CN105195115B - 二乙氨乙基化葡聚糖修饰以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及二乙氨乙基化葡聚糖修饰以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质及制备方法和应用；首先是接枝用DEAE Dextran分子量的选择；其次，DEAE Dextran水溶液浓度的控制；再次，偶联DEAE Dextan前扩散时间的确定；最后，偶联DEAE Dextran的反应时间和氢氧化钠浓度、体积的确定。本发明的DEAE Dextran修饰以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质在不同的修饰密度时对蛋白质均具有很强的吸附特性，表现出了很高的吸附容量和吸附速率，提高了分离效率。介质清洗、除菌方便，易于再生，生物相容性好，制备方法简单、低毒，在蛋白质高效快速分离纯化中将有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及二乙氨乙基化葡聚糖修饰以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质及制备方法和应用，在提高蛋白质吸附容量和传质速率中有明显提高，属于生物技术领域中的蛋白质色谱分离技术。
背景技术
二乙氨乙基化葡聚糖(DEAE Dextran)是葡聚糖上修饰有二乙氨乙基(DEAE)的一种长链阳离子聚电解质。DEAE Dextran带正电荷，可以可逆性吸附带负电荷的物质。DEAEDextran具有较好的生物相容性，多应用于基因转染和蛋白的持续缓释传递。近年来，研究者发现DEAE Dextran也可以应用于生物传感器中的细胞固定化。
DEAE Dextran分子量较大，具有较多的羟基，容易通过间隔臂与色谱基质偶联而获得DEAE Dextran接枝的色谱介质。葡聚糖与蛋白质之间基本没有非特异性相互作用，并且在碱性溶液中具有很高的稳定性。葡聚糖链具有较高的柔韧性和灵活性，其吸附位点和蛋白质的结合也更加灵活。此外，DEAE Dextran带正电荷，不需要进行配基偶联反应，可以简化接枝色谱介质合成工艺。因此，DEAE Dextran十分适用于色谱基质的接枝修饰。
然而，目前DEAE Dextran多应用于基因的转染，鲜少有研究涉及在以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质上接枝DEAE Dextran以改变蛋白质在离子交换剂上的吸附容量和吸附速率。并且，在接枝型色谱介质中，利用葡聚糖作为接枝链修饰色谱基质的研究大多采用小分子量且不带电荷的葡聚糖作为接枝链。采用这种小分子中性葡聚糖作为接枝链，通常是先将中性葡聚糖接枝到色谱基质的表面，然后通过配基功能化，使葡聚糖接枝链与色谱基质表面同时偶联上离子交换配基，最终得到接枝型离子交换介质。一方面，合成工艺较为复杂；另一方面，中性小分子量葡聚糖修饰的离子交换色谱介质，虽然在一定程度上能够提升蛋白的吸附容量和传质速率，但是提升程度非常有限。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，进而提供一种提高蛋白质吸附性能的DEAE Dextran修饰的以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质。DEAE Dextran修饰的以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质同时具有高吸附容量和高传质速率的优点。本发明即为将荷电DEAEDextran修饰的以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质应用于蛋白质的快速高效吸附中，DEAEDextran修饰的以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质具有高吸附容量和高传质速率的优点，相较于传统非接枝型色谱介质及小分子中性葡聚糖修饰的离子交换色谱介质，能够大幅度的提升吸附容量和传质速率，合成工艺简单，成本低廉，生物相容性好，安全低毒。因此，DEAEDextran修饰的以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质非常适用于蛋白质的快速高效吸附中。
本发明的技术方案概述如下：
一种用于提高蛋白质吸附容量和传质速率的DEAE Dextran修饰以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质的制备方法，为在以琼脂糖凝胶为基础的颗粒表面通过引进环氧基间隔臂进而修饰DEAE Dextran。
制备DEAE Dextran修饰以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质的DEAE Dextran(Mw300-500kDa)的结构单元如下(不代表真实的配基比例与分布)：
上述DEAE Dextran修饰的以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质包括直接在琼脂糖凝胶表面修饰DEAE Dextran得到的介质以及在偶联DEAE的琼脂糖凝胶表面修饰DEAEDextran得到的介质。
直接在琼脂糖凝胶表面修饰DEAE Dextran的介质结构式(Ⅰ)示意如下(不代表真实的配基比例与分布)：
在偶联DEAE的琼脂糖凝胶表面修饰DEAE Dextran的介质结构式(Ⅱ)示意如下(不代表真实的配基比例与分布)：
本发明DEAE Dextran修饰以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质中，直接在琼脂糖凝胶表面修饰DEAE Dextran结构式(Ⅰ)的介质制备方法如下：
利用环氧氯丙烷活化法在琼脂糖凝胶为基础的颗粒表面引进环氧基间隔臂，然后在平均环氧基密度大于40mmol/L的琼脂糖凝胶介质中加入等体积的DEAE Dextran溶液，使DEAE Dextran充分扩散到介质孔道内；然后向介质悬浮液中加入氢氧化钠溶液，置于恒温水浴摇床中反应；反应产物经去离子水反复冲洗至中性后，用硼氢化钠溶液还原琼脂糖凝胶介质表面残留的环氧基，还原后的琼脂糖凝胶介质再次用去离子水反复冲洗，得到结构式(Ⅰ)的琼脂糖表面修饰DEAE Dextran介质。
所述的DEAE Dextran溶液浓度为200-600mg/mL；置于20-35℃的恒温水浴摇床中，120-200rpm搅拌混合1-12h，使DEAE Dextran充分扩散到介质孔道内。
所述的氢氧化钠溶液浓度为0.1-2mol/L的，氢氧化钠溶液体积用量为活化的琼脂糖凝胶介质体积量的0.1-2倍，置于20-35℃恒温水浴摇床中，120-200rpm下反应12-60h。
所述的硼氢化钠溶液浓度为0.3g/L-1g/L。
本发明中二乙氨乙基化葡聚糖修饰以琼脂糖凝胶为基础的结构式(Ⅱ)的色谱介质的制备方法，只是将琼脂糖凝胶先处理，方法为：在琼脂糖凝胶表面偶联二乙氨乙基(DEAE)，利用环氧氯丙烷活化法在以表面偶联DEAE的琼脂糖凝胶为基础的颗粒表面引进环氧基间隔臂；然后与在琼脂糖凝胶表面修饰DEAE Dextran结构式(Ⅰ)的介质制备方法相同，得到结构式(Ⅱ)的在琼脂糖凝胶为基础的表面修饰DEAE Dextran介质。
偶联DEAE的琼脂糖凝胶介质的DEAE密度为30-103mmol/L。
本发明的二乙氨乙基化葡聚糖修饰以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质应用于蛋白质高效分离纯化中，提升蛋白质的吸附容量和吸附速率。
本发明首先是接枝用DEAE Dextran分子量的选择，分子量较高的DEAE Dextran有利于获得吸附性能较好的接枝介质；其次，DEAE Dextran水溶液浓度的控制，高浓度的DEAEDextran水溶液有利于获得高接枝密度的DEAE Dextran修饰介质；再次，偶联DEAE Dextan前扩散时间的确定，合适的扩散时间有利于DEAE Dextran大分子充分进入介质孔道，进而有助于偶联反应。最后，偶联DEAE Dextran的反应时间和氢氧化钠浓度、体积的确定，充足的偶联时间及偶联时合适的氢氧化钠浓度与体积有助于获得高接枝密度的DEAE Dextran修饰介质。
经实验证明，DEAE Dextran修饰以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质在不同的修饰密度时对蛋白质均具有很强的吸附特性，表现出了很高的吸附容量和吸附速率，提高了分离效率。介质清洗、除菌方便，易于再生，生物相容性好，制备方法简单、低毒，在蛋白质高效快速分离纯化中将有广阔的应用前景。
附图说明
图1：牛血清白蛋白的吸附等温线；
图2：牛血清白蛋白溶液浓度随时间的变化曲线。
具体实施方式
下面的实例将对本发明提供的方法予以进一步的说明。
本发明DEAE Dextran修饰以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质中，直接在琼脂糖凝胶表面修饰DEAE Dextran结构式(Ⅰ)的介质制备方法如下：
利用环氧氯丙烷活化法在琼脂糖凝胶表面引进环氧基间隔臂，然后在平均环氧基密度大于40mmol/L的琼脂糖凝胶介质中加入等体积的DEAE Dextran溶液，DEAE Dextran溶液浓度为200-600mg/mL；置于20-35℃的恒温水浴摇床中，120-200rpm搅拌混合1-12h，使DEAE Dextran充分扩散到介质孔道内；然后向介质悬浮液中加入浓度为0.1-2mol/L的氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液体积用量为活化的琼脂糖凝胶介质体积量的0.1-2倍，置于20-35℃恒温水浴摇床中，120-200rpm下反应12-60h；反应产物经去离子水反复冲洗至中性后，用0.3g/L-1g/L的硼氢化钠溶液还原琼脂糖凝胶介质表面残留的环氧基，还原后的琼脂糖凝胶介质再次用去离子水反复冲洗，得到结构式(Ⅰ)的琼脂糖表面修饰DEAE Dextran介质。
其中，利用环氧氯丙烷活化法在琼脂糖凝胶为基础的颗粒表面引进环氧基间隔臂进而得到表面环氧基密度大于40mmol/L的琼脂糖凝胶介质可以通过通用方法得到或者通过如下实验条件得到：
在琼脂糖凝胶中加入二甲基亚砜和环氧氯丙烷，混合制得混合悬浮液，二甲基亚砜体积用量为琼脂糖凝胶介质体积的2倍；环氧氯丙烷体积用量为琼脂糖凝胶介质体积的1-2倍；再向混合悬浮液中加入浓度为1.0mol/L氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液体积为琼脂糖凝胶介质体积的2倍，置于25℃的恒温水浴摇床中，170rpm活化1-4h后，用去离子水洗涤介质至无游离环氧氯丙烷，得到表面带有活性环氧基的琼脂糖凝胶介质。
本发明DEAE Dextran修饰以琼脂糖凝胶凝胶为基础的色谱介质中，在偶联DEAE的琼脂糖凝胶表面修饰DEAE Dextran结构式(Ⅱ)的介质制备方法如下：
利用环氧氯丙烷活化法在偶联DEAE的琼脂糖凝胶表面引进环氧基间隔臂，然后在平均环氧基密度大于40mmol/L的的琼脂糖凝胶介质中加入等体积的DEAE Dextran，琼脂糖凝胶偶联的DEAE密度为30-103mmol/L，DEAE Dextran溶液浓度为203-600mg/mL；置于20-35℃的恒温水浴摇床中，120-200rpm搅拌混合1-12h，使DEAE Dextran充分扩散到介质孔道内；然后向介质悬浮液中加入浓度为0.1-2mol/L的氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液体积用量为活化的琼脂糖凝胶介质体积量的0.1-2倍，置于20-35℃恒温水浴摇床中，120-200rpm下反应12-60h；反应产物经去离子水反复冲洗至中性后，用0.3g/L-1g/L的硼氢化钠溶液还原琼脂糖凝胶介质表面残留的环氧基，还原后的琼脂糖凝胶介质再次用去离子水反复冲洗，制得结构式(Ⅱ)的在偶联DEAE的琼脂糖凝胶表面修饰DEAE Dextran的介质。
其中，表面偶联DEAE的琼脂糖凝胶以及利用环氧氯丙烷活化偶联DEAE的琼脂糖凝胶介质得到表面环氧基密度大于40mmol/L的偶联DEAE的琼脂糖凝胶介质可以通过通用方法得到或者通过如下实验条件得到：
琼脂糖凝胶表面偶联DEAE：在琼脂糖凝胶中加入一定浓度(0.2-4mol/L)的二乙氨氯乙烷盐酸盐溶液，制备介质悬浮液，二乙氨氯乙烷盐酸盐溶液体积用量为介质体积量的2倍。再向混合悬浮液中加入浓度为3.5mol/L的氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液体积为介质体积的2倍，置于60℃的恒温水浴中，170rpm反应0.3-1h，之后用去离子水冲洗介质至无游离的二乙氨氯乙烷盐酸盐与氢氧化钠，制得表面偶联DEAE的琼脂糖凝胶；
环氧氯丙烷活化表面偶联DEAE的琼脂糖凝胶介质：在表面偶联DEAE的琼脂糖凝胶中加入二甲基亚砜和环氧氯丙烷，混合制得混合悬浮液，二甲基亚砜体积用量为表面偶联DEAE的琼脂糖凝胶介质体积的2倍；环氧氯丙烷体积用量为表面偶联DEAE的琼脂糖凝胶介质体积的1-2倍；再向混合悬浮液中加入浓度为1.0mol/L氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液体积为表面偶联DEAE的琼脂糖凝胶介质体积的2倍，置于25℃的恒温水浴摇床中，170rpm活化1-4h后，用去离子水洗涤介质至无游离环氧氯丙烷，得到表面带有活性环氧基的偶联DEAE的琼脂糖凝胶介质；
实施例1：
(1)取G3漏斗抽干的1g琼脂糖凝胶放入50mL锥形瓶中，依次加入2mL的二甲基亚砜，1.3mL的环氧氯丙烷，在25℃，170rpm摇床中混匀0.5h。然后加入2mL的氢氧化钠(1mol/L)，反应2.5h。用去离子水反复冲洗，直到清洗液用酚酞–Na2S2O3溶液检测不变色，制得表面带有活性环氧基的琼脂糖凝胶介质。表面带有活性环氧基的琼脂糖凝胶介质的环氧基修饰密度为51mmol/L。
(2)将用G3漏斗抽干的1g表面带有活性环氧基的琼脂糖凝胶介质加入到1mL的DEAE Dextran(Mw 500kDa)水溶液(200mg/mL)中，置于20℃恒温摇床中，120rpm扩散1h，使DEAE Dextran充分扩散到介质孔道内，之后加入2mL的氢氧化钠(0.1mol/L)，20℃，120rpm反应48h以使DEAE Dextran偶联到琼脂糖凝胶上，用去离子水反复冲洗，直到清洗液用酚酞检测不变色，再将介质置于0.3g/L的硼氢化钠溶液中，室温反应12h还原介质表面残留环氧基，还原后的介质再次用去离子水反复冲洗，制得结构式(Ⅰ)的离子交换容量为45mmol/L的DEAE Dextran接枝琼脂糖凝胶介质。
实施例2：
将G3漏斗抽干的3g实施例1步骤(1)中的表面带有活性环氧基的琼脂糖凝胶介质加入到3mL的DEAE Dextran(Mw 500kDa)水溶液(300mg/mL)中，置于25℃恒温摇床中，170rpm扩散2.5h，使DEAE Dextran充分扩散到介质孔道内，加入3mL的氢氧化钠(1mol/L)，25℃，170rpm反应48h以使DEAE Dextran偶联到琼脂糖凝胶上，用去离子水反复冲洗，直到清洗液用酚酞检测不变色，再将介质置于0.5g/L的硼氢化钠溶液中，室温反应12h还原介质表面残留环氧基，还原后的介质再次用去离子水反复冲洗，制得结构式(Ⅰ)的离子交换容量为90mmol/L的DEAE Dextran接枝琼脂糖凝胶介质。
实施例3：
将G3漏斗抽干的5g实施例1步骤(1)中的表面带有活性环氧基的琼脂糖凝胶介质加入到5mL的DEAE Dextran(Mw 500kDa)水溶液(600mg/mL)中，置于25℃恒温摇床中，200rpm扩散2.5h，使DEAE Dextran充分扩散到介质孔道内，加入5mL的氢氧化钠(1mol/L)，25℃，170rpm反应60h以使DEAE Dextran偶联到琼脂糖凝胶上，用去离子水反复冲洗，直到清洗液用酚酞检测不变色，再将介质置于0.5g/L的硼氢化钠溶液中，室温反应12h还原介质表面残留环氧基，还原后的介质再次用去离子水反复冲洗，制得结构式(Ⅰ)的离子交换容量为199mmol/L的DEAE Dextran接枝琼脂糖凝胶介质。
实施例4：
将G3漏斗抽干的6g实施例1步骤(1)中的表面带有活性环氧基的琼脂糖凝胶介质加入到6mL的DEAE Dextran(Mw 300kDa)水溶液(500mg/mL)中，置于35℃恒温摇床中，200rpm扩散12h，使DEAE Dextran充分扩散到介质孔道内，加入0.6mL的氢氧化钠(2mol/L)，35℃，200rpm反应12h以使DEAE Dextran偶联到琼脂糖凝胶上，用去离子水反复冲洗，直到清洗液用酚酞检测不变色，再将介质置于1g/L的硼氢化钠溶液中，室温反应12h还原介质表面残留环氧基，还原后的介质再次用去离子水反复冲洗，制得结构式(Ⅰ)的离子交换容量为109mmol/L的DEAE Dextran接枝琼脂糖凝胶介质。
实施例5：
在G3漏斗抽干的1g琼脂糖凝胶中加入2mL的二乙氨氯乙烷盐酸盐(0.5mol/L)，在60℃，170rpm摇床中混匀10min。然后加入2mL的温度为60℃的氢氧化钠(3.5mol/L)，反应35min。用去离子水冲洗介质至无游离的二乙氨氯乙烷盐酸盐与氢氧化钠，制得离子交换容量为30mmol/L的表面带有DEAE的琼脂糖凝胶介质。
在G3漏斗抽干的1g离子交换容量为30mmol/L的表面带有DEAE的琼脂糖凝胶介质中，依次加入2mL的二甲基亚砜，1.5mL的环氧氯丙烷，在25℃，170rpm摇床中混匀0.5h。然后加入2mL的氢氧化钠(1mol/L)，反应2.5h。用去离子水洗涤介质至无游离环氧氯丙烷，制得表面带有环氧基的偶联DEAE的琼脂糖凝胶介质。表面带有活性环氧基的表面偶联DEAE的琼脂糖凝胶介质的环氧基修饰密度为47mmol/L。
将1mL的DEAE Dextran(Mw 500kDa)水溶液(203mg/mL)加入到表面带有环氧基的修饰DEAE的琼脂糖凝胶介质(1g)中，置于20℃，120rpm摇床中扩散1h，使DEAE Dextran充分扩散到介质孔道内，加入1mL的氢氧化钠(1mol/L)，20℃，170rpm反应48h以使DEAE Dextran偶联到琼脂糖凝胶上，用去离子水反复冲洗，直到清洗液用酚酞检测不变色，再将介质置于0.3g/L的硼氢化钠溶液中，室温反应12h还原介质表面残留环氧基，还原后的介质再次用去离子水反复冲洗，制得结构式(Ⅱ)的离子交换容量为75mmol/L的DEAE Dextran修饰的表面偶联DEAE的琼脂糖凝胶介质。
实施例6：
在G3漏斗抽干的5g琼脂糖凝胶中加入10mL的二乙氨氯乙烷盐酸盐(3.0mol/L)，在60℃，170rpm摇床中混匀10min。然后加入10mL的温度为60℃的氢氧化钠(3.5mol/L)，反应1h。用去离子水冲洗介质至无游离的二乙氨氯乙烷盐酸盐与氢氧化钠，制得离子交换容量为103mmol/L的表面带有DEAE的琼脂糖凝胶介质。
在G3漏斗抽干的5g离子交换容量为103mmol/L的表面带有DEAE的琼脂糖凝胶介质中，依次加入10mL的二甲基亚砜，7.8mL的环氧氯丙烷，在25℃，170rpm摇床中混匀0.5h。然后加入10mL的氢氧化钠(1mol/L)，反应2.5h。用去离子水洗涤介质至无游离环氧氯丙烷，制得表面带有环氧基的偶联DEAE的琼脂糖凝胶介质。表面带有活性环氧基的表面偶联DEAE的琼脂糖凝胶介质的环氧基修饰密度为53mmol/L。
将5mL的DEAE Dextran(Mw 500kDa)水溶液(250mg/mL)加入到5g表面带有环氧基的修饰DEAE的琼脂糖凝胶介质中，置于25℃，170rpm摇床中扩散12h，使DEAE Dextran充分扩散到介质孔道内，加入5mL的氢氧化钠(1mol/L)，25℃，170rpm摇床中反应48h以使DEAEDextran偶联到琼脂糖凝胶上，用去离子水反复冲洗，直到清洗液用酚酞检测不变色，再将介质置于0.5g/L的硼氢化钠溶液中，室温反应12h还原介质表面残留环氧基，还原后的介质再次用去离子水反复冲洗，制得结构式(Ⅱ)的离子交换容量为149mmol/L的DEAE Dextran修饰的表面偶联DEAE的琼脂糖凝胶介质。
实施例7：
在G3漏斗抽干的10g琼脂糖凝胶中加入20mL的二乙氨氯乙烷盐酸盐(1.5mol/L)，在60℃，170rpm摇床中混匀10min。然后加入20mL的温度为60℃的氢氧化钠(3.5mol/L)，反应1h。用去离子水冲洗介质至无游离的二乙氨氯乙烷盐酸盐与氢氧化钠，制得离子交换容量为65mmol/L的表面带有DEAE的琼脂糖凝胶介质。
在G3漏斗抽干的10g离子交换容量为65mmol/L的表面带有DEAE的琼脂糖凝胶介质中，依次加入20mL的二甲基亚砜，16mL的环氧氯丙烷，在25℃，170rpm摇床中混匀0.5h。然后加入20mL的氢氧化钠(1mol/L)，反应2.5h。用去离子水洗涤介质至无游离环氧氯丙烷，制得表面带有环氧基的偶联DEAE的琼脂糖凝胶介质。表面带有活性环氧基的表面偶联DEAE的琼脂糖凝胶介质的环氧基修饰密度为55mmol/L。
将10mL的DEAE Dextran(Mw 500kDa)水溶液(600mg/mL)加入到10g表面带有环氧基的修饰DEAE的琼脂糖凝胶介质中，35℃，200rpm摇床中扩散2.5h，使DEAE Dextran充分扩散到介质孔道内，加入10mL的氢氧化钠(1mol/L)，35℃，200rpm摇床中反应60h以使DEAEDextran偶联到琼脂糖凝胶上，用去离子水反复冲洗，直到清洗液用酚酞检测不变色，再将介质置于1g/L的硼氢化钠溶液中，室温反应12h还原介质表面残留环氧基，还原后的介质再次用去离子水反复冲洗，制得结构式(Ⅱ)的离子交换容量为224mmol/L的DEAE Dextran修饰的表面偶联DEAE的琼脂糖凝胶介质。
实施例8：不同的介质对牛血清白蛋白的静态吸附实验
将实施例1、2、3、4、5、6、7中DEAE Dextran修饰的以琼脂糖凝胶为基础的介质分别用20mmol/L Tris–HCl缓冲液(pH 8)平衡后，再将G3漏斗抽干的0.05g平衡后介质分别加入到5mL用平衡缓冲液配制的不同浓度的牛血清白蛋白中，上述介质悬浮液置于25℃，170rpm恒温水浴震荡24h后，离心收集上清液在280nm下测吸光值，通过物料衡算确定蛋白质在介质上的吸附量。
比较：将商品化介质DEAE Sepharose FF(离子交换容量为153mmol/L)用20mmol/LTris–HCl缓冲液(pH 8)平衡后，再将G3漏斗抽干的0.05g平衡后介质加入到用平衡缓冲液配制的不同浓度的牛血清白蛋白中，上述介质悬浮液置于25℃和170rpm恒温水浴震荡24h后，离心收集的上清液在280nm下测吸光值，通过物料衡算确定蛋白质在介质上的吸附量。
实施例中获得的DEAE Dextran修饰以琼脂糖凝胶为基础的介质与商品化介质DEAE Sepharose FF分别对牛血清白蛋白的吸附量如表1所示。相应的吸附等温线如图1所示。
表1不同介质对牛血清白蛋白的吸附容量和传质速率
由结果可知，在相同的缓冲液条件下，DEAE Dextran修饰以琼脂糖凝胶为基础的介质(实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7中的介质)对牛血清白蛋白的静态饱和吸附容量是商品化介质DEAE Sepharose FF饱和吸附容量的1.25-2.66倍。这说明DEAE Dextran修饰以琼脂糖凝胶为基础的介质显著提高了蛋白质的吸附容量。
实施例9：不同的介质对牛血清白蛋白的吸附动力学实验
将实施例1、2、3、4、5、6、7中DEAE Dextran修饰的以琼脂糖凝胶为基础的介质分别用20mmol/L Tris–HCl缓冲液(pH 8)平衡后，经G3漏斗抽干后取0.25g分别加入100mL含有1mg/mL的牛血清白蛋白的相应平衡缓冲液中，上述介质悬浮液置于25℃恒温水浴，搅拌速度为280rpm，通过实时在线检测蛋白质溶液在280nm下的吸光值，从而确定蛋白质溶液浓度随时间变化的曲线，求得蛋白质在介质中的传质速率，用有效孔扩散系数与牛血清白蛋白在自由溶液中扩散系数的比值(De/D0)来代表。
比较：将商品介质DEAE Sepharose FF用20mmol/L Tris–HCl缓冲液(pH 8)平衡后，经G3漏斗抽干后称取0.25g加入100mL含有1mg/mL的牛血清白蛋白的相应的平衡缓冲液中，上述介质悬浮液置于25℃恒温水浴，搅拌速度为280rpm，通过实时在线检测蛋白质溶液在280nm下的吸光值，从而确定蛋白质溶液浓度随时间变化的曲线，求得蛋白质在介质中的传质速率，用有效孔扩散系数与牛血清白蛋白在自由溶液中扩散系数的比值(De/D0)来代表。
牛血清白蛋白分别在实施例中获得的DEAE Dextran修饰以琼脂糖凝胶为基础的介质与商品化介质DEAE Sepharose FF的传质速率如表1所示。相应的蛋白质溶液浓度随时间变化的曲线如图2所示。
由结果可知，在上述实验条件下，DEAE Dextran修饰以琼脂糖凝胶为基础的介质(实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7中的介质)对牛血清白蛋白的吸附速率是商品化介质DEAE Sepharose FF传质速率的21-36倍。这说明DEAE Dextran修饰以琼脂糖凝胶为基础的介质显著提升了牛血清白蛋白的传质速率。
另外，DEAE Dextran修饰的以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质对其他蛋白如卵清蛋白等蛋白的吸附容量及传质速率都很高。
本发明提出的DEAE Dextran修饰以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质在提高蛋白质吸附容量和吸附速率的应用，已通过现场较佳实验例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
Claims (9)
1.二乙氨乙基化葡聚糖(DEAE Dextran)修饰以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质，其特征是在琼脂糖凝胶为基础的颗粒表面通过引进环氧基间隔臂进而修饰DEAE Dextran；结构式如下：
2.如权利要求1所述的色谱介质，其特征是DEAE Dextran的分子量为300-500kDa。
3.如权利要求1所述的二乙氨乙基化葡聚糖(DEAE Dextran)修饰以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质，其特征是结构式(Ⅰ)的色谱介质的制备方法是：利用环氧氯丙烷活化法在琼脂糖凝胶为基础的颗粒表面引进环氧基间隔臂，然后在平均环氧基密度大于40mmol/L的琼脂糖凝胶介质中加入等体积的DEAE Dextran溶液，使DEAE Dextran充分扩散到介质孔道内；然后向介质悬浮液中加入氢氧化钠溶液，置于恒温水浴摇床中反应；反应产物经去离子水反复冲洗至中性后，用硼氢化钠溶液还原琼脂糖凝胶介质表面残留的环氧基，还原后的琼脂糖凝胶介质再次用去离子水反复冲洗，得到结构式(Ⅰ)的琼脂糖表面修饰DEAE Dextran介质。
4.如权利要求3所述的色谱介质，其特征是所述的DEAE Dextran溶液浓度为200-600mg/mL；置于20-35℃的恒温水浴摇床中，120-200rpm搅拌混合1-12h，使DEAE Dextran充分扩散到介质孔道内。
5.如权利要求3所述的色谱介质，其特征是所述的氢氧化钠溶液浓度为0.1-2mol/L，氢氧化钠溶液体积用量为活化的琼脂糖凝胶介质体积量的0.1-2倍，置于20-35℃恒温水浴摇床中，120-200rpm下反应12-60h。
6.如权利要求3所述的色谱介质，其特征是所述的硼氢化钠溶液浓度为0.3g/L-1g/L。
7.如权利要求1所述的二乙氨乙基化葡聚糖(DEAE Dextran)修饰以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质，其特征是结构式(Ⅱ)色谱介质的制备方法是：在琼脂糖凝胶表面偶联二乙氨乙基，利用环氧氯丙烷活化法在以表面偶联二乙氨乙基的琼脂糖凝胶为基础的颗粒表面引进环氧基间隔臂，然后方法与权利要求3的方法相同，得到结构式(Ⅱ)的在琼脂糖凝胶为基础的表面修饰DEAE Dextran介质。
8.如权利要求7所述的色谱介质，其特征是偶联DEAE的琼脂糖凝胶介质的DEAE密度为30-103mmol/L。
9.如权利要求1所述的二乙氨乙基化葡聚糖修饰以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质应用于蛋白质高效分离纯化中，提升蛋白质的吸附容量和吸附速率。
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