CN104784972B - 一种橙皮苷类免疫亲和柱的制备及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及应用可特异性识别橙皮苷类的抗体来制备一种橙皮苷类免疫亲和柱及其应用，属于食品药品质量控制领域。其目的是将橙皮苷类成分从复杂的基质中分离出来，可以使复杂的前处理方法变得简单，有效去除干扰成分，解决因为基质多样、干扰严重而不能将同一提取净化方法、色谱条件应用于不同制剂和药材的问题。

Description

一种橙皮苷类免疫亲和柱的制备及其应用
技术领域：
一种橙皮苷类免疫亲和柱的制备及其应用，属于利用生物技术方法进行食品药品质量控制领域。
背景技术：
陈皮为常用中药材，应用较为广泛，有理气健脾，燥湿化痰的功效，《中国药典》2010年版一部中以陈皮为处方成分的中药制剂达129种，但由于成方制剂成分复杂，干扰严重，所以多数含陈皮的中药制剂中尚未建立陈皮中有效成分橙皮苷类成分的质控方法。
中药基质成分复杂，有效成分含量低，样品前处理净化技术很大程度上决定着分析的成败。随着科学技术的不断发展，现代仪器分析与检测技术的效率与传统分析技术相比有了大幅度提高，但样品前处理净化方式依然多为传统的液液萃取，柱层析等粗犷方式，使得样品前处理与检测技术之间的差距越来越大，样品的前处理已成为现代分析的瓶颈。
传统的净化方式需要使用大量的有机溶剂，缺乏选择性，费时繁琐。针对不同基质还可能需要设计不同的方法，使得虽然针对相同成分，但在不同中药制剂中，检测技术却较难统一。
免疫亲和层析将生物技术与固相萃取相结合，根据待测物与抗体之间有选择性的和可逆的相互作用从而将分析物从复杂的样品基质中分离出来。免疫亲和层析作为样品的前处理方法，集分离、净化和浓缩功能于一体，简化了分离净化等复杂的前处理步骤；选择性好，专属性强，选择性的吸附目标成分，延长了仪器及色谱柱的使用寿命；简单、经济、环保，减少了有机溶剂的使用；便于实现标准化、自动化操作。
发明内容:
本发明涉及应用可特异性识别橙皮苷类的抗体来制备一种橙皮苷类免疫亲和柱及其应用。其目的是将橙皮苷类成分从复杂的基质中分离出来，可以使复杂的前处理方法变得简单，有效去除干扰成分，解决因为基质多样、干扰严重而不能将同一提取净化方法、色谱条件应用于不同制剂和药材的问题，进而实现将药材及含有该药材的成方制剂的含量测定方法统一。
为了达到上述目的，在本发明中，制备出了橙皮苷类载体，再用交联剂将载体进行交联。交联后的载体装柱后就形成了高亲和力的橙皮苷类免疫亲和柱。该亲和柱操作简便，纯化橙皮苷类成分效率高。样本经过简单的处理后就可以进行纯化，得到纯度很高的橙皮苷类成分。用于含陈皮中药制剂的质量控制。
具体操作如下：
1.载体活化
选择琼脂糖载体，sepharose4B，以环氧氯丙烷活化法进行活化。
取2%的预溶胀的琼脂糖凝胶sepharose4B，用20倍体积的蒸馏水充分冲洗，洗去残存的乙醇，用漏斗过滤掉水分。
称取滤去水份后的湿凝胶5克，加入7.5毫升0.8M的NaOH，30%的环氧氯丙烷2毫升，2mg/ml的硼氢化钠NaBH4 5毫升，在25℃下摇床反应8小时。
反应后，用大量的蒸馏水洗涤，去除凝胶中混杂的环氧氯丙烷。
2.抗橙皮苷类抗体与蛋白G-sepharose载体连接
将抗体连接于琼脂糖上。将抗橙皮苷类抗体溶于20mM PH7.4的PBS中，终浓度2mg/ml。将抗体加入用20Mm PH7.4的PBS缓冲液洗涤过的凝胶中。室温结合30分钟。
结合后的载体用PBS洗涤。连接有抗体的载体命名为抗体—sepharose。
3.载体交联
将抗体—sepharose用0.1M PH9.0的硼酸缓冲液洗涤3次。然后加入0.1M PH9.0的硼酸缓冲液，在缓冲液中加入交联剂如庚二亚氨酸二甲酯（DMP）至终浓度20mM。室温交联1小时。
加入50mM PH9.0 的乙醇胺终止反应。并用50mM的乙醇胺封闭10分钟。
交联后的抗体—sepharose载体用20mM PH7.4的PBS洗涤3次。
4.装柱
将交联后的抗体—琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的橙皮苷类亲和纯化柱。
与现有技术相比，本发明特异性强，纯化效果显著。该橙皮苷类免疫亲和层析柱可提高富集和纯化的效率。
附图说明
图1：橙皮苷类免疫亲和柱结构示意图
A：进样口； B：柱体； C：筛板； D：橙皮苷类抗体-sepharose填料 E：筛板； F：出样口
图2：舒肝止痛丸的HPLC图谱（未使用本发明提供的橙皮苷类免疫亲和柱净化）
图3：舒肝止痛丸的HPLC图谱（使用本发明提供的橙皮苷类免疫亲和柱净化）
图4：益气养血口服液的HPLC图谱（未使用本发明提供的橙皮苷类免疫亲和柱净化）
图5：益气养血口服液的HPLC图谱（使用本发明提供的橙皮苷类免疫亲和柱净化）
实施例1：橙皮苷类免疫亲和纯化柱的制备
本发明制备橙皮苷类免疫亲和纯化柱的一个优选的实施方案如下：
1.琼脂糖凝胶活化
取2%的琼脂糖凝胶sepharose4B，用20倍体积的蒸馏水充分冲洗，洗去残存的乙醇。用漏斗过滤掉水分。称取滤去水份后的湿凝胶5克，加入7.5毫升0.8M的NaOH，30%的环氧氯丙烷2毫升，2mg/ml的硼氢化钠NaBH4,5毫升，在25℃下摇床反应8小时。
反应后，用50毫升蒸馏水洗涤，去除凝胶中混杂的环氧氯丙烷。
2.抗橙皮苷类IgG单抗与sepharose结合
将抗橙皮苷类抗体溶于20mM PH7.4的PBS中，终浓度2mg/ml，总体积10ml。
将sepharose用20Mm PH7.4的PBS缓冲液洗涤三次，每次30ml。将溶解于PBS中的橙皮苷类抗体加入洗涤过的sepharose中。室温结合30分钟。
结合后的载体用20Mm PH7.4的PBS洗涤三次，每次30ml。连接有抗体的载体命名为抗体—sepharose。
3.结合IgG的琼脂糖sepharose交联
将抗体—sepharose用0.1M PH9.0的硼酸缓冲液洗涤3次，每次30ml。
将湿凝胶固体，加入0.1M PH9.0的硼酸缓冲液20ml，在缓冲液中加入交联剂庚二亚氨酸二甲酯（DMP）至终浓度20mM。室温交联1小时。
加入100mM,PH9.0 的乙醇胺20ml终止反应。并用50mM的乙醇胺20ml封闭10分钟。
交联后的抗体—sepharose载体用20mM PH7.4的PBS洗涤3次，每次30ml。
4.装柱
将交联后的sepharose用10毫升20mM PBS PH7.4重悬，然后装入空的亲和纯化柱柱体中。
实施例2：利用橙皮苷类免疫亲和柱纯化和检测舒肝止痛丸中的橙皮苷类成分
1.舒肝止痛丸样品处理:
取本品10g，研细，取约2g，精密称定，精密加入甲醇50ml超声提取30分钟，补重，离心3分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液1ml至100ml量瓶中，加水至刻度。
2.将橙皮苷类免疫亲和纯化柱室温平衡30分钟。
3.取出免疫亲和柱，进样口与注射器针筒连接，注射器接入到气控操作架上。
4.用去离子水洗涤亲和柱3次，每次10毫升，调节气孔操作架气泵压力，使液体以每分钟3ml的流速流出。量取25ml通过橙皮苷类免疫亲和柱，流速3ml，用水20ml洗涤，洗脱液除去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，用2ml甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，。
5.用蒸馏水洗涤纯化柱3次，每次5毫升。
6.加入2ml甲醇，收集洗脱产物,并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
7.洗脱产物用高效液相色谱HPLC检测。
实施例3：利用橙皮苷类免疫亲和柱纯化和检测益气养血口服液中的橙皮苷类成分
1.益气养血口服液样品处理:
精密量取本品3ml，置10ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理(功率250W，频率33kHz)30分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取上清液1ml至25ml量瓶中，加水至刻度。精密量取1ml置50ml量瓶中，加水至刻度。
2.将橙皮苷类免疫亲和纯化柱室温平衡30分钟。
3.取出免疫亲和柱，进样口与注射器针筒连接，注射器接入到气控操作架上。
4.用去离子水洗涤亲和柱3次，每次10毫升，调节气孔操作架气泵压力，使液体以每分钟3ml的流速流出。量取25ml通过橙皮苷类免疫亲和柱，流速3ml，用水20ml洗涤，洗脱液除去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，用2ml甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，。
5.用蒸馏水洗涤纯化柱3次，每次5毫升。
6.加入2ml甲醇，收集洗脱产物,并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
7.洗脱产物用高效液相色谱HPLC检测。
实施例4：柚皮芸香苷及橙皮苷的载样量及回收率考察
橙皮苷及柚皮芸香苷的载样量及回收率考察，采用橙皮苷类免疫亲和柱的最优条件，结果见下表，结果表明橙皮苷的载样量为8ug，回收率为95~109%，柚皮芸香苷的载样量为5.6ug，回收率为99~106%。
表1 橙皮苷的载样量与回收率考察
序号 上样量(ug) 洗脱量(ug) 回收率
1 15.39 9.36 60.82%
2 15.39 9.82 63.81%
3 10.26 7.81 76.12%
4 10.26 8.15 79.43%
5 8.21 7.86 95.73%
6 8.21 8.03 97.83%
7 2.05 2.07 100.69%
8 2.05 1.96 95.47%
9 0.51 0.49 96.41%
10 0.51 0.56 109.15%
表2 柚皮芸香苷的载样量与回收率考察
序号 上样量(ug) 洗脱量(ug) 回收率
1 7.46 5.70 76.52%
2 7.46 5.67 76.10%
3 5.59 5.56 99.49%
4 5.59 5.92 105.82%
5 5.59 5.95 106.47%
6 5.59 5.56 99.51%
7 4.66 4.82 103.44%
8 4.66 4.87 104.50%
9 4.66 4.86 104.26%
10 4.66 4.91 105.42%
将一定量的橙皮苷与柚皮芸香苷混和后，上免疫亲和柱，考察两种成分同时存在时的载样量与回收率，结果见下表，从表中可以看出，当柚皮芸香苷为3.728ug，橙皮苷为5.41ug时，两种成分的回收率均可达90%以上。
表3 橙皮苷与柚皮芸香苷的混合回收率与载样量考察

Claims (2)

1.一种橙皮苷类免疫亲和柱在检测橙皮苷和柚皮芸香苷中的应用，
所述橙皮苷类免疫亲和柱包含有载体和橙皮苷类抗体；
所述的载体是琼脂糖凝胶，所述的琼脂糖凝胶包含但不限于溴化氰活化的琼脂糖凝胶、交联的琼脂糖凝胶、聚丙烯酸琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶以及纤维素；
所述的橙皮苷类抗体包括单克隆IgG抗体或多克隆抗体；
所述橙皮苷类免疫亲和柱制备方法为:
1)载体活化
取2％的预溶胀的琼脂糖凝胶sepharose4B，用20倍体积的蒸馏水充分冲洗，洗去残存的乙醇，用漏斗过滤掉水分，称取滤去水分后的湿凝胶5克，加入7.5毫升0.8M的NaOH溶液，30％的环氧氯丙烷2毫升，2mg/ml的硼氢化钠5毫升，在25℃下摇床反应8小时，反应后，用大量的蒸馏水洗涤，去除凝胶中混杂的环氧氯丙烷；
2)橙皮苷类抗体与琼脂糖凝胶载体连接
将抗体连接于琼脂糖凝胶上，将橙皮苷类抗体溶于20mM pH7.4的PBS中，终浓度2mg/ml，将抗体加入用20mM pH7.4的PBS缓冲液洗涤过的凝胶中，室温结合30分钟，结合后的载体用PBS洗涤，连接有抗体的载体命名为抗体—sepharose；
3)载体交联
将抗体—sepharose用0.1M pH9.0的硼酸缓冲液洗涤3次，然后加入0.1M pH9.0的硼酸缓冲液，在缓冲液中加入交联剂庚二亚氨酸二甲酯至终浓度20mM，室温交联1小时，加入50mM pH9.0的乙醇胺终止反应，并用50mM的乙醇胺封闭10分钟，交联后的抗体—sepharose载体用20mM pH7.4的PBS洗涤3次；
4)装柱
将交联后的抗体—sepharose载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的橙皮苷类免疫亲和柱，放于4℃保存。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包含但不限于中药中橙皮苷类成分的分离纯化。
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