CZ20002386A3 - Erythropoetinový konjugát - Google Patents

Erythropoetinový konjugát Download PDF

Info

Publication number
CZ20002386A3
CZ20002386A3 CZ20002386A CZ20002386A CZ20002386A3 CZ 20002386 A3 CZ20002386 A3 CZ 20002386A3 CZ 20002386 A CZ20002386 A CZ 20002386A CZ 20002386 A CZ20002386 A CZ 20002386A CZ 20002386 A3 CZ20002386 A3 CZ 20002386A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
thr
asn
conjugate
sequence
glycoprotein
Prior art date
Application number
CZ20002386A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ299516B6 (cs
Inventor
Pascal Sebastian Bailon
Original Assignee
F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27495518&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ20002386(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by F. Hoffmann-La Roche Ag filed Critical F. Hoffmann-La Roche Ag
Publication of CZ20002386A3 publication Critical patent/CZ20002386A3/cs
Publication of CZ299516B6 publication Critical patent/CZ299516B6/cs

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K17/00Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • A61P31/14Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18Antivirals for RNA viruses for HIV
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06Antianaemics
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505Erythropoietin [EPO]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Erythropoetinový konjugát
Oblast techniky
Vynález se týká erythropoetinového konjugátu, kompozic na jeho bázi a jejich použití.
Dosavadní stav techniky
Erythropoéza je produkce červených krvinek, která kompenzuje jejich úbytek vyvolaný destrukcí. Erythropoéza je řízeným fysiologickým mechanismem, který zpřístupňuje dostatečný počet krvinek pro správné okysličování tkání. Přirozený lidský erythropoetin (hEPO) vzniká v ledvinách a je humorálním plasmatickým faktorem, který stimuluje tvorbu červených krvinek (Carnot, P. a Deflandre, C, 1906,
C. R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev, A. J., 1953 Blood 8:
349; Reissmann, K. R., 1950, Blood 5: 372; Jacobson, L. O., Goldwasser, E., Freid, W. a Plzak L. F., 1957, Nátuře 179: 6331 až 6334). Přirozený EPO stimuluje dělení a diferenciaci determinovaných erythroidních progenitorů v kostní dřeni a uplatňuje svou biologickou aktivitu vazbou k receptorům na erythroidních prekursorech (Krantz, B. S., 1991, Blood 77, 419) .
Erythropoetin je vyráběn biosyntetický za použití technologie rekombinantní DNA (Egrie J. C., Strickland T.
W., Lané, J. et al., 1986, Immunobiol. 72, 213 až 224) a je produktem klonovaného genu lidského EPO insertovaného do buněk tkáně vaječníku čínského křečka (buněk CHO), v nichž je exprimován. Primární struktura převládající, plně upravené formy hEPO je uvedena v SEQ ID NO: 1. V této struktuře jsou dva disulfidové můstky mezi Cys7-Cys161 a Cys29-Cys33.
Molekulová hmotnost polypeptidového řetězce EPO bez cukerných zbytků je 18 236 Da. V intaktní molekule EPO asi 40 % molekulové hmotnosti připadá na sacharidové skupiny, které glykosylují protein na glykosylačních místech proteinu (Sasaki, Η., Bothner, Β., Dell, A., a Fukuda, Μ. , 1987, J. Biol. Chem. 262, 12059).
Jelikož je lidský erythropoetin nezbytný při tvorbě červených krvinek, je tento hormon užitečný při léčení krevních poruch charakterizovaných nízkou nebo defektní tvorbou červených krvinek. Klinicky se EPO používá při léčení anémie u pacientů s chronickým selháním ledvin (CRF) (Eschbach, J. W. , Egri, J. C., Downing, M. R. et al., 1987, NEJM 316, 73 až 78; Eschbach, J. W., Abdulhadi, Μ. Η., Browne, J. K. et al., 1989, Ann. Intern. Med., 111, 992; Egrie, J. C. Eschbach, J. W., McGuire, Τ., Adamson, J. W., 1988, Kidney Intl. 33, 262; Lim, V. S.; Degowin, R. L., Zavala, D. et al., 1989, Ann. Intern. Med. 110, 108 až 144), u pacientů trpících AIDS a pacientů trpících rakovinou, kteří prodělávají chemoterapii (Danna, R. Ρ., Rudnick, S. A., Abels,
R. I., MB, ed. Garnick, Erythropoietin in Clinical
Applications - An International Perspective, New York, NY, Marcel Dekker; 1990, str. 301 až 324). Biodostupnost u proteinových léčiv dostupných na trhu, jako je EPO, je však omezena jejich krátkým poločasem v plasmě a náchylností k degradaci proteasami. Tyto nedostatky brání dosažení maximální klinické účinnosti.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je erythropoetinový konjugát, přičemž tento konjugát obsahuje erythropoetinový glykoprotein s alespoň jednou volnou aminoskupinou, jehož biologická aktivita in vivo spočívá v tom, že vede buňky kostní dřeně ke zvýšení produkce retikulocytů a červených krvinek, a který je zvolen ze souboru sestávajícího z lidského erythropoetinu a jeho analogů, v nichž je sekvence lidského erythropoetinu modifikována přidáním 1 až 6 glykosylačních míst nebo přeřazením alespoň jednoho glykosylačního místa; přičemž tento glykoprotein je kovalentně vázán k n poly(ethylenglykol)ovým skupinám obecného vzorce
-co-(ch2)x-(och2ch2)m-0R, kde
-CO tj. karbonyl, každé póly(ethylenglykol)ové skupiny tvoří amidovou vazbu s jednou z výše uvedených aminoskupin;
R představuje nižší alkylskupinu;
x představuje 2 nebo 3;
m představuje asi 450 až asi 900;
n představuje 1 až 3; a n a m jsou zvoleny tak, že molekulová hmotnost konjugátu snížená o molekulovou hmotnost erythropoetinového glykoproteinu je 20 kDa až 100 kDa.
Předmětem vynálezu jsou dále kompozice, které obsahují konjugáty popsané výše, přičemž podíl konjugátů, kde n představuje číslo 1, v kompozici je alespoň 90 %.
Ve srovnání s nemodifikovaným EPO (tj. EPO bez navázaného PEG) a obvyklými konjugáty PEG-EPO, konjugáty podle vynálezu vykazují prodloužený poločas cirkulace a prodlouženou dobu setrvání v plasmě, sníženou clearanci a • 4
I 4 » 4
4 4
• 4 4 zvýšenou klinickou aktivitu in vivo. Konjugát podle vynálezu má stejné využití jako EPO. Konkrétně je konjugát podle vynálezu užitečný při léčení pacientů stimulací dělení a diferenciací determinovaných erythroidních progenitorů v kostní dřeni stejně jako EPO.
Následuje podrobnější popis vynálezu.
Předmětem vynálezu je erythropoetinový konjugát, přičemž tento konjugát obsahuje erythropoetinový glykoprotein s alespoň jednou volnou aminoskupinou, jehož biologická aktivita in vivo spočívá v tom, že vede buňky kostní dřeně ke zvýšení produkce retikulocytů a červených krvinek, a který je zvolen ze souboru sestávajícího z lidského erythropoetinu a jeho analogů, v nichž je sekvence lidského erythropoetinu modifikována přidáním 1 až 6 glykosylačních míst nebo přeřazením alespoň jednoho glykosylačního místa; přičemž tento glykoprotein je kovalentně vázán k n poly(ethylenglykol)ovým skupinám obecného vzorce
-co-(ch2)x-(och2ch2)m0R, kde
-CO tj. karbonyl, každé póly(ethylenglykol)ové skupiny tvoří amidovou vazbu s jednou z výše uvedených aminoskupin;
R představuje nižší alkylskupinu;
x představuje 2 nebo 3;
m představuje asi 450 až asi 900;
n představuje 1 až 3; a n a m jsou zvoleny tak, že molekulová hmotnost konjugátu snížená o molekulovou hmotnost erythropoetinového glykoproteinu je 20 kDa až 100 kDa.
Bylo zjištěno, že konjugáty podle vynálezu je možno používat stejně jako nemodifikovaný EPO. Tyto konjugáty však vykazují prodloužený poločas cirkulace a prodlouženou dobu setrvání v plasmě, sníženou clearanci a zvýšenou klinickou aktivitu in vivo. Vzhledem k těmto zlepšeným vlastnostem je konjugáty podle vynálezu možno podávat jednou týdně, namísto podávání třikrát týdně u nemodifikovaného EPO. Předpokládá se, že následkem snížené četnosti podávání bude zvýšení kompliance u pacientů, které dále povede ke zlepšeným výsledkům léčení a zvýšené kvalitě života pacientů. Bylo zjištěno, že ve srovnání s obvyklými konjugáty EPO vázaného k polyethylenglykolu, konjugáty s molekulovou hmotností a linkerovou strukturou konjugátů podle tohoto vynálezu vykazují zlepšenou účinnost, stabilitu, AUC, zlepšený poločas cirkulace a profil nákladů realizovaného zboží.
Konjugáty podle tohoto vynálezu je možno podávat v terapeuticky účinných dávkách pacientům stejným způsobem, jakým je podáván EPO. Terapeuticky účinné množství je takové množství konjugátu, které je nezbytné pro dosažení biologické aktivity in vivo, jež vede buňky kostní dřeně ke zvýšení produkce retikulocytů a červených krvinek. Přesné množství je záležitostí přednostní volby, v závislosti na takových faktorech, jako jsou přesný typ léčeného stavu, stav léčeného pacienta a také ostatní složky kompozice. Je například možno tento konjugát podávat v dávkách 0,01 až 10 gg/kg tělesné hmotnosti, přednostně 0,1 až 1 gg/kg tělesné hmotnosti, například jednou týdně.
Je možno připravovat farmaceutické kompozice obsahující konjugát podle vynálezu v účinné koncentraci, které
se budou podávat různými způsoby humánním pacientům, kteří mají v anamnéze krevní poruchy charakterizované nízkou nebo defektní tvorbou červených krvinek. Průměrné terapeuticky účinné množství konjugátu může kolísat a v konkrétním případě by mělo být založeno na doporučení a předpisu od kvalifikovaného ošetřujícího lékaře.
Produkty na bázi erythropoetinového glykoproteinu podle tohoto vynálezu je možno připravovat ve formě farmaceutických kompozic vhodných pro injekční podávání za použití farmaceuticky vhodných nosičů nebo vehikulí známých v tomto oboru. Vhodné kompozice jsou například popsány ve W097/09996, W097/40850, W098/58660 a W099/07401. Jako farmaceuticky vhodné nosiče, kterých se přednostně používá při formulaci produktů podle vynálezu, je možno uvést humánní sérový albumin, humání plasmové proteiny atd. Sloučeniny podle vynálezu je možno připravovat v lOmM pufru na bázi fosforečnanu sodného/draselného o pH 7, který obsahuje činidlo upravující tonicitu, například 132mM chlorid sodný. Farmaceutické kompozice mohou popřípadě obsahovat konzervační látky. Farmaceutická kompozice může obsahovat různá množství erythropoetinu, například 10 až 1000 gg/ml, například 50 gg nebo 400 gg.
Pod pojmem erythropoetin nebo EPO se rozumí glykoprotein s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO:1 nebo SEQ ID NO: 2 nebo aminokyselinovou sekvencí, která je s nimi v podstatě homologní, jehož biologické vlastnosti spočívají ve stimulaci produkce červených krvinek a stimulaci dělení a diferenciace determinovaných erythroidních progenitorů v kostní dřeni. Do rozsahu těchto pojmů, jak se jich používá v tomto textu, spadají takové proteiny modifikované záměrně, jako jsou proteiny modifikované místně cílenou mutagenezí, nebo náhodně modifikované mutacemi. Do rozsahu těchto pojmů také spadají analoga s 1 až 6 přidav• · · »· · · • · · • 9 99 ·
• · · · · nými glykosylačními místy, analoga s alespoň jednou přídavnou aminokyselinou na karboxylovém konci glykoproteinu, v nichž přídavná aminokyselina obsahuje alespoň jedno glykosylační místo, a analoga s aminokyselinovou sekvencí, která zahrnuje přeřazení alespoň jednoho místa pro glykosylaci. Pod těmito pojmy se rozumí jak přirozený, tak i rekombinantní lidský erythropoetin.
Erythropoetinové konjugáty podle vynálezu lze znázornit obecným vzorcem I
P-[NHCO-(CH2)χ-(OCH2CH2)m-0R]n (I) kde x, m, n a R mají výše uvedený význam, a P představuje zbytek erythropoetinového glykoproteinu popsaný v tomto textu (tj. bez aminoskupiny nebo aminoskupin, které tvoří amidovou vazbu s karbonylem znázorněným v obecném vzorci I) vykazující biologickou aktivitu, která spočívá v tom, že vede buňky kostní dřeně ke zvýšení produkce retikulocytů a červených krvinek.
V přednostním provedení tohoto vynálezu R představuje methylskupinu. Hodnota m je přednostně asi 650 až 750 a n je přednostně 1.
V nejvýhodnějším provedení tohoto vynálezu R představuje methylskupinu, m představuje asi 650 až asi 750 a n představuje číslo 1, tzn. že konjugát definovaný výše odpovídá obecnému vzorci [CH3O(CH2CH2O)mCH2CH2CH2CO-NH]n-P kde m představuje 650 až 750, n představuje 1 a P má výše uvedený význam. V přednostním provedení je m průměrně asi
680.
Glykoproteinem konjugátů definovaných výše je přednostně lidský erythropoetin. Lidský erythropoetin a analogické proteiny definované výše mohou být exprimovány aktivací endogenního genu. Přednostní lidské erythropoetinové glykoproteiny mají sekvenci odpovídající SEQ ID NO:
a SEQ ID NO: 2, zvláště pak SEQ ID NO: 1.
P může být zvolen ze souboru sestávajícího ze zbytků lidského erythropoetinu a jeho analog s 1 až 6 přídavnými glykosylačními místy. Jak je podrobněji popsáno dále, připrava a čištění EPO jsou v tomto oboru dobře známy. Pod pojmem EPO se rozumí přirozený nebo rekombinantní protein, přednostně lidský, jak byl získán z jakéhokoliv obvyklého zdroje, jako jsou tkáně, syntéza proteinu, buněčná kultura s přirozenými nebo rekombinantními buňkami. Do rozsahu tohoto pojmu spadá jakýkoliv protein, který vykazuje aktivitu EPO, jako jsou muteiny nebo jinak modifikované proteiny. Rekombinantní EPO je možno připravovat expresí v buněčných liniích CHO, BHK nebo HeLa, postupem s rekombinantní DNA nebo aktivací endogenního genu. Exprese proteinů, včetně EPO aktivací endogenního genu je v tomto oboru dobře známa a je popsána na příklad v US patentech č. 5 733 761,
641 670 a 5 733 746 a mezinárodních patentových přihláškách WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354,
WO 91/06667 a WO 91/09955, které jsou citovány náhradou za přenesení celého jejich obsahu do tohoto textu. Přednostními druhy EPO při výrobě erythropoetinových glykoproteinových produktů jsou druhy lidského EPO. Jako druhu EPO se větší přednost dává lidskému EPO s aminokyselinovou sekvencí znázorněnou v SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 2, výhodněji aminokyselinovou sekvencí znázorněnou v SEQ ID NO: 1.
V jednom provedení P může představovat zbytek glykoproteinového analogu s 1 až 6 přídavnými glykosylačními místy. Ke glykosylaci proteinu jedním zbytkem oligosacharidu ·· • * « ·
949 9 nebo více zbytky oligosacharidu dochází na specifických místech hlavního řetězce polypeptidu, a významně ovlivňuje fyzikální vlastnosti proteinu, jako je stabilita, sekrece, subcelulární lokalizace a biologická aktivita proteinu. Obvykle se vyskytují dva typy glykosylace. O-vázané oligosacharidy jsou navázány ke zbytkům šeřinu nebo threoninu a N-vázané oligosacharidy jsou navázány ke zbytkům asparaginu. Jeden typ oligosacharidu, který může být jak N-vázaný, tak O-vázaný, představuje N-acetylneuraminová kyselina (sialová kyselina), což je třída aminocukrů obsahujících 9 nebo více atomů uhlíku. Sialová kyselina je obvykle terminálním zbytkem N-vázaných i O-vázaných oligosacharidů a jelikož nese negativní náboj, propůjčuje oligosacharidu kyselé vlastnosti. Lidský erythropoetin se 165 aminokyselinami obsahuje tři N-vázané oligosacharidové řetězce a jeden O-vázaný oligosacharidový řetězec, které tvoří asi 40 % celkové molekulové hmotnosti glykoproteinu. N-vázaná glykosylace se vyskytuje na asparaginových zbytcích v polohách 24, 38 a 83 a 0-vázaná glykosylace se vyskytuje na serinovém zbytku v poloze 126. Oligosacharidové řetězce jsou modifikovány terminálními zbytky sialové kyseliny. Enzymatické odstranění všech zbytků sialové kyseliny z glykosylovaného erythropoetinu vede ke ztrátě aktivity in vivo, nikoliv však in vitro, jelikož sialylace erythropoetinu brání jeho vazbě, a následné clearanci, hepatickým vazebným proteinem.
Glykoproteiny podle tohoto vynálezu zahrnují analoga lidského erythropoetinu s aminokyselinovou sekvencí lidského erythropoetinu, v níž je provedena jedna změna nebo větší počet změn, což vede ke zvýšení počtu míst pro navázání sialové kyseliny. Tato glykoproteinová analoga je možno připravovat místně cílenou mutagenesí zahrnující přidání, deleci nebo náhradu aminokyselinových zbytků, kterou se zvyšují nebo pozměňují místa, která jsou dostupná pro glykosy10 ·· · ** .
♦ · · · ·· t · * * ♦· • · · · * * 9 ·
111 1 1 11111
1 11 111
111 11 911 1911 11 111 láci. Glykoproteinová analoga, v nichž je úroveň sialové kyseliny vyšší, než je její úroveň v lidském erythropoetinu se obvykle připravují přidáním glykosylačních míst, která nenarušují sekundární nebo terciární konformaci, která je nutná pro biologickou aktivitu. Do glykoproteinů podle vynálezu také spadají analoga se zvýšenou úrovní navázání sacharidů v glykosylačním místě, která obvykle obsahují substituci jedné nebo více aminokyselin v těsné blízkosti N-vázaného nebo O-vázaného místa. Glykoproteiny podle tohoto vynálezu také zahrnují analoga obsahující jednu nebo více aminokyselin, které prodlužují karboxylový konec erythropoetinu a poskytují alespoň jedno přídavné sacharidové místo. Do glykoproteinů podle tohoto vynálezu také spadají analoga s aminokyselinovou sekvencí, která obsahuje přeřazení alespoň jednoho glykosylačního místa. Takové přeřazení glykosylačního místa zahrnuje deleci jednoho nebo většího počtu glykosylačních míst v lidském erythropoetinu a přidání jednoho nebo většího počtu nepřirozených glykosylačních míst. Zvýšením počtu sacharidových řetězců na erythropoetinu, a tedy počtu sialových kyselin na molekulu erythropoetinu, se může dosáhnout výhodných vlastností, jako je zvýšená rozpustnost, větší resistence vůči proteolýze, snížená imunogenicita, prodloužený poločas v séru a zvýšená biologická aktivita. Erythropoetinová analoga s přídavnými glykosylačními místy jsou podrobněji popsána v evropské patentové přihlášce 640 619 (Elliot), zveřejněné 1. března 1995.
V přednostním provedení glykoproteiny podle tohoto vynálezu zahrnují aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje alespoň jedno přídavné glykosylační místo. Jako neomezující příklady takových glykoproteinů je možno uvést erythropoetin, který zahrnuje sekvenci lidského erythropoetinu, jež je změněna modifikací zvolenou ze souboru sestávajícího z • Φ • 4 • ··
9 Φ Φ
ΦΦΦ Φ 99 Φ 4
Φ Φ
ΦΦΦ Φ Φ 4
Asn30Thr32;
Asn51Thr53,
Asn57Thr59;
Asn69;
Asn69Thr71;
Ser68Asn69Thr71;
Val87Asn88Thr90;
Ser87Asn88Thr90;
Ser87Asn88Gly89Thr90;
Ser87Asn88Thr90Thr92;
Ser87Asn88Thr90Ala162;
Asn69Thr71Ser87ASn88Thr90;
Asn30Thr32Val87Asn88Thr90;
Asn89Ile90Thr91;
Ser87Asn89Ile90Thr91;
Asn136Thr138;
Asn138Thr140;
Thr125; a Pro124Thr125.
Záznam, kterého se zde používá pro popis modifikací aminokyselinové sekvence vyjadřuje, že v poloze v odpovídajícím nemodifikovaném proteinu (například hEPO o SEQ ID NO:
nebo SEQ ID NO: 2) vyjádřené horním indexem byla provedena změna na aminokyselinu uvedenou bezprostředně před tímto horním indexem.
Glykoproteinem také může být analog s alespoň jednou přídavnou aminokyselinou na svém karboxylovém konci, přičemž tato přídavná aminokyselina obsahuje alespoň jedno glykosylační místo, tzn. že konjugát definovaný výše se také vztahuje na sloučeniny, kde glykoprotein má sekvenci, která zahrnuje sekvenci lidského erythropoetinu, a druhou sekvenci na karboxylovém konci sekvence lidského erythropoetinu, přičemž tato druhá sekvence obsahuje alespoň jedno glykosy• ·· • Φ · ft • · · • ··· 9
9
999 99
49 99
4 4 4 4
9 4 4
9 4 9 4
4 4 4 lační místo. Přídavná aminokyselina může obsahovat peptidový fragment odvozený od karboxylového konce lidského choriového gonadotropinu. V přednostním provedení je glykoproteinem analog zvolený ze souboru sestávajícího ze (a) lidského erythropoetinu s aminokyselinovou sekvencí Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gin (SEQ ID NO: 3), připojenou ke karboxylovému konci; (b) analog definovaný v odstavci (a), který dále obsahuje Ser87 Asn88 Thr90 EPO; a (c) analog definovaný v odstavci (a), který dále obsahuje Asn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90 EPO.
Glykoproteinem také může být analog s aminokyselinovou sekvencí, která zahrnuje přeřazení alespoň jedno glykosylačního místa. Přeřazení může představovat deleci jakéhokoliv N-vázaného cukerného místa v lidském erythropoetinu a přidání N-vázaného sacharidového místa v poloze 88 aminokyselinové sekvence lidského erythropoetinu.
V přednostním provedení je glykoproteinem analog zvolený ze souboru sestávajícího z Gin24 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; Gin38 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; a Gin83 Ser87 Asn88 Thr90 EPO.
Pod pojmem nižší alkyl se v tomto textu rozumí přímá nebo rozvětvená alkylskupina s 1 až 6 atomy uhlíku. Jako příklady nižších alkylskupin je možno uvést methyl-, ethyl- a isopropylskupinu. Podle tohoto vynálezu R představuje jakýkoliv nižší alkyl. Přednost se dává konjugátům, kde R představuje methylskupinu.
Symbol m představuje počet ethylenoxidových zbytků (OCH2CH2) v poly(ethylenoxid)ové skupině. Jednoduchá ethylenoxidová PEG podjednotka má molekulovou hmotnost asi 44 Da. Molekulová hmotnost konjugátu (nezahrnující molekulovou hmotnost EPO) tedy závisí na hodnotě m. V konjugátech podle tohoto vynálezu m představuje asi 450 až asi • ·· • ftftft ft • ftft • ftftft ft ft ft • ftft ftft · • ft ·· ftft ftft • ftft • ftft ft • ftft ···· ··
900 (což odpovídá molekulové hmotnosti asi 20 kDa až asi 40 kDa), přednostně od asi 650 do asi 750 (což odpovídá molekulové hmotnosti asi 30 kDa). Hodnota m je zvolena tak, aby výsledný konjugát podle tohoto vynálezu vykazoval fyziologickou aktivitu srovnatelnou s nemodifikovaným EPO, přičemž tato aktivita může být stejná jako odpovídající aktivita nemodifikovaného EPO, nebo vyšší či může představovat její zlomek. Molekulová hmotnost, jejíž určitá hodnota je uvozena slovem asi znamená, že jde o hodnotu vykazující rozumný rozptyl od hodnoty stanovené obvyklými analytickými postupy. Hodnota m je zvolena tak, aby molekulová hmotnost každé poly(ethylenglykol)ové skupiny kovalentně vázané k erythropoetinovému glykoproteinu byla od asi 20 kDa do asi 40 kDa, a přednostně asi 30 kDa.
V konjugátech podle tohoto vynálezu symbol n představuje počet polyethylenglykolových skupin kovalentně vázaných k volným aminoskupinám (včetně epsílon-aminoskupin aminokyseliny lysinu a/nebo aminoskupiny na aminovém konci) erythropoetinového proteinu prostřednictvím amidové vazby či amidových vazeb. V konjugátu podle vynálezu mohou na jednu molekulu EPO připadat 1, 2 nebo 3 PEG skupiny. Symbol n představuje celé číslo v rozmezí 1 až 3, přednostně číslo 1 nebo 2, výhodněji číslo 1.
Sloučeniny obecného vzorce I je možno připravovat ze známé polymerní sloučeniny obecného vzorce II
O
RO(CH2CH2O)m(CH2)xCOON (II)
9« 00
0 0 0 0 0 0
9 0 0
0 9 0 «
0 0 ·
9909999 09 9 kde R a m mají výše uvedený význam, tak, že se sloučenina obecného vzorce II kondenzuje s erythropoetinovým glykoproteinem. Sloučeninami obecného vzorce II, kde X představuje číslo 3, jsou alfa-nižší alkoxy, máselná kyselina sukcinimidylestery poly(ethylenglykolu) (nižší alkoxy-PEG-SBA). Sloučeniny obecného vzorce II, kde x představuje číslo 2 jsou alfa-nižší alkoxy, propionová kyselina sukcinimidylestery póly(ethylenglykolu) (nižší-alkoxy-PEG-SPA). Reakci aktivovaného esteru s aminem za vzniku amidu je možno provádět jakýmkoliv obvyklým způsobem. Při výše popsané reakci je uvedený sukcinimidylester odstupující skupinou vyvolávající tvorbu amidu. Použití sukcinimidylesterů jako sloučenin obecného vzorce II při výrobě konjugátů s proteiny je popsáno v US patentu č. 5 672 662, uděleném 30. září 1997 (Harris et al.).
Lidský EPO obsahuje volných 9 aminoskupin: aminoskupinu aminového konce a epsílon-aminoskupiny 8 zbytků lysinu. Bylo zjištěno, že když se pegylační činidlo nechá reagovat s SBA sloučeninou obecného vzorce II při pH 7,5, v poměru protein : PEG 1:3a při teplotě od 20 do 25°C, vznikne směs obsahující mono- a dipegylované sloučeniny a stopová množství tripegylovaných sloučenin. Když je pegylačním činidlem SPA sloučenina obecného vzorce II, poměr protein : PEG je 1 : 2a ostatní podmínky zůstávají stejné, získají se převážně monopegylované sloučeniny. Pegylovaný EPO je možno podávat ve formě směsi nebo ve formě různě pegylovaných sloučenin rozdělených katexovou chromatografií. Se změnami reakčních podmínek (jako je například poměr reagentů, pH, teplota, koncentrace proteinu, reakční doba atd.) se relativní množství různě pegylovaných sloučenin mohou měnit.
Lidský erythropoetin (EPO) je lidský glykoprotein, který stimuluje tvorbu erythrocytů. Jeho výroba a terapeu15 ♦ 44 4 « · » · 4 4 4
444 44 444 4444 44 444 tické aplikace jsou podrobně popsány například v US paten-
těch č. 5 547 933 a 5 621 080, EP-B 0 148 605, Huang, S. L.,
Proč. Nati . Acad. Sci. USA, 1984, 2708 až 2712, EP-B
0 205 564, EP- -B 0 209 539 a EP -B 0 411 678 a také v Lai, P.
H. et al., J. Biol . Chem. 261, 1986, 3116 až 3121 a Sasaki,
H. et al., J. Biol . Chem. 262, 1987, 12059 až 12076.
Erythropoetin pro použití při léčení je možno vyrábět
rekombinantními postupy (EP-B 0 148 605, EP-B 0 209 539 a Egrie, J. C., Strickland, T. W., Lané, J. et al., 1986, Immunobiol. 72, 213 až 224).
Způsoby exprese a výroby erythropoetinu v médiu bez séra jsou popsány příklad v přihlášce WO 96/35718 (Burg), zveřejněné 14. listopadu 1996 a v evropské patentové publikaci č. 513 738 (Koch), zveřejněné 12. června 1992. Kromě těchto způsobů popsaných v uvedených publikacích je známo, že je možno provést bezsérovou fermentaci rekombinantních buněk CHO, které obsahují EPO gen. Takové způsoby jsou popsány například v EP-A 0 513 738, EP A 0 267 678 a v obecné formě v Kawamoto, T. et al., Analytical Biochem. 130 (1983) 445 až 453, EP-A 0 248 656, Kowar, J. a Franěk,
F., Methods in Enzymology 421 (1986) 277 až 292, Bavister,
Β. , Expcology 271 (1981), 45 až 51, EP-A 0 481 791, EP-A 0 307 247, EP-A 0 343 635 a WO 88/00967.
V EP-A 0 267 678 jsou popsány ionexová chromatografie na S-Sepharose, vysokotlaká kapalinová chromatografie s reversními fázemi na sloupci Cg a gelová filtrační chromatografie pro čištění EPO získaného v kultuře bez séra po dialýze. V této souvislosti lze stupeň gelové filtrační chromatografie nahradit ionexovou chromatografií na S-Sepharose Fast Flow. Před ionexovou chromatografií je také možno provést chromatografií na sloupci s barvivém Blue Trisacryl.
• *«p # »* ee » ·· · · 19 · 9 9 9 99
9 9 9 9 9 9 9
919 9 9 9 9 9 9 · • · · · 9 9 9
999 99 119 9999 99 999
Způsob čištění rekombinantního EPO je popsán v Nobuo, I. et al., J. Biochem. 107, 1990, 352 až 359. Při tomto postupu se však před provedením purifikačního stupně EPO zpracovává roztokem Tween^R^20, fenylmethylsulfonylchloridu, ethylmaleinimidu, pepstatinu A, síranu měďnatého a kyseliny oxamové. Publikace, včetně WO 96/35718 (Burg), zveřejněné 14. listopadu 1996, popisují způsob výroby erythropoetinu fermentací bez séra (EPOsf).
Specifickou aktivitu EPO nebo EPO konjugátů podle tohoto vynálezu je možno stanovit za použití různých zkoušek známých v tomto oboru. Biologická aktivita purifikovaných EPO proteinů podle tohoto vynálezu je taková, že injekční podání EPO proteinu humánnímu pacientovi vede u buněk kostní dřeně k produkci retikulocytů a červených krvinek, která je oproti kontrolním skupinám subjektů zvýšena. Biologickou aktivitu EPO proteinů nebo jejich fragmentů, které byly získány a purifikovány podle tohoto vynálezu, je možno zkoušet postupy popsanými v Annable et al., Bull. Wld. Hlth. Org., 1972, 47, 99 až 112 a Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio, 1977, 2. Jiná biologická zkouška stanovení aktivity EPO proteinu, zkouška na normocytních myších, je popsána v příkladu 4.
Předmětem vynálezu jsou také kompozice, které obsahují výše popsané konjugáty. Kompozici obsahující alespoň 90 % mono-PEG konjugátů, tj. v nichž n představuje číslo 1, je možno připravit způsobem popsaným v příkladu 5. Běžně jsou žádoucí mono-PEG konjugáty erythropoetinových glykoproteinů, jelikož obvykle mají vyšší aktivitu než di-PEG konjugáty. Procentní podíl mono-PEG konjugátu, jakož i poměr mono- a di-PEG produktů lze regulovat: za účelem snížení procentního podílu mono-PEG produktu se shromažďuje širší rozmezí frakcí okolo elučního píku, nebo za účelem zvýšení procentního podílu mono-PEG produktu se shromažďuje užší
0 ·· • 94 94 9
·· 4 * 94 9 9 9 9 99
• · · 9 4 9 4
• ··» 0 4 4 9 » ·
0 · 4 9 * 4
000 94 494 4494 94 44
rozmezí frakcí okolo elučního píku. U kompozic s 90% podílem mono-PEG konjugátů je dobře vyvážen poměr výtěžek/aktivita. Někdy však mohou být potřebné kompozice s konjugáty, z nichž alespoň 92 nebo alespoň 96 % tvoří mono-PEG konjugáty (tj. kde n představuje číslo 1). V provedení podle tohoto vynálezu činí podíl konjugátů, kde n představuje číslo 1, až 96 %.
Předmětem vynálezu jsou dále odpovídající farmaceutické kompozice, jejichž podstata spočívá v tom, že obsahují konjugát nebo kompozici, které jsou definovány výše, a farmaceuticky vhodný excipient.
Konjugáty a kompozice podle tohoto vynálezu jsou zvláště užitečné při výrobě léčivých přípravků pro léčení nebo prevenci chorob, které souvisejí s anémií u pacientů s chronickým selháním ledvin (CRF), AIDS a u pacientů, kteří prodělávají chemoterapii při léčení rakoviny.
Předmětem vynálezu je také způsob preventivního nebo kurativního léčení poruch zahrnujících anémií u pacientů s chronickým selháním ledvin (CRF) nebo AIDS a u pacientů, kteří prodělávají chemoterapii při léčení rakoviny, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje stupeň, při němž se pacientu podává výše definovaná kompozice.
Dále je předmětem vynálezu způsob výroby sloučenin definovaných výše, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje kondenzaci sloučeniny obecného vzorce II
(II)
kde R, m a x mají výše uvedený význam;
s erythropoetinovým glykoproteinem.
Předmětem vynálezu jsou dále sloučeniny definované výše pro léčení chorob, které souvisejí s anémií u pacientů s chronickým selháním ledvin (CRF) nebo AIDS a u pacientů, kteří prodělávají chemoterapii při léčení rakoviny.
Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Fermentace a purifikace lidského EPO
a) Příprava inokula a fermentace
Jedna lahvička Working Cell Bank obsahující buňky, které pocházejí z CHO buněčné linie produkující EPO (je možno použít ATCC CRL8695, popsané v EP 411 678, Genetics Institute) se vyjme z plynné fáze tanku pro ukládání v kapalném dusíku. Buňky se umístí do skleněných rotačních nádob a kultivují v médiu pufrovaném hydrogenuhličitanem v inkubátoru se zvlhčenou atmosférou CO2. Obvyklá bezsérová média používaná pro přípravu inokula a fermentaci jsou popsána v evropské patentové přihlášce 513 738 (Koch), zveřejněné 12. června 1992, nebo WO 96/35718 (Burg), zveřejněné 14. listopadu 1996. Tato média například obsahují DMEM/F12 (např. JRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, US, pořadové číslo 57-736) a navíc hydrogenuhličitan sodný, L-(+)-glutamin, D-(+)-glukosu, rekombinantní inzulín, selenit sodný, diaminobutan, hydrokortizon, síran železnatý, asparagin, asparagovou kyselinu, serin a stabilizátor pro savčí buňky, jako je například polyvinylalkohol, methylcelulosa, polydextran, polyethylenglykol, Pluronic F68, plasmový expandér polygelin (HEMACCEL(R>) nebo polyvinylpyrrolidon (WO 96/35718).
Kultury se podrobí mikroskopické kontrole ohledně nepřítomnosti kontaminujících mikroorganismů a stanoví se buněčná densita. Tyto zkoušky se provádějí při každém stupni dělení.
Po počátečním období růstu se buněčná kultura zředí čerstvým médiem na výchozí buněčnou densitu a nechá projít dalším růstovým cyklem. Tento postup se opakuje, dokud se nezíská kultura v objemu asi 2 litrů na skleněnou rotační nádobu. Po asi 12 zdvojeních je dostupných 1 až 5 litrů této kultury, kterou je možno použít jako inokula pro lOlitrový inokulační fermentor.
Po 3 až 5 dnech je kultury z lOlitrového fermentoru možno použít jako inokula pro lOOlitrový inokulační fermentor.
Po dalších 3 až 5 dnech kultivace je kultury ze lOOlitrového fermentoru možno použít jako inokula pro lOOOlitrový produkční fermentor.
b) Sklizeň a separace buněk
Po dosažení požadované buněčné denzity se sklidí asi 80 % kultury. Zbytek kultury se doplní čerstvým kultivačním médiem a kultivuje do následující sklizně. Jeden produkční cyklus sestává maximálně z 10 následných sklizní:
9 9
9* 9 9 · · *
9 · «
9 9 částečných sklizní a 1 úplné sklizně na Sklizeň se provádí každé 3 až 4 dny.
závěr fermentace.
Stanovený objem sklizených buněk se přemístí do chlazené nádoby. Buňky se odstraní centrifugací nebo filtrací a zahodí. Supernatant z centrifugačního stupně obsahující EPO se přefiltruje přes filtr zapojený v sérii a shromáždí do druhé chlazené nádoby. Každá sklizeň se podrobí separačnímu postupu odděleně.
Typický postup purifikace EPO proteinu je popsán v WO96/35718 (Burg), zveřejněné 14. listopadu 1996. Popis tohoto purifikačního postupu následuje.
a) Chromatografie na Blue Sepharose
Blue Sepharose (Pharmacia) je tvořena perlami Sepharose, k jejichž povrchu je kovalentně navázána modř Cibacron. Jelikož vazba EPO k Blue Sepharose je silnější než vazba většiny nebílkovinných kontaminantů, některých nečistot bílkovinné povahy a PVA, je v tomto stupni možno získat produkt obohacený EPO. Eluce sloupce Blue Sepharose se provádí za zvyšující se koncentrace soli a hodnoty pH.
Sloupec se naplní 80 až 100 litry Blue Sepharose, regeneruje hydroxidem sodným a ekvilibruje ekvilibračním pufrem (chlorid sodný/vápenatý a octan sodný). Do sloupce se uvede okyselený a přefiltrovaný supernatant z fermentoru. Poté se sloupec promyje nejprve pufrem podobným ekvilibračnímu pufru, který obsahuje vyšší koncentraci chloridu sodného a následně pufrem Tris-báze. Produkt se eluuje pufrem Tris-báze a shromáždí v jediné frakci v souladu se vzorovým elučním profilem.
b) Chromatografie na Butyl Toyopearl
Butyl Toyopearl 650 C (Toso Haas) tvoří matrice na bázi polystyrenu, k níž jsou kovalentně vázány alifatické butylové zbytky. Jelikož vazba EPO k tomuto gelu je silnější než vazba většiny nečistot a PVA, musí se eluovat pufrem obsahujícím isopropylalkohol.
Sloupec se naplní 30 až 40 litry Butyl Toyopearl 650 C, regeneruje hydroxidem sodným, promyje pufrem Tris-báze a ekvilibruje pufrem Tris-báze obsahujícím isopropylalkohol.
Eluát ze sloupce Blue Sepharose se nastaví na koncentrací isopropylalkoholu v pufru použitém pro ekvilibraci sloupce a uvede do sloupce. Sloupec se promyje ekvilibračním pufrem se zvýšenou koncentrací isopropylalkoholu. Produkt se eluuje elučním pufrem (pufr Tris-báze s vysokým obsahem isopropylalkoholu) a shromáždí v jediné frakci v souladu se vzorovým elučním profilem.
c) Chromatografie na Hydroxyapatite Ultrogel
Hydroxyapatite Ultrogel (Biosepra) je tvořen hydroxyapatitem, který je z důvodu zlepšení mechanických vlastností začleněn do agarosové matrice. EPO má nízkou afinitu k hydroxyapatitu, a lze ho tedy eluovat při nižší koncentraci fosforečnanu než proteinové nečistoty.
Sloupec se naplní 30 až 40 litry Hydroxyapatite Ultrogel a regeneruje pufrem na bázi fosforečnan draselného/chloridu vápenatého a NaOH a následně pufrem Tris-báze. Poté se sloupec ekvilibruje pufrem Tris-báze obsahujícím malé množství isopropylalkoholu a chloridu sodného.
β» • · · · · • · · 4 4
4 ·
- ι ··: · • · · · · ·
Eluát z chromatografie na sloupci Butyl Toyopearl obsahující EPO se uvede do sloupce. Sloupec se poté promyje ekvilibračním pufrem a pufrem Tris-báze bez isopropylalkoholu a chloridu sodného. Produkt se eluuje pufrem Tris-báze obsahujícím fosforečnan draselný v nízké koncentraci a shromáždí v jediné frakci v souladu se vzorovým elučním profilem.
d) Vysokotlaká kapalinová chromatografie s obrácenými fázemi (RP-HPLC) na sloupci Vydac C4
Látka pro RP-HPLC Vydac C4 (Vydac) je tvořena silikagelovými částicemi, jejichž povrch nese alkylové řetězce se 4 atomy uhlíku. Oddělování EPO od nečistot proteinové povahy je založeno na odlišnostech v síle hydrofobních interakcí. Eluce se provádí gradientem acetonitrilu ve zředěné trifluoroctové kyselině.
Preparativní HPLC se provádí za použití kolony z nerezové oceli (naplněné 2,8 až 3,2 litru silikagelu Vydac C4). Eluát získaný chromatografií na Hydroxyapatite Ultrogel se okyselí přidáním trifluoroctové kyseliny a uvede do sloupce Vydac C4. Pro propláchnutí a eluci se použije gradientu acetonitrilu ve zředěné trifluoroctové kyselině. Frakce se shromáždí a ihned zneutralizuji fosforečnanovým pufrem. Shromažďují se frakce EPO, které jsou v rozmezí IPC.
e) Chromatografie na DEAE Sepharose
Látka DEAE Sepharose (Pharmacia) je tvořena perlami Sepharose, k jejichž povrchu jsou kovalentně navázány diethylaminoethylskupiny (DEAE). Vazba EPO ke skupinám DEAE je zprostředkována iontovými interakcemi. Sloupcem se bez zadržování nechá procházet acetonitril a trifluoroctová kyselina. Poté, co se tyto látky vymyjí, se sloupec « · · · promyje acetátovým pufrem o nízkém pH, čímž se odstraní stopové nečistoty, načež se sloupec promyje neutrálním fosforečnanovým pufrem a EPO se eluuje pufrem se zvýšenou iontovou silou.
Sloupec se naplní látkou DEAE Sepharose Fast Flow. Objem sloupce se nastaví tak, aby se zajistilo, že na 3 až lOmg dávku EPO bude připadat 1 ml gelu. Sloupec se promyje vodou a ekvilibračním pufrem (fosforečnan sodný/draselný). Shromážděné frakce HPLC eluátu se uvedou do sloupce a sloupec se promyje ekvilibračním pufrem. Poté se sloupec promyje promývacím pufrem (pufr na bázi octanu sodného) a dále ekvilibračním pufrem. Následně se ze sloupce elučním pufrem (chlorid sodný, fosforečnan sodný/draselný) eluuje EPO, který se shromáždí v jediné frakci v souladu se vzorovým elučním profilem.
Eluát ze sloupce DEAE Sepharose se nastaví na specifikovanou vodivost. Výsledné léčivo se přefiltruje za sterilních podmínek do teflonových nádob a skladuje při -70°C.
Příklad 2
Pegylace EPO pomocí mPEG-SBA
EPO purifikovaný způsobem bez séra popsaným v příkladu 1 (EPOsf) je podle analýz homogenní a vykazuje typický profil tvořený 8 isoformami. Jeho specifická biologická aktivita stanovená na normocytních myších je 190 000 IU/mg. Jako pegylačního činidla se použije methoxy-PEG-SBA, což je sloučenina obecného vzorce II, kde R představuje methylskupinu; x představuje číslo 3; a m představuje číslo 650 až 750 (průměrně asi 680, což odpovídá průměrné molekulové hmotnosti asi 30 kDa).
··· · • · ·
Pegylační reakce
Ke 100 mg EPOsf (9,71 ml zásobního roztoku EPOsf o koncentraci 10,3 mg/ml, 5,48 μιηοΐ) se přidá 10 ml O,1M pufru obsahujícího fosforečnan draselný (pH 7,5) s obsahem 506 mg 30kDa methoxy-PEG-SBA (16,5 μιηοΐ) (od firmy Shearwater Polymers, lne., Huntsville, Alabama, USA). Vzniklá směs se 2 hodiny míchá při teplotě místnosti (20 až 23°C). Konečná koncentrace proteinu je 5 mg/ml a poměr protein : PEG činidlo je 1 : 3. Po 2 hodinách se reakce zastaví nastavením pH na hodnotu 4,5 za použití ledové kyseliny octové. Produkt se uchovává při -20°C až do purifikace.
Purifikace
1. Konjugátová směs
Asi 28 ml SP-Sepharose FF (sulfo-propylová katexová pryskyřice) se naplní do skleněné kolony Amicon (2,2 x 7,5 cm) a ekvilibruje 20mM acetátovým pufrem (pH 4,5) při rychlosti průtoku 150 ml/h. 6 ml reakční směsi obsahující 30 mg proteinu se pětinásobně zředí ekvilibračním pufrem a uvede do sloupce. Neadsorbované látky se odplaví pufrem a adsorbovaná PEG konjugátová směs se ze sloupce eluuje 0,175M chloridem sodným v ekvilibračním pufru. Nemodifikovaný EPOsf, který ještě zůstal ve sloupci, se eluuje 750mM chloridem sodným. Sloupec se reekvilibruje výchozím pufrem. Vzorky se analyzují postupem SDS-PAGE a stanoví se stupeň jejich pegylace. Zjistilo se, že eluát získaný za použití 0,175M chloridu sodného obsahuje monopegylované a dipegylované produkty a stopová množství tripegylovaných produktů, zatímco eluát získaný za použití 750mM chloridu sodného obsahuje nemodifikovaný EPOsf.
•9 · ·· «♦ ♦ » ···» • · · * * * • · · · · · · · v • · · · ·
2. Di-PEG a mono-PEG-EPOsf
Purifikovaná konjugátová směs eluovaná ze sloupce v předchozím stupni se čtyřnásobně zředí pufrem a znovu uvede do sloupce a promyje popsaným způsobem. Ze sloupce se odděleně eluuje O,1M chloridem sodným di-PEG-EPOsf a 0,175M chloridem sodným mono-PEG-EPOsf. Eluce se také provádí pomocí 750mM roztoku chloridu sodného, čímž se eluuje všechen zbytkový nemodifikovaný EPOsf.
Alternativně se reakční směs pětinásobně zředí acetátovým pufrem a uvede do sloupce SP-Sepharose (asi 0,5 mg proteinu/ml gelu). Sloupec se promyje a naadsorbovaný mono-PEG-EPOsf, di-PEG-EPOsf a nemodifikovaný EPOsf se eluují postupem popsaným v předchozím textu.
Výsledky
PEG-EPOsf se syntetizuje chemicky konjugací lineární molekuly PEG s průměrnou molekulovou hmotností 30kDa. PEG-EPOsf vzniká reakcí mezi primárními aminoskupinami EPOsf a sukcinimidylesterovým derivátem 30kDa PEG-máselné kyseliny, která vede k amidové vazbě.
Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce 1. Purifikovaná konjugátová směs podle analýzy SDS-PAGE obsahuje mono- a di-PEG-EPOsf a neobsahuje nemodifikovaný EPOsf. Výtěžek konjugátové směsi činí 23,4 mg či 78 %, vztaženo na výchozí látku. Katexová chromatografická separace monoa di-PEG-EPOsf ukázala, že poměr mono- a di-PEG-EPOsf v konjugátové směsi je téměř 1 : 1. Po dokončení reakce je poměr jednotlivých složek mono-PEG : di-PEG : nemodifikovaný EPOsf 40 : 38 : 20 (%). Celkový výtěžek je téměř kvantitativní.
Tabulka 1
Souhrn výsledků pegylace EPOsf
Vzorek Protein (mg) Výtěžek
Rxn směs 30 100
Mono 12,0 40
Di 11,4 38
Nemodifikovaný 6,0 20
Konjug. směs 23,4 78
Příklad 3
Pegylace EPO za použití mPEG-SPA
Alikvot EPOsf, odlišný od alikvotu použitého při postupu podle příkladu 2, se nechá reagovat s 30kDa methoxy-PEG-SPA (Shearwater Polymers, lne., Huntsville, Alabama, USA). Reakce se provádí při poměru protein:činidlo 1:2a čištění se provádí způsobem popsaným v příkladu 2. Získá se převážně mono-pegylováný produkt.
Příklad 4
Aktivita pegylovaného EPO in vivo stanovená zkouškou na normocytních myších
Biostanovení na normocytních myších je v tomto oboru známé (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)) a postup je popsán v monografii o erythropoetinu Ph. Eur. BRP. Vzorky se zředí BSA-PBS. Normálním zdravým myším o stáří 7 až 15 týdnů se subkutánně podá 0,2 ml EPO frakce obsahující nepegylovaný EPO nebo tri-, dinebo mono-pegylovaný EPO získaný podle příkladu 2 nebo 3.
• · ♦ * ·· · · « *·· • · · « ·«·· • ··« · · · · # · « • · · · · · · «·· ·· ·♦· ···♦ «· «··
Během 6 dní se napíchnutím ocasní žíly odebírá krev.
Odebraná krev se ředí tak, že v 1 ml 0,15μΜ akridinového oranžového barvicího roztoku je 1 μΐ krve. Doba barvení je 3 až 10 minut. Retikulocyty se spočítají mikrofluorometricky v průtokovém cytometru analýzou červeného fluorescenčního histogramu. Počty retikulocytů se uvádějí v absolutních číslech (na 30 000 analyzovaných krvinek). Každou skupinu tvoří 5 myší za den a krev se odebírá jednou denně.
Myším se při odděleně prováděných zkouškách podá jediná dávka nemodifikovaného EPO (25 ng EPO), směs PEG(SBA)-EPO získaná podle příkladu 2 (10 ng konjugátu), mono- a di-pegylovaný EPOsf získaný podle příkladu 2 (10 ng konjugátu), PEG(SPA)-EPO získaný podle příkladu 3 (10 ng konjugátu) a pufrovací roztok. Výsledky jsou znázorněny v tabulce 2. Výsledky ukazují vyšší aktivitu a prodloužený poločas pegylovaných EPO produktů, což je doloženo významným zvýšením počtu retikulocytů a posunem maximálního počtu
retikulocytů za použití stejné dávky na myš (10 ng) ve
srovnání s 25ng dávkou nemodifikovaného EPO.
T a b u 1 k a 2
EPO ne- 3 0kDa Mono Di PEG-EPO Kontrola
modifi- SPA 30K 30K SBA kon- pufr
kovaný PEG SBA SBA jugátová směs
72 h 1000 1393 1411 994 1328 857
96 h 500 1406 1501 926 1338 697
120 h asi 200 1100 1182 791 944 701
144 h asi 0 535 607 665 660 708
• · 0 0 00» · · * 0 • 0 0 0 «00 • 0000 0 000 0
0 0 0 0 0
000 00 000 0000 00 0
Příklad 5
Příprava převážně mono-PEG-EPO
Pegylační reakce
Použije se 100 mg (5,48 μκιοί) EPOsf ve lOOmM pufru obsahujícím fosforečnan draselný (pH 7,5) připraveného způsobem popsaným v příkladu 1. Přidá se 329 mg (10,96 μκιοί) 30kDa PEG-SBA činidla rozpuštěného ve 3 ml lmM kyseliny chlorovodíkové. K reakční směsi se přidá lOOmM pufrovací roztok fosforečnanu draselného (pH 7,5) v množství dostatečném pro doplnění objemu směsi do 20 ml. Konečná koncentrace proteinu je 5 mg/ml a poměr protein : PEG činidlo je 1 : 2. Reakční směs se 2 hodiny míchá při teplotě místnosti (20 až 22°C). Po 2 hodinách se reakce zastaví nastavením pH na hodnotu 4,5 za použití ledové kyseliny octové. Produkt se až do purifikace uchovává ve zmrazeném stavu při -20°C.
Purifikace
Reakční směs získaná v předchozím stupni se zředí v poměru 1 : 5 lOmM octanem sodným (pH 4,5) a uvede do sloupce 4,2 x 19 cm naplněného 300 ml SP-Sepharose FF (sulfopropyl katexová pryskyřice). Sloupec se předběžně ekvilibruje stejným pufrem. Výtok ze sloupce se monitoruje při 280 nm za použití UV monitoru Gilson a hodnoty se zaznamenávají za použití zařízení Kipp and Zonen. Sloupec se promyje ekvilibračním pufrem (300 ml nebo jeden objem lože), aby se odstranil nadbytek reakčních činidel, vedlejší produkty a oligomerní PEG-EPO; a poté dvěma objemy lože lOOmM chloridu sodného, aby se odstranil di-PEG-EPO. Poté se 200mM chloridem sodným eluuje mono-PEG-EPO. Při eluci mono-PEG-EPO se prvních 50 ml proteinového píku zahodí • ·· · ·· ·· · ♦ © · · ·♦ © « ♦ © ·· ·©· © ·««· © ··· · · · © · · · • · © · © · · ·©· ·· ·©· ···· ·· ©·« a mono-PEG-EPO se shromáždí jako 150ml frakce. Nemodifikovaný EPOsf, který zůstal na sloupci, se eluuje 750mM chloridem sodným. Všechna eluční činidla byla připravena v ekvilibračním pufru. Všechny eluované vzorky se analyzují SDS-PAGE a vysoce výkonnou chromatografií SEC. Mono-PEG-EPO pool získaný ze 150ml frace, který neobsahuje žádný nemodifikovaný EPOsf, se poté zkoncentruje na koncentraci asi 4,5 až 7,5 mg/ml a diafiltruje do zásobního pufru, lOmM fosforečnanu draselného, lOOmM chloridu sodného (pH 7,5). Zkoncentrování/diafiltrace se provádí za použití systému Milipore Labscale^R^ TFF s membránou Millipore Pellicon XL Biomax 50 s vylučovacím limitem 50 kDa při teplotě místnosti. Koncentrovaný mono-PEG-EPO se přefiltruje za sterilních podmínek a uchovává zmrazený při -20°C.
Přibližně 75 % EPOsf je pegylováno. Po přečištění byl celkový výtěžek mono-PEG-EPO bez detekovatelného nemodifikovaného EPOsf asi 30 % a di-PEG-EPO asi 25 %. Oligomery a nepegylovaný EPOsf se považují za zbývající protein. Mono-PEG-EPO pool získaný ze 150ml frakce obsahuje asi 90 % mono-PEG-EPO a asi 10 % di-PEG-EPO.
• · • · * · » ♦ ··« · · · · · · • « · · ·
SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL:
(A) JMÉNO: F.Hoffmann-La Roche AG
(B) ULICE: 124 Grenzacherstrasse
(C) MĚSTO: Basilej
(E) ZEMĚ: Švýcarsko
(F) PSČ: CH-4070
(G) TELEFON : (61) 688 11 11
(H) TELEFAX : (61) 688 13 95
(I) TELEX: 962 292 hlr ch
(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Erythropoetinový konjugát (iii) POČET SEKVENCÍ: 3 (iv) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:
(A) TYP MEDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: WORD (D) SOFTWARE: Patentin Release 2.0 <170> Patentin Ver. 2.0 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
Ala 1 Pro Pro Arg Leu 5 Ile Cys Asp Ser Arg 10 Val Leu Glu Arg Tyr 15 Leu
Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His
20 25 30
Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
35 40 45
Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala Val Glu Val Trp
50 55 60
Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu 'Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp
85 90 95
Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu
100 105 110
Gly Ala Gin Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala
115 120 125
Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
• 44 4 44 «4
4« « 4 >4 44 444
4 4 4 4 4 ·
4444 4 4444
4 4 4 ··
444 44 444 4444 ·· 4
Cys Arg Thr Gly Asp 165 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 2 Ser Arg Val 10 Leu Glu Arg Tyr 15 Leu
Ala 1 Pro Pro Arg Leu 5 Ile Cys Asp
Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His
20 25 30
Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
35 40 45
Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala Val Glu Val Trp
50 55 60
Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp
85 90 95
Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu
100 105 110
Gly Ala Gin Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala
115 120 125
Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
<210> 3 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 3
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
1 5 10 15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gin
25

Claims (30)

  1. PATENTOVÉ Ν
    1. Konjugát, který obsahuje erythropoetinový glykoprotein s alespoň jednou volnou aminoskupinou, jehož biologická aktivita in vivo spočívá v tom, že vede buňky kostní dřeně ke zvýšení produkce retikulocytů a červených krvinek, a který je zvolen ze souboru sestávajícího z lidského erythropoetinu a jeho analogů, v nichž je sekvence lidského erythropoetinu modifikována přidáním 1 až 6 glykosylačních míst nebo přeřazením alespoň jednoho glykosylačního místa; přičemž tento glykoprotein je kovalentně vázán k n póly(ethylenglykol)ovým skupinám obecného vzorce
    -co-(ch2)x-(och2ch2)m-OR, kde
    -CO každé póly(ethylenglykol)ové skupiny tvoří amidovou vazbu s jednou z výše uvedených aminoskupin;
    R představuje nižší alkylskupinu;
    x představuje 2 nebo 3;
    m představuje asi 450 až asi 900;
    n představuje 1 až 3; a n a m jsou zvoleny tak, že molekulová hmotnost konjugátu snížená o molekulovou hmotnost erythropoetinového glykoproteinu je 20 kDa až 100 kDa.
  2. 2. Konjugát podle nároku 1 obecného vzorce I
    P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m~OR]n (I) fc fcfc · ·· *· « • fcfcfc fcfc fc · · · fcfc • •fc · ··♦· • ··· fc · · « · fc · fc · fcfc · · fc ··· ·· fcfc· ···· ·· ··· kde x, m, n a R mají význam uvedený v nároku 1, a P představuje zbytek glykoproteinu bez n aminoskupiny nebo aminoskupin, které tvoří amidovou vazbu se skupinou nebo skupinami póly(ethylenglykol)u.
  3. 3. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde R představuje methylskupinu.
  4. 4. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde m představuje asi 650 až asi 750.
  5. 5. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde n představuje 1.
  6. 6. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde R představuje methylskupinu; m představuje asi 650 až asi 750; a n představuje 1.
  7. 7. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků obecného vzorce [CH30(CH2CH2O)mCH2CH2CH2CO-NH]n-P kde m představuje 650 až 750, n představuje 1 a P má význam uvedený v nároku 1.
  8. 8. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde glykoproteinem je lidský erythropoetin.
  9. 9. Konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde lidský erythropoetinový glykoprotein je exprimován aktivací endogenního genu.
    • fcfc · fcfc fcfc fc fcfcfcfc fcfcfcfc fcfcfcfc fcfcfc · fcfcfcfc • fcfcfc fc · fcfc··· • fc · · « · · • fcfc fcfc fcfcfc fc··· fcfc fcfcfc
  10. 10. Konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, kde glykoprotein má sekvenci SEQ ID NO: 1.
  11. 11. Konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, kde glykoprotein má sekvenci lidského erythropoetinu modifikovanou přidáním 1 až 6 glykosylačních míst.
  12. 12. Konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, kde glykoprotein má sekvenci lidského erythropoetinu, jež je změněna modifikací zvolenou ze souboru sestávajícího z
    Asn30Thr32;
    Asn51Thr53,
    Asn57Thr59;
    Asn69;
    Asn69Thr71;
    Ser68Asn69Thr71;
    Val87Asn88Thr90;
    Ser87Asn88Thr90;
    Ser87Asn88Gly89Thr90;
    Ser87Asn88Thr90Thr92;
    Ser87Asn88Thr90Ala162;
    Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90;
    Asn30Thr32Val87Asn88Thr90;
    Asn89Ile90Thr91;
    Ser87Asn89Ile90Thr91;
    Asn136Thr138;
    Asn138Thr140;
    Thr125; a Pro124Thr125.
  13. 13. Konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kde glykoprotein má sekvenci, která zahrnuje sekvenci lidského erythropoetinu a druhou sekvenci na karboxylovém • 9·
    00 0 0 • · 0 • ··· 0 0
    00 0 00 • 00 00 * »000 · 0 00
    0 ·0·0 0 0 « 0 0 0 0 0 0 0 0 000 00·0 ·0 000 konci sekvence lidského erythropoetinu, přičemž tato druhá sekvence obsahuje alespoň jedno glykosylační místo.
  14. 14. Konjugát podle nároku 13, kde druhá sekvence zahrnuje sekvenci odvozenou od sekvence karboxylového konce lidského choriového gonadotropinu.
  15. 15. Konjugát podle nároku 13, kde glykoprotein má sekvenci zvolenou ze souboru sestávajícího ze (a) sekvence lidského erythropoetinu a sekvencí SEQ ID NO: 3 na karboxylovém konci sekvence lidského erythro poetinu;
    (b) sekvence definované v odstavci (a), která je
    O Ϋ O Q Q n modifikována prostřednictvím Ser° Asn°° Thr; a (c) sekvence definované v odstavci (a), která je modifikována prostřednictvím Asn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90.
  16. 16. Konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde glykoprotein má sekvenci lidského erythropoetinu modifikovanou přeřazením alespoň jednoho glykosylačního místa.
  17. 17. Konjugát podle nároku 16, kde přeřazení zahrnuje delecí jakýchkoliv N-vázaných glykosylačních míst v lidském erythropoetinu a přidání N-vázaného glykosylačního místa v poloze 88 sekvence lidského erythropoetinu.
  18. 18. Konjugát podle nároku 17, kde glykoprotein má sekvenci lidského erythropoetinu pozměněnou modifikací zvolenou ze souboru sestávajícího z •
    444 4 4
    Gin24 Ser87 Asn88 Thr90; Gin38 Ser87 Asn88 Thr90; a Gin83 Ser87 Asn88 Thr90.
  19. 19. Kompozice obsahující konjugáty, vyznačující se tím, že každý z těchto konjugátů obsahuje erythropoetinový erythropoetin s alespoň jednou volnou aminoskupinou, jehož biologická aktivita in vivo spočívá v tom, že vede buňky kostní dřeně ke zvýšení produkce retikulocytů a červených krvinek, a který je zvolen ze souboru sestávajícího z lidského erythropoetinu a jeho analogů, v nichž je sekvence lidského erythropoetinu modifikována přidáním 1 až 6 glykosylačních míst nebo přeřazením alespoň jednoho glykosylačního místa; přičemž tento glykoprotein v každém z těchto konjugátů je kovalentně vázán k n poly(ethylenglykol)ovým skupinám obecného vzorce
    -CO-(ch2)χ-(och2ch2)m“0R, kde
    -CO každé póly(ethylenglykol)ové skupiny tvoří amidovou vazbu s jednou z výše uvedených aminoskupin;
    přičemž v každém z těchto konjugátů
    R představuje nižší alkylskupinu;
    x představuje 2 nebo 3;
    m představuje asi 450 až asi 900;
    n představuje 1 až 3; a • ·♦ 9 99 91 ·
    99 · · 99 9 9 1 9 99
    9 9 9 9 9 9 1 9 • 911 9 9 9 9 9 1 1
    9 9 9 1. 1 9 9
    999 91 199 1191 19 919 n a m jsou zvoleny tak, že molekulová hmotnost každého konjugátu snížená o molekulovou hmotnost erythropoetinového glykoproteinů je 20 kDa až 100 kDa;
    přičemž podíl konjugátů, kde n představuje číslo 1, činí alespoň 90 %.
  20. 20. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje konjugáty podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18, přičemž podíl konjugátů, kde n představuje číslo 1, činí alespoň 90 %.
  21. 21. Kompozice podle nároku 19 nebo 20, vyznačující se tím, že podíl konjugátů, kde n představuje číslo 1, činí alespoň 92 %.
  22. 22. Kompozice podle nároku 22, vyznačující se tím, že podíl konjugátů, kde n představuje číslo 1, činí alespoň 96 %.
  23. 23. Kompozice podle nároku 19 nebo 20, vyznačující se tím, že podíl konjugátů, kde n představuje číslo 1, činí 90 % až 96 %.
  24. 24. Farmaceutická kompozice, vyznačuj ιοί se tím, že obsahuje konjugát nebo kompozici podle kteréhokoliv z nároků 1 až 23 a farmaceuticky vhodný excipient.
  25. 25. Použití konjugátu nebo kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 23 pro výrobu léčiv pro léčení nebo profylaxi chorob, které souvisejí s anémií u pacientů s chronickým selháním ledvin nebo AIDS a pro léčení pacientů trpících rakovinou, kteří prodělávají chemoterapii.
    • 99 • 9· 99 • 9 9 99 9 9 9 9 9 9 • 99 9 · 9 9 • 999 9 • 9 9 9 9 • » • · 9 9 • 9 ·· «9· 999» 99 99
  26. 26. Způsob profylaktického nebo kurativního léčení poruch zahrnujících anémii u pacientů s chronickým selháním ledvin nebo AIDS a pacientů trpících rakovinou, kteří prodělávají chemoterapii, vyznačující se tím, že se pacientu podává kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 23.
  27. 27. Způsob výroby sloučenin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 23, vyznačující se tím, že zahrnuje kondenzaci sloučeniny obecného vzorce II
    O
    RO(CH2CH2O)m(CH2)xCOON (II) kde R, m a x mají význam uvedený ve kterémkoliv z nároků 1 až 6, s erythroproteinovým glykoproteinem.
  28. 28. Sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 vyrobené způsobem podle nároku 27.
  29. 29. Sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 23 pro léčení chorob spojených s amémií u pacientů s chronickým selháním ledvin nebo AIDS a pacientů trpících rakovinou, kteří prodělávají chemoterapii.
  30. 30. Nové sloučeniny, způsoby a použití takových sloučenin jak jsou popsány v tomto textu.
CZ20002386A 1999-07-02 2000-06-23 Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem CZ299516B6 (cs)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14225499P 1999-07-02 1999-07-02
US15022599P 1999-08-23 1999-08-23
US15154899P 1999-08-31 1999-08-31
US16615199P 1999-11-17 1999-11-17

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20002386A3 true CZ20002386A3 (cs) 2002-04-17
CZ299516B6 CZ299516B6 (cs) 2008-08-20

Family

ID=27495518

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20002386A CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2000-06-23 Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem

Country Status (52)

Country Link
US (2) US6583272B1 (cs)
EP (2) EP1839676A3 (cs)
JP (2) JP3727009B2 (cs)
KR (1) KR100593143B1 (cs)
CN (2) CN1184233C (cs)
AR (2) AR024625A1 (cs)
AT (1) ATE370748T1 (cs)
AU (1) AU736067B2 (cs)
BG (1) BG65449B1 (cs)
BR (2) BRPI0002276B8 (cs)
CA (1) CA2310536C (cs)
CO (1) CO5190661A1 (cs)
CY (2) CY1107719T1 (cs)
CZ (1) CZ299516B6 (cs)
DE (3) DE122007000064I2 (cs)
DK (1) DK1064951T3 (cs)
DO (1) DOP2000000030A (cs)
EA (1) EA003777B1 (cs)
ES (2) ES2289985T3 (cs)
FR (2) FR2795734B1 (cs)
GB (2) GB2393960C (cs)
GC (1) GC0000197A (cs)
GE (1) GEP20022804B (cs)
GT (1) GT200000109A (cs)
HK (2) HK1068354A1 (cs)
HR (1) HRP20000436B1 (cs)
HU (1) HU226233B1 (cs)
ID (1) ID26447A (cs)
IL (1) IL137056A0 (cs)
IS (1) IS2492B (cs)
IT (1) IT1318606B1 (cs)
LU (1) LU91363I2 (cs)
MA (1) MA26746A1 (cs)
MX (1) MXPA00006547A (cs)
MY (1) MY128500A (cs)
NL (1) NL300289I9 (cs)
NO (2) NO327043B1 (cs)
NZ (1) NZ505454A (cs)
OA (1) OA11442A (cs)
PA (1) PA8497801A1 (cs)
PE (1) PE20010297A1 (cs)
PL (1) PL202758B1 (cs)
PT (1) PT1064951E (cs)
RS (1) RS49928B (cs)
SG (1) SG92717A1 (cs)
SI (1) SI1064951T1 (cs)
SK (1) SK286301B6 (cs)
SV (1) SV2002000120A (cs)
TN (1) TNSN00147A1 (cs)
TR (1) TR200001956A2 (cs)
TW (1) TWI235667B (cs)
UY (1) UY26228A1 (cs)

Families Citing this family (227)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2221717T3 (es) 1997-12-08 2005-01-01 Emd Lexigen Research Center Corp. Proteinas de fusion heterodimeras utiles para inmunoterapia dirigida e inmunoestimulacion general.
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
JP2002511432A (ja) * 1998-04-15 2002-04-16 レキシジェン ファーマシューティカルズ コーポレイション 新脈管形成インヒビターの同時投与による抗体−サイトカイン融合タンパク質媒介性免疫応答の増強
US7304150B1 (en) * 1998-10-23 2007-12-04 Amgen Inc. Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia
US7345019B1 (en) * 1999-04-13 2008-03-18 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
KR100827757B1 (ko) * 1999-08-09 2008-05-07 메르크 파텐트 게엠베하 복수의 시토킨-항체 복합체
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
ATE336514T1 (de) * 2000-02-11 2006-09-15 Merck Patent Gmbh Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
DK1311285T4 (en) 2000-05-15 2017-07-24 Hoffmann La Roche Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivative
RU2272644C2 (ru) * 2000-06-29 2006-03-27 Мерк Патент Гмбх Усиление иммунной реакции, медиатором которой является слитый протеин антитело-цитокин, при помощи комбинированного лечения агентами, увеличивающими поглощение иммуноцитокина
JP5170931B2 (ja) * 2000-10-16 2013-03-27 中外製薬株式会社 Peg修飾エリスロポエチン
WO2002049673A2 (en) * 2000-12-20 2002-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg)
AU3323002A (en) * 2000-12-20 2002-07-01 Hoffmann La Roche Erythropoietin conjugates
US7767643B2 (en) 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
US20030072737A1 (en) * 2000-12-29 2003-04-17 Michael Brines Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs
EP1234583A1 (en) * 2001-02-23 2002-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag PEG-conjugates of HGF-NK4
EP1366067B1 (en) * 2001-03-07 2012-09-26 Merck Patent GmbH Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
WO2002079415A2 (en) * 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
AU2002308562B2 (en) * 2001-05-03 2008-01-24 Merck Patent Gmbh Recombinant tumor specific antibody and use thereof
US6818613B2 (en) 2001-11-07 2004-11-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Aqueous sustained-release formulations of proteins
KR100467751B1 (ko) 2001-12-03 2005-01-24 씨제이 주식회사 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질
EP1454138B1 (en) * 2001-12-04 2012-01-18 Merck Patent GmbH Immunocytokines with modulated selectivity
ES2414706T3 (es) * 2001-12-06 2013-07-22 Fibrogen, Inc. Métodos para aumentar la eritropoyetina endógena
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
US7129267B2 (en) 2002-03-11 2006-10-31 Janssen Pharmaceutica N.V. Methods for SHP1 mediated neuroprotection
EP1552298A4 (en) * 2002-07-01 2006-11-08 Kenneth S Warren Inst Inc RECOMBINANT TISSUE-PROOFING CYTOKINS AND NUCLEIC ACIDS COORDINATING THEREOF FOR THE PROTECTION, RECOVERY AND IMPROVEMENT OF CELLS, TISSUE AND ORGANS THEREOF
PL375265A1 (en) 2002-07-24 2005-11-28 F.Hoffmann-La Roche Ag Polyalkylene glycol acid additives
US7459435B2 (en) * 2002-08-29 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
US20050176627A1 (en) * 2002-09-09 2005-08-11 Anthony Cerami Long acting erythropoietins that maintain tissue protective activity of endogenous erythropoietin
WO2004022593A2 (en) * 2002-09-09 2004-03-18 Nautilus Biotech Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules
BR0314107A (pt) 2002-09-11 2005-07-19 Fresenius Kabi De Gmbh Método de produção de derivados de hidroxialquil amido
US7459436B2 (en) * 2002-11-22 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
US7388079B2 (en) * 2002-11-27 2008-06-17 The Regents Of The University Of California Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
PL211180B1 (pl) * 2002-12-17 2012-04-30 Merck Patent Gmbh Białko fuzyjne typu przeciwciało-IL2, wektor zawierający sekwencję kwasów nukleinowych kodujących takie białko, kompozycja farmaceutyczna zawierająca takie białko fuzyjne oraz jego zastosowania do wytwarzania leków
US7553930B2 (en) 2003-01-06 2009-06-30 Xencor, Inc. BAFF variants and methods thereof
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7610156B2 (en) 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
US7587286B2 (en) 2003-03-31 2009-09-08 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
US7642340B2 (en) 2003-03-31 2010-01-05 Xencor, Inc. PEGylated TNF-α variant proteins
US7279174B2 (en) * 2003-05-08 2007-10-09 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Stent coatings comprising hydrophilic additives
CA2525568C (en) * 2003-05-12 2017-07-25 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
EP2204193A3 (en) * 2003-05-12 2010-08-18 Affymax, Inc. Novel spacer moiety for poly(ethylene glycol)-modified peptide-based compounds
EA010099B1 (ru) * 2003-05-12 2008-06-30 Афимакс, Инк. Пептиды, которые связываются с рецептором к эритропоэтину, и способы их применения
CN1820024B (zh) * 2003-05-12 2011-06-22 阿费麦克斯公司 新的聚(乙二醇)修饰的化合物及其用途
JP2007537986A (ja) * 2003-05-30 2007-12-27 セントカー・インコーポレーテツド トランスグルタミナーゼを用いる新規なエリトロポエチン複合体の形成
WO2005011587A2 (en) * 2003-07-30 2005-02-10 New Century Pharmaceuticls Chalaropsis lysozyme protein and its method of use in anti-bacterial applications
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
EP1670492A4 (en) * 2003-09-29 2009-07-08 Warren Pharmaceuticals Inc FABRIC PROTECTION CYTOKINES FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF SEPTICEMIA AND THE FORMATION OF ADHESIONS
WO2005035564A2 (en) 2003-10-10 2005-04-21 Xencor, Inc. Protein based tnf-alpha variants for the treatment of tnf-alpha related disorders
PL1696947T3 (pl) * 2003-12-19 2014-08-29 Hoffmann La Roche Zastosowanie erytropoetyny w leczeniu zaburzeń dystrybucji żelaza w przewlekłych chorobach zapalnych jelit
EP1548031A1 (en) * 2003-12-22 2005-06-29 Dubai Genetics FZ-LLC Nature-identical erythropoietin
JP2008504008A (ja) * 2003-12-31 2008-02-14 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング 改良された薬物動態を有するFc−エリスロポエチン融合タンパク質
AU2005206549B2 (en) * 2004-01-21 2011-09-15 Nektar Therapeutics Method of preparing propionic acid-terminated polymers
ZA200606225B (en) * 2004-02-02 2007-11-28 Ambrx Inc Modified human four helical bundle polypeptides and their uses
AR048035A1 (es) 2004-03-11 2006-03-22 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugados de almidon de hidroxialquilo y una proteina, preparados por aminacion reductora
US7588745B2 (en) * 2004-04-13 2009-09-15 Si Options, Llc Silicon-containing products
US7253650B2 (en) 2004-05-25 2007-08-07 International Business Machines Corporation Increase productivity at wafer test using probe retest data analysis
WO2006062685A2 (en) * 2004-11-11 2006-06-15 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
AU2005310189A1 (en) * 2004-11-11 2006-06-08 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
WO2006081249A2 (en) 2005-01-25 2006-08-03 Cell Therapeutics, Inc. Conjugates of biologically active proteins having a modified in vivo half-life
EP1848461A2 (en) * 2005-02-16 2007-10-31 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of an epo moiety and a polymer
US7919461B2 (en) 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7550433B2 (en) * 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US20070072795A1 (en) * 2005-09-28 2007-03-29 Anton Haselbeck Treatment of neurodegenerative disorders
ES2357152T3 (es) * 2005-10-04 2011-04-19 Zymogenetics, L.L.C. Producción y purificación de il-29.
US8741260B2 (en) * 2005-10-07 2014-06-03 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of GDNF to the CNS
US8124095B2 (en) * 2005-10-07 2012-02-28 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of erythropoietin to the CNS
US8053569B2 (en) * 2005-10-07 2011-11-08 Armagen Technologies, Inc. Nucleic acids encoding and methods of producing fusion proteins
CN101291684A (zh) * 2005-10-21 2008-10-22 阿维季尼克斯股份有限公司 甘醇化和糖基化的禽类来源的治疗性蛋白
US20080171696A1 (en) * 2005-10-21 2008-07-17 Avigenics, Inc. Pharmacodynamically enhanced therapeutic proteins
US20130172274A1 (en) * 2005-12-20 2013-07-04 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US8841255B2 (en) 2005-12-20 2014-09-23 Duke University Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides
US20100166700A1 (en) 2006-02-28 2010-07-01 Oligasis Corporation Acryloyloxyethylphosphorylcholine Containing Polymer Conjugates and Their Preparation
JP5553506B2 (ja) 2006-03-22 2014-07-16 中外製薬株式会社 エリスロポエチン溶液製剤
WO2008019214A1 (en) * 2006-08-04 2008-02-14 Prolong Pharmaceuticals, Inc. Modified erythropoietin
US8759297B2 (en) * 2006-08-18 2014-06-24 Armagen Technologies, Inc. Genetically encoded multifunctional compositions bidirectionally transported between peripheral blood and the cns
EP2120998B1 (en) 2006-11-28 2013-08-07 HanAll Biopharma Co., Ltd. Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment
WO2008097461A2 (en) * 2007-02-02 2008-08-14 Amgen Inc Hepcidin and hepcidin antibodies
US20090011040A1 (en) * 2007-05-02 2009-01-08 Naash Muna I Use of compacted nucleic acid nanoparticles in non-viral treatments of ocular diseases
CL2008002054A1 (es) * 2007-07-17 2009-05-29 Hoffmann La Roche Metodo para la regeneracion de una columna de cromatografia de intercambio cationico despues de la elusion de eritropoyetina monopeguilada y metodo para obtener una eritropoyetina monopeguilada, incorporando el metodo de regeneracion de la columna de intercambio cationico.
AR067537A1 (es) * 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Purificacion de polipeptidos pegilados
CA2694762A1 (en) 2007-07-27 2009-02-05 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing alpha-l-iduronidase activity in the cns
CA2701032C (en) 2007-09-27 2021-01-26 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
US8796206B2 (en) 2007-11-15 2014-08-05 Amgen Inc. Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stabilised by antioxidants for parenteral administration
US8101706B2 (en) 2008-01-11 2012-01-24 Serina Therapeutics, Inc. Multifunctional forms of polyoxazoline copolymers and drug compositions comprising the same
EP2235090B1 (en) 2008-01-11 2013-09-04 Serina Therapeutics, Inc. Multifunctional forms of polyoxazoline copolymers and drug compositions comprising the same
WO2009094551A1 (en) 2008-01-25 2009-07-30 Amgen Inc. Ferroportin antibodies and methods of use
CN103694337B (zh) 2008-02-08 2016-03-02 Ambrx公司 经修饰瘦素多肽和其用途
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
US20100003238A1 (en) 2008-04-14 2010-01-07 Frost Gregory I Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions
ES2487846T3 (es) 2008-05-01 2014-08-25 Amgen, Inc. Anticuerpos anti-hepcindina y métodos de uso
CN105727261A (zh) 2008-06-27 2016-07-06 杜克大学 包含弹性蛋白样肽的治疗剂
KR101647164B1 (ko) 2008-09-26 2016-08-09 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 동물 에리트로포이에틴 폴리펩티드 및 이의 용도
CN104922669A (zh) 2008-11-13 2015-09-23 通用医疗公司 用于通过调整bmp-6来调节铁稳态的方法和组合物
EP3037529B1 (en) 2008-12-09 2019-03-27 Halozyme, Inc. Extended soluble ph20 polypeptides and uses thereof
CA2748889A1 (en) 2009-03-18 2010-09-23 Armagen Technologies, Inc. Compositions and methods for blood-brain barrier delivery of igg-decoy receptor fusion proteins
JP5813638B2 (ja) 2009-07-30 2015-11-17 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 可動クロマトグラフィーカラムセパレータ
WO2011024025A1 (en) * 2009-08-28 2011-03-03 Avesthagen Limited An erythropoietin analogue and a method thereof
MX2012003282A (es) 2009-09-17 2012-04-30 Baxter Healthcare Sa Co-formulacion estable de hialuronidasa e inmunoglobulina, y metodos de su uso.
CA2775012A1 (en) * 2009-09-23 2011-03-31 Biogenerix Ag Process for the purification of recombinant human erythropoietin (epo), epo thus purified and pharmaceutical compositions comprising same
ES2725200T3 (es) 2009-10-09 2019-09-20 Armagen Inc Métodos y composiciones para aumentar la actividad de iduronato 2-sulfatasa en el SNC
AU2010310457B2 (en) 2009-10-23 2015-07-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
US8765432B2 (en) 2009-12-18 2014-07-01 Oligasis, Llc Targeted drug phosphorylcholine polymer conjugates
JP2013525406A (ja) * 2010-04-27 2013-06-20 スキル テクノロジー ゲーエムベーハー 安定mia/cd−rap製剤
RS54291B2 (sr) 2010-06-07 2023-12-29 Amgen Inc Uređaj za isporuku lekova
KR20130125753A (ko) 2010-07-20 2013-11-19 할로자임, 아이엔씨 항-히알루로난제 투여와 관련된 유해 부작용의 치료
CA2808748C (en) 2010-09-14 2018-09-11 Roberto Falkenstein Method for purifying pegylated erythropoietin
WO2012104278A1 (en) 2011-02-02 2012-08-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Chromatography column support
EP2907504B1 (en) 2011-02-08 2017-06-28 Halozyme, Inc. Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia
MX341790B (es) 2011-03-31 2016-09-02 Amgen Inc Adaptador de viales y sistema.
CA3145238A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
US20130011378A1 (en) 2011-06-17 2013-01-10 Tzung-Horng Yang Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
CA2851521C (en) 2011-10-14 2020-09-22 Amgen Inc. Injector and method of assembly
EP2771028A2 (en) 2011-10-24 2014-09-03 Halozyme, Inc. Companion diagnostic for anti-hyaluronan agent therapy and methods of use thereof
EP4338797A3 (en) 2011-12-02 2024-06-12 Armagen, Inc. Methods and compositions for increasing arylsulfatase a activity in the cns
JP6067746B2 (ja) 2011-12-30 2017-01-25 ハロザイム インコーポレイテッド Ph20ポリペプチド変異体、その製剤および使用
JP6042527B2 (ja) 2012-04-04 2016-12-14 ハロザイム インコーポレイテッド 抗ヒアルロナン剤と腫瘍標的タキサンの組み合わせ治療
CN102816227A (zh) * 2012-08-30 2012-12-12 深圳赛保尔生物药业有限公司 回收促红细胞生成素的方法
WO2014062856A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods
AU2013348071B2 (en) 2012-11-21 2018-05-24 Amgen Inc. Drug delivery device
EP2968760B1 (en) 2013-03-15 2024-01-03 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
WO2014143815A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
TWI592183B (zh) 2013-03-15 2017-07-21 安美基公司 本體輪廓可調適之自動注射器裝置
CA2904357C (en) 2013-03-15 2020-09-22 Intrinsic Lifesciences Llc Anti-hepcidin antibodies and uses thereof
LT2976117T (lt) 2013-03-22 2021-02-25 Amgen Inc. Purkštuvas ir surinkimo būdas
TW201534726A (zh) 2013-07-03 2015-09-16 Halozyme Inc 熱穩定ph20玻尿酸酶變異體及其用途
SI3041513T1 (sl) 2013-09-08 2020-11-30 Kodiak Sciences Inc. Zwitterionski polimerni konjugati faktorja VIII
EP3501575B1 (en) 2013-10-24 2021-12-01 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive-control
BR112016008946B1 (pt) 2013-10-24 2022-12-27 Amgen Inc Injetores e método para montar os injetor
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
EP3139977B1 (en) 2014-05-07 2021-02-17 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
SG11201609966SA (en) 2014-06-03 2016-12-29 Amgen Inc Drug delivery system and method of use
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
ES2727137T3 (es) 2014-08-28 2019-10-14 Halozyme Inc Terapia combinada con una enzima de degradación de hialuronano y un inhibidor de puntos de control inmunitario
US10323088B2 (en) 2014-09-22 2019-06-18 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
MX2021014323A (es) 2014-10-14 2023-02-02 Amgen Inc Dispositivo de inyección de fármaco con indicadores visuales y audibles.
CA3203273A1 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Halozyme, Inc. Compositions of adenosine deaminase-2 (ada2), variants thereof and methods of using same
KR20210013299A (ko) 2014-10-17 2021-02-03 코디악 사이언시스 인코포레이티드 부티릴콜린에스테라제 양성이온성 중합체 컨쥬게이트
EP3689394A1 (en) 2014-12-19 2020-08-05 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
EP3848072A1 (en) 2014-12-19 2021-07-14 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
US10538589B2 (en) 2015-01-14 2020-01-21 Armagen Inc. Methods and compositions for increasing N-acetylglucosaminidase (NAGLU) activity in the CNS using a fusion antibody comprising an anti-human insulin receptor antibody and NAGLU
EP3556411B1 (en) 2015-02-17 2021-06-30 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
EP3261690B1 (en) 2015-02-27 2021-12-15 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
US11351308B2 (en) 2015-12-09 2022-06-07 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
IL290457B1 (en) 2015-12-30 2024-10-01 Kodiak Sciences Inc Antibodies and their conjugates
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
ES2814287T3 (es) 2016-03-15 2021-03-26 Amgen Inc Reducir la probabilidad de rotura de cristal en dispositivos de administración de fármaco
CN105820232B (zh) * 2016-04-08 2019-05-17 昂德生物药业有限公司 单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法及其制品和应用
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
WO2017197222A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
EP3478342A1 (en) 2016-07-01 2019-05-08 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
PL3484911T3 (pl) 2016-07-15 2021-03-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposób oczyszczania PEGylowanej erytropoetyny
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
US11369736B2 (en) 2017-02-17 2022-06-28 Amgen Inc. Cannula insertion and retraction mechanisms
CA3048520A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
JP2020508803A (ja) 2017-03-06 2020-03-26 アムジエン・インコーポレーテツド 作動防止特徴部を備える薬物送達デバイス
SG11201908058UA (en) 2017-03-07 2019-09-27 Amgen Inc Needle insertion by overpressure
KR102619150B1 (ko) 2017-03-09 2023-12-27 암겐 인코포레이티드 약물 전달 장치용 삽입 메커니즘
JP2020511499A (ja) 2017-03-20 2020-04-16 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 赤血球生成刺激タンパク質のインビトロでの糖鎖改変のための方法
SI3600491T1 (sl) 2017-03-28 2023-11-30 Amgen Inc. Sistem in postopek za sestavljanja droga bata in brizge
AU2018280054B2 (en) 2017-06-08 2023-07-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
CN110709121B (zh) 2017-06-08 2022-06-24 安进公司 扭矩驱动式药物递送装置
MX2019015472A (es) 2017-06-22 2020-02-19 Amgen Inc Reduccion del impacto/choque de la activacion del mecanismo.
MX2019015402A (es) 2017-06-22 2020-07-20 Catalyst Biosciences Inc Polipeptidos de serina proteasa 1 de tipo membrana modificada (mtsp-1) y metodos de uso.
WO2018237225A1 (en) 2017-06-23 2018-12-27 Amgen Inc. ELECTRONIC DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A CAP ACTIVATED BY A SWITCH ASSEMBLY
EP3651832B1 (en) 2017-07-14 2023-12-13 Amgen Inc. Needle insertion-retraction system having dual torsion spring system
MA49626A (fr) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc Élément d'étanchéité perméable aux gaz pour récipient à médicament et procédés d'assemblage
MA49676A (fr) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament doté d'un système d'accès à un récipient et procédé d'assemblage associé
EP3658203B1 (en) 2017-07-25 2022-08-31 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
WO2019032482A2 (en) 2017-08-09 2019-02-14 Amgen Inc. HYDRAULIC-PNEUMATIC PRESSURE CHAMBER DELIVERY SYSTEM
EP3668567A1 (en) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
MA50611A (fr) 2017-10-04 2020-08-12 Amgen Inc Adaptateur d'écoulement destiné à un dispositif d'administration de médicament
WO2019070552A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A LOCKOUT ASSEMBLY AND ASSOCIATED ASSEMBLY METHOD
US11464903B2 (en) 2017-10-09 2022-10-11 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
MA50527A (fr) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc Système et approches pour stériliser un dispositif d'administration de médicament
EP3706830B1 (en) 2017-11-06 2024-08-07 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
CN111225696B (zh) 2017-11-10 2023-07-18 安进公司 用于药物递送装置的柱塞
AU2018368340B2 (en) 2017-11-16 2024-03-07 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
AU2018368338B2 (en) 2017-11-16 2024-07-25 Amgen Inc. Autoinjector with stall and end point detection
EP3731871B1 (en) 2017-12-29 2023-10-04 F. Hoffmann-La Roche AG Process for providing pegylated protein composition
EP3731872B1 (en) 2017-12-29 2021-11-24 F. Hoffmann-La Roche AG Process for providing pegylated protein composition
EP3731873B1 (en) 2017-12-29 2022-01-26 F. Hoffmann-La Roche AG Process for providing pegylated protein composition
MX2020009152A (es) 2018-03-02 2020-11-09 Kodiak Sciences Inc Anticuerpos de il-6 y constructos de fusion y conjugados de los mismos.
WO2019222435A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Halozyme, Inc. Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
MA53375A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
US12115360B2 (en) 2018-07-24 2024-10-15 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
MA53379A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
US12109389B2 (en) 2018-07-31 2024-10-08 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
EP3613486B1 (de) * 2018-08-24 2020-10-07 UGA Biopharma GmbH Verfahren und anlage zur reinigung von epo und/oder einem epo-derivat
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
AU2019350660B2 (en) 2018-09-28 2024-09-26 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
CN117159846A (zh) 2018-10-02 2023-12-05 安进公司 具有内部力传递的用于药物递送的注射系统
CA3112214A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
MA53912A (fr) 2018-10-15 2022-01-19 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un mécanisme d'amortissement
MX2021002791A (es) 2018-10-15 2021-05-12 Amgen Inc Proceso de ensamblaje de plataforma para un dispositivo de administracion de farmacos.
US11213620B2 (en) 2018-11-01 2022-01-04 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
EP3873563A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
US11613744B2 (en) 2018-12-28 2023-03-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use
CA3137360A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
WO2021041067A2 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
CA3157509A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
WO2022063082A1 (zh) 2020-09-22 2022-03-31 美国杰科实验室有限公司 一种糖基化修饰的促红细胞生成素及其应用
WO2022159414A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 University Of Rochester Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction
IL308169A (en) 2021-05-10 2024-01-01 Chiome Bioscience Inc Purification method of an antibody compound
US20240208680A1 (en) 2021-05-21 2024-06-27 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
WO2023209074A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods of restoring erythropoiesis in patients suffering from a sf3b1 mutant myelodysplastic syndrome by correcting coasy mis-splicing
WO2024094457A1 (en) 2022-11-02 2024-05-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing glycoprotein compositions
CN116492448A (zh) * 2023-04-12 2023-07-28 深圳赛保尔生物药业有限公司 负载peg-epo及间充质干细胞的组合物、药物及其制备方法

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
KR850004274A (ko) * 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
JPS6197229A (ja) 1984-10-18 1986-05-15 Chugai Pharmaceut Co Ltd 安定なエリトロポエチン製剤
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5641663A (en) * 1985-11-06 1997-06-24 Cangene Corporation Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and other heterologous proteins from steptomyces
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5674534A (en) * 1992-06-11 1997-10-07 Alkermes, Inc. Composition for sustained release of non-aggregated erythropoietin
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5359030A (en) * 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
IL110669A (en) * 1993-08-17 2008-11-26 Kirin Amgen Inc Erythropoietin analogs
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
DE741187T1 (de) 1995-05-05 1997-04-30 Hoffmann La Roche Rekombinante Obesitäts-(OB)-Proteine
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US6025324A (en) * 1996-05-15 2000-02-15 Hoffmann-La Roche Inc. Pegylated obese (ob) protein compositions
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
ES2208798T3 (es) * 1997-09-01 2004-06-16 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Eritropoyetina humana recombinante con un perfil de glicosilacion ventajoso.
CA2352538A1 (en) 1998-11-30 2000-06-08 Eli Lilly And Company Erythropoietic compounds
JO2291B1 (en) * 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
WO2001068141A2 (en) 2000-03-17 2001-09-20 Maxygen Aps Dispersions of polypeptide conjugates
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
DK1311285T4 (en) * 2000-05-15 2017-07-24 Hoffmann La Roche Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivative

Also Published As

Publication number Publication date
ATE370748T1 (de) 2007-09-15
AU4274400A (en) 2001-01-04
JP2001064300A (ja) 2001-03-13
PT1064951E (pt) 2007-09-10
FR07C0051I2 (fr) 2008-05-09
AU736067B2 (en) 2001-07-26
NL300289I1 (nl) 2007-11-01
CY1107719T1 (el) 2010-07-28
EA200000607A1 (ru) 2001-02-26
GT200000109A (es) 2001-12-21
FR07C0051I1 (cs) 2007-12-14
GB2393960C (en) 2012-08-29
ES2191511A1 (es) 2003-09-01
NL300289I9 (nl) 2019-08-21
DE10031839A1 (de) 2001-02-01
MY128500A (en) 2007-02-28
CN1515590A (zh) 2004-07-28
LU91363I2 (fr) 2007-11-12
DK1064951T3 (da) 2007-10-08
NO2009010I1 (no) 2009-05-25
GEP20022804B (en) 2002-09-25
GB0016205D0 (en) 2000-08-23
CY2007021I1 (el) 2009-11-04
MA26746A1 (fr) 2004-12-20
NO20003372L (no) 2001-01-03
GB2393960A (en) 2004-04-14
TWI235667B (en) 2005-07-11
CA2310536A1 (en) 2001-01-02
CN1280137A (zh) 2001-01-17
KR100593143B1 (ko) 2006-06-26
IL137056A0 (en) 2001-06-14
SG92717A1 (en) 2002-11-19
NO2009010I2 (no) 2014-06-02
CO5190661A1 (es) 2002-08-29
HRP20000436A2 (en) 2001-06-30
EP1839676A2 (en) 2007-10-03
HUP0002553A3 (en) 2005-11-28
DE60036053D1 (de) 2007-10-04
NO20003372D0 (no) 2000-06-28
FR2795734B1 (fr) 2005-09-30
NZ505454A (en) 2001-12-21
AR024625A1 (es) 2002-10-16
TNSN00147A1 (fr) 2005-11-10
BRPI0002276B1 (pt) 2019-05-14
EP1839676A3 (en) 2008-09-03
KR20010049676A (ko) 2001-06-15
BRPI0002276B8 (pt) 2021-05-25
IS2492B (is) 2009-02-15
CZ299516B6 (cs) 2008-08-20
BG104570A (en) 2001-09-28
BG65449B1 (bg) 2008-08-29
GB0400086D0 (en) 2004-02-04
BR0002276A (pt) 2001-12-11
CA2310536C (en) 2007-09-11
US6583272B1 (en) 2003-06-24
EP1064951A3 (en) 2002-03-20
EP1064951A2 (en) 2001-01-03
JP2004155787A (ja) 2004-06-03
UY26228A1 (es) 2000-10-31
ITMI20001479A0 (it) 2000-06-30
HK1033328A1 (en) 2001-08-24
SK9872000A3 (en) 2002-06-04
NL300289I2 (nl) 2010-02-01
CY2007021I2 (el) 2009-11-04
HU0002553D0 (en) 2000-08-28
GB2393960B (en) 2004-08-04
RS49928B (sr) 2008-09-29
SV2002000120A (es) 2002-01-31
PL341187A1 (en) 2001-01-15
HRP20000436B1 (en) 2008-01-31
DE60036053T2 (de) 2008-01-03
YU40700A (sh) 2003-12-31
GB2353281A (en) 2001-02-21
ITMI20001479A1 (it) 2001-12-30
CN1184233C (zh) 2005-01-12
TR200001956A2 (tr) 2001-01-22
IT1318606B1 (it) 2003-08-27
AR055650A2 (es) 2007-08-29
ID26447A (id) 2001-01-04
GC0000197A (en) 2006-03-29
LU91363I9 (cs) 2018-12-31
HU226233B1 (en) 2008-07-28
HUP0002553A2 (en) 2001-03-28
IS5554A (is) 2001-01-02
NO327043B1 (no) 2009-04-06
DE122007000064I2 (de) 2010-03-25
US20030120045A1 (en) 2003-06-26
DE122007000064I1 (de) 2008-01-03
JP3727009B2 (ja) 2005-12-14
SK286301B6 (en) 2008-07-07
GB2353281B (en) 2004-06-09
EP1064951B1 (en) 2007-08-22
MXPA00006547A (es) 2004-10-28
PA8497801A1 (es) 2001-12-14
OA11442A (fr) 2004-04-28
DOP2000000030A (es) 2002-07-15
EA003777B1 (ru) 2003-08-28
HK1068354A1 (en) 2005-04-29
PE20010297A1 (es) 2001-03-07
ES2191511B1 (es) 2005-01-01
PL202758B1 (pl) 2009-07-31
CN1283664C (zh) 2006-11-08
FR2795734A1 (fr) 2001-01-05
ES2289985T3 (es) 2008-02-16
SI1064951T1 (sl) 2007-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3727009B2 (ja) エリスロポエチン誘導体
JP4190184B2 (ja) ポリエチレングリコールを有するエリスロポエチン接合体
EP1432802B1 (en) Pegylated and diglycosylated erythropoietin
CZ20024005A3 (cs) Nová farmaceutická kompozice
RU2232163C2 (ru) Конъюгаты эритропоэтина и полиэтиленгликоля, фармацевтические композиции (варианты), способ профилактического и/или терапевтического лечения нарушений и способ получения коньюгата или композиции

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20220725