CN104784973A - 净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱及其制备方法与应用。本发明采用4％的柱状琼脂糖凝胶作为固相载体，琼脂糖凝胶与本发明制备的苯巴比妥抗体和市场上购买的莱克多巴胺抗体偶联形成免疫吸附剂，装柱制成免疫亲和柱。当含有苯巴比妥和莱克多巴胺的样品通过免疫亲和柱时，免疫吸附剂就会特异性的吸附苯巴比妥和莱克多巴胺，其他的杂质则流出免疫亲和柱，然后用甲醇将苯巴比妥和莱克多巴胺从柱子中洗脱下来，样品得到了很好的净化。建立免疫亲和柱净化-液相色谱法检测苯巴比妥和莱克多巴胺，使检测快捷，精确，安全。

Description

净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱的制备与应用，更确切的说是苯巴比妥和莱克多巴胺免疫亲和柱的制备方法，免疫亲和柱净化-液相色谱法检测苯巴比妥和莱克多巴胺检测方法的建立。

背景技术

苯巴比妥，为白色有光泽的结晶性粉末；无臭，味微苦。具有镇静、催眠、抗惊厥作用。并可抗癫痫，对癫痫大发作与局限性发作及癫痫持续状态有良效；对癫痫小发作疗效差；而对精神运动性发作则往往无效，且单用本药治疗时还可能使发作加重。本品还有增强解热镇痛药之作用，并能诱导肝脏微粒体葡萄糖醛酸转移酶活性，促进胆红素与葡萄糖醛酸结合，降低血浆胆红素浓度，治疗新生儿髙胆红素血症(脑核性黄疸)。不良反应(1)用药后可出现头晕、困倦等后遗效应，久用可产生耐受性及依赖性。多次连用应警惕蓄积中毒。(2)少数患者可出现皮疹、药热、剥脱性皮炎等过敏反应。

莱克多巴胺是一种人工合成的克仑巴安β-肾上腺受体激动剂，可用于治疗充血性心力衰竭症、肌肉萎缩症，增长肌肉，减少脂肪蓄积，并对胎儿和新生儿生长有益。莱克多巴胺正被作为一种新型瘦肉精被一些养猪场使用。对此药物在养殖业的适用范围和安全性世界各国的规定不尽相同。自2011年12月5日起在中国境内禁止生产和销售莱克多巴胺。

目前，苯巴比妥和莱克多巴胺的检测方法主要有薄层层析法，酶联免疫法(ELISA)，免疫亲和层析-液相色谱法，免疫亲和层析-荧光光度法等。薄层层析法，要接触大量的标准品，不利于实验者的健康，而且灵敏度很低。酶联免疫法，只适用于定性检测，很容易出现假阳性和假阴性的现象。免疫亲和层析-液相色谱法可以定量地检测许多商品中的苯巴比妥和莱克多巴胺的含量。由于采用了先进的生物技术，该方法可以检测出苯巴比妥和莱克多巴胺，而不使用有毒的溶剂如氯仿和二氯甲烷等。因此，当务之急，要制备出性能稳定的免疫亲和柱，并建立一种经济，快捷，精确，安全的试验方法。

发明内容

为了解决现有技术中检测苯巴比妥和莱克多巴胺亟需性能稳定的免疫亲和柱的问题，本发明提供了一种苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱及其制备方法与在HPLC检测中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱的制备方法如下：

a)基质制备

称取1g琼脂糖凝胶基质粉末，溶于1mmol/L HCl中，然后置于烧结玻璃过滤器中使用1mmol/L HCl洗涤15min；

b)配体偶联

使用偶联缓冲液0.2mol/L NaHCO₃pH8.3溶解待偶联的抗苯巴比妥单克隆抗体和抗莱克多巴胺单克隆抗体，获得抗体溶液，迅速将步骤a)活化的琼脂糖凝胶基质转移到所述抗体溶液中，充分混匀上述的混和物2-4h；

c)配体封闭

封闭所有残留的活性基团，转移经步骤b)处理的琼脂糖凝胶基质至0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中，室温条件下静置2-4h；

d)除去偶联后未偶联上的多余的配体

依次用0.1mol/L醋酸/醋酸钠缓冲液和0.1mol/L Tris-HCl缓冲液对经步骤c)处理后的琼脂糖凝胶基质进行洗涤，至少洗涤3个循环；

e)装柱

用5倍所述琼脂糖凝胶体积的0.01％NaN₃-PBS洗涤，并使用0.01％NaN₃-PBS保存，然后装柱。

在以上获得复合免疫亲和柱(IAC)的基础上，本发明建立了利用液相色谱法检测苯巴比妥和莱克多巴胺检测的方法：当含有苯巴比妥和莱克多巴胺的样品通过IAC时，免疫吸附剂就会特异性的吸附苯巴比妥和莱克多巴胺，其他的杂质则流出IAC柱，然后用甲醇将苯巴比妥和莱克多巴胺从柱子中洗脱下来，样品得到了很好的净化。

用所述复合免疫亲和柱净化待测样液，然后用色谱级甲醇洗脱亲和柱，流速为1mL/min～2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供HPLC分析；

高效液相色谱条件

苯巴比妥

色谱柱：Cloversil-C₁₈,4.6×250mm

流动相：甲醇:水＝50:50(v/v)

流速：0.8mL/min

检测器：紫外检测器，波长254nm

进样体积：50～100uL；

莱克多巴胺：

色谱柱：Cloversil-C₁₈,4.6×250mm

流动相：乙腈：0.05％三氟乙酸＝20：80(v/v)

流速：0.8mL/min

检测器：紫外检测器，波长224nm

进样体积：50～100uL；

定量

用进样器吸取50μL标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶液的响应值，分别得到标准溶液高效液相色谱图。

本发明制备的复合免疫亲和柱可以有效地利用到苯巴比妥和莱克多巴胺的液相色谱检测中，使检测快捷，精确，安全。

附图说明

图1为样品中苯巴比妥的色谱图；

图2为样品中莱克多巴胺的色谱图。

具体实施方式

实例一：

制备抗苯巴比妥单克隆抗体；莱克多巴胺抗体为市售产品。

动物免疫：免疫动物为6-8周龄左右，雌性BALB/c小鼠。免疫原：ZER-BSA免疫5只小鼠。取适量免疫原(100μg/只)加等量弗氏完全佐剂，制成乳化剂进行免疫，之后佐剂改为不完全佐剂，共免疫6次，每次间隔2周。除第一次为颈背部皮下多点注射外，其余均为腹腔注射。

细胞融合：脾细胞和杂交瘤细胞按照10:1的比例进行细胞融合试验。

杂交瘤细胞克隆化：采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，直到得到对苯巴比妥有很好的特异性反应的细胞。最后筛选出分泌苯巴比妥抗体的杂交瘤细胞9203，制备出单克隆抗体。抗苯巴比妥单克隆抗体细胞已于2014年5月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.9203。

实例二：

本实例为苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱的制备

1.基质制备

称取所需1g的琼脂糖凝胶(Sepharose)基质粉末(每克冻干基质粉末可形成3.5ml终体积的溶胀基质)，溶于1mmol/L HCl中。基质将会立即溶胀，然后置于烧结玻璃过滤器中使用1mmol/L HCl洗涤15min。

2.配体(抗体)偶联

a使用偶联缓冲液0.2mol/L NaHCO₃pH8.3溶解待偶联的抗苯巴比妥单克隆抗体细胞9203分泌的抗苯巴比妥单克隆抗体和市购的莱克多巴胺抗体，抗体浓度为7.8mg/ml，溶解的抗体置于冰浴中暂存。在一个带盖的可完全密封的容器中加入上述含有抗体的偶联缓冲液。迅速将CNBr活化的Sepharose转移到抗体溶液中。室温条件(20-25℃)下采用end-over-end的方式充分混匀上述的混和物2-4h，

b偶联率的计算：离心，2,000RMP×1min，将sepharose离心至管底，将上清液转移至新的离心管中，测定上清液的蛋白质含量值。计算偶联率为99.3％(说明偶联很成功)。取离心至管底的sepharose，使用偶联缓冲液进行洗涤，除去多余的配体。

c封闭：封闭所有残留的活性基团。转移基质至0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中。室温条件下静置2-4h。

d为除去偶联后未偶联上的多余的配体，依次用低、高两种pH的缓冲液对基质进行洗涤，至少洗涤3个循环，每种缓冲液的使用量至少5倍基质体积。

每个洗涤循环步骤：先用0.1mol/L醋酸/醋酸钠缓冲液洗涤，接着再用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液进行洗涤。

e用5倍基质体积的0.01％NaN₃-PBS洗涤，并使用0.01％NaN₃-PBS保存。

3.装柱

使用结合缓冲液制备浆液，以75％沉降基质和25％缓冲液的比例进行混合。以连续性的操作向柱内倾入浆液。使用一个斜靠在柱内壁上的玻璃棒进行填柱操作，将有助于减少气泡的产生。填柱后，关闭亲和柱下端的开口，并取下亲和柱的顶端部件。仔细操作，使用缓冲液加入充填亲和柱的余下部分，以在亲和柱的顶端形成一个向上的弯液面。将顶端筛板以一定的角度插入到亲和柱中，确保在筛板的下方没有空气。将筛板锁定在基质表面适当的位置上，打开亲和柱下方的开口，用5倍柱床体积的无菌过滤的0.01％NaN₃-PBS过柱，并使用0.01％NaN₃-PBS保存，至此苯巴比妥和莱克多巴胺复合亲和柱已装填并平衡完毕，可直接供使用。

实例三：饲料中的苯巴比妥和莱克多巴胺的检测

1.0饲料中的苯巴比妥和莱克多巴胺的检测

饲料添加回收实验，分别添加20μg/kg，50μg/kg，100μg/kg三个浓度梯度。每个实验做五组平行试验。

2.0饲料中的苯巴比妥和莱克多巴胺的提取：

准确称取磨细试样25.0g于250mL具塞锥形瓶中，加入100.0mL乙腈/0.3mol/L NaHCO3(1:1,v/v)溶液，以均质器高速搅拌提取2min。槽纹滤纸过滤，准确移取5.0mL滤液于25mL容量瓶中,用pH7.4PBS定容至25mL，用玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用。

将复合免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取8.0mL样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约2mL/min(1滴/秒)流速缓慢通过复合免疫亲和柱，直至2～3mL空气通过柱体。以2-3mL/min(1-2滴/秒)流速用10.0mL水淋洗柱子1次，弃去全部流出液，并使2mL～3mL空气通过柱体。准确加入2.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1mL/min～2mL/min(1滴/秒)，收集全部洗脱液于玻璃试管中，50℃下氮气浓缩吹干后，用流动相定容至0.5mL，供HPLC分析。

3.0高效液相色谱条件

苯巴比妥

色谱柱：Cloversil-C₁₈,4.6×250mm

流动相：甲醇:水＝50:50(v/v)

流速：0.8mL/min

检测器：紫外检测器，波长254nm

进样体积：50～100uL；

莱克多巴胺：

色谱柱：Cloversil-C₁₈,4.6×250mm

流动相：乙腈：0.05％三氟乙酸＝20：80(v/v)

流速：0.8mL/min

检测器：紫外检测器，波长224nm

进样体积：50～100uL；

4.0定量

用进样器吸取50μL标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶液的响应值(峰高或峰面积)，分别得到标准溶液高效液相色谱图。参考谱图苯巴比妥1，莱克多巴胺见图2

5.0结果

饲料添加回收率结果都在80-120％之间，CV均小于15％。结果表明该方法完全满足饲料中苯巴比妥和莱克多巴胺检测的分析要求。结果分别见表1,表2。

表1 饲料中苯巴比妥添加回收率结果

表1 饲料中莱克多巴胺添加回收率结果

Claims (5)

1.净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱，其特征在于，制备方法如下：

a)基质制备

称取1g琼脂糖凝胶基质粉末，溶于1mmol/L HCl中，然后置于烧结玻璃过滤器中使用1mmol/L HCl洗涤15min；

b)配体偶联

使用偶联缓冲液0.2mol/L NaHCO₃pH8.3溶解待偶联的抗苯巴比妥单克隆抗体和抗莱克多巴胺单克隆抗体，获得抗体溶液，迅速将步骤a)活化的琼脂糖凝胶基质转移到所述抗体溶液中，充分混匀上述的混和物2-4h；

c)配体封闭

封闭所有残留的活性基团，转移经步骤b)处理的琼脂糖凝胶基质至0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中，室温条件下静置2-4h；

d)除去偶联后未偶联上的多余的配体

依次用0.1mol/L醋酸/醋酸钠缓冲液和0.1mol/L Tris-HCl缓冲液对经步骤c)处理后的琼脂糖凝胶基质进行洗涤，至少洗涤3个循环；

e)装柱

用5倍所述琼脂糖凝胶体积的0.01％NaN₃-PBS洗涤，并使用0.01％NaN₃-PBS保存，然后装柱。

2.根据权利要求1所述净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱，其特征在于：所述抗苯巴比妥单克隆抗体采用常规单克隆抗体制备方法制备。

3.根据权利要求1所述净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱，其特征在于：所述制备抗苯巴比妥单克隆抗体的抗苯巴比妥单克隆抗体细胞为细胞保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.9203。

4.一种净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，包括：

a)基质制备

称取1g琼脂糖凝胶基质粉末，溶于1mmol/L HCl中，然后置于烧结玻璃过滤器中使用1mmol/L HCl洗涤15min；

b)配体偶联

使用偶联缓冲液0.2mol/L NaHCO₃pH8.3溶解待偶联的抗苯巴比妥单克隆抗体和抗莱克多巴胺单克隆抗体，获得抗体溶液，迅速将步骤a)活化的琼脂糖凝胶基质转移到所述抗体溶液中，充分混匀上述的混和物2-4h；

c)配体封闭

封闭所有残留的活性基团，转移经步骤b)处理的琼脂糖凝胶基质至0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中，室温条件下静置2-4h；

d)除去偶联后未偶联上的多余的配体

依次用0.1mol/L醋酸/醋酸钠缓冲液和0.1mol/L Tris-HCl缓冲液对经步骤c)处理后的琼脂糖凝胶基质进行洗涤，至少洗涤3个循环；

e)装柱

用5倍所述琼脂糖凝胶体积的0.01％NaN₃-PBS洗涤，并使用0.01％NaN₃-PBS保存，然后装柱。

5.利用权利要求1所述复合免疫亲和柱，进行苯巴比妥和莱克多巴胺检测的方法，其特征在于：包括如下步骤：

用所述复合免疫亲和柱净化待测样液，然后用色谱级甲醇洗脱亲和柱，流速为1mL/min～2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供HPLC分析；

高效液相色谱条件

苯巴比妥

色谱柱：Cloversil-C₁₈,4.6×250mm

流动相：甲醇:水＝50:50(v/v)

流速：0.8mL/min

检测器：紫外检测器，波长254nm

进样体积：50～100uL；

莱克多巴胺：

色谱柱：Cloversil-C₁₈,4.6×250mm

流动相：乙腈：0.05％三氟乙酸＝20：80(v/v)

流速：0.8mL/min

检测器：紫外检测器，波长224nm

进样体积：50～100uL；

定量

用进样器吸取50μL标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶液的响应值，分别得到标准溶液高效液相色谱图。