CN102816227A - 回收促红细胞生成素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种回收促红细胞生成素的方法，包括将制备促红细胞生成素偶联物的反应液进行疏水层析并收集含促红细胞生成素的组分，对所述含促红细胞生成素的组分进行超滤浓缩，该超滤浓缩使用截留分子量为5000-10000道尔顿的超滤膜。本发明工艺简单、效果显著；经本发明从反应液中回收的促红细胞生成素的纯度高、得率高；经本发明所回收的促红细胞生成素具有良好的体内活性，各项质量指标均符合2010国家药典标准；并且所回收的促红细胞生成素与聚乙二醇衍生物的反应活性较强，可以回收再用，从而避免了浪费，极大地降低了生产成本。该发明可进行放大生产，具有较高的医药价值和经济效益。

Description

回收促红细胞生成素的方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种回收促红细胞生成素的方法。
背景技术
促红细胞生成素（EPO）是存在人体内的一种造血因子，1985年体外基因克隆成功，1989年获准上市应用于治疗贫血类疾病的注射类药物。常规EPO是目前世界上应用最成功的蛋白类药物，每年销售额达百亿美元。但常规EPO在体内易被肾小体清除，半衰期短，病人需要频繁注射（一周三次）以维持药效，而且EPO在体内有一定的抗原性。EPO通过聚乙二醇（PEG）化后，得到聚乙二醇化促红细胞生成素（PEG-EPO）,可以很好克服常规EPO的缺点，注射次数显著减少（半个月甚至一个月一次），从而提高病人的生活质量。罗氏的抗贫血药mircera正是这一类药，于2007年在欧洲上市，取得医药上和商业上的巨大成功。生产PEG-EPO的原材料EPO需要通过基因重组CHO细胞表达，再经过纯化等技术获得，并且产品质量要求完全符合2010国家药典要求，因此EPO的价格十分昂贵。然而，使用EPO制备PEG-EPO时，一般有30%左右的EPO无法转化为目标产物，而未反应的EPO通常在提取了目标产物PEG-EPO后被丢弃，造成了极大的浪费。有的EPO回收工艺不仅复杂，回收得率也较低；或者回收得到的EPO质量不能符合国家药典标准的要求，同时与PEG反应的活性也极低。
发明内容
本发明的目的在于为克服现有技术的缺陷，而提供一种工艺简单的回收促红细胞生成素的方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种回收促红细胞生成素的方法，包括以下步骤：
a、将制备促红细胞生成素偶联物的反应液进行疏水层析并收集含促红细胞生成素的组分；
b、对所述含促红细胞生成素的组分进行超滤浓缩；
c、对超滤浓缩所得产物进行缓冲液的置换；
其中，步骤a中所述的反应液包含促红细胞生成素、促红细胞生成素偶联物和具有以下结构的亲水性聚合物的混合物，所述促红细胞生成素偶联物是促红细胞生成素分子与有以下亲水性聚合物结构的物质的偶联物；
Figure BDA00002075159300021
其中：
P为聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉或其共聚物，分子量为10-50kD；优选分子量为30-40kD的聚乙二醇；
T为葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、乳糖中的任一种或任一种的衍生物或任一种的寡糖；优选葡萄糖；
步骤a中所述疏水层析的层析填料为含有丁基、辛基、苯基、烷基、己基或乙醚基的疏水填料。疏水层析采用梯度洗脱的方式进行，该梯度洗脱的第一流动相是含0.5-2M硫酸铵，0.05-0.25M的磷酸缓冲液，pH 6.0-9.0，优选是2M硫酸铵，0.15M的磷酸缓冲液，pH 7.3；该梯度洗脱的第二流动相是0.05-0.25M的磷酸缓冲液，pH 6.0-9.0，优选是0.15M的磷酸缓冲液，pH 7.3。
步骤b中所述超滤浓缩使用截留分子量为5-10kD的超滤膜。超滤膜的材质为聚醚砜或再生纤维素材质，优选再生纤维素材质。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明工艺简单、效果显著；经本发明从混合液中回收的促红细胞生成素的纯度高、收率高；经本发明所回收的促红细胞生成素具有良好的体内活性，各项质量指标均符合2010国家药典标准；并且所回收的促红细胞生成素与聚乙二醇衍生物的反应活性较强，可以回收再用或其它用途，从而避免了浪费，极大的降低了生产成本。该发明可进行放大生产，具有较高的医药价值和经济效益。
附图说明
图1为实施例步骤一中反应液的体积排阻高效液相色谱（SEC-HPLC)图；
图2为疏水层析的层析谱图；
图3为回收EPO的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测结果；
图4为回收EPO中PEG残留量的检测结果；
图5为回收EPO的SEC-HPLC谱图；
图6为试验三中反应液的SEC-HPLC谱图。
具体实施方式
为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案进一步介绍和说明。
实施例
步骤一：EPO与葡萄糖聚乙二醇NHS酯（GLUC-NHS）反应及反应液成分检测。
向300ml的广口瓶中先加入40ml EPO原液（EPO含量为2.5mg/ml），再向该广口瓶中加入60ml pH7.2浓度为20mM的磷酸缓冲液使EPO的浓度为1mg/ml。用21.88ml pH3.0浓度为2mM的磷酸缓冲液溶解2188mg分子量为35kD的GLUC-NHS（在其它实施例中，GLUC-NHS与EPO的摩尔比也可在10-25:1范围内），溶解后，将GLUC-NHS溶液全部加入EPO中，用pH试纸测定反应液的pH为7.2（在其它实施例中，反应液的pH可在7.0-7.5范围内进行选择，不影响本发明的目的）。反应混合液放置于震荡器上，室温震荡反应至少2小时，本实验采用的反应时间为2.5小时。结束反应后用SEC-HPLC对反应液进行检测，反应液中含有未反应的EPO、PEG、单取代PEG-EPO(mPEG-EPO)、二取代PEG-EPO(d PEG-EPO)和多取代PEG-EPO（oli PEG-EPO,三取代以上PEG-EPO)。
SEC-HPLC检测条件：
SEC-HPLC柱：GE super pos e610/300GL(球蛋白分离范围5-5000KD)
流动相：3.2mM Na2HPO4，1.5mM KH2PO4，0.4M NaCl
HPLC:岛津HPLC，PDA检测器，LC solution工作站
检测波长：280nm
上样量：20μl
流速：0.5ml/min
如图1所示，为上述反应液的SEC-HPLC图，图上的峰依次为d EPO、mPEG-EPO、EPO和盐峰。SEC-HPLC的检测数据如下表所示，其中m PEG-EPO、EPO和d PEG-EPO的峰面积比为m PEG-EPO：EPO：d PEG-EPO=23.4：51.3:25.3。
  峰名称   保留时间   峰面积   峰高   峰面积百分比
  (min)   (mAU.min)   (mAU)   （%）
  d PEG-EPO   21.553   947650   6677   23.4
  m PEG-EPO   25.362   2081873   16743   51.3
  EPO   34.128   1028123   11333   25.3
在其它实施例中可以使用具有以下结构的亲水性聚合物取代GLUC-NHS。
Figure BDA00002075159300051
其中：
P为聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉或其共聚物，分子量为10000-50000道尔顿；
T为葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、乳糖中的任一种或任一种的衍生物或任一种的寡糖。
步骤二：对实步骤一的反应液进行疏水层析。
用第一流动相将1L步骤一的反应液稀释至10L。用第一流动相充分平衡5个柱体积后，紫外检测归零，然后上样并收集穿透组份，上样完毕后，继续用第一流动相冲洗柱子至5个柱体积后，开始梯度洗脱，0-100%/100min,分别收集各洗脱峰。疏水层析的层析图谱如图2所示，第一个峰即穿透峰，经SEC-HPLC检测（检测条件同步骤一），第一个峰主要含未反应的EPO，纯度大于98%，经SDS-PEG碘染分析，其不含PEG。第二个峰是m PEG-EPO的峰，纯度达到98%以上，得率为85%以上；第三个峰主要为di PEG-EPO和oliPEG-EPO的峰；主要含m PEG-EPO的组分可根据申请号为2010010516922.X的专利申请文件所述的方法继续纯化，可以得到纯度大于98%，得率大于60%的m PEG-EPO；
层析条件：
层析柱：华美玻璃柱，尺寸15×10cm
疏水层析填料：可以使用如GE公司的Source、Fast Flow或sepharose HighPerformance系列;也可以使用Tosh公司的Butyl、Hexyl、Phenyl、PPG或Ether等。
流速：500ml/min
检测波长：280nm
第一流动相：0.15M磷酸缓冲液,2M硫酸铵，pH7.3
第二流动相：0.15M磷酸缓冲液,pH7.3
在其它实施例中，可以使用含0.5-2M硫酸铵，0.05-0.25M的磷酸缓冲液，pH6.0-9.0的溶液为第一流动相；含0.05-0.25M的磷酸缓冲液，pH6.0-9.0的溶液为第二流动相。
步骤三：对步骤二所收集的主要含EPO的组分进行超滤浓缩。
首先用0.1M NaOH溶液清洗超滤膜包30min；接着再用注射用水冲洗膜包30min后，检测穿透液的pH是否为7.0左右；然后加入步骤二中收集的10L左右主要含EPO的组分，将其浓缩至200ml左右；加入1.8L4℃的注射用水,将其浓缩至200ml左右；再次加入1.8L4℃的注射用水并浓缩至200mL；最后向浓缩液中加入1.8L4℃的0.2M氯化钠/20mM枸橼酸钠的混合溶液，pH7.0，并将其浓缩至50-100ml左右。
进行三个批次以上实验，结果如下表所示，EPO经超滤浓缩的平均回收率是61%。
Figure BDA00002075159300071
超滤条件：
超滤仪器：Millipore labscale
超滤膜包：2个并联，膜包面积为50cm2，截留分子量为10kD；
膜包材质：再生纤维素材质，在其它实施例中膜包材质也可以是聚醚砜材料。
试验一：分别使用SDS-PAGE和SEC-HPLC对上述回收EPO进行纯度检测。
回收EPO的SDS-PAGE（非还原型）纯度检测和考染方法按照2010药典方法进行；碘染方法按照文献（Manfred M.et al.,Analytical Biochemistry200，2444-248，1992）进行。如图3所示为回收EPO的SDS-PAGE检测结果，EPO的纯度达到100%；如图4所示为回收EPO中PEG残留量的检测结果，EPO中无PEG残留；如图5所示为回收EPO的SEC-HPLC的检测结果，EPO的纯度达100%。
试验二：对上述回收EPO进行质量(纯度，活性等)检测:
检测方法按照2010药典方法进行，检测结果如下表所示，检测指标均符合2010年国家药典标准。
Figure BDA00002075159300081
实验三：回收EPO与PEG的反应活性检测。
向15ml塑料离心管中加入3ml EPO溶液（回收EPO的含量为2.5mg/ml），再加入3ml pH7.2的20mM磷酸缓冲液至EPO的终浓度为1mg/ml。用1094μlpH3.0含量为2mM的磷酸缓冲液溶解109.4mg分子量为35kD的葡萄糖聚乙二醇（GLUC-NHS），溶解后，将GLUC-NHS溶液全部加入EPO溶液中，EPO溶液的pH为7.2。将反应混合液放置于震荡器上，室温震荡反应2.5小时。停止反应后，对反应液进行SEC-HPLC检测（检测条件与步骤一相同），图6为反应液的SEC-HPLC图，图上的峰依次为d EPO、m PEG-EPO、EPO和盐峰。检测结果如下表所示，d EPO、m PEG-EPO和EPO的峰面积比为d EPO：mPEG-EPO：EPO=4.4:35.5:60.1，即未反应的EPO约为60%，反应单取代率约为36%。结果表明：回收的EPO仍然具有较强的反应活性。
Figure BDA00002075159300091
以上对本发明回收促红细胞生成素的方法进行了阐述，用于帮助理解本发明，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，任何未背离本发明原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种回收促红细胞生成素的方法，包括将制备促红细胞生成素偶联物的反应液进行疏水层析并收集含促红细胞生成素的组分，其特征在于：对所述含促红细胞生成素的组分进行超滤浓缩，该超滤浓缩使用截留分子量为5000-10000道尔顿的超滤膜。
2.根据权利要求1所述回收促红细胞生成素的方法，其特征在于：还包括置换缓冲液的步骤，对所述超滤浓缩所得产物进行缓冲液的置换。
3.根据权利要求1所述回收促红细胞生成素的方法，其特征在于：所述反应液包含促红细胞生成素、促红细胞生成素偶联物和具有以下结构的亲水性聚合物的混合物，所述促红细胞生成素偶联物是促红细胞生成素分子与有以下亲水性聚合物结构的偶联物；
Figure FDA00002075159200011
其中：
P为聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉或其共聚物，分子量为10000-50000道尔顿；
T为葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、乳糖中的任一种或任一种的衍生物或任一种的寡糖。
4.根据权利要求3所述回收促红细胞生成素的方法，其特征在于：所述促红细胞生成素偶联物是聚乙二醇衍生物化促红细胞生成素，所述亲水性聚合物是聚乙二醇衍生物；其中聚乙二醇的分子量为30000-40000道尔顿。
5.根据权利要求1所述回收促红细胞生成素的方法，其特征在于：所述疏水层析的层析填料为含有丁基、辛基、苯基、烷基、己基或乙醚基的疏水填料。
6.根据权利要求1所述回收促红细胞生成素的方法，其特征在于：所述疏水层析采用梯度洗脱，该梯度洗脱的第一流动相是含0.5-2M硫酸铵，0.05-0.25M的磷酸缓冲液，pH 6.0-9.0；该梯度洗脱的第二流动相是0.05-0.25M的磷酸缓冲液，pH 6.0-9.0。
7.根据权利要求6所述回收促红细胞生成素的方法，其特征在于：所述第一流动相是含2M硫酸铵，0.15M的磷酸缓冲液，pH 7.3，所述第二流动相是0.15M的磷酸缓冲液，pH 7.3。
8.根据权利要求1所述回收促红细胞生成素的方法，其特征在于：所述超滤膜的材质为聚醚砜或再生纤维素材质。
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C53 Correction of patent of invention or patent application
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Zhang Diping

Inventor after: Li Xionghui

Inventor after: Wu Yuanyuan

Inventor after: Zhang Xiangrong

Inventor after: Sheng Guangyang

Inventor after: Huang Jian

Inventor after: Chen Xianguang

Inventor after: Huang Junlong

Inventor before: Li Xionghui

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: LI XIONGHUI TO: ZHANG DIPING LI XIONGHUI WU YUANYUAN ZHANG XIANGRONG SHENGGUANGYANG HUANG JIAN CHEN XIANGUANG HUANG JUNLONG

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20121212