CN101455844B - 聚乙二醇化促红细胞生成素偶联物和其制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种聚乙二醇化促红细胞生成素偶联物，所述偶联物是由甲氧基聚乙二醇基团通过式-CH2-X-S-Y-中的-CH2-基团与促红细胞生成素的氨基形成-NH-CH2-键连接而得到。本发明还公开了上述偶联物的制备方法，即偶联物是由促红细胞生成素和含有已保护巯基的醛类物质发生还原胺化反应，形成通过-NH-CH2-键连接的活化促红细胞生成素；进一步与甲氧基聚乙二醇衍生物偶联而得到，该方法具有反应位点更单一，质量更可控的优点。本发明提供的聚乙二醇化促红细胞生成素偶联物或含有聚乙二醇化促红细胞生成素偶联物的药物组合物可在治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病中广泛应用。

Description

聚乙二醇化促红细胞生成素偶联物和其制备方法与用途
技术领域
本发明涉及一种聚乙二醇促红细胞生成素偶联物，该偶联物具有提高体内血红蛋白含量和网织红细胞数目的生物学活性，本发明的应用领域涉及生物化学、药物化学以及人类疾病的治疗。
技术背景
促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种糖蛋白激素，分子量约34kD。血浆中存在的促红细胞生成素由165个氨基酸组成，糖基化程度很高，糖基成分主要是唾液酸。根据碳水化合物含量不同，天然存在的促红细胞生成素分为两种类型，α型含34％的碳水化合物，β型含26％的碳水化合物。两种类型在生物学特性、抗原性及临床应用效果上均相同。人类促红细胞生成素基因位于7号染色体长22区。1985年其cDNA被成功克隆，并利用基因重组技术开始大批量生产重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHuEPO)，广泛用于临床。应用重组DNA技术已经生物合成出促红细胞生成素(Egrie，JC，Strickland，TW，Lane，J等(986)免疫生物学(lmmunobiol)72：213-224)，其是插入到中国仓鼠的卵巢组织细胞(CHO细胞)中并且表达的克隆的人促红细胞生成素基因的产物。天然存在的人促红细胞生成素首先翻译成含有166个氨基酸并且166位是精氨酸的多肽链。在翻译后修饰中用羟肽酶裂解掉166位精氨酸。没有糖基的人EPO的多肤链的分子量是18236Da.在完整的促红细胞生成素分子中，糖基占整个分子量的大约40％(J.Biol.Chem.262：12059)。
促红细胞生成素是最早应用于临床的细胞因子，是迄今所知作用最单一、且安全可靠的升血红蛋白制剂。对于肾贫血、再生障碍性贫血、多发性骨髓瘤及阵发性夜间血尿等均有一定疗效；此外，应用EPO还可减少手术中的输血量，并能在一定程度上纠正由恶性肿瘤、化疗及类风湿性关节炎引起的贫血。由于促红细胞生成素主要由肾小管内 皮细胞产生，肾性疾患引起的贫血是促红细胞生成素的首选适应证；EPO纠正肾性贫血的疗效几乎100％，但并不能改善肾功能。促红细胞生成素的治疗安全、有效，适合长期治疗，也能避免血源紧张。在2006年的全球生物技术药市场上，促红细胞生成素类的重组药物占了119亿美元，有巨大的市场容量。
早在1989年，美国FDA就正式批准重组人促红素(EPOGEN)用于肾性贫血的治疗，但直到1992年才在我国上市。我国慢性肾炎的年发病率约为0.25％，其中相当一部分患者最终会转为肾衰，每年的肾性贫血患者约50-60万。根据保守的用药量估算，如果按当前的价格30-40元/支，加上癌症相关性贫血等其他病人的用药，国内市场容量约12-16亿元甚至更大(病人平均体重按50Kg计算)。自20世纪90年代后期，EPO已进入我国重点城市医院畅销药品行列，2003年在全国重点城市样本医院用药金额6213万元，排名第56位。2004年，全国重点城市样本医院购药金额增长到8049万元，同比增长了30％。
促红细胞生成素作为一种作用于骨髓造血细胞，促进红系祖细胞增生、分化，最终成熟的内分泌激素。对机体供氧状况发挥重要的调控作用。在胚胎早期，EPO由肝生成，然后逐渐向肾转移，出生后主要由肾小管间质细胞分泌。
在促红细胞生成素诱导红组细胞分化过程中，球蛋白被诱导，这能使细胞吸收更多的铁合成功能性的血红蛋白，这种功能性的血红蛋白可以和成熟的红血球中的氧结合，因此，红血球和血红蛋白在提供机体氧方面扮演了极其重要的角色。这一过程是由促红细胞生成素与红组细胞的表面受体之间的相互作用引起的。
当人体处于健康状态时，组织可以从已经存在的红血球中吸收足够多的氧，此时体内的促红细胞生成素浓度很低，这种正常的较低的促红细胞生成素浓度完全可以刺激促进由于年龄的问题而正常损失的红细胞。
当循环系统中的依靠红细胞进行氧输送的水平被降低进而出现缺氧情况时，促红细胞生成素在体内的数量将会增加，机体缺氧状态可以由以下原因引起的：过量的辐射、因高纬度或长期昏迷造成的氧摄入量减少、各种类型的贫血等等。作为对组织处于缺氧压力的应答，促 红细胞生成素水平的提高可以刺激红组细胞的分化达到提高红细胞生成的能力。当体内的红细胞的数量大于正常组织的需求时，循环系统中促红细胞生成素的水平被降低。正是由于促红细胞生成素对于红细胞的生成有着至关重要的作用，因此这类激素对于治疗和诊断以红细胞生成低下和缺陷为特征的血液病方面有着很广泛的前景。最近的研究为推测促红细胞生成素疗法在多种疾病、紊乱和血液学异常情况中的效用提供了基础，这些疾病包括：慢性肾衰竭(CRF)患者贫血症的治疗中使用促红细胞生成素和在艾滋病和接受化疗的癌症患者贫血症的治疗中使用EPO(Danna，RP，Rudnick，SA，Abels，RI，于：MB，Garnick编著，临床应用中的促红细胞生成素一国际展望(Erythropoietin inClinical Applications-An International Perspective.Marcel Dekker；1990：p301-324)。
但是当前可获得未被修饰的促红细胞生成素的血浆半衰期短，容易遭受蛋白酶降解，利用率不高，这些缺陷阻止它们取得最大的临床疗效。因此获得长效的促红细胞生成素已经成了各大研究机构及制药企业竞相研发的热点，如已经上市的amgen公司的长效促红细胞生成素产品(aransp)是通过基因工程的手段增加糖基化的位点数目，进而提高糖基化的程度，达到每两周注射一次，改善了促红细胞生成素在体内的半衰期，但是这种产品由于仍然无法避免体内蛋白酶的酶解影响，因此延长体内半衰期的程度有限，并且生产成本较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物学活性更好，生物利用度更高的的聚乙二醇修饰的促红细胞生成素偶联物以及该偶联物的制备方法。
本发明目的还在于提供一种含有该被修饰的促红细胞生成素偶联物的药物组合物，用于治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病。
本发明所公开的一种新的聚乙二醇修饰的促红细胞生成素偶联物，
其结构通式为
P-NH-CH2-X-S-Y-(OCH2CH2)m1-OCH3
所述偶联物是由甲氧基聚乙二醇基团通过式-CH2-X-S-Y-中的-CH2- 基团与促红细胞生成素的氨基形成-NH-CH2-键连接而得到，其中P是指重组人促红细胞生成素，X是-(CH2)k-或-CH2(OCH2CH2)k-，k的数目选自2～10，m1选自100～2000之间的整数，Y选自：
Figure S2007101953118D00041
其中m、n的数目各自独立地选自2～10。
其中重组人促红细胞生成素优选重组人促红细胞生成素α或β，特别是α。促红细胞生成素的制备是通过本领域公开的技术而得到。
在本方案中，其中m，n优选的整数为2。
在本方案中，其中X是-(CH2)k-，k选自2～10。
在本方案中，k的数目优选2～4，进一步优选为2。
在本方案中，甲氧基聚乙二醇基团的平均分子量优选为5,000～40,000道尔顿，进一步优选为为20,000道尔顿。
在本方案中，一个优选实施方案所对应的偶联物的结构式为：
Figure S2007101953118D00042
其中P是指重组人促红细胞生成素，X是-(CH2)k-或 -CH2(OCH2CH2)k-，k的数目选自2～10，m、n的数目选自2～10，m1 选自100～2000之间的整数。
其中X优选为-(CH2)k-，k的数目可进一步优选自2～4，最优选的是2。
进一步优选地，本发明的一个实施方案对应的结构式为：
Figure S2007101953118D00051
m1选自450～600的整数，其中P是指重组人促红细胞生成素，可进一步优选重组人促红细胞生成素α或β，最优选α。
本发明还提供一种如下结构通式的偶联物：
Figure S2007101953118D00052
其中P是指重组人促红细胞生成素糖蛋白，X是-(CH2)k-或-CH2(OCH2CH2)k-，k的数目选自2～10，m的数目选自2～10，m1选自100～2000之间的整数。
进一步优选地，该结构式中P是指重组人促红细胞生成素α；X是-(CH2)k-，其中k是2；m的数目选自2；m1选自450～600的整数。
本发明还提供一种如下结构通式的偶联物：
其中P是指重组人促红细胞生成素，X是-(CH2)k-或-CH2(OCH2CH2)k-，k的数目选自2～10，m的数目选自2～10，m1选自100～2000之间的整数。
进一步优选，该结构式中P是指重组人促红细胞生成素α；X是-(CH2)k-，其中k是2；m的数目选自2；m1选自450～600的整数。
本发明还提供一种如下结构通式的偶联物：
Figure S2007101953118D00061
其中P是指重组人促红细胞生成素，X是-(CH2)k-或-CH2(OCH2CH2)k-，k的数目选自2～10，m1选自100～2000之间的整数。
进一步优选地，该结构式中P是指重组人促红细胞生成素α；X是-(CH2)k-，其中k是2；m1选自450～600的整数。
本发明还提供一种如下结构通式的偶联物：
其中P是指重组人促红细胞生成素，X是-(CH2)k-或-CH2(OCH2CH2)k-，k的数目选自2～10，m1选自100～2000之间的整数。
进一步优选地，该结构通式中P是指重组人促红细胞生成素α；X是-(CH2)k-，其中k是2；m1选自450～600的整数。
本发明还提供一种如下结构通式的偶联物：
Figure S2007101953118D00063
其中P是指重组人促红细胞生成素，X是-(CH2)k-或-CH2(OCH2CH2)k-，k的数目选自2～10，m、n的数目选自2～10，m1 选自100～2000之间的整数。
进一步优选地，该结构式中P是指重组人促红细胞生成素α；X是-(CH2)k-，其中k是2；m、n的数目选自2；m1选自450～600的整数。
本发明所公开的偶联物是促红细胞生成素通过连接体(-CH2-X-S-Y-)与甲氧基聚乙二醇基团共价连接进而被修饰，关键在于促红细胞生成素与连接体以形成-NH2-CH2-键形式而连接，与未被修饰的促红细胞生成素相比，本发明提供的偶联物能够提高血浆的停留时间和循环半衰期，降低清除率，在体内的生物活性更高，并且具有和促红细胞生成素一样的用途。与以形成-NH-CO-键形式的聚乙二醇促 红细胞生成素偶联物相比具有反应位点更单一，质量更可控的优点。本发明提供的聚乙二醇促红细胞生成素偶联物可以被用来治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病。
本发明还公开了上述偶联物的一种制备方法，包括以下步骤：首先是促红细胞生成素和含有已保护巯基的醛类物质发生还原胺化反应，形成通过-NH-CH2-键连接的活化促红细胞生成素，然后，将所述活化促红细胞生成素脱保护，与活性甲氧基聚乙二醇衍生物偶联，通过进一步的分离纯化而得到。
本发明还公开了一种药物组合物，包含：(1)治疗量的上述聚乙二醇化促红细胞生成素偶联物；(2)药学可接受的药物载体。
本发明含有任意的上述治疗量的聚乙二醇化促红细胞生成素偶联物用于治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病。特别是治疗下述疾病：末期肾功能衰竭或透析；AIDS相关性贫血，自身免疫性疾病，或恶性肿瘤；囊性纤维变性；早期早熟性贫血；与慢性炎性疾病相关的贫血；脊髓损伤；急性失血；衰老和伴有异常红细胞产生的肿瘤疾病。
促红细胞生成素的制备
促红细胞生成素的制备方法是通过内源基因激活表达蛋白质的方法，都是本领域公知的技术。其制备及治疗应用详细描述于美国专利US5547933、US5621080和US5955422，EP-B0209539和EP-B0148605和EP-B0209539，以及Huang，S.L.，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1984)2708-2712等。
重组促红细胞生成素的纯化一般使用羟基磷灰石凝胶，离子交换层析，凝胶层析等本领域公知的纯化方法进行纯化，并在美国专利No.5547933、5621080和5955422等专利中均有详细描述；Nobuo，I.等，生物化学杂质(J.Biochem)107(1990)352-359也描述了重组EPO的纯化方法。
聚乙二醇促红细胞生成素偶联物的制备
本发明提供一种制备聚乙二醇促红细胞生成素偶联物的制备方法，其步骤包括：
(1)通过本领域技术人员所公知的技术制备结构通式I的小分子醛化合物，如将硫代乙酸与烯醛类化合物进行迈克尔加成反应：
Figure S2007101953118D00081
其中k的数目选自2～10，优选2；
(2)将结构通式I的小分子醛化合物与促红细胞生成素在缓冲液里反应，并加入还原剂得到结构通式为II的活化促红细胞生成素；
Figure S2007101953118D00082
其中P是指重组人促红细胞生成素α或β，优选重组人促红细胞生成素α，缓冲液的pH选自4.0～6.0，优选6.0，还原剂可以是硼氰化钠、氰基硼氰化钠，优选氰基硼氰化钠；
(3)利用本领域公知的技术在含有活化促红细胞生成素的缓冲液里加入脱保护剂，脱去结构通式为(II)的活化促红细胞生成素的乙酰基保护基，随后加入结构通式为III的活化甲氧基聚乙二醇进行聚乙二醇化反应。
Figure S2007101953118D00083
其中加入的脱保护剂优选羟胺；缓冲体系的pH选自5.0～7.0，优选pH6.2；AG选自：
Figure S2007101953118D00091
其中m、n的数目选自2～10，优选2；
(4)聚乙二醇促红细胞生成素偶联物的纯化方法采用本领域技术人员公知的技术，如离子交换层析、凝胶层析。
生物学活性的测试
通过本领域公知的各种测试可以测定促红细胞生成素或本发明提.供的聚乙二醇促红细胞生成素偶联物的生物学活性。体内活性的测试通过小鼠皮下注射促红细胞生成素及本发明提供的聚乙二醇促红细胞生成素偶联物，连续三天，然后处死小鼠，取全血进行外周血细胞及网织红细胞计数，血细胞计数采用全自动血球计数仪计数。对猕猴静脉注射进行药效学研究，单次给药剂量1.35mg/kg，作为对比药物使用的促红细胞生成素给药剂量为240μ/kg，每周三次，连续给药六周，采集血样进行相关血液学指标分析。
通过对本发明提供的聚乙二醇促红细胞生成素偶联物的测试数据表明：本发明提供的聚乙二醇促红细胞生成素偶联物能够明显刺激小鼠外周血网织红细胞计数的升高，说明它们刺激红细胞生成，同时还能够大大延长偶联物在体内的半衰期。聚乙二醇促红细胞生成素偶联物对成熟的红细胞、血细胞压积、血红蛋白含量没有明显的影响，对外周血白细胞计数液没有明显影响。
药物组合物的制备
可以通过本领域公知的方法用药学可接受载体或赋形剂制成适合注射的药物组合物。用于配制本发明的产物的优选的药学可接受载体是人血清白蛋白，人血浆蛋白质等。本发明的化合物可以在含有132mm氯化钠的10mM磷酸钠/钾缓冲液pH7中配制。任选地，药物组合物可以含有防腐剂。药物组合物可以含有不同量的促红细胞生成素，优选10-1000微克/毫升。
具体实施方式：
实施例1：乙酰基巯基丙醛的制备
Figure 725715DEST_PATH_G200710195311801D00011
将11.2g(20mmol)丙烯醛与干燥的100ml THF加入到反应瓶中，冷却至0℃，然后缓慢滴加1.52g(0.2mol)硫代乙酸/20ml THF的混合溶液。滴加完毕保温反应2小时后。35℃减压浓缩除去过量的丙烯醛。然后快速上柱(洗脱液纯正己烷→正己烷/乙酸乙酯＝50/1)，合并收集产物点，减压浓缩至干得油状液体0.6g。
实施例2：mPEG-MAL-01(20kD)的制备
Figure DEST_PATH_RE-S2007101953118D00111
将20g(1mmol)mPEG-OH(20kD)投入到200ml的单口瓶中，加入100ml甲苯，回流分水反应2.5hr；然后蒸出甲苯，冷却至室温，再加入100mlDCM，随后加入1.18g(4mmol)的三光气(triphosgene)，室温密闭搅拌反应过夜；次日处理：将反应液于通风厨中冲析入200ml的无水乙醚中，过滤后真空干燥得白色固体15g。将15g上步白色固体投入到200ml的单口瓶中，加入100ml Toluene/DCM(2∶1)的溶液，再加入0.25g的HOSu，随后加入0.3g三乙胺，室温密闭搅拌反应4hr(或过夜)；反应结束后，将反应液过滤，滤液直接冲析入100ml的无水乙醚中，过滤，真空干燥得白色固体14g，即为SC-mPEG(20kD)；
将1.4g无水乙二胺用50ml DCM于200ml反应瓶中溶解，再取14gSC-mPEG(20kD)溶解于100ml的DCM溶解后加入到上述乙二胺溶液中，反应过夜；次日停止反应过滤，滤液加入500ml的饱和食盐水洗涤，分出有机层，水层用DCM提取三次(200ml×3)，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至100ml，于500ml无水乙醚中沉降析出固体，过滤，真空干燥得白色固体13g，即为mPEG-NHCH2CH2NH2(20kD)；
将1.9g的MAL-ONP用50mL DCM溶解，加入0.04g的三乙胺，再将13g的mPEG-NHCH2CH2NH2(20kD)用100ml的新开的DCM溶解，然后加入上述MAL-ONP的DCM溶液中，室温反应过夜；次日减压浓缩出DCM，残余物加入200ml的无水乙醚中，沉降析出固体，真空干燥得白色固体12.5g，即为mPEG-MAL-01(20kD)。
实施例3：mPEG-MAL-02(20kD)的制备
Figure DEST_PATH_RE-S2007101953118D00121
将2.0g的MAL-ONP用50mL DCM溶解，加入0.05g的三乙胺，再将15g的mPEG-NH2(20kD)用100ml的新开的DCM溶解，然后加入上述MAL-ONP的DCM溶液中，室温反应过夜；次日减压浓缩出DCM，残余物加入200ml的无水乙醚中，沉降析出固体，真空干燥得白色固体13g，即为mPEG-MAL-02(20kD)。
实施例4：mPEG-OPPS-01(20kD)的制备
Figure DEST_PATH_RE-S2007101953118D00122
将0.5g MPPS用50mlDCM溶解，随后加入0.05g三乙胺和20gmPEG-NH2(20kD)，室温搅拌反应过夜，次日减压浓缩出DCM，残余物加入200ml的无水乙醚，析出固体，过滤，真空干燥得白色固体19g，即为mPEG-OPPS-01(20kD)。
实施例5：mPEG-OPPS-02(20kD)的制备
Figure DEST_PATH_RE-S2007101953118D00131
将0.5g MPPS用50mlDCM溶解，随后加入0.05g三乙胺和20gmPEG-NHCH2CH2NH2(20kD)，室温搅拌反应过夜，次日减压浓缩出DCM，残余物加入200ml的无水乙醚，析出固体，过滤，真空干燥得白色固体18.5g，即为mPEG-OPPS-02(20kD)。
实施例6：活化促红细胞生成素的制备
取促红细胞生成素原液60毫克，蛋白浓度为1.5毫克/毫升，共40毫升，体系为0.1M磷酸钠盐缓冲液，pH6.0；取2.5毫克乙酰基巯基丙醛溶于80微升乙腈后加入以上蛋白溶液；再称取50毫克氰基硼氢化钠加入上述反应液，并慢速搅拌反应，冰浴控制反应温度在10℃，反应24小时；然后将反应液转入透析袋(截留分子量3500)，对0.1M磷酸钠盐缓冲液，含2mM EDTA，pH6.25进行透析，以除掉过量的小分子醛，然后再加入羟胺脱去乙酰基，得活化促红细胞生成素。
实施例7：HH-EPO-014A的制备
通过实施例6得到的10mg活化促红细胞生成素(1.4毫克/毫升， 0.1M磷酸钠盐缓冲液，含2mM EDTA，pH6.25)，加入100毫克mPEG-MAL-01(20kD)。搅拌反应60分钟；再加入N-甲基马来酰亚胺至浓度为5mM，室温反应30分钟，以反应掉蛋白上剩余的巯基；然后将反应液透析至20mM乙酸-乙酸盐缓冲液体系。
反应液的纯化依次使用离子交换层析(SP Sepharose H.P)和凝胶层析(Superdex 200)，即可得到聚乙二醇化促红细胞生成素(HH-EPO-014A)，约5mg。
实施例8：HH-EPO-014B的制备
通过实施例6得到的含有游离巯基的10mg活化促红细胞生成素(1.4毫克/毫升，0.1M磷酸钠盐缓冲液，含2mM EDTA，pH6.25)，加入100毫克mPEG-MAL-02(20kD)。搅拌反应60分钟(25℃)；再加入N-甲基马来酰亚胺至浓度为5mM，室温反应30分钟，以反应掉蛋白上剩余的巯基；然后将反应液透析至20mM乙酸-乙酸盐缓冲液体系。
反应液的纯化依次使用离子交换层析(SP Sepharose H.P)和凝胶层析(Superdex 200)，即可得到聚乙二醇化促红细胞生成素(HH-EPO-014B)，约5.5mg。
实施例9：HH-EPO-014C的制备
向实施例6得到的10mg活化促红细胞生成素(1.4毫克/毫升，0.1M磷酸钠盐缓冲液，含2mM EDTA，pH6.25)溶液中加入100毫克mPEG-MAL(20KD)，搅拌反应60分钟(25℃)，再加入N-甲基马来酰亚胺至浓度为5mM，室温反应30分钟，以反应掉蛋白上剩余的巯基；然后将反应液透析至20mM乙酸-乙酸盐缓冲液体系。
反应液的纯化依次使用离子交换层析(SP Sepharose H.P)和凝胶层析(Superdex 200)，即可得到聚乙二醇化促红细胞生成素(HH-EPO-014C)，约6.2mg。
实施例10：HH-EPO-014D的制备
向实施例6得到的10mg活化促红细胞生成素(1.4毫克/毫升，0.1M磷酸钠盐缓冲液，含2mM EDTA，pH6.25)溶液中加入100毫克 mPEG-OPPS(20KD)，搅拌反应60分钟(25℃)，再加入N-甲基马来酰亚胺至浓度为5mM，室温反应30分钟，以反应掉蛋白上剩余的巯基；然后将反应液透析至20mM乙酸-乙酸盐缓冲液体系。
反应液的纯化依次使用离子交换层析(SP Sepharose H.P)和凝胶层析(Superdex 200)，即可得到聚乙二醇化促红细胞生成素(HH-EPO-014D)，约6.0mg。
实施例11：HH-EPO-014E的制备
向实施例6得到的10mg活化促红细胞生成素(1.4毫克/毫升，0.1M磷酸钠盐缓冲液，含2mM EDTA，pH6.25)溶液中加入100毫克mPEG-OPPS-01(20KD)，搅拌反应60分钟(25℃)，再加入N-甲基马来酰亚胺至浓度为5mM，室温反应30分钟，以反应掉蛋白上剩余的巯基；然后将反应液透析至20mM乙酸-乙酸盐缓冲液体系。
反应液的纯化依次使用离子交换层析(SP Sepharose H.P)和凝胶层析(Superdex 200)，即可得到聚乙二醇化促红细胞生成素(HH-EPO-014E)，约5.6mg。
实施例12：HH-EPO-014F的制备
向实施例6得到的10mg活化促红细胞生成素(1.4毫克/毫升，0.1M磷酸钠盐缓冲液，含2mM EDTA，pH6.25)溶液中加入100毫克mPEG-OPPS-02(20KD)，搅拌反应60分钟(25℃)，再加入N-甲基马来酰亚胺至浓度为5mM，室温反应30分钟，以反应掉蛋白上剩余的巯基；然后将反应液透析至20mM乙酸-乙酸盐缓冲液体系。
反应液的纯化依次使用离子交换层析(SP Sepharose H.P)和凝胶层析(Superdex 200)，即可得到聚乙二醇化促红细胞生成素(HH-EPO-014F)，约5.6mg。
实验例
实验例1：聚乙二醇促红细胞生成素偶联物对小鼠的作用
实验目的：
评价并比较聚乙二醇促红细胞生成素偶联物及促红细胞生成素蛋 白对小鼠红细胞生成的影响。
材料及方法：
聚乙二醇促红细胞生成素偶联物HH-EPO-014A、HH-EPO-014B、HH-EPO-014C、HH-EPO-014D、HH-EPO-014E、HH-EPO-014F由江苏豪森药业股份有限公司提供；促红细胞生成素(阳性对照)：购自沈阳三生制药有限责任公司；昆明种小鼠，购自中科院上海实验动物中心，体重25～30g，♀，各组动物数：10只。
小鼠皮下注射聚乙二醇促红细胞生成素偶联物及促红细胞生成素，连续三天，然后处死小鼠，取全血进行外周血细胞及网织红细胞计数，血细胞计数用全自动血球计数仪计数。
结果与讨论：
按照目前的给药方案，聚乙二醇促红细胞生成素偶联物及促红细胞生成素均能明显刺激小鼠外周血网织红细胞计数的升高，说明它们刺激红细胞生成(见表一)。聚乙二醇促红细胞生成素偶联物对成熟的红细胞、血细胞压积、血红蛋白含量没有明显的影响(见表二)，对外周血白细胞计数液没有明显影响(见表三)。
表一、聚乙二醇促红细胞生成素偶联物对小鼠网织红细胞生成的影响
  分组   小鼠  (只)   给药剂量和方案   网织红细胞计数  (×109/L，x±SD)
  control  HH-EPO-014A  HH-EPO-014B  HH-EPO-014C  HH-EPO-014D  HH-EPO-014E  HH-EPO-014F   10  10  10  10  10  10  10   0.1％BSA in NS  5μg/kg，sc，d1-3  5μg/kg，sc，d1-3  5μg/kg，sc，d1-3  5μg/kg，sc，d1-3  5μg/kg，sc，d1-3  5μg/kg，sc，d1-3   177.6±55.2  826.1±25.1  810.2±58.3  765.3±67.5  652.1±81.3  647.5±24.1  586.0±32.4
  EPO   10   5μg/kg，sc，d1-3   360.6±27.0
表二、聚乙二醇促红细胞生成素偶联物对小鼠红细胞生成、血细胞压积、血红蛋白含量的影响
  分组   小鼠  (只)   给药剂量和方案   红细胞计数  (×106/μL，x  ±SD)   血细胞压积  (％)   血红蛋白  (％)
  control  HH-EPO-014A  HH-EPO-014B  HH-EPO-014C  HH-EPO-014D  HH-EPO-014E  HH-EPO-014F   10  10  10  10  10  10  10   0.1％BSA in NS  5μg/kg，sc，d1-3  5μg/kg，sc，d1-3  5μg/kg，sc，d1-3  5μg/kg，sc，d1-3  5μg/kg，sc，d1-3  5μg/kg，sc，d1-3   9.6±0.5  9.9±0.4  9.3±0.1  9.6±0.3  9.7±0.1  9.1±0.5  9.2±0.6   48.2±3.0  52.1±1.6  53.0±1.5  53.2±1.4  50.0±1.9  55.4±1.2  56.5±1.8   14.8±0.7  15.7±0.6  15.7±0.7  15.1±0.5  14.7±0.7  16.5±0.9  16.3±0.7
  EPO   10   5μg/kg，sc，d1-3   9.0±0.6   46.2±2.7   14.3±0.7
表三、聚乙二醇促红细胞生成素偶联物对小鼠血小板、白细胞生成的影响
  分组   小鼠  (只)   给药剂量和方案   血小板(×103/μL)  白细胞(×103/μL)
  control  HH-EPO-014A  HH-EPO-014B  HH-EPO-014C  HH-EPO-014D  HH-EPO-014E  HH-EPO-014F   10  10  10  10  10  10  10   0.1％BSA in NS  5μg/kg，sc，d1-3  5μg/kg，sc，d1-3  5μg/kg，sc，d1-3  5μg/kg，sc，d1-3  5μg/kg，sc，d1-3  5μg/kg，sc，d1-3   1078.0±151.2  1372.5±135  1350.8±327  1207±237  1325±223  1457.6±247.6  1186.8±218.6   5.1±1.5  4.2±1.5  4.2±1.1  5.0±2.2  5.5±1.2  4.2±1.2  4.1±1.2
  EPO   10   5μg/kg，sc，d1-3   1306.8±170.   4.0±0.9
实验例2：聚乙二醇促红细胞生成素偶联物对猕猴的作用
实验目的：
评价聚乙二醇促红细胞生成素偶联物对猕猴红细胞生成的影响
材料及方法：
聚乙二醇促红细胞生成素偶联物HH-EPO-014A，由江苏豪森药业股份有限公司提供；促红细胞生成素(阳性对照)：购自沈阳三生制药有限责任公司。使用前以含0.1％BSA的生理盐水稀释。
猕猴，体重5.5～8.5kg，雌雄不限，购自苏州西山中科实验动物中心。猕猴根据基础血红蛋白分组，每组三只。HH-EPO-014A，1.35mg/kg，静脉注射一次；EPO 240μ/kg，三次/周，连续给药6周，每周测1～2次血液学指标
结果及讨论：
用HH-EPO-014A单次静脉注射导致猕猴外周血血红蛋白含量上升，血细胞压积升高，说明HH-EPO-014A刺激血红蛋白生成，该刺激作用在给药35天后达到顶峰，随后缓慢下降，对血红蛋白的刺激作用大约为33％。阳性对照促红细胞生成素同样升高猕猴外周血血红蛋白含量，升高血细胞压积，其作用在停药后缓慢减弱。按照目前的给药方案，单次静脉注射HH-EPO-014A和多次连续静脉注射促红细胞生成素对猕猴血红蛋白生成的刺激作用相当。

Claims (31)

1.一种聚乙二醇化促红细胞生成素偶联物，其结构通式为
P-NH-CH2-X-S-Y-(OCH2CH2)m1-OCH3
所述偶联物是由甲氧基聚乙二醇基团通过式-CH2-X-S-Y-中的-CH2-基团与促红细胞生成素的氨基形成-NH-CH2-键连接而得到，其中P是指重组人促红细胞生成素，X是-(CH2)k-或-CH2(OCH2CH2)k-，k的数目选自2～10，m1选自100～2000之间的整数，Y选自：
Figure FSB00000411267000011
其中m、n的数目各自独立地选自2～10。
2.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于所述重组人促红细胞生成素是重组人促红细胞生成素α或β。
3.根据权利要求2所述的偶联物，其特征在于所述重组人促红细胞生成素是重组人促红细胞生成素α。
4.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于m＝2，n＝2。
5.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于X是-(CH2)k-，k选自2～10。
6.根据权利要求5所述的偶联物，其特征在于k选自2～4。
7.根据权利要求6所述的偶联物，其特征在于k为2。
8.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于所述甲氧基聚乙二醇基团的平均分子量为5,000～40,000道尔顿。
9.根据权利要求8所述的偶联物，其特征在于甲氧基聚乙二醇基团的平均分子量为20,000道尔顿。
10.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于偶联物的结构式为：
Figure FSB00000411267000021
其中P是指重组人促红细胞生成素，X是-(CH2)k-或-CH2(OCH2CH2)k-，k的数目选自2～10，m、n选自2～10，m1选自100～2000之间的整数。
11.根据权利要求10所述的偶联物，其特征在于X是-(CH2)k-。
12.根据权利要求10所述的偶联物，其特征在于k选自2～4。
13.根据权利要求12所述的偶联物，其特征在于k为2。
14.根据权利要求10所述的偶联物，其特征在于偶联物的结构式
Figure FSB00000411267000022
其中m1选自450～600的整数。
15.根据权利要求10所述的偶联物，其特征在于所述重组人促红细胞生成素是重组人促红细胞生成素α或β。
16.根据权利要求15所述的偶联物，其特征在于所述重组人促红细胞生成素是重组人促红细胞生成素α。
17.根据权利要求1所述的偶联物，其结构式为：
Figure FSB00000411267000031
其中P是指重组人促红细胞生成素，X是-(CH2)k-或-CH2(OCH2CH2)k-，k的数目选自2～10，m选自2～10，m1选自100～2000之间的整数。
18.根据权利要求17所述的偶联物，其特征在于P是指重组人促红细胞生成素α其中k是2；m为2；m1为选自450～600的整数。
19.根据权利要求1所述的偶联物，其结构式为：
Figure FSB00000411267000032
其中P是指重组人促红细胞生成素，X是-(CH2)k-或-CH2(OCH2CH2)k-，k选自2～10，m选自2～10，m1选自100～2000之间的整数。
20.根据权利要求19所述的偶联物，其特征在于P是指重组人促红细胞生成素α；X是-(CH2)2-；m为2；m1选自450～600的整数。
21.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于偶联物的结构式为：
其中P是指重组人促红细胞生成素，X是-(CH2)k-或-CH2(OCH2CH2)k-，k选自2～10，m1选自100～2000之间的整数。
22.根据权利要求21所述的偶联物，其特征在于P是指重组人促红细胞生成素α；X是-(CH2)2-；m1选自450～600的整数。
23.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于偶联物的结构式为：
Figure FSB00000411267000042
其中P是指重组人促红细胞生成素，X是-(CH2)k-或-CH2(OCH2CH2)k-，k的数目选自2～10；m选自2～10；m1选自100～2000之间的整数。
24.根据权利要求23所述的偶联物，其特征在于P是指重组人促红细胞生成素α；X是-(CH2)2-；m为2，m1选自450～600的整数。
25.根据权利要求1所述的偶联物，其结构式为：
Figure FSB00000411267000043
其中P是指重组人促红细胞生成素，X是-(CH2)k-或-CH2(OCH2CH2)k-，k的数目选自2～10，m、n选自2～10，m1选自100～2000之间的整数。
26.根据权利要求25所述的偶联物，其特征在于P是指重组人促红细胞生成素α；X是-(CH2)2-；m、n选自2；m1选自450～600的整数。
27.一种制备权利要求1～26任一项所述偶联物的方法，包括以下步骤：
(1)促红细胞生成素和含有已保护巯基的醛类物质发生还原胺化反应，形成通过-NH-CH2-键连接的活化促红细胞生成素；
(2)所述活化促红细胞生成素脱保护，与活性甲氧基聚乙二醇衍生物偶联。
28.一种药物组合物，包含：
(1)治疗量的如权利要求1-26任意一项所述的聚乙二醇化促红细胞生成素偶联物，和
(2)药学可接受的药物载体。
29.根据权利要求1-26任一项所述的聚乙二醇化促红细胞生成素偶联物在制备用于治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病的药物中的用途。
30.根据权利要求29所述的用途，其特征在于缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病是末期肾功能衰竭或透析；AIDS相关性贫血，自身免疫性疾病，或恶性肿瘤；囊性纤维变性；早期早熟性贫血；与慢性炎性疾病相关的贫血；脊髓损伤；急性失血；和衰老。
31.根据权利要求30所述的用途，其特征在于所述恶性肿瘤是伴有异常红细胞产生的肿瘤。
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