CN108717121B

CN108717121B - 一种同时检测四环素类药物、氟喹诺酮类药物和磺胺类药物的试纸条及方法

Info

Publication number: CN108717121B
Application number: CN201810553523.7A
Authority: CN
Inventors: 万宇平; 何方洋; 崔廷婷; 崔海峰; 冯才伟; 龙光宗; 李静; 李旭; 鲁晓雄; 常平平
Original assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-06-01
Filing date: 2018-06-01
Publication date: 2021-05-18
Anticipated expiration: 2038-06-01
Also published as: CN108717121A

Abstract

本发明公开了一种同时检测四环素类药物、氟喹诺酮类药物和磺胺类药物的试纸条及方法。该试纸条包括试纸和微孔试剂，所述试纸由样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜、底板依次连接组成，所述反应膜上有三条检测线和一条质控线，所述三条检测线上分别包被有四环素类药物半抗原‑载体蛋白偶联物、氟喹诺酮类药物半抗原‑载体蛋白偶联物、磺胺类药物半抗原‑载体蛋白偶联物，所述质控线上包被有羊抗鼠抗抗体；所述微孔试剂中冻干有四环素类药物单克隆抗体‑胶体金标记物、氟喹诺酮类药物单克隆抗体‑胶体金标记物和磺胺类药物单克隆抗体‑胶体金标记物。用本发明试纸条同时检测四环素类药物、氟喹诺酮类药物和磺胺类药物的方法简便、快速、直观、准确、便于携带、适用范围广、成本低、易推广使用。

Description

一种同时检测四环素类药物、氟喹诺酮类药物和磺胺类药物的试纸条及方法

技术领域

本发明涉及一种同时检测四环素类药物、氟喹诺酮类药物和磺胺类药物的试纸条及方法，具体涉及一种用于同时检测四环素类药物、氟喹诺酮类药物和磺胺类药物的胶体金试纸条。

技术背景

四环素类药物(Tetracyclines，TCs)具有广谱高效的杀菌抗生功效，可作为预防和治疗畜禽疾病的兽药或作为促进畜禽生长的饲料添加剂而广泛应用于可食性动物中。氟喹诺酮类药物(Fluoroquinolones，FQs)是人工合成的含4-喹诺酮基本结构的抗菌药，它通过抑制细菌DNA的合成而达到抑菌作用。磺胺类药物(Sulfonamides，SAs)是一类具有对氨基苯磺酰胺结构的化学治疗药物，通过影响细胞核蛋白质的合成，抑制细菌的繁殖。由于TCs、FQs和SAs能抑制大多数革兰氏阳性菌和阴性菌，性质稳定、价格低廉、使用方便，常以亚治疗浓度的药物作为饲料添加剂来预防疾病的发生，提高饲料的转化率，促进动物生长。但长期用药所产生的不良反应、在畜禽产品中的残留、耐药性的增加以及在环境中的生态效应等已引起国内外的广泛关注。我国规定了牛奶中土霉素、四环素、金霉素残留限量为100μg/L，牛、鸡、猪、羊等动物组织中达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星(环丙沙星与恩诺沙星量之和)、沙拉沙星等喹诺酮类兽药最高残留限量为10～1900μg/kg，磺胺类兽药总量的最高残留限量为100μg/kg；欧盟规定在肌肉及牛奶中的四环素类化合物的总量不得超过100μg/kg，在肾脏、肝脏及鸡蛋中分别不得超过600、300μg/kg及200μg/kg，在动物组织中达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星(环丙沙星与恩诺沙星量之和)、麻保沙星、沙拉沙星等喹诺酮类兽药最高残留限量为10～1900μg/kg，磺胺类兽药的最高残留限量与我国相同；而美国FDA明确规定四环素、土霉素、金霉素在动物肌肉组织中残留总量不超过2μg/kg，牛奶中为300ng/g，肉中磺胺二甲嘧啶残留量要小于100μg/kg，并且禁止在食源性动物中使用氟喹诺酮类兽药。

目前，动物源性食品中TCs、FQs和SAs残留的检测手段主要包括微生物法、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫法(ELISA)、高效毛细管电泳法(HPCE)、放射免疫法和荧光光度法等。由于兽药性质差别较大，现有的残留分析一般按照化学结构类似的同族药物来建立相应的检测方法，而这些分析方法多集中在对单类抗生素的同时检测上，而对多类抗生素同时检测的方法研究较少，不能满足目前兽药种类不断增加、分析通量不断提高的需求。目前也有关于液相色谱-质谱联用技术的研究，该方法灵敏度高，选择性和特异性好，能对低浓度的样品进行准确的定性确认，但样品前处理过程复杂，仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，仅适用于样品的确证分析，不适合大批量样品的筛选及现场检测。与之相比，胶体金免疫层析法检测时间短、稳定性好、操作简便、无需其他仪器设备，结果判断直观可靠，适用于对现场大批量样品进行快速筛选，对控制多类抗生素残留具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种同时检测四环素类药物、氟喹诺酮类药物和磺胺类药物的试纸条。

本发明所提供的试纸条包括试纸和微孔试剂，试纸包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜、底板，反应膜上有三条检测线和一条质控线，三条检测线上分别包被有四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物、氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物、磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物，质控线上包被有羊抗鼠抗抗体；微孔试剂具有微孔塞，其中冻干有四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物、氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物和磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物。

所述四环素类药物单克隆抗体是以四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述氟喹诺酮类药物单克隆抗体是以氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述磺胺类药物单克隆抗体是以磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。

所述四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物由四环素类药物半抗原与载体蛋白偶联得到；所述氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物由氟喹诺酮类药物半抗原与载体蛋白偶联得到；所述磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物由磺胺类药物半抗原与载体蛋白偶联得到。

所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白。

所述四环素类药物半抗原的合成方法为：N-(4-氨苯基)马来酰亚胺0.25g，加水2mL，加1mol/L盐酸3.98mL，搅拌，溶解澄清，0～5℃搅拌30min，加亚硝酸钠0.11g，继续搅拌2h，得到重氮盐溶液A液；取四环素0.5g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液10mL溶解，得到B液，将A液滴加到B液中，0～5℃搅拌4h；停止反应，用6mol/L盐酸调节pH到7，加乙酸乙酯100mL×3，萃取三次，合并有机相，浓缩蒸干，无水乙醇重结晶，得到四环素类药物半抗原。

所述氟喹诺酮类药物半抗原的合成方法为：取非那沙星0.5g，加甲醇30mL溶解；取2-吗啉甲酸0.63g，加5mL水溶解，加入到非那沙星溶液中，搅拌，加冰乙酸0.1mL，充分搅拌后，加37％甲醛0.76mL，充分搅拌，加热回流反应4h，停止反应，旋蒸，除去甲醇，加水，加乙酸乙酯80mL×3，萃取三次，合并有机相，体积比为1:1的二氯甲烷/正己烷80mL重结晶，得到氟喹诺酮类药物半抗原。

所述磺胺类药物半抗原的合成方法为：取磺胺甲噁唑BATA-D-葡糖苷酸0.5g，加N,N-二甲基甲酰胺溶解，加三乙胺0.2mL，氯甲酸异丁酯0.45mL，搅拌4h，加0.18g氨基己酸，继续搅拌3h，停止反应，加水50mL，加乙酸乙酯80mL×3，萃取三次，合并有机相，蒸干，上硅胶柱，体积比为10:1的二氯甲烷/甲醇洗脱纯化，得到磺胺类药物半抗原。

所述样品吸收垫上粘贴有保护膜，为检测端，所述保护膜上面有MAX标记线。

所述检测线位于近于有MAX标记的保护膜的一端，所述质控线位于远离有MAX标记的保护膜的一端。

所述底板为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫为吸滤纸或滤油纸；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：

1)制备冻干有四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物、氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物和磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

2)制备具有分别包被有四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物、氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物、磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的三条检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；

4)将1)和3)制备好的微孔试剂和试纸组装成试纸条。

具体地说，步骤包括：

1)将四环素与N-(4-氨苯基)马来酰亚胺反应，制备四环素类药物半抗原；将非那沙星与2-吗啉甲酸反应，制备氟喹诺酮类药物半抗原；将磺胺甲噁唑BATA-D-葡糖苷酸与氨基己酸反应，制备磺胺类药物半抗原；

2)将四环素类药物半抗原与载体蛋白偶联，制备四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物；将氟喹诺酮类药物半抗原与载体蛋白偶联，制备氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物；将磺胺类药物半抗原与载体蛋白偶联，制备磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物；

3)用四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌四环素类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株；用氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌氟喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株；用磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌磺胺类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5)将四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物、氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物、磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物分别包被于反应膜的三条检测线上，将羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的质控线上；

6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

7)将制备的四环素类药物单克隆抗体、氟喹诺酮类药物单克隆抗体、磺胺类药物单克隆抗体分别加入到制备的胶体金中，得到四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物、氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物、磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物；

8)将四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物、氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物和磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物共同冻干在微孔试剂中，将微孔试剂加上微孔塞；

9)将样品吸收垫用含质量分数0.5％牛血清白蛋白、pH 7.2的0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；

10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜；

11)将制备好的微孔试剂和试纸组装成试纸条，2～8℃条件下保存12个月。

本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条同时检测样本中四环素类药物、氟喹诺酮类药物和磺胺类药物残留的方法，它包括步骤：

(1)用试纸条进行检测；

(2)分析检测结果。

本发明试纸条的检测原理：将待检样本滴加于微孔试剂中，混匀后，将标有MAX标记线端向下，插入孵育后的微孔试剂中，待检样品液与微孔中的金标抗体结合后一起向反应膜扩散；若待检样品液中四环素类药物、氟喹诺酮类药物或磺胺类药物的含量高，则扩散过程中待检样品液中的四环素类药物、氟喹诺酮类药物或磺胺类药物可与金标抗体相结合，进而完全封闭金标抗体上四环素类药物、氟喹诺酮类药物或磺胺类药物的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上的四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物、氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物或磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物结合，检测限显色弱于质控线显色或检测线不显色，而抗抗体则可与金标抗体结合，质控线显色；若待检样品液中四环素类药物、氟喹诺酮类药物或磺胺类药物的含量低或无，则金标抗体上的抗原结合位点不能被封闭，进而金标抗体会与反应膜上的四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物、氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物或磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物结合，检测线显色强于质控线显色或与质控线显色一致，同时抗抗体也可与金标抗体结合，质控线显色。如果质控线不显色，则试纸失效。如图4所示。

阴性：当质控线显示出红色条带，三条检测线同时也都显示出红色条带，且检测线显色强于质控线显色或与质控线显色一致，判为阴性。

四环素类药物阳性：当质控线显示出红色条带，包被有氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物、磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线显色强于质控线显色或与质控线显色一致，而包被有四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线显色弱于质控线显色或不显色，判为四环素类药物阳性。

氟喹诺酮类药物阳性：当质控线显示出红色条带，包被有四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物、磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线显色强于质控线显色或与质控线显色一致，而包被有氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线显色弱于质控线显色或不显色，判为氟喹诺酮类药物阳性。

磺胺类药物阳性：当质控线显示出红色条带，包被有四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物、氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线显色强于质控线显色或与质控线显色一致，而包被有磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线显色弱于质控线显色或不显色，判为磺胺类药物阳性。

四环素类药物、氟喹诺酮类药物、磺胺类药物均阳性：当质控线显示出红色条带，而三条检测线显色都弱于质控线显色或都不显色，判为四环素类药物、氟喹诺酮类药物、磺胺类药物均阳性。

无效：当质控线不显示出红色条带，则无论检测线显示出红色条带与否，该试纸均判为无效。

本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、便于携带、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，采用高特异性的单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性；将金标抗体冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度；本发明试纸条能够同时检测四环素类药物、氟喹诺酮类药物和磺胺类药物，实现了一个试纸条对多类抗生素的检测，满足了市场上对四环素类药物、氟喹诺酮类药物和磺胺类药物同时检测的需求。用本发明试纸条检测四环素类药物、氟喹诺酮类药物和磺胺类药物的方法，简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

图1为试纸剖面结构示意图。

图2为试纸俯视图。

图3为微孔试剂图。

图4为试纸检测结果判定图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1同时检测四环素类药物、氟喹诺酮类药物和磺胺类药物的试纸条的构成

一、试纸(图1)

所述试纸是由底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜组成；

所述样品吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序粘贴在底板6上，样品吸收垫的末端与反应膜相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；

所述试纸粘贴有保护膜，保护膜7覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX字样(图2)；

所述反应膜上有检测线4-1、检测线4-2、检测线4-3和质控线5，均呈与所述试纸的长相垂直的条带状，检测线4-1位于近于有MAX标记的保护膜的一端，质控线5位于远离有MAX标记的保护膜的一端，检测线4-2位于检测线4-1和检测线4-3之间，检测线4-3位于检测线4-2和质控线5之间，检测线4-1包被有四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物(四环素类药物半抗原-卵清蛋白偶联物)，检测线4-2包被有氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物(氟喹诺酮类药物半抗原-卵清蛋白偶联物)，检测线4-3包被有磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物(磺胺类药物半抗原-卵清蛋白偶联物)，质控线5包被有羊抗鼠抗抗体；

所述底板为PVC底板；所述样品吸收垫为吸滤纸；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。

二、微孔试剂(图3)

所述微孔试剂8中冻干有四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物、氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物和磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物；所述微孔试剂具有微孔塞9。

将上述试纸与微孔试剂组装成试纸条，在2～8℃环境中保存，有效期12个月。

实施例2实施例1中所述试纸条的制备方法

一、试纸条的制备

该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

4)将1)和3)制备好的微孔试剂和试纸组装成试纸条。

下面分步详细叙述：

(一)各部件的制备

1.四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定

四环素类药物是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。

(1)四环素类药物半抗原的合成

N-(4-氨苯基)马来酰亚胺0.25g，加水2mL，加1mol/L盐酸3.98mL，搅拌，溶解澄清，0～5℃搅拌30min，加亚硝酸钠0.11g，继续搅拌2h，得到重氮盐溶液A液；取四环素0.5g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液10mL溶解，得到B液，将A液滴加到B液中，0～5℃搅拌4h；停止反应，用6mol/L盐酸调节pH到7，加乙酸乙酯100mL×3，萃取三次，合并有机相，浓缩蒸干，无水乙醇重结晶，得到四环素类药物半抗原。

(2)免疫原的制备——四环素类药物半抗原与牛血清白蛋白偶联物合成

取牛血清白蛋白(BSA)100mg，加0.1mol/L磷酸盐缓冲液8mL溶解，加二硫苏糖醇6.9mg，室温搅拌4h，0.02mol/L PB缓冲液透析纯化3d，每天换液3次，得到蛋白活化液A液；取四环素类药物半抗原37mg，加N,N-二甲基甲酰胺(DMF)2mL溶解，得到B液；将B液滴加到A液中，室温搅拌24h，0.02mol/L PB缓冲液透析纯化3d，每天换液3次，得到四环素类药物半抗原-牛血清白蛋白偶联物(免疫原)，-20℃保存，备用。

(3)包被原的制备——四环素类药物半抗原与卵清蛋白偶联物合成

取卵清蛋白(OVA)50mg，加0.1mol/L磷酸盐缓冲液4mL溶解，加二硫苏糖醇4.2mg，室温搅拌4h，0.02mol/L PB缓冲液透析纯化3d，每天换液3次，得到蛋白活化液A液；取四环素类药物半抗原17mg，加DMF 1mL溶解，得到B液；将B液滴加到A液中，室温搅拌24h，0.02mol/L PB缓冲液透析纯化3d，每天换液3次，得到四环素类药物半抗原-卵清蛋白偶联物(包被原)，-20℃保存，备用。

(4)四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定

将四环素类药物半抗原、载体蛋白、四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/mL的溶液，以0.01mol/L pH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200～800nm范围内扫描，得到四环素类药物半抗原、载体蛋白、四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明四环素类药物半抗原与载体蛋白偶联成功。

2.氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定

氟喹诺酮类药物是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。

(1)氟喹诺酮类药物半抗原的合成

取非那沙星0.5g，加甲醇30mL溶解；取2-吗啉甲酸0.63g，加5mL水溶解，加入到非那沙星溶液中，搅拌，加冰乙酸0.1mL，充分搅拌后，加37％甲醛0.76mL，充分搅拌，加热回流反应4h，停止反应，旋蒸，除去甲醇，加水，加乙酸乙酯80mL×3，萃取三次，合并有机相，体积比为1:1的二氯甲烷/正己烷80mL重结晶，得到氟喹诺酮类药物半抗原0.62g，收率92.5％。

(2)免疫原的制备——氟喹诺酮类药物半抗原与牛血清白蛋白偶联物合成

取20mg氟喹诺酮类药物半抗原，加二甲基亚砜(DMSO)2.0mL溶解，加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)9mg，碳二亚胺(EDC)15mg，搅拌反应2h，得到半抗原活化液A液；取50mg BSA，加0.9％的生理盐水4mL溶解，得到B液；将A液滴加到B液中，搅拌反应10h，0.02mol/L PB缓冲液透析纯化3d，每天换液三次，得到氟喹诺酮类药物半抗原-牛血清白蛋白偶联物(免疫原)，分装，-20℃保存，备用。

(3)包被原的制备——氟喹诺酮类药物半抗原与卵清蛋白偶联物合成

取14mg氟喹诺酮类药物半抗原，加DMSO 2.0mL溶解，加三乙胺0.2mL，氯甲酸异丁酯0.37mL，搅拌反应2h，得到半抗原活化液A液；取100mg OVA，加0.9％的生理盐水7mL溶解，得到B液；将A液滴加到B液中，搅拌反应10h，0.02mol/L PB缓冲液透析纯化3d，每天换液三次，得到氟喹诺酮类药物半抗原-卵清蛋白偶联物(包被原)，分装，-20℃保存，备用。

(4)氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定

将氟喹诺酮类药物半抗原、载体蛋白、氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/mL的溶液，以0.01mol/L pH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200～800nm范围内扫描，得到氟喹诺酮类药物半抗原、载体蛋白、氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明氟喹诺酮类药物半抗原与载体蛋白偶联成功。

3.磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定

磺胺类药物是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。

(1)磺胺类药物半抗原的合成

取磺胺甲噁唑BATA-D-葡糖苷酸0.5g，加DMF溶解，加三乙胺0.2mL，氯甲酸异丁酯0.45mL，搅拌4h，加0.18g氨基己酸，继续搅拌3h，停止反应，加水50mL，加乙酸乙酯80mL×3，萃取三次，合并有机相，蒸干，上硅胶柱，体积比为10:1的二氯甲烷/甲醇洗脱纯化，得到磺胺类药物半抗原。

(2)免疫原的制备——磺胺类药物半抗原与牛血清白蛋白偶联物合成

取33mg磺胺类药物半抗原，加2mL DMF溶解，加NHS 24mg，EDC 28mg，搅拌2h，得到半抗原活化液A液；取100mg BSA，加生理盐水7mL，得到B液；将A液滴加到B液中，搅拌12h，停止反应，0.02mol/L PB透析纯化3d，每天换液3次，分装，得到磺胺类药物半抗原-牛血清白蛋白偶联物(免疫原)，-20℃保存，备用。

(3)包被原的制备——磺胺类药物半抗原与卵清蛋白偶联物合成

取8mg磺胺类药物半抗原，加1mL DMF溶解，加NHS 6mg，EDC 8mg，搅拌2h，得到半抗原活化液A液；取50mg OVA，加生理盐水4mL，得到B液；将A液滴加到B液中，搅拌12h，停止反应，0.02mol/L PB透析纯化3d，每天换液3次，分装，得到磺胺类药物半抗原-卵清蛋白偶联物(包被原)，-20℃保存，备用。

(4)磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定

将磺胺类药物半抗原、载体蛋白、磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/mL的溶液，以0.01mol/L pH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200～800nm范围内扫描，得到磺胺类药物半抗原、载体蛋白、磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明磺胺类药物半抗原与载体蛋白偶联成功。

4.单克隆抗体的制备

(1)动物免疫

将步骤1、2和3得到的三种免疫原分别注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

(2)细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(3)细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁶个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

(4)单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的质量分数为20％，碳酸氢钠在细胞培养基中的质量分数为0.2％；所述细胞培养基的pH为7.4。

5.羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

6.单克隆抗体-胶体金标记物的制备

(1)胶体金的制备

用双蒸去离子水将质量分数为1％的氯金酸稀释成0.01％，取100mL置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5mL质量分数为1％的柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。

(2)单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入20～50μg的标准向胶体金溶液中分别加入上述四环素类药物单克隆抗体、氟喹诺酮类药物单克隆抗体和磺胺类药物单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置10min，加入10％牛血清白蛋白，使其在胶体金溶液中的体积分数为1％，静置10min。12000r/min，4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。

复溶缓冲液：含牛血清白蛋白的体积分数为0.1％～0.3％、吐温-80的质量分数为0.05％～0.2％、pH为7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

7.将单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上

向微孔试剂微孔板中加入50μL四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物、50μL氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物和50μL磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50℃条件下，预冻3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到冻干有四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物、氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物和磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，密封保存。

8.样品吸收垫的制备

将样品吸收垫用含质量分数0.5％牛血清白蛋白、pH 7.2的0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h备用。

9.反应膜的制备

包被过程：用磷酸缓冲液将四环素类药物半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到1mg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T₁)，包被量为1.0μL/cm；用磷酸缓冲液将氟喹诺酮类药物半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到1mg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T₂)，包被量为1.0μL/cm；用磷酸缓冲液将磺胺类药物半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到1mg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T₃)，包被量为1.0μL/cm；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C)，包被量为1.0μL/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

(二)各部件的组装

1.试纸的组装

将所述样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次按顺序粘贴在所述底板上；样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；在组装好的试纸上粘贴保护膜，保护膜上印有MAX标记线的一端粘贴在样品吸收垫上。

2.试纸条的组装

将上述步骤1得到的试纸与微孔试剂组装成试纸条，在2～8℃的环境中贮存，有效期12个月。

实施例3牛奶中四环素类药物、氟喹诺酮类药物和磺胺类药物的检测

1.用试纸条检测

从原包装(若低温存放需要预先平衡至室温)中取出所需数目的微孔试剂和试纸，并做好标记；用微量移液器吸取200μL待检牛奶溶液于微孔中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀，将微孔放入迷你金属浴中；在45℃条件下，将标记好的试纸插入微孔中——印有“MAX”线端朝下，使之充分浸入溶液中；液体流动开始计时，45℃反应8min，取出试纸，判定结果。

2.检测结果分析

阴性：当质控线(C)显示出红色条带，检测线(T₁)、检测线(T₂)和检测线(T₃)同时也都显示出红色条带，且检测线显色强于质控线显色或与质控线显色一致，判为阴性，如图4a、4b所示；

四环素类药物阳性：当质控线(C)显示出红色条带，检测线(T₂)和检测线(T₃)显色强于质控线显色或与质控线显色一致，而检测线(T₁)显色弱于质控线显色或不显色，判为四环素类药物阳性，如图4c、4d所示；

氟喹诺酮类药物阳性：当质控线(C)显示出红色条带，检测线(T₁)和检测线(T₃)显色强于质控线显色或与质控线显色一致，而检测线(T₂)显色弱于质控线显色或不显色，判为氟喹诺酮类药物阳性，如图4e、4f所示；

磺胺类药物阳性：当质控线(C)显示出红色条带，检测线(T₁)和检测线(T₂)显色强于质控线显色或与质控线显色一致，而检测线(T₃)显色弱于质控线显色或不显色，判为磺胺类药物阳性，如图4g、4h所示；

四环素类药物、氟喹诺酮类药物、磺胺类药物均阳性：当质控线(C)显示出红色条带，而检测线(T₁)、检测线(T₂)和检测线(T₃)显色都弱于质控线显色或都不显色时，判为四环素类药物、氟喹诺酮类药物、磺胺类药物均阳性，如图4i、4j所示；

无效：当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T₁)、检测线(T₂)和检测线(T₃)显示出红色条带与否，该试纸均判为无效，如图4k1、4k2、4k3、4k4、4k5所示。

实施例4试纸条技术参数的确定

1.检测限试验

将四环素类药物、氟喹诺酮类药物和磺胺类药物稀释成如下不同浓度：四环素、金霉素、强力霉素、土霉素0、35、70、140μg/L；达氟沙星0、9、18、36μg/L，培氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、麻保沙星0、3、6、12μg/L，氟甲喹、依诺沙星0、5、10、20μg/L，氧氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、洛美沙星0、3.5、7、14μg/L，噁喹酸0、10、20、40μg/L；磺胺嘧啶0、1.5、3、6μg/L，磺胺甲基嘧啶、磺胺氯吡嗪0、2、4、8μg/L，磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶0、1、2、4μg/L，磺胺二甲基嘧啶、磺胺氯哒嗪0、7、14、28μg/L，磺胺间二甲氧嘧啶0、4、8、16μg/L，磺胺甲噻二唑、磺胺喹噁啉0、3.5、7、14μg/L，磺胺甲噁唑、磺胺噻唑0、20、40、80μg/L，磺胺甲氧哒嗪0、35、70、140μg/L；所用稀释液为pH7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。用试纸条进行检测，结果见表1。

表1检测限测定结果

由表1可知，本试纸条对四环素类药物的灵敏度分别为：四环素、金霉素、强力霉素、土霉素70μg/L；对氟喹诺酮类药物的灵敏度分别为：达氟沙星18μg/L，培氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、麻保沙星6μg/L，氟甲喹、依诺沙星10μg/L，氧氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、洛美沙星7μg/L，噁喹酸20μg/L；对磺胺类药物的灵敏度分别为：磺胺嘧啶3μg/L，磺胺甲基嘧啶、磺胺氯吡嗪4μg/L，磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶2μg/L，磺胺二甲基嘧啶、磺胺氯哒嗪14μg/L，磺胺间二甲氧嘧啶8μg/L，磺胺甲噻二唑、磺胺喹噁啉7μg/L，磺胺甲噁唑、磺胺噻唑40μg/L，磺胺甲氧哒嗪70μg/L。

2.假阳性率、假阴性率试验

取经过LC-MS/MS确证的不含四环素类药物、氟喹诺酮类药物和磺胺类药物的空白牛奶样本50份，用3个批次的试纸条分别进行检测，结果发现试纸条检测结果均呈阴性，表明本发明的试纸条阴性符合率为100％，假阳性率为0。

取经过LC-MS/MS确证的不含四环素类药物、氟喹诺酮类药物和磺胺类药物的空白牛奶样本，向其中分别添加四环素类药物、氟喹诺酮类药物和磺胺类药物至检测限浓度，用3个批次的试纸条分别进行检测，结果发现试纸条检测结果均呈阳性，表明本发明的试纸条阳性符合率为100％，假阴性率为0。

3.特异性试验

特异性是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。将三聚氰胺、链霉素、林可霉素、泰乐菌素等药物用pH7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液进行稀释，用实施例1中所述的试纸条进行检测。结果显示，用该试纸条检测500μg/L三聚氰胺、链霉素、林可霉素、泰乐菌素等药物时，试纸检测结果均呈阴性，说明本试纸条对这些药物无交叉反应。

Claims

1.一种同时检测四环素类药物、氟喹诺酮类药物和磺胺类药物的试纸条，包括试纸和微孔试剂，所述试纸包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜、底板，其特征在于：所述反应膜上有三条检测线和一条质控线，所述三条检测线上分别包被有四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物、氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物、磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物，所述质控线上包被有羊抗鼠抗抗体；所述微孔试剂中冻干有四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物、氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物和磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物；

其中，所述四环素类药物单克隆抗体是以四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述氟喹诺酮类药物单克隆抗体是以氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述磺胺类药物单克隆抗体是以磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；

所述四环素类药物半抗原的合成方法为：N-(4-氨苯基)马来酰亚胺0.25g，加水2mL，加1mol/L盐酸3.98mL，搅拌，溶解澄清，0～5℃搅拌30min，加亚硝酸钠0.11g，继续搅拌2h，得到重氮盐溶液A液；取四环素0.5g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液10mL溶解，得到B液，将A液滴加到B液中，0～5℃搅拌4h；停止反应，用6mol/L盐酸调节pH到7，加乙酸乙酯100mL×3，萃取三次，合并有机相，浓缩蒸干，无水乙醇重结晶，得到四环素类药物半抗原；

所述氟喹诺酮类药物半抗原的合成方法为：取非那沙星0.5g，加甲醇30mL溶解；取2-吗啉甲酸0.63g，加5mL水溶解，加入到非那沙星溶液中，搅拌，加冰乙酸0.1mL，充分搅拌后，加37％甲醛0.76mL，充分搅拌，加热回流反应4h，停止反应，旋蒸，除去甲醇，加水，加乙酸乙酯80mL×3，萃取三次，合并有机相，体积比为1:1的二氯甲烷/正己烷80mL重结晶，得到氟喹诺酮类药物半抗原；

所述磺胺类药物半抗原的合成方法为：取磺胺甲噁唑BATA-D-葡糖苷酸0.5g，加N,N-二甲基甲酰胺溶解，加三乙胺0.2mL，氯甲酸异丁酯0.45mL，搅拌4h，加0.18g氨基己酸，继续搅拌3h，停止反应，加水50mL，加乙酸乙酯80mL×3，萃取三次，合并有机相，蒸干，上硅胶柱，体积比为10:1的二氯甲烷/甲醇洗脱纯化，得到磺胺类药物半抗原；

所述四环素类药物为四环素、金霉素、强力霉素、土霉素，所述氟喹诺酮类药物为达氟沙星、培氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、麻保沙星、氟甲喹、依诺沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、洛美沙星、噁喹酸，所述磺胺类药物为磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺氯吡嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑、磺胺噻唑、磺胺甲氧哒嗪。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述微孔试剂上具有微孔塞。

3.根据权利要求1-2任一项所述的试纸条，其特征在于：所述样品吸收垫上粘贴有保护膜，为检测端，所述保护膜上面有MAX标记线。

4.根据权利要求3所述的试纸条，其特征在于：所述检测线位于近于有MAX标记的保护膜的一端，所述质控线位于远离有MAX标记的保护膜的一端。

5.一种制备权利要求1-4任一项所述试纸条的方法，其包括步骤：

4)将1)和3)制备好的微孔试剂和试纸组装成试纸条。

6.一种同时检测样本中四环素类药物、氟喹诺酮类药物和磺胺类药物残留的方法，其包括步骤：

1)用权利要求1-4任一项所述的试纸条进行检测；

2)分析检测结果。