CN105301249A - 金刚烷胺药物残留快速检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明试纸条属于食品安全快速检测领域。试纸条包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，结合物释放垫的部分区域覆盖于样品吸收垫之下。在反应膜上包被有金刚烷胺-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠IgG构成的质控线；结合物释放垫包被有金刚烷胺的胶体金标记物。该试纸条可以延长检测结果观察时间，样品吸收垫也可以将检测液充分吸收与金标抗体完全接触而充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差。还可以防止检测样本中的一些干扰成份使金标抗体中的蛋白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。

Description

金刚烷胺药物残留快速检测试纸条

技术领域

本发明涉及一种检测金刚烷胺药物残留快速检测试纸条，属于食品安全快速检测领域。

技术背景

金刚烷胺是最早用于抑制流感病毒的抗病毒药，美国于亚洲感冒流行的1966年批准其作为预防药。并于1976年在预防药的基础上确认其为治疗药。该药对成年患者的疗效及安全性已得到广泛认同。但治疗剂量与产生副作用的剂量很接近，对高龄者及有慢性心肺疾病或肾脏疾病者的剂量和给药计划很难确定，因此尚未在临床上推广应用。在日本,金刚烷胺一直作为帕金森病的治疗药，直到1998年才被批准用于流感病毒A型感染性疾病的治疗。

金刚烷胺可用于亚洲甲-Ⅱ型流感的预防和早期治疗，与抗菌素合用可治败血症和病毒性肺炎，并有退烧作用。也有抗震颤麻痹的作用。适用于原发性帕金森病、脑炎后的帕金森综合征、药物诱发的锥体外系反应、一氧化碳中毒后帕金森综合征及老年人合并有脑动脉硬化的帕金森综合征。

根据其药理作用，国内现在主要将金刚烷胺用于鸡、猪流感的预防和早期治疗，及猪传染性胃肠炎的防治。为避免影响国家动物疫病强制性免疫政策落实,给重大动物疫病防控工作带来不良后果,农业部发布《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》,规定除经批准生产、使用的疫苗产品外,禁止使用金刚烷胺防治高致病性禽流感等一类病原微生物引起的病毒性疫病。

2005年农业部《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》，已将金刚烷胺、金刚乙胺等列入《兽药地方标准废止目录》，明确要求立即停止生产、经营和使用，违者按生产、经营假兽药和使用禁用兽药处理。

2005年中国政府《农业部公告(第560号)》也明确指出，“金刚烷胺类等人用抗病毒药移植兽用，缺乏科学规范、安全有效实验数据，用于动物病毒性疫病不但给动物疫病控制带来不良后果，而且影响国家动物疫病防控政策的实施。”

2012年11月底被爆出养殖的一只鸡从孵出到端上餐桌，只需要45天，是用饲料和药物喂养的。其中一些不法商贩采用金刚烷胺人用药物，用于抑制禽类的禽流感等病症。其原因是价格低廉，但如果用量不当会导致其在禽类体内残留或禽流感病毒变异，人体食用后会对人体造成伤害。

我国对于动物源性食品中金刚烷胺残留含量的相关研究报道属于空白，也未曾制定或立项过国家标准、行业标准，国际上也无特定限量要求及相应检测方法。研究食品中金刚烷胺残留含量的检测技术，对于指导进出口食品中金刚烷胺含量控制，有效应对日本肯定列表制度，及时消除潜在的出口贸易障碍，促进相关行业拓展国际市场，具有紧迫的现实意义。

发明内容

本发明的目的:研制出特异、敏感、快速、简便的金刚烷胺药物残留快速检测试纸条。

本发明的技术方案:

一种金刚烷胺药物残留快速检测试纸条，底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护膜固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为纤维层，吸附金标抗体纤维层，纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联金刚烷胺药物的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“Ⅱ”。支撑层是用不吸水的硬质塑胶片条或硬纸条制成。测试端纤维层用玻璃棉、或尼龙膜、或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、或聚酚膜制成，优选玻璃棉。吸水材料层用吸水纸制成。纤维素膜层用硝酸纤维素膜、或纯纤维素膜，或梭化纤维素膜制成。金标抗体纤维层用吸附金刚烷胺药物的金标抗体玻璃棉，金刚烷胺药物金标抗体为胶体金标记金刚烷胺药物的单克隆抗体或多克隆抗体，偶联金刚烷胺药物的载体蛋白溶液为金刚烷胺药物与载体蛋白偶联的复合溶液。在测试端吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在测试端纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端纤维层一侧约0.5cm处。偶联金刚烷胺药物的载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA），或为鸡卵清白蛋白（OVA），或为铁蛋白，或为血蓝蛋白。

本发明的金刚烷胺药物残留快速检测试纸条具有以下优点:

(1)特异性强，敏感性高。该试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速检测试纸条具有较高的特异性和敏感性。

(2)操作简便、快速。使用本发明试纸条时无需任何其它试剂，只需滴加100μl左右待检样品于样品垫上，在5分钟内即可判定检测结果。

(3)结果显示形象、直观、准确。本测试纸条以显示红棕色“I”及“Ⅱ”印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条棕红色“l”印迹表示在被检测样品液中含有金刚烷胺，两条棕红色“Ⅱ”印迹表示在被检样品中不含金刚烷胺，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。

(4)成本低，投资少。使用快速检测试纸条，不需另配仪器设备及其它试剂，随时随地进行检测，费用低廉，可节省大量贵重仪器及设备费用。

(5)应用范围广，便于推广应用。本发明快速检测试纸操作简单，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较好的经济、社会效益。

附图说明

图1为金刚烷胺药物残留快速检测试纸条结构示意图（其中1、样品吸收垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、检测线；6.质控线；7、底板）。

图2为金刚烷胺药物残留快速检测试纸条俯视结构示意图（其中8-1和8-2是覆盖在试纸卡两端的保护膜，9为标记线）。

图3为金刚烷胺药物快速检测试纸卡阴性（图3.a）、阳性（图3.b），无效（图3.c）显色示意图，其中T质控区，C为检测区。

具体实施方式

制备金刚烷胺药物残留快速检测试纸条，首先需制备偶联金刚烷胺药物的载体蛋白和金标抗体，从而制备检测印迹和金标抗体纤维;其次需制备羊抗或兔抗小鼠IgG抗体，用于制备对照印迹。

1.金刚烷胺药物与载体蛋白的偶联

分别采用混合酸酐法和碳化二亚胺法将金刚烷胺药物和卵清蛋白和血蓝蛋白偶联得到包被原（用于固定在反应膜上）和免疫原（用于制备单克隆抗体）。

(1)包被原的制备：

①将5mg金刚烷胺药物0.5mL甲酰胺（DMF）溶解，冷却至10℃,加入氯甲酸异丁酯5μ1,4℃搅拌反应30min，即可得到反应液Ⅰ液;

②称取卵清蛋白（OVA）30mg，使之充分溶解在2mL50mM碳酸钠溶液中，即可得到反应液Ⅱ液;其中金刚烷胺药物半抗原与所述卵清蛋白的摩尔配比为（15-20）:1。

③将反应Ⅰ液逐滴缓慢滴加到该反应Ⅱ溶液中，4℃反应4h，4℃过夜。取最终反应物于pH7.4，0.02M磷酸盐缓冲液中透析纯化24h，3000g以上离心30min，收集上清液，即得到包被原。

(2)免疫原的制备：

①将5mg金刚烷胺药物、10mgN-羟基琥珀酰亚胺（NHS），以及12.5mg碳化二亚胺（EDC）充分溶解于1mLDMF中，于室温下搅拌24h，即可得到反应液Ⅰ液;

②称取血蓝蛋白40mg，使之充分溶解在3mL40mM碳酸钠溶液中，即得到反应液Ⅱ液，其中金刚烷胺药物半抗原与所述血蓝蛋白的摩尔配比为（12-15）:1。

③将反应液Ⅰ液逐滴缓慢滴加到反应液Ⅱ液中，并于室温下搅拌3h，然后4℃过夜，过柱，用缓冲液平衡和洗脱，进一步纯化后得到免疫原。

2.抗金刚烷胺药物单克隆抗体的制备

(1)动物免疫：将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为100μg/只，使其产生抗血清。

(2)细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按7：1比例(数量配比)与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(3)细胞冻存和复苏：将前述单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1X10⁶个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

(4)单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射金刚烷胺药物的单克隆杂交瘤细胞株5X10⁷个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，得到单克隆抗体，于-20℃保存。

3.金刚烷胺药物金标抗体和金标抗体玻璃棉的制备

以柠檬酸钠还原法制备金溶胶，即在50~100mL沸腾的0.01~0.05%氯金酸水溶液中加入2~4mL的0.5~2%柠檬酸三钠溶液，获得直径15nm左右的胶体金。以0.1mol/L的K₂C0₃调胶体金pH至8.5~9.5，置于以1:2000~3000的标记比将待标记的金刚烷胺药物单克隆抗体加入pH8.5~9.5的金溶胶中，标记10min后，加20%PEG10000至终浓度0.05%，4℃、1500~3000rpm离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃,15000rpm离心1h，弃上清，获初步纯化金标抗体蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获金刚烷胺药物的胶体金标记抗体。将1:(100~500)稀释的胶金标记抗体吸附于精制玻璃棉中，4℃低温真空干燥，制备金刚烷胺药物金标抗体玻璃棉。

4.羊抗或兔抗小鼠IgG的制备

以饱和硫酸铵提取小鼠血清IgG，取1份小鼠血清加2份PBS(pH7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵混匀，置4℃冰箱2h,4℃,1200r/min离心15min，弃上清;以适量PBS(pH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵至终浓度33%，置4℃冰箱2h,4℃,1200r/min离心15min，弃上清，以少量PBS印H7.2)溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS(pH7.2)过夜透析，换液2~3次，4℃,12000r/min离心15min，收集上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度，以50~100μg/kg体重(小鼠血清IgG)经皮下和肌肉注射免疫健康羊或家兔3~4次，末次免疫10天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1:2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其高免血清，以饱和硫酸铵提取羊抗或兔抗小鼠IgG(方法与提取小鼠血清IgG相同，不重述)，用于金刚烷胺药物快速检测试纸条对照显示印迹的制备。

5.金刚烷胺药物快速检测试纸条反应原理

(1)当待检样品溶液滴入试纸条加样孔后，样品溶液因硝酸纤维素膜载体的毛细管作用向另一端扩散。在移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过免疫胶体金的颜色显示出来。如果样品溶液含有金刚烷胺药物残留，金刚烷胺药物先和胶体金颗粒上的抗体反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至检测线时，胶体金颗粒上抗体的活性位点因被样品溶液中的金刚烷胺药物占据而无法与检测线上金刚烷胺药物抗原结合，不能显示检测印迹，而羊抗鼠IgG抗体则可与金标抗体结合，质控区显色，形成一条红色对照印迹“Ⅰ”，呈一条印迹为阳性；相反样本溶液中无金刚烷胺药物则不能阻止金标抗体与纤维素膜上金刚烷胺药物抗原偶联载体蛋白检测印迹结合，检测区显示红色印迹“Ⅰ”，同样羊抗鼠IgG抗体也与金标抗体结合，质控区也显示红色对照印迹“Ⅰ”，形成两条红线“Ⅱ”阴性标记，如果纤维素膜上没有红色标记显示，则试纸卡无效。

(2)金刚烷胺药物残留快速检测试纸条的结构，参见图1、图2。图中1为样品吸收垫，用玻璃棉制成，2为结合物释放垫层，根据上述具体实施方式4中所述的制备方法，制备吸附有金刚烷胺药物单克隆抗体的金标抗体纤维层，3为反应膜层，采用硝酸纤维素膜，4为吸水材料层，用吸水滤纸制成，将编号1，2，3，4各层从左至右依次粘贴固定在塑胶条7上，各层交界处纤维互相交叉渗透。5为用偶联金刚烷胺药物的卵清蛋白（OVA）溶液印上检测印迹“Ⅰ”，6为用羊抗小鼠IgG溶液印上对照印迹“Ⅰ”，两印迹平行排列形成组合印迹带“Ⅱ”。8-1为覆盖在样品吸收垫层1和金标抗体纤维层2上面的测试样品端白色保护膜，在1和2交界处对应保护膜8-1位置上偏向于样品吸收垫一侧0.5cm处印有标记线9，9的右端印有箭头及max字样，滤纸层4为吸水层（手柄端）上覆盖有其它颜色（如黄色）保护膜8-2。

7.检测样品液的制备：

(1)取2g动物组织匀浆物于50mL聚苯乙烯离心管中；

(2)加入8mL甲醇-1%三氯乙酸溶液，充分混匀，室温以3000g以上的速度离心5min；

(3)取1mL上层液体加入9mL磷酸盐缓冲液中，充分混匀后用1M的氢氧化钠溶液调PH值至中性，混匀，室温以3000g以上的速度离心离心5min；

(4)取上层液待测。

8.检测操作方法:从包装袋中取出试纸条，用滴管吸取待检溶液，在加样孔中滴入3滴(约100μL),加样后开始计时，结果应在3-5分钟读取，其他时间判读无效。

9.检测结果判断:如果在纤维素膜上有一条红棕色标记“Ⅰ”显示，检侧结果呈阳性，表示在被检测样品液中含金刚烷胺药物（如图3b所示），如果金刚烷胺药物快速检测试纸条上的纤维素膜上出现两条红棕色标记“Ⅱ”，检测结果呈阴性，表示待检样品中不含金刚烷胺药物成份（如图3a所示），如未出现C线，可能操作不当或试剂板已失效（如图3.c所示）。

Claims (8)

1.一种金刚烷胺药物残留快速检测试纸条，含有底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护层固定在吸附层上，其特征是:吸附层从测试端依次为纤维层、吸附金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联金刚烷胺药物的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，有用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“Ⅱ”。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：支撑层是用不吸水的硬质塑胶条或硬纸条制成。

3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：测试端纤维层用玻璃棉、或尼龙膜、或聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜制成。

4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：吸水材料层用吸水纸制成。

5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:纤维素膜层用硝酸纤维素膜、或纯纤维素膜、或羧化纤维素膜制成。

6.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:金标抗体纤维层用吸附金刚烷胺药物的金标抗体玻璃棉，金刚烷胺药物金标抗体为胶体金标记的金刚烷胺药物单克隆抗体或多克隆抗体，偶联金刚烷胺药物的载体蛋白溶液为金刚烷胺药物与载体蛋白偶联的复合溶液。

7.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:在测试端吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在测试端纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端纤维层一侧约0.5cm处。

8.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:偶联金刚烷胺药物的载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA），或为鸡卵清白蛋白（OVA），或为铁蛋白，或为血蓝蛋白。