CN110441519B - 一种鉴别橙皮苷的检测卡及快速鉴别中药材中橙皮苷的方法 - Google Patents

一种鉴别橙皮苷的检测卡及快速鉴别中药材中橙皮苷的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴别橙皮苷的检测卡及快速鉴别中药材中橙皮苷的方法。本发明提供了一种专门鉴别橙皮苷的检测卡，该检测卡能够对中药材中的橙皮苷进行快速准确地鉴别，操作简单，无需用到有机溶剂及大型仪器设备，环境友好，且无需进行复杂的前处理过程，对操作人员的专业要求也不高，有利于对中药材中的橙皮苷进行现场快速鉴别。

Description

一种鉴别橙皮苷的检测卡及快速鉴别中药材中橙皮苷的方法
技术领域
本发明涉及检测领域，尤其涉及一种鉴别橙皮苷的检测卡及快速鉴别中药中橙皮苷的方法。
背景技术
橙皮苷又称川陈皮素，化学名为二氢黄酮甙，分子式为C28H34O15，橙皮苷是一种对人类健康很重要并具有抗氧化特性的多酚类物质，有修复和预防心血管疾病的作用。橙皮苷主要来源于芸香科柑桔属植物，如柑桔、柠檬等果皮中，橙皮苷亦是中药材陈皮的一种主要活性成分。
目前，中药材中的橙皮苷鉴别主要是采用薄层色谱法和高效液相色谱法，最常用方法是用薄层色谱法鉴别陈皮药材中的橙皮苷，需用有机溶剂甲醇，经加热回流和浓缩等前处理过程，然后将制备的供试品溶液和橙皮苷对照品溶液点样于硅胶G薄层板，经不同展开剂两次展开、晾干、喷以三氯化铝试液后，置紫外光灯(365nm)下检视，鉴别陈皮药材中是否含橙皮苷成分。薄层色谱法需经复杂的提取过程，需要用橙皮苷对照品，需经多次展开和紫外灯检视，对检测人员的专业技术要求较高，操作繁琐耗时长。高效液相色谱法鉴别是根据被测中药材提取溶液中含有与橙皮苷对照品保留时间一致的色谱峰，以鉴别中药材中是否含有橙皮苷化合物。高效液相色谱法同样需经复杂的提取过程，需要用橙皮苷对照品，需要配置高效液相色谱仪及相关色谱柱，操作同样耗时长。
中药材中化学成份较为复杂，要用色谱法进行目标成分鉴别时，首先要从中药材中提取分离得到被测目标化合物。目前，中药材中橙皮苷的鉴别和含量测定常用方法中，对提取过程要求较高，主要的提取方法包括：加热回流法、索氏提取法、微波辅助提取法、超声辅助提取法、碱提酸沉法、超滤提取法以及闪式提取法等。
针对上述传统鉴别方法需要用到大型仪器设备、需用橙皮苷对照品、需用大量有机溶剂提取、检测成本高、不经济、操作耗时以及会污染环境等缺点，有必要提供一种操作方便、快速、准确、低成本的鉴别方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴别橙皮苷的检测卡及快速鉴别中药材中橙皮苷的方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的目的之一在于提供一种鉴别橙皮苷的检测卡，该检测卡包括PVC板、PVC板上依次衔接的样品垫(11)、金标结合垫(12)、包被膜(13)和吸水垫(14)，其中，金标结合垫(12)为吸附橙皮苷单克隆抗体-胶体金复合物的玻璃纤维，在包被膜上依次用橙皮苷偶联抗原的溶液印制直线式隐线检测线T线、用羊抗鼠IgG溶液印制的直线式隐性质控线C线，所述T线和所述C线平行设置。
优选地，上述样品垫(11)搭接于上述金标结合垫(12)的1/3～1/2处。
更优选地，上述样品垫(11)搭接于上述金标结合垫(12)的1/3处。
优选地，上述金标结合垫(12)搭接于上述包被膜(13)一端的0.1～0.2cm处。
更优选地，上述金标结合垫(12)搭接于上述包被膜(13)一端的0.2cm处。
优选地，上述T线距离包被膜(13)下端6～10mm处。
更优选地，上述T线距离包被膜(13)下端6mm处。
优选地，上述C线距离包被膜(13)上端6～10mm处。
更优选地，上述C线距离包被膜(13)上端6mm处。
优选地，上述T线和上述C线的间距为4～6mm。
更优选地，上述T线和上述C线的间距为4.5mm。
T线处于靠近金标结合垫(12)的包被膜(13)上，C线处于靠近吸水垫(14)的包被膜(13)上。
优选地，上述吸水垫(14)搭接于上述包被膜(13)另一端的0.1～0.2cm处。
更优选地，上述吸水垫(14)搭接于上述包被膜(13)另一端的0.2cm处。
优选地，上述包被膜的长度为2～2.5cm；更优选为2.3cm。
优选地，上述金标结合垫的长度为0.8～1.2cm；更优选为1cm。
优选地，上述样品垫的长度为1.2～1.8cm；更优选为1.5cm。
优选地，上述吸水垫的长度为1.2～1.8cm；更优选为1.5cm。
优选地，上述包被膜选自硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
本发明的另一目的在于提供一种快速鉴别中药材中的橙皮苷的方法，该方法包括使用上述检测卡。
上述快速鉴别的方法，包括如下步骤：
1)将中药材样品粉碎后加水、振摇、过滤，得中药材样品滤液；
2)将中药材样品滤液滴加于橙皮苷检测卡中的样品垫上，若检测卡中的检测线T线和质控线C线均显色，则判定为阴性，即中药材样品中不含有橙皮苷；若检测卡中的检测线T线不显色，质控线C线显色，则判定为阳性，即中药材样品中含有橙皮苷；若质控线C线和检测线T线均不显色，或只出现检测线T线显色，则说明实验无效，需使用新的检测卡重新检测。
优选地，步骤1)中粉碎后的中药材的粒径为250～850μm。
优选地，步骤1)中振摇时间为4～6min；更优选为5min。
优选地，步骤2)将中药材样品滤液滴加于橙皮苷检测卡后到进行判定的时间为4～6min；更优选为5min。
上述鉴别方法相对于传统的薄层色谱或是高效液相色谱鉴别方法，大大节约了鉴别成本、鉴别时间，且本发明的鉴别方法操作非常简单，对操作者的专业技术要求不高，同时，本法民的检测方法无需复杂的前处理过程，实现了中药材中橙皮苷的快速、高效、简单地鉴别。
优选地，步骤1)中的过滤采用如图2所示的带有滤头的提取瓶或带有滤头的注射器进行过滤，该带有滤头的过滤的装置更有利于简化和过滤的步骤，从而节约时间，且操作更简便。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种专门鉴别橙皮苷的检测卡，该检测卡能够对橙皮苷进行快速准确地鉴别，操作简单，无需用到有机溶剂及大型仪器设备，环境友好，且无需进行复杂的前处理过程，对操作人员的专业要求也不高，特别有利于对于成分或组分非常复杂，需复杂前处理的中药材中橙皮苷进行现场快速鉴别。
附图说明
图1为本发明检测卡结构示意图，其中，11、样品垫；12、金标结合垫；13、包被膜；14、吸水垫；
图2为本发明的提取瓶的结构示意图，其中，8、瓶身；9、下瓶盖；10、上瓶盖；3、滤头。
具体实施方式
下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。
实施例1
一种鉴别橙皮苷的检测卡：
如图1所示：包括PVC板和PVC板上依次衔接的样品垫(11)、金标结合垫(12)、包被膜(13)和吸水垫(14)，样品垫(11)搭接于金标结合垫(12)的1/3处、金标结合垫(12)搭接于包被膜(13)一端的0.2cm处，在包被膜上依次用橙皮苷偶联载体蛋白溶液印制直线式隐性检测线T线，用羊抗鼠IgG溶液印制直线式隐性质控线C线，检测线T线和质控线C线平行设置，检测线T线距离靠近金标结合垫(12)一端的包被膜(13)下端6mm，质控线C线距离靠近吸水垫(14)一端的包被膜(13)上端6mm，T线和C线的间距为4.5mm，吸水垫(14)搭接于包被膜(13)另一端的0.2cm处，其中，样品垫的长度为1.5cm，金标结合垫的长度为1cm，包被膜的长度为2.3cm，吸水垫的长度为1.5cm。
其中，金标结合垫(13)为吸附橙皮苷单克隆抗体-胶体金复合物的玻璃纤维，金标结合垫的制备方法如下：
取胶体金溶液，调pH至7.6，在搅拌下按约20μg抗体/mL胶体金加入橙皮苷单克隆抗体，按每1mL加入100μL 10％的BSA使其稳定，并于12000rpm/s的条件下离心30min，弃去上清液，将沉淀用十分之一初始胶体金体积的复融液重悬，得橙皮苷单克隆抗体-胶体金复合物，后将橙皮苷单克隆抗体-胶体金复合物用金标稀释液稀释成OD520值为1.5的溶液，取玻璃纤维，每1cm2涂布0.1mL，置烘箱，烘干备用；
上述橙皮苷单克隆抗体的制备方法如下：
1)橙皮苷免疫抗原的制备：
取橙皮苷约15mg和过量琥珀酸酐，溶于2mL无水吡啶中，50℃下搅拌至橙皮苷完全溶解，并持续搅拌24h。减压蒸去溶剂，加水10mL与少量维生素C，用稀盐酸调pH至5～6，得红色沉淀物(半抗原)。取经水洗并干燥的半抗原约5mg、NHS约5mg和EDC约10mg溶于5mL DMF中，室温下电磁搅拌2h后，缓慢滴入用0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH 8.0)配制的浓度为10mg/mL的KLH溶液2mL，继续搅拌24h，得棕红色液体。4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液。得到的全抗原(橙皮苷-KLH，橙皮苷免疫抗原)以1mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中备用；
2)橙皮苷单克隆抗体的制备：
利用橙皮苷免疫抗原制备橙皮苷单克隆抗体。采用皮下注射混有弗氏佐剂的橙皮苷-KLH人工抗原，免疫10只8周龄的balb/c小鼠，一共免疫四次，免疫间隔时间2周，第三次和第四次免疫一周后采血检测抗血清效价。采用间接ELISA法检测抗血清效价，10只小鼠的第四次免疫后的抗血清效价均满足要求(效价大于1：32000)。并采用竞争ELISA法筛选出与橙皮苷结合效价高的两只小鼠，在无菌条件下取脾脏制备脾细胞，与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按5：1的比例混合于50mL离心管，加入25mL无血清IPMI1640培养基，1200r/min离心5min弃上清。在37℃水浴中，1分钟内滴入已预热至37℃的PEG-4000，静置1分钟后，在5min内加入30mL不完全培养基，以终止PEG-4000的融合作用。800r/min离心5min弃上清，再用完全培养基(含HTA和胎牛血清)重悬起融合完成的细胞，将其平均地滴在96孔培养板上，平均每个脾脏融合后滴在10块培养板上，37℃、体积分数5％的CO2条件下培养。四天后可见培养基颜色变黄，则换培养基一次，换培养基后三天时再换一次，显微镜下可以看到克隆形成。采用间接ELISA法筛选阳性克隆，选取效价较高的6株克隆继续进行三次亚克隆，并采用ELISA法进行单克隆抗体亚型鉴定，亚型鉴定结果显示克隆细胞株分泌的抗体都是IgG1亚型。选定稳定分泌橙皮苷单克隆抗体的杂交瘤细胞株并将其扩大培养。
采用动物体内诱导腹水的方法，提前一周用弗氏不完全佐剂0.5mL注射小鼠腹腔；注射佐剂后一周将生长旺盛的杂交瘤细胞离心弃去培养基，用PBS重悬后注射小鼠腹腔，10天左右就可以看到小鼠腹腔明显肿大，此时可以处死小鼠采集腹水。经Protein G纯化法制得橙皮苷单克隆抗体，所得单克隆抗体储存于含20％乙醇的PBS中，并冻存于4℃冰箱中备用
上述橙皮苷偶联载体蛋白的制备方法如下：
取橙皮苷约15mg和过量琥珀酸酐，溶于2mL无水吡啶中，50℃下搅拌至橙皮苷完全溶解，并持续搅拌24h。减压蒸去溶剂，加水10mL与少量维生素C，用稀盐酸调pH至5～6，得红色沉淀物(半抗原)。取经水洗并干燥的半抗原约5mg、NHS约5mg和EDC约10mg溶于5mL DMF中，室温下电磁搅拌2h后，缓慢滴入用0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH 8.0)配制的浓度为10mg/mL的BSA溶液2mL，继续搅拌24h，得棕红色液体。4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液。得到的全抗原(橙皮苷-BSA)以1mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中备用。
实施例2
一种快速鉴别中药材中橙皮苷的方法，包括如下步骤：
1)将0.5g陈皮中药材样品放置于称量纸上，粉粹至粗粉(粒径约为250-850μm)
2)将粉碎后的橙皮苷置于装有水的提取瓶中(见图2，该提取瓶包括瓶身(8)、下瓶盖(9)和上瓶盖(10))，后大力振摇约5min，静置约30s待药渣沉淀；
3)拧开提取瓶上盖接入滤头3，过滤，得样品滤液；
4)将样品滤液滴加于橙皮苷检测卡的样品垫上，5min后，根据检测卡中的检测线T线和质控线C线的显色情况，判断待测样品为阳性或是阴性，具体为：若检测卡中的质控线C线和检测线T线均显色，则判断为阴性，即待测样品中不含有橙皮苷；若质控线C线显色，检测线T线不显色，则判断为阳性，即待测样品中含有橙皮苷；若质控线C线和检测线T线均不显色，或只出现检测线T线显色，则说明实验无效，需使用新的检测卡重新检测。
灵敏度试验：
准确称取橙皮苷标准品，用水溶解并稀释制成浓度为20μg/mL的标准储备溶液。
橙皮苷标准溶液的配制：取标准储备溶液，用水逐级稀释制成浓度分别为50ng/mL、40ng/mL、30ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL以及0ng/mL的橙皮苷标准溶液，待测。
检测步骤同实施例2，检测结果显示浓度大于10ng/mL为阳性结果，浓度小于10ng/mL检测结果为阴性，则本方法的橙皮苷检测灵敏度为10ng/mL。

Claims (1)

1.一种快速鉴别中药材中橙皮苷的方法，包括如下步骤：
1)将0.5g陈皮中药材样品放置于称量纸上，粉粹至粗粉，粒径为250～850μm；
2)将粉碎后的橙皮苷置于装有水的提取瓶中，后大力振摇5min，静置30s待药渣沉淀；
3)过滤，得样品滤液；
4)将样品滤液滴加于橙皮苷检测卡的样品垫上，5min后，根据检测卡中的检测线T线和质控线C线的显色情况，判断待测样品为阳性或是阴性，具体为：若检测卡中的质控线C线和检测线T线均显色，则判断为阴性，即待测样品中不含有橙皮苷；若质控线C线显色，检测线T线不显色，则判断为阳性，即待测样品中含有橙皮苷；若质控线C线和检测线T线均不显色，或只出现检测线T线显色，则说明实验无效，需使用新的检测卡重新检测；
所述橙皮苷检测卡包括PVC板和PVC板上依次衔接的样品垫(11)、金标结合垫(12)、包被膜(13)和吸水垫(14)，样品垫(11)搭接于金标结合垫(12)的1/3处、金标结合垫(12)搭接于包被膜(13)一端的0.2cm处，在包被膜上依次用橙皮苷偶联载体蛋白溶液印制直线式隐性检测线T线，用羊抗鼠IgG溶液印制直线式隐性质控线C线，检测线T线和质控线C线平行设置，检测线T线距离靠近金标结合垫(12)一端的包被膜(13)下端6mm，质控线C线距离靠近吸水垫(14)一端的包被膜(13)上端6mm，T线和C线的间距为4.5mm，吸水垫(14)搭接于包被膜(13)另一端的0.2cm处，其中，样品垫的长度为1.5cm，金标结合垫的长度为1cm，包被膜的长度为2.3cm，吸水垫的长度为1.5cm。
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