化学反应的官能团是N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydrosuccinimide)。 
本发明的三分枝的PEG衍生物使具有分枝结构的高分子(其中结合了三个线性的生物学上接受的高分子)活化。丙三醇骨架结构中的所有三个OH(羟基)区域与乙二醇单元分子聚合，一个区域的末端被活化为官能团。除了被活化的区域外的其它两个区域用单甲氧基取代，以防止其它反应。当制备以上分枝的PEG时，各线性PEG的大小可通过本领域已知的方法自由地控制。 
本发明中三分枝的PEG衍生物可用作本领域中已知的具有与蛋白质和肽进行化学反应的官能团的PEG衍生物。在本发明的缀合物的收率方面，通式(2)的PEG衍生物(具有N-羟基琥珀酰亚胺)是优选的。 
本发明中的G-CSF可以从哺乳动物有机体中分离或通过本领域已知的方法例如gDNA克隆、cDNA克隆等来合成。而且，所述G-CSF可以是市场上商品化的。 
而且，G-CSF和所述三分枝的PEG衍生物之间的共价键可以在低温下形成。该反应通过加入酸来完成，制得的三分枝的PEG-G-CSF缀合物可以通过本领域已知的方法例如使用阳离子交换树脂的纯化方法来纯化。 
本发明中，G-CSF与所述三分枝的PEG衍生物的反应摩尔比是1∶0.5-1∶50。优选的G-CSF与所述三分枝的PEG衍生物的摩尔比是1∶0.5-1∶5，因为当聚乙二醇与G-CSF的摩尔比增大时，单PEG-G-CSF缀合物的收率减少。 
本发明还提供用于治疗或预防由造血功能下降或免疫功能下降造成的症状的药物组合物。具体地，使用本发明的缀合物作为有效物的临床试验显示，对于在治疗例如癌症化疗或放射治疗中造成的疾病；细菌、病毒和真菌造成的感染性疾病；其它感染性疾病；由遗传或环境原因造成的疾病，例如严重的慢性中性白细胞减少和白血病；或再次造成的老年疾病，嗜中性粒细胞的数量减少，并且所述症状减轻或得到控制。例如，由造血功能下降或免疫功能下降造成的症状是由血液肿瘤或实体癌的癌症化疗造成的 中性白细胞减少、由骨髓增生异常综合征造成的中性白细胞减少、由再生障碍性贫血造成的中性白细胞减少、先天性恶性中性白细胞减少症和由治疗人免疫缺陷病毒造成的中性白细胞减少。 
所述组合物可以由本发明的PEG-G-CSF缀合物或药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、辅剂和/或载体组成。 
本发明的组合物可以配制成注射剂、胶囊剂、片剂、液体药物、丸剂、软膏剂、眼膏剂、洗眼剂、透皮吸收剂、糊剂、泥敷剂、气雾剂等。 
而且，G-CSF的有效剂量非常小，例如0.1～500μg(优选5～50μg)。而且，包含0.1～500μg G-CSF的药物可以给予成人，通常一周1-7次。因此，本发明的药物组合物的有效剂量可以通过已知的G-CSF给药剂量和本发明中使用的PEG的分子量来计算。本发明的药物组合物的有效剂量可以变化，但是通常一周一次，并且所述组合物可以在每日有效剂量范围内一天给药一次或多次。 
以下的实施例意在进一步说明本发明，而无论如何都不意在藉此限制本发明的范围。 
有益效果 
在使PEG脱离PEG-G-CSF缀合物和形成缀合物的聚集体方面，本发明的三分枝的PEG-G-CSF缀合物比线性的或二分枝的PEG-G-CSF缀合物在药学上更稳定。而且，可以在无需另外分离位置异构体的情况下使用本发明的缀合物，因为所述缀合物由具有相似活性的位置异构体组成。而且，本发明的组合物具有连续产生中性白细胞增多和增加体内半衰期的效应。 
附图说明
图1是说明混合物的通过尺寸排阻高效液相色谱法的分析结果示意图，形成所述混合物以制备实施例1的分子量为23000 Da的三分枝的PEG和G-CSF的缀合物。 
图2是说明混合物的通过尺寸排阻高效液相色谱法的分析结果示意图，形成所述混合物以制备实施例2的分子量为43000 Da的三分枝的PEG和G-CSF的缀合物。 
图3是说明混合物的通过尺寸排阻高效液相色谱法的分析结果示意图，形成所述混合物以制备比较例1的分子量为10000Da的线性PEG和G-CSF的缀合物。 
图4是说明从实施例1的混合物中分离的单三分枝的PEG-G-CSF缀合物的纯度的通过尺寸排阻高效液相色谱法的分析结果示意图。 
图5是说明从实施例2的混合物中分离的单三分枝的PEG-G-CSF缀合物的纯度的通过尺寸排阻高效液相色谱法的分析结果示意图。 
图6是说明从比较例1的混合物中分离的单线性PEG-G-CSF缀合物的纯度的通过尺寸排阻高效液相色谱法的分析结果示意图。 
图7是说明从实施例1的混合物中分离的单三分枝的PEG-G-CSF缀合物的通过基质辅助的激光解吸电离(MALDI-TOF)质谱的分析结果示意图。 
图8是说明从实施例2的混合物中分离的单三分枝的PEG-G-CSF缀合物的通过基质辅助的激光解吸电离(MALDI-TOF)质谱的分析结果示意图。 
图9是说明从比较例1的混合物中分离的单线性PEG-G-CSF缀合物的通过基质辅助的激光解吸电离(MALDI-TOF)质谱的分析结果示意图。 
图10是说明从实施例1的混合物中分离出来的包含单三分枝的PEG-G-CSF缀合物的位置异构体的通过离子交换色谱法的分析结果示意图。 
图11是说明从实施例1的混合物中分离的单三分枝的PEG-G-CSF缀合物的位置异构体根据实验例1通过实验例2的方法的生物活性的分析结果示意图。 
发明模式 
<实施例1>三分枝的聚乙二醇(PEG，分子量23000Da)-G-CSF缀合物的制备 
用pH 8.5、50mM的硼砂缓冲溶液过滤10mg rhG-CSF(Dong-A Pharm.Co.，Ltd.)。然后，以rhG-CSF∶三分枝的PEG(摩尔比)为1∶0.75，将9.2mg具有N-羟基琥珀酰亚胺且分子量为23000道尔顿的三分枝的PEG(NOF公司，日本)加入该溶液中。并且，在4℃将该溶液搅拌90分钟。通过加入100mM HCl使溶液pH为4并且通过用5倍溶液体积的无菌蒸馏水稀释来 结束反应。然后，将混合物输入用20mM乙酸钠缓冲溶液(pH 4.0)平衡的SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换色谱(Amersham Pharmacia Biotech)，分离三分枝的PEG-G-CSF缀合物。通过使用0～1M的氯化钠(NaCl)浓度梯度分馏混合物。通过HPLC和SDS-PAGE确定三分枝的PEG-G-CSF缀合物中三分枝的PEG与G-CSF的摩尔比。而且，排除二或更多(三、四...)三分枝的PEG-G-CSF缀合物、反应后剩余的未反应的G-CSF等。而且，将洗脱物浓缩、灭菌过滤以获得单三分枝的PEG-G-CSF缀合物，其中一个G-CSF和一个三分枝的PEG(分子量23000Da)缀合(或称为单三分枝的PEG-G-CSF缀合物)。 
通过尺寸排阻高效色谱法确定反应混合物由35.4％单三分枝的PEG-G-CSF缀合物(单PEG-G-CSF缀合物)、约59.4％未被PEG修饰的G-CSF和其它[二三分枝的PEG-G-CSF缀合物(二PEG-G-CSF缀合物)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)]组成(见图1，其中1和2代表二PEG-G-CSF缀合物，3代表单PEG-G-CSF缀合物，4代表未被PEG修饰的G-CSF，5代表从三分枝的PEG脱离的NHS)。而且，通过尺寸排阻高效液相色谱法测定从混合物中分离的单三分枝的PEG-G-CSF的纯度(见图4，其中2代表二PEG-G-CSF缀合物，3代表单PEG-G-CSF缀合物)，而且通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱测定分子量(见图7：通过MALDI-TOF/MS的单三分枝的PEG-G-CSF的分析结果)。而且，通过阳离子交换树脂分析柱(SP-5WP，TOSOH)分离位置异构体，确定各位置异构体的比率约为54％∶33％∶10％(见图10)。而且，在各位置异构体的生物活性实验中确定，各位置异构体具有非常相似的活性(见图11)。 
<实施例2>三分枝的聚乙二醇(PEG，分子量43000Da)-G-CSF缀合物的制备 
用pH 8.5、50mM的硼砂缓冲溶液过滤10mg rhG-CSF(Dong-A Pharm.Co.，Ltd.)。然后，将17.2mg具有N-羟基琥珀酰亚胺且分子量为43000道尔顿的三分枝的PEG(NOF公司，日本)加入该溶液中，使rhG-CSF∶三分枝的PEG(摩尔比)为1∶0.75。并且，在4℃将该溶液搅拌90分钟。并且，通过加入100mM HCl使溶液pH为4并且通过用5倍溶液体积的无菌蒸馏 水稀释来结束反应。并且，将混合物输入用20mM乙酸钠缓冲溶液(pH 4.0)平衡的SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换色谱(Amersham Pharmacia Biotech)，从中分离三分枝的PEG-G-CSF缀合物。通过使用0～1M的氯化钠(NaCl)浓度梯度分馏混合物。通过HPLC和SDS-PAGE确定三分枝的PEG-G-CSF缀合物中三分枝的PEG与G-CSF的摩尔比。而且，排除二或更多(三、四...)三分枝的PEG-G-CSF缀合物、反应后剩余的未反应的G-CSF等。而且，将洗脱物浓缩、灭菌过滤以获得单三分枝的PEG-G-CSF缀合物，其中一个G-CSF和一个三分枝的PEG(分子量43000Da)缀合(或称为单三分枝的PEG-G-CSF缀合物)。 
通过尺寸排阻高效色谱法确定反应混合物由以18.7％单三分枝的PEG-G-CSF缀合物(单PEG-G-CSF缀合物)、约40.1％未被PEG修饰的G-CSF和其它[二三分枝的PEG-G-CSF缀合物(二PEG-G-CSF缀合物)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)](见图2，其中2代表二PEG-G-CSF缀合物，3代表单PEG-G-CSF缀合物，4代表未被PEG修饰的G-CSF)。而且，通过尺寸排阻高效液相色谱法测定从混合物中分离的单三分枝的PEG-G-CSF的纯度(见图5，其中1代表低PEG-G-CSF缀合物，2代表二PEG-G-CSF缀合物，3代表单PEG-G-CSF缀合物)，而且通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱测定分子量(见图8：通过MALDI-TOF/MS的单三分枝的PEG-G-CSF的分析结果)。 
<比较例1>线性聚乙二醇(PEG，分子量10000Da)-G-CSF缀合物的制备 
用pH 8.5、50mM的硼砂缓冲溶液过滤10mg rhG-CSF(Dong-A Pharm.Co.，Ltd.)。并且，将5.2mg具有N-羟基琥珀酰亚胺且分子量为13000道尔顿的线性PEG(NOF公司，日本)加入该溶液中，使rhG-CSF∶线性PEG(摩尔比)为1∶0.75。并且，在4℃将该溶液搅拌90分钟。并且，通过加入100mM HCl使溶液pH为4并且通过用5倍溶液体积的无菌蒸馏水稀释来结束反应。并且，将混合物输入用20mM乙酸钠缓冲溶液(pH 4.0)平衡的SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换色谱(Amersham Pharmacia Biotech)，从中分离线性的分枝的PEG-G-CSF缀合物。通过使用0～1M的氯化钠(NaCl) 浓度梯度分馏混合物。通过HPLC和SDS-PAGE确定线性PEG-G-CSF缀合物中线性PEG与G-CSF的摩尔比。并且，排除二或更多(三、四...)线性PEG-G-CSF缀合物、反应后剩余的未反应的G-CSF等。而且，将洗脱物浓缩、灭菌过滤以获得单线性PEG-G-CSF缀合物，其中一个G-CSF和一个线性PEG(分子量13000Da)缀合(或称为单线性PEG-G-CSF缀合物)。 
通过尺寸排阻高效色谱法确定反应混合物由45.6％单线性PEG-G-CSF缀合物(单PEG-G-CSF缀合物)、约45.9％未被PEG修饰的G-CSF和其它[二线性PEG-G-CSF缀合物(二PEG-G-CSF缀合物)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)](见图3，其中1代表低PEG-G-CSF缀合物，2代表二PEG-G-CSF缀合物，3代表单PEG-G-CSF缀合物，4代表未被PEG修饰的G-CSF)。而且，通过尺寸排阻高效液相色谱法测定从混合物中分离的单线性-分枝PEG-G-CSF的纯度(见图6，其中1代表低PEG-G-CSF缀合物，2代表二PEG-G-CSF缀合物，3代表单PEG-G-CSF缀合物，4代表未被PEG修饰的G-CSF)，而且通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱测定分子量(见图9)。 
<比较例2>线性聚乙二醇(PEG，分子量20000Da)-G-CSF缀合物的制备 
用pH 8.5、50mM的硼砂缓冲溶液过滤10mg rhG-CSF(Dong-A Pharm.Co.，Ltd.)，然后将8.0mg具有N-羟基琥珀酰亚胺且分子量为20000道尔顿的线性PEG(NOF公司，日本)加入该溶液中，使rhG-CSF∶线性PEG(摩尔比)为1∶0.75。并且，在4℃将该溶液搅拌90分钟。并且，通过加入100mM HCl使溶液pH为4并且通过用5倍溶液体积的无菌蒸馏水稀释来结束反应。并且，将混合物输入用20mM乙酸钠缓冲溶液(pH 4.0)平衡的SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换色谱(Amersham Pharmacia Biotech)，从中分离线性的分枝的PEG-G-CSF缀合物。通过使用0～1M的氯化钠(NaCl)浓度梯度分馏混合物。通过HPLC和SDS-PAGE确定线性PEG-G-CSF缀合物中线性PEG与G-CSF的摩尔比。并且，排除二或更多(三、四...)线性PEG-G-CSF缀合物、反应后剩余的未反应的G-CSF等。而且，将洗脱物浓缩、灭菌过滤以获得单线性PEG-G-CSF缀合物，其中一个G-CSF和一个 线性PEG(分子量20000Da)缀合(或称为单线性PEG-G-CSF缀合物)。 
<比较例3>二分枝的聚乙二醇(PEG，分子量20000Da，赖氨酸骨架结构)-G-CSF缀合物的制备 
用pH 8.5、50mM的硼砂缓冲溶液过滤10mg rhG-CSF(Dong-A Pharm.Co.，Ltd.)，然后将9.1mg具有N-羟基琥珀酰亚胺且分子量为20000道尔顿的二分枝的PEG(Nektar，USA)加入该溶液中，使rhG-CSF∶线性PEG(摩尔比)为1∶0.75。并且，在4℃将该溶液搅拌90分钟。并且，通过加入100mM HCl使溶液pH为4并且通过用5倍溶液体积的无菌蒸馏水稀释来结束反应。并且，将混合物输入用20mM乙酸钠缓冲溶液(pH 4.0)平衡的SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换色谱(Amersham Pharmacia Biotech)，从中分离线性的分枝的PEG-G-CSF缀合物。通过使用0～1M的氯化钠(NaCl)浓度梯度分馏混合物。通过HPLC和SDS-PAGE确定二分枝的PEG-G-CSF缀合物中二分枝的PEG与G-CSF的摩尔比。排除二或更多(三、四...)二分枝的PEG-G-CSF缀合物、反应后剩余的未反应的G-CSF等。而且，将洗脱物浓缩、灭菌过滤以获得单二分枝的PEG-G-CSF缀合物，其中一个G-CSF和一个二分枝的PEG(分子量20000Da)缀合(或称为单线性PEG-G-CSF缀合物)。 
<比较例4>二分枝的聚乙二醇(PEG，分子量20000Da，丙三醇骨架结构)-G-CSF缀合物的制备 
用pH 8.5、50mM的硼砂缓冲溶液过滤10mg rhG-CSF(Dong-A Pharm.Co.，Ltd.)。而且，将8.0mg具有N-羟基琥珀酰亚胺且分子量为20000道尔顿的二分枝的PEG(NOF，日本)加入该溶液中，使rhG-CSF∶线性PEG(摩尔比)为1∶0.75。在4℃将该溶液搅拌90分钟。并且，通过加入100mM HCl使溶液pH为4并且通过用5倍溶液体积的无菌蒸馏水稀释来结束反应。然后，将混合物输入用20mM乙酸钠缓冲溶液(pH4.0)平衡的SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换色谱(Amersham Pharmacia Biotech)，从中分离线性的分枝的PEG-G-CSF缀合物。通过使用0～1M的氯化钠(NaCl)浓度梯度分馏混合物。通过HPLC和SDS-PAGE确定二分枝的PEG-G-CSF缀合物中二 
分枝的PEG与G-CSF的摩尔比。排除二或更多(三、四...)二分枝的PEG-G-CSF缀合物、反应后剩余的未反应的G-CSF等。而且，将洗脱物浓缩、灭菌过滤以获得单二个分枝的PEG-G-CSF缀合物，其中一个G-CSF和一个二分枝的PEG(分子量20000 Da)缀合(或称为单线性PEG-G-CSF缀合物)。 
<比较例5>结合于N-末端α-氨基残基的单甲氧基聚乙二醇-G-CSF缀合物的制备 
按韩国专利0248111和美国专利5824784中所述的方法制备标题缀合物。所述方法的简单说明如下。 
在4℃下搅拌含有20mM NaCNBH3和5mg/ml的rhG-CSF的100mM磷酸钠。并且，在溶液中加入5倍摩尔数的线性甲氧基聚乙二醇(mPEG)醛(Nektar，美国)，将其搅拌10小时。通过加入100mM HCl使溶液pH为4并且通过用5倍溶液体积的无菌蒸馏水稀释来结束反应。然后，将混合物输入用20mM乙酸钠缓冲溶液(pH4.0)平衡的SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换色谱(Amersham Pharmacia Biotech)，从中分离线性的分枝的PEG-G-CSF缀合物。通过使用0～1M的氯化钠(NaCl)浓度梯度分馏混合物。而且，将洗脱物浓缩、灭菌过滤以获得单mPEG-G-CSF缀合物，其中一个G-CSF和一个二分枝的PEG(分子量20000 Da)缀合(或称为单线性PEG-G-CSF缀合物)。 
<比较例6>结合于G-CSF的半胱氨酸残基的硫醇基的单甲氧基聚乙二醇-G-CSF缀合物的制备 
按韩国专利0508358中所述的方法制备标题缀合物。所述方法的简单说明如下。 
将1mg rhG-CSF(Dong-A Pharm.Co.，Ltd.)加入到1mL pH8.5的磷酸钠缓冲溶液(0.1M)，将52.6mg聚乙二醇马来酰亚胺(NOF，Japan)加入该溶液中。并且，在室温将该溶液搅拌1小时。然后，通过Centricon 30(Amicon，USA)从溶液中除去反应后剩余的PEG衍生物。并且，将溶液浓缩、灭菌过滤以获得单mPEG-G-CSF缀合物。 
通过使用以上制备的缀合物来进行性质和药理学活性试验，结果如下。 
<实验例1>三分枝的PEG-G-CSF缀合物的位置异构体的分析性分离 
将100μg实施例1的单三分枝的PEG-G-CSF缀合物输入用25mM乙酸钠缓冲液(pH4.0，用冰醋酸控制)平衡的阳离子交换树脂分析柱(SP-5WP，TOSOH)，缀合物的各位置异构体用100mM乙酸钠缓冲液(pH7.8)分离。确定各位置异构体的比率约是54％∶33％∶10％(见图10)。 
<实验例2>三分枝的PEG-G-CSF缀合物的位置异构体的生物活性的分析 
通过使用G-CSF的相对生物活性测定实施例1的三分枝的PEG-G-CSF缀合物的位置异构体的相对生物活性。 
用含有5％FBS的试验RPMI 1640洗涤培养在含有10％FBS和1ng/mlrmIL-3的生长RPMI 1640上的NFS-60细胞株。并且，在96孔板上将该细胞株分为100ml(2×105细胞/ml)。然后，用试验培养基稀释样品以制备一个200ng/ml的样品和另9个5倍梯度稀释200ng/ml的样品，并且将样品分入含有细胞溶液的96孔板中，每一浓度3个孔，各100ml。 
每个孔在37℃和5％CO2的培养箱中培养48小时，向每个孔内加入40μl MTS。2小时后，用酶标仪在490nm处测定样品的吸光度。通过剂量-反应曲线和标准曲线的点构成的直线的线性回归分析来计算EC50，并测定位置异构体的活性(见图11)。本发明的三分枝的PEG-G-CSF缀合物具有活性相似的位置异构体。即，不需要除去某些具有较低活性的位置异构体，因为本发明的三分枝的PEG-G-CSF缀合物由具有均一的活性的缀合物组成。 
<实验例3>三分枝的PEG-G-CSF缀合物的药代动力学试验 
进行药代动力学试验，将G-CSF、实施例1的PEG-G-CSF缀合物和实施例2的PEG-G-CSF缀合物各自皮下注射到体重为240-260g的试验大鼠(Sprague Dawley)中。每只大鼠注射400μg量的上述物质后，在注射后0分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、8小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天采集大鼠血样。并且，通过酶联免疫吸附 测定(ELISA)试剂盒(Biosource，USA)定量分析样品中G-CSF缀合物的浓度。 
实施例1和实施例2的PEG-G-CSF缀合物在血液中的半衰期分别增加到G-CSF的半衰期的3倍和10.8倍，而且与G-CSF相比，实施例1和实施例2的缀合物在血液中的浓度-时间曲线下面积也分别增加到G-CSF的7.6倍和23.4倍[表1：三分枝的PEG-G-CSF缀合物和G-CSF在大鼠(SpragueDawley大鼠)中的药代动力学试验]。通过该试验确定，PEG-G-CSF缀合物的药代动力学依赖于PEG的大小。 
【表1】 
    rhG-CSF   实施例1   实施例2
  Cmax(hr)   1383.2   1676.8   1710.6
  Tmax(hr)   1.5   12   36
  T1/2(hr)   2.9   8.7   31.2
  AUC(ng*hr/ml)   6246.9   47420.3   146196.1
*上表中的缩写具有如下意义： 
Tmax：达到最大浓度的时间 
Cmax：最大浓度 
t1/2：消除半衰期 
AUC：浓度-时间曲线下面积。 
<实验例4>三分枝的PEG-G-CSF缀合物关于使PEG脱离缀合物的稳定性试验 
将实施例1和2、比较例2、3和4的PEG-G-CSF缀合物在pH7和37℃放置7天，通过反相高效液相色谱法分析在时间长度方面使PEG脱离的情况，以估计在骨架结构上使PEG脱离的程度、分子量和PEG的分枝类型。在PEG的骨架结构中，在使用线性PEG的比较例2中使PEG脱离发生得最频繁。然而，使PEG从实施例1和2和比较例4的缀合物脱离发生得频率低于比较例2和3(表2：具有各种PEG骨架结构的PEG-G-CSF缀合物中G-CSF生成速率的比较)。该试验确定，三分枝的PEG-G-CSF缀合物比线性的、二分枝的PEG-G-CSF缀合物更稳定，并且具有丙三醇骨架结构的缀合物比具有赖氨酸骨架结构的缀合物更稳定。 
【表2】 
Figure DEST_PATH_GSB00000788785400041
<实验例5>根据PEG的骨架结构和PEG与G-CSF结合的类型地三分枝的PEG-G-CSF缀合物对抗形成聚集的稳定性试验 
测试了实施例1的单三分枝的PEG-G-CSF缀合物、具有与实施例1的缀合物相似的分子量而与实施例1的缀合物的骨架结构不同的比较例2和4的单PEG-G-CSF缀合物、以及具有与实施例1的缀合物不同的结合类型的比较例5的单PEG-G-CSF缀合物，以测定对抗形成聚集的稳定性。各样品采集500μl，样品的溶剂与pH7、100Mm的磷酸盐缓冲溶液交换3次。并且，将样品在37℃放置14天，通过尺寸排阻高效液相色谱法分析缀合物的聚集的形成。 
形成聚集的分析结果表示，实施例1的单PEG-G-CSF缀合物在使PEG脱离方面具有最高的稳定性，并且最少形成聚集(表3：根据PEG的骨架结构和PEG与G-CSF结合的类型地聚集缀合物的生成速率)。使用具有与实施例1中的PEG相同的丙三醇骨架结构的PEG并且使用与实施例1相同的结合类型的比较例2和4的单PEG-G-CSF缀合物，以及实施例1的缀合物形成一些聚集。然而，使用具有与实施例1中PEG不同的骨架结构的PEG的比较例3的单PEG-G-CSF缀合物(但使用与实施例1相同的结合类型)形成许多聚集。而且，与实施例1的缀合物相比，使用具有与实施例1中PEG不同的骨架结构的PEG并且使用与实施例1不同的结合类型的比较例5的单PEG-G-CSF缀合物形成两倍或更多的聚集。 
【表3】 
Figure DEST_PATH_GSB00000788785400042
总之，实施例1的单三分枝的PEG-G-CSF缀合物在使PEG脱离缀合物和形成聚集两个方面都是最稳定的。即，该有益效果是来自分枝的PEG和本发明中使用的分枝的PEG之间不同的骨架结构。 
<实验例6>给药抗癌药物的动物模型中PEG-G-CSF缀合物的嗜中性粒细胞增殖活性测定 
通过给药抗癌药的小鼠模型测定实施例1的单三分枝的PEG-G-CSF缀合物、具有与实施例2的缀合物不同的结合类型和不同的分子量的比较例5和6的单mPEG(甲氧基聚乙二醇)-G-CSF缀合物的嗜中性粒细胞增殖活性。 
20-25g小鼠(BDF1)持续2天给药200mg/kg抗癌药(环磷酰胺)以减少嗜中性粒细胞的数量。 
而且，实施例1的缀合物和比较例5和6的缀合物各皮下给药一次，每只小鼠1mg/kg，G-CSF以每只小鼠0.125mg/kg给药8次以使总给药量为1mg/kg。在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和12天采集小鼠血液，通过自动血细胞测量仪(HEMAVET 850，Drew Scientific Ltd.，UK)测量白细胞和嗜中性粒细胞的总数。由抗癌药减少的嗜中性粒细胞开始恢复的时期和嗜中性粒细胞恢复所需的时间在实施例1的缀合物和比较例5和6的缀合物相似。然而，嗜中性粒细胞达到最大数量的时间在实施例1的缀合物比比较例5和6的缀合物快约12小时。实施例1的缀合物的增加的嗜中性粒细胞计数-时间曲线(AU-NC)下面积是最大的(表4：给药抗癌药物的动物模型中PEG-G-CSF缀合物的嗜中性粒细胞增殖活性测定)。因此，确定了单三分枝的PEG-G-CSF缀合物具有快速的嗜中性粒细胞增殖效应。 
【表4】 
Figure G2006800564239D00161
Figure G2006800564239D00171
给药后嗜中性粒细胞增加的时间 
*：给药抗癌药后达到1000/mm3或更多嗜中性粒细胞的时间。 
工业实用性 
在使PEG脱离PEG-G-CSF缀合物和形成缀合物的聚集体方面，本发明的三分枝的PEG-G-CSF缀合物比线性的或二分枝的PEG-G-CSF缀合物在药学上更稳定。而且，可以在无需另外分离位置异构体的情况下使用本发明的缀合物，因为所述缀合物由具有相似活性的位置异构体组成。而且，本发明的组合物具有连续产生中性白细胞增多和增加体内半衰期的效应。 

Claims (9)

1.以下通式(1)的三分枝的PEG-G-CSF缀合物：
Figure FSB00000788785300011
其中三分枝的聚乙二醇(PEG)和G-CSF的结合比率是1∶1(mol/mol)，而且PEG具有20000-45000道尔顿的平均分子量，
其中，
n是1-1000的整数；
m是10-1000的整数；
作为G-CSF和PEG的连接基的Z是(CH2)S或(CH2)SNHCO(CH2)S，其中S是1-6的整数；
Y是通过使G-CSF中的NH2官能团和PEG衍生物的官能团结合而形成的酰胺键。
2.权利要求1的缀合物，其中所述PEG具有23000-43000道尔顿的平均分子量。
3.制备权利要求1的通式(1)的三分枝的PEG-G-CSF缀合物的方法，其包括形成以下通式(2)的三分枝的PEG衍生物和G-CSF的共价键，其中PEG(聚乙二醇)具有20000-45000道尔顿的平均分子量；
Figure FSB00000788785300012
其中，
n是1-1000的整数；
m是10-1000的整数；
作为G-CSF和PEG的连接基的Z是(CH2)S或(CH2)SNHCO(CH2)S，其中S是1-6的整数；并且
能与含有G-CSF的蛋白质和肽进行化学反应的官能团是N-羟基琥珀酰亚胺。
4.权利要求3的方法，其中所述PEG具有23000-45000道尔顿的平均分子量。
5.权利要求3的方法，其中G-CSF与三分枝的PEG衍生物的摩尔比是1∶0.5-1∶50。
6.权利要求5的方法，其中反应中G-CSF与三分枝的PEG衍生物的摩尔比是1∶0.5-1∶5。
7.用于治疗或预防由造血功能下降和免疫功能下降造成的症状的药物组合物，其包含权利要求1或2的缀合物作为有效成分。
8.权利要求7的药物组合物，其中所述由造血功能下降和免疫功能下降造成的症状是实体癌、由血液肿瘤的癌症化疗造成的中性白细胞减少、由骨髓增生异常综合征造成的中性白细胞减少、由再生障碍性贫血造成的中性白细胞减少、先天性恶性中性白细胞减少症和由治疗人免疫缺陷病毒造成的中性白细胞减少。
9.权利要求1或2的缀合物在制备治疗中性白细胞减少、预防中性白细胞减少或促进在造血干细胞动员至外周血和造血干细胞移植时嗜中性粒细胞数量增加的药物中的用途。
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