CN113552360A - 一种检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条及其制备方法和检测方法 - Google Patents

一种检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条及其制备方法和检测方法 Download PDF

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CN113552360A CN202110611352.0A CN202110611352A CN113552360A CN 113552360 A CN113552360 A CN 113552360A CN 202110611352 A CN202110611352 A CN 202110611352A CN 113552360 A CN113552360 A CN 113552360A
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Abstract

本发明公开了一种检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条及其制备方法和检测方法，涉及分子检测技术领域。通过两条检测线可同时检测金刚烷胺与恩诺沙星两种物质，而无需任何仪器设备，操作简便快捷，手动操作同时通过肉眼即可读取结果，大大提高了实地现场检测金刚烷胺与恩诺沙星残留超标的效率，在恩诺沙星和金刚烷胺药物的快速免疫检测应用中将有广阔的前景，同时上述两用试纸条的提出也为市场监测提供了强力保障。该试纸条具有特异性好，稳定性好的优势。此外，还提供了一种检测恩诺沙星和/或金刚烷胺的方法，该检测方法可以满足恩诺沙星和金刚烷胺的快速精准检出。

Description

一种检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条及其制备方法和 检测方法
技术领域
本发明涉及分子检测技术领域，具体而言，涉及一种检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条及其制备方法和检测方法。
背景技术
恩诺沙星是第三代氟喹诺酮类广谱抗菌药，由于碱性分子的逐渐变化，恩诺沙星的抗菌性能大大提高，药代动力学得到改善，而不良反应的可能性降低，作为抗菌药物广泛应用于细菌和支原体感染等。恩诺沙星能够靶向抑制细菌促旋酶和拓扑异构酶的合成，从而对细菌的复制和生长阶段造成影响。根据国家规定恩诺沙星最高残留限量为0.1mg/mL。大剂量的恩诺沙星摄入会导致动物急性中毒；长期低剂量摄入也会使动物机体产生抗药性，而不科学滥用还会引发药物残留，经过食物链从而对人类健康产生很大危害。
恩诺沙星的化学名为1-环丙基-7-(4-乙基-1-哌嗪基)-6-氟-1,4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸，属于由萘啶酸核心结构衍生而成的6-氟喹诺酮或4-喹诺酮类化合物。CAS登记号为93106-60-6，分子式为C19H22FN3O3，相对分子质量为359.39，化学结构式如下：
Figure BDA0003095730460000011
金刚烷胺是一种三环胺，自20世纪60年代起首次作为抗病毒药物使用，其通过增加多巴胺的释放、阻断再摄取、增加突触后多巴胺受体或改变其构象来调节多巴胺活性，同时也是n-甲基-d-天冬氨酸(NMDA)受体，作为神经药物及止痛镇痛剂广泛应用于人类及动物治疗等多种场合(例如作为兽药)。分子式为C10H17N，相对分子量为151.249，化学结构式如下所示：
Figure BDA0003095730460000021
近年来动物源性食品中金刚烷胺与恩诺沙星检测超标事件时有发生，根据2020年市场监管总局发布的不合格产品情况通报，在流通量较大的禽类产品中，金刚烷胺与恩诺沙星检出频率尤为突出。目前国内外已发表的文献中，金刚烷胺和恩诺沙星检测方法主要有仪器检测法、荧光分光光度法和免疫分析方法等，但这些方法或需要昂贵的仪器设备，检测费用高，或操作时间长，操作技术要求高且不能用于现场检测。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条及其制备方法和检测方法以解决上述技术问题，从而建立一种快速、可靠、低成本的能够同时检测金刚烷胺与恩诺沙星的分析方法。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条，试纸条包括底板，在底板的表面沿层析方向依次铺设有样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，且样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次固定连接，硝酸纤维素膜上包被有两条检测线和质控线，两条检测线是指包被有金刚烷胺抗原的检测线和包被有恩诺沙星抗原的检测线，质控线是指包被有X抗鼠IgG的质控线；胶体金结合垫上设有金刚烷胺抗体、恩诺沙星抗体和胶体金的偶联物；X为羊或兔。
本发明还提供了一种检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条的制备方法，其包括如下步骤：
在底板上，将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫拼接为试纸条；
硝酸纤维素膜上包被有两条检测线和质控线。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述制备方法还包括在硝酸纤维素膜上间隔包被浓度为0.3-0.8mg/mL的金刚烷胺抗原和浓度为0.3-0.8mg/mL的恩诺沙星抗原作为检测线，并在硝酸纤维素膜上包被0.3-0.8mg/mL的X抗鼠IgG作为质控线，且质控线与检测线间隔设置。
在本发明应用较佳的实施方式中，在硝酸纤维膜上，每0.3-2cm长度上喷1-6μL的金刚烷胺抗原或恩诺沙星抗原作为两条检测线，每0.3-2cm长度上喷1-6μL的X抗鼠IgG作为质控线，相邻两条线之间的间距为0.2-0.5cm；
制备方法还包括在硝酸纤维膜上喷设两条检测线和质控线后进行干燥。
在本发明应用较佳的实施方式中，在将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫进行拼接之前还包括制备金刚烷胺抗体、恩诺沙星抗体和胶体金的偶联物，并将金刚烷胺抗体、恩诺沙星抗体和胶体金的偶联物喷于结合垫上制得胶体金结合垫，胶体金结合垫包括胶体金－金刚烷结合垫和胶体金－恩诺沙星结合垫；
金刚烷胺抗体、恩诺沙星抗体和胶体金的偶联物的制备包括：分别制备金刚烷胺抗体与胶体金的偶联物和恩诺沙星与胶体金的偶联物，将金刚烷胺抗体与胶体金的偶联物喷于结合垫上制得胶体金－金刚烷结合垫，将恩诺沙星与胶体金的偶联物喷于结合垫上制得胶体金－恩诺沙星结合垫；
金刚烷胺抗体与胶体金的偶联物的制备包括：将胶体金溶液、硼酸钾溶液、金刚烷胺抗体溶液和牛血清白蛋白溶液混合制得混合液，离心后的沉淀用磷酸缓冲液PB复溶制得金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物；
恩诺沙星抗体和胶体金的偶联物的制备包括：将胶体金溶液、硼酸钾溶液、恩诺沙星抗体溶液和牛血清白蛋白溶液混合制得混合液，离心后的沉淀用磷酸缓冲液PB复溶制得金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物；
每1mL胶体金溶液中添加2.5－3.5μL浓度为2mg/mL的金刚烷胺抗体溶液或1.5－2.5μL浓度为2mg/mL的恩诺沙星抗体溶液，添加0.1M的硼酸钾溶液30－50μL，添加25－45μL的0.5－1.5wt％BSA溶液；
优选地，在将金刚烷胺抗体溶液或恩诺沙星抗体溶液加入混合前还包括对金刚烷胺抗体或恩诺沙星抗体进行透析和复溶处理；透析是依次使用磷酸缓冲液PB以及蒸馏水进行透析，并用超纯水进行复溶；
优选地，在将结合垫上喷金前还包括对结合垫进行预处理，预处理是将含0.5－1.5wt％牛血清白蛋白和0.5－1.5％吐温－20溶液的0.005－0.015MPBS溶液均布在结合垫上，并干燥。
在本发明应用较佳的实施方式中，离心后的沉淀用磷酸缓冲液PB和5－10wt％的蔗糖复溶；
优选地，每1－2cm的结合垫上喷3－6μL的金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物；每1－2cm的结合垫上喷3－6μL的恩诺沙星抗体和胶体金的偶联物。
本发明还提供了一种同时检测恩诺沙星和金刚烷胺的试剂盒，其包括检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条以及壳体。
本发明还提供了一种使用上述检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条或上述同时检测恩诺沙星和金刚烷胺的试剂盒检测恩诺沙星和/或金刚烷胺的方法，其包括如下步骤：
将试纸条插入待检物质中或将待检物质滴在试纸条的样品垫上，根据条带判断检测结果。
根据条带判断检测结果的方法包括：
若质控线显色，且检测线有2条均显色，则判定待检物质中不含金刚烷胺和恩诺沙星；
若质控线显色，且检测线仅有金刚烷胺的检测线显色，而恩诺沙星的检测线不显色，则判定待检物质中的含恩诺沙星，不含金刚烷胺；
若质控线显色，且检测线仅有恩诺沙星的检测线显色，而金刚烷胺的检测线不显色，则判定待检物质中的含金刚烷胺，不含恩诺沙星；
若质控线显色，且检测线均不显色，则判定待检物质中同时含有金刚烷胺和恩诺沙星；
若质控线不显色，无论检测线是否显色，均判定试纸条失效。
检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条或同时检测恩诺沙星和金刚烷胺的试剂盒在畜禽产品中金刚烷胺和/或恩诺沙星检测中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明基于免疫侧向层析技术制备了一种检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条，通过两条检测线可同时检测金刚烷胺与恩诺沙星两种物质，而无需任何仪器设备，操作简便快捷，手动操作同时通过肉眼即可读取结果，大大提高了实地现场检测金刚烷胺与恩诺沙星残留超标的效率，在恩诺沙星和金刚烷胺药物的快速免疫检测应用中将有广阔的前景，同时上述两用试纸条的提出也为市场监测提供了强力保障。该试纸条具有特异性好，稳定性好的优势。此外，还提供了一种检测恩诺沙星和/或金刚烷胺的方法，该检测方法可以满足恩诺沙星和金刚烷胺的快速精准检出。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的试纸条的结构示意图；
图2为试纸条组装流程示意图；
图3为试纸条特异性的验证结果图；图中，左：1000ng/mL金刚烷胺标准样品检测；中：200ng/mL恩诺沙星标准样品检测；右：阴性对照；
图4为试纸条检测不同浓度金刚烷胺的结果图；图中，金刚烷胺的浓度从左至右分别为0ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL；
图5为试纸条检测不同浓度恩诺沙星的结果图；图中，恩诺沙星的浓度从左至右分别为0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
本发明提供了一种检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条，试纸条包括底板，在底板的表面沿层析方向依次铺设有样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，且样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次固定连接，硝酸纤维素膜上包被有两条检测线和质控线，两条检测线是指包被有金刚烷胺抗原的检测线和包被有恩诺沙星抗原的检测线，质控线是指包被有X抗鼠IgG的质控线；胶体金结合垫上设有金刚烷胺抗体、恩诺沙星抗体和胶体金的偶联物。
借助两条检测线可以实现待测产品中恩诺沙星和金刚烷胺的快速检出，从而为禽畜产品的监管提供便利，本发明提供的两用试纸条便于测试人员可以根据试纸条显色的条带数判断该待测产品是否存在金刚烷胺和恩诺沙星。
需要说明的是，质控线使用的抗体要求能够与金标抗体偶联物相结合，符合此条件的抗体均可作为质控线使用。
可选的，上述底板为聚氯乙烯底板，结合垫为玻璃纤维膜。
本发明还提供了一种检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条的制备方法，其包括如下步骤：
在底板上，将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫拼接为试纸条；硝酸纤维素膜上包被有两条检测线和质控线。
需要说明的是，上述粘接可以选择试纸条专用固定带固定粘接，也可以根据需要选择胶条等其他方式实现粘接。
可选的，平稳放置NC膜(硝酸纤维素膜)，佩戴指套将两种结合垫(即得胶体金-金刚烷结合垫和胶体金-恩诺沙星结合垫)上部压到NC膜下部并固定，将样品垫上部压在结合垫下部并固定；三者重叠处设置为0.1-0.2cm。使用试纸条专用胶带及贴纸固定NC膜、结合垫和样品垫。紧贴NC膜上部安装吸水垫。试纸条组装好后剪裁成3mm的规格。
在一种实施方式中，可以设置组装试纸条的条件为温度24-25℃，湿度32-35％。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述制备方法还包括在硝酸纤维素膜上间隔包被浓度为0.5mg/mL的金刚烷胺抗原和浓度为0.5mg/mL的恩诺沙星抗原作为检测线，并在硝酸纤维素膜上包被0.5mg/mL的X抗鼠IgG作为质控线，且质控线与检测线间隔设置。
发明人发现，选择包被上述浓度的抗原作为检测线时，能够满足较低检测限的金刚烷胺和恩诺沙星的检出，若包被的抗原浓度超出或低于上述浓度，均无法达到本申请相当的检测特异性和准确度。
在本发明应用较佳的实施方式中，在硝酸纤维膜上，每0.3-2cm长度上喷1-6μL的金刚烷胺抗原或恩诺沙星抗原作为两条检测线，每0.3-2cm长度上喷1-6μL的X抗鼠IgG作为质控线，相邻两条线之间的间距为0.2-0.5cm。
制备方法还包括在硝酸纤维膜上喷设两条检测线和质控线后进行干燥。优选地，选择在烘箱中进行干燥，例如40℃下干燥过夜。
在本发明应用较佳的实施方式中，在将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫进行拼接之前还包括制备金刚烷胺抗体、恩诺沙星抗体和胶体金的偶联物，并将金刚烷胺抗体、恩诺沙星抗体和胶体金的偶联物喷于结合垫上制得胶体金结合垫，胶体金结合垫包括胶体金－金刚烷结合垫和胶体金－恩诺沙星结合垫。
金刚烷胺抗体、恩诺沙星抗体和胶体金的偶联物的制备包括：分别制备金刚烷胺抗体与胶体金的偶联物和恩诺沙星与胶体金的偶联物，将金刚烷胺抗体与胶体金的偶联物喷于结合垫上制得胶体金－金刚烷结合垫，将恩诺沙星与胶体金的偶联物喷于结合垫上制得胶体金－恩诺沙星结合垫；
金刚烷胺抗体与胶体金的偶联物的制备包括：将胶体金溶液、硼酸钾溶液、金刚烷胺抗体溶液和牛血清白蛋白溶液混合制得混合液，离心后的沉淀用磷酸缓冲液PB复溶制得金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物；
恩诺沙星抗体和胶体金的偶联物的制备包括：将胶体金溶液、硼酸钾溶液、恩诺沙星抗体溶液和牛血清白蛋白溶液混合制得混合液，离心后的沉淀用磷酸缓冲液PB复溶制得金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物；
每1mL胶体金溶液中添加2.5－3.5μL浓度为2mg/mL的金刚烷胺抗体溶液或1.5－2.5μL浓度为2mg/mL的恩诺沙星抗体溶液，添加0.1M的硼酸钾溶液30－50μL，添加25－45μL的0.5－1.5wt％BSA溶液。
为了确定胶体金溶液中添加多少量的抗体溶液，发明人通过设置不同浓度梯度的抗体溶液筛选出溶液颜色变化最佳的方法，即每1mL的胶体金溶液中添加3μL浓度为2mg/mL的金刚烷胺抗体溶液或2μL浓度为2mg/mL的恩诺沙星抗体溶液。
优选地，在将金刚烷胺抗体溶液或恩诺沙星抗体溶液加入混合前还包括对金刚烷胺抗体或恩诺沙星抗体进行透析和复溶处理；透析是依次使用磷酸缓冲液PB以及蒸馏水进行透析，并用超纯水进行复溶。
购买的商用抗体经过透析超纯水复溶后减少了传统抗体保存液中盐离子的干扰，有有利于抗体与胶体金的进一步结合。
上述透析的次数可以根据实际的需求进行自适应选择，例如设置使用磷酸缓冲液PB透析1次，用蒸馏水透析2次，每间隔4h更换1次透析液，冷冻干燥后使用超纯水复溶为浓度1－2mg/mL的抗体溶液。在其他实施方式中，可以根据需要将抗体复溶为一定浓度的抗体溶液。
优选地，在将结合垫上喷金前还包括对结合垫进行预处理，预处理是将含0.5－1.5wt％牛血清白蛋白和0.5－1.5％吐温－20溶液的0.005－0.015MPBS溶液均布在结合垫上，并干燥。
结合垫预处理后促使金标抗体更易释放，有助于提高试纸条的显色深度，同时也有利于缩短显色时间。
在本发明应用较佳的实施方式中，离心后的沉淀用磷酸缓冲液PB和5－10wt％的蔗糖复溶。磷酸缓冲液PB可以采用如下的配方配制：0.01M，pH 7.4的磷酸缓冲液PB：称取KH2PO4 0.02g；Na2HPO4·12H2O 0.296g；用超纯水定容到1000mL，常温保存待用。
优选地，每1－2cm的结合垫上喷3－6μL的金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物；每1－2cm的结合垫上喷3－6μL的恩诺沙星抗体和胶体金的偶联物。
本发明还提供了一种同时检测恩诺沙星和金刚烷胺的试剂盒，其包括检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条以及壳体。
本发明还提供了一种使用上述检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条或上述同时检测恩诺沙星和金刚烷胺的试剂盒检测恩诺沙星和/或金刚烷胺的方法，其包括如下步骤：
将试纸条插入待检物质中或将待检物质滴在试纸条的样品垫上，根据条带判断检测结果。
根据条带判断检测结果的方法包括：
若质控线显色，且检测线有2条均显色，则判定待检物质中不含金刚烷胺和恩诺沙星；
若质控线显色，且检测线仅有金刚烷胺的检测线显色，而恩诺沙星的检测线不显色，则判定待检物质中的含恩诺沙星，不含金刚烷胺；
若质控线显色，且检测线仅有恩诺沙星的检测线显色，而金刚烷胺的检测线不显色，则判定待检物质中的含金刚烷胺，不含恩诺沙星；
若质控线显色，且检测线均不显色，则判定待检物质中同时含有金刚烷胺和恩诺沙星；
若质控线不显色，无论检测线是否显色，均判定试纸条失效。
上述两用试纸条的检测原理在于：将试纸条插在待检样本溶液中或者将待检样本溶液滴加于样品垫上，混匀后，待检样品液与胶体金结合垫上的金标抗体(金刚烷胺和恩诺沙星抗体与胶体金颗粒的偶联物)结合后在毛细作用下于硝酸纤维素膜上扩散，方向为从样品垫至吸水垫；
若待检样品液中仅含有金刚烷胺，则扩散过程中待检样品液中的金刚烷胺可与胶体金结合垫上的金刚烷胺金标抗体相结合，进而完全封闭金标抗体上能够与金刚烷胺抗原相结合的位点，阻止金刚烷胺金标抗体与硝酸纤维素膜上金刚烷胺抗原结合(待检液中的金刚烷胺竞争性结合胶体金结合垫上的金标抗体)，使得金刚烷胺检测线不显色，而X抗鼠IgG由于结合位点不同，无论待测样品中是否含有金刚烷胺，都可以与金标抗体结合，质控线始终显色；同时由于待检样品液中不含有恩诺沙星，恩诺沙星金标抗体在毛细作用下向吸水垫方向移动，并与硝酸纤维素膜上包被的恩诺沙星抗原结合，进而使得恩诺沙星检测线显色。
若待检样品液中仅含有恩诺沙星，则扩散过程中待检样品液中的恩诺沙星可与胶体金结合垫上的恩诺沙星金标抗体相结合，进而完全封闭恩诺沙星金标抗体上与恩诺沙星抗原的结合位点，阻止恩诺沙星金标抗体与硝酸纤维素膜上恩诺沙星抗原结合(待检液中的恩诺沙星竞争性结合胶体金结合垫上的金标抗体)，使得恩诺沙星检测线不显色，而X抗鼠IgG由于结合位点不同，无论待测样品中是否含有恩诺沙星，都可以与金标抗体结合，质控线始终显色；同时由于待检样品液中不含有金刚烷胺，金刚烷胺抗体在毛细作用下向吸水垫方向移动，并与硝酸纤维素膜上包被的金刚烷胺抗原结合，进而使得金刚烷胺检测线显色。
若待检样品液中同时含有一定量的金刚烷胺和恩诺沙星，则金标抗体上的抗原结合位点均被封闭，检测线不显色，而X抗鼠IgG仍可与金标抗体结合，质控线显色。如果质控线不显色，则试纸失效。
检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条或同时检测恩诺沙星和金刚烷胺的试剂盒在畜禽产品中金刚烷胺和/或恩诺沙星检测中的应用。
上述两用试纸条或检测试剂盒既可用于单独检测禽畜产品(例如肉、蛋、奶、奶制衍生品)中恩诺沙星或金刚烷胺的残留，也可以同时实现二者的残留检出。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
以下为本发明实施例以及实验例使用的试剂来源及组成。
牛血清白蛋白(BSA，分子量68kDa)、羊抗小鼠二抗IgG均购自索莱宝公司。吸收垫、样品垫、吸水纸、塑料壳、硝酸纤维素膜(NC膜)和喷金机(BioDot XY-3000)等试纸条制作材料及设备均购自上海杰一生物有限公司；KOH等其余常规试剂均购自北京化学试剂公司。
金刚烷胺、恩诺沙星：购自天津阿尔塔科技有限公司。
金刚烷胺抗原、抗体，恩诺沙星抗原：购自广州优抗多生物技术有限公司。
恩诺沙星抗体：购自美国Fitzgerald Industries International,Inc.
胶体金溶剂购自上海杰一生物有限公司。
pH7.5、0.1M的PBS缓冲液的制备方法：称量4.0g NaCl、0.1g KH2PO4、1.48gNa2HPO4·12H2O，用蒸馏水定容至500mL。
0.01M，pH 7.4的磷酸缓冲液PB：称取KH2PO4 0.02g；Na2HPO4·12H2O 0.296g；用超纯水定容到1000mL，常温保存待用
0.1M硼酸钾溶液，pH 8.3:分别称取KOH 0.397g，H3BO3 3.092g，溶解后使用
用超纯水定容到500mL，常温保存待用。
0.1％NaN3:称取0.1g NaN3，将其溶于100mL超纯水中，0.45μm过滤，常温保存待用。
1％BSA溶液:称取1g BSA溶于100mL超纯水中，过滤后添加0.1％的NaN3，使总体积稀释20倍防止蛋白质溶液变质。常温保存待用。
结合垫预处理液：在0.01MPBS中加入0.1％BSA溶液，同时添加1％Tween-20溶液充分摇匀。
实施例1
本实施例提供了一种检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条及其制备方法。
(1)制备胶体金与金刚烷胺抗体的偶联物以及胶体金与恩诺沙星抗体的偶联物。
本实施例先制备胶体金与金刚烷胺抗体的偶联物。抗体的准备：待使用的金刚烷胺抗体使用PB透析一次后，蒸馏水透析2次，每4h换一次透析液。冷冻干燥后使用超纯水溶解为2mg/mL。
筛选最佳标记条件：准备5个1.5mL离心管，每管均加入胶体金1mL，0.1M硼酸钾溶液50μL。轻柔颠倒，充分使溶液混匀，防止剧烈震荡破坏胶体金溶液稳定性。5个离心管中分别加入1μL、2μL、3μL、4μL、5μL上述的2mg/mL的抗体溶液。轻柔颠倒混匀后每管加入10％NaCl溶液50μL。混匀后观察混合液颜色。选择混合液颜色不变的溶液作为添加抗体的合适浓度。确定了最佳标记条件添加3μL金刚烷胺抗体溶液。
胶体金与金刚烷胺抗体的偶联物的制备：根据试纸条制作量准备若干1.5mL离心管，每管加入1mL胶体金溶液，0.1M硼酸钾溶液50μL，轻柔颠倒混匀。添加3μL金刚烷胺抗体溶液。混匀后每管加入40μL10％BSA溶液，混匀。10000rpm离心15min，离心弃上清。沉淀应呈现均匀紫红色，若离心管壁黏着有红色物质或底部是黑色泥状物表示标记失败。由此制得胶体金与金刚烷胺抗体的偶联物。
按照胶体金与金刚烷胺抗体的偶联物的制备方法，筛选出1mL的胶体金溶液添加2mg/mL恩诺沙星抗体溶液的体积为2μL，并制得胶体金与恩诺沙星抗体的偶联物。
(2)在硝酸纤维素膜上喷制检测线和质控线。分别将金刚烷胺抗原、恩诺沙星抗原和羊抗鼠二抗IgG用磷酸缓冲液PB溶解，配置成系列浓度后，用来筛选合适的条件和灵敏度。
本实施例中将金刚烷胺抗原按浓度0.5mg/mL、恩诺沙星抗原按浓度0.5mg/mL与羊抗鼠二抗IgG浓度0.5mg/mL分别喷在硝酸纤维素膜上作为两条检测线(T线)和对照线(C线)，每两条线之间间距为0.3cm，硝酸纤维素膜每1cm喷样1μL。40℃烘箱干燥过夜。
(3)将步骤(1)制备胶体金与金刚烷胺抗体的偶联物以及胶体金与恩诺沙星抗体的偶联物用含5wt％蔗糖的磷酸缓冲液PB溶解，其中金刚烷胺使用800μL的磷酸缓冲液PB、恩诺沙星使用200μL磷酸缓冲液PB溶解，获得待使用的金标抗体溶液。
准备结合垫，使用喷金机将金刚烷胺金标抗体溶液均匀喷到结合垫上，每1cm结合垫铺3μL。40℃烘箱干燥过夜制得胶体金－金刚烷胺结合垫。使用喷金机将恩诺沙星金标抗体溶液均匀喷到结合垫上，每1cm结合垫铺3μL。40℃烘箱干燥过夜制得胶体金－恩诺沙星结合垫。
平稳放置NC膜，佩戴指套将两种结合垫上部压到NC膜下部并固定，将样品垫上部压在结合垫下部并固定；三者重叠处设置为0.2cm。使用试纸条专用胶带及贴纸固定NC膜(硝酸纤维素膜)、胶体金-金刚烷结合垫和胶体金-恩诺沙星结合垫以及样品垫。紧贴NC膜上部安装吸水垫。试纸条组装好后剪裁成3mm的规格。需要说明的是胶体金-金刚烷结合垫和胶体金-恩诺沙星结合垫并排设置，使得在一个试纸条的横截面同时具有金刚烷抗体和恩诺沙星抗体。
试纸条的组装参照图1和图2所示(图2中：1.PB复溶后的金标抗体通过喷金机固定在金标垫上；2.试纸条底板；3.硝酸纤维素膜；4.划线为羊抗鼠二抗作为质控线；5.两条检测线分别划有金刚烷胺抗原与恩诺沙星抗原；6.吸水垫黏贴至底板上部；7.样品垫黏贴至底板下部)。
实验例1
本实验例对实施例1制备的两用试纸条进行试纸条特异性评价。
分别使用恩诺沙星和金刚烷胺的标准梯度溶液来判定本发明所述试纸条是否能同时检测恩诺沙星与金刚烷胺两种物质而不产生交叉。
当单独使用200ng/mL恩诺沙星标准溶液时(图3中的中图)，所有试纸条显示恩诺沙星T线均不显色。
当单独使用1000ng/mL金刚烷胺标准溶液时(图3中的左图)，所有试纸条显示金刚烷胺T线均不显色。
而阴性对照中(阴性对照即为预处理液，图3中的右图)，所有试纸条显示两条T线均显色。
说明本发明所述同时检测试纸条恩诺沙星与金刚烷胺之间是能够实现特异性检测的。
实验例2
本实验例对上述实施例1制备的两用试纸条进行最小消线浓度的确定。
最小消线浓度指当T线不显色时，抑制所需目标物的最小浓度。
将金刚烷胺标准液稀释为1000、500、200、100、50ng/mL五个浓度，将恩诺沙星稀释为200、100、50、20、10ng/mL五个浓度，使用预处理液作为阴性对照，滴加50μL标准样品溶液到试纸条的样品垫中，15分钟内观测试纸条颜色，根据T线颜色深浅来判断试纸条最小消线浓度。
如图4、图5所示，阴性样品中试纸条的2条T线及1条C线总计3条线显色；当发生完全消线时，金刚烷胺浓度应在200-500ng/mL之间，恩诺沙星浓度应在50-20ng/mL之间。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板，在所述底板的表面沿层析方向依次铺设有样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，且所述样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次固定连接，所述硝酸纤维素膜上包被有两条检测线和质控线，两条所述检测线是指包被有金刚烷胺抗原的检测线和包被有恩诺沙星抗原的检测线，所述质控线是指包被有X抗鼠IgG的质控线；所述胶体金结合垫上设有金刚烷胺抗体、恩诺沙星抗体和胶体金的偶联物；所述X为羊或兔。
2.一种如权利要求1所述的检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
在所述底板上，将所述样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫拼接为试纸条；
所述硝酸纤维素膜上包被有两条检测线和质控线。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括在所述硝酸纤维素膜上间隔包被浓度为0.3-0.8mg/mL的金刚烷胺抗原和浓度为0.3-0.8mg/mL的恩诺沙星抗原作为检测线，并在所述硝酸纤维素膜上包被0.3-0.8mg/mL的X抗鼠IgG作为质控线，且所述质控线与所述检测线间隔设置。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在所述硝酸纤维膜上，每0.3-2cm长度上喷1-6μL的金刚烷胺抗原或恩诺沙星抗原作为两条检测线，每0.3-2cm长度上喷1-6μL的X抗鼠IgG作为质控线，相邻两条线之间的间距为0.2-0.5cm；
所述制备方法还包括在所述硝酸纤维膜上喷设两条检测线和质控线后进行干燥。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在将所述样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫进行拼接之前还包括制备金刚烷胺抗体、恩诺沙星抗体和胶体金的偶联物，并将所述金刚烷胺抗体、恩诺沙星抗体和胶体金的偶联物喷于结合垫上制得所述胶体金结合垫，所述胶体金结合垫包括胶体金－金刚烷结合垫和胶体金－恩诺沙星结合垫；
所述金刚烷胺抗体、恩诺沙星抗体和胶体金的偶联物的制备包括：分别制备金刚烷胺抗体与胶体金的偶联物和恩诺沙星与胶体金的偶联物，将所述金刚烷胺抗体与胶体金的偶联物喷于结合垫上制得胶体金－金刚烷结合垫，将所述恩诺沙星与胶体金的偶联物喷于结合垫上制得胶体金－恩诺沙星结合垫；
所述金刚烷胺抗体与胶体金的偶联物的制备包括：将胶体金溶液、硼酸钾溶液、金刚烷胺抗体溶液和牛血清白蛋白溶液混合制得混合液，离心后的沉淀用磷酸缓冲液PB复溶制得金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物；
所述恩诺沙星抗体和胶体金的偶联物的制备包括：将胶体金溶液、硼酸钾溶液、恩诺沙星抗体溶液和牛血清白蛋白溶液混合制得混合液，离心后的沉淀用磷酸缓冲液PB复溶制得金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物；
每1mL胶体金溶液中添加2.5－3.5μL浓度为2mg/mL的金刚烷胺抗体溶液或1.5－2.5μL浓度为2mg/mL的恩诺沙星抗体溶液，添加0.1M的硼酸钾溶液30－50μL，添加25－45μL的0.5－1.5wt％BSA溶液；
优选地，在将所述金刚烷胺抗体溶液或所述恩诺沙星抗体溶液加入混合前还包括对金刚烷胺抗体或所述恩诺沙星抗体进行透析和复溶处理；所述透析是依次使用磷酸缓冲液PB以及蒸馏水进行透析，并用超纯水进行复溶；
优选地，在将所述结合垫上喷金前还包括对结合垫进行预处理，所述预处理是将含0.5－1.5wt％牛血清白蛋白和0.5－1.5％吐温－20溶液的0.005－0.015M PBS溶液均布在所述结合垫上，并干燥。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，离心后的沉淀用磷酸缓冲液PB和5－10wt％的蔗糖复溶；
优选地，每1－2cm的结合垫上喷2－5μL的所述金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物；每1－2cm的结合垫上喷2－5μL的所述恩诺沙星抗体和胶体金的偶联物。
7.一种同时检测恩诺沙星和金刚烷胺的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条以及壳体。
8.一种使用权利要求1所述的检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条或权利要求7所述的同时检测恩诺沙星和金刚烷胺的试剂盒检测恩诺沙星和/或金刚烷胺的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
将所述试纸条插入待检物质中或将待检物质滴在所述试纸条的样品垫上，根据条带判断检测结果。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，根据条带判断检测结果的方法包括：
若质控线显色，且检测线有2条均显色，则判定待检物质中不含金刚烷胺和恩诺沙星；
若质控线显色，且检测线仅有金刚烷胺的检测线显色，而恩诺沙星的检测线不显色，则判定待检物质中的含恩诺沙星，不含金刚烷胺；
若质控线显色，且检测线仅有恩诺沙星的检测线显色，而金刚烷胺的检测线不显色，则判定待检物质中的含金刚烷胺，不含恩诺沙星；
若质控线显色，且检测线均不显色，则判定待检物质中同时含有金刚烷胺和恩诺沙星；
若质控线不显色，无论检测线是否显色，均判定试纸条失效。
10.如权利要求1所述的检测恩诺沙星和金刚烷胺的两用试纸条或权利要求7所述的同时检测恩诺沙星和金刚烷胺的试剂盒在畜禽产品中金刚烷胺和/或恩诺沙星检测中的应用。
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