CN101703760A

CN101703760A - 用于预防和治疗贫血的方法以及组合物

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Publication number: CN101703760A
Application number: CN200910151885A
Authority: CN
Inventors: J·C·埃格里; S·G·埃利奥特; J·K·布朗
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1998-10-23
Filing date: 1999-10-18
Publication date: 2010-05-12
Also published as: PT1123313E; JP5558213B2; CN1346369A; DE69935345T2; ES2283139T3; TWI234583B; CA2345882A1; JP2010248207A; ES2283139T5; ATE477270T1; EP1123313B2; HUP0103920A3; ATE355303T1; IL142334A; JP2002528465A; EP1813624A1; HUP0103920A2; CN1346369B; DE69935345T3; ES2347884T3

Abstract

本发明涉及用于预防和治疗贫血的方法以及组合物。具体地说，本发明公开了提高以及维持哺乳动物血细胞比容的方法，该方法包括给予高糖基化红细胞生成素类似物。为了获得相当的目标血细胞比容并治疗贫血，给予类似物的频度低于给予等摩尔量的重组人红细胞生成素的频度。或者给予较低摩尔量高糖基化类似物就可获得相当的目标血细胞比容并治疗贫血。本发明还公开了新的高糖基化红细胞生成素类似物、生产该类似物的方法以及包含该类似物的组合物。

Description

用于预防和治疗贫血的方法以及组合物

本申请是申请日为1999年10月18日，申请号为99814697.8，发明名称为“用于预防和治疗贫血的方法以及组合物”的发明专利申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及应用高糖基化红细胞生成素类似物提高哺乳动物血细胞比容。更具体地说，本发明涉及较低频度给予高糖基化类似物(与重组人红细胞生成素相比)以提高以及维持血细胞比容并治疗贫血。本发明还涉及以相同给药频率给予较低剂量高糖基化类似物(与重组人红细胞生成素相比)以提高以及维持血细胞比容并治疗贫血。还提供新的高糖基化红细胞生成素类似物。

发明背景

红细胞生成素(Epo)是红细胞类祖细胞成熟为红细胞必需的糖蛋白激素。它在肾脏产生，主要调节循环红细胞水平。特征为低水平组织氧体征的情况增加Epo产生，它再刺激红细胞生成。例如见于慢性肾功能衰竭(CRF)的肾功能障碍通常导致Epo产生减少，同时红细胞减少。

Miyake等(J.Biol.Chem.252，5558(1977))从再生障碍性贫血患者纯化人尿Epo。但是，从该来源获得的纯化Epo蛋白量不足以进行治疗应用。Lin在美国专利第4,703,008号中公开了鉴定以及克隆编码人Epo的基因以及表达重组蛋白，该专利公开内容通过引用结合到本文中。Lai等在美国专利第4,667,016号中公开了从细胞培养基纯化重组人红细胞生成素的方法，将其通过引用结合到本文中。已由哺乳动物宿主细胞产生生物活性Epo，首次获得适合治疗用途的Epo量。此外，对所述基因序列的了解以及纯化蛋白的生物利用度提高使得可以更好地了解该蛋白的作用模式。

人尿来源的Epo(Miyake等，同上)和在哺乳动物细胞中表达的重组人Epo均含有3个N-联和1个O-联寡糖链，它们一起约占所述糖蛋白总分子量的40％。N-联糖基化发生于位于位置24、38和83的天冬酰胺残基，而O-联糖基化发生于位于位置126的丝氨酸残基(Lai等，J.Biol.Chem.261，3116(1986)；Broudy等，Arch.Biochem.Biophys.265，329(1988))。已经证实所述寡糖链在末端被唾液酸残基修饰，通常N-联链最高每链可含有4个唾液酸，而O-联链最高可含有2个唾液酸。所以Epo多肽最高总共可以接纳14个唾液酸。

各种研究已经表明，改变Epo糖链可影响生物活性。然而在一个研究中，单独去除N-联或O-联寡糖链或者通过诱变为糖基化位点的天冬酰胺或丝氨酸残基一起去除N-联或O-联寡糖链明显降低在哺乳动物细胞中产生的改变的Epo的体外活性(Dube等，J.Biol.Chem.263，17516(1988))。然而，DeLorme等(Biochemistry 31，9871-9876(1992))报道去除Epo N-链糖基化位点降低体内生物活性而不是体外生物活性。

通过测定分离的Epo同种型的体内活性可揭示Epo唾液酸含量和其体内生物活性的关系.以等摩尔浓度的分离的Epo同种型提高正常小鼠的血细胞比容的能力测定，发现每个Epo分子的唾液酸含量逐渐提高导致相应的Epo体内生物活性逐渐提高(Egrie等，Glycoconjugate J.10，263(1993))。此外，具有较高唾液酸含量的Epo同种型的血清半衰期更长，但是与Epo受体的亲和力降低，提示血清半衰期是体内生物活性的重要决定因素。

在Epo多肽中导入新的糖基化位点可产生具有额外糖链的分子。参见PCT公开号WO91/05867和WO94/09257，将其通过引用全部结合到本文中。公开了具有至少一个额外N-联糖链和/或具有至少一个额外O-联糖链的Epo糖基化类似物。测定发现，与重组人Epo(rHuEpo)(同种型9-14)和每个分子含有14个唾液酸的纯化同种型rHuEpo相比，含有一个额外N-联链的糖基化类似物的循环半衰期更长。

给予重组人红细胞生成素(rHuEpo)可有效提高终末期肾病贫血患者的红细胞水平(Eschbach等，New Eng.J.Med.316，73-38(1987))。随后的研究表明，用rHuEpo治疗可校正与各种其它疾病有关的贫血。(Fischl等，New Eng.J.Med.322，1488-1493(1990))；Laupacis，Lancet341，1228-1232(1993)。有关条例已经批准rHuEpo用于治疗CRF伴随的贫血、HIV感染患者采用AZT(齐多夫定)治疗引起的贫血、接受化疗的非骨髓性恶性肿瘤患者的贫血以及外科手术患者的贫血，从而减少对同种异体输血的需要。对所有批准适应症(除了外科适应症)的现有疗法包括初始给药剂量为50-150单位/kg，静脉(IV)或皮下(SC)注射，每周3次(TIW)，以达到所提出的目标血细胞比容范围。对于外科适应症，手术前10天、手术当天以及手术后4天每天给予rHuEpo(EPOGEN

Package Insert，12/23/96)。一般来说，目前的rHuEpo推荐起始剂量在约6-8周内使血细胞比容升高到目标范围。达到目标血细胞比容范围后确立维持剂量方案，维持剂量方案随患者而不同，但是CRF贫血患者通常为每周3次。上述给予rHuEpo是治疗贫血的有效而且患者耐受性良好的方案。

最好是有比rHuEpo效力更强的治疗药物。这种分子的优势应该是给药频率和/或剂量更低。贫血患者的现有治疗方法需要每周给予EPOGEN

3次，而外科患者需要每天给药一次。较低给药频度的治疗方案对医生和患者均更方便，尤其是对不能按规定方案到医生办事处或诊所看病的患者或自我注射Epo的患者尤为方便。更有效分子的另一个好处是使较少的药物进入患者体内就可达到相当的血细胞比容的升高。

所以本发明目的之一是鉴定更有效的治疗贫血的分子，它可提供给药频度较低的方案。本发明再一目的是提供当给予较低剂量时可以提高并维持至少与Epo相当的血细胞比容水平的分子。本发明再一目的是所选定的给药频率更小的这些分子的耐受性至少与rHuEpo一样好，甚至在某些患者的耐受性可能更好。

发明概述

已发现当给药剂量和频率与rHuEpo相同时，称为N47(Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Epo)的高糖基化Epo类似物的血清半衰期较重组人红细胞生成素(rHuEpo)更长，而且其体内活性更高。此外，已经证实该类似物在小鼠以每周给予1次与每周给予3次rHuEpo升高的血细胞比容相同。在小鼠和人类给予Epo类似物N47的药代动力学相似。

本发明提供升高并维持哺乳动物血细胞比容的方法，包括给予有效治疗量的Epo高糖基化类似物的药用组合物，其中所述类似物比获得相当目标水平的血细胞比容的等摩尔量rHuEpo的给药频率更低.为了达到患者的最佳血细胞比容范围，本发明的给药频率低于每周3次.给药频率可以为每周2次，每周1次，或低于每周1次，例如每隔1周1次，每月1次或每两个月1次.维持患者目标血细胞比容需要的给药频率低于每周3次.给药频率可以为每周2次，每周1次，或低于每周1次，例如每隔1周1次，每月1次或每两个月1次.

本发明还提供升高并维持哺乳动物血细胞比容的方法，包括给予有效治疗量的Epo高糖基化类似物，其中给予所述类似物的摩尔量低于获得相当目标血细胞比容的rHuEpo的摩尔量。

还提供包含Epo高糖基化类似物的药用组合物，其中所述组合物的合适给药频率低于每周3次。所述组合物将包括适合同Epo高糖基化类似物一同使用的药学上可接受的辅助剂。

本发明可适用于导致红细胞水平降低的任何病症，例如肾功能降低或丧失(慢性肾功能衰竭)、骨髓抑制性疗法、癌症、病毒性感染、慢性疾病和手术过程中过量失血伴随的贫血。在一个实施方案中，采用每周给药一次或更低给药频率的治疗用于慢性肾功能衰竭引起的贫血。

还提供新的Epo高糖基化类似物。与rHuEpo相比，该类似物至少包含一个额外糖链，其中在位置52、53、55、86和114中的任何位置至少加入一个N-联糖链。新的高糖基化类似物可以含有2、3或4个额外的糖链，或者可以含有4个以上的额外糖链。

附图说明

图1表示人红细胞生成素的氨基酸序列。

图2图示rHuEpo和CHO细胞表达在不含血清的培养基中的Epo高糖基化类似物的蛋白质印迹分析。实施例1描述类似物N53和N61的构建。标示出每个类似物上的N-联糖链数量。

图3根据小鼠低氧性红细胞增多的生物测定(exhypoxicpolycythemic mouse bioassay)比较rHuEPo、Epo类似物N4、N18和N50(含有4个N-联糖链)、N47(含有5个N-联糖链)和N53(含有6个N-联糖链)的活性。在实施例3中描述实验方法。每个点代表5只动物的平均反应。以前在WO94/09257中描述了类似物N4、N18和N47。

图4比较通过静脉注射(IV)给予正常大鼠的rHuEpo和Epo类似物N47的血清半衰期。在实施例4中描述实验方法。结果为每组的平均值(±SD)。

图5比较通过静脉注射(IV)给予小猎犬的rHuEpo和Epo类似物N47的血清半衰期。在实施例4中描述实验方法。结果为每组的平均值(±SD)。

图6图示在小鼠对每周腹膜内注射(IP)3次(TIW)不同剂量的rHuEpo或Epo类似物N47，连续6周的反应中血细胞比容的增加。在实施例5中描述实验方法。所示结果为每个剂量组血细胞比容变化的各组平均值(±SD)。

图7比较rHuEpo和Epo类似物N47在小鼠中的相对效力，其中rHuEpo和Epo类似物N47以每周一次(QW)或每周三次(TIW)的频率通过腹膜内(IP)或静脉内(IV)途径给予。在实施例5中描述实验方法。每个点代表以下不同实验数据的平均值(±SD)：N47，IP，TIW(n＝5)；N47，IV，TIW(n＝1)；N47，IP，QW(n＝2)；N47，IV，QW(n＝3)，rHuEpo，IP，TIW(n＝5)；rHuEpo，IV，QW(n＝2)。每个实验每个剂量使用7-13只小鼠。

图8图示在小鼠对每周静脉内注射(IV)1次(QW)不同剂量的rHuEpo或Epo类似物N47，连续约6周的反应中血细胞比容的增加。在实施例5中描述实验方法。所示结果为每个剂量组血细胞比容变化的各组平均值(±SD)。

图9图示在小鼠对每周静脉内注射(IV)1次(QW)或每隔一周一次(EOW)不同剂量的rHuEpo或Epo类似物N47，连续约6周的反应中血细胞比容的增加。在实施例5中描述实验方法。所示结果为每个剂量组血细胞比容变化的各组平均值(±SD)。

本发明详述

本发明提供升高并维持血细胞比容的方法，包括给予治疗有效量的高糖基化红细胞生成素类似物的药用组合物。所述类似物的给药频率低于获得相当的目标血细胞比容的等摩尔量rHuEpo的给药频率。本发明还提供升高并维持血细胞比容的方法，包括以低于获得相当目标血细胞比容的rHuEpo量的摩尔量给予高糖基化类似物。所述组合物可通过静脉、皮下或腹膜内途径给药。

令人惊奇的是，发现每周给予一次类似物N47的血细胞比容增加与每周给予三次rHuEpo观测到的血细胞比容增加相当，类似物N47是在WO94/09257中描述的高糖基化Epo类似物。类似物N47的氨基酸变化如下：30的ala变为asn；32的his变为thr；87的pro变为val；88的trp变为asn以及90的pro变为thr，导致在天冬酰胺残基30和88加入2个N-联糖链。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达所述类似物(见实施例1所述)并按实施例2所述纯化，获得含有17-22个唾液酸的同种型。当静脉注射时(图4和5)，类似物N47在大鼠和小猎犬的血清半衰期比rHuEpo长。当每周腹膜内注射3次时，较低浓度的N47使正常小鼠的血细胞比容增加程度与rHuEpo相当(图6)。证实当每周给予三次时N47的效力比rHuEpo高约3-4倍(图6和7)。当每周给予一次时，相似剂量的rHuEpo对正常小鼠的血细胞比容的刺激作用几乎没有，而N47明显升高正常小鼠血细胞比容(图8)。每周给予一次时N47的效力比rHuEpo高约14倍(图7)。重要的是，每周给予一次类似物N47的血细胞比容反应与每周给予三次rHuEpo的反应相似。甚至当每隔一周给予一次时，N47仍然使正常小鼠的血细胞比容明显增加(图9)。总而言之，所述数据表明，可通过使用比现有rHuEpo疗法更低的给药频率，优选应用Epo高糖基化类似物尤其是类似物N47提高血细胞比容。

此外，还表明可把在小鼠获得的上述结果外推到人类。给予rHuEpo和类似物N4711个的连续性非卧床腹膜透析(CAPD)患者的药代动力学参数证实，类似物N47的血清半衰期比rHuEpo长3倍(实施例6和表5)。这些结果提示，Epo高糖基化类似物在人类的给药频率比rHuEpo低。

本文使用的术语“高糖基化Epo类似物”是指包含至少一个额外糖基化位点和加入所述位点的一个额外糖链的Epo。糖基化位点可用于N-联糖链或O-联糖链。通过改变DNA序列导入新的N-联糖基化位点，以编码在所述多肽链中加入的N-联糖的共有位点(氨基酸Asn-X-Ser/Thr)，同时通过改变DNA序列导入新的O-联位点，以编码丝氨酸或苏氨酸残基。为了导入增加或改变可糖基化的Epo多肽位点的添加、缺失或替代氨基酸残基，通过诱变技术构建所述类似物。将编码Epo高糖基化类似物的DNA转染入真核宿主细胞中，分析所表达的糖蛋白中存在的额外糖链。

已经证实Epo高糖基化类似物的体外活性与所测定的rHuEpo的活性相当甚至更低，说明与Epo受体的结合并没有增强，而且在某些情况下因为加入糖链而可能降低.然而，高糖基化通常可以提高血清半衰期，从而潜在性导致体内生物活性升高.与rHuEpo(同种型9-14)或每个分子含有14个唾液酸的纯化的同种型rHuEpo相比，在位置88含有一个额外N-联糖链的一种Epo类似物与受体的亲和力的降低，该类物还显示，与Epo同种型9-14混合物或分离的Epo同种型14相比，循环半衰期更长以及体内活性增强.

可按照本发明给予的Epo高糖基化类似物至少含有一个额外N-联或O-联糖链。在一个实施方案中，所述类似物含有两个额外N-联糖链。在其它实施方案中，所述类似物含有3、4或更多个额外N-联糖链。例如本发明类似物在人Epo序列的氨基酸残基数30、51、57、69、88、89、136和138中一个或多个残基上至少含有一个额外N-联链。在一个实施方案中，所述类似物在人Epo残基30和88上含有额外N-联糖链。人Epo氨基酸残基编码如图1和SEQ ID NO：1所示。图1图示预期的166个氨基酸的Epo成熟多肽，而重组产生的Epo在去除C末端精氨酸残基后含有165个氨基酸。当然，rHuEpo和高糖基化Epo类似物或者可以含有165个氨基酸，或者可以含有166个氨基酸。

本发明类似物至少含有4个N-联糖链。4个糖链中的3个可在位置24、38和83的天然位点上。然而，设想本发明某些类似物可以含有一个或多个改变的天然糖基化位点，使得一个或多个所述位点缺失或被一个新位点替代。本发明也提供这类类似物。例如在位置24、38和83的任何一个位点可以缺失或被位置88的一个位点取代。所述类似物可任选在位置126含有O-联位点。

本发明还提供至少含有一个额外糖链的新的Epo高糖基化类似物。已经发现在修饰成为糖基化位点的位置52、53、55、86和114中的任何一个位置加入一个额外N-联糖链。具体实施方案包括类似物N49-N61，见表1所示。新的类似物在位置52、53、55、86和114中的任何一个位置上至少含有一个新的N-联糖基化位点，而且可进一步在其它位点含有额外N-联或O-联糖链。所述类似物可以含有1、2、3或4个额外糖链，或者含有4个以上额外糖链。在一个优选的实施方案中，所述类似物含有3个额外N-联糖链(总共6个N-联链)。在另一个优选的实施方案中，所述类似物含有4个额外N-联链(总共7个N-联链)。含有3或4、或4个以上额外N-联糖链的类似物可以在位置52、53、55、86和114中任何一个位置上含有但不限于一个额外链。

令人惊奇的是，发现在位置30、53和88含有3个额外N-联链的高糖基化类似物(总共6个N-联链)的体内活性比含有2个额外链的类似物N47(总共5个)高。结果见图3。显然所述类似物的体内活性直接取决于N-联糖链数量。这些结果可以外推到治疗情况，其中比N47含有的N-联糖链更多的类似物的给药频率可以更低。

可用本领域技术人员可利用的各种诱变技术制备所述类似物，例如定点诱变、PCR诱变和盒式诱变(Zoller等，Meth.Enz.100，468-500(1983)；Higuchi，载于PCR Protocols第177-183页(Academic Press，1990)；Wells等，Gene 34，315-323(1985))。实施例1描述了应用PCR诱变技术构建新的Epo高糖基化类似物。

采用标准技术利用适合保持在哺乳动物宿主细胞中的载体将已经诱变的Epo DNA序列插入表达载体中。所述载体通常含有以下适用于哺乳动物宿主细胞的元件：启动子和其它“上游”调节元件、复制起点、核糖体结合位点、转录终止位点、多接头位点和选择标记。载体还可以含有同样允许在原核宿主细胞增殖和维持的元件。

合适的细胞或细胞系包括哺乳动物来源(包括人类来源)的任何细胞或细胞系。实例包括COS-7(ATCC保藏号CRL 1651)、人293、年幼仓鼠肾脏(BHK，ATCC保藏号CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞(包括二氢叶酸还原酶(DHFR)-缺陷细胞，Urlab等，Proc.Natl.Acad.Sci USA77，4216-4220(1980))。其它合适哺乳动物细胞系包括但不限于HeLa、小鼠L-929和3T3。在一个优选的实施方案中，使用DHFR-缺陷型CHO细胞。

用标准转化或转染技术将包含编码Epo高糖基化类似物的序列的载体导入宿主细胞中。利用公众可应用的方法完成培养、扩增和筛选转化宿主细胞或转染宿主细胞(Gething等，Nature 293，620-625(1981)；Kaufman等，Mol Cell.Biol.5，1750-1759(1985)；美国专利第4,419,446号)。在可表达所述类似物的条件下培养含有Epo高糖基化类似物DNA编码序列的宿主细胞。从所述细胞培养基回收所述类似物，并采用基本上与以前所述(WO94/09257)相同的方法和实施例2的方法进行纯化。所述纯化方法可分离因为加入额外糖链产生的含有较多唾液酸的Epo同种型。

所述Epo高糖基化类似物除了包含新的糖基化位点之外，还含有不会产生新的糖基化位点而且基本上不改变所述高糖基化类似物的生物活性的添加、缺失或取代的氨基酸残基。按Syed等，Nature 395，511(1998)所述，通过检测Epo-Epo受体复合物的结构可确定可以被改变但是不会影响生物活性的Epo各位点或区。检测Epo-Epo受体复合物的结构表明，那些残基与Epo受体结合位点相互作用或者非常靠近Epo受体结合位点，而且当改变Epo氨基酸序列时应该避开这些氨基酸残基。或者人们可以经验性确定可耐受丙氨酸扫描诱变引起的氨基酸取代的那些区(Cunningham等，Science 244，1081-1085(1989)。在该方法中，用中性氨基酸(例如丙氨酸)单独取代选定的氨基酸残基，以确定对生物活性的影响。

一般认为保守氨基酸的变化几乎不可能扰乱多肽的结构和/或功能。因此，本发明包括一个或多个保守氨基酸改变的Epo高糖基化类似物。保守氨基酸变化一般涉及一个氨基酸被另一结构和/或功能相似的氨基酸(例如侧链大小、电荷和形状相似的氨基酸)取代。本领域技术人员熟知这些变化的性质，将其总结于下表1。“优选取代”表头项下显示这种保守取代。还设想了也可以导入的更明显的改变(“典型取代”)。熟练技术人员知道最初应该以相对保守的方式取代修饰所述位点。如果这种取代保持生物活性，则可以导入更明显的变化(典型取代)和/或进行其它添加/缺失，然后筛选获得的产物。

表1：氨基酸取代

原残基优选取代典型取代

Ala(A) Val Val；Leu；Ile

Arg(R) Lys Lys；Gln；Asn

Asn(N) Gln Gln；His；Lys；Arg

Asp(D) Glu Glu

Cys(C) Ser Ser

Gln(Q) Asn Asn

Glu(E) Asp Asp

Gly(G) Pro Pro

His(H) Arg Asn；Gln；Lys；Arg

Ile(I) Leu Leu；Val；Met；Ala；Phe；

正亮氨酸

Leu(L) Ile 正亮氨酸；Ile；Val；Met；

Ala；Phe

Lys(K) Arg Arg；Gln；Asn

Met(M) Leu Leu；Phe；Ile

Phe(F) Leu Leu；Val；Ile；Ala

Pro(P) Gly Gly

Ser(S) Thr Thr

Thr(T) Ser Ser

Trp(W) Tyr Tyr

Tyr(Y) Phe Trp；Phe；Thr；Ser

Val(V) Leu Ile；Leu；Met；Phe；Ala；

正亮氨酸

本发明还提供基本上不影响生物活性的缺失或添加氨基酸的高糖基化Epo类似物。这种添加和缺失可以是在所述多肽的N末端或C末端，或者可以是在所述多肽的内部。一般来说，较少缺失或添加影响Epo或高糖基化类似物的结构和/或功能的可能性更小。在一个实施方案中，缺失或添加可以是5-10个残基，或者2-5个氨基酸残基，或者1-2个残基。

术语“摩尔量”是指基于没有糖基化的相应红细胞生成素多肽分子量的高糖基化类似物或rHuEpo的量。等量的rHuEpo和类似物是指当考虑测定这样的量所用方法的正常变化时的相等的量。必须用这种方法确定等量，因为rHuEpo和类似物的分子量随糖链数的不同而不同。如图1和SEQ ID NO：1所示，根据氨基酸残基1-165计算红细胞生成素多肽rHuEpo的分子量。根据图1和SEQ ID NO：1的残基1-165的氨基酸变化调整高糖基化类似物的分子量。

高糖基化类似物的给药频率随需要治疗的病症和目标血细胞比容而不同，但是一般低于每周三次。所述给药频率约为每周2次，约每周1次。给药频率也可以低于约每周1次，例如约每2周1次(约每14天1次)、每月1次或每2个月1次。当然，因为不同个体对Epo类似物的反应不同，实际应用的给药频率可多少不同于本文所公开的给药频率；术语“约”是用于反映这样的变化。

本文使用的术语“治疗有效量”是指使血细胞比容升高到对患者有益的目标血细胞比容或目标血细胞比容范围或者维持患者目标血细胞比容或目标血细胞比容范围的高糖基化类似物的量。所述治疗有效量在不同个体之间是不同的，它取决于许多因素，包括患者的总体生理状况、贫血的严重程度和潜在原因以及所述患者个体的最终目标血细胞比容。目标血细胞比容通常为至少约30％，或30-38％范围，优选38％以上，更优选40-45％。关于rHuEpo的目标血细胞比容范围的一般指南还见于日期为12/23/96的EPOGEN

说明书，而且如本文所述为30-36％或32-38％。当然，这样的目标范围随不同个体而不同，这样决定任何特定患者的实际目标血细胞比容时医生的决定可能是合适的。尽管如此，决定目标血细胞比容也完全在本领域技术水平范围内。

本领域技术人员可以容易地确定本发明组合物的治疗有效量.实施例6描述了一个临床方案，其目的之一是确定每周给予1次和每周给予3次类似物N47的治疗有效量.每周给予一次的剂量范围为每剂每公斤体重约0.075-约4.5μg红细胞生成素肽.每周给予三次的剂量范围为每剂每公斤体重0.025-1.5μg红细胞生成素肽.该剂量范围可用于其它Epo高糖基化类似物，而所述剂量范围的任何调整对于本领域技术人员而言是常规性的.

本发明的明显优势是能够将糖基化程度和剂量或给药间隔联系起来，使得人们可以让Epo类似物“满足”特定剂量或给药方案的要求。如图3所示，鉴于具有1、2或3个额外糖链的Epo类似物的体内活性增加，所以治疗医生可以选择一种适合而且便于所治疗的贫血病症的类似物。例如如果是急性贫血而且需要有效大剂量的患者时，或者如果是需要持续较长时间治疗的患者时，可以优选给予具有3或4个甚至更多额外糖链的高糖基化类似物。对于其贫血较轻或需要治疗的时间较短的其它患者，可以优选具有1或2个额外糖链的类似物。本发明类似物为医生预防和治疗贫血提供更大的灵活性，所述贫血可起因于各种基本疾病。

本发明还提供给予治疗有效量铁以维持治疗期间的红细胞生成增加。由本领域技术人员可根据rHuEpo疗法适当地决定给予量。

本发明可用于刺激红细胞生成以及预防和治疗贫血。本发明可治疗的贫血包括以下疾病引起的贫血：肾脏功能降低或丧失(慢性肾功能衰竭)、骨髓抑制性疗法如化疗或抗病毒药物(诸如AZT)、非骨髓癌恶化、病毒感染(例如HIV)和慢性疾病。也可以治疗在其它健康个体导致贫血的病症，例如手术期间预期的血液损失。一般而言，任何可用rHuEpo治疗的病症也可以用本发明的Epo高糖基化类似物治疗。

本发明还提供药用组合物，它包括治疗有效量Epo高糖基化类似物和药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或辅助剂。所述组合物适用于每周低于三次的给药方案。所述组合物可以为液体或冻干形式，它含有具有不同pH值和离子强度的稀释剂(Tris、柠檬酸盐、乙酸盐或磷酸盐缓冲剂)、增溶剂如吐温或聚山梨酸酯、载体如人血清白蛋白或明胶、防腐剂如硫汞撒、对羟基苯甲酸酯类、benzylalconium chloride或苄醇、抗氧化剂如抗坏血酸或偏亚硫酸氢钠以及其它成分如赖氨酸或甘氨酸。对具体组合物的选择取决于许多因素，包括所治疗的病症、给药途径和需要的药代动力学参数。对适用于药用组合物的成分的更广泛的综述见Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R.Gennaro编辑，Mack，Easton，PA(1980)。在一个优选的实施方案中，用含有人白蛋白和任选含有防腐剂苄醇的等渗氯化钠/柠檬酸钠缓冲液将本发明Epo高糖基化类似物配制成液体形式。所述组合物优选含有具有1、2、3、4或更多个额外糖链的类似物。

优选通过皮下或静脉内注射给予本发明组合物。最终选定的给药途径取决于许多因素，而本领域技术人员可确定最终给药途径。

以下实施例用于更充分地阐明本发明，而不能解释为限制本发明范围。

实施例1

构建高糖基化Epo类似物

构建编码高糖基化Epo类似物的cDNA

采用几种不同的方法通过体外诱变制备Epo类似物.按WO94/09257所述构建类似物N49和N50.也通过改变重叠PCR(聚合酶链反应)方法构建类似物.基本方法包括2个连续步骤.在第一步中，总共用4个寡核苷酸：5’(正向)引物、反向诱变引物、正向诱变引物(通常与反向诱变引物互补)以及3’(反向)引物，对Epo或Epo类似物模板DNA进行两个PCR反应(PCR1和PCR2).诱变引物含有需要的核苷酸变化以及在这些变化两侧的6-14个准确匹配的核苷酸.PCR1使用5’(正向)引物和反向诱变引物.PCR2使用3’(反向)引物和正向诱变引物.通过琼脂糖凝胶电泳分离扩增的DNA片段.从凝胶上切下含有正确大小DNA片段的小片琼脂.将PCR1和PCR2的DNA片段合并在一起，只用5’正向和3’反向引物进行第三个PCR反应.因此扩增含有需要突变的全长DNA区段.在几种情况下，采用相同的PCR方法，通过在已具有一种改变的DNA中导入一种新的取代，合并2或3种突变.为了构建这些多糖基化位点类似物，将一个双位点或三位点类似物(如上所述产生)用作PCR模板，用合适的引物通过定点诱变再导入一个糖基化位点.

用重叠PCR(聚合酶链反应)方法1构建Epo类似物N51、N52和N53。在每种情况下均导入一个额外N-糖基化位点。用pDSRα2 Epo作PCR模板，N56在天然序列HuEpo中加入一个糖基化位点(N114T116)，用pDSRα2 Epo N47模板(Asn30、Thr32、Val87、Asn88、Thr90)，N51在N47 Epo中加入一个O-联糖基化位点(Thr125)，而用pDSRα2EpoN47模板，类似物N59在类似物47中加入一个糖基化位点(Asn53)。

采用Cheng等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，5695(1994))的修订方法进行方法1的聚合酶链反应。3’(反向)引物包含在Xba I限制位点之前导入一个终止密码子的序列：

ATCTAGAAGTTGCTCTCTGGACAGTTCCT(SEQ ID NO：2)

5’正向反应引物：

GAAGCTTGCGCCACCATGGGGGTGCACGAATG(SEQ ID NO：3)在Epo起始密码子(ATG)上游的Kozak序列之前含有一个Hind III限制位点。典型PCR反应混合物含有：4μl各正向和反向引物(5pmol/μl)、1μl模板(25ng)、10μl 5X LP缓冲液(100mM Tricine pH 8.7/25％甘油/425mM KOAc)、10μl dNTP母液(dATP、dTTP、dCTP、dGTP各1mM)、0.8μl rtTh聚合酶(Perkin Elmer；2.5U/μl)和2μl Vent聚合酶(NEB；0.01U/μl用1X LP缓冲液现稀释100倍的稀释液)。加入水使终体积为50μl。所有组分按所示顺序加在一起，当第一个循环的温度高于60℃时加入1μl 50mM MgOAc开始PCR。典型反应条件是：94℃，10秒/50℃，1分钟/68℃，5分钟，2个循环；然后94℃，10秒/55℃，1分钟/68℃，5分钟，25个循环。通过琼脂糖凝胶电泳分离扩增片段，用Geneclean^TM试剂盒和生产商(Bio 101，Inc.)提供的方法纯化正确大小的DNA片段。用Hind III和Xba I消化纯化DNA，然后用Geneclean^TM试剂盒再次纯化。然后将所述片段连接到Hind III和XbaI切割的pDSRα2载体中。用2体积乙醇的0.3M NaOAc pH 5.2在存在运载体tRNA下沉淀连接的DNA，并将其转化入大肠杆菌中。通过限制性消化微量DNA制品(mini DNA preps)筛选Epo类似物。然后从阳性克隆制备质粒，对插入片段进行测序以证实存在需要的突变而且保证没有导入其它氨基酸变化。

采用重叠PCR策略方法2构建类似物N54-N61。3’(反向)引物包含在Xba I限制位点之前导入一个终止密码子的序列：

GATCCTCTAGAGTTGCTCTCTGGACAG(SEQ ID NO：4)

5’正向反应引物：

CAACAAGCTTGCGCCGCCATGGGGG(SEQ ID NO：5)在Epo起始密码子(ATG)上游的Kozak序列之前含有一个Hind III限制位点。采用Perkin Elmer UlTma DNA聚合酶和以下试剂进行高保真PCR策略：10μl 10X PCR缓冲液、3μl 1mM dNTP、5pmol各引物和水，终体积为100μl。当PCR混合物温度达到94℃时加入0.5单位的UlTma聚合酶。然后进行PCR反应：94℃30秒，50℃30秒和72℃90秒，5个循环。随后进行25个循环：94℃30秒和72℃90秒。电泳后从琼脂糖凝胶切下正确大小的产物带。

用Qiagne凝胶抽提试剂盒纯化(clean)所获得的各类似物PCR产物。将纯化DNA在100μl含有HindIII和XbaI限制酶(BoehringerMannheim)的限制性消化反应物中于37℃消化1小时。再凝胶纯化消化产物，然后将消化片段连接到HindIII和XbaI消化的pDSRα2载体中。

用2体积乙醇的0.3M NaOAc pH 5.2在运载体tRNA存在下沉淀连接的DNA，并将其转化入大肠杆菌中。利用集落PCR(colony PCR)初步筛选Epo类似物，以鉴定含有正确大小和DNA插入片段类型的克隆。采用该方法，将含有质粒的细胞加入含有Epo正向引物和反向引物的PCR试管中。然后用上述反应条件对混合物进行PCR。再后从阳性克隆制备质粒，对Epo类似物插入片段进行测序以证实存在需要的突变而且保证没有导入其它氨基酸变化。

表1

含有N-联糖链位点的红细胞生成素类似物

糖链加入的分析

将插入表达载体pDSRα2的高糖基化Epo类似物的构建物转染入COS细胞中.通过蛋白质印迹分析转染COS细胞上清液，确定表达和分泌的Epo类似物是否含有额外的糖.将样品直接加入SDS-PAGE凝胶孔中，然后用单克隆抗体9G8A(Elliott等(1996)Blood87：p2714)的免疫印迹进行分析.比较类似物样品的代谢物与含有rHuEpo的样品的迁移率.图1显示，与类似物N4(4个糖链)和N47(5个糖链)相比，类似物N53和N61的迁移率降低.迁移率与类似物N53存在6个糖链和类似物N61存在7个糖链一致.所有高糖基化类似物的数据见表2.

体外生物学测定

测定表达rHuEpo或类似物的COS或CHO细胞的条件培养基刺激UT7-Epo细胞摄取³H-胸腺嘧啶的作用(Komatsu等，Blood 82，456)。UT7-Epo细胞是Epo反应细胞，它在其细胞表面表达人Epo受体。使UT7-Epo细胞在生长培养基(含有L-谷氨酰胺、25mM HEPES缓冲剂和3024mg/L碳酸氢钠，但是不含α-硫代甘油或β-巯基乙醇的1XIscove改良的Dulbecco培养基(GIBCO)/10％ v/v胎牛血清/1％ v/v L-谷氨酰胺-青霉素-链霉素溶液(Irvine Scientific)/1单位/mL rHuEpo)中生长至约3×10⁵细胞/mL。离心(约500xG)收集细胞，用磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，以5×10⁴细胞/mL悬浮于检测培养基(不含L-谷氨酰胺的1×RPMI培养基1640(Gibco)/1％L-谷氨酰胺/4％胎牛血清)中。将用检测培养基至少稀释5倍的受试样品或Epo标准品(rHuEpo)100μL加入96孔微量滴定板的各孔中。然后加入50μL悬浮细胞(5000细胞/孔)，将微量滴定板置于37℃和5％CO₂的湿化培养箱中温育。72小时后，加入50μl用检测培养基稀释100倍的甲基-³H-胸腺嘧啶(1mCi/mL；20Ci/mMole)。将细胞再于37℃和5％二氧化碳下温育4小时。将标记细胞收获在玻璃纤维滤板上，用去离子水洗涤，然后用2-丙醇洗涤，干燥并计数。通过比较测得的各类似物的反应和rHuEpo标准品的反应，确定活性。然后用体外活性除以免疫测定测得的各类似物的浓度，确定生物比活性(Elliott等(1996)Blood 87：p2714)。结果见表2。

表2

类似物 N-联糖链数体外活性^＊＊

rHuEpo 3 +++

N49 4 +++

N50 4 +++

N51 5^* +++

N52 3-4 +++

N53 6 ++

N54 4 NT

N55 4 +++

N56 4 +++

N57 3-4 +++

N58 4 +++

N59 5 ++

N60 4-5 +++

N61 6-7 NT

^*含有1-2个O-联链

^**相当于rHuEpo活性的体外活性

+++相当于rHuEpo活性

++为rHuEpo的25-75％活性

NT未测试

实施例2

制备重组人红细胞生成素和高糖基化红细胞生成素类似物

用带有人红细胞生成素基因的重组质粒转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达用于本文所述实验的重组人红细胞生成素(rHuEpo)。从所述条件培养基中回收重组产物，而且基本上按Lai等(同上)所述纯化。按等电聚焦测定，获得的rHuEpo制品主要为9-14个唾液酸的同种型。

按WO91/05867和WO94/09257所述用带有Epo类似物基因的重组质粒转染的CHO细胞表达重组高糖基化红细胞生成素类似物，所述文献通过引用结合到本文。如下所述从培养上清液中纯化高糖基化类似物。

浓缩并渗滤条件培养基

从转染CHO细胞系的3个连续收获物(每次5-8天)中收集条件培养基(不含血清)，通过0.45μm滤膜过滤，浓缩约30倍，用具有10,000分子量截留膜的切向流超滤系统(Millipore)渗滤入10mMTris、20μM硫酸铜，pH 7.0中。将渗滤培养基(DFM)第二次过滤(0.45μm)，用于纯化前保藏于-20℃。

纯化

所有步骤在2-8℃下进行。

阴离子交换层析(1Q)

将澄清的DFM上样于用10mM双Tris丙烷(BTP)，pH 7.0平衡的Q-Sepharose Fast Flow柱(Pharmacia，6cm×18cm)上，用2个柱体积10mM BTP洗涤以洗脱所有非结合型物质。根据所述高糖基化类似物是含有4、5个还是6个N-联糖链，运行以下梯度。在该阶段使用的所有缓冲液均含有1mM甘氨酸、20μM硫酸铜、6M尿素、5μg/mL亮抑蛋白酶肽和1μg/mL胃蛋白酶抑制剂。对于具有4个N-联糖链的类似物，在49个柱体积中梯度为10mM乙酸、0.1mM氯化钠至500mM乙酸、5mM氯化钠，2个柱体积保持高盐条件。对于具有5个N-联糖链的类似物，在30个柱体积中梯度为0.7M乙酸、7mM氯化钠至1.0M乙酸、10mM氯化钠，2个柱体积保持高盐条件。对于具有6个N-联糖链的类似物，在50个柱体积中梯度为1.0M乙酸、10mM氯化钠至1.5M乙酸、20mM氯化钠，2个柱体积保持高盐条件。在所述梯度后，用2个柱体积的10mM BTP，pH 7.0洗涤柱，用0.6M氯化钠、100mM BTP，pH 7.0洗脱高同种型部分。

反相层析(C4)

将Q-Sepharose柱(1Q)的高盐洗脱部分(strip)上样于用20％乙醇、10mM BTP，pH 7.0平衡的Vydac C4反相柱(30μ粒度，4cm×18cm)，用30个柱体积的梯度(至用10mM BTP，pH 7.0缓冲的94％乙醇)洗脱该柱。用4体积10mM BTP，pH 7.0稀释约60％乙醇洗脱的合并产物峰，使由存在的乙醇引起聚集作用的可能性最小。

阴离子交换层析(2Q)

将反相柱的稀释洗出液上样于第二个用10mM BTP，pH 7.0平衡的Q-Sepharose Fast Flow(Pharmacia，3cm×9cm)柱。用平衡缓冲液洗涤柱，用0.6M氯化钠、20mM柠檬酸钠，pH 6.0洗脱高糖基化Epo类似物。

纯化蛋白通过centricon(截留10,000分子量)交换入20mM磷酸钠，pH 6.0，140mM氯化钠中，然后通过0.2μm滤膜，将其保藏于2-8℃.

实施例3

rHuEpo和含有4、5和6个N-联糖链的rHuEpo类似物的体内生物活性

根据小鼠低氧性红细胞增多的生物测定比较含有4、5和6个N-联糖链的Epo类似物和rHuEpo的体内活性。该测定定量⁵⁹Fe掺入新生成的红细胞的量，以测定小鼠在对外源性给予受试样品的反应中增加的红细胞生成。如下所述进行测定，该测定为改良的Cotes和Bangham(Nature 191，1065(1961))方法。

在该测定中，首先如下预处理小鼠：将雌性BDF₁小鼠暴露在低气压(0.4-0.5atm)室的低氧条件，每天约18小时，连续14天。为了代偿低氧条件，小鼠的反应是刺激红细胞生成，增加红细胞数，从而增强相对携氧能力。结束最后的低气压暴露后，在腹膜注射给予受试样品之前使小鼠保持在环境气压下约72小时。在环境气压下小鼠的红细胞相对多，其机体反应是减少内源性红细胞生成素的产生和红细胞生成速率。给予受试样品后5天，经尾静脉注射0.2ml 0.2-0.3μCi⁵⁹FeCl₃。48小时后处死小鼠，通过测定0.5mL全血样品中的⁵⁹Fe掺入量，确定受试样品引起的红细胞生成增加程度。

用该测定法测试rHuEpo和含有4、5或6个N-联糖链的5种不同Epo类似物时，获得的结果实例见图3。以合适浓度范围的6或7个不同稀释度测定每个样品。用含有0.5％牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液稀释所有样品，将0.4mL各稀释液给予5只预处理小鼠。给予⁵⁹Fe后48小时，通过γ计数测定0.5mL血液中的⁵⁹Fe掺入量。以⁵⁹Fe掺入百分率与给予剂量的对数对各样品结果进行作图。

如图3所示，在该测定中所测试的全部5种高糖基化Epo类似物比rHuEpo更有效。此外，每种类似物的效力直接取决于N-联糖链的数目，而且类似物含有的糖链数越多，其活性就越高。因此含有6个N-联糖链的类似物N53是作用最强的类似物。含有5个N-联糖链的类似物N47又比含4个N-联链的类似物的作用强。含4个N-联糖链的3种类似物(N4、N18和N50)的效力彼此几乎相同，而且高于rHuEPo。

在该实验中，产生40％⁵⁹Fe掺入需要的rHuEpo和含4、5或6个N-联糖链的类似物的剂量分别为10,700ng、640ng、140ng和38ng。根据产生该水平红细胞生成需要的物质量，含有4、5或6个N-联糖链的Epo类似物的效力分别是rHuEPo的17倍、77倍和280倍。

实施例4

rHuEPo和Epo类似物N47在大鼠和小猎犬的IV药代动力学

在大鼠和小猎犬进行两个独立实验，比较Epo N47类似物和rHuEpo的药代动力学参数。

在大鼠研究中，将1μCi(～0.1μg肽/kg)¹²⁵I-Epo N47类似物或¹²⁵I-重组人红细胞生成素(Amersham)静脉内注射入外科植入正常雄性Sprague-Dawley大鼠的颈动脉插管内，所述大鼠重314-363g。给药后不同时间点收集0.3mL血液，离心制备血清。然后用90％乙醇于4℃温育过夜后，测定各血清样品的¹²⁵I-rHuEpo或¹²⁵I Epo N47类似物水平。离心收集各血清样品的乙醇沉淀蛋白。以γ计数器计数放射性。获得的血清浓度与时间的药代动力学曲线见图4。每个点代表N47类似物组5只大鼠的组平均值和rHuEpo组6只大鼠的组平均值。利用PCNONLIN 4.0非线性回归分析(Statistical Consultants，1992)确定每只大鼠的药代动力学参数，并平均每组结果。结果见表3。

表3

比较N47和r-HuEpo在大鼠的IV药代动力学参数

^a结果表示为N47组5只大鼠和r-HuEpo组6只大鼠的组平均值±SD。

在狗的研究中，给体重为7.8-9.5kg的正常小猎犬经颅静脉静脉内快速浓注～29μCi¹²⁵I-rHuEpo或¹²⁵I-N47(～0.1μg肽/kg)。给药后24小时中的不同时间点收集约1-2mL血液并制备血清。测定0.1mL血清中的¹²⁵I-rHuEpo或¹²⁵I-N47的浓度，如上所述计算药代动力学参数。关于狗实验的血清浓度与时间的药代动力学曲线见图5。每个时间点为各组2只动物的组平均值。药代动力学参数总结于表4。

表4

比较N47和r-HuEpo在狗的IV药代动力学参数

^a结果表示为每组2只狗的平均值。

在大鼠和狗研究中，rHuEpo和Epo N47类似物均显示双相血清清除。在大鼠中，rHuEpo血清清除率比Epo N47类似物快约3.7倍，Epo N47类似物的β半衰期比rHuEpo长约2.8倍。在狗研究中的药代动力学参数基本上与在大鼠观测到的结果一致。在狗的研究中，rHuEpo血清清除率比Epo N47类似物快约3.5倍，Epo N47类似物的β半衰期比rHuEpo长约3.5倍。

实施例5

给予rHuEpo和Epo类似物N47后血细胞比容的剂量反应

每周三次(TIW)的血细胞比容剂量反应研究

通过腹膜或静脉注射一定剂量范围内的rHuEpo和Epo类似物N47，每周三次，连续长达6周，比较它们在正常小鼠体内的生物活性。眼框后取血测定血细胞比容，每周2次。

正常CD1小鼠重约30g(每组10-13只小鼠)，对小鼠每周腹膜注射3次rHuEpo(剂量范围为0.625-10μg/kg/剂)、Epo N47类似物(剂量范围为0.156-1.25μg肽/kg/剂)或溶媒对照，共计连续6周。溶媒对照和不同rHuEpo和Epo N47类似物给药制剂的稀释液是含有0.025％小鼠血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液(PBS)。测定所有小鼠的基线血细胞比容和此后的每周两次框后取血的血细胞比容。在实验结束时收集所有动物的血清，通过溶液的放射免疫沉淀测定法测定血清中抗所注射制品的抗体。判定为中和抗体阴性的动物的血细胞比容数据用于随后的分析。

如图6所示，在6周的研究中，rHuEpo和Epo N47类似物均产生剂量依赖性血细胞比容增加，但是在给定浓度时，与rHuEpo相比，N47类似物促进血细胞比容增加的作用更强.在该实验中，腹膜注射每周三次给予时，Epo N47类似物的作用强约3-4倍。

采用类似于腹膜注射的方法，每周静脉注射3次，进行rHuEpo和类似物N47的剂量反应研究。所获得的结果类似于腹膜给予结果，尤其是该研究进一步证实，每周给予三次时，Epo N47类似物的效力比rHuEpo高。

为了更好地比较和定量rHuEpo和Epo N47类似物提高正常小鼠血细胞比容的生物活性，还通过相对效力图分析实验结果。对于每个实验，通过以下方法确定各剂量rHuEPo或Epo N47类似物活性：通过梯形累加对研究的最初38天增加的血细胞比容求和，获得曲线下面积(AUC)。然后将其对μg肽/kg/周的剂量对数进行作图。通过测定相关对数剂量反应直线之间的距离，可确定相同或不同给药途径或给药频率的化合物之间的效差。图7总结了所进行的所有实验的相对效力数据，比较两种不同给药途径(腹膜和静脉)和两种不同给药方案的rHuEpo和Epo N47类似物的活性。

如图7所示，每周给予三次时，静脉或腹膜途径注射给予的EpoN47类似物的效力相同，比每周腹膜注射3次的rHuEpo的效力高3.6倍。

每周一次(OW)的血细胞比容剂量反应研究

通过腹膜或静脉途径给予rHuEpo和Epo类似物N47，每周1次，连续6周，比较它们对正常小鼠血细胞比容的增加。

正常CD1小鼠重约30g(每组8-10只小鼠)，对小鼠每周静脉注射1次用含有0.025％小鼠血清白蛋白的PBS配制的不同浓度rHuEpo、Epo N47类似物或溶媒对照(含有0.025％小鼠血清白蛋白的PBS)，共计连续6周。类似物的剂量范围是6.25-25μg肽/kg/剂，而rHuEpo剂量范围是25-200μg/kg/剂。测定所有小鼠的基线血细胞比容和此后的每周两次框后取血的血细胞比容。在实验结束时收集所有动物的血清，通过溶液的放射免疫沉淀测定法测定血清中抗所注射制品的抗体。判定为中和抗体阴性的动物的数据用于随后的分析。

如图8所示，尽管每周给药一次时rHuEpo和N47类似物均提高正常小鼠血细胞比容，但是产生反应需要的rHuEpo剂量明显高于类似物47。例如在该实验中，25μg肽/kg/周的N47在6周后增加41.2个点的小鼠血细胞比容，而相同剂量的rHuEpo只增加12.5个点的血细胞比容。

采用类似于上述的方法，每周腹膜注射1次，进行rHuEpo和类似物N47的剂量反应研究。所获得的结果与静脉给予结果一致，进一步证实每周给予1次时，类似物N47的效力比rHuEpo高。

为了定量每周给予rHuEpo和N47类似物各一次时的活性差异，如上所述由所有相关实验产生相对效力图。如图7所示，每周给予1次时，静脉或腹膜途径注射给予类似物N47的效力相同。每周给予每种药物一次时，类似物N47的效力比rHuEpo强14倍。

此外，图6的对数剂量反应图还阐明了以下几点：(1)每周给予一次(QW)特定剂量类似物N47基本上与以3个分剂量给予(TIW)的相同的周总剂量rHuEpo同样有效；(2)每周给予一次(QW)特定剂量的rHuEpo的效果仅为以3个分剂量给予(TIW)的相同的周总剂量类似物N47的约2％；(3)给予类似物N47 TIW在小鼠中的效力大约是QW的4倍。

每隔一周(EOW)的血细胞比容剂量反应研究

此外进行实验以评价当每隔一周注射一次时类似物N47增加小鼠血细胞比容的能力。对正常CD-1小鼠(每组10只小鼠)每周或每隔一周静脉注射1次用含有0.025％小鼠血清白蛋白的PBS配制的不同浓度Epo N47类似物，共计连续约6周。每隔一周给予类似物N47200、100或25μg/kg/剂或以12.5μg/kg/剂每周给予一次。测定所有小鼠的基线血细胞比容和此后的每周两次框后取血的血细胞比容。

如图9所示，甚至当每月给予类似物N472次时，它仍能够以剂量依赖性方式增加小鼠血细胞比容。正如所料，当以较低频率给药时，需要更大剂量的N47类似物来增加血细胞比容。每隔一周给予N47类似物剂量200μg/kg在6周后增加血细胞比容的程度基本上与每周给予一次12.5μg/kg相同。

实施例6

Epo N47类似物和rHuEpo在连续性非卧床腹膜透析(CAPD)患者的IV药代动力学

因为Epo N47类似物在大鼠和小猎犬的血清半衰期比rHuEpo明显增加，所以令人感兴趣的是确定在人类是否也能够观察到这样的增加。

对11名稳定CAPD患者(7名男性，4名女性，年龄27-75岁)进行双盲随机交叉设计研究。一个患者组接受100U/kg rHuEpo(相当于0.5μg肽/kg)，而第二组患者接受0.5μg肽/kg Epo N47类似物，两组均一次性快速静脉注射。通过留置管取静脉血样品(3mL)，而且在快速静脉注射前、注射后5、10、15、30分钟和1、2、5、8、12、16、24、30、36、48、60、72和96小时取血。在28天消除期后，第一组患者接受一次性静脉注射Epo类似物N47，而第二组接受单次静脉注射剂量的rHuEpo。按第一个治疗周期取血样品。采用ELISA在减去基线内源性Epo水平后确定血清rHuEpo和Epo N47类似物水平。在调整交叉设计影响后估测的药代动力学参数(均数±SE)见表5。采用线性梯形求和计算血清浓度AUC。t1/2_z定义为：log(2)/K_z，其中以ln(血清浓度)时间曲线终末部分的斜率计算K_z。清除率(Cl)定义为：剂量/AUC。分布体积(V_d)定义为：Cl/K。

表5

Epo N47类似物的平均血清半衰期(25.3小时)比rHuEpo(8.5小时)长3倍，rHuEpo的清除率比类似物N47快2.5倍。

实施例7

Epo N47类似物的II期剂量选择和剂量方案研究

启动多中心随机剂量序贯增加的研究，研究皮下或静脉注射给予CRF透析患者类似物N47时类似物N47的最佳剂量和剂量方案。

给药方案如下：

每周给药一次：0.075，0.225，0.45，0.75，1.5和4.5μg肽/kg/剂。

每周给药三次：0.025，0.075，0.15，0.25，0.5和1.5μg肽/kg/剂。

以两个部分进行研究：第一个部分是设计的剂量增加研究，以评价每周给予1次或3次类似物N47在4周内以最佳速率增加血红蛋白的剂量(大于或等于1g/dL，但是低于3g/dL).设计每个研究的第二部分以确定维持血细胞比容在治疗目标水平需要(每周通过静脉或皮下给药途径给予1次或3次)的剂量.

初步的结果表明，每周给予一次类似物N47可用来同时提高并维持CRF贫血患者的血细胞比容。初步的结果提示，对于两种给药途径而言，以每周给药3次的给药方案开始治疗的优选剂量为0.15和0.25μg肽/kg/剂，每周1次的给药方案的优选剂量为0.45和0.75μg肽/kg/剂。

尽管用被认为是本发明优选的实施方案描述了本发明，但是本发明不限于所公开的实施方案，而是相反，本发明包括所附权利要求书宗旨和范围包括的各种改进实施方案和等同实施方案，本发明范围与最广义的解释一致，以包括所有这样的改进和等同实施方案。

序列表

<110>Amegn Inc.

<120>用于预防和治疗贫血的方法以及组合物

<130>A-460

<140>09/178,292

<141>1998-10-23

<160>5

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>193

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>SIGNAL

<222>(1)..(27)

<223>信号序列是残基1-27

<400>1

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

20 25 30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

35 40 45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

50 55 60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65 70 75 80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

85 90 95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

100 105 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

115 120 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

130 135 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145 150 155 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

165 170 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

180 185 190

Arg

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人

<400>2

atctagaagt tgctctctgg acagttcct 29

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人

<400>3

gaagcttgcg ccaccatggg ggtgcacgaa tg 32

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人

<400>4

gatcctctag agttgctctctggacag 27

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人

<400>5

caacaagctt gcgccgccat ggggg 25

Claims

1.有效量高糖基化红细胞生成素类似物在制备提高并维持哺乳动物血细胞比容的药物中的用途，其中所述类似物的给药频率低于获得相似目标血细胞比容的等摩尔量重组人红细胞生成素的给药频率。

2.权利要求1的用途，其中所述高糖基化红细胞生成素类似物量的给予是约每周2次。

3.权利要求1的用途，其中所述高糖基化红细胞生成素类似物量的给予是约每周1次。

4.权利要求1的用途，其中所述高糖基化红细胞生成素类似物量的给予是约每隔一周1次。

5.权利要求1的用途，其中所述高糖基化红细胞生成素类似物量的给予是约每月1次。

6.权利要求3的用途，其中所述高糖基化红细胞生成素类似物给予量约0.075-4.5μg红细胞生成素肽/kg/剂。

7.有效量高糖基化红细胞生成素类似物在制备提高并维持哺乳动物血细胞比容的药物中的用途，其中以低于获得相似目标血细胞比容的重组人红细胞生成素的摩尔量给予所述类似物。

8.权利要求7的用途，其中所述高糖基化红细胞生成素类似物的给予量是约0.025-1.5μg红细胞生成素肽/kg/剂，每周3次。

9.权利要求1或7的用途，其中与人红细胞生成素相比，所述高糖基化红细胞生成素类似物包含一个或更多额外糖基化位点，其中一个或更多糖链添加到该位点。

10.权利要求1或7的用途，其中所述目标血细胞比容至少为约30％。

11.权利要求9的方法，其中该类似物含有一个或更多额外糖链，其中N-联糖链连接图1所示的人红细胞生成素序列第1-165位残基(SEQ ID NO：1)的位置30、51、57、69、88、89、136或138。

12.权利要求9的方法，其中该类似物含有额外N-联糖链，该额外的N-联糖链连接图1所示的人红细胞生成素序列第1-165位残基(SEQ ID NO：1)的位置30和88。

13.权利要求12的方法，其中该类似物包含Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Epo。

14.权利要求1或7的用途，其中所述药用组合物包含药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或辅助剂。

15.权利要求14的方法，其中所述组合物包括含柠檬酸钠或磷酸钠缓冲液的稀释剂。

16.权利要求14的方法，其中所述组合物包括含人血清白蛋白的载体。

17.权利要求14的方法，其中所述组合物包括含苄醇的防腐剂。

18.权利要求1或7的用途，其中所述哺乳动物患有与肾功能降低或丧失有关的贫血。

19.权利要求1或7的用途，其中所述哺乳动物患有与骨髓抑制性治疗有关的贫血。

20.权利要求19的用途，其中所述骨髓抑制性治疗包括化疗药物或抗病毒药物。

21.权利要求1或7的用途，其中所述哺乳动物患有与过量失血有关的贫血。

22.权利要求1或7的用途，它还包括给予治疗有效量的铁。

23.人红细胞生成素的类似物，它至少在图1所示的人红细胞生成素序列第1-165位残基(SEQ ID NO：1)的位置52、53、55、86和114中的任何位置上含有一个额外糖基化位点，其中N-联糖链加入该位点。

24.权利要求23的类似物，它至少含有2个额外糖基化位点，其中糖链与每个所述位点连接。

25.权利要求23的类似物，它包含至少3个额外糖基化位点，其中糖链与每个所述位点连接。

26.权利要求23的类似物，它包含至少4个额外糖基化位点，其中糖链与每个所述位点连接。

27.人红细胞生成素的类似物，它选自：

Asn⁵²Thr⁵⁴Epo；

Asn⁵³Thr⁵⁵Epo；

Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr¹²⁵Epo；

Asn¹¹⁴Thr¹¹⁶Epo；

Asn³⁰Thr³²Asn⁵³Thr⁵⁵Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Epo；

Asn⁵⁵Thr⁵⁷Epo；

Asn⁸⁶Val⁸⁷Thr⁸⁸Epo；

Ala⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Epo；

Val⁸⁷Asn⁸⁸Ser⁹⁰Epo；

Val⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰Epo；

Asn³⁰Thr³²Asn⁵³Thr⁵⁵Epo；

Asn³⁰Thr³²Asn¹¹⁴Thr¹¹⁶Epo；和

Asn³⁰Thr³²Asn⁵³Thr⁵⁵Val⁸⁷Asn⁹⁸Thr⁹⁰Asn¹¹⁴Thr¹¹⁶Epo。

28.权利要求23-27的类似物，它是外源性DNA序列的表达产物。

29.一种DNA序列，它编码权利要求23-27的类似物。

30.一种真核生物宿主细胞，它是用权利要求29的DNA序列以允许所述宿主细胞表达所述类似物的方式转染的真核生物宿主细胞。

31.一种组合物，它包含治疗有效量的权利要求23-27的类似物和药学上可接受的稀释剂、辅助剂或载体。

32.治疗有效量的权利要求23-27类似物在制备提高并维持哺乳动物血细胞比容的药用组合物中的用途。

33.权利要求32的用途，其中所述类似物的给药频率低于获得相当目标血细胞比容的等摩尔量重组人红细胞生成素的给药频率。

34.权利要求33的用途，其中所述类似物量约每周给予1次、约每隔一周给予1次或约每月给予1次。

35.权利要求32的用途，其中给予所述类似物的摩尔量低于获得相当目标血细胞比容的重组人红细胞生成素的摩尔量。

36.权利要求34的用途，其中所述类似物的给予量约为0.025-1.5μg红细胞生成素肽/kg/剂，每周3次。

37.权利要求34的用途，其中所述类似物的给予量小于约0.025μg红细胞生成素肽/kg/剂，每周3次。

38.生产高糖基化红细胞生成素类似物的方法，包括在容许表达及回收该类似物的条件下，在介质中培养权利要求30所述的宿主细胞。