CN103941000B - 一种检测磺胺类药物和氟喹诺酮类药物的试纸条及方法 - Google Patents

一种检测磺胺类药物和氟喹诺酮类药物的试纸条及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测磺胺类药物和氟喹诺酮类药物的试纸条及方法。试纸条包括微孔试剂和试纸，所述微孔试剂中冻干磺胺类药物单克隆抗体‑胶体金标记物和氟喹诺酮类药物单克隆抗体‑胶体金标记物；所述试纸由样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜、底板依次连接组成，所述反应膜上包括两条检测线和一条质控线，两条检测线上分别包被有磺胺类药物半抗原‑载体蛋白偶联物和氟喹诺酮类药物半抗原‑载体蛋白偶联物，质控线上包被有羊抗鼠抗抗体。用本发明试纸条检测磺胺类药物和氟喹诺酮类药物的方法简便、快速、直观、准确、便于携带、适用范围广、成本低、易推广使用。

Description

一种检测磺胺类药物和氟喹诺酮类药物的试纸条及方法
技术领域
本发明涉及一种检测磺胺类药物和氟喹诺酮类药物的试纸条及方法，具体涉及一种用于同时检测牛奶中磺胺类药物和氟喹诺酮类药物的胶体金试纸条。
技术背景
磺胺类药物(Sulfonamides，SAs)是一类具有对氨基苯磺酰胺结构的化学治疗药物，通过影响细胞核蛋白质的合成，抑制细菌的繁殖。氟喹诺酮类药物(Fluoroquinolones，FQs)是人工合成的含4-喹诺酮基本结构的抗菌药，它通过抑制细菌DNA的合成而达到抑菌作用。由于FQs和SAs能抑制大多数革兰氏阳性菌和阴性菌，性质稳定、价格低廉、使用方便，常以亚治疗浓度的药物作为饲料添加剂来预防疾病的发生，提高饲料的转化率，促进动物生长。但长期用药所产生的不良反应、在畜禽产品中的残留、耐药性的增加以及在环境中的生态效应等已引起国内外的广泛关注。我国规定了牛、鸡、猪、羊等动物组织中达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星(环丙沙星与恩诺沙星量之和)、沙拉沙星等喹诺酮类兽药最高残留限量为10～1900μg/kg，磺胺类兽药总量的最高残留限量为100μg/kg；欧盟规定在动物组织中达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星(环丙沙星与恩诺沙星量之和)、麻保沙星、沙拉沙星等喹诺酮类兽药最高残留限量为10～1900μg/kg，磺胺类兽药的最高残留限量与我国相同；而美国FDA明确规定肉中磺胺二甲嘧啶残留量要小于100μg/kg，并且禁止在食源性动物中使用氟喹诺酮类兽药。
目前，动物源性食品中SAs和FQs残留的检测手段主要包括微生物法、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫法(ELISA)、高效毛细管电泳法(HPCE)、放射免疫法和荧光光度法等。由于兽药性质差别较大，现有的残留分析一般按照化学结构类似的同族药物来建立相应的检测方法，而这些分析方法多集中在对单类抗生素的同时检测上，而对多类抗生素同时检测的方法研究较少，不能满足目前兽药种类不断增加、分析通量不断提高的需求。目前也有关于液相色谱-质谱联用技术的研究，该方法术灵敏度高，选择性和特异性好，能对低浓度的样品进行准确的定性确认，但样品前处理过程复杂，仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，仅适用于样品的确证分析，不适合大批量样品的筛选及现场检测。与之相比，胶体金免疫层析法检测时间短、稳定性好、操作简便、无需其他仪器设备，结果判断直观可靠，适用于对现场大批量样品进行快速筛选，对控制多类抗生素残留具有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种同时检测磺胺类药物和氟喹诺酮类药物的试纸条。
本发明所提供的试纸条包括微孔试剂和试纸，微孔试剂具有微孔塞，试纸包括底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜，其依次连接；所述微孔试剂中冻干有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物和氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物；反应膜上包括两条检测线和一条质控线，两条检测线上分别包被有磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物和氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物，质控线上包被有羊抗鼠抗抗体。
所述磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物由磺胺类药物半抗原与载体蛋白偶联得到，所述氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物由氟喹诺酮类药物半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。
所述磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物中的磺胺类药物单克隆抗体是以磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物中的氟喹诺酮类药物单克隆抗体是以氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。
所述样品吸收垫上粘贴有保护膜，为检测端，上面有MAX标记线。
所述检测线位于近于有MAX标记的保护膜的一端，所述质控线位于远离有MAX标记的保护膜的一端。
所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：
1)制备冻干有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物和氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；
2)制备具有分别包被有磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物和氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物的两条检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；
4)将1)和3)制备好的冻干有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物和氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。
具体地说，步骤包括：
1)将4-乙酰氨基苯磺酰氯与2-氨基-3-吡啶甲醛反应，制备磺胺类药物半抗原；将诺氟沙星与1,3-丙二胺反应，制备氟喹诺酮类药物半抗原；
2)将磺胺类药物半抗原与载体蛋白偶联，制备磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物；将氟喹诺酮类药物半抗原与载体蛋白偶联，制备氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物；
3)用磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌磺胺类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株；用氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌氟喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体
5)将磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物和氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物分别包被于反应膜的两条检测线上，将羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的质控线上；
6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；
7)将制备的磺胺类药物单克隆抗体和氟喹诺酮类药物单克隆抗体分别加入到制备的胶体金中，得到磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物和氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物；
8)将磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物和氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物共同冻干在微孔试剂中，将微孔试剂加上微孔塞；
9)将样品吸收垫用体积分数为0.5％牛血清白蛋白、pH为7.2的0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；
10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜；
11)将制备好的微孔试剂和试纸组装成试纸条，2～8℃条件下保存12个月。
本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测牛奶中磺胺类药物和氟喹诺酮类药物残留的方法，它包括步骤：
(1)用试纸条进行检测；
(2)分析检测结果。
本发明试纸条的检测原理：将待检牛奶样本滴加于微孔试剂中，混匀后，将标有MAX标记线端向下，插入孵育后的微孔试剂中，待检样品液与微孔中的金标抗体结合后一起向反应膜扩散；若待检样品液中磺胺类药物或氟喹诺酮类药物的含量高，则扩散过程中待检样品液中的磺胺类药物或氟喹诺酮类药物可与金标抗体相结合，进而完全封闭金标抗体上磺胺类药物或氟喹诺酮类药物的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物或氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物结合，检测线不显色，而抗抗体则可与金标抗体结合，质控线显色；若待检样品液中磺胺类药物或氟喹诺酮类药物的含量低或无，则金标抗体上的抗原结合位点不能被封闭，进而金标抗体会与反应膜上磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物和氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联偶联物结合，检测线显色，同时抗抗体也可与金标抗体结合，质控线显色。如果质控线不显色，则试纸失效。如图4所示。
阴性：当质控线显示出红色条带，两条检测线也都显示出红色条带，判为阴性。
磺胺类药物阳性：当质控线和包被有氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线显示出红色条带，而包被有磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线不显色时，判为磺胺类药物阳性。
氟喹诺酮类药物阳性：当质控线和包被有磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线显示出红色条带，而包被有氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线不显色时，判为氟喹诺酮类药物阳性。
磺胺类药物和氟喹诺酮类药物均阳性：当质控线显示出红色条带，而两条检测线都不显色时，判为磺胺类药物和氟喹诺酮类药物均阳性。
无效：当质控线不显示出红色条带，则无论检测线显示出红色条带与否，该试纸均判为无效。
本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、便于携带、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，采用高特异性的磺胺类药物单克隆抗体和氟喹诺酮类药物单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性；将金标抗体冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度；本发明试纸条能够同时检测磺胺类药物和氟喹诺酮类药物，实现了一个试纸条对多类抗生素的检测，满足了市场上对磺胺类药物和氟喹诺酮类药物同时检测的需求。用本发明试纸条检测磺胺类药物和氟喹诺酮类药物的方法，简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。
附图说明
图1为试纸剖面结构示意图。
图2为试纸俯视图。
图3为微孔试剂图。
图4为试纸检测结果判定图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1检测磺胺类药物和氟喹诺酮类药物的试纸条的构成
一、试纸(图1)
所述试纸是由底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜组成；
所述样品吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序粘贴在底板6上，样品吸收垫的末端与反应膜相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；
所述试纸粘贴有保护膜，保护膜7覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX字样(图2)；
所述反应膜上有检测线4-1、检测线4-2和质控线5，均呈与所述试纸的长相垂直的条带状，检测线4-1位于近于有MAX标记的保护膜的一端，质控线5位于远离有MAX标记的保护膜的一端，检测线4-2位于检测线4-1和质控线5之间，检测线4-1包被有磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物(磺胺类药物半抗原-卵清蛋白偶联物)，检测线4-2包被有氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物(氟喹诺酮类药物半抗原-卵清蛋白偶联物)，质控线5包被有羊抗鼠抗抗体；
所述底板为PVC底板；所述样品吸收垫为吸滤纸；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。
二、微孔试剂(图3)
所述微孔试剂8上冻干有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物和氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物；所述微孔试剂具有微孔塞9。
将上述试纸与微孔试剂组装成试纸条，在2～8℃环境中保存，有效期12个月。
实施例2实施例1中所述试纸条的制备方法
一、试纸条的制备
该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：
1)制备冻干有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物和氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；
2)制备具有分别包被有磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物和氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物的两条检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；
4)将1)和3)制备好的冻干有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物和氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。
下面分步详细叙述：
(一)各部件的制备
1.磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定
磺胺类药物是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。
(1)磺胺类药物半抗原的合成
2-氨基-3-吡啶甲醛0.48g和三乙胺2ml溶入10ml二氯甲烷中，加入适量催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)。室温下缓慢滴入4-乙酰氨基苯磺酰氯的2ml二氯甲烷溶液，滴加完毕后继续反应5h，蒸除溶剂，柱层析纯化后，加入2mol/L NaOH水溶液80ml，加热回流10h，乙酸乙酯萃取，柱层析纯化后得到磺胺类药物半抗原醛基磺胺吡啶。
(2)免疫原的制备——磺胺类药物半抗原与牛血清白蛋白偶联物合成
取磺胺类药物半抗原23mg用3ml二甲基甲酰胺(DMF)溶解完全，制成溶液Ⅰ；取牛血清白蛋白(BSA)100mg用7ml 0.1mol/L PBS(pH7.0)溶解完全，制成溶液Ⅱ；将溶液Ⅰ加入溶液Ⅱ中，室温反应24h后，用0.01mol/L PBS透析三天，每天换液三次，得免疫原。
(3)包被原的制备——磺胺类药物半抗原与卵清蛋白偶联物合成
取磺胺类药物半抗原23mg用3ml DMF溶解完全，制成溶液Ⅰ；取卵清蛋白(OVA)100mg用7ml 0.1mol/L PBS(pH7.0)溶解完全，制成溶液Ⅱ；将溶液Ⅰ加入溶液Ⅱ中，室温反应24h后，用0.01mol/L PBS透析三天，每天换液三次，得包被原。
(4)磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定
将磺胺类药物半抗原、载体蛋白、磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200～800nm范围内扫描，得到磺胺类药物半抗原、载体蛋白、磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明磺胺类药物半抗原与载体蛋白偶联成功。
2.氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定
氟喹诺酮类药物是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。
(1)氟喹诺酮类药物半抗原的合成
将诺氟沙星0.64g溶于20ml三氯甲烷中，加入二环己基碳二亚胺(DCC)0.82g、适量催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)和1,3-丙二胺0.30g，室温反应10h，过滤，将液相水洗，无水Na2SO4干燥，除去溶剂后柱层析纯化得到氟喹诺酮类药物半抗原丙二胺单诺氟沙星酰胺化衍生物。
(2)免疫原的制备——氟喹诺酮类药物半抗原与牛血清白蛋白偶联物合成
取氟喹诺酮类药物半抗原23mg用2ml DMF溶解完全，制成溶液Ⅰ；取BSA100mg用7ml 0.1mol/L PBS(pH7.0)溶解完全，制成溶液Ⅱ；将溶液Ⅰ加入溶液Ⅱ中制成溶液Ⅲ；取碳化二亚胺(EDC)100mg用1ml水溶解后缓慢加入溶液Ⅲ中，室温搅拌2h；用0.01mol/L PBS透析三天，每天换液三次，得免疫原。
(3)包被原的制备——氟喹诺酮类药物半抗原与卵清蛋白偶联物合成
取氟喹诺酮类药物半抗原23mg用2ml DMF溶解完全，制成溶液Ⅰ；取OVA 100mg用7ml 0.1mol/L PBS(pH7.0)溶解完全，制成溶液Ⅱ；将溶液Ⅰ加入溶液Ⅱ中制成溶液Ⅲ；取EDC 100mg用1ml水溶解后缓慢加入溶液Ⅲ中，室温搅拌2h；用0.01mol/L PBS透析三天，每天换液三次，得包被原。
(4)氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定
将氟喹诺酮类药物半抗原、载体蛋白、氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200～800nm范围内扫描，得到氟喹诺酮类药物半抗原、载体蛋白、氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明氟喹诺酮类药物半抗原与载体蛋白偶联成功。
3.单克隆抗体的制备
(1)动物免疫
将步骤1和2得到的两种免疫原分别注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。
(2)细胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
(3)细胞冻存和复苏
将杂交瘤细胞用冻存液制成1×106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
(4)单克隆抗体的制备与纯化
增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。
所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的质量分数为20％，碳酸氢钠在细胞培养基中的质量分数为0.2％；所述细胞培养基的pH为7.4。
4.羊抗鼠抗抗体的制备
以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
5.单克隆抗体-胶体金标记物的制备
(1)胶体金的制备
用双蒸去离子水将质量分数为1％的氯金酸稀释成0.01％，取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml质量分数为1％的柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。
(2)单克隆抗体-胶体金标记物的制备
在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入20～50μg的标准向胶体金溶液中分别加入上述磺胺类药物单克隆抗体和氟喹诺酮类药物单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置10min，加入10％牛血清白蛋白，使其在胶体金溶液中的体积分数为1％，静置10min。12000r/min，4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。
复溶缓冲液：含牛血清白蛋白的体积分数为0.1％～0.3％、吐温-80的质量分数为0.05％～0.2％、pH为7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
6.将单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上
向微孔试剂微孔板中加入50μl磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物和50μl氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50℃条件下，预冻3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到冻干有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物和氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，密封保存。
7.样品吸收垫的制备
将样品吸收垫置于体积分数为0.5％牛血清白蛋白、pH为7.2的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h备用。
8.反应膜的制备
包被过程：用磷酸缓冲液将磺胺类药物半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到1mg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T1)，包被量为1.0μl/cm；用磷酸缓冲液将氟喹诺酮类药物半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到1mg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T2)，包被量为1.0μl/cm；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C)，包被量为1.0μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。
(二)各部件的组装
1.试纸的组装
将所述样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次按顺序粘贴在所述底板上；样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；在组装好的试纸上粘贴保护膜，保护膜上印有MAX标记线的一端粘贴在样品吸收垫上。
2.试纸条的组装
将上述步骤1得到的试纸与微孔试剂组装成试纸条，在2～8℃的环境中贮存，有效期12个月。
实施例3牛奶中磺胺类药物和氟喹诺酮类药物的检测
1.用试纸条检测
从原包装(若低温存放需要预先平衡至室温)中取出所需数目的微孔试剂和试纸，并做好标记；用微量移液器吸取200μl待检牛奶溶液于微孔中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀；将标记好的试纸插入微孔中——印有“MAX”线端朝下，使之充分浸入溶液中；室温(20-25℃)孵育5min，取出试纸，判定结果。
3.检测结果分析
阴性：当质控线(C)显示出红色条带，检测线(T1)和检测线(T2)同时也都显示出红色条带，判为阴性，如图4a所示；
磺胺类药物阳性：当质控线(C)和检测线(T2)显示出红色条带，而检测线(T1)不显色时，判为磺胺类药物阳性，如图4b所示；
氟喹诺酮类药物阳性：当质控线(C)和检测线(T1)显示出红色条带，而检测线(T2)不显色时，判为氟喹诺酮类药物阳性，如图4c所示；
磺胺类药物和氟喹诺酮类药物均阳性：当质控线(C)显示出红色条带，而检测线(T1)和检测线(T2)都不显色时，判为磺胺类药物和氟喹诺酮类药物均阳性，如图4d所示；
无效：当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T1)和检测线(T2)显示出红色条带与否，该试纸均判为无效，如图4e1、4e2、4e3、4e4所示。
实施例4试纸条技术参数的确定
1.检测限试验
将磺胺类药物和氟喹诺酮类药物稀释成如下不同浓度：磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑0、40、80、160μg/L；磺胺甲氧哒嗪、磺胺多辛(周效磺胺)、磺胺嘧啶0、35、70、140μg/L；磺胺苯酰、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶0、25、50、100μg/L；磺胺氯哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶0、15、30、60μg/L；磺胺二甲基嘧啶0、10、20、40μg/L；磺胺异噁唑0、5、10、20μg/L；恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氟甲喹、培氟沙星、达氟沙星(单诺沙星)0、10、20、40μg/L；氧氟沙星0、15、30、60μg/L；依诺沙星、噁喹酸0、20、40、80μg/L；所用稀释液为pH7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。
用试纸条进行检测，结果为：当磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑标准品浓度为0、40μg/L，磺胺甲氧哒嗪、磺胺多辛(周效磺胺)、磺胺嘧啶标准品浓度为0、35μg/L，磺胺苯酰、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶标准品浓度为0、25μg/L，磺胺氯哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶标准品浓度为0、15μg/L，磺胺二甲基嘧啶标准品浓度为0、10μg/L，磺胺异噁唑标准品浓度为0、5μg/L，恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氟甲喹、培氟沙星、达氟沙星(单诺沙星)标准品浓度为0、10μg/L，氧氟沙星标准品浓度为0、15μg/L，依诺沙星、噁喹酸标准品浓度为0、20μg/L时，试纸上显示出肉眼可见的三条红色条带，呈阴性；当磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑标准品浓度为80、160μg/L，磺胺甲氧哒嗪、磺胺多辛(周效磺胺)、磺胺嘧啶标准品浓度为70、140μg/L，磺胺苯酰、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶标准品浓度为50、100μg/L，磺胺氯哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶标准品浓度为30、60μg/L，磺胺二甲基嘧啶标准品浓度为20、40μg/L，磺胺异噁唑标准品浓度为10、20μg/L时，试纸质控线(C)和检测线(T2)显色，检测线(T1)不显色，呈磺胺类药物阳性；当恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氟甲喹、培氟沙星、达氟沙星(单诺沙星)标准品浓度为20、40μg/L，氧氟沙星标准品浓度为30、60μg/L，依诺沙星、噁喹酸标准品浓度为40、80μg/L时，试纸质控线(C)和检测线(T1)显色，检测线(T2)不显色，呈氟喹诺酮类药物阳性。表明本试纸条对磺胺类药物的灵敏度分别为：磺胺喹噁啉80μg/L、磺胺甲噁唑80μg/L、磺胺甲氧哒嗪70μg/L、磺胺多辛(周效磺胺)70μg/L、磺胺嘧啶70μg/L、磺胺苯酰50μg/L、磺胺间甲氧嘧啶50μg/L、磺胺间二甲氧嘧啶50μg/L、磺胺氯哒嗪30μg/L、磺胺对甲氧嘧啶30μg/L、磺胺二甲基嘧啶20μg/L、磺胺异噁唑10μg/L；对氟喹诺酮类药物的灵敏度分别为：恩诺沙星20μg/L、沙拉沙星20μg/L、双氟沙星20μg/L、氧氟沙星30μg/L、诺氟沙星20μg/L、环丙沙星20μg/L、氟甲喹20μg/L、培氟沙星20μg/L、依诺沙星40μg/L、噁喹酸40μg/L、达氟沙星(单诺沙星)20μg/L。
2.假阳性率、假阴性率试验
取经过LC-MS/MS确证的不含磺胺类药物和氟喹诺酮类药物的空白牛奶样本50份，用3个批次的试纸条分别进行检测，结果发现试纸上均显示出肉眼可见的三条红色条带，呈阴性，表明本发明的试纸条阴性符合率为100％，假阳性率为0。
取经过LC-MS/MS确证的不含磺胺类药物和氟喹诺酮类药物的空白牛奶样本60份，向其中分别添加磺胺类药物至终浓度为磺胺喹噁啉80μg/L、磺胺甲噁唑80μg/L、磺胺甲氧哒嗪70μg/L、磺胺多辛(周效磺胺)70μg/L、磺胺嘧啶70μg/L、磺胺苯酰50μg/L、磺胺间甲氧嘧啶50μg/L、磺胺间二甲氧嘧啶50μg/L、磺胺氯哒嗪30μg/L、磺胺对甲氧嘧啶30μg/L、磺胺二甲基嘧啶20μg/L、磺胺异噁唑10μg/L，每种药物添加5份样品，用3个批次的试纸条分别进行检测，结果发现试纸上均显示为质控线(C)和检测线(T2)显色，检测线(T1)不显色，呈磺胺类药物阳性；取经过LC-MS/MS确证的不含磺胺类药物和氟喹诺酮类药物的空白牛奶样本55份，向其中分别添加氟喹诺酮类药物至终浓度为恩诺沙星20μg/L、沙拉沙星20μg/L、双氟沙星20μg/L、氧氟沙星30μg/L、诺氟沙星20μg/L、环丙沙星20μg/L、氟甲喹20μg/L、培氟沙星20μg/L、依诺沙星40μg/L、噁喹酸40μg/L、达氟沙星(单诺沙星)20μg/L，每种药物添加5份样品，用3个批次的试纸条分别进行检测，结果发现试纸上均显示为质控线(C)和检测线(T1)显色，检测线(T2)不显色，呈氟喹诺酮类药物阳性。表明本发明的试纸条阳性符合率为100％，假阴性率为0。
3.特异性试验
特异性是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。将氯霉素、林可霉素、链霉素等药物用pH7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液进行稀释，用实施例1中所述的试纸条进行检测。结果显示，用该试纸条检测500μg/L氯霉素、林可霉素、链霉素等药物时，试纸质控线和两条检测线均显色，说明本试纸条对这些药物无交叉反应。

Claims (7)

1.一种检测磺胺类药物和氟喹诺酮类药物的试纸条，其特征在于包括试纸和微孔试剂，所述试纸包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板，所述反应膜上有两条检测线和一条质控线，两条检测线上分别包被有磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物和氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物，质控线上包被有羊抗鼠抗抗体，所述微孔试剂中冻干有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物和氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物；
其中，所述磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物由磺胺类药物半抗原与载体蛋白偶联得到，所述氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物由氟喹诺酮类药物半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白；
所述磺胺类药物半抗原的合成方法为：2-氨基-3-吡啶甲醛0.48g和三乙胺2ml溶入10ml二氯甲烷中，加入适量催化剂4-二甲氨基吡啶，室温下缓慢滴入4-乙酰氨基苯磺酰氯的2ml二氯甲烷溶液，滴加完毕后继续反应5h，蒸除溶剂，柱层析纯化后，加入2mol/L NaOH水溶液80ml，加热回流10h，乙酸乙酯萃取，柱层析纯化后得到磺胺类药物半抗原醛基磺胺吡啶；
所述氟喹诺酮类药物半抗原的合成方法为：将诺氟沙星0.64g溶于20ml三氯甲烷中，加入二环己基碳二亚胺0.82g、适量催化剂4-二甲氨基吡啶和1,3-丙二胺0.30g，室温反应10h，过滤，将液相水洗，无水Na2SO4干燥，除去溶剂后柱层析纯化得到氟喹诺酮类药物半抗原丙二胺单诺氟沙星酰胺化衍生物。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述微孔试剂上具有微孔塞。
3.根据权利要求1-2任一项所述的试纸条，其特征在于所述样品吸收垫上粘贴有保护膜，为检测端，所述保护膜上面有MAX标记线。
4.根据权利要求3所述的试纸条，其特征在于所述检测线位于近于有MAX标记的保护膜的一端，所述质控线位于远离有MAX标记的保护膜的一端。
5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物中的磺胺类药物单克隆抗体是以磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物中的氟喹诺酮类药物单克隆抗体是以氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。
6.一种制备权利要求1-5任一项所述试纸条的方法，其包括步骤：
1)制备冻干有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物和氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；
2)制备具有分别包被有磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物和氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物的两条检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；
4)将1)和3)制备好的冻干有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物和氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。
7.一种同时检测牛奶样本中磺胺类药物和氟喹诺酮类药物残留的方法，其包括步骤：
1)用权利要求1-5任一项所述的试纸条进行检测；
2)分析检测结果。
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