CN103105492A - 一种荧光免疫层析流感病毒检测试纸 - Google Patents

一种荧光免疫层析流感病毒检测试纸 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荧光免疫层析流感病毒检测试纸，包括PVC底板(1)，在PVC底板(1)上表面铺有结合垫(3)，在结合垫(3)的左边设置加样孔(2)，右边依次粘贴硝酸纤维膜(4)和吸水垫(9)，所述硝酸纤维膜(4)上从左到右依次设有线状或带状的三条检测抗体检测线和β-肌动蛋白检测抗体控制线(8)，其特征在于：所述结合垫(3)由玻璃纤维膜组成，在玻璃纤维膜上均匀附着有红色、绿色和橙色的荧光素颗粒，其中红色荧光素颗粒上分别偶联三种抗目的物检测抗体，绿色荧光素颗粒上偶联AMACR抗原，橙色荧光素颗粒上偶联抗β-肌动蛋白抗体作为内参。本产品价格便宜、材料易得，灵敏度和特异性在95％以上。

Description

一种荧光免疫层析流感病毒检测试纸
技术领域
本发明涉及一种荧光免疫层析流感病毒检测试纸。
背景技术
快速早期诊断各种病毒感染，对于早期预防和治疗急性传染病非常重要。目前国内外对于病毒感染的早期诊断还没有一种有效和快速的方法，用分子生物学的方法，包括EILSA方法，影像学诊断等等，均没有达到快速诊断的目的，所以现在国内和国际上急需开发出一种高效的和快速的方法诊断各种病毒感染。
另外，目前的检测试纸主要由PVC底板、加样孔、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫组成，在硝酸纤维膜上仅点有带状或线状的1条目的物检测抗体，只能用于检测一种病毒，检测效率低，不适合快速检测多种病毒。
发明人早期开发了一种纳米流感病毒检测试纸，能同时检测三种病毒，但其中的纳米胶体金复合微粒材料难得，价格昂贵。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种材料易得，价格便宜，灵敏度高的荧光免疫层析流感病毒检测试纸，可以同时检测三种流感病毒。
本发明的技术方案如下：一种荧光免疫层析流感病毒检测试纸，包括PVC底板(1)，在PVC底板(1)上表面铺有结合垫(3)，在结合垫(3)的左边设置加样孔(2)，右边依次粘贴硝酸纤维膜(4)和吸水垫(9)，所述硝酸纤维膜(4)上从左到右依次设有线状或带状的三条检测抗体检测线和β-肌动蛋白检测抗体控制线(8)，其特征在于：所述结合垫(3)由玻璃纤维膜组成，在玻璃纤维膜上均匀附着有红色、绿色和橙色的荧光素颗粒，其中红色荧光素颗粒上分别偶联三种抗目的物检测抗体，绿色荧光素颗粒上偶联AMACR抗原，橙色荧光素颗粒上偶联抗β-肌动蛋白抗体作为内参。
采用上述技术方案，使用荧光免疫层析复合荧光素颗粒为载体偶联不同抗体，可同时检测3种病毒，建立一个多价生物标志物分子检测系统，材料易得，价格便宜，在灵敏度和特异性上也有很大的提高，利用复合荧光素颗粒将定位沉积部位进行显色加强，提高了反应灵敏、点样简便、试纸保存期长，适用于基层，实验室及现场检测，利用本发明检测流感病毒的灵敏度为96.8％以上，特异性为95.6％以上。比发明人早期开发了一种纳米流感病毒检测试纸灵敏度提高10-20倍。
在上述技术方案中：所述荧光素颗粒选自异硫氰酸荧光素或四甲基异硫氰酸罗丹明或四乙基罗丹明。
在上述技术方案中：所述三条检测抗体检测线为普通流感病毒检测抗体检测线(5)、禽流感病毒检测抗体检测线(6)、甲型流感病毒检测抗体检测线(7)，所述三种抗目的物抗体为普通流感病毒检测抗体、禽流感病毒检测抗体和甲型流感病毒检测抗体。
在上述技术方案中：所述PVC底板(1)为长为10cm、宽为4cm的矩形聚乙烯塑料片，所述硝酸纤维膜(4)为长为8cm、宽为3cm、厚度为0.1mm、平均孔径为5um的微多孔硝酸纤维素膜片。
在上述技术方案中：三条抗体检测线按照如下方法制得：用磷酸盐缓冲液分别稀释3种流感病毒的多克隆抗体，即普通流感病毒多克隆抗体、禽流感病毒多克隆抗体和甲型流感病毒多克隆抗体，使溶液中多克隆抗体重量百分比浓度为0.05-0.3mg/ml，制得普通流感病毒多克隆抗体溶液、禽流感病毒多克隆抗体溶液和甲型流感病毒多克隆抗体溶液；然后用点膜器将上述普通流感病毒多克隆抗体溶液、禽流感病毒多克隆抗体溶液和甲型流感病毒多克隆抗体溶液以3μL/cm分别在硝酸纤维膜(4)上依次点成线状或带状的普通流感病毒检测抗体检测线(5)、禽流感病毒检测抗体检测线(6)和甲型流感病毒检测抗体检测线(7)。
在上述技术方案中：所述结合垫(3)按照如下步骤制得：
1)荧光素颗粒的表面硅化：分别在5-10ml乙醇中，加入0.1-10mg红、绿、橙三种颜色的荧光素颗粒、1-10uL N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷，在15-50℃恒温搅拌3-10小时，再依次加入0.1-10mL水、0.1-10mL15％wt氨水、0.1-10mL正硅酸乙酯(TEOS)，继续反应3-10小时，然后用乙醇洗涤获得红、绿、橙三种颜色的表面硅化的荧光素颗粒；
2)荧光素颗粒的表面氨基化：取上述表面硅化的荧光素颗粒，加入10-50mL1：3-3：1(VN)甲醇和丙三醇组成的混合溶液，超声分散，然后加入10-500uL N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷，在15-50℃恒温搅拌5-10小时，用乙醇洗涤，干燥，获得表面氨基化的荧光素颗粒；
3)荧光素颗粒表面连接抗体：将上述表面氨基化的红色荧光素颗粒分散在5-10ml磷酸缓冲液中，加入5-10ml戊二醛反应2-5小时，离心除去戊二醛，将红色荧光素颗粒重新分散在5-10ml磷酸缓冲液中，加入普通流感病毒检测抗体、禽流感病毒检测抗体和甲型流感病毒检测抗体，使得各种抗体的浓度分别为100ug/ml，室温搅拌反应1-5小时，用磷酸缓冲液洗涤后获得荧光素颗粒-抗体复合物，然后将荧光素颗粒-抗体复合物保存在含0.1％BSA和0.1％Tween20的磷酸缓冲液中；
将上述表面氨基化的绿色荧光素颗粒分散在5-10ml磷酸缓冲液中，加入5-10ml戊二醛反应2-5小时，离心除去戊二醛，将绿色荧光素颗粒重新分散在5-10ml磷酸缓冲液中，加入AMACR抗原，使得AMACR抗原浓度为100ug/ml，室温搅拌反应1-5小时，用磷酸缓冲液洗涤后获得荧光素颗粒-AMACR抗原复合物，然后将荧光素颗粒-AMACR抗原复合物保存在含0.1％BSA和0.1％Tween20的磷酸缓冲液中；
将上述表面氨基化的橙色荧光素颗粒分散在5-10ml磷酸缓冲液中，加入5-10ml戊二醛反应2-5小时，离心除去戊二醛，将橙色荧光素颗粒重新分散在5-10ml磷酸缓冲液中，加入β-肌动蛋白抗体，使得β-肌动蛋白抗体浓度为100ug/ml，室温搅拌反应1-5小时，用磷酸缓冲液洗涤后获得荧光素颗粒-β-肌动蛋白抗体复合物，然后将荧光素颗粒-β-肌动蛋白抗体复合物保存在含0.1％BSA和0.1％Tween20的磷酸缓冲液中；
最后将红、绿橙三种复合荧光素颗粒表面没有完全反应的活化基团进行封闭，以降低在以后试验中可能发生的非特异性吸附；再将红、绿橙三种复合荧光素颗粒重悬在保护液中，制成浓度为2mg/ml的微球溶液进行保存，其中保存液为pH9.0，含0.05％Tween-20，0.1％NaN3和0.1％BSA的0.005M硼酸盐缓冲液；最后将红，绿和橙三种复合荧光素颗粒等质量混合制成一种红绿橙三色混合免疫复合荧光素颗粒；用移液枪将10-40微升，浓度为为2mg/ml的复合荧光素颗粒滴在玻璃纤维膜上，然后干燥得到结合垫(3)。
有益效果：本产品具有高效，快速，便宜，便利，容易使用，价格便宜、材料易得，便于运输及保存，无毒性，可在同一个试纸上同时快速诊断三种病毒等优点，因此具有较强的竞争优势。与现有的技术相比，这种试纸的灵敏度和特异性在95％以上。
附图说明
图1为本发明的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
本发明中：BSA为bovine serum albumin的缩写，即牛血清白蛋白。
AMACR抗原为α-甲基酰基辅酶A消旋酶抗原的缩写。
Tween为吐温溶液。
PVC为聚氯乙烯的缩写。
实施例1：如图1所示，本发明由PVC底板1、加样孔2、结合垫3、硝酸纤维膜4和吸水垫9组成，在PVC底板1上铺有结合垫3，在结合垫3的左边设置加样孔2，右边依次粘贴硝酸纤维膜4和吸水垫9；所述PVC底板1为长为10cm、宽为4cm的矩形聚乙烯塑料片，所述硝酸纤维膜4为长为8cm、宽为3cm、厚度为0.1mm、平均孔径为5um的微多孔硝酸纤维素膜片；
所述硝酸纤维膜4上从左到右依次设有线状或带状的三条检测抗体检测线和β-肌动蛋白检测抗体控制线8，所述三条检测抗体检测线为普通流感病毒检测抗体检测线5、禽流感病毒检测抗体检测线6、甲型流感病毒检测抗体检测线7。所述结合垫3由玻璃纤维膜组成，在玻璃纤维膜上均匀附着有红色、绿色和橙色的荧光素颗粒，其中红色荧光素颗粒上分别偶联三种抗目的物检测抗体，绿色荧光素颗粒上偶联AMACR抗原，橙色荧光素颗粒上偶联抗β-肌动蛋白抗体作为内参。所述三种抗目的物抗体为普通流感病毒检测抗体、禽流感病毒检测抗体和甲型流感病毒检测抗体。所述荧光素颗粒为异硫氰酸荧光素。
其中三条抗体检测线的按照如下方法制得：
用磷酸盐缓冲液分别稀释3种流感病毒的多克隆抗体，即普通流感病毒多克隆抗体、禽流感病毒多克隆抗体和甲型流感病毒多克隆抗体，使溶液中多克隆抗体重量百分比浓度为0.05-0.3mg/ml，制得普通流感病毒多克隆抗体溶液、禽流感病毒多克隆抗体溶液和甲型流感病毒多克隆抗体溶液；然后用点膜器将上述普通流感病毒多克隆抗体溶液、禽流感病毒多克隆抗体溶液和甲型流感病毒多克隆抗体溶液以3μL/cm分别在硝酸纤维膜4上依次点成线状或带状的普通流感病毒检测抗体检测线5、禽流感病毒检测抗体检测线6和甲型流感病毒检测抗体检测线7。
所述结合垫3按照如下步骤制得：
1)异硫氰酸荧光素颗粒的表面硅化：分别在5-10ml乙醇中，加入0.1-10mg红、绿、橙三种颜色的异硫氰酸荧光素颗粒、1-10uL N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷，在15-50℃恒温搅拌3-10小时，再依次加入0.1-10mL水、0.1-10mL15％wt氨水、0.1-10mL正硅酸乙酯(TEOS)，继续反应3-10小时，然后用乙醇洗涤获得红、绿、橙三种颜色的表面硅化的异硫氰酸荧光素颗粒；
2)异硫氰酸荧光素颗粒的表面氨基化：取上述表面硅化的异硫氰酸荧光素颗粒，加入10-50mL1：3-3：1(VN)甲醇和丙三醇组成的混合溶液，超声分散，然后加入10-500uL N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷，在15-50℃恒温搅拌5-10小时，用乙醇洗涤，干燥，获得表面氨基化的异硫氰酸荧光素颗粒；
3)异硫氰酸荧光素颗粒表面连接抗体：将上述表面氨基化的红色异硫氰酸荧光素颗粒分散在5-10ml磷酸缓冲液中，加入5-10ml戊二醛反应2-5小时，离心除去戊二醛，将红色异硫氰酸荧光素颗粒重新分散在5-10ml磷酸缓冲液中，加入普通流感病毒检测抗体、禽流感病毒检测抗体和甲型流感病毒检测抗体，使得各种抗体的浓度分别为100ug/ml，室温搅拌反应1-5小时，用磷酸缓冲液洗涤后获得荧光素颗粒-抗体复合物，然后将荧光素颗粒-抗体复合物保存在含0.1％BSA和0.1％Tween20的磷酸缓冲液中；
将上述表面氨基化的绿色异硫氰酸荧光素颗粒分散在5-10ml磷酸缓冲液中，加入5-10ml戊二醛反应2-5小时，离心除去戊二醛，将绿色异硫氰酸荧光素颗粒重新分散在5-10ml磷酸缓冲液中，加入AMACR抗原，使得AMACR抗原浓度为100ug/ml，室温搅拌反应1-5小时，用磷酸缓冲液洗涤后获得荧光素颗粒-AMACR抗原复合物，然后将荧光素颗粒-AMACR抗原复合物保存在含0.1％BSA和0.1％Tween20的磷酸缓冲液中；
将上述表面氨基化的橙色异硫氰酸荧光素颗粒分散在5-10ml磷酸缓冲液中，加入5-10ml戊二醛反应2-5小时，离心除去戊二醛，将橙色异硫氰酸荧光素颗粒重新分散在5-10ml磷酸缓冲液中，加入β-肌动蛋白抗体，使得β-肌动蛋白抗体浓度为100ug/ml，室温搅拌反应1-5小时，用磷酸缓冲液洗涤后获得荧光素颗粒-β-肌动蛋白抗体复合物，然后将荧光素颗粒-β-肌动蛋白抗体复合物保存在含0.1％BSA和0.1％Tween20的磷酸缓冲液中；
最后将红、绿橙三种复合异硫氰酸荧光素颗粒表面没有完全反应的活化基团进行封闭，以降低在以后试验中可能发生的非特异性吸附；再将红、绿橙三种复合异硫氰酸荧光素颗粒重悬在保护液中，制成浓度为2mg/ml的微球溶液进行保存，其中保护液为pH9.0，含0.05％Tween-20，0.1％NaN3和0.1％BSA的0.005M硼酸盐缓冲液；最后将红，绿和橙三种复合异硫氰酸荧光素颗粒等质量混合制成一种红绿橙三色混合免疫复合荧光素颗粒；用移液枪将10-40微升，浓度为2mg/ml的复合荧光素颗粒滴在玻璃纤维膜上，然后干燥得到结合垫(3)。
其中复合荧光素颗粒的封闭为：在复合荧光素颗粒中加入1％-5％的牛血清白蛋白(BSA)，BSA事先溶解在硼酸盐吐温缓冲溶液中，对复合荧光素颗粒表面没有完全反应的活化基团进行封闭，并通过BSA的物理吸附，封闭其他的空间位点，以降低以后实验中可能发生的非特异性吸附，室温下封闭反应30min。
实施例2，其他与实施例1相同，只是将异硫氰酸荧光素颗粒改变成四甲基异硫氰酸罗丹明
实施例3：其他与实施例1相同，只是将异硫氰酸荧光素颗粒改变成四乙基罗丹明。

Claims (6)

1.一种荧光免疫层析流感病毒检测试纸，包括PVC底板(1)，在PVC底板(1)上表面铺有结合垫(3)，在结合垫(3)的左边设置加样孔(2)，右边依次粘贴硝酸纤维膜(4)和吸水垫(9)，所述硝酸纤维膜(4)上从左到右依次设有线状或带状的三条检测抗体检测线和β-肌动蛋白检测抗体控制线(8)，其特征在于：所述结合垫(3)由玻璃纤维膜组成，在玻璃纤维膜上均匀附着有红色、绿色和橙色的荧光素颗粒，其中红色荧光素颗粒上分别偶联三种抗目的物检测抗体，绿色荧光素颗粒上偶联AMACR抗原，橙色荧光素颗粒上偶联抗β-肌动蛋白抗体作为内参。
2.根据权利要求1所述的一种荧光免疫层析流感病毒检测试纸，其特征在于：所述荧光素颗粒选自异硫氰酸荧光素或四甲基异硫氰酸罗丹明或四乙基罗丹明。
3.根据权利要求1或2所述的一种荧光免疫层析流感病毒检测试纸，其特征在于：所述三条检测抗体检测线为普通流感病毒检测抗体检测线(5)、禽流感病毒检测抗体检测线(6)、甲型流感病毒检测抗体检测线(7)，所述三种抗目的物抗体为普通流感病毒检测抗体、禽流感病毒检测抗体和甲型流感病毒检测抗体。
4.根据权利要求3所述的一种荧光免疫层析流感病毒检测试纸，其特征在于：所述PVC底板(1)为长为10cm、宽为4cm的矩形聚乙烯塑料片，所述硝酸纤维膜(4)为长为8cm、宽为3cm、厚度为0.1mm、平均孔径为5um的微多孔硝酸纤维素膜片。
5.根据权利要求3所述的一种荧光免疫层析流感病毒检测试纸，其特征在于：三条抗体检测线按照如下方法制得：
用磷酸盐缓冲液分别稀释3种流感病毒的多克隆抗体，即普通流感病毒多克隆抗体、禽流感病毒多克隆抗体和甲型流感病毒多克隆抗体，使溶液中多克隆抗体重量百分比浓度为0.05-0.3mg/ml，制得普通流感病毒多克隆抗体溶液、禽流感病毒多克隆抗体溶液和甲型流感病毒多克隆抗体溶液；然后用点膜器将上述普通流感病毒多克隆抗体溶液、禽流感病毒多克隆抗体溶液和甲型流感病毒多克隆抗体溶液以3μL/cm分别在硝酸纤维膜(4)上依次点成线状或带状的普通流感病毒检测抗体检测线(5)、禽流感病毒检测抗体检测线(6)和甲型流感病毒检测抗体检测线(7)。
6.根据权利要求3所述的一种荧光免疫层析流感病毒检测试纸，其特征在于：所述结合垫(3)按照如下步骤制得：
1)荧光素颗粒的表面硅化：分别在5-10ml乙醇中，加入0.1-10mg红、绿、橙三种颜色的荧光素颗粒、1-10uL N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷，在15-50℃恒温搅拌3-10小时，再依次加入0.1-10mL水、0.1-10mL15％wt氨水、0.1-10mL正硅酸乙酯(TEOS)，继续反应3-10小时，然后用乙醇洗涤获得红、绿、橙三种颜色的表面硅化的荧光素颗粒；
2)荧光素颗粒的表面氨基化：取上述表面硅化的荧光素颗粒，加入10-50mL1：3-3：1(VN)甲醇和丙三醇组成的混合溶液，超声分散，然后加入10-500uL N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷，在15-50℃恒温搅拌5-10小时，用乙醇洗涤，干燥，获得表面氨基化的荧光素颗粒；
3)荧光素颗粒表面连接抗体：将上述表面氨基化的红色荧光素颗粒分散在5-10ml磷酸缓冲液中，加入5-10ml戊二醛反应2-5小时，离心除去戊二醛，将红色荧光素颗粒重新分散在5-10ml磷酸缓冲液中，加入普通流感病毒检测抗体、禽流感病毒检测抗体和甲型流感病毒检测抗体，使得各种抗体的浓度分别为100ug/ml，室温搅拌反应1-5小时，用磷酸缓冲液洗涤后获得荧光素颗粒-抗体复合物，然后将荧光素颗粒-抗体复合物保存在含0.1％BSA和0.1％Tween20的磷酸缓冲液中；
将上述表面氨基化的绿色荧光素颗粒分散在5-10ml磷酸缓冲液中，加入5-10ml戊二醛反应2-5小时，离心除去戊二醛，将绿色荧光素颗粒重新分散在5-10ml磷酸缓冲液中，加入AMACR抗原，使得AMACR抗原浓度为100ug/ml，室温搅拌反应1-5小时，用磷酸缓冲液洗涤后获得荧光素颗粒-AMACR抗原复合物，然后将荧光素颗粒-AMACR抗原复合物保存在含0.1％BSA和0.1％Tween20的磷酸缓冲液中；
将上述表面氨基化的橙色荧光素颗粒分散在5-10ml磷酸缓冲液中，加入5-10ml戊二醛反应2-5小时，离心除去戊二醛，将橙色荧光素颗粒重新分散在5-10ml磷酸缓冲液中，加入β-肌动蛋白抗体，使得β-肌动蛋白抗体浓度为100ug/ml，室温搅拌反应1-5小时，用磷酸缓冲液洗涤后获得荧光素颗粒-β-肌动蛋白抗体复合物，然后将荧光素颗粒-β-肌动蛋白抗体复合物保存在含0.1％BSA和0.1％Tween20的磷酸缓冲液中；
最后将红、绿、橙三种复合荧光素颗粒表面没有完全反应的活化基团进行封闭，以降低在以后试验中可能发生的非特异性吸附；再将红、绿橙三种复合荧光素颗粒重悬在保护液中，制成浓度为2mg/ml的微球溶液进行保存，其中保存液为pH9.0，含0.05％Tween-20，0.1％NaN3和0.1％BSA的0.005M硼酸盐缓冲液；最后将红，绿和橙三种复合荧光素颗粒等质量混合制成一种红绿橙三色混合免疫复合荧光素颗粒；用移液枪将10-40微升，浓度为2mg/ml的复合荧光素颗粒均匀滴在玻璃纤维膜上，然后干燥得到结合垫(3)。
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