CN211905395U - 一种检测水产品中喹诺酮类药物的二合一胶体金试剂板 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种检测水产品中喹诺酮类药物的二合一胶体金试剂板，试剂板由上下两块塑料模板和喹诺酮类高灵敏度试纸条、喹诺酮类低灵敏度试纸条组成，每根试纸条均由底板以及依次粘于底板上的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成，硝酸纤维膜从样品垫到吸水垫方向依次喷有检测线和质控线。该试剂板可满足对喹诺酮类药物四种禁用药和两种限用药的检出灵敏度要求，整个操作过程只需5 min左右，且无需任何昂贵实验设备辅助和专业操作人员操作，利于现场快速检测及大规模样品筛查，适用于水产品生产加工企业和政府检测机构。

Description

一种检测水产品中喹诺酮类药物的二合一胶体金试剂板

技术领域

本实用新型属于水产品安全检测领域，具体涉及一种检测水产品中喹诺酮类药物的二合一胶体金试剂板。

背景技术

中国是世界第一水产养殖大国和水产品贸易大国，养殖水产品产量占全世界的70%左右，而水产品药物残留问题一直都是各方关注的焦点。喹诺酮类药物（4-quinolones，QNs），又称吡酮酸类或吡啶酮酸类，是人工合成的含4-喹诺酮基本结构的抗菌药，因其具有抗菌谱广、抗菌活性强、组织穿透力强、价格低廉、与其它抗菌药物无交叉耐药性等特点，曾被广泛应用于水产养殖业中。但不合理的用药可导致喹诺酮类药物及其代谢产物在水产品中的残留，进而引起食用者肠道菌群失衡或产生远期毒性作用及潜在“三致”(致癌、致畸、致突变)作用。近年来，随着社会对食品安全问题关注度逐渐增大，喹诺酮类药物在水产养殖等领域的应用开始受到限制，或制定了相应的最大残留限量（MRL）。例如欧盟已禁止诺氟沙星、环丙沙星在水产养殖业中使用；美国禁止在食用动物养殖中使用喹诺酮类药物；我国于2002年规定类环丙沙星、恩诺沙星等7种QNs药物在动物肌肉组织中MRL为10~500 µg/kg；2015年我国农业部发布的第2292号公告，禁止洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种喹诺酮类药物在食用动物中的使用；2019年我国农业部等联合发布的GB31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》规定了动物肌肉中恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星的最高残留总限量为100 µg/kg，与国际基本接轨。因此，开展对水产品中喹诺酮类药物残留的检测方法研究，实施对喹诺酮类药物残留的监控，对保障水产品质量安全、促进渔业可持续发展具有重要意义。

目前，QNs药物残留的检测方法主要微生物法、仪器法和酶联免疫吸附法（ELISA）。微生物法操作简便，但检测周期长，灵敏度低；仪器法，如高效液相色谱法（HPLC），虽然非常灵敏、准确，但仪器化程度高、样品处理较复杂、检测费用高等，不适合现场快速检测；ELISA同样存在检测时间长、费用高、对检测人员要求较高等缺点，不利于在基层单位推广使用。

胶体金免疫层析法是在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，满足灵敏度高、特异性好、操作简单、检测时间短、技术要求低等要求，是当前现场快速检测和样品大规模筛选分析手段之首选。然而，目前市面上尚未出现针对喹诺酮类四种禁用药物（洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星）的高灵敏度（≤1ppb）检测卡，且现有检测卡的检出限不能同时满足针对四种禁用药的高灵敏度和针对两种限用药（恩诺沙星、环丙沙星）的低灵敏度要求。

实用新型内容

本实用新型的目的是提供一种检出限能同时满足喹诺酮类四种禁用药的高灵敏度和两种限用药的低灵敏度要求，成本低、重现性好、检测时间短、适合现场快速检测的二合一试剂板。

为实现上述目的，本实用新型技术方案是：一种检测水产品中喹诺酮类药物二合一胶体金试剂板，包括上下两块塑料模板和喹诺酮类高灵敏度试纸条、喹诺酮类低灵敏度试纸条，所述试纸条均由底板以及依次粘于底板上的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成，相邻部分有1~2 mm重叠区域。样品垫经过盐离子缓冲液及活性剂的浸泡干燥后，上面附着有盐离子及活性剂等物质。胶体金结合垫上均包被有胶体金标记的喹诺酮类药物单克隆抗体。硝酸纤维膜从样品垫到吸水垫方向依次喷有检测线和质控线，两种试纸条的检测线上分别包被有恩诺沙星-载体蛋白偶联物，喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物，质控线上均包被有羊抗鼠IgG抗体。偶联恩诺沙星、喹诺酮类药物半抗原的载体蛋白为牛血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白等。

本实用新型试剂板中所含的喹诺酮类高灵敏度试纸条、喹诺酮类低灵敏度试纸条的反应原理相同，运用了胶体金标记技术、层析技术、竞争免疫技术，通过抗原和单抗-胶体金标记物反应显色，特异性检测水产品中喹诺酮类药物残留水平。当水产样品中无喹诺酮类药物残留或残留量低于检出限时，检测线（T线）出现红色条带，且颜色比质控线（C线）深或一样深，判定为阴性，如图3.a所示；当水产样品中喹诺酮类药物残留量等于或高于检出限时，检测线（T线）出现红色条带，但颜色比控制线（C线）浅或检测线（T线）未出现红色条带，判定为阳性，如图3.b所示；当未出现质控线（C线），可能是操作不当或试剂板已失效，应再次阅读说明书，并用新的试剂板重新测试，如图3.c所示。

在实际应用中，若样品对试纸条A测定结果为阴性，表明样品中无喹诺酮类药物残留或喹诺酮类药物残留量低于1.0 μg/kg，判定为阴性样品。若样品对试纸条A测定结果为阳性、试纸条B测定结果为阴性，表明样品中喹诺酮类药物残留量大于1.0 μg/kg且小于100μg/kg，判定为阳性样品。若样品对试纸条A和试纸条B测定结果均为阳性，表明样品中喹诺酮类药物残留量等于或高于100 μg/kg，判定为阳性样品。

本实用新型试剂板的各部分组成成分和功能如下：

塑料模板，起固定底板和标示各功能区（加样孔、检测区、质控区）的作用。

底板，由一面涂有不干胶的聚氯乙烯（PVC）材料制成，起固定支撑试剂板其他组成部分的作用。

样品垫，由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液和缓冲样品溶液pH值得作用。

金标结合垫，由玻璃纤维制成，为样品溶液中有效成分和单抗-胶体金标记物反应提供场所。

硝酸纤维素膜，从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和质控线，将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。

吸水垫，由滤纸制成，吸收反应过程中多余的溶液。

本实用新型试剂板具有如下有益效果：

（1）灵敏度高：本实用新型试剂板对洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星检测灵敏度为1.0 μg/kg，对恩诺沙星、环丙沙星检测灵敏度为100 μg/kg。能同时满足针对洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种禁用药和恩诺沙星、环丙沙星两种限用药的检出限要求，符合国家限量要求。

（2）特异性好：本实用新型试剂板对四环素、氯霉素、青霉素、庆大霉素、磺胺类抗生素的交叉反应率均小于1%，具有高度专一性。

（3）成本低、操作简便：本实用新型试剂板生产工艺简单，生产成本低廉。试剂板将所需的大部分原料整合到PVC底板上，加样后3-5 min即可用肉眼根据检测线和质控线颜色深浅读取结果。检测过程不依赖任何仪器设备，结果判定形象、直观、准确，操作人员无需专业培训，适用于现场快速检测和大规模样本筛查。

（4）易推广应用：本实用新型试剂板操作简单，能较好满足不同层次人员需要，尤其适用于现场快速检测及大批量检测，具有广阔的应用前景。

附图说明

下面结合附图和实施例对本实用新型进一步说明。

图1为胶体金免疫层析试纸条结构示意图，其中1为样品垫，2为金标结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线，5为质控线，6为吸水垫，7为不干胶，8为PVC底板。

图2为喹诺酮类药物二合一胶体金试剂板俯视图，其中9为观察窗，10为手持区域，A为喹诺酮类高灵敏度试纸条，B为喹诺酮类低灵敏度试纸条，S为加样孔，C为质控区，T为检测区。

图3为喹诺酮类药物二合一胶体金试剂板结果判定示意图，a为无效卡，b为阴性结果，c为阳性结果，C为质控区，T为检测区。

具体实施方式

本实用新型试剂板的制备包括载体蛋白偶联物的制备、抗喹诺酮类药物单克隆抗体的制备、胶体金溶液的制备、胶体金标记抗喹诺酮类药物单克隆抗体的制备和喹诺酮类药物二合一胶体金试剂板的组装。

1. 载体蛋白偶联物的制备

1.1 QNs半抗原的合成

取吡哌酸（8-乙基-5-氧代-5，8-二氢-2-（1-哌嗪基）吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸）500 mg 溶于30 mL水中，加入乙基碳二亚胺（EDC）200 mg室温反应1 h，再加入对氨基苯乙酸150 mg反应过夜。然后经酸洗提取出QNs半抗原。

1.2 QNs半抗原与载体蛋白偶联物的合成

先称取70 mg BSA溶解于25 mL PBS（0.05 mol/L，pH 7.4）中，再加入25 mL的二甲基甲酰胺（DMF）；然后，称取7.8 mg QNs半抗原，溶于2 mL DMF中，向QNs半抗原溶液中加入三丁胺6.0 μL，混匀后加入氯甲酸异丁酯3.8 μL，于4 ℃下磁力搅拌25 min。磁力搅拌下，将BSA溶液加入到QNs半抗原溶液中反应，用1mol/L 的NaOH调节反应液pH值至9.0。于4 ℃磁力搅拌下反应4 h，将最终反应液用装入透析袋中，在PBS（0.01mol/L，pH 7.4）中透析。偶联物冷冻干燥后，-20 ℃下冻存备用，即为QNs半抗原-BSA偶联物。

用卵清蛋白(OVA)替代BSA，采用同样方法制备QNs半抗原-OVA偶联物。

1.3恩诺沙星-牛血清白蛋白偶联物的合成

将8 mg的牛血清蛋白（BSA）溶解在4 mL PBS（0.01 mol/L，pH 5.0）中，分别加入240 mg EDC和20 mg恩诺沙星（ENR），在室温中反应2 h静置，装入透析袋中，在PBS（0.01mol/L，pH 5.0）中透析2天，期间每天换液一次。偶联物冷冻干燥后，-20 ℃下冻存备用，此为ENR-BSA偶联物。

2. 抗喹诺酮类药物单克隆抗体的制备

将QNs半抗原-BSA偶联物与等体积的弗氏完全佐剂乳化后皮下注射Balb/c小鼠，剂量为100 μg/只，之后每隔3周加强免疫1次，用不完全佐剂腹腔注射。融合前3 d强化免疫1次，不用佐剂，剂量加倍。细胞融合按常规方法进行：将Sp2/0多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1：10的比例混合，在50%聚乙二醇作用下融合，HAT培育悬浮，分种于96孔培养板中，37 ℃，5% CO₂培养箱中培养。

融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初筛选择10 mg/L QNs半抗原-BSA包被酶联板，被测孔加培养上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠IgG-HRP（1：1000），OPD显色。筛选出的阳性孔再用卵清蛋白偶联物包被的酶联板进行阻断间接ELISA。将细胞培养上清与2×10^-3 mol/L喹诺酮类药物溶液等量混合，37 ℃感作1 h，加入已包被的酶标板中。另外用PBS（0.01 mol/L pH 7.4）作对照试验，步骤同上。若喹诺酮类药物阻断后的OD值将至对照孔的50%以下，则判为阳性孔。经2~3次检测都呈阳性的孔，立即用有限稀释法进行克隆化。

体外培养：将克隆化的细胞株扩大培养，细胞浓度达5×10⁵ mL时停止换液，细胞全部死亡后收集培养液。体内诱生腹水：给腹腔注射液体石蜡10天后的小鼠腹腔注射克隆化细胞株10⁷个细胞，7天后抽取腹水。

3. 胶体金溶液的制备

将100mL 0.01%氯金酸溶液加热至沸腾后，加入1mL 0.1%柠檬酸三钠水溶液，保持煮沸15min，冷却至室温后，用0.1 mol/L K₂CO₃和0.1 mol/L HCl调节pH至9，4℃保存备用。胶体金颗粒的平均大小为30nm。

4. 胶体金标记的抗喹诺酮类药物单克隆抗体的制备

将抗喹诺酮类药物单克隆抗体用0.01mol/L的PB缓冲液（pH7.4）配置成0.5mg/ml溶液，15000r/min 4℃离心30min，去除蛋白聚合物。取5支小试管中分别加入1mL胶体金溶液和10、15、20、25、30μg/ml的抗体用量进行预标记，10min后每管分别加入10μg BSA结合未标记完全的胶体金。标记结束后，每个浓度的金标抗体溶液均取2μL滴加到空白胶体金垫上，分别滴加PBS（0.01mol/L）和地西泮标准品（1μg/L），筛选抗体最佳标记量。余下的胶体金溶液，以抗体最佳标记量进行标记，15000r/min离心30min，弃上清，沉淀用10ml金标抗体保存液使其复溶，4℃保存备用。

取制备好的100 mL胶体金溶液，边搅拌边加入1.5 mg抗喹诺酮类药物单克隆抗体，搅拌20 min，再逐滴加入2 mL 25 mol/L聚乙二醇20000（PEG 20000），搅拌15 min。15000r/min离心30min，弃上清，加入10 mL pH 7.4 PBS缓冲液（含0.4 mol/L PEG）清洗2次。将沉淀用5 mL含2% BSA的PBS缓冲液（pH 7.4）溶解，用0.22 μm无菌过滤器过滤后，4 ℃保存备用。

5. 喹诺酮类药物二合一胶体金试剂板的组装

参照图1，用点膜机把适当浓度的包被抗原和羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和质控线，37 ℃烘箱干燥8 h。其中，喹诺酮类高灵敏度试纸条A检测线包被抗原为ENR-BSA偶联物，喹诺酮类低灵敏度试纸条B检测线包被抗原为QNs半抗原-BSA偶联物。将制备好的胶体金标记喹诺酮类药物单克隆抗体包被在金标结合垫上；然后将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘于PVC底板上，用切割机将贴好的大卡切割成3.0 mm宽的试纸条。将上述A、B两种试纸条装入塑料模板中制成检测试剂板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。

6. 喹诺酮类药物二合一胶体金试剂板检测实施操作方法

6.1 样品制备

取鱼、虾等可食用肌肉组织样本，用均质机搅碎均匀；称取2.00 g匀质后样本于5mL离心管中，加入4 mL乙腈，剧烈振荡3 min，室温下，于4000 r/min离心5 min；移取2 ml上清液于5 mL离心管中，在75 ℃下用氮气或空气吹干；依次加入0.3 mL正己烷和0.3 mLPBST缓冲液，用滴管冲洗离心管内壁上残留物，加盖，上下缓慢颠倒20次；静置分层后，吸取下层溶液作为检测样品A。另取20 μL检测样品A加入0.4 mL PBST缓冲液，混合均匀，作为检测样品B。

6.2 检测步骤

从包装袋中取出试剂板，分别取100 μL检测样品A和B滴加到对应加样孔中，在3～5 min内读取检测结果。

6.3 结果判读

阴性（-）：试样检测线（T线）出现红色条带，且颜色比质控线（C线）深或一样深，表示喹诺酮类药物残留或喹诺酮类药物残留量低于检出限。如图3.a所示。

阳性（+）：试样检测线（T线）出现红色条带，但颜色比控制线（C线）浅或检测线（T线）未出现红色条带为阳性，表示喹诺酮类药物残留量等于或高于检出限。如图3.b所示。

无效：未出现质控线（C线），可能是操作不当或试剂板已失效。应再次阅读说明书，并用新的试剂板重新测试。如图3.c所示。

样品对试纸条A测定结果为阴性，表明样品中无喹诺酮类药物残留或喹诺酮类药物残留量低于1.0 μg/kg，判定为阴性样品

样品对试纸条A测定结果为阳性、试纸条B测定结果为阴性，表明样品中喹诺酮类药物残留量大于1.0 μg/kg且小于100 μg/kg，判定为阳性样品。

样品对试纸条A和试纸条B测定结果均为阳性，表明样品中喹诺酮类药物残留量等于或高于100 μg/kg，判定为阳性样品。

Claims (6)

1.一种检测水产品中喹诺酮类药物的二合一胶体金试剂板，其特征在于，所述试剂板由上下两块塑料模板和喹诺酮类高灵敏度试纸条、喹诺酮类低灵敏度试纸条组成，每根试纸条均由底板以及依次粘于底板上的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成，相邻部分有1~2mm重叠区域。

2.如权利要求1所述的试剂板，其特征在于喹诺酮类高灵敏度试纸条和喹诺酮类低灵敏度试纸条的硝酸纤维膜从样品垫到吸水垫方向依次喷有检测线和质控线，检测线上分别包被有恩诺沙星-载体蛋白偶联物，喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物，质控线上均包被有羊抗鼠IgG抗体。

3.如权利要求1所述的试剂板，其特征在于喹诺酮类高灵敏度试纸条和喹诺酮类低灵敏度试纸条的金标结合垫均包被有胶体金标记的喹诺酮类药物单克隆抗体。

4.如权利要求1所述的试剂板，其特征在于偶联恩诺沙星、喹诺酮类药物半抗原的载体蛋白为牛血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白。

5.如权利要求1所述的试剂板，其特征在于底板由一面涂有不干胶的聚氯乙烯材料制成，样品垫由玻璃纤维制成，金标结合垫由玻璃纤维制成，吸水垫为滤纸。

6.如权利要求1所述的试剂板，其特征在于试剂板上设有两个观察窗、两个加样孔，靠近加样孔端设有便于手持的弧线状凸起。

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