KR102268647B1 - 안정성이 향상된 에리스로포이에틴 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

안정성이 향상된 에리스로포이에틴 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 안정성이 향상된 에리스로포이에틴 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 에리스로포이에틴의 생리활성의 저하를 최대한 감소시키고 혈중 혈청 반감기를 증가시켜 체내 약물의 효능을 높임으로써, 적혈구 생성 및 조혈에 관련된 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있으므로, 의학 분야 및 인류의 의료복지 향상에 크게 활용될 것으로 기대된다.

Description

안정성이 향상된 에리스로포이에틴 조성물 및 이의 제조방법{A Composition comprising erythropoietin and a method of producing the same}
본 발명은 안정성이 향상된 에리스로포이에틴 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
에스트로포이에틴(erythropoietin, EPO)은 적혈구 전구세포의 마지막 성숙과 성장을 조절하는 역할을 하는 호르몬으로서, 주로 태아 간이나 성인 신장에서 생산되며, 저산소 혈중상태에서 혈액 내 양이 증가하여 성숙한 산소전달 적혈구 세포의 생산을 조절하는 것으로 알려져 있다. 혈중 EPO의 감소로 적혈구 수가 감소하면 조직의 기능 장애가 일어나 빈혈을 일으키게 되므로, 현대에는 체외에서 인공적으로 합성한 EPO를 약학조성물로 투여하는 기술이 개발되었다. EPO와 같은 폴리펩타이드, 앱타머, siRNA 등의 바이오 의약품은 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 신장이나 간을 통해 쉽게 제거되기 때문에, 약리성분으로 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 약물을 환자에게 좀 더 자주 투여할 필요가 있다. 그러나, 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사를 놓는 것은 환자에게 고통을 야기할 뿐 아니라, 제조된 단백질 의약품의 보관 및 유통에도 많은 비용이 소모되게 된다. 따라서 바이오 의약품의 생리활성 저하를 최대한 감소시키고 혈중 반감기를 증가시키기 위한 기술이 시급이 요구되고 있는 실정이다.
한편, 페길레이션(PEGylation, 공유 접합)이란, 기존의 단백질 약물의 생물학적 반감기를 극대화하고, 생체 내에서의 약효를 지속적으로 유지하며, 기존의 빈번한 투여로 인해 약물의 부작용인 면역원성 및 항원성을 감소시키기 위한 DDS(Drug delivery system) 기술이다. 페길레이션은 수용성 생체 적합성 고분자로 단백질/펩타이드에 공유결합하여 그 단백질의 물리적 성질을 변화시킴으로써 체내 안정성을 증가시키는 역할을 한다. 단백질 의약품의 페길레이션 지속성 제제는 단백질 약물의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다. 그러나 대부분의 페길레이션은 비선택적으로 행해졌으며, 이에 따라 생물학적 활성을 나타내는 부위의 페길레이션에 의한 블로킹(blocking) 등의 문제가 있어, 활성이 현저히 떨어지거나, 페길레이션 수식 부위별로 활성의 불균일성을 보이는 등의 문제점을 가지고 있었다.
이에 본 발명자들은 상기한 바와 같이, 종래 페길레이션 기술의 단점을 보완하고, 반응 수율 및 생체 수율이 높으면서도, 체내 안정성과 지속성이 높은 생체적합성 고분자가 접합된 EPO의 제조방법을 개발하기 위한 연구를 계속한 결과, 본 발명을 완성하였다. 본 발명의 안정성이 향상된 에리스로포이에틴 조성물은 체내 안정성이 현저하게 증가되므로, 의학 분야 및 인류의 의료복지 향상에 크게 활용될 것으로 기대된다.
본 발명은 안정성이 향상된 에리스로포이에틴 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “에리스로포이에틴(erythropoietin, EPO)”이란, 적혈구 전구세포의 마지막 성숙과 성장을 조절하는 역할을 하는 당단백질 호르몬으로서(Goldwasser 등, Ann. NY Acad. Sci., 149, 49, 1968), 주로 태아 간이나 성인 신장에서 생산되며, 혈액 내 인간 EPO의 양은 저산소 혈중상태에서 증가하여, 그 결과로 성숙한 산소전달 적혈구 세포의 생산을 조절한다. 인간은 정상적인 조직의 기능을 위해 적정한 수준의 적혈구 수를 유지하고 있으므로 적혈구 수가 감소하면 조직의 기능 장애가 일어나 빈혈을 일으키게 된다. 인간 EPO는 1906년에 적혈구 조혈(erythropoiesis)을 조절할 수 있는 체액성 인자의 존재 가능성이 보고되면서 처음으로 알려지기 시작하였고, 1957년에 에리스로포이에틴으로 명명된 적혈구 생성을 촉진하는 호르몬이 신장에서 생성된다는 것이 밝혀졌다(Jacobson 등, Nature, 179, 633, 1957). 1977년에는 미야케 등이 재생불량성 빈혈환자의 뇨로부터 대량 분리, 정제하는데 최초로 성공한 이후(Miyake 등, J. Biol. Chem., 252(15), 5558, 1977), 분자생물학과 당생물학에서 연이은 연구가 본격화되기 시작하여 야나가와 등에 의해 N-말단 30개의 아미노산 서열이 처음으로 보고 되었고(Yanagawa 등, J. Biol. Chem., 295(5), 2707, 1984), 2년 후에는 래이 등이 인간 뇨 유래 EPO로부터 전체 아미노산 서열을 결정하여 보고하였다(Lai 등, J. Biol. Chem., 261, 3116, 1986). 천연형 인간 EPO는 산성(acid), 단일형(monomer)의 당단백질로서 전체 분자량이 약 34,000 달톤 정도이며, 당을 제외한 단백질 부분만의 분자량은 약 18,000 달톤이다(Wang 등, Endocrinology, 116, 2286, 1985). 인간 EPO에서 전체 분자량의 약 40%인 당쇄 부분은 인간 EPO의 생체 내 활성 및 구조 안정성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 왔다(Linda et al, J. Biological Chemistry 266, 23022-23026(1991)). 따라서, 인간 EPO의 당 함량이 감소되면 인간 EPO 분자의 생물학적 반감기가 급격히 감소되어 인간 EPO의 생체 내 생물학적 활성이 소실된다(Goto 등, Biotechnology, 6, 67, 1988).
현대에는 체외에서 인공적으로 합성한 EPO를 약학조성물로 투여하는 기술이 개발되었는데, 유전자 클로닝 및 발현을 통한 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조되어 만성 신부전, 골수억제 화학치료에 있는 암 환자와 관련된 빈혈을 포함한 다양한 형태의 빈혈 치료에 유용하게 사용되어 왔다(US 5618698B1). 그러나, 이와 같은 EPO의 효능은 입증되었으나, EPO는 체내에서의 반감기가 짧아(약 4시간) 자주 투여하여야 하므로, 환자들에게 만족감을 주는 데에는 한계가 있었다. 따라서 EPO와 같은 시판되는 단백질 치료제의 고유 활성을 유지하면서 체내 안정성 및 지속성을 증진시키는 연구가 계속되고 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “페길레이션(PEGylation)”이란, “공유접합”을 의미하는 것이며, 기존의 단백질 약물의 생물학적 반감기를 극대화하고, 생체 내에서의 약효를 지속적으로 유지하며, 기존의 빈번한 투여로 인해 약물의 부작용인 면역원성 및 항원성을 감소시키기 위한 DDS(Drug delivery system) 기술이다. 페길레이션은 수용성 생체 적합성 고분자로 단백질/펩타이드에 공유결합하여 그 단백질의 물리적 성질을 변화시킴으로써 체내 안정성을 증가시키는 역할을 한다. 그러나 대부분의 페길레이션은 비선택적으로 행해졌으며, 이에 따라 생물학적 활성을 나타내는 부위의 페길레이션에 의한 블로킹(blocking) 등의 문제가 있어, 활성이 현저히 떨어지거나, 페길레이션 수식 부위별로 활성의 불균일성을 보이는 등의 문제점을 가지고 있었다.
현재까지 8개의 페길레이션된 제품이 치료제로 사용되고 있으며, 특히 2002년에 미 FDA 허가를 받은 C형 간염 치료제인 페길레이션된 인터페론(PEGylation-interferon)은 1주 1회 주사제로 개발되어 그 규모가 2004년에 13억불을 초과하였으며, 기존의 1주 3회 주사제인 1세대 인터페론 시장을 70% 이상 빠르게 대체하고 있다.
본 발명에 있어서 페길레이션은 EPO에 대해 수행되는 것이며, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)로 페길레이션 하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서 “생체적합성 고분자”는, 천연 또는 인공 합성 고분자 물질 등 EPO와 같은 생물학적 활성물질에 부가될 수 있는 인체에 유용한 모든 생체적합성 고분자를 총칭한다. 본 명세서에서 사용되는 "생체적합성"이란 용어는, 생체 독성 반응, 염증 반응, 면역 반응, 발암성 등을 일으킴이 없이, 생체에 무독 무해하고 면역학적 거부 반응을 일으키지 않으면서 생체 조직이나 생체 시스템과 좋은 친화성으로 양립할 수 있는 능력을 말한다.
본 발명에 사용될 수 있는 인체에 유용한 생체적합성 고분자 물질로는, 다양한 용매에 쉽게 용해될 수 있고 수평균 분자량이, 바람직하게는 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤, 더욱 바람직하게는 약 5,000 달톤 내지 약 40,000 달톤인 생체적합성 고분자로서, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리트리메틸렌글리콜, 폴리락트산 및 이들의 유도체, 폴리아크릴산 및 그의 유도체, 폴리아미노산, 폴리비닐 알콜, 폴리우레탄, 폴리포스파진, 폴리(L-라이신), 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴아마이드 및 이들의 둘 이상의 공중합체로 이루어진 그룹 중에서 선택된 비면역원성 고분자 물질이 포함되며, 이에 한정되지 않는다. 이들 생체적합성 고분자는 선형(linear) 형태뿐만 아니라 가지 달린(branched) 형태의 고분자도 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 폴리에틸렌글리콜이다. PEG는 HO-(-CH2CH2O-)-H의 반복 구조를 가지는 수용성, 무독성의 고분자로서, 생물학적 반감기(Plasma half-life)의 증가, 용해도 및 안정성의 증가, 면역원성의 감소 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 펩타이드 또는 단백질 등의 생물학적 활성물질에 결합되는 PEG의 분자량 범위는 대략 1,000 내지 100,000, 바람직하게는 5,000 내지 40,000 이다. PEG의 분자량이 1,000 이상일 경우 독성은 상당히 낮은 편으로 알려져 있다. 분자량 범위 1,000 내지 6,000의 PEG는 전신에 분포하며 신장을 통해 대사되고, 특히 분자량 40,000의 측쇄형 PEG는 혈액과 간을 포함한 기관들에 분포되고 대사는 간에서 이루어진다.
PEG 등 생체적합성 고분자를 단백질 등의 생물학적 활성 물질과 결합시키기 위해서는, 일반적으로 생체적합성 고분자의 양 말단 중 하나 또는 둘 다를 알데히드기, 석신이미딜기, 하이드로자이드기, 이민기 등의 고 반응성 작용기로 치환한 후, 상기 고 반응성 작용기가 생물학적 활성 물질의 아민기, 카르복실기, 티올기 등과 화학 반응을 통해 결합하여 접합체를 이루도록 한다. 경우에 따라서는, 바람직하게 PEG 등 생체적합성 고분자의 한 하이드록시 말단을 메톡시기 등으로 보호한 후, 나머지 한 말단만 고 반응성 작용기를 치환하여 반응시키거나, 또는 한쪽 말단을 보호하고 나머지 말단에 특정 생물학적 활성 물질을 결합시킨 후, 다른 쪽 말단의 보호기를 제거하고 이를 활성화시켜 또 다른 생물학적 활성 물질을 결합시킬 수도 있다.
상기와 같이 생체적합성 고분자를 생물학적 활성물질에 결합시키기 위해 말단 그룹 중 하나 또는 둘 모두를 반응성 작용기로 전환시키는 과정을 "활성화"라고 하며, 이 과정에 의해 반응성 작용기로 치환, 생성된 고분자 산물을 "활성화된 생체적합성 고분자"라고 한다. 예를 들면, 폴리(알킬렌 옥사이드)를 펩타이드 또는 단백질에 결합시키기 위해 하이드록실 말단 그룹 중 하나를 카르보네이트와 같은 반응성 작용기로 전환시킬 수 있으며, 이에 따라 수득된 산물은 실온에서 수용성인 활성화된 폴리(알킬렌 옥사이드)(PAO)가 된다. 이러한 그룹에는 mPEG과 같은 일 치환 폴리알킬렌 옥사이드 유도체 또는 C1-4 말단 그룹을 함유하는 것들과 같은 다른 적당한 알킬-치환 PAO 유도체가 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 바람직한 반응성 작용기는 EPO의 카르복실기와 결합할 수 있도록 생체적합성 고분자를 활성화하는 그룹 또는 잔기를 말한다. 바람직하게, 상기 반응성 작용기는 1급 아민, 또는 하이드라진 및 하이드라자이드 작용기(아실 하이드라자이드, 카르바제이트, 세미카르바제이트, 티오카르바제이트 등)와 같이 카르복실산 및 반응성 카르보닐기와 반응할 수 있는 작용기 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)”이란, 생체적합성 고분자 물질의 일종으로 PEG로 생물학적 활성 물질을 페길레이션시키는 많은 특허공보 및 문헌을 찾아볼 수 있다. EPO에 PEG 유도체를 접합시킨 예로, WO 94/28024는 EPO의 라이신의 아민기나 당의 산화된 기에 PEG를 접합한 것을 개시하였다. US 6340742B1에서는 EPO 표면에 라이신과 같은 아미노기에 20K 내지 40K PEG 유도체를 접합하여 PEG가 없는 EPO에 비해 반감기가 증가한다는 것을 보여 주고 있다. 또한 US 6586398B1에서는 정상 에리스로포이에틴 자극 단백질(Novel erythropoietin stimulating protein, NESP)의 N-말단을 포함하는 자유(free) 아민기 또는 산화된 당사슬에 선형(linear) 또는 분지된(branched) 형태의 PEG 유도체를 접합하여 적혈구 생성 효능을 보여 주었다.
그러나, 기존의 PEG-EPO의 접합체는 주로 EPO의 아민기에 PEG가 접합된 것으로서, 많은 생물학적 활성 물질, 예를 들어 단백질의 경우, 라이신에 PEG가 접합되면 상당한 생물 활성을 잃게 된다는 보고가 있다. EPO는 단 8개의 라이신기만을 가지고 있어 활성 감소의 문제가 있을 수 있으며, 또한 라이신에 접합되는 PEG의 수가 많을수록 EPO의 생리 활성은 더 감소하는 것으로 보고 되고 있다(WO 94/28024). 그 예로 PCT/JP01/08539에서 PEG 유도체가 EPO의 라이신의 아민기에 결합한 경우, PEG의 결합 수가 증가함에 따라 생물학적 활성이 천연(native) EPO에 비해 13 % 내지 0.79 %만 유지하는 것으로 보고 되고 있다.
따라서, EPO에 PEG페길레이션(PEG-EPO)하여 EPO의 안정성을 향상시키되, 생물 활성의 역가는 유지되는 PEG-EPO 제조방법의 개발이 시급한 실정이다.
본 발명의 일구체예에서 “조성물”이란, 고분자 화합물 또는 접합체등이 다양한 유사한 구조로 존재하는 것으로, 이에 한정하지는 않지만, 동일한 구조 화합물이지만 이성질체이거나, 동일한 분자량의 화합물이 EPO와 같은 단백질의 서로 다른 특정 위치에 결합한 위치 이성질체를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서 “조혈 질환”이란, 조혈, 즉 혈구의 생성이 정상적으로 조절되지 않는 질환으로서, 적혈구계 이상, 백혈구계 이상, 출혈성 질환, 및 림프계통 질환이다. 적혈구계 이상은 주로 빈혈을 의미하는 것으로서, 적혈구 생성 감소, 용혈성 질환, 및 실혈등이 원인이 되고, 상세한 종류로는 철 결핍성 빈혈, 악성빈혈, 재생불량성 빈혈, 및 용혈성 빈혈로 구분할 수 있다. 백혈구계 이상의 종류는 백혈병과 골수종이 있고, 상기 백혈병은 림프성 백혈병과 골수성 백혈병으로 구분되며, 상기 골수종은 다발성 골수종과 골수섬유증으로 구분된다. 출혈성 질환은 크게 혈소판 이상과 응고기전 이상으로 구분할 수 있는데, 혈소판 이상의 종류로는 특발성 혈소판 감소성 자반병과 혈전성 혈소판 감소증이 있고, 응고기전 이상의 종류로는 혈우병, 폰빌레브란트병(von Willebrand disease), 및 파종성 혈관내 응고증후군이 있다. 또한 림프계통 질환은 림프절의 염증질환, 악성종양, 비장 질환, 및 흉선 질환으로 구분되고, 상기 림프절의 염증질환은 비특이 림프절염, 결핵성 림프절염과 사르토이드증(uberculous lymphadenitis & sarcoidosis), 및 괴사성 림프절염으로 구분 가능하나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서 “투여”란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 치료 방법은 상기 약제학적 조성물을 약제학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 유전자의 발현 억제제 또는 단백질의 활성 억제제를 1일 1회 내지 수회 투여시, siRNA일 경우 0.01ng/kg-10㎎/kg, 상기 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 경우 0.01ng/kg-10㎎/kg, 화합물일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg, 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg의 용량으로 투여될 수 있다.
상기 조성물은 총 중량에 대하여 유효성분을 0.001 내지 100 중량%로 포함한다. 본 발명의 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 포유동물, 바람직하게는 사람에서 각종 의학 질환의 치료 방법을 제공한다. 이 방법은 이러한 치료가 필요한 포유동물에게 본원에 기술된 바와 같이 제조한 PEG-EPO 접합체 함유 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 이 접합체는 다른 것들 중에서, 조혈작용의 효과에 대해 의학 분야에 공지되어 있는 바, 조혈 기능 이상에 기준한 질환에 대해 양성적으로 또는 긍정적으로 반응하는 상태를 치료하는데 유용하다. 본 발명에 따라 치료할 수 있는 상태는 일반적으로 EPO를 이용한 치료에 민감한 질환이다. 예를 들어, 민감한 질환은 이들 용어가 의학 분야에 공지되어 있는 바, 조혈 기능 이상에 기준한 질환에 대해 양성적으로 또는 긍정적으로 반응하는 질환을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 에리스로포이에틴 및 생체적합성 고분자화합물이 공유 결합된 접합체를 제공하고, 상기 생체적합성 고분자화합물은 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리트라이메틸렌 글라이콜, 폴리락트 산과 이의 유도체, 폴리아크릴 산과 이의 유도체, 폴리(아미노산), 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리(L-라이신), 폴리알킬렌 산화물, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 피롤리딘, 폴리비닐 알코올, 폴리아크릴 아마이드와 이들의 공중합체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 접합체를 제공하며, 상기 고분자화합물은 폴리에틸렌글리콜인 접합체를 제공하며, 상기 폴리에틸렌글리콜은 화학식 1로 표시되고, 분자량이 20 kDa인 것인 접합체를 제공하며, 상기 접합체는 에리스로포이에틴의 Lys 45 및 97번 아미노산에 생체적합성 고분자화합물이 공유 결합된 것인 접합체를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112017055573119-pat00001
본 발명의 다른 구체예에서, 상기의 접합체 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조혈질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고, 상기 조혈 질환은 철 결핍성 빈혈, 악성빈혈, 재생불량성 빈혈, 용혈성 빈혈, 림프성 백혈병, 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 골수섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 혈전성 혈소판 감소증, 혈우병, 폰빌레브란트병(von Willebrand disease), 파종성 혈관내 응고증후군, 비특이 림프절염, 결핵성 림프절염과 사르토이드증(uberculous lymphadenitis & sarcoidosis), 괴사성 림프절염, 림프 악성종양, 비장 질환, 및 흉선 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 조혈 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 생체적합성 고분자화합물을 인산염에서 용해시키는 단계; (b) (a)에 에리스로포이에틴을 첨가하고 교반하는 단계; 및 (c) 산도(pH)를 4.0 내지 5.0으로 조절하여 반응을 정지시키는 단계를 포함하는 에리스로포이에틴 및 생체적합성 고분자화합물이 공유 결합된 접합체를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 (a)단계에서의 생체적합성 고분자화합물은 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리트라이메틸렌 글라이콜, 폴리락트 산과 이의 유도체, 폴리아크릴 산과 이의 유도체, 폴리(아미노산), 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리(L-라이신), 폴리알킬렌 산화물, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 피롤리딘, 폴리비닐 알코올, 폴리아크릴 아마이드와 이들의 공중합체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 에리스로포이에틴 및 생체적합성 고분자화합물이 공유 결합된 접합체를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 고분자화합물은 폴리에틸렌글리콜인 에리스로포이에틴 및 생체적합성 고분자화합물이 공유 결합된 접합체를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 폴리에틸렌글리콜은 화학식 1로 표시되고, 분자량이 20 kDa인 것인 에리스로포이에틴 및 생체적합성 고분자화합물이 공유 결합된 접합체를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 (b)단계에서의 에리스로포이에틴은 생체적합성 고분자화합물에 대하여 1:1 내지 1:5 몰비로 첨가되는 것인 에리스로포이에틴 및 생체적합성 고분자화합물이 공유 결합된 접합체를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 (b)단계에서의 교반은 18 내지 32 ℃에서 0.2 내지 3 시간 동안 수행하는 것인 에리스로포이에틴 및 생체적합성 고분자화합물이 공유 결합된 접합체를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 접합체는 에리스로포이에틴의 Lys 45 및 97번 아미노산에 생체적합성 고분자화합물이 공유 결합된 것인 에리스로포이에틴 및 생체적합성 고분자화합물이 공유 결합된 접합체를 제조하는 방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112017055573119-pat00002
이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명은 에리스로포이에틴(EPO)의 안정성을 향상시키되, 생물 활성의 역가는 유지되는 PEG-EPO 접합체, PEG-EPO 접합체를 포함하는 조성물, 및 PEG-EPO 접합체의 제조방법을 제공함으로써, 조혈 기능 이상에 기준한 질환에 대해 유용한 치료 효과를 부여하므로, 의학 분야 및 인류의 의료복지 향상에 크게 활용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, PEG-EPO-TS의 SDS PAGE 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, PEG-EPO-TS의 HPLC 순도 분석 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, PEG-EPO-Mircera, PEG-EPO-TS, 및 EPO의 SDS-PAGE 분리 및 밴드 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, SDS-PAGE 분리된 PEG-EPO-TS 접합체 밴드의 HPLC의 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, pH 반응조건에 따른 PEG-EPO 접합체 생성 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, EPO:PEG 비율에 따른 PEG-EPO 접합체 생성 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 반응시간에 따른 PEG-EPO 접합체 생성 결과를 나타낸 도이다.
도 8 내지 도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, PEG-EPO-Mircera, 및 PEG-EPO-TS 의 2차 구조를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른, PEG-EPO-Mircera, PEG-EPO-TS, 및 EPO에 Lys-C 분해 효소, 키모트립신 분해 효소(Chymotrypsin digestion), 또는 Glu-C 분해 효소 처리 후 펩타이드 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른, PEG-EPO-Mircera, PEG-EPO-TS, 및 EPO에 N-탈당쇄효소 처리 후 펩타이드 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른, PEG-EPO-TS와 PEG-EPO-Mircera의 페길레이션 되는 EPO 펩타이드 위치 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른, PEG-EPO-TS와 PEG-EPO-Mircera의 페길레이션 되는 EPO 펩타이드 위치를 표시한 펩타이드 모식도이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른, EPO, PEG-EPO-TS, 및 PEG-EPO-Mircera의 반유효 농도(EC50)을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른, 시간에 따른 EPO, PEG-EPO-TS, 또는 PEG-EPO-Mircera의 혈중 농도 변화를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른, B6D2F1 마우스에게 EPO, PEG-EPO-TS, 또는 PEG-EPO-Mircera 약물 투여 전후의 적혈구 계수 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른, B6D2F1 마우스에게 EPO, PEG-EPO-TS, 또는 PEG-EPO-Mircera 약물 투여 전후의 망상 적혈구 비율 계산 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른, B6D2F1 마우스에게 EPO, PEG-EPO-TS, 또는 PEG-EPO-Mircera 약물 투여 전후의 망상 적혈구 계수 결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. PEG-EPO 접합체의 제조
50 mM 인산염(sodium phosphate, pH 7.5) 용액에 EPO: PEG= 1: 5 비율로 반응을 진행하였다. 이를 위해, 먼저 냉장보관 중이던 EPO는 얼음 내에서 보관하고, PEG는 반응 전 상온에 도달하도록 미리 워밍하였다. PEG 5 비율을 먼저 인산염에서 마그네틱 바를 이용하여 용해시키고, 후 EPO 1 비율을 첨가 시킨 후, 상온(23내지 25℃)에서 1시간 교반하여 페길레이션(PEGylation) 되도록 하였다. 이 때 EPO의 최종 농도는 1mg/㎖이 되도록 하였다. 교반 후에 초산(Acetic acid)을 이용하여 pH를 4.4내지 4.5로 맞추어 PEG와 EPO의 반응을 정지시켰다. 반응 1시간 후 HPLC로 반응 수율을 분석하고, 반응 완료 후 최종 산물을 10 mM 초산나트륨(NaOAc) 완충액(pH 4.4)으로 5배 희석하였다.
본 발명에서 사용한 인간 유래 EPO의 아미노산 서열을 서열번호 1에 기재하고, 본 발명 의제조방법으로 제조된 페길레이션된 EPO를 “PEG-EPO-TS”로 명명하였으며, 상기 PEG는 그 화학식을 하기 화학식 1에 나타내었다.
[화학식 1]
Figure 112017055573119-pat00003
본 발명의 조성물의 비교군으로서, 시판되는 페길레이션된 EPO(Mircera, 한국 로슈)를 사용하였다. 이를 “PEG-EPO-Mircera”라 명명하였다.
실시예 2. PEG-EPO 접합체의 분리 및 정제
상기 실시예 1에서 제조된 PEG-EPO 접합체의 SDS PAGE 분석 결과를 도 1에 나타내고, HPLC 순도 분석 수행한 결과를 도 2에 나타내었다. HPLC 정제 공정은 PEG-EPO-TS 접합체 혼합물을 10 mM 아세트산나트륨 pH 4.4 완충액, 또는 염산염이 추가된 10 mM 아세트산나트륨 pH 4.4 완충액으로 희석 및 세척하는 방법으로 양이온 교환 크로마토그래피로 PEG-EPO-TS 접합체의 분리 및 정제를 수행하였다. 크로마토그래피의 레진은 30㎖의 SP 세파로즈(SP Sepharose Fast Flow, GE Healthcare, Cat # 17-0729-01)를 5 ㎖/min의 유량 속도로 측정하였다. 보다 구체적인 크로마토그래피 수행 조건을 하기 표 1에 기재하였다.
Fraction Buffer Column volume
Equilibration 10 mM NaOAc pH 4.4 buffer 5 CV
Loading Product 100 ㎖
Washing 10 mM NaOAc pH 4.4 buffer+ 50mM NaCl 10 CV
Elution 1 10 mM NaOAc pH 4.4 buffer+ 110mM NaCl 12 CV
Elution 2 10 mM NaOAc pH 4.4 buffer+ 180mM NaCl 12 CV
Elution 3 10 mM NaOAc pH 4.4 buffer+ 1 M NaCl 10 CV
실험 결과, PEG-EPO-TS 접합체의 자연체(Native), 모노머(monomer), 다이머(dimer), 및 트리머(trimer)의 비율은 다이머및 트리머가 19.47%, 모노머가 59.19%, 및 자연체가 27.3%인 것으로 나타났다.
실시예 3. PEG-EPO 접합체의 생성 및 정제 순도 확인
양성대조군으로 시판되는 PEG-EPO-Mircera(mircera, 한국 로슈社)와 본 발명의 PEG-EPO-TS, 및 EPO를 트리졸 염색하였다. 먼저 상기 세 종류의 시료를 SDS-PAGE에서 단백질 크기 분획하고, SDS-PAGE를 70℃ DDW에서 1분간 세척한 후에, 25㎖의 70℃ 염화 바륨액(5%)에서 5분간 염색시켰다. 이후 5분간 DDW에서 세척하고 25㎖의 요오드액에서 1분간 발색시켰다. 단백질 밴드가 확인되면 DDW 세척하였다. 상기의 SDS-PAGE 분획 직후와 염색 후의 결과를 도 3에 기재하였다.
또한 상기 SDS-PAGE 분획된 밴드 중에서 PEG-EPO-TS 위치의 밴드로부터 단백질 추출하여 실시예 3과 동일한 방법으로 HPLC 분석한 결과, 다이머, 및 트리머가 2.3%, 모노머가 97.6%, 및 자연체가 0%인 것으로 나타나, 모노머의 정제가 매우 잘 이루어진 것을 확인할 수 있었다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
실시예 4. PEG-EPO 접합체 제조의 최적화 조건 확인
상기 실시예 1 내지 3의 실험 결과로부터 PEG-EPO-TS의 안정적인 제조를 확인하였고, 추가로 PEG-EPO-TS의 페길레이션 반응 조건 최적화를 위해 pH, 몰비(molar ratio), 및 반응시간(reaction time)에 따른 최적화 실험을 실시하였다.
먼저, 반응 조건 pH 6.5 또는 pH 7.5에서 페길레이션 후 HPLC의 분석을 통해 모노머, 다이머, 및 자연체 PEG-EPO-TS의 생성 비율을 확인하였다. 그 결과를 표 2 및 도 5에 나타내었다.
pH pH 6.5 pH 7.5
Sample Protein(mg) Yield(%) Protein(mg) Yield(%)
Rxn. Mix 20 100 20 100
Mono- 6.8 34 10.62 53.1
Di- 0.66 3.3 3.88 19.4
Unmod. 11.12 55.6 5.46 27.3
Conju.Mix 7.46 57 14.5 76.5
다음으로, 몰비에 따른 페길레이션 정도를 분석하기 위해, pH 7.5에서 EPO와 PEG 비율 1:3 또는 1:5 조건으로 페길레이션 진행하고, HPLC의 분석을 통해 모노머, 다이머, 및 자연체 PEG-EPO-TS의 생성 비율을 확인하였다. 그 결과를 표 3 및 도 6에 나타내었다.
Ratio Ratio (1 : 3) Ratio (1 : 5)
Sample Protein(mg) Yield(%) Protein(mg) Yield(%)
Rxn. Mix 20 100 20 100
Mono- 8.2 41 11.99 57.1
Di- 3.2 16 3.88 19.4
Unmod. 8.6 43 9.58 23.5
Conju.Mix 11.4 57 15.3 76.5
마지막으로, pH 7.5 및 EPO와 PEG 비율 1:5 조건에서 반응시간에 따른 페길레이션 후 모노머, 다이머, 및 자연체 PEG-EPO-TS의 생성 비율을 확인하였다. 그 결과를 표 4 및 도 7에 나타내었다.
Time 30 min 60 min 90 min 120 min Over night
Sample Protein
(mg)		 Yield
(%)		 Protein
(mg)		 Yield
(%)		 Protein
(mg)		 Yield
(%)		 Protein
(mg)		 Yield
(%)		 Protein
(mg)		 Yield
(%)
Rxn. Mix 20 100 20 100 20 100 20 100 20 100
Mono- 8.2 44.1 8.2 55.1 10.58 52.9 10.6 53 10.8 54
Di- 3.2 3.4 3.2 8.8 3.6 18 4.24 21.2 6.2 31
Unmod. 8.6 52.3 8.6 35.9 5.8 29 5 25 2.8 14
Conju.Mix 11.4 47.7 11.4 64.1 14.18 71 14.84 75 17 86
실시예 5. PEG-EPO 접합체의 분자량 분석
PEG-EPO-TS를 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight) 질량분석기를 이용하여 단백질 분자량 분석하였다. 먼저, 0.5㎖의 시료의 원액(770 ug/㎖)과 대조군으로서 BSA(Calibration standard bovine serum albumin)를 10mg/㎖의 시나핀산(30% Acetonitrile, 및 0.3% trifluoroacetic acid)과 1:1(v/v)비율로 혼합하여 OptiTOF MALDI플레이트(stainless steel target plate, ABSCIEX)에 1㎕ 점적한 후 진공원심농축기에서 건조하였다. MALDI-TOF질량분석기 수행 조건을 하기 표 5에 나타내었다.
분석 mode MS linear high mass positive ion mode
Mass range(Da) 10,000~100,000
Total shots/spectrum 2250 shots
Fixed laser intensity 7200
Detector voltage multiplier 0.98
상기 조건으로 BSA대조군 측정 결과 66,425.8438(1가 charged ion), 및 33,222.5117(2가 charged ion)로 측정되었다. 분자량이 큰 시료를 측정하는 방식인 Linear mode 특성상 평균 MS를 사용하기에 Reflector mode에 비해 질량의 정확도가 떨어지는 것이 자명하므로, 상기 BSA대조군 측정값에 의거하여 질량 보정 후 MS tolerance는 +/- 10 m/z로 설정하고 PEG-EPO-TS 시료 분석을 실시하였다.
동일한 PEG-EPO-TS 시료에 대하여 6회 반복 측정한 결과, 각각의 측정값을 평균 및 표준편차 처리결과 59,374.58 ± 83.77로 계상되어, 본 발명에서 제조한 PEG-EPO-TS는 59kDa 의 단백질인 것으로 분자량 측정되었다. 상기 6회 반복 측정한 결과의 평균값을 하기 표 6에 나타내었다.
시료(Sample) Charge (n) (M+nH)n+평균
PEG-EPO-TS +1 59,465.3672
+1 59,376.9063
+1 59,253.4570
+1 59,324.4727
+1 59,471.1094
+1 59,356.1914
PEG-EPO-TS Intact MS results(Average±STDEV): 59,374.58± 83.77
실시예 6. PEG-EPO 접합체의 2차 구조 확인
양성대조군으로 시판되는 PEG-EPO-Mircera와 PEG-EPO-TS의 구조적 차이 및 유의성을 확인하기 위해서 단백질 구조분석을 수행하였다. 이를 위해, 먼저 50mM 인산나트륨(pH 6 내지 8) 완충액을 준비하고, 시료를 0.2mg/㎖ 내지 0.5mg/㎖로 희석하여 1mm cell에 200㎕를 충전하고, 260 내지 180nm에서 UV 측정하였다(Far UV J-1500, JASCO International Co., Ltd). 단백질의 2차구조 분석은 JASCO Spectra Manager Version2 CD Multivarlate SSE version 2.1.0.3 프로그램으로 수행하였다.
실험 결과, 200 내지 210nm 구간에서 차이가 특히 많이 발생하는 것을 확인할 수 있었다. 상기의 결과를 표 7 및 도 8 내지 도 10에 나타내었다.
시료 Helix Sheet Turn Other
PEG-EPO-Mircera 49.90% 9.00% 9.60% 31.50%
PEG-EPO-TS 56.60% 5.70% 10.50% 27.20%
실시예 7. PEG-EPO 접합체의 접합위치 및 펩타이드 서열 확인
본 발명에서 제조된 PEG-EPO-TS의 접합 위치 확인을 위해서 음성대조군으로서 EPO 단백질, 양성대조군으로서 시판되는 PEG-EPO-Mircera와 함께 펩타이드 서열 분석을 수행하였다. Lys-C 분해 효소, 키모트립신 분해 효소(Chymotrypsin digestion), 또는 Glu-C 분해 효소 처리 후 펩타이드 맵(peptide mapping)의 피크패턴을 분석하였다. 실험 결과, 3 종류의 효소 처리 후에도 EPO 단백질, PEG-EPO-TS, 및 PEG-EPO-Mircera의 피크패턴이 균일하게 나타나는 것을 확인하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
또한 EPO 단백질, PEG-EPO-TS, 또는 PEG-EPO-Mircera에 펩티드 N-탈당쇄효소(PNGase) 처리 후 상기 3종 분해 효소 처리된 시료에 대해서 펩타이드 서열 분석을 수행하였다. 거울상(mirror image)을 이용하여 비교한 결과, 각 피크에 대한 대기 시간(retention time)은 분자량이 같은 패턴으로 나타나는 것을 확인하였다. 그러나 PEG-EPO-TS와 PEG-EPO-Mircera에서 미세한 차이가 나타났는데, PNGase F를 처리하지 않을 경우 EPO의 특성상 3개의 N-glycan과 1개의 O-glycan에서 보여지는 차이인 것으로 예측 할 수 있었다. 상기 결과를 도 12에 나타내었다.
마지막으로, 상기 3 종류의 효소 처리된 PEG-EPO-TS와 PEG-EPO-Mircera에 대하여 페길레이션 위치 분석을 수행하였다. 먼저, 0.5mg의 단백질 시료를 25㎕의 중탄산 암모늄(100mM)으로 희석한 후에, 25㎕의 TFE 변성액을 첨가하고, 1㎕의 DTT(200mM)를 혼합하고, 60℃에서 1시간 동안 가열한 후 냉각하였다. 이 후, 4㎕의 IAM(200mM)을 첨가하고 상온의 암실에서 1시간 동안 인큐베이션하고, IAM의 반응을 중지시키기 위해서 1㎕의 DTT(200mM)를 첨가하고, 상온의 암실에서 1시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 반응액이 들어있는 튜브에 300㎕의 증류수를 첨가하고, pH를 증가시키기 위해서 100㎕의 중탄산 암모늄(100mM)을 첨가하였다. pH가 7.5 내지 8.0인 것을 확인한 후에, 트립신을 1:50 비율로 첨가하고, 37℃에서 밤새도록 인큐베이션 하고, 다시 1㎕의 포름산 또는 TFA를 첨가하였다. 단백질 분해양상의 측정은 Acquity UPLC I-Class 장비로 수행하였고, 컬럼은 Advance biopeptide mapping column(2.1 X 150mm, Agilent)를 사용하였다. 사용시 온도는 60℃로 세팅하였고, 유속은 분당 0.4㎖으로 조절하였다. 선형 구배는 1시간에 5% 내지 40%로 조절하였다. 질량 분석을 위한 질량 분석기는 Orbitrap Elite 장비를 사용하였고, 해상도 60,000, 모드는 양이온, Max IT는 100ms, 스캔 범위는 400 내지 2000, 활성 타입은 CID, 미니넘 필요 신호는 5.00E+01, 격리 폭은 5.0m/s, NCE는 35, 활성 시간은 30ms, 및 스펙트럼은 센트로이드(Centroid)로 세팅하여 측정하였다.
실험 결과, PEG-EPO-TS와 PEG-EPO-Mircera는 페길레이션 되는 EPO펩타이드 위치가 상이한 것으로 나타났다. 본 발명에서 제조된 PEG-EPO-TS는 Lys45, 및 Lys97 아미노산에서 페길레이션 되었으나, PEG-EPO-Mircera의 경우 Lys45, Lys52, Lys97, 및 Lys140 아미노산에서 페길레이션 되는 것으로 확인되었다. 상기 결과를 도 13에 나타내고, 페길레이션 위치를 표시한 펩타이드 모식도를 도 14에 나타내었다.
실시예 8. PEG-EPO 접합체의 반유효 농도(EC50) 확인
EPO, PEG-EPO-TS, 및 PEG-EPO-Mircera의 반유효 농도(half-maximal effective concentration, EC50)을 측정하였다. 측정은 Nett JH 등의 논문(J Biotechnol. 2012 Jan;157(1):198-206.)을 참고하여, CellTiter-Blue Cell viability assay(Promega, Cat.G8080) 키트 제조사의 권장 프로토콜에 따라 수행하였다.
구체적으로, 실험에 들어가기 하루 전날, T75 배양 접시로부터 TF-1 세포(Human erythroblast, ATCC, Cat.RL-2003)를 수득하고, 125g에서 7분간 원심 분리한 후, 상층액을 제거한 펠렛에 1X의 PBS 10㎖을 첨가하여 세포를 세척하였다. 이를 다시 125g에서 7분간 원심분리하여, 상기의 동일한 방법으로 1X PBS를 제거하고, 2% FBS가 포함된 Opti-MEM(Gibco, Cat.3198-070) 배양액 5㎖로 희석하여 계수하고, 3 X 105 cells/㎖로 재희석하여 분주하고, O/N 배양하였다. 다음날, EPO, PEG-EPO-TS, 및 PEG-EPO-Mircera 접합체를 마이크로튜브 상에서 무혈청 Opti-MEM 배양액으로 희석하여 100ng/㎖이 되도록 전처리하고, 1/2씩 연속 9번 시리얼 다운 희석한 후에, 농도별로 중복 분석이 가능하도록 시료를 준비하여 Opti-MEM 배양액이 20㎕씩 분주된 96웰 플레이트에 웰당 30㎕씩 첨가하였다. 이 후, 배양된 세포를 수득하고, 계수하여 상기 96웰 플레이트에 웰당 1X104 cells/50㎕로 첨가하였다. 상기의 대조군으로는 Opti-MEM 배양액만 들어있거나, 세포만 들어있는 웰을 함께 준비하였다. 세포가 첨가된 웰을 잘 흔들어서 세포를 분산시키고, 37℃ 배양기에서 3일(72시간)간 재배양하였다. 3일 후, 플레이트의 각 웰에 CellTiter-Blue Cell reagent를 20㎕씩 첨가하고, 4시간 반응시킨 후에 흡광도 측정하였다. 분광광도계(Microplate reader, BioTek, Synerge HT)의 측정 모드는 형광(Flourescence), 리드 타입은 종점(Endpoint), 파장은 560ex/590em로 설정하였다. 상기의 측정 결과를 평행선 검정하여 시료의 역가를 계산한 결과를 도 15에 나타내었다.
실험 결과, 반유효 농도(EC50)는 EPO가 0.252, PEG-EPO-TS가 0.994, PEG-EPO-Mircera가 1.269인 것으로 나타나, PEG-EPO-TS가 PEG-EPO-Mircera보다 유효반농도가 더 낮은 것을 알 수 있었다.
실시예 9. PEG-EPO 접합체의 약동학적 효과 확인
실시예 9-1. 랫드에서의 약동학( Pharmacokinetics ) 확인
SD 랫드(수컷, 7주령, 체중 243.53±14.33g)에게 PEG-EPO 접합체를 정맥 투여(intravenous)하는 방법으로 약동학을 측정하였다. 구체적으로, 3 μg/kg의 EPO, PEG-EPO-TS, 또는 PEG-EPO-Mircera 투여 후, 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24(1d), 48(2d), 96(4d), 및 168(8d) 시간 후에 랫드에서 혈액을 SST 튜브로 채취하고, 4℃에서 6,000 rpm으로 10분간 원심분리 후, 농도 측정시까지 -80℃에 보관하였다. 혈중 에리스로포이에틴의 농도는 ELISA로 측정하였다. 상기 시간에 따른 약물의 혈중 농도 변화를 표 8와 도 16에 나타내었다.
0 h 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 24 h 48 h 96 h 168 h
EPO 0 37.6 26.5 21.8 11.3 5.9 0.3 0 0 0
PEG-EPO-TS 0 6.9 6.3 4.7 4.2 3.8 2.5 1.3 0.9 0.2
PEG-EPO-Mircera 0 8.7 7.6 6.3 6.8 4.9 3.6 2.1 0.7 0.1
상기 측정된 농도 결과에 대한 약동학 분석은 비구획적 분석(non-compartmental analysis, NCA)으로 실시하였고, Phoenix WinNonlin 7.0(Certara USA Inc., Princeton, NJ, USA) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 개체별 NCA 파라미터를 산출하였다. 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
EPO PEG-EPO-TS PEG-EPO-Mircera
Body weight(g) 264.7 238.1 257.1
T1/2(h) 3.79 38.21 27.83
Tmax(h) 0.5 0.5 0.5
Cmax(ng/㎖) 37.6 6.9 8.7
C0(ng/㎖) 53.35 7.56 9.96
AUClast(ngh/㎖) 180.01 225.71 284.59
AUCinf(ngh/㎖) 181.65 236.74 288.60
AUC%Extrap(%) 0.90 4.66 1.39
VZ(㎖/kg) 903.47 6469.54 4506.67
C1(㎖/h/kg) 165.15 117.36 112.24
MRTlast(h) 4.22 45.26 36.87
Vss(㎖/kg) 734.81 6283.26 4406.32
T1/2, half-life; Tmax, time at maximal concentration; Cmax, maximal concentration; C0, initial concentration; AUClast, area under the curve from administration to the last measured concentration; AUCinf, area under the curve from administration to infinity; AUC%Extrap, percentage of the extrapolated area under the curve at the total area under the curve; VZ, volume of distribution; C1, clearance; MRTlast, mean residence time to the last measured concentration; Vss, volume of distribution at steady state
실험 결과, IV로 투여되는 경우, 반감기는 EPO가 3.8h, PEG-EPO-TS가 38.2h, PEG-EPO-Mircera가 27.8h으로, PEG-EPO가 EPO보다 7 내지 12배 긴 것으로 나타났다. 또한 PEG-EPO 접합체 사이의 비교에서는 PEG-EPO-TS가 PEG-EPO-Mircera 보다 약 27% 반감기가 긴 것으로 나타났다.
실시예 9-2. 마우스에서의 약력학 ( Pharmacodynamics ) 확인
B6D2F1 마우스(암컷, 7주령, 체중 20.02±0.88g)에게 PEG-EPO 접합체를 복강 투여(intraperitoneal)하는 방법으로 약력학을 측정하였다. 구체적으로, 1.25, 2.5, 5, 또는 20 μg/kg의 EPO, PEG-EPO-TS, 또는 PEG-EPO-Mircera 약물을 투여하고 7일 후, 란셋을 이용하여 안면 정맥으로부터 마이크로 EDTA 튜브(MiniCollect, Greiner Bio-One)에 200 내지 300 ㎕ 채혈하고, 쉐이커를 이용하여 EDTA가 충분히 혼합되도록 하여 응고를 방지한 후에, 1시간 이내에 ADVIA 2120i(Siemens) 장비를 이용하여 CBC 검사를 실시하였다. 상기 결과를 약물 투여 전 CBC 결과가 비교하여 하기 표 10과 도 17 내지 19에 나타내었다.
Dose
(μg/kg)		 RBC(x106/㎕) Reticulocyte(%) Reticulocyte(x109/L)
0d 7d 증감(%) 0d 7d 0d 7d 증감(%)
Vehicle 0 10.84 10.21 -5.81 1.60 5.78 173.20 589.80 240.53
EPO 1.25 10.52 10.05 -4.47 2.30 4.87 242.20 489.50 102.11
2.5 9.87 10.45 5.88 1.96 4.93 193.70 515.10 165.93
5. 10.20 10.52 3.14 2.04 3.51 208.30 368.90 77.10
20 10.77 11.19 3.90 1.53 1.80 165.30 200.90 21.54
PEG-EPO-TS 1.25 10.50 11.09 5.62 1.18 2.50 123.60 277.20 124.27
2.5 10.59 12.25 15.68 1.61 6.38 170.30 781.00 358.60
5. 9.47 13.04 37.70 1.73 14.23 163.70 1855.00 1033.17
20 10.47 14.10 34.67 0.85 15.78 89.20 2225.00 2394.39
PEG-EPO-Mircera 1.25 8.25 9.49 15.03 2.77 4.78 228.40 453.40 98.51
2.5 8.86 12.16 37.25 1.62 4.05 143.50 491.90 242.79
5. 9.15 12.01 31.26 1.47 12.89 134.10 1548.00 1054.36
20 10.43 13.55 29.91 1.87 17.33 194.70 2347.00 1105.44
실험 결과, 적혈구(RBC)의 경우, Vehicle 투여 군에서는 5.81%의 감소(-5.81%)가 있었고, EPO 투여 군에서는 -4.47 내지 5.88%의 감소 또는 증가가 있었지만, PEG-EPO-TS 투여 군에서는 5.62 내지 37.70%의 증가가 있는 것으로 확인되었다. 이것은 3.3 내지 37.24%의 증가를 나타낸 PEG-EPO-Mircera 보다 적혈구 수 증가가 현저한 것이다.
망상적혈구(Reticulocyte)의 경우에는, EPO 투여 군에서는 Vehicle 투여 군 보다도 망상적혈구 수의 증가폭이 작은 것으로 나타났다(Vehicle vs. EPO = 240% vs. 21.54~165.93%). PEG-EPO-Mircera 투여 군은 증가폭이 98.51 내지 1105.44%로 비교적 증가폭이 크고, 농도에 따른 증가를 잘 반영하는 것으로 나타났다. PEG-EPO-TS 투여군의 경우, 증가폭이 124.27 내지 2394.39%로 세 가지 그룹 중에서 가장 증가폭이 크며, 농도에 따른 증가를 잘 반영하는 것으로 나타났다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> HANKOOK KORUS PHARMACEUTICAL CO.,LTD. <120> A Composition comprising erythropoietin and a method of producing the same <130> DPB172439 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp 165

Claims (14)

  1. 에리스로포이에틴 및 생체적합성 고분자화합물이 공유 결합된 접합체로서,
    상기 생체적합성 고분자화합물은 폴리에틸렌글리콜이고, 상기 폴리에틸렌글리콜이 에리스로포이에틴의 Lys 45 및 97번 아미노산에 공유 결합된 것인 접합체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜은 화학식 1로 표시되고, 분자량이 20 kDa인 것인, 접합체.
    [화학식 1]
    Figure 112021048700398-pat00004

  5. 삭제
  6. 제 1항 및 제 4항의 접합체 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 조혈 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 조혈 질환은 철 결핍성 빈혈, 악성빈혈, 재생불량성 빈혈, 용혈성 빈혈, 림프성 백혈병, 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 골수섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 혈전성 혈소판 감소증, 혈우병, 폰빌레브란트병(von Willebrand disease), 파종성 혈관내 응고증후군, 비특이 림프절염, 결핵성 림프절염과 사르토이드증(uberculous lymphadenitis & sarcoidosis), 괴사성 림프절염, 림프 악성종양, 비장 질환, 및 흉선 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 조혈 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  8. (a) 생체적합성 고분자화합물을 인산염에서 용해시키는 단계;
    (b) (a)에 에리스로포이에틴을 생체적합성 고분자화합물에 대하여 1:1 내지 1:5 몰비로 첨가하고, 산도(pH) 7.5, 18 내지 32℃에서 0.2 내지 3 시간 동안 교반하는 단계; 및
    (c) 산도(pH)를 4.0 내지 5.0으로 조절하여 반응을 정지시키는 단계를 포함하는, 에리스로포이에틴 및 생체적합성 고분자화합물이 공유 결합된 접합체를 제조하는 방법으로서,
    상기 생체적합성 고분자화합물은 폴리에틸렌글리콜이고, 상기 폴리에틸렌글리콜이 에리스로포이에틴의 Lys 45 및 97번 아미노산에 공유 결합된 것인 접합체를 제조하는 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 8항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜은 화학식 1로 표시되고, 분자량이 20 kDa인 것인, 에리스로포이에틴 및 생체적합성 고분자화합물이 공유 결합된 접합체를 제조하는 방법.
    [화학식 1]
    Figure 112021048700398-pat00005
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
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