CN108761081A - 一种同时检测磺胺喹噁啉和诺氟沙星的免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents

一种同时检测磺胺喹噁啉和诺氟沙星的免疫层析试纸条及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种同时检测磺胺喹噁啉和诺氟沙星两种兽药多残留免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背板，其特征在于，在PVC背板上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，其中结合垫一半覆盖在硝酸纤维素膜上，样品垫部分覆盖于结合垫上，吸水垫部分覆盖于硝酸纤维素膜上；所述的硝酸纤维素膜上平行设置一条质控线和两条检测线。本发明还公开了这种基于两种可视化颜色试纸条的制备方法。本发明具有以下突出的优点：本发明的检测磺胺喹噁啉和诺氟沙星兽药多残留免疫层析试纸条是利用抗原抗体的特异性反应实现的，因此特异性高，灵敏度好。

Description

一种同时检测磺胺喹噁啉和诺氟沙星的免疫层析试纸条及其 制备方法
技术领域
本发明涉及一种快速检测动物源性食品中磺胺喹噁啉和诺氟沙星两种兽药多残留的免疫层析试纸条方法，特别是两种可视化颜色标记物在同一试纸条上同时检测磺胺喹噁啉和诺氟沙星兽药多残留免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术
磺胺类药物是最早的合成抗生素。对氨基苯磺酰胺是磺胺类药物的经典基本结构，对其进行修饰显示出良好活性，衍生物也属于磺胺类药物，对R、R’不同取代官能团就是不同的新型磺胺药物。磺胺类药物可以抑制叶酸的合成，从而抑制核酸的合成，最终达到抑制细菌繁殖的目的。磺胺类药物的广泛应用及其周期长等特点导致其容易残留于动源性食品中，食品安全问题越来越受到广泛关注。喹诺酮类药物是以1,4-二氢-4-氧吡啶-3-羧酸为基本母环结构的化合物，是从萘啶酸或吡酮酸演化而来的人工合成抗菌药物，也是人类在合成抗生素方面的重要突破，因其对革兰氏阴性菌、支原体和一些革兰氏阳性菌具有超强的杀菌作用并且具有抗菌谱广、口服吸收快、血液浓度高等特点而得到迅速推广，其被广泛应用于家畜的疾病预防与治疗。
动物源性食品的兽药残留问题成为全世界关注的重点，对于兽药残留检测技术提出了新的要求。免疫层析分析方法具有高灵敏度、高特异性、操作简便、检测时间短、成本低等优点，适用于大量样品的快速现场检测，近年来在兽药残留检测领域得到了快速的发展。乳胶微球是工业化生产的高分子微球，颗粒大小均一，在液体中形成稳定的乳液体系。乳胶微球作为免疫层析技术的标记材料，经羧基化后，可与抗体的氨基共价结合形成的乳胶微球与抗体的结合物，胶体碳作为标记物具有良好的稳定性、价格低廉、易于制备、黑色信号与白色的背景层析膜强烈对比而显示出的高灵敏性以及还可定量分析等优点，具有广泛的应用前景。
常见的免疫层析试纸条大多是检测一种物质，同时检测两种物质的较少，仅有的多残留检测也存在检测灵敏度低，检测不准确等问题；同时检测磺胺喹噁啉和诺氟沙星两种兽药的免疫层析试纸条目前没有报道，这类试纸条的开发大大缩短动源性食品检测的时间，提高了检测效率。
发明内容
有鉴于此，本发明创造旨在提出一种基于两种可视化颜色标记物在同一试纸条上同时检测磺胺喹噁啉和诺氟沙星多残留免疫层析试纸条方法。
为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
一种同时检测两种项目的免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背板，在PVC背板上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，其中结合垫一半覆盖在硝酸纤维素膜上，样品垫部分覆盖于结合垫上，吸水垫部分覆盖于硝酸纤维素膜上；所述的硝酸纤维素膜平行设置一条质控线和两条检测线。
优选的，所述的硝酸纤维素膜上分别包被有羊抗鼠二抗构成的质控线和磺胺喹噁啉抗原和诺氟沙星抗原构成的检测线a和检测线b。
一种同时检测磺胺喹噁啉和诺氟沙星免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：
(1)磺胺喹噁啉抗血清和诺氟沙星抗血清纯化，得到磺胺喹噁啉单克隆抗体和诺氟沙星单克隆抗体；
(2)分别采用活化脂法制备磺胺喹噁啉抗原和诺氟沙星抗原；
(3)采用硼酸盐缓冲溶液配制胶体碳；
(4)将步骤(1)纯化的抗体15μg和10μg分别加入到步骤(3)制备的300μL胶体碳和200μL蓝色乳胶微球中，制备抗体-胶体碳标记物和抗体-蓝色乳胶微球标记物；蓝色乳胶微球粒径190纳米。
(5)将步骤(2)制备的磺胺喹噁啉抗原和诺氟沙星抗原分别稀释80倍和50倍包被在硝酸纤维素膜上构成检测线a和检测线b，并将羊抗兔二抗稀释100倍包被于硝酸纤维素膜上构成质控线；
(6)在PVC背板上按顺序依次粘附样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，得到所述的检测磺胺喹噁啉和诺氟沙星的试纸条；
蓝色乳胶微球选粒径时，是选择较大粒径，容易显色；标记的抗体少，提高灵敏度。但是粒径也不能太大，要考虑微球层析时的速度；还要考虑硝酸纤维素膜的孔径大小。综合考虑之后选择了190纳米的微球。
本发明纯化了磺胺喹噁啉抗血清和诺氟沙星抗血清，得到了磺胺喹噁啉单克隆抗体和诺氟沙星单克隆抗体，备用。制备磺胺喹噁啉抗原和诺氟沙星抗原作为检测线的包被抗原，采用羊抗鼠二抗作为质控线的捕获抗体。利用竞争法来检测磺胺喹噁啉和诺氟沙星，根据检测线条带的深浅判断待测样品中是否含有磺胺喹噁啉和诺氟沙星。若质控线条带无颜色，则该试纸条失效。
与现有国内外检测方法相比，本发明具有以下突出的优点：1、本发明的检测磺胺喹噁啉和诺氟沙星多残留免疫层析试纸条是利用抗原抗体的特异性反应实现的，因此特异性高，灵敏度好。2、本发明的检测试纸条检测时间快速(10分钟)且不需要任何特殊仪器、设备，检测成本低。3、本发明的检测试纸条操作简便，不需由专业人员操作。4、检测时胶体碳标记磺胺喹噁啉抗体，在试纸条表现为黑色条带，代表磺胺喹噁啉的检测，蓝色乳胶微球标记诺氟沙星抗体，在试纸条表现为蓝色条带，显示的是诺氟沙星的检测，黑色条带和蓝色条带对比明显，使检测结果更加直观。
附图说明
图1本发明试纸条结构示意图
1样品垫、2结合垫、3硝酸纤维素膜、4吸水垫
5检测线a、6检测线b、7质控线、8PVC板
具体实施方式
实施例一
一种同时检测磺胺喹噁啉和诺氟沙星多残留免疫层析纸条的制备方法
1、胶体碳的制备：
将炭黑分散到硼酸盐缓冲溶液中，超声20min，得到分散均匀的胶体溶液，且其浓度为0.5mg/mL。
2、抗体-标记物结合物的制备
磺胺喹噁啉抗体—胶体碳标记物的制备：
用硼酸盐缓冲溶液将诺氟沙星抗体稀释至0.5mg/mL；在缓慢搅拌条件下将抗体加入到胶体碳溶液中，然后于4℃冰箱内缓慢搅拌过夜；用缓冲液14000r/min，10℃，30min洗涤碳标抗体3次，最后沉淀用缓冲液重悬至最初体积，并控制抗体的浓度在250μg/mL与100μg/mL之间，4℃保存备用；使用前再用硼酸盐缓冲液进行稀释。
诺氟沙星抗体-蓝色乳胶微球标记物的制备：
用pH5.5mes缓冲液洗涤50mg/mL的粒径190纳米的蓝色乳胶微球，重复2次，于14000r/min，4℃，离心15min；将沉淀用mes缓冲液稀释至1mg/mL，4℃保存备用；取200μL1mg/mL蓝色乳胶微球，加入4μL0.5mg/mL的EDC与NHS，在摇床反应15min；用磷酸盐缓冲液洗涤已活化乳胶微球，重复2次，于14000r/min，4℃，离心15min，将沉淀用磷酸盐缓冲液稀释至1mg/mL，4℃保存备用；在搅拌速度150rpm条件下将诺氟沙星抗体加入到上述蓝色乳胶微球溶液中，在室温下，于摇床反应1h，得蓝色乳胶微球标记抗体；加入4μL 20％BSA封闭15min；于14000r/min，4℃，离心15min；将最终沉淀用工作液重悬至40μL，4℃保存备用。
3、硝酸纤维素膜的包被
用上海金标的双维平面划膜仪将制备的磺胺喹噁啉抗原和诺氟沙星抗原分别稀释80倍和50倍包被于硝酸纤维素膜上作为检测线a、检测线b，包被量为0.8μL/cm；将购买的羊抗鼠二抗稀释100倍包被于硝酸纤维素膜上作为质控线，包被量为0.8μL/cm，37℃烘干。
4、试纸条的组装
本发明的试纸条组成如下：样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4和PVC板8，在PVC板8上按顺序依次粘附有样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4，其中结合垫一半覆盖在硝酸纤维素膜上，样品垫部分覆盖于结合垫上，吸水纸部分覆盖于硝酸纤维素膜上；所述的硝酸纤维素膜3上分别包被有磺胺喹噁啉抗原和诺氟沙星抗原构成的检测线a、检测线b和羊抗鼠二抗构成的质控线7。
5、灵敏度试验
用PBS作为稀释液使混合标准品中磺胺喹噁啉的浓度为0、2、5、10μgL-1，诺氟沙星的浓度为0、1、2、5μgL-1，取稀释后的胶体碳标记的磺胺喹噁啉抗体与混合标准品溶液，取稀释后的蓝色乳胶微球标记的诺氟沙星抗体与混合标准品溶液，混合均匀后滴加到加样孔中，以每种标准品使其检测线与空白对照检测线颜色有明显差别的最小浓度作为检测限。经过多次重复实验，当混合标准品中磺胺喹噁啉的浓度为5μgL-1，诺氟沙星的浓度为2μgL-1时，检测线与空白对照检测线颜色有明显差别，和单个标记试纸条检测线一样，并且两种包被原的划线顺序对试纸条的检测结果并没有影响，定义多残留检测磺胺喹噁啉和诺氟沙星的免疫层析试纸条的检测限为5μgL-1、2μgL-1。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种同时检测磺胺喹噁啉和诺氟沙星的免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背板，其特征在于，在PVC背板上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，其中结合垫一半覆盖在硝酸纤维素膜上，样品垫部分覆盖于结合垫上，吸水垫部分覆盖于硝酸纤维素膜上；所述的硝酸纤维素膜上平行设置一条质控线和两条检测线。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测磺胺喹噁啉和诺氟沙星的免疫层析试纸条，其特征在于，所述的上样液中有抗体-胶体碳标记物和抗体-蓝色乳胶微球标记物；所述的硝酸纤维素膜上分别包被有羊抗兔二抗构成的质控线，磺胺喹噁啉抗原构成的检测线a和诺氟沙星抗原构成的检测线b。
3.权利要求2所述一种同时检测磺胺喹噁啉和诺氟沙星的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)磺胺喹噁啉抗血清和诺氟沙星抗血清纯化，得到磺胺喹噁啉单克隆抗体和诺氟沙星单克隆抗体；
(2)采用活化脂法制备磺胺喹噁啉抗原和诺氟沙星抗原；
(3)采用硼酸盐缓冲溶液配制胶体碳；
(4)将步骤(1)纯化的磺胺喹噁啉单克隆抗体15μg和诺氟沙星单克隆10μg分别加入到步骤(3)制备的300μL胶体碳和200μL粒径适当的羧基化蓝色乳胶微球中，制备抗体-胶体碳标记物和抗体-蓝色乳胶微球标记物；
(5)将步骤(2)制备的磺胺喹噁啉抗原和诺氟沙星抗原分别稀释80倍和50倍包被在硝酸纤维素膜上构成检测线a和检测线b，并将羊抗兔二抗稀释100倍包被于硝酸纤维素膜上构成质控线；
(6)在PVC背板上按顺序依次粘附样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，得到所述的检测磺胺喹噁啉和诺氟沙星免疫层析试纸条；
(7)将磺胺喹噁啉和诺氟沙星混合配制成一系列梯度的混标溶液，取稀释后的胶体碳标记的抗体、蓝色乳胶微球标记抗体与混标溶液，混合均匀后滴加到加样孔中，10min后观察结果。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述羧基化蓝色乳胶微球的粒径是190纳米。
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